Питательная среда для культивирования ооцитов крупного рогатого скота in vitro Российский патент 2022 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности репродуктивной биотехнологии для разведения крупного рогатого скота методом трансплантации эмбрионов in vitro.

Эффективность метода трансплантации эмбрионов in vitro зависит от подхода к его применению, основанного на строго научной основе, с непременным соблюдением всех технологических требований. При культивировании эмбрионов методами in vitro важно является создание и соблюдение тех же условий, как и при созревании in vivo. Культивирование ранних зародышей представляет собой развитие оплодотворенной яйцеклетки до стадии морулы, или бластоцисты.

В настоящее время существует несколько методов культивирования эмбрионов. При этом этапе технологии in vitro следует строго соблюдать определенные протоколы и принципы их проведения. Важным является соблюдение протоколов промывания эмбриона перед его культивированием, температуру и время культивирования, содержание углекислого газа и кислорода, состав и свойства питательной среды.

Правильно подобранная питательная среда для культивирования яйцеклетки in vitro может уменьшить стрессовое повреждение, вызванное внешней средой, способствует созреванию цитоплазмы ооцита, увеличивает потенциал развития зигот после оплодотворения яйцеклетки.

Для культивирования эмбрионов in vitro используются растворы, приготовленные на основе коммерческих сред, к которым относятся: среда для культивирования тканей 199 (TCM-199), альбумин (TALP), синтетическая жидкость яйцеводов (SOF) с небольшими модификациями и большинство из них содержат сыворотку BSA. Все растворы для культивирования in vitro основаны на сбалансированном солевом растворе, растворе аминокислот, пируват, ЭДТА и ионные буферы.

Известен способ культивирования ооцитов коров с использованием сывороточного гонадотропина жеребых кобыл (PMSG) и хорионического гонадотропина человека (hCG) (Avery В., Strobech L., Jacobsen T. et al. In vitro maturation of bovine cumulus-oocyte complexes in undiluted follicular fluid: effect on nuclear maturation, pronucleus formation and embryo development. Theriogenology. 2003. 59: 987-999). В качестве культуральной используют среду ТСМ-199, содержащую 2 U/мл препарата PMSG-hCG, 50 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 0.2 мМ пирувата натрия, 5% эстральной сыворотки коров и 50 мкг/мл гентамицина. Ооцит -кумулюсные комплексы (50-60 штук) инкубируют в 700 мкл среды в течение 22.5-24 ч при температуре 38.8°С в увлажненном воздухе, содержащем 5% CO₂. При культивировании в этих условиях 69% ооцитов дозревали до стадии метафазы II. Недостатком данного способа является невысокая эффективность культивирования и низкий процент выхода ооцитов готовых к оплодотворению, что препятствует получению требуемого технического результата.

Известен способ культивирования ооцитов коров в присутствии пролактина (Кузьмина Т.И., Лебедева И.Ю., Торнер X., Альм X. Эффекты пролактина в различных системах культивирования на созревание ооцитов коров и их способность к дальнейшему развитию. Онтогенез. 2001. 32 (2): 140-147). Ооцит -кумулюсные комплексы культивируют группами по 15-20 штук в каплях среды объемом 200 мкл, покрытых минеральным маслом, в течение 24 ч при температуре 38,5°С в атмосфере с 5% CO₂ и 90%-ной влажностью. Для культивирования используют среду ТСМ-199 (с L-глутамином), содержащую 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0,23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES и 50 мкг/мл гентамицина. Недостаток метода заключается в том, воспроизводимость указанного метода зависит от факторов, связанных с физиологическим состоянием животных и качеством фолликулов. Помимо этого, процедура выделения и подготовки клеток гранулезы к совместному культивированию с ооцитами удлиняет общую продолжительность времени между овариэктомией коров и началом культивирования, что является неблагоприятным фактором для жизнеспособности ооцитов и увеличивает трудозатраты при реализации способа.

Известен патент US5213979 в котором описывается питательная среда для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота, которая включает эпителиальные клетки из яйцевода животного-донора. Кроме того, описан процесс созревания ооцитов в среде культивирования in vitro, содержащей эпителиальные клетки из донорского яйцевода. Однако данный способ при его реализации является трудозатратным и низкоэффективным.

Известен патент US20050019906 - единая система питательных сред используется для обеспечения оптимальной среды для удовлетворения потребностей в питательных веществах при культивировании ооцитов и эмбрионов от стадии извлечения ооцитов до стадии имплантации эмбрионов. Однако данный способ описывает использование только на ооцитах и эмбрионах человека.

Ближайшим аналогом предлагаемого технического решения является патент CN101962626A «Решение для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro», где описано добавление цистеамина в питательную среду для культивирования ооцитов. Однако данный способ при его реализации является трудозатратным и низкоэффективным. Получению требуемого технического результата препятствует выбор эффективных веществ в качестве добавки к питательной среде, которые не обеспечивают интенсивного накопления некоторых факторов роста.

Техническим результатом настоящего технического решения является создание питательной среды для улучшения развития ооцитов крупного рогатого скота в условиях in vitro за счет включения новых компонентов в питательную среду.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, выражается в повышении качества и жизнеспособности ооцитов, за счет того, что ооциты помещают в питательную среду для созревания состоящую из среды созревания для ооцитов ТСМ-199, сыворотки эмбриональной бычьей 10% FBS, препарата ФСГ супер, антибиотика гентамицин, витамина В₁₂, витаминоподобного вещества L-карнитина в условиях in vitro, где они созревают до ооцита готового к оплодотворению в течение 24 часов при температуре 38,5 °С в среде, в которой объемная концентрация СО₂ составляет 6%.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать добавки для питательной среды для созревания ооцитов до стадии оплодотворения in vitro, включающую 3 мг/мл - В₁₂ и 4 мМ L-карнитина.

Теоретическим основанием для использования витамина В₁₂ (кобаламин, цианокобаламин) в качестве добавки для питательной среды являются данные о том, что он является одним из самых важных во всей группе витаминов В, а обмен белков необходимых для роста и развития клеток не обходится без цианокобаламина. Витамин В₁₂ участвует в переводе фолиевой кислоты в активную форму, в синтезе метионина, коэнзима А, антиоксиданта глутатиона, янтарной кислоты, миелина. Он контролирует синтез ДНК (следовательно, деление клеток), увеличивает уровень Т-супрессоров, что способствует ограничению аутоиммунных процессов. Для циркуляции по телу белков, необходимых для роста и восстановления клеток, требуется витамин В₁₂. Многие из ключевых компонентов белка, так называемые аминокислоты, становятся недоступными для использования в отсутствие В₁₂ (Bala R., 2021, Dhiman P., 2021).

Теоретическим основанием для использования L-карнитина в качестве добавки для культуральной среды являются данные о том, что L-карнитин обеспечивает антиоксидантную защиту от метаболических токсинов и клеточного стресса (Thakur Y., 2021). В исследованиях на животных женского пола, карнитин помогал развитию яйцеклетки в яичнике. Яйцеклетки, созревшие с добавлением карнитина, имели более здоровый уровень митохондриальной ДНК и лучший уровень эстрогена. Это привело к улучшению фертильности и эмбриологического развития (Liang Y., 2020). Питательная среда и метод культивирования с использованием питательной среды позволяют решать проблемы, возникающие при культивировании ооцитов, которые выражаются в низкой жизнеспособности и слабом развитии ооцитов, что в дальнейшем приводит к низкому проценту оплодотворения. Дефицит питательных веществ в культуральных средах приводит снижению качества яйцеклетки и эмбриона (Sartori R. et al., 2002).

Пример выполнения.

На первом этапе получали ооциты методом трансвагинальной пункции яичников коров доноров черно-пестрой породы и проводили их оценку.

Ооциты распределяли по 4 классам на основе клеток кумулюса:

- степень А: ооциты, полностью окруженные клетками кумулюса;

- степень B: ооциты, частично окруженные клетками кумулюса;

- степень C: ооциты, не окруженные клетками кумулюса;

- степень D: дегенерация, наблюдаемая как в клетках ооцитов, так и в клетках кумулюса.

Степень A и B считается нормальной, а степень C и D - нарушенной (Khandoker, M. A. M. Y., 2005; Bilodeau-Goeseels, S. 2012).

На втором этапе проводили культивирование ооцитов. Ооциты отличного и хорошего качества культивировали в исследуемых средах в течение 24 часов на питательных средах при температуре 38,5 °С и газовом режиме - 6% СО₂ по схеме, представленной в таблице 1. В чашках Петри размещали по 10 ооцитов в 100 мкл матурирующего раствора.

В I опытной группе были использованы питательные среды состава: ТСМ-199, 10% FBS, 5 мг/мл ФСГ-супер, 50 мг/мл гентамицин.

Во II опытной группе были использованы аналогичные схема и питательные растворы, за исключением добавления 3 мг/мл - витамина В₁₂.

Во III опытной группе были использованы аналогичные схема и питательные растворы, за исключением добавления 4 мМ L-карнитина.

Во IV опытной группе были использованы аналогичные схема и питательные растворы, за исключением добавления 3 мг/мл витамина В₁₂+4 мМ L-карнитина.

Таблица 1 - Схема опыта

Опытные группы Компоненты и рабочие растворы I ТСМ-199+10% FBS+5 мг/мл ФСГ супер+50 мг/мл гентамицин II ТСМ-199+10% FBS+5 мг/мл ФСГ супер+50 мг/мл гентамицин+3 мг/мл - В12 III ТСМ-199+10% FBS+5 мг/мл ФСГ супер+50 мг/мл гентамицин+4 мМ L-карнитина IV ТСМ-199+10% FBS+5 мг/мл ФСГ супер+50 мг/мл гентамицин+3 мг/мл - В12+4 мМ L-карнитина

На третьем этапе проводили оценку созревших к оплодотворению ооцитов.

После созревания ооцитов степень экспансии клеток кумулюса определяли под микроскопом при 10-кратном увеличении как:

-уровень-1: небольшая экспансия ооцит-кумулюсного комплекса;

- уровень-2: умеренная экспансия ооцит-кумулюсного комплекса;

- уровень-3: заметная экспансия ооцит-кумулюсного комплекса.

Оценка созревания ооцитов по экспансии клеток кумулюса представлена в таблице 2.

Таблица 2 - Оценка созревания ооцитов по экспансии клеток кумулюса

Показатель Степень экспансии клеток кумулюса уровень 3 уровень 2 уровень 1 №I n 70 51 12 7 % 100 72,86 17,14 10,00 №II n 70 53 11 6 % 100 75,72 15,71 8,57 №III n 70 52 12 6 % 100 74,29 17,14 8,57 №IV n 70 56 10 4 % 100 80,00 14,29 5,71

Как видно из таблицы, через 24 ч культивирования в IV группе 80% ооцитов созрели до стадии оплодотворения, что было больше, чем в группах I, II и III на 7,14%, 4,28% и 5,71% соответственно.

Схема, использованная в IV группе с применением добавок 3 мг/мл витамина В₁₂ и 4 мМ L-карнитина к питательной среде, показала лучшие результаты.

Таким образом, предложенный способ позволяет значительно повысить in vitro выход созревших ооцитов (до 80%) и их компетенцию к оплодотворению по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, заключающийся в том, что яйцеклетку помещают в питательную среду для созревания в условиях in vitro, где она созревает до ооцита, готового к оплодотворению в течение 24 ч в среде, в которой объемная концентрация СО₂ составляет 6 %. Питательная среда для созревания яйцеклетки in vitro состоит из ТСМ-199, 10 % FBS, 5 мг/мл ФСГ-супер, 50 мг/мл гентамицина, 3 мг/мл В₁₂, 4 мМ L-карнитина. Преимущество изобретения заключается в повышении качества и жизнеспособности ооцитов крупного рогатого скота. 2 табл., 1 пр.

Питательная среда для культивирования ооцитов крупного рогатого скота in vitro, отличающаяся тем, что питательная среда состоит из среды созревания для ооцитов ТСМ-199, сыворотки эмбриональной бычьей 10 % FBS, 5 мг/мл препарата ФСГ-супер, 50 мг/мл антибиотика гентамицин, 3 мг/мл витамина В₁₂, 4 мМ витаминоподобного вещества L-карнитина в условиях in vitro.