ТЕХНОЛОГИЯ ДОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА НА СТАДИИ GV С ПОМОЩЬЮ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ В ПРОГРАММАХ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ: EV-IVM (EXTRACELLULAR VESICLES IN VITRO MATURATION) Российский патент 2023 года по МПК C12N5/75 A61K35/54 

В программах лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) проводят контролируемую овариальную стимуляцию для получения как можно более качественных зрелых женских половых клеток, находящихся на стадии МП (метафаза II деления мейоза). Однако в клинической практике не все получаемые ооциты являются зрелыми и пригодными для оплодотворения. У пациенток с резистентными яичниками, а также при наличии противопоказаний к стимуляции овуляции врачи прибегают к технологии дозревания ооцитов in vitro.

In vitro maturation (IVM) - это вспомогательная репродуктивная технология, подразумевающая аспирацию незрелых ооцитов и их последующее созревание in vitro (Михайлова Н.Д. и др., 2021; Gong et al., 2022). Созревание ооцитов in vitro было впервые описано еще в 1930-е гг., а сама технология IVM для ооцитов человека была впервые представлена Р. Эдвардсом в 1965 г. Однако на практике данная методика продемонстрировала положительные результаты только в 1990-е гг.: в 1991 г. была зарегистрирована первая беременность после IVM, а в 1994-м - первый случай живорождения после применения IVM у пациенток с синдромом поликистозных яичников.

Данная методика IVM подразумевает использование ооцит-кумулюсных комплексов, которые получают при трансвагинальной пункции из небольших фолликулов. Существует несколько разновидностей программ in vitro maturation: CAPA-IVM, OTO-IVM, классическое IVM. При этом все программы, в настоящее время применяемые на практике, используют культуральные среды (одно- или многоступенчатые), в которых происходит спонтанное дозревание женских половых клеток, окруженных клетками кумулюса. Ни одна коммерческая культуральная среда не использует аутологичные биологические жидкости, в частности, фолликулярную жидкость (ФЖ).

Как известно, зрелый фолликул состоит из ооцита, окруженного клетками кумулюса, антральной полости, содержащей фолликулярную жидкость (ФЖ), гранулезных клеток, базальной мембраны и клеток теки. ФЖ продуцируется клетками гранулезы и кровеносными сосудами, окружающими клетки теки. Осмотический градиент, возникающий за счет гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфата, образованными гранулезными клетками, создает приток жидкости из сосудов теки, увеличивая объемы ФЖ в процессе роста фолликула (Rodgers et al, 2010; Hennet et al., 2012). В состав ФЖ входят различные белки, липиды, полисахариды, факторы роста, нуклеиновые кислоты, стероидные гормоны, активные формы кислорода и антиоксидантные ферменты. Учитывая широкий спектр активных молекул и веществ, содержащихся в ФЖ, можно заключить, что ФЖ играет важную роль в регуляции фолликулогенеза, обеспечивая защиту, питание и созревание ооцита. Ранее исследователи пробовали использовать ФЖ для дозревания ооцитов человека, добавляя ее в среду культивирования, однако данный метод не показал высокую эффективность. Предлагаемый метод дозревания ооцитов использует не саму ФЖ, а внеклеточные везикулы (ВВ), которые инъецируют под блестящую оболочку ооцита.

Наличие ВВ и микроРНК в ФЖ человека впервые было идентифицировано в 2013 году методом электронной микроскопии (Sang et al, 2013), позже экзосомы из ФЖ человека были выделены с помощью ультрацентрифугирования, анализа слежения за наночастицами и проточной цитометрии. В 2014 г. в составе экзосом ФЖ женщин были обнаружены экзосомальные микроРНК и с помощью биоинформатического анализа обнаружена их способность регуляции развития фолликулов, возобновления в ооцитах мейоза и последующей овуляции (Santonocito et al, 2014). По результатам исследования Sohel et al., поглощение экзосом фолликулярными клетками инициирует повышение уровней микроРНК в этих клетках, при этом большинство микроРНК ФЖ приходится именно на экзосомальную фракцию, когда свободные микроРНК находятся в меньшинстве. Более того, некоторые микроРНК в составе эксзосом могут способствовать росту ооцитов, поскольку они по-разному экспрессировались в фолликулах, содержащих ооциты на разных стадиях созревания (Sohel et al., 2013).

Экспериментальные модели на животных показали, что добавление ВВ из ФЖ небольших фолликулов в среду культивирования приводило к увеличению количества бластоцист, изменениям в транскрипции генов эмбрионов, а также изменения уровней метилирования ДНК (de Almeida et al., 2020; Pioltine et al., 2020). На ооцитах человека исследования подобного типа описаны в литературе не были. Также на животных моделях было установлено, что экзосомы ФЖ обладают цитопротекторным действием. Обработка ооцитов экзосомами, полученными из ФЖ снижала апоптоз клеток кумулюса и повреждение ооцитов, вызванное тепловым шоком (Rodrigues et al., 2019).

Именно в силу значимой роли внеклеточных везикул ФЖ для созревания ооцитов предложено инъецировать их под блестящую оболочку, тем самым создавая предпосылки для возобновления мейоза и созревания ооцитов. В отличие от OTO-IVM и CAPA-IVM, которые невозможно проводить без окружающих ооцит клеток кумулюса, выделение внеклеточных везикул является недорогой и аутологичной процедурой, позволяющей получать хорошие результаты. Более того, предлагаемый метод использует женские половые клетки на стадии герминативного везикула (GV) без окружающих клеток кумулюса, которые были удалены с помощью фермента гиалуронидазы (стандартная подготовка к процедуре интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит). Такие ооциты GV в рутинной практике не пригодны для дальнейшего использования в программах лечения бесплодия методами ВРТ.

После пилотных проектов на ооцитах, донированных для научно-образовательных целей, подписания информированного добровольного согласия и разрешения Комиссии по этике биомедицинских исследований ФГБУ НМИЦ АГП им.Кулакова МЗ РФ (выписка из протокола №10 от 20.10.2022) был разработан протокол использования внеклеточных везикул фолликулярной жидкости для дозревания ооцитов человека на стадии герминативного пузырька, который состоит из следующих этапов.

1. Выделение ВВ-ФЖ в день трансвагинальной пункции фолликулов пациентки. Критерии включения пациентов полностью соответствуют нормативам, прописанным в Приказе Министерства здравоохранения Российской Федерации от 31 июля 2020 г. №803н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению». Собранную фолликулярную жидкость в объеме 5 мл последовательно подвергнуть ряду центрифугирований для удаления дебриса (400g в течение 10 мин с последующим 10 000g при 4°С в течение 30 мин). Супернатант использовать для выделения везикул ультрацентрифугированием при 108000g. Полученный осадок затем ресуспендировать в 100 мкл фильтрованного и предварительно центрифугированного (108000g) фосфатно-солевого буфера (PBS). Образцы ВВ в случае необходимости хранить в морозильнике при температуре -80°С.

2. Ооциты на стадии GV после обработки гиалуронидазой оставить на 1-2 ч в культуральной среде для половых клеток (бикарбонат) в условиях 37°С, 5% О₂, 6% СО₂.

3. Подготовьте чашку Петри согласно рисунку.

4. Инъекция ВВ-ФЖ в незрелые ооциты. Необходимо работать стандартными инструментами для ИКСИ: боросиликатные иглы для инъекции и удержания ооцита. В инъекционную иглу для ИКСИ аспирировать внеклеточные везикулы ФЖ (два диаметра ооцита).

Зафиксировать на холдинг-игле ооцит и провести под блестящую оболочку инъекционную иглу, не травмируя оолемму ооцита. Ввести в перивителлиновое пространство ооцита внеклеточные везикулы в объеме, равном не более диаметра ооцита. Далее поместить ооциты в традиционную культуральную среду для половых клеток (бикарбонат).

5. Оценить стадию развития ооцита через 24 часа. Дальнейшую работу в женскими половыми клетками проводить согласно стандартным операционным процедурам, принятым в клинике ЭКО.

ФЖ представляет собой жидкость яичников, которая играет важную роль в созревании яйцеклеток и является источником ВВ. Именно поэтому целесообразно использовать аутологичную фолликулярную жидкость женщины для дозревания ооцитов на стадии GV, чтобы увеличить число пригодных для оплодотворения клеток и тем самым повысить шансы наступления беременности.

Клинический пример

Пациентка М-ва, 32 лет, обратилась по поводу лечения бесплодия методами ВРТ. Проведено полное клиническое обследование мужчины и женщины согласно действующим нормативно-правовым актам. Выставлен диагноз: трубно-перитонеальный фактор бесплодия, астенотератозооспермия. В анамнезе 2 неудачные попытки ВРТ, в которых все полученные ооциты были не пригодны для оплодотворения, незрелые на стадии GV. Супружеской паре было предложено сменить триггер финального созревания ооцитов и использовать аутологичные внеклеточные везикулы фолликулярной жидкости в случае получения ооцитов на стадии GV. После подписания информированного добровольного согласия супружеская пара вступила в программу ВРТ. В день пункции фолликулов получено 4 ооцита, все на стадии GV. Была собрана фолликулярная жидкость и из 5 мл выделены внеклеточные везикулы. Проведена инъекция внеклеточных везикул фолликулярной жидкости под блестящую оболочку ооцита. Через 24 часа из 4 ооцитов 2 созрели до стадии MII и были оплодотворены. 1 ооцит дегенерировал, 1 созрел до стадии MI. Нормальное оплодотворение 2PN2PB наблюдали в 1 ооците, во 2-м - множественные пронуклеусы (зиготы утилизирована). На 5 сутки культивирования нормально оплодотворенная зигота находилась на стадии морулы и была криоконсервирована методом витрификации для дальнейшего использования в криоцикле.

Таким образом, разработанная техника использования внеклеточных везикул фолликулярной жидкости для дозревания ооцитов на стадии GV позволяет не останавливать программу лечения бесплодия методами ВРТ, проводить дозревание и получать эмбрионы, пригодные для переноса в полость матки. Метод является не только недорогим, но и безопасным, поскольку используется аутологичная биологическая жидкость, а процедура инъекции аналогична отработанной методике ИКСИ.

Список литературы

1. Михайлова Н.Д., Мишиева Н.Г., Кириллова А.О., Мартазанова Б.А., Джинчарадзе Л.Г. Дозревание ооцитов in vitro //Акушерство и гинекология., 2021, №11, с. 64-70.

2. Gong X, Li Н, Zhao Y. The Improvement and Clinical Application of Human Oocyte In Vitro Maturation (IVM). Reprod Sci. 2022 Aug; 29(8): 2127-2135. doi: 10.1007/s43032-021-00613-3. Epub 2021 Jun 2. PMID: 34076873.

3. R. J. Rodgers and H. F. Irving-Rodgers Formation of the Ovarian Follicular Antrum and Follicular Fluidl Biol Reprod, vol. 82, no. 6, pp. 1021-1029, Jun. 2010, doi: 10.1095/biolreprod.l09.082941.

4. Hennet and С.M. H. Combelles The antral follicle: a microenvironment for oocyte differentiation, Int J Dev Biol, vol. 56, no. 10-11-12, pp. 819-831, 2012, doi: 10.1387/ijdb.l20133cc.

5. Sang et al. Identification of MicroRNAs in Human Follicular Fluid: Characterization of MicroRNAs That Govern Steroidogenesis in Vitro and Are Associated With Polycystic Ovary Syndrome in Vivo, J Clin Endocrinol Metab, vol. 98, no. 7, pp. 3068-3079, Jul. 2013, doi: 10.1210/jc.2013-1715.

6. Santonocito et al. Molecular characterization of exosomes and their microRNA cargo in human follicular fluid: bioinformatic analysis reveals that exosomal microRNAs control pathways involved in follicular maturation, Fertil Steril, vol. 102, no. 6, pp. 1751-1761.el, Dec. 2014, doi: 10.1016/j.fertnstert.2014.08.005.

7. Sohel et al. Exosomal and Non-Exosomal Transport of Extra-Cellular microRNAs in Follicular Fluid: Implications for Bovine Oocyte Developmental Competence, PLoS One, vol. 8, no. 11, p.e78505, Nov. 2013, doi: 10.1371/journal.pone.0078505

8. de Almeida Monteiro Melo Ferraz M, Fujihara M, Nagashima JB, Noonan MJ, Inoue-Murayama M, Songsasen N. Follicular extracellular vesicles enhance meiotic resumption of domestic cat vitrified oocytes. Sci Rep. 2020 May 25; 10(1):8619. doi: 10.1038/s41598-020-65497-w. PMID: 32451384; PMCID: PMC7248092.

9. Pioltine EM, Machado MF, da Silveira JC, Fontes PK, Botigelli RC, Quaglio AEV, Costa CB, Nogueira MFG. Can extracellular vesicles from bovine ovarian follicular fluid modulate the in-vitro oocyte meiosis progression similarly to the CNP-NPR2 system? Theriogenology. 2020 Nov; 157:210-217. doi: 10.1016/j.theriogenology.2020.06.031. Epub 2020 Jul 31. PMID: 32814248.

10. Rodrigues ТА, Tuna KM, Alii AA, Tribulo P, Hansen PJ, Koh J, Paula-Lopes FF. Follicular fluid exosomes act on the bovine oocyte to improve oocyte competence to support development and survival to heat shock. Reprod Fertil Dev. 2019 Apr; 31(5):888-897. doi: 10.1071/RD18450. PMID: 30760387.

Подпись к рисунку 1

Дизайн чашки для выполнения процедуры инъекции внеклеточных везикул фолликулярной жидкости в незрелые ооциты под блестящую оболочку.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу дозревания ооцитов человека на стадии GV. Способ предусматривает ультрацентрифугирование собственной фолликулярной жидкости женщины и инъекцию выделенных внеклеточных везикул под блестящую оболочку ооцита, что позволяет индуцировать их созревание и приближать условия in vitro к естественным условиям в фолликуле яичника. Способ эффективен для дозревания и дальнейшего развития эмбриона. 1 пр., 1 ил.

Способ дозревания ооцитов человека на стадии GV с помощью внеклеточных везикул фолликулярной жидкости в программах экстракорпорального оплодотворения: EV-IVM (extracellular vesicles in vitro maturation), отличающийся тем, что используют внеклеточные везикулы, выделенные методом ультрацентрифугирования из 5 мл фолликулярной жидкости, которые добавляют в чашку Петри и инъецируют под блестящую оболочку ооцита в объеме, равном диаметру ооцита, так увеличивают количество зрелых женских половых клеток, пригодных для дальнейшего использования в программах экстракорпорального оплодотворения.