Способ получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота Российский патент 2024 года по МПК C12N5/10 A01K67/02 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно клеточной инженерии, и может быть использовано для создания системы получения эмбрионов крупного рогатого скота (КРС) in vitro.

Для культивирования эмбрионов КРС in vitro используют растворы, приготовленные на основе коммерческих сред, к которым относятся: среда для культивирования тканей 199 (ТСМ-199), альбумин (TALP), синтетическая жидкость яйцеводов (SOF) с небольшими модификациями и большинство из них содержат сыворотку BSA (бычий сывороточный альбумин). Все растворы для культивирования in vitro основаны на сбалансированном солевом растворе, растворе аминокислот, пируват, ЭДТА и ионные буферы.

Известен способ экстракорпорального культивирования ооцитов коров (патент РФ №2410063, кл. A61D 19/04, A01K 67/02, 2011 г.) с использованием сывороточного гонадотропина жеребых кобыл (PMSG) и хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). В качестве культуральной используют среду ТСМ-199, содержащую 2 U/мл препарата PMSG-hCG, 50 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 0.2 мМ пирувата натрия, 5% эстральной сыворотки коров и 50 мкг/мл гентамицина. Ооцит - кумулюсные комплексы (50-60 штук) инкубируют в 700 мкл среды в течение 22,5-24 ч при температуре 38.8°С в увлажненном воздухе, содержащем 5% CO₂. При культивировании в этих условиях 69% ооцитов дозревали до стадии метафазы II.

Недостатком данного способа является невысокая эффективность культивирования и низкий процент выхода ооцитов готовых к оплодотворению.

Известен способ (патент РФ №2778147, кл. C12N 1/00, 2022 г.) заключающийся в том, что яйцеклетку помещают в питательную среду для созревания в условиях in vitro, где она созревает до ооцита, готового к оплодотворению в течение 24 ч в среде, в которой объемная концентрация СО₂ составляет 6%. Питательная среда для созревания яйцеклетки in vitro состоит из ТСМ-199, 10% FBS, 5 мг/мл ФСГ (фолликулостимулирующий гормон) - супер, 50 мг/мл гентамицина, 3 мг/мл В₁₂, 4 мМ L-карнитина. Преимущество изобретения заключается в повышении качества и жизнеспособности ооцитов крупного рогатого скота.

Наиболее близким по технической сущности является техническое решение, (ж-л «Достижения науки и техники АПК», 2020. Т. 34. №2, 53-56 стр./ Использование коммерческих сред, разработанных для эмбрионов человека, для in vitro кyльтивиpoвaния гамет и эмбрионов крупного рогатого скота, И.Г. Сметанина, Л.В. Татаринова, А.С. Кривохарченко, электронный ресурс https://cyberleninka.ru/article/ri/ispolzovanie-kommercheskih-sred-razrabotannvh-dlya-embrionov-cheloveka-dlya-in-vitro-kultivirovaniya-gamet-i-embrionov-krupnogo?ysclid=locwm2alqr923878954) в котором осуществляют отбор яичников у коров после убоя, получение ооцит-кумулюсных комплексов, их созревание в коммерческой среде для развития in vitro эмбрионов человека с добавлением фолликулостимулирующего гормона и хорионического гонадотропина человека, отмывание созревших in vitro ооцитов, обработку сперматозоидов быка, оплодотворение путем совместного инкубирования ооцитов со сперматозоидами в коммерческой среде для эмбрионов человека in vitro в течение 24 ч при температуре 38,5°С с использованием в качестве капацитирующего агента гепарина и культивирование оплодотворенных ооцитов в коммерческой среде для эмбрионов человека при температуре 38,5°С. В известном техническом решении показана принципиальная возможность использования сред, разработанных для человеческих эмбрионов, в экспериментах по культивированию гамет и эмбрионов КРС. Следует отметить, что на стадиях созревания, оплодотворения и культивирования используются разные культуральные среды, т.е. эмбрион подвергается воздействию 3-4 различных сред за время развития, которые могут иметь разные концентрациюи ионов и энергетических субстратов. При этом эффект от переноса развивающегося эмбриона между различными культуральными средами неизвестен. Поскольку разные среды, то эмбриону необходимо некоторое количество энергии и времени для адаптации. Периодическое приспособление эмбриона к меняющейся среде культивирования приводит к снижению потенциала развития. Кроме того, использование нескольких разных сред в процессе получения эмбрионов, усложняет его.

Техническим результатом является повышение потенциала развития эмбриона без изменчивости от партии к партии и упрощение процесса получения эмбрионов КРС.

Технический результат достигается тем, что в способе получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота включающем отбор яичников у коров после убоя, получение ооцит-кумулюсных комплексов, их созревание в коммерческой среде для развития in vitro эмбрионов человека с добавлением фолликулостимулирующего гормона и хорионического гонадотропина человека, отмывание созревших in vitro ооцитов, обработку сперматозоидов быка, оплодотворение путем совместного инкубирования ооцитов со сперматозоидами в коммерческой среде для эмбрионов человека in vitro в течение 24 ч при температуре 38,5°С с использованием в качестве капацитирующего агента гепарина и культивирование оплодотворенных ооцитов в коммерческой среде для эмбрионов человека при температуре 38,5°С, согласно изобретению в качестве коммерческой среды для эмбрионов человека используют среду «Continuous Single Culture Complete», которую в свежем виде на стадиях созревания, оплодотворения и культивирования in vitro эмбрионов крупного рогатого скота каждый раз покрывают минеральным маслом для клеточных культур «Sage», при уровне углекислого газа 6,5 об. % и кислорода - 5,0 об. %, при этом обработку сперматозоидов проводят путем центрифугирования в течение 15 минут, при 15000 об/мин в условиях комнатной температуры и в градиенте плотности: 3 мл 80% Percoll, а осадок сперматозоидов после центрифугирования в течение 10 минут при 8000 об/мин промывают буферной средой, содержащей 3 ME гепарина и вносят в среду оплодотворения подвижные сперматозоиды с концентрацией 1,0-2,0×10⁶ в 1 мл этой среды и из расчета 10 ооцит-кумулюсных комплексов на 50 мкл среды, далее через 16-18 часов после оплодотворения комплексы очищают от кумулюсных клеток и сперматозоидов, переносят в среду и культивируют в течение 170-180 часов до стадии бластоцисты.

Сопоставительный анализ заявляемого решения с известными способами получения эмбрионов крупного рогатого скота позволяет сделать вывод, о его соответствии критерию «НОВИЗНА», так как в результате проведенного патентно-информационного поиска, предлагаемая совокупность существенных признаков изобретения не обнаружена, поскольку отличительными признаками заявляемого способа, являются:

- использование в качестве коммерческой среды для эмбрионов человека среду «Continuous Single Culture Complete», которую в свежем виде на стадиях созревания, оплодотворения и культивирования in vitro эмбрионов крупного рогатого скота, каждый раз покрывают минеральным маслом для клеточных культур «Sage», при уровне углекислого газа 6,5 об. % и кислорода - 5,0 об. %;

- обработка сперматозоидов путем центрифугирования в течение 15 минут, при 15000 об/мин в условиях комнатной температуры и в градиенте плотности: 3 мл 80% Percoll, а осадок сперматозоидов после центрифугирования в течение 10 минут при 8000 об/мин промывают буферной средой, содержащей 3 ME гепарина.

Сопоставление заявленного технического решения с известными позволили выявить признаки, не являющиеся очевидными для специалиста отрасли в связи с достигаемым всей совокупностью существенных признаков техническим результатом. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «ИЗОБРЕТАТЕЛЬСКИЙ УРОВЕНЬ».

Заявляемое техническое решение соответствует критерию «ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ», так как может быть использовано при получении эмбрионов КРС в коммерческих средах для развития in vitro эмбрионов человека.

Коммерческая среда для эмбрионов человека «Continuous Single Culture Complete» (CSCM) - это клинически доказанная одноэтапная культуральная среда с низким содержанием лактата, которая помогает улучшить развитие бластоцисты. CSCM предназначена для оплодотворения и культивирования эмбрионов в течение 5/6 дня развития эмбрионов. Эта среда оптимизирована для использования в системе непрерывного культивирования без смены чашек или обновления среды (https://www.embryomed.com/product-page/continuous-single-culture-nx-complete). Среда CSCM-C содержит сывороточный альбумин человека (HSA). Исходный человеческий материал, который использован в производстве этого продукта был протестирован на лицензионных наборах FDA и признан нереактивными с антителами Гепатита С (HCV), и антителами к Вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ). Среда CSCM-C является полноценной, готовой к использованию, содержащая Человеческий сывороточный альбумин (HSA). При оплодотворении за день до забора ооцитов, подготавливают чашки для оплодотворения со средой CSCM-C, накрытую маслом и предварительно доводят до 37°С в СО₂ инкубаторе. Для культивирование эмбриона, в день оплодотворения (за один день до оценки оплодотворения), готовят чашку для культивирования со средой CSCM-C, которую покрывают маслом и предварительно http://teh-med.com/catalog/Gamete+Processing/CONTINUOUSSINGLECULTURECo mplete/.

Способ получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота осуществляют следующим образом.

Предварительно осуществляют отбор яичников у коров после убоя. Стандартным методом получают ооцит-кумулюсные комплексы, затем их помещают в коммерческую среду для развития in vitro эмбрионов человека «Continuous Single Culture Complete)) (CSCM) с добавлением фолликулости-мулирующего гормона и хорионического гонадотропина человека. Далее созревшие in vitro ооцитов отмывают.

Проводят обработку сперматозоидов быка методом центрифугирования в градиенте плотности. Этот метод выбран в связи с тем, что в процессе центрифугирования сперматозоиды перемещаются к той позиции в градиенте, которая отвечает их собственной плотности, т.е. к своей изопикнической точке. Так, сперматозоиды с нарушенным хроматином обладают меньшей плотностью и будут задерживаться в верхнем слое или на границе раздела сред градиента. Точно так же, изопикническая точка для сперматозоидов с морфологическими дефектами головки из-за их отличающейся плотности будет находиться на другом уровне, на котором они и будут концентрироваться. Кроме того, в процессе градиентного центрифугирования могут быть отделены другие клетки, присутствующие в эякуляте, - например, лейкоциты и эпителиальные клетки, так же, как мертвые и погибающие сперматозоиды, которые служат источником реакционно активных форм кислорода и могут вызывать оксидативный стресс. Следует отметить, что проведенные научные исследования показали, что выбранный метод, позволяет в полной мере выделять из нативного эякулята прогрессивно подвижные сперматозоиды file:///C:/Users/AflMHHHCTpaTop/Downloads/sravnitelnaya-harakteristika-metodov-vydeleniya-spermatozoidov-iz-nativnogo-eyakulyata-muzhchin%20(2).pdf.

Далее проводят оплодотворение путем совместного инкубирования ооцитов со сперматозоидами в коммерческой среде для эмбрионов человека in vitro ((Continuous Single Culture Complete)) (CSCM) в течение 24 ч при температуре 38,5°С с использованием в качестве капацитирующего агента гепарина и культивирование оплодотворенных ооцитов в коммерческой среде для эмбрионов человека при температуре 38,5°С.

Используемую среду «Continuous Single Culture Complete)), в свежем виде на стадиях созревания, оплодотворения и культивирования in vitro эмбрионов крупного рогатого скота, каждый раз покрывают минеральным маслом для клеточных культур «Sage», при уровне углекислого газа 6,5 об. % и кислорода - 5,0 об. %. Такой уровень углекислого газа и кислорода является оптимальным, т.к., ниже этого предела наблюдается лимитирование роста, а при превышении - ингибирование.

Обработку сперматозоидов проводят путем центрифугирования в течение 15 минут, при 15000 об/мин в условиях комнатной температуры и в градиенте плотности: 3 мл 80% Percoll, а осадок сперматозоидов после центрифугирования в течение 10 минут при 8000 об/мин промывают буферной средой, содержащей 3 ME гепарина и вносят в среду оплодотворения подвижные сперматозоиды с концентрацией 1,0-2,0×10⁶ в 1 мл этой среды и из расчета 10 ооцит-кумулюсных комплексов на 50 мкл среды, далее через 16-18 часов после оплодотворения комплексы очищают от кумулюсных клеток и сперматозоидов, переносят в среду «Continuous Single Culture Complete», и культивируют в течение 170-180 часов до стадии бластоцисты.

Пример конкретного осуществления заявляемого способа

Яичники КРС после убоя были отобраны и транспортированы в лабораторию при 38,5°С в контролируемой температурной среде в течение 4-5 часов. Аспирацию фолликулов от 2 до 15 мм выполняли с помощью иглы 18G, прикрепленной к 5-10 мл шприцу. Аспирацию фолликулов и дальнейшую работу с яйцеклетками и эмбрионами проводили в стерильных условиях «чистой зоны» в ламинарных шкафах с подогреваемой до 38,5°С поверхностью. Для исследования использовали 375 ооцит-кумулюсных комплексов крупного рогатого скота.

Полученные ооцит-кумулюсные комплексы рандомным образом распределялись на четыре группы:

1 группа - созревание, оплодотворение и культивирование проводили на средах, разработанных для КРС IVF-Bioscience (BO-IVM, BO-IVF, ВО-IVC);

2 группа - созревание, оплодотворение и культивирование проводили на средах для ВРТ человека Vitrolife (G-IVF, G-TL);

3 группа - созревание, оплодотворение и культивирование проводили на средах для ВРТ человека Life Global (IVF, IVC).

4-я группа - созревание, оплодотворение и культивирование проводили на среде для ВРТ человека Irvine Scientific (Continuous Single Culture Complete).

Дозревание ооцитов.

Дозревание ооцитов первой группы проводили в течение 24 часов в культуральной среде BO-IVM), покрытой минеральным маслом для клеточных культур(Sage), при температурном режиме 38,5°С, уровне углекислого газа 6,5 об/%, кислороде - 5,0 об. %.

Дозревание эмбрионов в трех других группах проводили путем добавления гормонов 0,5 мкг/мл фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и 0,5 мкг/мл хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в среду созревания: для второй группы в среду G-IVF, для третьей группы в среду IVF (Life GJobal), для четвертой группы в среду ((Continuous Single Culture Complete)). Инкубировали в течение 24 часов, покрыв среду минеральным маслом для клеточных культур минеральным маслом для клеточных культур (Sage), при температурном режиме 38,5 °С, уровне углекислого газа 6,5 об. %, кислороде - 5,0 об. %.

Оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов.

Для экстракорпорального оплодотворения использовали криоконсер-вированные сперматозоиды быка, замороженные в соломинах объемом 0,5 мл. Соломины размораживали на водяной бане с температурой 37°С в течение 30 секунд. Обработку сперматозоидов проводили методом центрифугирования в градиенте плотности: 3 мл 80% Percoll (Irvine Scientific), в течение 15 минут 15000 об /мин при комнатной температуре. Осадок сперматозоидов после центрифугирования промывали буферной средой, содержащей 3 ME гепарина в течение 10 минут при 8000 об/мин.

После центрифугирования и отмывки, сперматозоиды в концентрации 1,0-2,0×10⁶ подвижных сперматозоидов в 1 мл вносили в среду оплодотворения с ооцит-кумулюсными комплексами: для первой группы - BO-IVF, для второй группы - G-IVF, для третьей группы - IVF, для четвертой группы - Continuous Single Culture Complete (без добавления гормонов). Инкубировали, покрыв среду минеральным маслом для клеточных культур (Sage), при температурном режиме 38,5°С, уровне углекислого газа 6,5 об. %, кислороде - 5,0 об. %.

Через 16-18 часов после оплодоторенения комплексы полностью очищали от кумулюсных клеток и сперматозоидов и переносили в среду культивирования: для первой группы - BO-IVC, для второй группы - G-TL, для третьей группы - IVC. для четвертой группы - Continuous Single Culture Complete. Эмбрионы культивировались при тех же условиях инкубирования под маслом без смены среды весь период развития до стадии бластоцисты, что составило в среднем 170-180 часов после оплодотворения.

Статистическая обработка проводилась программным комплексом Statistica 10.0 с использованием непараметрических методов анализа с определением достоверности различий критерием Mann-Whitney (U).

Результаты:

Для анализа использовали следующие критерии оценки:

- уровень дозревания определяли по количеству ооцитов с первым полярным телом после денудации;

- уровень делящихся эмбрионов определяли по количеству эмбрионов начавших делиться через 48 ч после оплодотворения;

- уровень бластуляции эмбрионов - по количеству эмбрионов формирующих бластоцисту от количества делящихся эмбрионов (таблица 1).

Количество оплодотворенных ооцитов не оценивали, так как в ооцитах КРС пронуклеусы визуализировать затруднительно из-за большого количества липидных гранул в цитоплазме.

Заявляемый способ позволяет упростить дозревание ооцитов и культивирование эмбрионов КРС для получения воспроизводимых результатов без изменчивости от партии к партии.

По полученным результатам, менее выраженной была разница в уровнях созревания, дробления и бластуляции между ооцитами КРС, развивающимися на специализированных средах, разработанных для КРС IVF-Bioscience (69,4%, 60,1% и 22,4%, соответственно) и на средах для ВРТ человека Irvine Scientific Continuous Single Culture Complete (63,2%, 52,9% и 18,3%, соответственно). Хотя выявлена тенденция к более низким результатам при использовании Irvine Scientific. Возможно, это связано с тем, что механизмы оогенеза и оплодотворения у всех млекопитающих схожи, но все-таки не идентичны полностью. Однако были значительные различия по этим показателям при культивировании на средах для ВРТ человека Vitrolife серии G (23,1%, 11,5% и 0% соответственно) и незначительные на средах Life Global IVF, IVC (28,1%о, 21,9%, 15,6%o соответственно), однако эта среда используется только при оплодотворении и культивировании.

Хорошая эффективность использования среды Irvine Scientific Continuous Single Culture Complete, вероятно, обусловлена также тем, что это универсальная среда, которая поддерживает оплодотворение ооцита и развитие зиготы без смены среды со дня оплодотворения, до дня формирования бластоцист. Созревание ооцитов КРС в заявляемом способе проводили в этой же среде с добавлением гормонов. Принцип, по которому разработаны требующие смены среды культивирования основывается на том, что in vivo в ходе этапов развития доимплантационный эмбрион продвигается по маточным трубам и попадает в матку, соответственно, условия его развития изменяются. В результате развития in vitro, эмбрион также подвергается воздействию нескольких различных сред. При этом эффект от переноса развивающегося эмбриона между различными культуральными средами может быть отрицательным из-за разного состава сред и для адаптации эмбриону требуется некоторое количество энергии и временичто может привести к снижению потенциала развития. При этом среда Irvine Scientific Continuous Single Culture Complete разработана по другому принципу: "свободный выбор эмбриона" - то есть в ней есть все необходимые компоненты для поддержания развития эмбриона.

Полученные авторами результаты подтверждают, что ооциты крупного рогатого скота могут созревать, оплодотворяться и культивироваться в некоторых средах промышленного коммерческого производства для эмбрионов человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно клеточной инженерии, и может быть использовано для создания системы получения эмбрионов крупного рогатого скота (КРС) in vitro. Изобретение представляет собой способ получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота. Способ включает отбор яичников у коров после убоя, получение ооцит-кумулюсных комплексов, их созревание в коммерческой среде для развития in vitro эмбрионов человека с добавлением фолликулостимулирующего гормона и хорионического гонадотропина человека, отмывание созревших in vitro ооцитов, обработку сперматозоидов быка, оплодотворение путем совместного инкубирования ооцитов со сперматозоидами в коммерческой среде для эмбрионов человека in vitro в течение 24 ч при температуре 38,5°С с использованием в качестве капацитирующего агента гепарина и культивирование оплодотворенных ооцитов в коммерческой среде для эмбрионов человека при температуре 38,5°С. В качестве коммерческой среды для эмбрионов человека используют среду «Continuous Single Culture Complete», которую в свежем виде на стадиях созревания, оплодотворения и культивирования in vitro эмбрионов крупного рогатого скота каждый раз покрывают минеральным маслом для клеточных культур «Sage», при уровне углекислого газа 6,5 об. % и кислорода 5,0 об. %, при этом обработку сперматозоидов проводят путем центрифугирования в течение 15 мин, при 15000 об/мин в условиях комнатной температуры и в градиенте плотности: 3 мл 80% Percoll, а осадок сперматозоидов после центрифугирования в течение 10 мин при 8000 об/мин промывают буферной средой, содержащей 3 ME гепарина, и вносят в среду оплодотворения подвижные сперматозоиды с концентрацией 1,0-2,0×10⁶ в 1 мл этой среды и из расчета 10 ооцит-кумулюсных комплексов на 50 мкл среды, далее через 16-18 ч после оплодотворения комплексы очищают от кумулюсных клеток и сперматозоидов, переносят в среду и культивируют в течение 170-180 ч до стадии бластоцисты. Изобретение позволяет повысить потенциал развития эмбриона без изменчивости от партии к партии и упростить процесса получения эмбрионов КРС. 1 табл.

Способ получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота, включающий отбор яичников у коров после убоя, получение ооцит-кумулюсных комплексов, их созревание в коммерческой среде для развития in vitro эмбрионов человека с добавлением фолликулостимулирующего гормона и хорионического гонадотропина человека, отмывание созревших in vitro ооцитов, обработку сперматозоидов быка, оплодотворение путем совместного инкубирования ооцитов со сперматозоидами в коммерческой среде для эмбрионов человека in vitro в течение 24 ч при температуре 38,5°С с использованием в качестве капацитирующего агента гепарина и культивирование оплодотворенных ооцитов в коммерческой среде для эмбрионов человека при температуре 38,5°С, отличающийся тем, что в качестве коммерческой среды для эмбрионов человека используют среду «Continuous Single Culture Complete», которую в свежем виде на стадиях созревания, оплодотворения и культивирования in vitro эмбрионов крупного рогатого скота каждый раз покрывают минеральным маслом для клеточных культур «Sage», при уровне углекислого газа 6,5 об. % и кислорода 5,0 об. %, при этом обработку сперматозоидов проводят путем центрифугирования в течение 15 мин, при 15000 об/мин в условиях комнатной температуры и в градиенте плотности: 3 мл 80% Percoll, а осадок сперматозоидов после центрифугирования в течение 10 мин при 8000 об/мин промывают буферной средой, содержащей 3 ME гепарина, и вносят в среду оплодотворения подвижные сперматозоиды с концентрацией 1,0-2,0×10⁶ в 1 мл этой среды и из расчета 10 ооцит-кумулюсных комплексов на 50 мкл среды, далее через 16-18 ч после оплодотворения комплексы очищают от кумулюсных клеток и сперматозоидов, переносят в среду и культивируют в течение 170-180 ч до стадии бластоцисты.