СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА В ПРОГРАММАХ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 A61B17/435 

Цель вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) при лечении различных факторов бесплодия - увеличение процента имплантации, наступление беременности и рождение здорового ребенка. Низкий процент имплантации (не более 40%) остается нерешенной проблемой репродуктивной медицины человека (Choe, 2022). Мужское бесплодие занимает лидирующее место в причинах бесплодия в браке. Часто в программах ВРТ неудачи оплодотворения связаны с низкой прогрессивной подвижностью мужских половых клеток, или с астенозооспермией. Низкая подвижность вынуждает клинического эмбриолога прибегать к методу интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ).

Во время выполнения классического экстракорпорального оплодотворения добавление специально подготовленной спермы не всегда приводит к появлению пронуклеусов, то есть к нормальному оплодотворению. Сперматозоиды могут терять подвижность уже в чашке Петри в процессе оплодотворения. Именно поэтому целесообразен поиск методов увеличения подвижности мужских половых клеток при их использовании в программах лечения бесплодия методами ВРТ.

В настоящее время в научной литературе особое внимание уделяется изучению внеклеточных везикул (ВВ) и их функциям в различных системах организма. ВВ представляют собой частицы, окруженные двуслойной липидной мембраной, секретируемые почти всеми типами клеток - от прокариот до эукариот и обнаруженные во всех жидкостях организма человека (кровь, моча, слюна, грудное молоко, семенная плазма, фолликулярная жидкость и т.д.). Одной из важнейших функций ВВ является транспорт биологически активных молекул: различных белков, липидов, мРНК и миРНК, также ВВ могут служить потенциальными маркерами мужского и женского бесплодия (Candenas L. et al., 2020).

В репродуктивной системе ВВ играют значительную роль в созревании мужских и женских гамет, процессах оплодотворения, эмбриогенезе и имплантации (Nguyen et al, 2022). На экспериментальных животных моделях показано, что использование ВВ значительно повышает эффективность ВРТ. Однако нет описанных способов (даже в рамках научных работ) использования внеклеточных везикул при лечении бесплодия у человека методами вспомогательных репродуктивных технологий.

Как показали экспериментальные модели, внеклеточные везикулы, полученные из фолликулярной жидкости крупного рогатого скота, модулируют жизнеспособность, капацитацию и акросомную реакцию сперматозоидов быков (Hasan MM et al., 2021).

Перед слиянием яйцеклетки и сперматозоида в женской репродуктивной системе происходит несколько жизненно важных процессов оплодотворения. Одним из таких процессов является созревание сперматозоидов, происходящее в женских половых путях. Сперматозоиды, не созревшие в женских половых путях, не могут проникнуть в яйцеклетку. Во многих сообщениях предполагается участие различных факторов в активации функционального созревания сперматозоидов. Фолликулярная жидкость (ФЖ) названа одним из таких факторов. ФЖ представляет собой жидкость яичников, которая играет важную роль в созревании яйцеклеток и является источником ВВ. В исследованиях на животных сообщалось, что ФЖ способствует функциональному созреванию сперматозоидов (Hasan MM et al., 2021). Авторы предположили, что ВВ-ФЖ передают сигналы сперматозоидам, поддерживая жизнеспособность сперматозоидов, вызывая капацитацию сперматозоидов и акросомную реакцию. В этом исследовании оценивали влияние ВВ-ФЖ крупного рогатого скота (КРС) на функции сперматозоидов. Независимо от размера фолликулов, из которых произошли ВВ-ФЖ, они были способны поддерживать жизнеспособность сперматозоидов, индуцировать капацитацию и акросомную реакцию. Эти эффекты были специфичны для источника бычьих ВВ-ФЖ, поскольку ВВ-ФЖ, полученные из клеточной линии человека, или свиные ВВ-ФЖ не влияли на жизнеспособность сперматозоидов и не индуцировали капацитацию и акросомную реакцию. Минимум 5×10⁵ ВВ/мл был достаточным для поддержания жизнеспособности сперматозоидов и индукции капацитации и акросомной реакции в сперматозоидах быков. Это исследование демонстрирует, что ВВ-ФЖ могут поддерживать функцию сперматозоидов КРС и могут способствовать созданию благоприятной периконцепционной микросреды.

Таким образом, изучение состава ВВ-ФЖ, ответственного за модуляцию функций сперматозоидов, потенциально может оказаться полезной для диагностики и лечения мужского бесплодия и улучшения существующих протоколов ВРТ.

В нашем исследовании, проведенном в рамках экспериментальной модели на половых клетках человека, было показано, что ВВ-ФЖ изменяют морфофункциональные характеристики сперматозоидов (Sysoeva et al., 2021). В работе была использована также электронная микроскопия (ТЭМ), чтобы проследить взаимодействие между ВВ-ФЖ и сперматозоидами человека. Инкубация постэякуляторных сперматозоидов с фракцией выделенных ВВ из ФЖ в течение 1 ч привела к высокому проценту связанных сперматозоидов с ВВ. Связывание ВВ было обнаружено в большей степени в акросомной области головки и средней части сперматозоида. ТЭМ подтвердила наличие ВВ от 60 до 180 нм. Связанные везикулы не были обнаружены в контрольных образцах без добавления ВВ. На сперматозоидах человека такое взаимодействие ВВ показано впервые, не было найдено ни одной публикации, касающейся данного вопроса в современной литературе. На втором этапе экспериментальной работы сперму инкубировали в течение 30 минут и 1 часа с ВВ, предварительно выделенными их из ФЖ человека. Инкубация показала больший процент подвижных сперматозоидов (парный t-критерий Стьюдента, р<0,001 р=0,005 для 30 минут и 1 часа соответственно; среднее значение признака до эксперимента составляет 21,340±10.368, среднее значение признака после эксперимента составляет 47,602±8.216 для 1 часа и среднее значение признака до эксперимента составляет 22,782±11.308, среднее значение признака после эксперимента составляет 32,676±8.144 для 30 минут инкубации по сравнению с контролем (параллельная инкубация без ВВ). Изменения были обнаружены не только в увеличении общей подвижности, но количестве прогрессивно-подвижных сперматозоидов у каждого пациента, особенно ярко это выражено через 1 час инкубации по сравнению с контролем. Важно отметить, что значительное увеличение количества прогрессивно-подвижных сперматозоидов относительно контроля и изменения общей подвижности мы связываем с усилением гиперактивации сперматозоидов. При анализе данных криволинейной и прямолинейной скоростей движения сперматозоидов через 1 час после инкубации с ВВ статистически значимых различий выявлено не было. Наше предположение об увеличении гиперактивации сперматозоидов после инкубирования с ВВ фолликулярной жидкости также подтверждается изменением треков движения сперматозоидов относительно контроля, которые были получены с помощью системы компьютерной оценки показателей эякулята (CASA). Треки имели спиралевидную форму, стала заметнее хаотичность движения.

Проведенное экспериментальное исследование дало возможность применения выявленных эффектов в программах лечения бесплодия при астенозооспермии. Был разработан способ использования ВВ-ФЖ для увеличения подвижности сперматозоидов при оплодотворении, который состоит из следующих этапов.

1. Выделение ВВ-ФЖ в день трансвагинальной пункции фолликулов пациентки. Критерии включения пациентов полностью соответствуют нормативам, прописанным в Приказе Министерства здравоохранения Российской Федерации от 31 июля 2020 г. №803н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению». Собранную фолликулярную жидкость в объеме 5 мл последовательно подвергнуть ряду центрифугирований для удаления дебриса (400g в течение 10 мин с последующим 10000 g при 4°С в течение 30 мин). Супернатант использовать для выделения везикул ультрацентрифугированием при 108000 g. Полученный осадок затем ресуспендировать в 100 мкл фильтрованного и предварительно центрифугированного (108000 g) фосфатно-солевого буфера (PBS). Образцы ВВ в случае необходимости хранить в морозильнике при температуре -80°С.

2. Обработка эякулята для оплодотворения. В день получения эякулята выполнить его обработку стандартным методом центрифугирования в градиенте плотностей (согласно инструкции производителя).

3. Добавление ВВ-ФЖ в кулътуралъную среду с ооцит-кумулюсными комплексами. Разморозить ВВ-ФЖ при комнатной температуре (22-24°С) в течение 10 мин, затем нагреть в термостате при 37°С для дальнейшего использования в течение 10 мин (если ВВ-ФЖ были заморожены). В чашку с ооцит-кумулюсными комплексами добавить 10 мкл среды с ВВ-ФЖ и необходимое количество мужских половых клеток (100000 сперматозоидов на 1 ооцит), объем капли 100 мкл. Культивирование проводить в течение 18 часов. Оценить оплодотворение. Далее работать согласно стандартным операционным процедурам, принятым в клинике.

Необходимо отметить, что попытки увеличения подвижности сперматозоидов в программах ВРТ предпринимались неоднократно (Лучко и др., 2000; Lewis et al., 1993; Nassar et al., 1999; Elsraite et al., 2009). Однако ни один из предложенных методов не использует аутологичные биологические жидкости супружеских пар, которые проходят лечение бесплодия. Например, использование пентоксифилина (эуфиллина) возможно только для процедур ИКСИ и дифференцировки живых неподвижных сперматозоидов. Нет ни одного примера увеличения подвижности сперматозоидов для классического экстракорпорального оплодотворения.

Клинические примеры

1. Пациентка В., 25 лет, обратилась по поводу лечения бесплодия методами ВРТ. Проведено полное клиническое обследование мужчины и женщины согласно действующим нормативно-правовым актам. Выставлен диагноз: Фактор мужского бесплодия (астенозооспермия, процент прогрессивно-подвижных сперматозоидов PR%=8%). Супружеская пара категорически отказывалась от использования интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит. Именно поэтому было предложено применить внеклеточные везикулы фолликулярной жидкости женщины для повышения подвижности сперматозоидов. После подписания информированного добровольного согласия супружеская пара вступила в программу ВРТ. В день пункции фолликулов была собрана фолликулярная жидкость и из 5 мл выделены внеклеточные везикулы. Параметры эякулята в день оплодотворения: концентрация сперматозоидов 23 млн/мл, PR%=5%, морфологически нормальных сперматозоидов 4%. После обработки спермы было проведено оплодотворение в чашке Петри с добавлением внеклеточных везикул супруги. Из 12 зрелых ооцитов МП нормальное оплодотворение 2PN2PB наблюдали в 10 (83,3%). В полость матки был перенесен один эмбрион, наступила клиническая беременность.

2. Супружеская пара М., женщина 26 лет, мужчина 31 год, обратилась по поводу лечения бесплодия методами ВРТ и переноса эмбрионов. Из анамнеза 2 эктопические беременности с последующих удалением маточных труб. По результатам спермограммы астенотератозооспермия. Проведено полное клиническое обследование супругов. Супруге была проведена стимуляция овуляции по модифицированному короткому протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормонами, выполнена трансвагинальная пункция фолликулов, получено 3 зрелых ооцита. Показатели эякулята в день оплодотворения: 59 млн/мл, PR%=10%, морфологически нормальных сперматозоидов 3%. После обработки спермы процент прогрессивно-подвижных сперматозоидов снизился до 3%. По финансовым причинам проведение ИКСИ было затруднено. Супружеской паре было предложено сокультивирование ооцит-кумулюсных комплексов с внеклеточными везикулами фолликулярной жидкости. Пара подписала добровольное информированное согласие. Из 5 ооцит-кумулюсных комплексов оплодотворение наступило в 4 ооцитах (80%). На 5-е сутки культивирования один эмбрион на стадии бластоцисты был перенесен в полость матки. Наступила беременность, которая закончилась родами здоровым ребенком.

Таким образом, разработанная техника использования внеклеточных везикул фолликулярной жидкости для повышения подвижности сперматозоидов является эффективным методом работы с образцами спермы с астенозооспермией в программах лечения бесплодия методами ВРТ, что позволяет в некоторых случаях отказаться от использования ИКСИ и при этом повысить эффективность лечения.

Список литературы

1. Choe J, Shanks AL. In Vitro Fertilization. 2022 Sep 5. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2022 Jan-. PMID: 32965937.

2. Nguyen J, Fuhrmann G. Extracellular Vesicles - A Versatile Biomaterial. Adv Healthc Mater. 2022 Mar;11(5):e2200192. doi: 10.1002/adhm.202200192. PMID: 35233995.

3. Hasan MM, Reshi QUA, Lattekivi F, et al. Bovine Follicular Fluid Derived Extracellular Vesicles Modulate the Viability, Capacitation and Acrosome Reaction of Bull Spermatozoa. Biology (Basel). 2021;10(11):1154. Published 2021 Nov 9. doi:10.3390/biologyl0111154

4. Sysoeva AP, Makarova NP, Silachev DN, Lobanova NN, Shevtsova YA, Bragina EE, Kalinina EA, Sukhikh GT. Influence of Extracellular Vesicles of the Follicular Fluid on Morphofunctional Characteristics of Human Sperm. Bull Exp Biol Med. 2021 Dec;172(2):254-262. doi: 10.1007/s10517-021-05372-4. Epub 2021 Dec 2. PMID: 34855079.

5. Лучко H.A., Грищенко В.И., Кучков И.Н., Калугин Ю.В. Способ повышения подвижности спермиев человека. Патент №31979 А Украины, МПК 6 А61К 31/52, AO1N1. Опубл. В Б.И., 2000, №7-11, с. 168.

6. Lewis S., Moohan J., Thompson W. Effect of pentoxifylline on human sperm motility in normozoospermic individuals using computer-assisted analysis // Fert.andSteril. - 1993. - 59. -418-23.

7. Nassar A., Mahony M., Morshedi M. et al. Modulation of sperm tail protein tyrosine phosphorylation by pentoxifylline and its correlation with hyperactivated motility //Fert.andSteril. - 1999. - 71. - 919-23.

Elsraite O. et al. Effect of caffeine on human sperm motility in vitro //15th world congress on in vitro fertilization, 2009.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, репродуктологии и клинической эмбриологии, и касается увеличения подвижности сперматозоидов человека в программах экстракорпорального оплодотворения путем использования внеклеточных везикул фолликулярной жидкости. Способ включает применение внеклеточных везикул, выделенных методом ультрацентрифугирования из 5 мл фолликулярной жидкости, которые добавляют в чашку Петри с ооцит-кумулюсными комплексами и низкоподвижными сперматозоидами, 100000 сперматозоидов на 1 ооцит-кумулюсный комплекс, в соотношении: 10 мкл везикул к 100 мкл среды оплодотворения. Изобретение позволяет увеличить подвижность сперматозоидов человека в программах экстракорпорального оплодотворения и является эффективным методом работы с образцами спермы с астенозооспермией в программах лечения бесплодия методами ВРТ, что дает возможность в некоторых случаях отказаться от использования ИКСИ и при этом повысить эффективность лечения. 1 пр.

Способ увеличения подвижности сперматозоидов человека в программах экстракорпорального оплодотворения путем использования внеклеточных везикул фолликулярной жидкости отличается тем, что применяют внеклеточные везикулы, выделенные методом ультрацентрифугирования из 5 мл фолликулярной жидкости, которые добавляют в чашку Петри с ооцит-кумулюсными комплексами и низкоподвижными сперматозоидами, 100000 сперматозоидов на 1 ооцит-кумулюсный комплекс, в соотношении: 10 мкл везикул к 100 мкл среды оплодотворения.