СПОСОБ УДАЛЕНИЯ ЛИПОПЕПТИДОВ ИЗ РАСТВОРОВ И ИЗМЕНЕНИЕ ИХ СТРУКТУРЫ Российский патент 2022 года по МПК C07K1/12 C07K1/16 C07K7/06 

Предметом настоящего изобретения является способ извлечения липопептидов из растворов и изменения их структуры.

Биологические поверхностно-активные вещества - это поверхностно-активные вещества, вырабатываемые микроорганизмами или получаемые посредством биологического преобразования. Они биоразлагаемы, менее токсичны, а также более устойчивы к экстремальным условиям окружающей среды, чем их синтетические аналоги, в то же время обладая сильной способностью к снижению поверхностного натяжения на границе фазового перехода.

Липопептиды - группа биологических поверхностно-активных веществ, молекулы которых состоят из циклического пептида и цепи жирных β-оксикислот, присоединяемых за счет сложноэфирной (лактоновой) связи. Наиболее известный липопептид представлен сурфактином, вырабатываемым различными штаммами рода Bacillus. Он существует в форме ряда гомологов с разными длинами углеродных цепей в 12-17 атомов С. Как приводится в работе П. Биниарца и М. Лукашевича, «Прямой количественный анализ липопептидных биологических поверхностно-активных веществ в биологических образцах посредством ВЭЖХ и СВЭЖХ-МС требует изменения образца органическим растворителем», издание Appl. Microbiol. Biotechnol., том 101, 15, №11, сс. 4747-4759, 2017 г. Или же он имеет даже 18 атомов С, о чем говорится в работе С. Дюфо, М. Делье, К. Нотта, Б. Вателе и соавт. «Гемолитическая активность инновационных линейных аналогов сурфактина относительно их физико-химических свойств» («Hemolytic activity of new linear surfactin analogs in relation to their physico-chemical properties»), издание Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj., 2005 г., 1726, 87-95. Или же он представлен составом или последовательностью аминокислот в пептидном кольце.

Сурфактин может быть гидролизован под воздействием различных факторов, в результате приводящих к образованию новых биологических поверхностно-активных веществ с различными свойствами. Лактоновая или одна из пептидных связей подвергается гидролизу, что приводит к раскрытию циклического пептида и образованию линейных аналогов сурфактина.

Существуют известные случаи возникновения реакции гидролиза по щелочному сценарию, при которых сапонификация сложноэфирной связи возникает под воздействием гидроксида натрия NaOH) в метаноле, о чем говорится в заявке на патент US 20060166869; или же под действием метанолата натрия в метаноле, о чем говорится в работе Т. Имуры, С. Икэда, К. Абураи, Т. Таира и Д. Китамото «Образование разобщенных ламелл и взаимно-непрерывных кубических фаз из естественного циклического сурфактина и его линейных производных» («Interdigitated Lamella and Bicontinuous Cubic Phases Formation from Natural Cyclic Surfactin and Its Linear Derivatives), издание J. Oleo Sci., том 62, №7, cc. 499-503, 2013 г.; или под действием водного раствора натрия или гидроокиси аммония, как указано в патенте JPH0892279.

Существуют известные случаи кислотного гидролиза, о чем говорится в патенте JPH0892279. Он происходит в результате воздействия соляной кислоты на циклический сурфактин.

Также известен ферментативный гидролиз, индуцируемый ферментами, секретируемыми микроорганизмами. Штамм из рода стрептомицетов Mgl. вырабатывает фермент, гидролазу сурфактина, что также приводит к гидролизу лактоновых связей, о чем говорится в работе Б.К. Хефлера, К.В. Гожельника, Дж. И. Янга, Н. Хендрикса, П.К. Доррестайна и П.Д. Стрейта «Ферментативная резистентность к липопептиду сурфактину, определенная способом формирования изображения бактериальной конкуренции при масс-спектрометрии» («Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competitions), издание Proc. Natl. Acad. Sci., том. 109, №32, cc. 13082-13087, 2012 г. В свою очередь, эндопротеаза V8, полученная из золотистого стафилококка, провоцирует гидролиз пептидной связи между глутаминовой кислотой (L-Glul) и лейцином (L-Leu2), что описано в работе И. Гранжемара, Дж. Уаллака и Ф. Пейпу «Обеспечение гидролиза сурфактина посредством бактериальной эндопротеазы» («Evidence of surfactin hydrolysis by a bacterial endoprotease»), издание Biotechnol. Lett., том. 21, №3, cc. 241-244, 1999 г.). Также известны случаи ферментативного гидролиза других липопептидных соединений, например, антибиотика даптомицина. В публикации В.М. Д'Коста и соавт. «Инактивация липопетидного антибиотика даптомицина посредством механизмов гидролиза» («Inactivation of the lipopeptide antibiotic daptomycin by hydrolytic mechanisms»), издание Antimicrob. Agents Chemother., том. 56, №2, cc. 757-764, 2012 г. сообщается об исследовании способности к биоразложению посредством 60 актиномицетов, резистентных к даптомицину, из числа которых 44% спровоцировали гидролиз, а 29% - деацилирование даптомицина.

Линейные липопептиды также могут быть получены непосредственно за счет микроорганизмов. Три липопептида, полученных посредством штамма КСТС 1241 IВР сенной палочки, являются предметом заявки на патент KR 20180003520 А, поданной Х. Дж. Шином, Ф.С. Тареком, Х.С. Ли, Дж. С. Ли, И. Дж. Ли, М.А. Ли «Липотетрапептиды гагеостатинов, полученные из сенной палочки морского происхождения, обладающие противомикробным действием» («Gageostatins lipotetrapeptides produced from a marine-derived Bacillus subtilis having antimicrobial activity»). Они имеют состав аминокислот в пептидной части, аналогичный сурфактину, но разную хиральную конфигурацию 60 (LLLDLLL в сравнении с LLDLLDL в сурфактине). Также существует возможность генетической модификации микроорганизмов, вырабатывающих циклические липопептиды в естественном состоянии. Однако таким образом не были получены какие-либо линейные аналоги сурфактина, разве что кроме липопептидов с укороченной аминокислотной последовательностью (Ф. Де-Ферра, Ф. Родригес, О. Тортора, К. Тоси, Г. Гранди «Инженерия пептидных синтетаз. Ключевая роль тиоэстераза-подобного домена в эффективном получении рекомбинантных пептидов» («Engineering of peptide synthetases. Key role of the thioesterase-like domain for efficient production of recombinant peptides»), издание J. Biol. Cnem. 1997 г., 272, 25 304-25 309; Т. Штахельхаус, А. Шнайдер, М. Марахиэль «Рациональный дизайн пептидных антибиотиков целевым замещением доменов бактерий и грибков» («Rational design of peptide antibiotics by targeted replacement of bacterial and fungal domains»), издание Science 1995 г., 269, 69-72).

В случае ферментативного гидролиза пептидной связи его эффективность достигала 14%, в то время как ферментативный гидролиз лактоновой связи позволял достичь 95% преобразования циклического сурфактина в линейный. Щелочной гидролиз лактоновой связи привел к получению конечного продукта с КПД, равным 97%, в то время как КПД кислотного составил всего 56%. Однако для химического гидролиза требуется применение токсичных (метанол) и агрессивных соединений (NaOH, NH₃ Н₂О или НСl), что делает этот процесс менее экологически безопасным.

Задача по решению согласно настоящему изобретению заключается в получении продукта с высокой чистотой. Количество примесей в виде циклических форм липопептидов минимально и в то же время снижается применение экологически опасных химических веществ во время гидролиза.

Способ по настоящему изобретению основывается на том факте, что захват липопептидов и их секвестирована выполняются в водных растворах путем сорбции, а в случае с циклическими липопептидами, пептидное кольцо которых замыкается лактоновой связью, сорбция дополнительно связана с реакциями гидролиза, возникающими на поверхности активированного угля, что приводит к линеаризации в результате разрыва этой лактоновой связи.

Предпочтительно, чтобы процесс адсорбции и/или десорбции на активированном угле выполнялся с помощью микроволн, магнитного поля или электрического тока.

Также предпочтительно, чтобы этот процесс выполнялся в проточной или стационарной системе.

Предпочтительно, чтобы активированный уголь был представлен в виде гранулята, порошка или цельного куска.

Предпочтительно, чтобы площадь поверхности активированного угля составляла более 600 м²/г, а значение рН его водной суспензии - выше 6 единиц.

Также предпочтительно, чтобы сепарация линейных липопептидов осуществлялась известными способами.

Предпочтительно, чтобы строение линейных липопептидов, получаемых согласно настоящему способу, было представлено следующими химическими формулами:

где:

R¹ - алкильная группа с количеством атомов С>4, имеющая линейную изо- или антеизо-конфигурацию;

R² - пептид, терминированный посредством С-конца любой аминокислотной последовательности, имеющий длину, равную 4-12 аминокислотам.

Преимуществом решения является то, что гидролиз сурфактина на активированном угле в качестве катализатора представляет собой экологически безопасный процесс. Кроме того, активированный уголь - легкодоступный естественный продукт. Его можно использовать как многоразовый катализатор, а после применения он может быть легко и экономно восстановлен, например, посредством термообработки. Важным преимуществом гидролиза за счет активированного угля является то, что при этом сводится к минимуму использование экологически опасных химических веществ, таких как метанол, щелочи или кислоты. В данном случае гидролиз выполняется в водном растворе. Благодаря этому также можно получать продукт высокой чистоты с крайне малой долей примесей в виде циклических форм сурфактина. Продукты, получаемые с КПД, равным 95%, полностью биоразлагаемы.

Пример 1

Из раствора после ферментации, содержащего липопептидную смесь с преобладанием сурфактина, последний извлекают известным способом. Полученный водный раствор сурфактина концентрацией 0,8 мг/мл в объеме 100 мл помещают в коническую колбу объемом 250 мл. Далее добавляют 1 грамм активированного угля с размером частиц 0,2-1 мм и площадью пористой поверхности 650 м²/г, а также водную суспензию со значением рН, равным 8,5 единиц. Суспензию перемешивают с помощью встряхивателя в течение 72 часов при температуре 20°С. Спустя это время, раствор отделяют от активированного угля посредством фильтрации и центрифугирования. Адсорбированный сурфактин остается в активированном угле в объеме, составляющем 5% от изначально введенного в раствор. Оставшаяся часть сурфактина дает реакцию на поверхности активированного угля, образуя гидролизат сурфактина с линейной структурой, представленной в формулах (I) и (II).

Формулы линейных аналогов сурфактина с аминокислотными последовательностями L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu, в которых цепь жирных β-оксикислот состоит из 12 15 атомов C с линейной конфигурацией (I) или изо-конфигурацией (II).

Пример 2

Аналогично примеру 1, за исключением того, что концентрация водного раствора сурфактина составляет 2 мг/мл. Последовательно добавляют 3 грамма активированного угля с размером частиц 0,1-0,2 мм и площадью внутренней поверхности 750 м²/г, а также водную суспензию со значением рН, равным 9 единиц. Суспензию перемешивают с помощью встряхивателя в течение 72 часов при температуре 25°С. Спустя это время раствор отделяют от активированного угля посредством фильтрации и центрифугирования. Сурфактин адсорбируется активированным углем в объеме, составляющем 3% от изначально введенного в раствор. Оставшаяся часть сурфактина дает реакцию на поверхности активированного угля, образуя гидролизат сурфактина с линейной структурой. Смесь линейных продуктов сепарируют посредством подготовительной жидкофазной хроматографии в виде аналогов, различающихся по длине алкильной цепи, строение которых представлено формулой (III).

R¹ - алкильная цепь с 9-12 атомами С

Формула линейного аналога сурфактина с аминокислотной последовательностью L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu, в которой цепь жирных β-оксикислот состоит из 12-15 атомов C с линейной конфигурацией, изо-конфигурацией или антеизо-конфигурацией.

Пример 3

Аналогично примеру 1, за исключением того, что раствор сурфактина применяется в колонке. В колонку добавляют 20 грамм активированного угля в виде куска с размером ячейки 0,5×0,5 мм, толщиной стенки 0,5 мм, площадью пористой поверхности 750 м²/г и значением рН в водной суспензии, равным 9 единицам. При 25°C с помощью перистальтического насоса со скоростью 2000 мл/ч вводят водный раствор сурфактина с концентрацией 2 мг/мл. После прохождения слоя активированного угля раствор сливается в резервуар для обработки, из которого его извлекают с помощью насоса для проведения обработки в проточной системе. Проводят обработку в течение 48 часов. Сурфактин адсорбируется активированным углем в объеме, составляющем 10% от изначально введенного в раствор. Оставшаяся часть сурфактина дает реакцию на поверхности активированного угля, образуя гидролизаты сурфактина с линейной структурой, представленной в формулах (IV)-(VI), которые остаются в циркулирующем растворе. При обработке уголь может быть использован несколько раз. Регенерацию углерода можно выполнять внутри или снаружи колонки.

Формулы линейных аналогов сурфактина с аминокислотной последовательностью L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu, в которой цепь жирных β-оксикислот состоит из 7-9 атомов C с линейной (IV), изо- (V) или антеизо-конфигурацией (VI).

Пример 4

Аналогично примеру 1, за исключением того, что раствор сурфактина применяется в колонке. В колонку добавляют 20 грамм активированного угля в виде куска с размером ячейки 0,5×0,5 мм, толщиной стенки 0,5 мм, площадью внутренней поверхности 750 м²/г и значением рН в водной суспензии, равным 9 единицам. При протекании раствора к этому цельному куску подводят электрический ток. При 25°C с помощью перистальтического насоса со скоростью 2000 мл/ч вводят водный раствор сурфактина с концентрацией 2 мг/мл. После прохождения слоя активированного угля раствор сливается в резервуар для обработки, из которого его извлекают с помощью насоса для проведения обработки в проточной системе. Проводят обработку в течение 48 часов. Сурфактин абсорбируется активированным углем в объеме, составляющем 15% от изначально введенного в раствор. Оставшаяся часть сурфактина дает реакцию на поверхности активированного угля, образуя гидролизаты сурфактина с линейной структурой, представленной в формулах (VII)-(IX), которые остаются в циркулирующем растворе. При обработке уголь может быть использован несколько раз.

Формулы линейных аналогов сурфактина с аминокислотной последовательностью L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Ala-L-Asp-D-Leu-L-Leu, в которой цепь жирных β-оксикислот состоит из 7-9 атомов C с линейной (VII), изо- (VIII) или антеизо-конфигурацией (IX).

Пример 5

Аналогично примеру 4, за исключением того, что колонку помещают в микроволновой реактор.

Пример 6

Аналогично примеру 4, за исключением того, что колонку помещают в магнитное поле.

Пример 7

Липопептиды, полученные по способу, приведенному в примерах 1-6, были

проанализированы посредством жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Структуры линейных аналогов сурфактина, полученные по представленному способу, имеют следующий вид:

где:

R¹ - алкильная группа с количеством атомов С≥4, имеющая изо- или антеизо-конфигурацию;

R² - гептапептид с хиральной последовательностью LLDLLDL на С-конце и аминокислотной последовательностью, представленной в таблице 1

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ИНВЕНТИОНБИО СПОЛКА З ОГРАНИКЗОНА ОДПОВИЕДЗИАЛНОСЦИЯ

<120> Способ удаления липопептидов из растворов и изменение их

структуры

<140> PCT/IB2019/054480

<141> 2019-05-30

<150> PL425775

<151> 2018-05-30

<160> 19

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 1

Glu Leu Leu Val Asp Leu Leu

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 2

Glu Leu Leu Val Asp Leu Val

15

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 3

Glu Leu Leu Val Asp Leu Ile

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 4

Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ile

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 5

Glu Leu Leu Leu Asp Leu Val

15

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 6

Glu Leu Leu Ala Asp Leu Leu

15

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown <220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 7

Glu Leu Leu Leu Asp Leu Leu 1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 8

Glu Leu Leu Ile Asp Leu Leu

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 9

Glu Leu Leu Ile Asp Leu Ile

15

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 10

Glu Ile Leu Ile Asp Leu Ile

15

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 11

Glu Val Leu Val Asp Leu Val

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 12

Glu Ile Leu Val Asp Leu Val

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 13

Glu Ile Leu Val Asp Leu Ile

15

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 14

Gln Leu Leu Val Asp Leu Leu 15

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 15

Gln Leu Leu Val Asp Leu Val 15

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 16

Gln Leu Leu Val Asp Leu Ile

15

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 17

Gln Leu Leu Ala Asp Leu Leu 15

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина <400> 18

Gln Leu Leu Ala Asp Leu Val 1 5

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> линейные аналоги сурфактина

<400> 19

Gln Leu Leu Ala Asp Leu Ile

1 5

<---

Изобретение относится к способу извлечения липопептидов из растворов и изменения их структуры с циклической на линейную, в котором захват липопептидов и их секвестирование выполняются в водных растворах путем сорбции, а в случае с циклическими липопептидами, пептидное кольцо которых замыкается лактоновой связью, сорбция дополнительно связана с реакциями гидролиза, возникающими на поверхности активированного угля, что приводит к линеаризации в результате разрыва этой лактоновой связи. 5 з.п. ф-лы, 1 табл., 7 пр.

1. Способ извлечения липопептидов из растворов и изменения их структуры с циклической на линейную, отличающийся тем, что секреция липопептидов выполняется в водных растворах посредством сорбции, а в случае с циклическими липопептидами, пептидное кольцо которых замыкается лактоновой связью, сорбция дополнительно связана с реакциями гидролиза, возникающими на поверхности активированного угля, что приводит к линеаризации в результате разрыва этой лактоновой связи; также отличающийся тем, что площадь поверхности активированного угля составляет более 600 м²/г, а значение рН его водной суспензии - выше 6 единиц.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс адсорбции и/или десорбции на активированном угле выполняется с помощью микроволн, магнитного поля или электрического тока.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс выполняется в проточной или стационарной системе.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что активированный уголь представлен в виде гранулята, порошка или цельного куска.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сепарация липопептидов осуществляется известными способами.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что строение линейных липопептидов, получаемых согласно настоящему способу, представлено следующей химической формулой:

где:

R¹ - алкильная группа с количеством атомов С≥4, имеющая изо- или антеизо-конфигурацию;

R² - пептид, терминированный посредством С-конца любой аминокислотной последовательности, имеющий длину, равную 4-12 аминокислотам.