НОВЫЕ ФЕРМЕНТЫ CRISPR И СИСТЕМЫ Российский патент 2022 года по МПК C12N9/22 C12N15/10 C12N15/11 C12N15/90 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ И ВКЛЮЧЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ССЫЛКИ

[1] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявке на патент США №62/320231, поданной 8 апреля 2016 года, 62/181675, поданной 18 июня 2015 года, 62/285349, поданной 22 октября 2015 года, 62/296522, поданной 17 февраля 2016 года, и 62/320231, поданной 8 апреля 2016 года.

[2] Все документы, цитируемые или упоминаемые в процитированных в настоящей заявке документах, вместе с любыми инструкциями производителей, описаниями, характеристиками и технологической картой продукта, для любого из продуктов, упомянутых в настоящем описании или в любом документе, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, включены в настоящее описание в качестве ссылки и могут быть использованы при осуществлении изобретения. Более конкретно, все упоминаемые документы включены в качестве ссылки в той же степени, как если бы каждый отдельный документ был конкретно и индивидуально указан как включенный в качестве ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ О ФЕДЕРАЛЬНОМ СПОНСИРОВАНИИ ИССЛЕДОВАНИЯ

[3] Настоящее изобретение было сделано при поддержке правительственных грантов под номерами MH100706, MH110049, DK097768 и GM10407, присужденными Национальным Институтом Здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на изобретение.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[4] Настоящее изобретение относится к системам, способам и композициям, применяющимся для контроля экспрессии генов, включая нацеливание на последовательности, такое как изменение транскрипции генов или редактирование нуклеиновых кислот, в котором могут использоваться векторные системы, относящиеся к коротким палиндромным повторам, регулярно расположенным кластерами (CRISPR), и их компонентам.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[5] Последние достижения в способах секвенирования генома и анализа получаемых последовательностей существенно увеличили скорость каталогизации и картирования генетических факторов, ассоциированных с широким спектром биологических функций и заболеваний. Технологии направленного внесения изменений в геном необходимы для систематического поиска генетических вариаций, являющихся причинами заболеваний, а также для развития синтетической биологии, применений в биотехнологии и медицине. Несмотря на существование различных техник редактирования генома, таких как сконструированные цинковые пальцы, подобные активатору транскрипции эффекторы (TALE), хоминг-мегануклеазы, остается потребность в новых технологиях инженерии генома и транскриптома, в которых используются новейшие стратегии и молекулярные механизмы, и которые являются доступными, легко устанавливаемыми, масштабируемыми и способными к нацеливанию на множественно положений в пределах эукариотического генома и транскриптома. Это может обеспечить основной ресурс для новых подходов в генной инженерии и биотехнологии.

[6] Системы адаптивного иммунитета бактерий и архей CRISPR-Cas демонстрируют огромное разнообразие белкового состава и архитектуры геномных локусов. Локусы системы CRISPR-Cas включают более 50 семейств генов, и не существует строго универсальных генов, что указывает на быструю эволюцию и чрезвычайное разнообразие архитектуры локусов. На данный момент с использованием комплексного подхода примерно 395 профилей 93 Cas-белков были исчерпывающе идентифицированы как гены cas. Для классификации систем CRISPR-Cas используют профили генов и характерные особенности архитектуры локусов. В последней предложенной классификации системы CRISPR-Cas в самом общем виде разделены на два класса: системы 1 класса состоят из многосубъединичных эффекторных комплексов, а в системах 2 класса эффекторный модуль состоит из одного белка, например, белка Cas9 (фиг. 1A и 1B). Новые эффекторные белки, ассоциированные с системами CRISPR-Cas 2 класса, могут служить мощными инструментами для геномной инженерии и прогнозирование предполагаемых новых эффекторных белков и их конструирование и оптимизация представляются важными.

[7] Цитирование или указание на какой-либо документ в настоящей заявке не является признанием того, что такой документ доступен в качестве уровня техники для настоящего изобретения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[8] CRISPR-Cas является системой адаптивного иммунитета, которая защищает микроорганизмы от чужеродных генетических элементов путем интерференции ДНК или РНК-ДНК. Авторы изобретения изучили принадлежащий ко 2 классу типа IV однокомпонентный эффектор C2c2 CRISPR-Cas и охарактеризовали его как РНК-направленную РНК-азу. Авторы изобретения продемонстрировали, что C2c2 (к примеру, выделенный из Leptotrichia shahii) вызывает сильную интерференцию в ответ на заражение РНК-содержащим фагом. Путем биохимического анализа in vitro и анализов in vivo, авторы изобретения показали, что C2c2 может быть запрограммирован для расщепления оцРНК-мишеней, несущих протоспейсеры, фланкированные 3'-H (не G) последовательностями. Расщепление опосредуется каталитическими остатками в двух консервативных доменах HEPN C2c2, мутации в которых приводят к каталитически неактивному РНК-связывающему белку. C2c2 направляется единичной cr-РНК и может быть перепрограммирован для удаления конкретных мРНК in vivo. Авторы изобретения показали, что LshC2c2 может быть нацелен на конкретный представляющий интерес участок и может проявлять неспецифичную РНК-азную активность после стимуляции его РНК-мишенью. Эти результаты расширяют понимание систем CRISPR-Cas и демонстрируют возможность использования C2c2 для разработки широкого арсенала инструментов нацеливания на РНК.

[9] Существует острая необходимость разработки альтернативных и надежных систем и техник для нацеливания на нуклеиновые кислоты и полинуклеотиды (например, ДНК или РНК, а также любые их гибриды и производные) с широким спектром практических применений. Настоящее изобретение направлено на решение этой задачи и имеет ряд связанных с этим преимуществ. Обогащение существующего репертуара технологий нацеливания на представляющую интерес последовательность ДНК или РНК (таргетинга) в геноме и эпигеноме новыми системами, представленными в настоящем описании, может привести к преобразованиям не только в изучении, но и в изменении или редактировании определенных участков-мишеней путем прямого обнаружения, анализа и модификации. Чтобы эффективно использовать рассматриваемые в данной заявке системы геномного или эпигеномного нацеливания на ДНК или РНК без неблагоприятных последствий, важно понимать основные принципы инженерии и оптимизации этих инструментов нацеливния на ДНК или РНК.

[10] Эффекторный белок C2c2, относящийся к типу VI класса 2, является РНК-направленной РНК-азой, которая может быть эффективно запрограммирована на деградацию оцРНК. C2c2 производит отщепление РНК посредством консервативных основных остатков внутри двух его HEPN-доменов, в отличие от каталитических механизмов, известных для других РНК-аз, обнаруженных в системах CRISPR-Cas. Мутации в HEPN-домене, такие как замена (например, на аланин) в любом из четырех предсказанных каталитических остатков HEPN-домена превращает C2c2 в неактивный программируемый РНК-связывающий белок (dC2c2, аналогичный dCas9).

[11] Способность С2с2 связываться с определенными последовательностями может быть использована в нескольких аспектах согласно изобретению: (i) для доставки эффекторных модулей к определенным транскриптам с целью модулирования их функции или трансляции, что может быть использовано для крупномасштабного скрининга, конструирования синтетических регуляторных систем и других целей, (ii) для флуоресцентного мечения определенных РНК для визуализации их перемещений и/или локализации, (iii) для изменения локализации РНК посредством доменов с аффинностью к конкретным внутриклеточным компартментам, и (iv) для захвата определенных транскриптов (посредством их прямого связывания с C2c2 или с использованием C2c2 для локализации активности биотин-лигазы к определенным транскриптам) для увеличения содержания проксимальных молекулярных партнеров, включая РНК и белки.

[12] Активный C2c2 имеет большие перспективы практического применения. Одним из аспектов настоящего изобретения является нацеливание на конкретный транскрипт для разрушения, как в случае с RFP, описанного в настоящем описании. Кроме того, после стимуляции собственной мишенью C2c2 может расщеплять другие (некомплементарные) молекулы РНК in vitro и ингибировать рост клеток in vivo. В биологическом смысле, эта неспецифическая РНК-азная активность может находить отражение в защитном механизме систем CRISPR-Cas типа VI на основе запрограммированной клеточной смерти/покое PCD/D. Соответственно, в одном аспекте изобретения ее можно использовать для запуска PCD или покоя в конкретных клетках, например, злокачественных клетках, экспрессирующих определенный транскрипт, нейронах определенного класса, клетках, зараженных определенным патогеном, или других аберрантных клетках, присутствие которых нежелательно.

[13] Настоящее изобретение относится к способу модификации последовательностей нуклеиновых кислот, ассоциированных с локусом-мишенью или находящихся непосредственно в нем, причем способ включает доставку в указанный локус не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей эффекторный белок локусов системы CRISPR-Cas типа VI и один или более компонентов-нуклеиновых кислот, где эффекторный белок формирует комплекс с одним или более компонентами-нуклеиновыми кислотами и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок индуцирует модификацию последовательностей, ассоциированных с представляющим интерес локусом или находящихся непосредственно в нем. В предпочтительном варианте осуществления модификация представляет собой внесение разрыва цепи. В предпочтительном варианте осуществления последовательности в локусе-мишени, ассоциированные с ним или находящиеся непосредственно в нем, включают РНК или ДНК, и эффекторный белок кодируется локусами CRISPR-Cas типа VI.

[14] Будет понятно, что термины "фермент Cas", "фермент CRISPR", "белок CRISPR", "белок Cas" и "CRISPR Cas" используются обычно взаимозаменяемо и в каждом случае, когда они упоминаются в настоящем описании, обозначают новые эффекторные белки CRISPR, описанные далее в настоящем описании, если иное не следует из контекста, в частности при конкретном упоминании Cas9. Эффекторные белки CRISPR, описанные в настоящем описании, предпочтительно являются эффекторными белками C2c2.

[15] Изобретение относится к способу модификации последовательностей, ассоциированных с или находящихся в представляющем интерес локусе-мишени, причем способ включает доставку в указанные последовательности, ассоциированные с или находящиеся в локусе не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей эффекторный белок локусов C2c2 и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок C2c2 образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок индуцирует модификацию последовательностей, ассоциированных с или находящихся в представляющем интерес локусе-мишени. В предпочтительном варианте осуществления модификация представляет собой внесение разрыва цепи. В предпочтительном варианте осуществления эффекторный белок C2c2 образует комплекс с одним компонентом, являющимся - нуклеиновой кислотой, преимущественно сконструированным способами инженерии или не встречающимся в природе компонентом, являющимся нуклеиновой кислотой. Индукция модификации последовательностей, ассоциированных с или находящихся в представляющем интерес локусе-мишени, может направляться комплексом эффекторный белок C2c2-нуклеиновая кислота. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным компонентом, являющимся нуклеиновой кислотой, является РНК CRISPR (cr-RNA). В предпочтительном варианте осуществления компонентом, являющимся нуклеиновой кислотой, является зрелая cr-РНК или направляющая РНК, где зрелая cr-РНК или направляющая РНК содержит спейсерную последовательность (или направляющую последовательность) и содержащую прямые повторы последовательность либо ее производные. В предпочтительном варианте осуществления спейсерная последовательность или ее производное включает последовательность-затравку, причем последовательность-затравка имеет критическое значение для распознавания и/или гибридизации с последовательностью локуса-мишени. В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательности, ассоциированные с или находящиеся в целевом представляющем интерес локусе, содержат линейную или суперспиральную ДНК.

[16] Аспекты изобретения связаны с образованными эффекторным белком C2c2 комплексами, включающими один или более компонентов, являющихся не встречающимися в природе, или сконструированными способами инженерии, или модифицированными, или оптимизированными нуклеиновыми кислотами. В предпочтительном варианте осуществления изобретения компонент, являющийся нуклеиновой кислотой, комплекса может содержать направляющую последовательность, связанную с содержащей прямые повторы последовательностью, где содержащая прямые повторы последовательность содержит одну или более шпилечных структур или оптимизированные вторичные структуры. В определенных вариантах осуществления изобретения прямые повторы имеют длину минимум 16 п.н., такую как не менее 28 п.н., а также одну шпилечную структуру. В следующих вариантах осуществления изобретения прямые повторы могут иметь длину более 16 п.н., предпочтительно 17 п.н., такую как не менее 28 п.н., а также одну или более шпилечных структур или оптимизированных вторичных структур. В конкретных вариантах осуществления изобретения прямой повтор может быть модифицирован таким образом, чтобы он содержал один или более связывающих белки РНК-аптамеров. В предпочтительном варианте осуществления изобретения один или более аптамеров могут быть включены в качестве части оптимизированной вторичной структуры. Такие аптамеры могут быть способны к связыванию белка оболочки бактериофага. Белок оболочки бактериофага может быть выбран из группы, включающей Qβ, F2, GA, fr, JP501, MS2, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, ϕCb5, ϕCb8r, ϕCb12r, ϕCb23r, 7s и PRR1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используется белок оболочки бактериофага MS2. Изобретение также относится к компонентам вышеназванных комплексов, являющимся нуклеиновыми кислотами длиной 30 или более, 40 или более, а также 50 или более п.н.

[17] Изобретение относится к способам редактирования генома и изменения транскриптома, причем способ включает два или более этапа нацеливания на эффекторный белок C2c2 и расщепления. В определенных вариантах осуществления изобретения первый этап включает расщепление эффекторным белком C2c2 последовательностей, ассоциированных с локусом-мишенью, находящимся на большом расстоянии от последовательности-затравки, в то время как второй этап включает расщепление эффекторным белком С2с2 последовательностей в локусе-мишени. В определенных таких вариантах осуществления изобретения первый этап нацеливания эффекторного белка C2c2 приводит к образованию разрыва цепи, в то время как второй этап нацеливания эффекторного белка C2c2 приводит к второму разрыву цепи. В одном из вариантов осуществления изобретения один или более этапов нацеливания эффекторного белка C2c2 приводит к образованию разрыва с липкими концами, который может быть репарирован.

[18] Изобретением также относится к способу модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем способ включает доставку в указанный локус не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей эффекторный белок локусов С2с2 и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок С2с2 образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновой кислотой, и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени. В предпочитаемом варианте осуществления изобретения такой модификацией является разрыв цепи.

[19] В таких способах представляющий интерес локус-мишень может являться частью молекулы РНК. Помимо этого, представляющий интерес локус-мишень может являться частью молекулы ДНК, в определенных вариантах осуществления изобретения - частью транскрибированной молекулы ДНК. В таких способах представляющий интерес локус-мишень может быть частью молекулы нуклеиновой кислоты in vitro.

[20] В таких способах представляющий интерес локус-мишень может быть частью молекулы нуклеиновой кислоты в клетке. Такая клетка может быть как прокариотической, так и эукариотической. Такая клетка может быть клеткой млекопитающего. Такая клетка млекопитающего может быть клеткой отличного от человека примата, клеткой коровы, свиньи, грызуна или мыши. Такая клетка может быть клеткой домашней птицы, рыбы или креветки. Такая клетка может быть растительной клеткой, полученной из таких растений как маниок, кукуруза, сорго, пшеница или фиг. Такая клетка растения может также быть клеткой водоросли, дерева или овоща. Модификации, внесенные в такую клетку в соответствии с настоящим изобретением, могут быть выполнены таким образом, что такая клетка и ее потомки будут изменены с целью улучшить производство биологических продуктов, таких как антитела, крахмал, спирт или другой желаемый продукт клетки. Такие внесенные в клетку модификации в соответствии с настоящим изобретением могут быть способны приводить к тому, что клетка или ее дочерние клетки будут иметь свойство производить измененный продуцируемый биологический продукт.

[21] Клетка млекопитающего может быть клеткой отличного от человека млекопитающего, например, клеткой примата, коровы, овцы, свиньи, собаки, грызуна, представителя семейства Leporidae, клеткой такого млекопитающего как обезьяна, клеткой коровы, овцы, свиньи, собаки, кролика, крысы или мыши. Клетка может быть эукариотической клеткой не являющегося млекопитающим животного, такого как домашняя птица (например, курицы), позвоночной рыбы (например, лосося) или беспозвоночного (например, устрицы, двустворчатого моллюска, лобстера, креветки). Такая клетка может быть также клеткой растения. Такая растительная клетка может быть получена из однодольного растения или двудольного растения, а также сельскохозяйственного растения или злака, такого как маниок, кукуруза, сорго, соя, пшеница, овес или фиг. Такая растительная клетка может быть также быть клеткой водоросли, дерева или растения-продуцента, фрукта или овоща (например, дерева такого как цитрусовые деревья, например, апельсина, грейпфрута или лимона; персика или нектарина; яблони и груши; орехоносного дерева, такого как миндаль, грецкий орех или фисташка; пасленового растения; растения рода Brassica; растения рода Lactuca; растения рода Spinacia; растения рода Capsicum; хлопка, табака, спаржи, моркови, капусты, брокколи, цветной капусты, томата, баклажана, перца, латука, шпината, клубники, черники, малины, ежевики, винограда, кофе, какао и т.д.)

[22] Изобретение относится к способу модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем способ включает доставку в указанный локус не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа IV и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок образует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, причем после связывания указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени. В предпочитаемом варианте осуществления изобретения такой модификацией является разрыв цепи.

[23] В таких способах представляющий интерес локус-мишень может являться частью молекулы ДНК или молекулы РНК. В предпочитаемом варианте осуществления изобретения представляющий интерес локус-мишень представляет собой РНК.

[24] Настоящее изобретение также относится к способу модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем способ включает доставку в указанный локус не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей эффекторный белок локуса C2c2 и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где эффекторный белок C2c2 формирует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени. В предпочитаемом варианте осуществления изобретения такой модификацией является разрыв цепи.

[25] В таких способах представляющий интерес локус-мишень может являться частью нуклеиновой кислоты in vitro. В таких способах представляющий интерес локус-мишень может являться частью нуклеиновой кислоты, находящейся в клетке. В способе по настоящему изобретению предпочтительно, чтобы представляющий интерес локус-мишень являлся частью молекулы РНК in vitro. В таких способах также предпочтительно, чтобы представляющий интерес локус-мишень являлся частью молекулы РНК, находящейся в клетке. Такая клетка может быть прокариотической или эукариотической. Такая клетка может быть клеткой млекопитающего. Такая клетка может быть клеткой грызуна. Такая клетка может быть клеткой мыши.

[26] В любом из описанных способов представляющий интерес локус-мишень может быть геномным или эпигеномным представляющим интерес локусом. В любом из описанных способов такой комплекс может быть доставлен при помощи многих направляющих молекул для мультиплексированного использования. В каждом из описанных способов может быть использовано более одного белка.

[27] В следующих аспектах изобретения компоненты, являющиеся нуклеиновыми кислотами, могут включать предполагаемую последовательность РНК CRISPR (cr-РНК). Не ограничиваясь этим, заявители предполагают, что в таких случаях пре-cr-РНК может содержать вторичную структуру, обеспечивающую как процессинг с образованием зрелой cr-РНК, так и загрузку cr-РНК в эффекторный белок. В качестве неограничивающего примера, такая вторичная структура может содержать, по существу состоять или состоять из шпилечной структуры в пре-cr-РНК, в частности в составе прямого повтора.

[28] В любом из описанных способов эффекторный белок и компоненты, являющиеся нуклеиновыми кислотами, могут быть предоставлены посредством одной или более полинуклеотидных молекул, кодирующих белок и/или компонент(ы), являющийся нуклеиновой кислотой, причем одна или более полинуклеотидных молекул функционально приспособлены для экспрессии белка и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой. Одна или более полинуклеотидных молекул могут содержать один или более регуляторных элементов, функционально приспособленных для экспрессии белка и/или компонента(ов), являющегося нуклеиновой кислотой. Одна или более полинуклеотидных молекул может находиться в одном или более векторах. В любом из описанных способов представляющий интерес локус-мишень может быть геномным или эпигеномным представляющим интерес локусом. В любом из описанных способов комплекс может быть доставлен с использованием множественных направляющих молекул для мультиплексированного использования. В любом из описываемых способов может быть использовано более одного белка.

[29] В любом из описанных способов разрыв цепи может быть одноцепочечным или двухцепочечным разрывом.

[30] Регуляторные элементы могут включать индуцибельные промоторы. Полинуклеотиды и/или векторные системы могут являться индуцибельными системами.

[31] В любом из описанных способов одна или более полинуклеотидных молекул могут быть включены в систему доставки, или один или более векторов могут быть включены в систему доставки.

[32] В любом из описанных способов такую не встречающуюся в природе или сконструированную способами инженерии композицию можно доставлять при помощи липосом, и других частиц, включая наночастицы, экзосомы, микровезикулы, генные пушки или одного или более вирусных векторов.

[33] Также изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, которая представляет собой композицию, имеющую характеристики, описанные в настоящем описании или определенные в любом из описанных в настоящем описании способов.

[34] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, в частности, композиции, способной или приспособленной для модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем указанная композиция включает эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа VI и один или более компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, причем такой эффекторный белок формирует комплекс с одним или более компонентами, являющимися нуклеиновыми кислотами, и при связывании указанного комплекса с представляющим интерес локусом такой эффекторный белок индуцирует модификацию представляющего интерес локуса-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения, такой эффекторный белок может быть эффекторным белком локусов С2с2.

[35] Также в следующем аспекте настоящее изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, в частности, композиции, способной или приспособленной для модификации представляющего интерес локуса-мишени, причем указанная композиция включает: (a) молекулу направляющей РНК (или комбинацию молекул направляющей РНК, например, первую молекулу направляющей РНК-гида или вторую молекулу направляющей РНК) или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу направляющей РНК (или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих комбинацию молекул направляющих РНК); (b) эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа VI или нуклеиновую кислоту, кодирующую эффекторный белок локусов CRISPR-Cas типа VI. В некоторых вариантах осуществления такой эффекторный белок может быть эффекторным белком локуса С2с2.

[36] Еще один аспект изобретения также относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, которая: (a) содержит молекулу направляющей РНК (или комбинацию молекул направляющей РНК, например, первую молекулу направляющей РНК и вторую молекулу направляющей РНК) или нуклеиновую кислоту, кодирующую комбинацию молекул направляющих РНК; (b) является эффекторным белком локуса C2c2.

[37] Также изобретение относится к векторной системе, включающей один или более векторов, причем один или более векторов содержат одну или более полинуклеотидных молекул, кодирующих компоненты с не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композицией, которая представляет собой композицию, обладающую характеристиками, которые определены в любом из описанных в настоящем описании способов.

[38] Также изобретение относится к системе доставки, содержащей один или более векторов или одну или более полинуклеотидных молекул, причем один или более векторов или полинуклеотидных молекул включают одну или более полинуклеотидных молекул, кодирующих компоненты не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, которая представляет собой композицию, имеющую характеристики, описанными в настоящем описании или определенными в любом из описанных способов.

[39] Также изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, или одному или более полинуклеотидам, кодирующим компоненты указанной композиции, или к вектору либо системе доставки, содержащим один или более полинуклеотидов, кодирующих компоненты указанной композиции для использования в терапевтическом способе лечения. Такой терапевтический способ лечения может включать генное или транскриптомное редактирование или генную терапию.

[40] Также изобретение относится к вычислительным (биоинформатическим) способам и алгоритмам прогнозирования новых систем CRISPR-Cas 2 класса и идентификации их компонентов.

[41] Также изобретение относится к способам и композициям, в которых один и несколько аминокислотных остатков эффекторного белка могут быть модифицированы, например, в сконструированном способами инженерии или не встречающемся в природе эффекторном белке или C2c2. В одном из вариантов осуществления изобретения модификация может включать мутацию одного или более аминокислотных остатков эффекторного белка. Одна или более мутаций могут быть локализованы в одном или более каталитических доменах эффекторного белка. Нуклеазная активность такого эффекторного белка может быть снижена или отсутствовать по сравнению с эффекторным белком, не имеющим указанную одну или более мутаций. Такой эффекторный белок может быть не способен направлять расщепление цепи ДНК или РНК в представляющем интерес локусе-мишени. Предпочтительный вариант осуществления включает две таких мутаций. В предпочтительном варианте осуществления изобретения такие один или более аминокислотных остатков модифицированы в эффекторном белке С2с2, например, в сконструированном способами инженерии или не встречающемся в природе эффекторном белке или C2c2. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие один или более модифицированных либо имеющих мутации аминокислотных остатков находятся в C2c2 и соответствуют R597, H602, R1278 и H1283 (с отсылкой к аминокислотам в Lsh C2c2 и консенсусной нумерации C2c2), включая R597A, H602A, R1278A и HI283A, или соответствуют аминокислотным остаткам в ортологах Lsh C2c2.

[42] В конкретных вариантах осуществления изобретения, такие один или более модифицированных или мутантных аминокислотных остатков являются модифицированными аминокислотными остатками C2c2, соответствующими K2, КЗ9, V40, E479, L514, V518, N524, G534, K535, E580, L597, V602, D630, F676, L709, I713, R717 (HEPN), N718, H722 (HEPN), E773, P823, V828, I879, Y880, F884, Y997, L1001, F1009, L1013, Y1093, L1099, L1111, Y1114, L1203, D1222, Y1244, L1250, L1253, K1261, I1334, L1355, L1359, R1362, Y1366, E1371, R1372, D1373, R1509 (HEPN), H1514 (HEPN), Y1543, D1544, К1546, К1548, V1551, I1558, в соответствии с нумерацией консенсусного C2c2. В определенных вариантах осуществления один или более модифицированных либо мутантных аминокислотных остатков являются одним или более аминокислотными остатками C2c2, соответствующими R717 и R1509. В некоторых аспектах осуществления такие один или более модифицированных либо мутантных аминокислотных остатков являются одним или более аминокислотными остатками C2c2, соответствующими K2, K39, K535, K1261, R1362, R1372, К1546 и K1548. В некоторых аспектах осуществления указанные мутации приводят к тому, что белок имеет измененную или модифицированную активность. В некоторых вариантах осуществления указанные мутации приводят к тому, что белок имеет увеличенную активность. В некоторых вариантах осуществления указанные мутации приводят к тому, что такой белок имеет увеличенную активность, например, за счет увеличенной специфичности. В некоторых вариантах осуществления указанные мутации приводят к тому, что такой белок имеет сниженную активность, например, за счет сниженной специфичности. В некоторых вариантах осуществления указанные мутации приводят к тому, что такой белок не имеет каталитической активности (так называемый "мертвый" C2c2). В одном из вариантов осуществления указанные мутации соответствуют аминокислотным остаткам Lsh C2c2 или соответствующим аминокислотными остаткам белка C2c2 других биологических видов.

[43] Также изобретение относится к одной или более мутациям или к двум или более мутациям в каталитически активном домене эффекторного белка. В некоторых вариантах осуществления изобретения такой каталитически активный домен может являться одним из доменов RuvCI, RuvCII или RuvCIII либо каталитически активным доменом, гомологичным доменам RuvCI, RuvCII и RuvCIII и т.д. или любому соответствующему домену, как описано в любом из описанных в настоящем описании способов. В некоторых вариантах осуществления такие одна или более мутаций могут быть локализованы в каталитически активном домене эффекторного белка, являющемся доменом HEPN, или каталитически активном домене, гомологичном домену HEPN. Такой эффекторный белок может иметь один или более доменов, являющихся сигналом ядерной локализации (NLS). Такие один или более гетерологичных функциональных доменов могут содержать по меньшей мере два или более доменов NLS. Такие один или более доменов NLS могут быть расположены в конце или вблизи конца последовательности эффекторного белка (например, C2c2), а в случае двух и более NLS каждый из этих двух может быть расположен вблизи конца эффекторного белка (например, C2c2). Такие один или более гетерологичных функциональных доменов могут являться одним или более доменами активации трансляции. В других вариантах осуществления такой функциональный домен может являться доменом активации трансляции, например, VP64. Такие один или более функциональных доменов могут являться одним или более доменами репрессии транскрипции. В некоторых вариантах осуществления такой домен репрессии транскрипции является доменом KRAB или доменом SID (например, SID4X). Такие один или более гетерологичных функциональных доменов могут являться одним или более нуклеазными доменами. В предпочтительном варианте осуществления нуклеазный домен является доменом Fok1.

[44] Также изобретение относится к одному или более гетерологичным функциональным доменам следующих типов активности: метилазная активность, деметилазная активность, активация транскрипции, репрессия транскрипции, активность фактора терминации транскрипции, модификация гистонов, нуклеазная активность, расщепление одноцепочечной РНК, расщепление двухцепочечной РНК, расщепление одноцепочечной ДНК, расщепление двухцепочечной ДНК и связывание нуклеиновых кислот. По меньшей мере один или более гетерологичных функциональных доменов могут находиться в N-конце эффекторного белка или вблизи него, при этом также по меньшей мере один или более гетерологичных функциональных доменов могут находиться в C-конце эффекторного белка или вблизи него. Такой один или более гетерологичных функциональных доменов могут быть слиты с таким эффекторным белком. Такие один или более гетерологичных функциональных доменов могут быть присоединены к такому эффекторному белку. Такие один или более гетерологичных функциональных доменов могут быть соединены с таким эффекторным белком посредством связующей группы.

[45] Также изобретение относится к эффекторному белку, включающему эффекторный белок из организма, относящегося к одному из следующих родов: Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium или Acidaminococcus. Такой эффекторный белок может представлять собой химерный эффекторный белок, первый фрагмент которого получен из первого ортолога эффекторного белка, а второй фрагмент - из второго ортолога эффекторного белка, причем первый и второй ортологи эффекторного белка различаются. По меньшей мере один из первого и второго ортологов эффекторного белка может представлять собой эффекторный белок одного из следующих организмов: Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium,Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Methylobacterium или Acidaminococcus.

[46] В некоторых вариантах осуществления изобретения такой эффекторный белок, в частности, эффекторный белок локусов типа V, а более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, в частности C2c1p, может происходить из, быть получен из или являться производным метаболизма бактерий, относящегося к таким таксонам как Bacilli, Verrucomicrobia, альфа-протеобактерии или дельта-протеобактерии. В некоторых вариантах осуществления такой эффекторный белок, в частности, эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов V-B типа, в частности C2c1p, может происходить из, быть выделен из или являться производным метаболизма бактерий, относящихся к одному из следующих родов: Alicyclobacillus, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Desulfatirhabdium, Citrobacter, и Methylobacterium. В некоторых вариантах осуществления такой эффекторный белок, в частности, эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, в частности C2c1p, может происходить из, быть выделен из или являться производным метаболизма следующих бактерий: Alicyclobacillusacidoterrestris (например, ATCC 49025), Alicyclobacilluscontaminans (например, DSM 17975), Desulfovibrioinopinatus (например, DSM 10711), Desulfonatronumthiodismutans (например, штамм MLF-1), Opitutaceaebacterium TAV5, Tuberibacilluscalidus (например, DSM 17572), Bacillusthermoamylovorans (например, штамм B4166), Brevibacillussp. CF112, Bacillussp. NSP2.1, Desulfatirhabdiumbutyrativorans (например, DSM 18734), Alicyclobacillusherbarius (например, DSM 13609), Citrobacterfreundii (например, ATCC 8090), Brevibacillusagri (например, BAB-2500), Methylobacteriumnodulans (например, ORS 2060). В некоторых вариантах осуществления такой эффекторный белок, в частности, эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, в частности C2c1p, может происходить из, быть выделен из являться производным метаболизма бактерий из перечня, приведенного в таблице на фиг. 41A-B.

[47] В некоторых вариантах осуществления такой эффекторный белок, а именно белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, в частности C2c1p, может содержать, по существу состоять или состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из перечня, включающего аминокислотные последовательности, представленные на множественном выравнивании последовательностей на фиг. 13D-H.

[48] В некоторых вариантах осуществления локус типа V-B, как подразумевается в настоящем описании, может кодировать слитую конструкцию Cas1-Cas4, Cas2 и эффекторный белок C2c1p. В некоторых вариантах осуществления локус типа V-B, как подразумевается в настоящем описании, может примыкать к последовательности CRISPR. Характерная организация локусов типа V-B проиллюстрирована на фиг. 9 и фиг. 41A-B.

[49] В некоторых вариантах осуществления белок Cas1, кодируемый локусом типа V-B, как подразумевается в настоящем описании, может группироваться с системой типа I-U. На фиг. 10A и 10B и 10C-V проиллюстрировано дерево Cas1, включая Cas1, кодируемый репрезентативными локусами типа V-B.

[50] В определенных вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, а частности - C2c1p, например, природный C2c1p, может иметь длину от приблизительно 1100 до приблизительно 1500 аминокислот, например, от приблизительно 1100 до приблизительно 1200, или от приблизительно 1200 до приблизительно 1300 аминокислот, или от приблизительно 1300 до приблизительно 1400 аминокислот, или от приблизительно 1400 до приблизительно 1500 аминокислот, например, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400, или приблизительно 1500 аминокислот.

[51] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, в частности - C2c1p, и предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка, содержит три каталитических мотива RuvC-подобной нуклеазы (т.е. RuvCI, RuvCII и RuvCIII). В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок и предпочтительно С-концевая часть указанного эффекторного белка может далее содержать область, соответствующую мостиковой спирали (также известной как богатый аргинином кластер), которая в белке Cas9 участвует в связывании cr-РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок и предпочтительно C-концевая часть указанного белка может далее включать домен, содержащий цинковый палец, который может быть неактивным (т.е. который не связывает цинк, например, в котором Zn-связывающие остатки цистеина отсутствуют). В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок и предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка может содержать три каталитических мотива RuvC-подобной нуклеазы (т.е. RuvCI, RuvCII и RuvCIII), область, соответствующую мостиковой спирали, домен, содержащий цинковый палец, предпочтительно в следующем порядке, от N- к C-концу: RuvCI-мостиковая спираль-RuvCII-цинковый палец-RuvCIII См. Фиг. 11, фиг. 12 и фиг. 13A и 13C для иллюстрации доменной архитектуры представителей эффекторных белков типа V-B.

[52] В некоторых вариантах осуществления изобретения локусы типа V-B, как описано в настоящем описании, могут содержать CRISPR-повторы длиной от 30 до 40 п.н., более типично от 34 до 38 п.н., еще более типично - от 36 до 37 п.н., например, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 п.н.

[53] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно - эффекторный белок локусов типа V-C, в частности - C2c3p может происходить, быть изолирован или получен из бактериального метагенома, выбранного из бактериальных метагеномов, перечисленных в таблице на фиг. 43 A-B.

[54] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-C, в частности - C2c3p, может включать, состоять в основном из или состоять только из аминокислотной последовательности, выбранной из группы аминокислотных последовательностей, показанных на множественном выравнивании последовательностей на фиг. 131.

[55] В некоторых вариантах осуществления изобретения локус типа V-C, как описано в настоящем описнаии, может кодировать эффекторный белок Cas1 и C2c3p. См. Фиг. 14 и фиг. 43A-B для иллюстрации организации характерных локусов типа V-С.

[56] В некоторых вариантах осуществления изобретения белок Cas1, кодируемый локусом типа V-С, как описано в настоящем описании, может образовывать кластеры с системой типа I-B. См. Фиг. 10A и 10B и фиг. 10C-W, иллюстрирующие дерево Cas-белков, включающее белок Cas1, кодируемый характерными локусами типа V-С.

[57] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-С, еще более конкретно - C2c3p, в частности C2c3p, может иметь длину от приблизительно 1100 до приблизительно 1500 аминокислот, например, от приблизительно 1100 до приблизительно 1200 аминокислот, или от приблизительно 1200 до приблизительно 1300 аминокислот, или от приблизительно 1300 до приблизительно 1400 аминокислот, или от приблизительно 1400 до приблизительно 1500 аминокислот, например, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400 или приблизительно 1500 аминокислот, или как минимум приблизительно 1100, как минимум приблизительно 1200, как минимум приблизительно 1300, как минимум приблизительно 1400 или как минимум приблизительно 1500 аминокислот.

[58] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-С, в частности - C2c3p, предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка, включает три каталитических мотива RuvC-подобной нуклеазы (т.е., RuvCI, RuvCII и RuvCIII). В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок, предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка, может содержать область, соответствующую мостиковой спирали (также известной как богатый аргинином кластер), которая в белке Cas9 участвует в связывании cr-РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок, предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка, может далее включать домен цинкового пальца. Предпочтительно сохранение Zn-связывающих остатков цистеина в C2c3p. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный эффекторный белок, предпочтительно C-концевая часть указанного эффекторного белка, может включать три каталитических мотива RuvC-подобной нуклеазы (т.е., RuvCI, RuvCII и RuvCIII), область, соответствующую мостиковой спирали, и домен цинкового пальца, предпочтительно в следующем порядке с N к C концу: RuvCI-мостиковая спираль-RuvCII-цинковый палец-RuvCIII. См. Фиг. 13A и 13C для иллюстрации характерной доменной архитектуры эффекторных белков типа V-С. В конкретных вариантах осуществления указанный эффекторный белок может включать два HEPN каталитических мотива, как показано на фиг. 97(A).

[59] В некоторых вариантах осуществления изобретения локусы типа V-С, как предполагается в настоящем описании, могут содержать CRISPR-повторы длиной от 20 до 30 п.н., более типично от 22 до 27 п.н. длиной, и еще более типично 25 п.н. длиной, например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, или 30 п.н.

[60] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно эффекторный белок локусов типа VI, в частности C2c2p, может происходить, быть выделенными или полученным из бактерий, принадлежащих к таксонам альфа-протеобактерии, Bacilli, Clostridia, Fusobacteria и Bacteroidetes. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретнее эффекторный белок локусов типа VI, в частности - C2c2p, может происходить, быть выделенным или полученным из бактерий, принадлежащих к одному из следующих родов: Lachnospiraceae, Clostridium, Carnobacterium, Paludibacter, Listeria, Leptotrichia и Rhodobacter. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно эффекторный белок локусов типа VI, в частности C2c2p, может происходить, быть выделенным или полученным из следующих видов бактерий: Lachnospiraceaebacterium MA2020, Lachnospiraceaebacterium NK4A179, Clostridiumaminophilum (например, DSM 10710), Lachnospiraceaebacterium NK4A144, Carnobacteriumgallinarum (например, DSM 4847 штамм MT44), Paludibacterpropionicigenes (например, WB4), Listeriaseeligeri (например, серовар штамм SLCC3954), Listeriaweihenstephanensis (например, FSL R9-0317 c4), Listerianewyorkensis (например, штамм FSL M6-0635), Leptotrichiawadei (например, F0279), Leptotrichiabuccalis (например, DSM 1135), Leptotrichiasp. Oraltaxon 225 (например, str. F0581), Leptotrichiasp. Oraltaxon 879 (например, штамм F0557), Leptotrichiashahii (например, DSM.19757), Rhodobactercapsulatus (например, SB 1003, R121, или DE442). В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок, более конкретно эффекторный белок локусов типа V, еще более конкретно - C2c2p может происходить, быть выделенным или полученным из видов бактерий, перечисленных в таблице в фиг. 42А-В. В конкретных вариантах осуществления белок C2c2 происходит из Leptotrichiashahii (например, DSM 19757).

[61] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно, эффекторный белок локусов типа VI, в частности - C2c2p, может содержать, состоять только из или включать аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, показанных на множественном выравнивании на фиг. 13J-N или, более конкретно, состоящих из аминокислотных последовательностей, показанных на выравнивании на фиг. 110.

[62] В некоторых вариантах осуществления изобретения локус типа VI, как предполагается в рамках настоящего изобретения, может кодировать эффекторные белки Cas1, Cas2 и C2c2p. В некоторых вариантах осуществления изобретения локус типа V-С, как предполагается в рамках настоящего изобретения, может содержать последовательность CRISPR. В некоторых вариантах осуществления изобретения локус типа V-С, как предполагается в рамках настоящего изобретения, может содержать ген c2c2 и последовательность CRISPR, и не содержать гены cas1 и cas2. См. Фиг. 15 и фиг. 42A-В для иллюстрации характерной организации локусов типа VI.

[63] В некоторых вариантах осуществления изобретения белок Cas1, кодируемый локусом типа VI, как предполагается в рамках настоящего изобретения, может образовывать кластеры с поддеревом типа II, включая небольшую ветвь типа III-A, или внутри системы типа III-A. См. Фиг. 10A и 10B и фиг. 10C-W, на которых изображено дерево Cas1, включающее белок Cas1, кодируемый типичными локусами типа VI.

[64] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа VI, в частности C2c2p, например природный C2c2p, может быть от приблизительно 1000 до приблизительно 1500 аминокислотных остатков длиной, таким как от приблизительно 1100 до приблизительно 1400 аминокислот длиной, например, от приблизительно 1000 до приблизительно 1100 аминокислот длиной, от приблизительно 1100 до приблизительно 1200 аминокислот длиной, или от приблизительно 1200 до приблизительно 1300 аминокислот длиной, или от приблизительно 1300 до приблизительно 1400 аминокислот длиной, или от приблизительно 1400 до приблизительно 1500 аминокислот длиной, например, приблизительно 1000, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400 или приблизительно 1500 аминокислот длиной.

[65] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно эффекторный белок локусов типа VI, а частности C2c2p, содержит как минимум один или предпочтительно как минимум два, наиболее предпочтительно ровно два, консервативных мотива RxxxxH. Каталитические RxxxxH-мотивы характерны для HEPN-доменов (домен, связывающийся с ДНК, присутствующий у эукариот и прокариот). Следовательно, в некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно эффекторный белок локусов типа VI, в частности - C2c2p, содержит как минимум один или предпочтительно как минимум два, наиболее предпочтительно ровно два, HEPN-домена. См. Фиг. 11 и фиг. 13B и фиг. 110A для иллюстрации характерной доменной архитектуры эффекторных белков типа VI. В некоторых вариантах осуществления изобретения HEPN-домены могут обладать РНК-азной активностью. В других вариантах осуществления изобретения HEPN-домены могут обладать ДНК-азной активностью.

[66] В некоторых вариантах осуществления изобретения локусы типа VI, как предполагается в рамках настоящего изобретения, могут содержать CRISPR-повторы длиной от 30 до 40 п.н., более типично длиной от 35 до 39 п.н., например, длиной 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, или 40 п.н. В конкретных вариантах осуществления изобретения длина прямого повтора составляет как минимум 25 п.н.

[67] В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность, прилегающая к протоспейсеру (PAM), или PAM-подобный мотив управляет связыванием эффекторного белкового комплекса с представляющим интерес локусом-мишенью, как описано настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения, PAM может представлять собой 5'-PAM (т.е. быть расположенным выше 5'-конца протоспейсера). В других вариантах осуществления изобретения PAM может представлять собой 3'-PAM (т.е. быть расположенным ниже 5'-конца протоспейсера). Термин "PAM" может быть использован взаимозаменяемо с термином "PFS" или "участок, фланкирующий протоспейсер" или "последовательность, фланкирующая протоспейсер".

[68] В предпочтительном варианте осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно эффекторный белок локусов типа V-B, еще более конкретно - C2c1p, может распознавать 5'-PAM. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа V, более конкретно - эффекторный белок локусов типа V-B, еще более конкретно - C2c1p, может распознавать 5'-PAM, который является 5'-TTN- или 5'-ATTN-последовательностью, где N - это A, C, G или T. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может быть белком C2c1p бактерии Alicyclobacillus acidoterrestris, более предпочтительно - белком ATCC 49025 C2c1p бактерии Alicyclobacillus acidoterrestris, в котором 5'-PAM представлен 5'-последовательностью TTN, где N - это A, C, G или T, более предпочтительно где N - это A, G или T. В других наилучших вариантах осуществления изобретения эффекторный белок является белком C2c1p бактерии Bacillus thermoamylovorans, более предпочтительно - белком C2c1p штамма B4166 бактерии Bacillusthermo amylovorans, в котором 5'-PAM представлен 5'-последовательностью ATTN, где N - это A, C, G или T.

[69] В предпочтительном варианте осуществления изобретения эффекторный белок, конкретно эффекторный белок локусов типа VI, более конкретно - C2c2p, может распознавать 3'-PAM. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, а именно - эффекторный белок локусов типа VI, в частности - C2c2p, может распознавать 3'-PAM, который представлен 5'-H, где H - это A, C или U. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может быть белком C2c2p бактерии Leptotrichia shahii, более предпочтительно - белком DSM 19757 C2c2 бактерии Leptotrichia shahii, в котором 5'-PAM представлен 5'-H.

[70] В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR сконструирован способами инженерии и может содержать одну и несколько мутаций, которые уменьшают или полностью устраняют нуклеазную активность. Мутации также могут быть внесены в соседние остатки, например, в аминокислоты возле указанных выше, которые обеспечивают нуклеазную активность. В некоторых вариантах осуществления изобретения только один HEPN-домен инактивирован, в других вариантах, второй HEPN-домен тоже инактивирован.

[71] В некоторых вариантах осуществления изобретения направляющая РНК или зрелая cr-РНК содержит, состоит в основном из или состоит только из прямой повторяющейся последовательности и направляющей последовательности или спейсера. В некоторых вариантах осуществления изобретения направляющая РНК или зрелая cr-РНК состоит из частичного прямого повтора размером 19 нуклеотидов с последующей направляющей последовательностью размером 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, или более нуклеотидов, например, направляющей последовательностью или спейсером размером 18-25, 19-25, 20-25, 21-25, 22-25 или 23-25 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок представлен эффекторным белком C2c2 и требует направляющей последовательности длиной как минимум 16 нуклеотидов для достижения поддающегося обнаружению расщепления ДНК и направляющей последовательности размером минимум 17 нуклеотидов для достижения эффективного расщепления ДНК in vitro. В конкретных вариантах осуществления изобретения эффекторный белок представлен белком C2c2 и требует направляющей последовательности размером как минимум 19 нуклеотидов для достижения поддающегося обнаружению расщепления РНК. В некоторых вариантах осуществления прямая повторяющаяся последовательность расположена выше (т.е. на 5'-конце) направляющей последовательности или спейсера. В предпочтительном варианте осуществления последовательность затравки (т.е. последовательность, необходимая для распознавания и/или гибридизации с последовательностью локуса-мишени) направляющей РНК C2c2 находится примерно в пределах первых 5 нуклеотидов на 5'-конце направляющей последовательности или спейсера.

[72] В предпочтительных вариантах осуществления изобретения зрелая cr-РНК содержит шпилечную структуру или оптимизированную шпилечную структуру или любую оптимизированную вторичную структуру. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения зрелая cr-РНК содержит шпилечную структуру или оптимизированную шпилечную структуру в прямой повторяющейся последовательности, где шпилечная структура или оптимизированная шпилечная структура важна для расщепления. В некоторых вариантах осуществления изобретения зрелая cr-РНК предпочтительно включает единичную шпилечную структуру. В некоторых вариантах осуществления изобретения прямая повторяющаяся последовательность предпочтительно включает единичную шпилечную структуру. В некоторых вариантах осуществления изобретения активность расщепления комплекса эффекторного белка может быть модифицирована путем внесения мутаций, которые влияют на структуру дуплекса РНК шпилечной структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения могут быть внесены мутации, поддерживающие структуру дуплекса РНК шпилечной структуры, благодаря которым будет сохранятся ферментативная активность, осуществляемая комплексом эффекторного белка. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения мутации, нарушающие структуру дуплекса РНК шпилечной структуры, могут быть внесены для полного удаления ферментативной активности, осуществляемой комплексом эффекторного белка.

[73] В конкретных вариантах осуществления изобретения белок C2c2 представляет собой эффекторный белок Lsh C2c2, и зрелая cr-РНК включает структуру или оптимизированную шпилечную структуру. В конкретных вариантах осуществления изобретения прямой повтор cr-РНК содержит по меньшей мере 25 нуклеотидов, включая шпилечную структуру. В конкретных вариантах осуществления изобретения шпилька подвержена заменам отдельных оснований, но активность нарушается только при изменении большей части вторичной структуры или укорочении cr-РНК. Примеры нарушающих активность мутаций включают замену более двух из нуклеотидов шпильки, добавление непарных нуклеотидов к шпильке, сокращение шпильки (удаление одного из образующих пару нуклеотидов) или удлинение шпильки (добавление одной пары нуклеотидов). Однако cr-РНК может быть подвергнута 5'- и/или 3'-удлинению, чтобы включать нефункциональные последовательности РНК, как предусмотрено для конкретных применений, описанных в настоящем описании.

[74] Также изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей эффекторный белок, являющейся кодон-оптимизированной для экспрессии в эукариотическом организме или эукариотической клетке посредством любого из описанных в настоящем описании способов или композиций. В одном варианте осуществления изобретения кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая эффекторный белок, кодирует любой C2c2, обсуждаемый в настоящем описании, и подвергнута оптимизации кодонов для удобства использования в эукариотической клетке или организме, например, такой клетке или организме, как описано в настоящем описании в иных местах, например, но не ограничиваясь этим, в клетке дрожжей, или клетке или организме млекопитающего, включая клетку мыши, клетку крысы, и клетку человека или не являющегося человеком эукариотического организма, например, растения.

[75] В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один сигнал ядерной локализации (NLS) присоединен к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим эффекторные белки C2c2. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна или более C-концевых или N-концевых последовательностей NLS присоединены (следовательно, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие эффекторный белок C2c2, могут включать код для последовательностей NLS, чтобы экспрессируемый продукт имел присоединенную последовательность NLS). В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один сигнал ядерного экспорта (NES) присоединен к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим эффекторные белки C2c2. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна или более C-концевых или N-концевых последовательностей NES присоединены (следовательно, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие эффекторный белок C2c2, могут включать код для NES-последовательностей, чтобы экспрессируемый продукт имел присоединенную последовательность NES). В предпочтительном варианте осуществления изобретения C-концевые и/или N-концевые NLS или NES присоединены для оптимальной экспрессии и нацеливания в ядро эукариотических клеток, предпочтительно клеток человека. В предпочтительном варианте осуществления изобретения кодон-оптимизированным эффекторным белком является C2c2 и длина спейсера направляющей РНК составляет от 15 до 35 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения длина спейсера направляющей РНК - по меньшей мере 16 нуклеотидов, такая как по меньшей мере 17 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 18 нуклеотидов, такая как предпочтительно по меньшей мере 19 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 21 нуклеотид или по меньшей мере 22 нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления изобретения длина спейсера составляет от 15 до 17 нуклеотидов, от 17 до 20 нуклеотидов, от 20 до 24 нуклеотидов, например, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, от 23 до 25 нуклеотидов, например, 23, 24 или 25 нуклеотидов, от 24 до 27 нуклеотидов, 27-30 нуклеотидов, 30-35 нуклеотидов или 35 нуклеотидов или длиннее. В некоторых вариантах осуществления изобретения кодон-оптимизированным эффекторным белком является C2c2, и длина прямого повтора направляющей РНК составляет по меньшей мере 16 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения кодон-оптимизированным эффекторным белком является C2c2, и длина прямого повтора направляющей РНК составляет от 16 до 20 нуклеотидов, например, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения длина прямого повтора направляющей РНК равна 19 нуклеотидам.

[76] Настоящее изобретение также охватывает способы для доставки множественных компонентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, где каждый компонент, являющийся нуклеиновой кислотой, специфичен к различным представляющим интерес локусам-мишеням для изменения множественных представляющих интерес локусов-мишеней. Компонент, являющийся нуклеиновой кислотой, комплекса может включать один или более связывающих белок РНК-аптамеров. Один или более аптамеров могут быть способны к связыванию с белком оболочки бактериофага. Белок оболочки бактериофага может быть выбран из группы, включающей: Qβ, F2, GA, fr, JP501, MS2, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, М11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, ϕCb5, ϕCb8r, ϕCb12r, ϕCb23r, 7s и PRR1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения белок оболочки бактериофага представлен белком MS2. Изобретение также предусматривает, что компонент, являющийся нуклеиновой кислотой, комплекса имеет длину 30 или больше, 40 или больше или 50 или больше нуклеотидов.

[77] Соответственно, задачей изобретения не является охватить в своих рамках какой-либо ранее известный продукт, процесс получения продукта или способ применения, таким образом, заявители сохраняют за собой право и настоящим подтверждают отказ от какого-либо ранее известного продукта, процесса или способа. Далее отмечено, что изобретение не намеревается охватить в своих рамках какой-либо продукт, процесс получения или способ применения продукта, которые не соответствует письменному описанию и разрешающим условиям USPTO (35 Свод Законов США 112, параграф первый) или EPO (Статья 83 EPC), так что Заявители сохраняют за собой право и настоящим подтверждают отказ от каого-либо ранее описанного продукта, процесса получения или способа применения продукта. В практике изобретения следует руководствоваться Статьей 53 (c) EPC и Правилом 28 (b) и (c) EPC. Ничто в настоящем описании не может быть истолковано как обещание.

[78] Отмечено, что в настоящей заявке и особенно в формуле изобретения и/или параграфах термины, такие как "содержать", "содержавшийся", "содержащий" и т.п., могут иметь значение, приписанное им в американском Патентном Законе; например, они могут означать "включает", "включенный", "включающий", и т.п.; термины, такие как "по существу состоящий из" и "по существу состоит из" имеют значение, приписанное им в американском Патентном праве, например, они включают элементы, не указанные явно, но исключают элементы, которые учтены в предшествующих заявках или которые влияют на основные или новые характеристики изобретения.

[79] Дальнейшим аспектом изобретения является, что в эукариотической клетке, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую систему CRISPR, описанную в настоящем описании, происходит модификация представляющего интерес локуса-мишени согласно любому из способов, описанных в настоящем описании. Еще один аспект изобретения относится к созданию клеточной линии указанной клетки. Следующий аспект изобретения предусматривает создание многоклеточного организма, включающего одну или более указанных клеток.

[80] В некоторых вариантах осуществления изобретения модификация представляющего интерес локуса-мишени может приводить к появлению эукариотической клетки с измененной экспрессией продукта по меньшей мере одного гена; эукариотической клетки с измененной экспрессией продукта по меньшей мере одного гена, причем экспрессия этого продукта увеличена; эукариотической клетки с измененной экспрессией продукта по меньшей мере одного гена, причем экспрессия этого продукта уменьшена; или эукариотической клетки, содержащей отредактированный геном.

[81] В некоторых вариантах осуществления изобретения эукариотическая клетка может быть клеткой млекопитающего или человека.

[82] В дальнейших вариантах осуществления изобретения не встречающиеся в природе или сконструированные способами инженерии композиции, векторные системы или системы доставки, в соответствии с настоящим описанием, могут использоваться для специфической интерференции последовательности РНК, специфического модулирования экспрессии последовательности РНК (включая специфичную экспрессию изоформ), стабилизации, локализации, функционализации (например, рибосомных РНК или микроРНК), и т.д.; или мультиплексирования таких процессов.

[83] В дальнейших вариантах осуществления изобретения не встречающиеся в природе или сконструированные способами инженерии композиции, векторные системы или системы доставки, как описано в настоящем описании, могут быть использованы для обнаружения РНК и/или определения ее количества в клетке.

[84] В дальнейших вариантах осуществления изобретения не встречающиеся в природе или сконструированные способами инженерии композиции, векторные системы или системы доставки, как описано в настоящем описании, могут быть использованы для создания моделей болезней и/или систем скрининга.

[85] В дальнейших вариантах осуществления изобретения не встречающиеся в природе или сконструированные способами инженерии композиции, векторные системы или системы доставки, как описано в настоящем описании, могут использоваться для сайт-специфического редактирования или изменения транскриптома; специфической интерференции последовательностей нуклеиновых кислот; или мультиплексной инженерии генома.

[86] Также изобретение относится к получению генного продукта из клетки, клеточной линии или организма, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество экспрессированного генного продукта может быть больше или меньше, чем количество генного продукта в клетке без измененной экспрессии или отредактированного генома. В некоторых вариантах осуществления изобретения генный продукт может быть изменен по сравнению с генным продуктом из клетки без измененной экспрессии или отредактированного генома.

[87] Эти и другие варианты осуществления изобретения раскрыты в, очевидны из или охвачены следующим Подробным Описанием.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[88] Новые признаки изобретения подробно сформулированы в приложенной формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ данного изобретения будет достигнуто при ознакомлении со следующим подробным описанием, которое включает материалы, иллюстрирующие принципы изобретения, и сопроводительные Фиг. к ним:

[89] На фиг. 1A-1B изображена новая классификация систем CRISPR-Cas. Класс 1 включает многосубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cascade), и Класс 2 включает односубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cas9-подобные). На фиг. 1B приведено другое описание новой классификации систем CRISPR-Cas.

[90] На фиг. 2 изображена молекулярная организация систем CRISPR-Cas.

[91] На фиг. 3A-3D изображены структуры эффекторных комплексов типов I и III: общая архитектура/общее происхождение прослеживается несмотря на обширную дивергенцию последовательностей.

[92] На фиг. 4 изображена CRISPR-Cas как система, основанная на мотивах распознавания РНК (RRM).

[93] На фиг. 5 изображена филогению Cas1, где показан главный аспект эволюции системы CRISPR-Cas - рекомбинация эффекторных модулей cr-РНК в целях адаптации.

[94] На фиг. 6 представлен перечень систем CRISPR-Cas, а именно распространение типов/подтипов систем CRISPR-Cas среди архей и бактерий.

[95] На фиг. 7 изображен алгоритм для идентификации Cas-кандидатов.

[96] На фиг. 8A-8B изображена организация полных локусов систем CRISPR-Cas класса 2. Обозначены три подтипа типа II и подтипы V-A, V-B и V-C и тип VI. Подсемейства на основе филогении Cas1 также обозначены. Схема включает только общие гены, представленные в каждом подтипе; дополнительные гены, присутствующие в некоторых вариантах, опущены. Красным прямоугольником обозначен вырожденный повтор. Серые стрелки показывают направление транскрипции последовательности CRISPR. PreFran, Prevotella-Francisella. На фиг. 8B приведено другое описание организации полных локусов нескольких систем CRISPR-Cas класса 2.

[97] На фиг. 9 изображены окрестности C2c1, т.е. геномная архитектура локусов C2c1 CRISPR-Cas. Обозначено количество повторов в последовательностях CRISPR. Для каждого геномного контига обозначен числовой ID Genebank и координаты локуса.

[98] На фиг. 10A-10B. Фиг. 10A и 10B изображены представления о дереве последовательностей белка Cas1. Дерево на фиг. 10B было построено на основе множественного выравнивания 1498 последовательностей Cas1, которые содержали 304 филогенетически информативных позиции. Ветви, соответствующие системам класса 2 подчеркнуты: голубым - тип II; оранжевым - подтип V-A; красным - подтип V-B; коричневым - подтип V-C; фиолетовым - тип VI. Вставки показывают расширенные ветви новых (под)типов. Значения поддержки бутстрэпа приведены в процентах и показаны только для некоторых соответствующих ветвей.

[99] На рисунках 10C-10W показано полное дерево Cas1, которое схематично показано на фиг. 10B в формате Newick с видовыми названиями и значениями поддержки бутстрэпа. Дерево было построено с помощью программы FastTree (опции "-gamma -wag"). Множественное выравнивание последовательностей Cas1 было отфильтровано с порогом однородности 0,1 и порогом возникновения промежутка 0,5 до реконструкции дерева.

[100] На фиг. 11 изображена доменная организация семейств класса 2.

[101] На фиг. 12 изображены участки гомологии TnpB белков класса 2.

[102] Фиг. 13A-13N. Фиг. 13A и 13B содержат другое изображение доменной архитектуры и консервативных мотивов эффекторных белков класса 2. Фиг. 13A иллюстрирует типы II и V: нуклеазы-производные TnpB. Верхний ряд на рисунке демонстрирует нуклеазы RuvC из Thermos thermophilus (PDB ID: 4EP5) с обозначением каталитических аминокислотных остатков. Ниже показана архитектура каждого домена, приведено выравнивание консервативных мотивов для отдельных представителей соответствующих семейств белков (единственная последовательность для RuvC). Каталитические остатки показаны белыми буквами на черном фоне, консервативные гидрофобные остатки выделены желтым; консервативные остатки малых аминокислот выделены зеленым; в выравнивании спирального мостика положительно заряженные остатки выделены красным. Предсказанная вторичная структура показана ниже выровненных последовательностей: H обозначает α-спирали, Е обозначает выпрямленную конформацию (β-структура). Малоконсервативные последовательности спейсеров между блоками выравнивания обозначены числами. Фиг. 13B иллюстрирует тип VI: белки содержат 2 HEPN-домена, которые могут демонстрировать РНК-азную активность. Верхние блоки выравнивания содержат отдельные описанные ранее домены HEPN, нижние блоки содержат каталитические мотивы из эффекторных белков типа VI. Обозначения как на фиг. 13 A. Фиг. 13C иллюстрирует ближайшие гомологи новых эффекторных белков типа V из числа кодируемых транспозонами белков: непересекающиеся наборы гомологов. Фиг. 13D-H иллюстрирует множественное выравнивание семейства белка C2c1. Данное выравнивание выполнено с использованием программы MUSCLE и изменено вручную на основе локальных попарных выравниваний, полученных с помощью PSI-BLAST. Для каждой последовательности приведен номер-идентификатор GenBank (GI) и систематическое название организма. Вторичная структура предсказана с помощью Jpred и показана ниже последовательности, использованной в качестве последовательности-запроса (обозначения: H - альфа-спираль, E - бета-структура). CONSENSUS рассчитан для каждого столбца выравнивания путем сравнения суммы парных весов каждого столбца для гомогенных столбцов (совпадающий остаток во всех выровненных последовательностях) и случайного столбца с порогом гомогенности 0,8. Мотивы активного сайта RuvC-подобного домена показаны ниже выравнивания. На фиг. 13I представлено множественное выравнивание для семейства белка C2c3. Данное выравнивание выполнено с использованием программы MUSCLE. Для каждой последовательности обозначены внутренний приписанный ей номер и номер-идентификатор GenBank (GI) метагеномного контига, кодирующего соответствующий белок С2с3. Вторичная структура предсказана с помощью Jpred и показана ниже выравнивания (обозначения: H - альфа-спираль, E - бета-структура). CONSENSUS рассчитан для каждого столбца выравнивания путем сравнения суммы парных весов каждого столбца для гомогенных столбцов (совпадающие остатки во всех выровненных последовательностях) и случайного столбца с порогом гомогенности 0,8. Мотивы активного сайта RuvC-подобного домена показаны ниже выравнивания С-концевого домена. Фиг. 13J-N иллюстрирует множественное выравнивание семейства белка C2c2. Выравнивание выполнено с использованием программы MUSCLE и изменено вручную на основе локальных выравниваний с помощью PSI-BLAST. Для каждой последовательности обозначен номер-идентификатор GenBank (GI) и систематическое название организма. Вторичная структура предсказана с помощью Jpred и показана ниже последовательности, использованной в качестве последовательности-запроса (обозначения: H - альфа-спираль, E - бета-структура). CONSENSUS рассчитан для каждого столбца выравнивания путем сравнения суммы парных весов каждого столбца для гомогенных столбцов (совпадающие остатки во всех выровненных последовательностях) и случайного столбца с порогом гомогенности 0,8. Мотивы активных сайтов домена HEPN показаны ниже выравнивания.

[103] На фиг. 14 изображены окрестности C2c3, т.е. геномная архитектура C2c3-локусов системы CRISPR-Cas. Указано количество повторов в последовательностях CRISPR. Для каждого геномного контига обозначены номер-идентификатор GenBank и координаты локуса.

[[104] На фиг. 15 изображены окрестности C2c2.

[105] На фиг. 16 изображены мотивы RxxxxH домена HEPN семейства C2c2.

[106] На фиг. 17 изображен C2C1: 1. Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025.

[107] На фиг. 18 изображен C2C1: 4. Desulfonatronum thiodismutans штамма MLF-1.

[108] На фиг. 19 изображен C2C1: 5. бактерии Opitutaceae TAV5.

[109] На фиг. 20 изображен C2C1: 7. Bacillus thermoamylovorans штамма B4166.

[110] На фиг. 21 изображен C2C1: 9. Bacillussp. NSP2.1.

[111] На фиг. 22 изображен C2C2: 1. бактерии Lachnospiraceae MA2020.

[112] На фиг. 23 изображен C2C2: бактерии 2. Lachnospiraceae NK4A179.

[113] На фиг. 24 изображен C2C2: 3. [Clostridium] aminophilum DSM 10710.

[114] На фиг. 25 изображен C2C2: 4. бактерии Lachnospiraceae NK4A144.

[115] На фиг. 26 изображен C2C2: 5. Carnobacterium gallinarum DSM 4847.

[116] На фиг. 27 изображен C2C2: 6. Carnobacterium gallinarum DSM 4847

[117] На фиг. 28 изображен C2C2: 7. Paludibacter propionicigenes WB4.

[118] На фиг. 29 изображен C2C2: 8. Listeria seeligeri серовара 1/2b.

[119] На фиг. 30 изображен C2C2: 9. Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317.

[120] На фиг. 31 изображен C2C2: 10. Listeria bacterium FSL M6-0635.

[121] На фиг. 32 изображен C2C2: 11. Leptotrichia wadei F0279.

[122] На фиг. 33 изображен C2C2: 12. Leptotrichia wadei F0279.

[123] На фиг. 34 изображен C2C2: 14. Leptotrichia shahii DSM 19757.

[124] На фиг. 35 изображен C2C2: 15. Rhodobacter capsulatus SB 1003.

[125] На фиг. 36 изображен C2C2: 16. Rhodobacter capsulatus R121.

[126] На фиг. 37 изображен C2C2: 17. Rhodobacter capsulatus DE442.

[127] На фиг. 38 изображено дерево DR-последовательностей.

[128] На фиг. 39 изображено дерево белков C2c2.

[129] Фиг. 40A-40D содержит таблицу, включающую описания 63 больших кодирующих белки генов вблизи генов cas1, идентифицированных с помощью описанного в настоящем описании вычислительного способа. Описанные в настоящем описании представители новых подтипов (V-B, V-C, VI) выделены цветом. Последовательности белков для представителей типа V-B и типа IV, кодирующих AUXO014641567.1, AUXO011689375.1, AUXO011689375.1, AIJXO011277409.1, AUXO014986615.1 не проанализированы, т.к. для этих последовательностей не может быть установлена видовая принадлежность.

[130] Фиг. 41A-41M. Фиг. 41A-B содержат таблицу, демонстрирующую результаты анализа локусов V- B типа (кодирующих белок C2c1). * cas1cas4 - ген, содержащий домены cas4 и cas1; CRISPR - CRISPR-повторы; SOS - гены SOS-ответа; unk - гипотетический белок; > - направление кодирующей последовательности гена; [D] - вырожденный повтор (определены, где возможно); [T] - tracr-РНК. Фиг. 41C-J иллюстрирует анализ CRISPR-последовательностей для локусов V-B типа (кодирующих белки C2c1), как описано в настоящем описании (раздел CRISPR является частью базового результата работы pilercr (см. описание результата работы на сайте pilercr: http://www.drive5.com/pHercr/); фолдинг повторов выполнен с помощью mfold (см. описание результата работы на сайте mfold: http://mfold.ma.albany.edu/?q=mfQld/DNA-Folding-FGrm); результаты фолдинга повторов и анализа CRISPR-последовательностей помещены после детального описания каждого случая; расположение CRISPR см. по ссылке в таблице на фиг. 41 A-В. Фиг. 41K иллюстрирует классификацию CRISPRmap CRISPR-повторов локусов типа V-B (кодирующих белок C2c1) как описано в настоящем описании с помощью CRISPRmap (детали см. http://rna.informatik.uni-freiburg.de/CRISPRmap/Input.jsp). Фиг. 41L иллюстрирует вырожденные повторы локусов V-B типа (кодирующие белок C2c1) обнаруженные, как описано в настоящем описании, с помощью алгоритма поиска CRISPR-последовательностей (http://crispr.u-psud.fr/Server/). Столбец нормальных повторов содержит нормальный повтор, столбец спейсеров - последний спейсер, столбец downstream - область низлежащих последовательностей, начиная с вырожденного повтора (250 п.н.); номер последовательности соответствует номеру последовательности CRISPR в соответствующем локусе (см. Таблицу на фиг. 41 A-В); выделенная желтым область имеет полное совпадение между нормальным повтором и вырожденным повтором (при несовпадении с другой частью вырожденного повтора). Фиг. 41M иллюстрирует предсказанные структуры tracr-РНК, образующие пары оснований с этими повторами. Tracr-РНК для Alicyclobacillus acidoterrestric был идентифицирован с помощью секвенирования РНК. Для остальных локусов предполагаемые tracr-РНК идентифицированы на основе присутствия последовательности антипрямого повтора (DR) (Anti-DR). Последовательности антипрямых повторов были идентифицированы с помощью Geneious (www.geneious.com) путем поиска последовательностей внутри каждого соответствующего локуса CRISPR с высокой гомологией к DR. 5'- и 3'-концы каждой предполагаемой tracr-РНК были определены с помощью вычислительного прогнозирования сайтов старта бактериальной транскрипции и терминации с помощью соответственно BPROM (www.softberry.com) и ARNOLD (rna.ig-mors.u-psud.fr/toolbox/amold/). Предсказания кофолдинга получены с помощью Geneious, 5'-концы выделены синим, 3'-концы выделены оранжевым.

[131] Фиг. 42A-42N. Рисунок 42A-B содержит таблицу, демонстрирующую результаты анализа локусов типа VI (кодирующих белок C2c2). *CRISPR - CRISPR повторы; unk - гипотетический белок; > - направление кодирующей последовательности гена; [D] - вырожденный повтор (определены, где возможно); [T] - tracr-РНК, фиг. 42C-I демонстрируют результаты анализа CRISPR-последовательностей локусов типа VI (кодирующих белок C2c2) как описано в настоящем описании (раздел CRISPR является частью базового результата работы pilercr (см. описание результата работы на сайте pilercr: http://www.drive5.com/pilercr/); фолдинг повторов выполнен с помощью mfold (см. описание результата работы на сайте mfold: http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfQld/DNA-Folding-Form); результаты фолдинга повторов и анализа CRISPR-последовательностей помещены после детального описания каждого случая; см. расположение CRISPR по ссылке в таблице на фиг. 42 A-В. Фиг. 42J иллюстрирует классификацию CRISPRmap CRISPR повторов локусов типа VI (кодирующих белок C2c2) с помощью, как описано в настоящем описании CRISPRmap (детали см. http://rna.informatik.uni-freiburg.de/CRISPRmap/Input.jsp). Фиг. 42K-L иллюстрирует вырожденные повторы локусов типа VI (кодирующие белок C2c2) как описано в настоящем описании, обнаруженные с помощью алгоритма по поиску CRISPR-последовательностей (http://crispr.u-psud.fr/Server/). Столбец нормальных повторов содержит нормальный повтор, столбец спейсеров - последний спейсер, столбец downstream - область низлежащих последовательностей, начиная с вырожденного повтора (250 п.н.); номер последовательности соответствует числовому значению CRISPR-последовательности в соответствующем локусе (см. таблицу на фиг. 42 A-В); выделенная желтым область имеет полное совпадение между нормальным повтором и вырожденным повтором (при несовпадении с другой частью вырожденного повтора). Фиг. 42M-N иллюстрирует предсказанные структуры tracr-РНК, образующие пары оснований с этими повторами. Предполагаемые tracr-РНК были идентифицированы на основе присутствия последовательности антипрямого повтора (DR) (Anti-DR). Последовательности антипрямых повторов были идентифицированы с помощью Geneious (www.geneious.com) путем поиска последовательностей внутри каждого соответствующего локуса CRISPR с высокой гомологией с DR. 5'- и 3'-концы каждой предполагаемой tracr-РНК были определены с помощью вычислительного прогнозирования сайтов старта бактериальной транскрипции и терминации с помощью BPROM (www.softberry.com) и ARNOLD (rna.ig-mors.u-psud.fr/toolbox/amold/) соответственно. Предсказания кофолдинга получены с помощью Geneious, 5'-концы выделены синим, 3'-концы выделены оранжевым.

[132] Фиг. 43A-43F. Рисунок 43 A-B содержит таблицу, демонстрирующую результаты анализа локусов типа V-С (кодирующих белок C2c3). *CRISPR - CRISPR-повторы; unk - гипотетический белок; > - направление кодирующей последовательности гена; [D] - вырожденный повтор (определены, где возможно). Фиг. 43C - демонстрируют результаты анализа CRISPR-последовательностей локусов типа V-С (кодирующих белок C2c3) как описано в настоящем описании (раздел CRISPR является частью базового результата работы pilercr (см. описание результата работы на сайте pilercr: http://www.drive5.com/pilercr/); фолдинг повторов выполнен с помощью mfold (см. описание результата работы на сайте mfold: http://mfold.ma.albany.edu/?q=mfQld/DNA-Folding-Form); результаты фолдинга повторов и анализа CRISPR-последовательностей помещены после детального описания каждого случая; см. расположение CRISPR по ссылке в таблице на фиг. 43 A-В. Показаны статистически значимые совпадения BLAST для спейсера с прокариотами и их вирусами. Фиг. 43E иллюстрирует классификацию CRISPRmap CRISPR повторов локусов типа V-С (кодирующих белок C2c3) как описано в настоящем описании с помощью CRISPRmap (детали см. http://rna.informatik.uni-freiburg.de/CRISPRmap/Input.jsp). Фиг. 43F иллюстрирует вырожденные повторы локусов типа V-С (кодирующие белок C2c3) как описано в настоящем описании, обнаруженные с помощью алгоритма по поиску CRISPR-последовательностей (http://crispr.u-psud.fr/Server/). Столбец нормальных повторов содержит нормальный повтор, столбец спейсера - последний спейсер, столбец downstream - область низлежащих последовательностей, начиная с вырожденного повтора (250 п.н.); номер последовательности соответствует номеру CRISPR-последовательности в соответствующем локусе (см. таблицу на фиг. 43A-В); выделенная желтым область имеет полное совпадение между нормальным повтором и вырожденным повтором (при несовпадении с другой частью вырожденного повтора).

[133] На фиг. 44A-44E приведен полный список локусов CRISPR-Cas в геномах, где были обнаружены белки C2c1 или C2c2. Гены белков C2c1 и C2c2 выделены желтым.

[134] На фиг. 45A-45C проиллюстрировано выравнивание локусов Listeria, кодирующих предполагаемую систему CRISPR-Cas типа VI. Выровненный синтетический участок, соответствующий контигу AODJ01000004.1 Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317 с координатами 42281-46274 и контигу JNFB01000012.1 Listeria newyorkensis, штамм FSL M6-0635, с координатами 169489-173541. Обозначения: ген C2c2 выделен голубым, повторы CRISPR - пурпурным, вырожденные повторы - пурпурным, спейсеры - жирным.

[135] На фиг. 46 проиллюстрировано два локуса C2c2 Carnobacterium gallinarum.

[136] На фиг. 47 схематически изображен уровень экспрессии для двух CRISPR-последовательностей в направлении гена C2c2 в первом локусе C2c2.

[137] На фиг. 48 схематически изображен уровень экспрессии для CRISPR-последовательностей с направлением транскрипции в сторону гена C2c2 во втором локусе C2c2.

[138] Фиг. 49A-49B. Фиг. 49A-49B иллюстрируют экспрессию и процессинг локусов C2c2. Фиг. 49A: секвенирование РНК локуса C2c2 Listeriaseeligeria, серовар 1/2b, штамм SLCC3954, экспрессированного в E.coli. Данный локус имеет высокий уровень экспрессии, процессированная cr-РНК содержит прямой повтор на 5'-конце длиной 29 п.н. и спейсер длиной 15-18 п.н. Для предполагаемой tracr-РНК экспрессия не установлена. In silico фолдинг РНК прямого повтора процессированной cr-РНК продемонстрировал стабильную шпилечную структуру. Фиг. 49B: нозерн-блоттинг РНК локуса C2c2 Leptotrichia shahii DSM 19757, экспрессированного в E.coli, демонстрирует процессированные cr-РНК с прямыми повторами на 5'-конце. Стрелки обозначают положения зондов и их направление.

[139] Фиг. 50A-50C. Фиг. 50A-C иллюстрируют экспрессию и процессинг локуса C2c2 Leptotrichia shahii DSM 19757. Фиг. 50A: секвенирование РНК локуса Leptotrichia shahii DSM 19757, экспрессированного в E.coli демонстрирует процессинг CRISPR-последовательности в направлении от 3'-конца к 5'-концу (направление этого локуса). cr-РНК процессируются таким образом, что имеют 5'-концевой прямой повтор длиной 28 п.н. и спейсеры длиной 14-28 п.н. Фиг. 50B: секвенирование РНК эндогенного локуса C2c2 Leptotrichia shahii DSM 19757 демонстрирует близкие результаты с изображенными на фиг. 50A. Фиг. 50C: In silico фолдинг прямого повтора (DR) в cr-РНК L. shahii предсказывает стабильную вторичную структуру.

[140] На фиг. 51 проиллюстрирован эволюционный сценарий для систем CRISPR-Cas. Предполагается, что белок Cas8 возник путем инактивации Cas10 (обозначен белым X), что сопровождалось значительным ускорением эволюции. Сокращения: TR, концевые повторы; TS, концевые последовательности, HD, семейство эндонуклеаз HD; HNH, семейство эндонуклеаз HNH, RuvC, семейство эндонуклеаз RuvC; HEPN, предполагаемая эндорибонуклеаза суперсемейства HEPN. Показанные серым области генов и белков обозначают последовательности, которые были закодированы в соответствующих мобильных элементах, но были утрачены в ходе эволюции систем CRISPR-Cas.

[141] На фиг. 52 изображена организация локуса гена C2c2, включая домены, принадлежащие к суперсемейству HEPN. Большая часть доменов HEPN содержит консервативные мотивы и представляет собой металл-независимые эндоРНК-азы.

[142] На фиг. 53 изображен результат анализа секвенирования РНК для эндогенного локуса из Leptotrichia shahii DSM 19757.

[143] На фиг. 54 схематически представлена схема эксперимента in vivo с использованием E.coli, экспрессирующей LshC2c2, с целью идентификации мотивов обедненными последовательностями. Библиотека PAM, обеспечивающая устойчивость к ампициллину, была перенесена в E.coli. Плазмиды, несущие мотивы последовательностей, содержащие детерминантную последовательность PAM, утрачены и, следовательно, не способны обеспечивать устойчивость к ампициллину. Мотивы последовательности PAM идентифицированы исходя из отсутствия определенных последовательностей.

[144] Фиг. 55 Идентификация последовательности PAM. Последовательности, для которых наблюдается обеднение, позволяют определить нуклеотиды 5'-PAM.

[145] На фиг. 56 изображено нацеливание на эндогенную мишень в E.coli. Интерференция установлена по уменьшению числа колониеобразующих единиц (КОЕ) на 20 нг плазмид. Интерференция наблюдалась в E.coli, содержащих LshC2c2, но не контрольной плазмиде pACYC184. Усиление интерференции связано с транскрипцией целевой последовательности.

[146] На фиг. 57 проиллюстрирована очистка C2c2 с использованием способа очистки с His-меткой с последующими одним этапом (слева) или тремя этапами (справа) гель-фильтрации, а также одна полоса красителя кумасси, соответствующая 168 кДа.

[147] На фиг. 58 изображены компоненты экспериментов in vitro с очищенным Lsh C2c2 и очищенной с помощью FPLC РНК-мишенью. Компонент "166" обозначает некомплементарную последовательность-мишень. "E" обозначает EDTA. Расщепление cr-РНК наблюдается в случае присутствия C2c2.

[148] На фиг. 59 изображены эксперименты in vitro с очищенным C2c2, РНК-мишенью и cr-РНК, имеющими спейсеры длиной 12-26 нуклеотидов. Наблюдается расщепление cr-РНК, имеющих спейсеры длиной 28 или 24 п.н.

[149] На фиг. 60 изображен анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA), позволяющий выявить комплексы состоящие из белков и нуклеиновых кислот.

[150] На фиг. 61 изображено нацеливание in vivo на транскрибированный красный флуоресцентный белок (RFP), с использованием спейсеров RFP, соответствующих или комплементарных РНК. Спейсеры, нацеливающие на транскрибируемый RFP, были клонированы в локус LshC2c2 с последующей экспрессией в E.coli, несущих плазмиду, экспрессирующую RFP, или контрольную плазмиду pUC19. Интерференция была определена на основе колониеобразующих единиц (КОЕ) на 20 п.н. трансформированной плазмиды.

[151] На фиг. 62 изображает зависимую от цепи интерференцию с плазмидой, несущей RFP-мишень. Интерференция была измерена как число колониеобразующих единиц (КОЕ) для 6 RFP-мишеней (слева). Наблюдалась зависимость интерференции от цепи, на которую было осуществлено нацеливание, и присутствия нуклеотида PAM. Интерференция с ненацеленной контрольной плазмидой pUC19 не наблюдалась (справа).

[152] Фиг. 63A-63C. На фиг. 63 изображен эффект белка C2c2 с нацеливающей РНК, комплементарной или некомплементарной экспрессированной РНК, на экспрессию RFP. А - схема нацеливания на RFP в гетерологической системе E.coli. Локусы LshC2c2, несущие спейсеры для нацеливания на RFP в различных последовательностях PAM, были встроены в экспрессирующую RFP E.coli. B - количественная оценка нацеливания на RFP в E.coli для множественных спейсеров для нацеливания A-, C- или U PAM. Экспрессия RFP была измерена с помощью поточной цитометрии. C - количественная оценка нацеливания на RFP в E.coli. Были встроены спейсеры с различными последовательностями PAM для нацеливания на некодирующую цепь ("ДНК") или кодирующую цепь ("РНК") гена RFP, и экспрессия RFP была измерена с помощью поточной цитометрии.

[153] На фиг. 64 изображен процессинг последовательностей прямых повторов (DR) при помощи LshC2c2. LshC2c2 процессирует прямые повторы (DR) на 5'-конце.

[154] На фиг. 65 изображена стратегия исследования выбора мишени. Мишень 1 (T1) содержит G-PAM, мишень 3 (T3) содержит C-PAM.

[155] На фиг. 66 изображены результаты реакции расщепления РНК белком C2c2, нацеленным на T3 (см. Фиг. 65). Компоненты реакции обозначены.

[156] На фиг. 67 представлены результаты реакции расщепления РНК белком C2c2, нацеленным на T1 (см. Фиг. 65). Компоненты реакции обозначены.

[157] На фиг. 68 изображено C2c2-опосредованное расщепление, нацеленное на РНК, экспрессированную с матрицы ДНК in vitro. Компоненты реакции обозначены. Дорожки 2-8: C2c2-опосредованное расщепление нацелено на T1 (см. Фиг. 65), дорожки 9-15: C2c2-опосредованное расщепление нацелено на последовательность, обратно комплементарную T1.

[158] На фиг. 69 изображено C2c2-опосредованное расщепление, нацеленное на РНК, экспрессированную с матрицы ДНК in vitro. Компоненты реакции обозначены. Дорожки 2-8: C2c2-опосредованное расщепление нацелено на T3 (см. Фиг. 65).

[159] На фиг. 70 изображены установленные размеры фрагмента РНК, для которого наблюдается C2c2-опосредованное расщепление, нацеленное на T1 или T3 (см. Фиг. 65).

[160] На фиг. 71 изображено C2c2-опосредованное расщепление РНК-мишеней T1 и T3. Наблюдаются множественные продукты расщепления и значительное сокращение интенсивности полосы мишени. Буфер 1: 40 мМ Tris-HCl (pH 7,9), 6 мМ MgCL2, 83 мМ NaCl, 1 мМ DTT, rNTP, полимераза T7. Буфер 2: 25 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 10 мМ MgCL2, 83 мМ NaCl, 5 мМ DTT. Буфер 2 воспроизводит условия реакции без ДНК-матрицы.

[161] На фиг. 72 показано, что мутации в любом домене HEPN препятствуют нацеливанию на РНК.

[162] На фиг. 73 представлен схематический обзор скрининга PAM РНК с использованием интерференции фага MS2. Библиотека, состоящая из спейсеров, нацеливающих на все возможные последовательности в РНК-геноме фага MS2, была клонирована в CRISPR-последовательность LshC2c2. Популяция клеток с этой библиотекой была обработана фагом и помещена в культуру для дальнейшего отбора выживших клеток. Частоту спейсеров сравнили с контрольной группой, не обработанной фагом, и обогащенные фагом спейсеры использовали для создания логотипов последовательностей.

[163] На фиг. 74 показано, что скрининг интерференции РНК-фага демонстрирует как значительное обогащение, так и обеднение спейсеров LshC2c2 PAM РНК, полученными с использованием интерференции фага MS2.

[164] Фиг. 75A-75J. На фиг. 75A-C представлена идентификация правой последовательности PAM, состоящей из единственного основания, для LshC2c2 с помощью скрининга PAM РНК с использованием интерференции фага MS2. Более конкретно, показано наличие справа H-PAM (не G). На фиг. 75C представлена количественная оценка анализа бляшек фага MS2, подтверждающего наличие PAM. Множественные спейсеры, направленные на каждый PAM, были клонированы в локус LshC2c2. Разведения фага были нанесены на чашки Петри с бактериями, и интерференция была определена количественно по максимальному разведению, при котором не наблюдалось литических бляшек. Фиг. 75D демонстрирует репрезентативные изображения, полученные при подсчете литических бляшек фага MS2, показывающие уменьшение формирования бляшек при наличии Н-PAM в спейсерах, но не при наличии G-PAM в спейсерах. На фиг. 75E представлено присутствие нуклеазной активности при наличии G-PAM в спейсерах и устойчивости при наличии H-PAM в спейсерах. Фиг. 75F иллюстрирует схему РНК-мишени, показывая участок протоспейсера и соответствующую cr-РНК. На фиг. 75G в денатурирующем геле показана ферментативная активность LshC2c2 по расщеплению оцРНК с использованием в качестве мишени РНК, меченных на 5'-конце IRDye 800 и на 3'-конце - Cy5. Наблюдаются четыре независимых участка расщепления. На фиг. 75 H в денатурирующем геле показан Н-РАМ (не G). Ферментативная активность по расщеплению оцРНК зависит от нуклеотида непосредственно на 3'-конце мишени. PAM был протестирован путем внесения мутаций в прилежащий нуклеотид и использования той же самой cr-РНК/мишени. На фиг. 75I изображена схема, показывающая расположенные по типу черепицы cr-РНК, чтобы продемонстрировать повторное нацеливание (перенацеливание) LshC2c2 и H-PAM (вверху) и соответствующий денатурирующий гель (внизу). Пять различных cr-РНК были протестированы для каждого возможного нуклеотида. В денатурирующем геле также продемонстрировано, что H-PAM использует различные CRISPR-РНК, расположенные по типу черепицы вдоль оцРНК-мишени. Пять различных cr-РНК были протестированы для каждого возможного нуклеотида. На фиг. 75J в денатурирующем геле показано тестирование на присутствие мотива спейсера. Были проверены три cr-РНК с каждым возможным последним нуклеотидом в качестве последнего основания в последовательности спейсера.

[165] На фиг. 76 продемонстрирована рестрикция РНК фага MS2, посредством LshC2c2. Клонированные спейсеры, нацеливающие на каждый из четырех генов фага MS2, с С- и G- PAM. G-PAM требуют более высоких концентраций фага для развития литических бляшек.

[166] На фиг. 77 продемонстрировано, что нацеливание на транскрипты RFP у бактерий замедляет скорость роста.

[167] Фиг. 78A-78D. На фиг. 78 A-В продемонстрировано, что LshC2c2 эффективно расщепляет РНК. Получение данных с использованием Minigel; не флюоресценция. На фиг. 78C продемонстрировано, что расщепление оцРНК LshC2c2 с использованием 5'-маркированных и 3'-маркированных мишеней было проанализировано в обозначенные моменты времени. На фиг. 78D представлена количественная оценка данных фиг. 78B.

[168] Фиг. 79: белок LshC2c2 и cr-РНК были инкубированы и последовательно разведены. Расщепление оцРНК было оценено с использованием обозначенных концентраций комплекса.

[169] На фиг. 80 продемонстрировано, что LshC2c2 эффективно расщепляет РНК. Считывание в 20-см слое геля; флуоресцентное изображение на 700 нм. Расщепление наблюдается только с меньшей РНК-мишенью длиной 85 нуклеотидов вместо обычной мишени длиной 173 нуклеотидов.

[170] На фиг. 81 представлено картирование фрагментов расщепления.

[171] На фиг. 82 представлено секвенирование РНК нуклеазной реакции in vitro.

[172] На фиг. 83 показано, что LshC2c2 не расщепляет нетранскрибированную или транскрибированную ДНК в RNAP E.coli при анализе in vitro. Анализ организован согласно Samai et al. (Cell, 2015). Использована мишень длиной 200 п.н. (соответствующая РНК-мишени фиг. 82). Инкубация в течение 1 ч при 37°C необходима для параллельной транскрипции и расщепления после формирования открытого комплекса.

[173] На фиг. 84 показано, что LshC2c2 не расщепляет оцДНК in vitro. Инкубация в течение 1 ч при 37°C, оцДНК-версия t3 G-PAM и последовательность, обратно комплементарная (RC) ей.

[174] Фиг. 85A-85B. На фиг. 85 представлено, что C2c2 не расщепляет дцДНК (A) и оцДНК (B). Гель для полос был экстрагирован и подготовлен к секвенированию последнего поколения с помощью Illumina MiSeq.

[175] На фиг. 86 показано, что LshC2c2 имеет 3'-G-PAM для расщепления РНК. Та же самая мишень с варьирующими PAM. (Показанная последовательность PAM является обратно комплементарной, так, что C на 5'-конце соответствует G на 3'-конце).

[176] На фиг. 87 показано, что LshC2c2 не требует малой РНК для расщепления РНК.

[177] На фиг. 88 показано, что LshC2c2 является перепрограммируемым и чувствительным к PAM.

[178] На фиг. 89 показано, что LshC2c2 является перепрограммируемым и чувствительным к PAM.

[179] Фиг. 90A-90B. На фиг. 90А и В показано, что расщепление оцРНК было проанализировано с помощью cr-РНК с различной длиной спейсера.

[180] Фиг. 91A-91C. На фиг. 91 А, B и C показано, что расщепление оцРНК, было проанализировано с использованием cr-РНК с различной длиной прямых повторов (DR). Расщепление РНК зависит от длины cr-РНК (фиг. 91 А, B). Расщепление РНК зависит от длины прямых повторов (DR) (фиг. 91C-E).

[181] Фиг. 92A-92D. На фиг. 92А, В, C и D представлены модификации стеблевой структуры CRISPR LshC2c2 и показано, что стеблевая структура подвержена отдельным заменам оснований, но активность нарушается только с изменением большей части вторичной структуры. Эксперименты по укорочению прямых повторов (DR) также указывают, что нарушение стеблевой структуры прекращает расщепление.

[182] Фиг. 93A-93D. На фиг. 93 А, В, C и D представлены модификации шпилечной структуры CRISPR LshC2c2 и показано, что шпилечная структура cr-РНК подвержена заменам оснований и удлинению, но не укорочению.

[183] На фиг. 94 показано, что C2c2 процессирует свою собственную последовательность. Буфер 1: 40 мМ Tris-HCl (pH 7,9), 6 мМ MgCl2, 70 мМ NaCl, 1 мМ DTT. Буфер 2: 40 мМ Tris-HCl (pH 7,3), 6 мМ MgCl2, 70 мМ NaCl, 1 мМ DTT, ингибитор РНК-азы мыши. LshC2c2 расщепляет как последовательность 1, так и последовательность 2 (последовательности различной длины) в обоих протестированных буферах. Расщепление становится очевидным по появлению более низких полос.

[184] На фиг. 95 показано, что мутанты по домену HEFN продолжают обладать способностью процессировать CRISPR-последовательность C2c2.

[185] На фиг. 96 показано, что процессинг последовательности C2c2 в E.coli требует присутствия белка C2c2.

[186] Фиг. 97A-97D. На фиг. 97A представлена схема, которая показывает различные мутации в домене HEPN в белке C2c2. Схема локуса и белка LshC2c2 показывает консервативные остатки в доменах HEPN. Фиг. 97В и C показывают, что каждый из мутантов по домену HEPN демонстрирует значительное снижение активности. C, вверху: в денатурирующем геле показаны консервативные остатки мотива HEPN, необходимые для расщепления оцРНК. C, внизу: количественная оценка анализа литических бляшек фага MS2 с мутантами в каталитических остатках домена HEPN. Локусы с мутантным LshC2c2 были неспособны защитить от фага. D, количественная оценка нацеливания на REP в E.coli с мутантами по аргинину в каталитических остатках домена HEPN. Локусы с мутантным LshC2c2 были неспособны к нокдауну RFP.

[187] На фиг. 98 представлен "эффект свидетеля". После активации C2c2 становится активным и деградирует другие РНК в образце. Верхний ряд: L=длинная мишень, small=короткая мишень, LC=длинная мишень с С-PAM. Нижний ряд: эффект присутствия или отсутствия активирующей мишени на расщепление различных мишеней-"свидетелей".

[188] Фиг. 99A-C. На фиг. 99А показано, что белок C2c2, мутантный по домену HEPN, продолжает обладать способностью связывать cr-РНК. На фиг. В и C показано влияние вторичной структуры РНК на продукт расщепления РНК-мишени.

[189] Фиг. 100A-100B. На фиг. 100A показывает эффект различных двухвалентных катионов на активность C2c2. Фиг. 100В показывает влияние наличия или отсутствия магния на титрование cr-РНК.

[190] На фиг. 101 продемонстрирована активность расщепления оцРНК белком LshC2c2 в денатурирующем геле с использованием мишени РНК, меченной на 5'-конце IRDye 800 и на 3'-конце - Cy5. Наблюдаются четыре независимых участка расщепления. Из этой фиг. также видно, что хелатирование ионов Mg2+ влияет на расщепление оцРНК под действием белка С2с2.

[191] На фиг. 102 показано, что C2c2 отщепляет 3'-конец мишени.

[192] На фиг. 103 показано, что C2c2 отщепляет 3'-конец мишени.

[193] На фиг. 104 показано перепрограммирование C2c2 с помощью cr-РНК.

[194] На фиг. 105 показано перепрограммирование C2c2 с помощью cr-РНК.

[195] На фиг. 106 показано перепрограммирование C2c2 с помощью cr-РНК.

[196] На фиг. 107 представлена IVC (нуклеазная реакция in vitro) длинной мишени.

[197] На фиг. 108 представлен "эффект свидетеля". В отсутствие магния наблюдается уменьшение расщепления.

[198] На фиг. 109 проиллюстрировано выравнивание последовательностей следующих ортологов: DSM 19757 C2c2Leptotrichia shahii; SB 1003 (RcS) Rhodobacter capsulatus; R121 (RcR) Rhodobacter capsulatus; DE442 (RcD) Rhodobacter capsulatus; MA2020 (Lb(X)) бактерий Lachnospiraceae; NK4A179 (Lb(X) бактерий Lachnospiraceae; DSM 10710 (CaC) [Clostridium] aminophilum; NK4A144 (Lb(X) бактерий Lachnospiraceae; F0279 (Lew) Leptotrichia wadei, F0279 (Lew7) Leptotrichia wadei; DSM 4847 (Cg) Carnobacterium gallinarum; WB4 (Pp) Paludibacter propionicigenes; 2b (Ls) Listeria seeligeri серовара 1; FSL R9-0317 (Liw) Listeria weihenstephanensis; и FSL М6-0635 (Lib) бактерий Listeria.

[199] На фиг. 110 представлены консервативные домены HEPN белков C2c2.

[200] На фиг. 111 показано, что мутанты С2с2 по домену HEPN сохраняют целевую активность связывания. Верхний ряд: использование способа сдвига электрофоретической подвижности для комплекса LshC2c2-cr-РНК дикого типа в отношении являющейся мишенью оцРНК и не являющейся мишенью комплементарной оцРНК. Нижние ряды: использование способа сдвига электрофоретической подвижности для комплекса LshC2c2-cr-РНК мутанта по домену HEPN R1278A в отношении являющейся мишенью оцРНК и не являющейся мишенью комплементарной оцРНК.

[201] Фиг. 112A-112D. На фиг. 112 представлен эффект нарушения комплементарности РНК-мишени и cr-РНК на РНК-азную активность LshC2c2. A. Количественная оценка одиночных нарушений комплементарности в различных положениях спейсера с использованием способа анализа литических бляшек фага MS2. Отдельные нарушения комплементарности имеют минимальный эффект на интерференцию фага. Положения нарушений комплементарности показаны красным; все нарушения комплементарности вызваны трансверсиями. B. Количественная оценка двойных нарушений комплементарности в различных положениях спейсера с использованием способа анализа литических бляшек фага MS2. Последовательные двойные нарушения комплементарности в середине спейсера прекращают интерференцию фага. Положения нарушений комплементарности показаны красным; все нарушения комплементарности вызваны трансверсиями. C. Расщепление in vitro белком Lshc2c2 для анализа одиночных нарушений комплементарности в cr-РНК. Одиночные нарушения комплементарности имеют минимальный эффект на расщепление оцРНК. Положения нарушений комплементарности показаны красным; все нарушения комплементарности вызваны трансверсиями. D. Расщепление in vitro белком Lshc2c2 для анализа двойных нарушений комплементарности в cr-РНК. Последовательные двойные нарушения комплементарности в середине спейсера прекращают активность LshC2c2. Положения нарушений комплементарности показаны красным; все нарушения комплементарности вызваны трансверсиями.

[202] Фиг. 113. Расщепление трех оцРНК-мишеней, имеющих одну и ту же последовательность, являющуюся мишенью cr-РНК, фланкированную различными последовательностями. Показана вторичная структура, и последовательность каждой из трех мишеней (вверху), паттерны расщепления белком C2c2 для каждой мишени продемонстрированы с использованием 10% геля PAGE (внизу).

[203] Фиг. 114A-114B. Картирование сайтов расщепления C2c2 с помощью секвенирования РНК: A, по положению; В, по вторичной структуре. A Графики для частоты наблюдения концов расщепления согласно данным секвенирования РНК для 5'-фиксированных фрагментов. Данные соотнесены со вторичной структурой (В). В, Сайты расщепления мишеней 1 и 3 картированы с помощью секвенирования РНК в реакции расщепления. Частота наличия концов каждого фрагмента (фиксированного на 5'-конце) соотнесена со значениями z-оценки и спроецирована на вторичную структуру мишени.

[204] На фиг. 115A-115I представлены вторичные структуры окружения мишени, которые в дальнейшем могут быть использованы для оценки эффективности расщепления C2c2 и картирования сайтов расщепления.

[205] Фиг. 116A-116E. Гетерологическая экспрессия локуса C2c2 Leptotrichia shahii опосредует значительную интерференцию РНК фага в Escherichia coli. (A) Схема скрининга интерференции бактериофага MS2. Библиотека, содержащая спейсеры, нацеливающие на все возможные последовательности в РНК-геноме фага MS2, была клонирована в матрицу CRISPR LshC2c2. Клетки, трансформированные нацеливающей на MS2 библиотекой спейсеров, были далее обработаны раствором с фагом и помещены в культуру для последующего отбора выживших клеток. Частоту встречаемости спейсеров сравнили с таковой для контрольных клеток (необработанных фагом), и спейсеры, для которых наблюдалось обогащение после обработки фагом, были использованы для создания логотипа PAM-последовательности. (B) График типа "ящик с усами", иллюстрирующий распределение нормализованных частот встречаемости cr-РНК при условии обработки фагом и контроля в повторности (n=2). Границами ящика являются первый и третий квартили, концы усов соответствуют 1 и 99 перцентилям. Значение среднего обозначено красной горизонтальной чертой. (C) Логотип, созданный на основе последовательностей, фланкирующих 3'-конец протоспейсеров, соответствующих тем спейсерам, для которых наблюдается обогащение, выявляющее присутствие 3'-концевой H-PAM (не G-PAM). (D) Анализ литических бляшек был использован для подтверждения функциональной значимости интерференции H-PAM в MS2. Все протоспейсеры, фланкированные PAM, отличной от П-PAM, демонстрируют выраженную интерференцию в фаге. Спейсеры были разработаны для нацеливания на ген mat фага MS2, их последовательности приведены ниже изображений литических бляшек; использованный спейсер в ненацеливающем контроле не комплементарен ни одной последовательности в геномах E.coli или MS2. Литические бляшки были получены в ходе серии полулогарифмических разведений. (E) Количественный анализ литических бляшек фага MS2, подтверждающих необходимость в H-PAM (не G). Для каждого PAM 4 было разработано нацеливающих на MS2 спейсера. Разведения фага были посеяны на бактериальный газон в серии полулогарифмических разведений, интерференция была оценена на основе максимального разведения, при котором не происходило образование литических бляшек. Каждая точка диаграммы рассеяния представляет собой среднее для трем биологических повторений и соответствует единственному спейсеру. Линии соответствуют среднему для 4 спейсеров для каждого PAM, ошибки показаны в виде s.e.m.

[206] Фиг. 117A-117D. LshC2c2 и cr-РНК опосредуют РНК-направляемое расщепление оцРНК. (A) Схема оцРНК-субстрата, на который нацелена cr-РНК, область протоспейсера выделена голубым, и PAM обозначен лиловой полосой. (B) В денатурирующем геле показано опосредованное cr-РНК расщепление оцРНК белком LshC2c2. Мишень оцРНК является меченной на 5'-конце IRDye 800 или на 3'-конце Cy5. Расщепление требует присутствия cr-РНК и прекращается при добавлении ЭДТА. Наблюдаются четыре участка расщепления. (С) В денатурирующем геле показана необходимость H-PAM (не G). Четыре идентичных, за исключением основания в PAM (обозначено лиловым X в схеме), оцРНК-субстрата использованы для реакции расщепления in vitro, активность по расщеплению оцРНК зависит от нуклеотида непосредственно на 3'-конце мишени. (D) Схема, показывающая пять протоспейсеров для каждого PAM на оцРНК-мишени (вверху). В денатурирующем геле показана направляемая cr-РНК активность белка LshC2c2 по расщеплению оцРНК. cr-РНК соответствуют нумерации протоспейсеров.

[207] Фиг. 118A-118I. Участки расщепления C2c2 определены вторичной структурой и последовательностью РНК-мишени (A) Схема мишеней гомополимерной оцРНК. Протоспейсер обозначен светло-голубой полосой. Участки гомополимера, образованные основаниями A (зеленым) и U (красным), перемежаются отдельными основаниями G (оранжевым) и C (фиолетовым). (B) В денатурирующем геле показаны паттерны опосредованного C2c2-cr-РНК расщепления каждого гомополимера. (C) В денатурирующем геле показаны паттерны опосредованного C2c2-cr-РНК расщепления трех негомополимерных мишеней оцРНК (1, 4, 5), которые имеют одинаковый протоспейсер, но фланкированы различными последовательностями. Вне зависимости от идентичных протоспейсеров, различные фланкирующие последовательности привели к различным паттернам расщепления (D, F и H). Участки расщепления негомополимерных мишеней оцРНК 1 (D), 4 (F) и 5 (H) были картированы с использованием секвенирования РНК продуктов расщепления. Частота расщепления по каждому основанию окрашена согласно z-оценке и показана на предсказанной вторичной структуре кофолдинга оцРНК и cr-РНК. Фрагменты, используемые для проведения анализа частот встречаемости, содержат полные 5'-концы. 5'- и 3'-концы мишени оцРНК обозначены соответственно голубыми и красными контурами. 5'- и 3'-концы спейсера (желтым контуром) выделены голубым и оранжевым соответственно. (E, G и I) Графики частот встречаемости участков расщепления для каждого положения оцРНК-мишеней 1, 4 и 5 для всех прочтений, начинающихся на 5'-конце. Область протоспейсера выделена голубым.

[208] Фиг. 119A-119E. Два домена HEPN C2c2 необходимы для направляемого CRISPR-РНК расщепления оцРНК, но не для направляемого CRISPR-РНК связывания оцРНК. (A) Схема локуса LshC2c2 и организация доменов белка LshC2c2, показывающая консервативные остатки в доменах HEPN. (B) Определение числа литических бляшек фага MS2 было выполнено с использованием мутантов по каталитическим остаткам HEPN. Для каждого мутанта был использован один и тот же нацеливающий cr-РНК протоспейсер 35. (C) В денатурирующем геле показаны консервативные остатки мотива HEPN, необходимые для направляемого cr-РНК расщепления оцРНК. (D) Результаты способа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA), использованного для оценки сродства комплекса LshC2c2-CRISPR-РНК дикого типа в отношении являющейся мишенью (слева) и не являющейся мишенью (справа) оцРНК-субстрата. Не являющаяся мишенью оцРНК-субстрат обратно комплементарна являющейся мишенью оцРНК. ЭДТА добавлена в реакционную среду с целью неспецифически снизить расщепление. (E) Результаты использования способа сдвига электрофоретической подвижности для комплекса LshC2c2(R1278A)-cr-РНК в сравнении с являющейся мишенью оцРНК и не являющейся мишенью комплементарной оцРНК (последовательности субстрата те же, что в D).

[209] Фиг. 120A-120B. Направляемая РНК РНК-азная активность белка LshC2c2 зависит от спейсера и длины прямых повторов. (A) В денатурирующем геле показана функция направляемого cr-РНК расщепления оцРНК 1 в зависимости от длины спейсера. (B) В денатурирующем геле показана функция направляемого cr-РНК расщепления оцРНК в зависимости от длины повтора.

[210] Фиг. 121A-121B. Направляемая РНК РНК-азная активность белка LshC2c2 зависит от структуры прямых повторов и аминокислотной последовательности. (A) Схема, изображающая модификации стеблевой структуры прямого повтора cr-РНК (вверху). Измененные основания выделены красным. В денатурирующем геле показано направляемое cr-РНК расщепление оцРНК 1 посредством каждой модифицированной cr-РНК (внизу). (B) Схема, изображающая модификации шпилечной структуры прямого повтора cr-РНК (вверху). Измененные основания обозначены красным, длина удаленных последовательность показана стрелками. В денатурирующем геле показано направляемое cr-РНК расщепление оцРНК посредством каждой из модифицированных cr-РНК (внизу).

[211] Фиг. 122A-122D. Влияние нарушений комплементарности РНК-мишени и cr-РНК на РНК-азную активность белка LshC2c2. (A) Подсчет числа литических бляшек фага MS2 для изучения единичных нарушений комплементарности в различных положениях спейсера. Единичные нарушения комплементарности имеют минимальный эффект на интерференцию фага. Положение и идентичность нарушений комплементарности обозначены красным. (B) Подсчет числа литических бляшек фага MS2 для изучения двойных нарушений комплементарности в различных положениях спейсера. Последовательные двойные нарушения комплементарности в середине спейсера прекращают интерференцию фага. Положение и идентичность нарушений комплементарности обозначены красным. (C) Схема, показывающая положение и идентичность нарушений комплементарности (красным) в спейсере cr-РНК (вверху). В денатурирующем геле показано расщепление оцРНК 1, направляемое cr-РНК с единичными нарушениями комплементарности в спейсере (внизу). (D) Схема, показывающая положение и идентичность двойных нарушений комплементарности (красным) в спейсере cr-РНК (вверху). В денатурирующем геле показано расщепление оцРНК 1, направляемое cr-РНК с парами нарушений комплементарности в спейсере (внизу).

[212] Фиг. 123A-123E. Нокдаун мРНК RFP путем перенацеливания LshC2c2. (A) Схема, показывающая направляемый cr-РНК нокаут RFP в E.coli, осуществляющей гетерологическую экспрессию локуса LshC2c2. Три нацеливающих на RFP спейсера были отобраны для каждого PAM, отличного от G-PAM, каждый протоспейсер мРНК RFP пронумерован. (B) Нацеливающие на мРНК RFP спейсеры оказывают влияние на нокдаун RFP, тогда как нацеливающие на ДНК спейсеры (кодирующие цепь гена RFP в экспрессирующей плазмиде, обозначенные как спейсеры "rc"), не влияют на экспрессию RFP, число биологических повторений n=3. (C) Количественная оценка нокдауна RFP в E.coli. Три спейсера, нацеливающих на соответственно фланкирующие C-, U- или А-PAM протоспейсеры (9 спейсеров с номерами 5-13 согласно обозначениям ряда (A)) были встроены в мРНК RFP, экспрессия RFP была измерена с помощью поточной цитометрии. Каждая точка на диаграмме рассеяния изображает среднее для трех биологических повторений и соответствует единственному спейсеру. Полосы показывают среднее значение для 4 спейсеров каждого PAM, ошибка показана в виде стандартной ошибки среднего. (D) Анализ кривой роста E.coli. (E) Влияние нацеливания на мРНК RFP на скорость роста трансформированной индуцируемой плазмидой экспрессии RFP и локусом LshC2c2 E.coli с ненацеливающим спейсером, нацеливающим на РНК спейсером (комплементарным некодирующей цепи гена RFP) и нацеливающим на ДНК спейсером (комплементарным кодирующей цепи гена RFP).

[213] Фиг. 124A-124B. Направляемое cr-РНК расщепление оцРНК-мишени активирует неспецифическую РНК-азную активность белка LshC2c2. (A) Схема биохимического анализа неспецифической РНК-азной активности не являющихся мишенью cr-РНК побочных молекул РНК. В дополнение к немаркированному оцРНК-субстрату, являющемуся мишенью РНК CRISP,R в ту же реакцию с целью отследить неспецифическую РНК-азную активность была добавлена вторая оцРНК, меченная на 3'-конце флуоресцентной меткой. (B) В денатурирующем геле показана неспецифическая РНК-азная активность против оцРНК-субстратов, не являющихся мишенью, в присутствии РНК-мишени. Не являющиеся мишенью оцРНК-субстраты не подвергаются расщеплению в отсутствие оцРНК-субстрата, являющегося мишенью cr-РНК.

[214] Фиг. 125. C2c2 является РНК-системой адаптивного иммунитета, предположительно участвующей в абортивной инфекции через программируемую клеточную смерть или индукцию состояния покоя клеток.

[215] Фиг. 126. Секвенирование РНК локуса Leptotrichia shahii, гетерологически экспрессированного в E.coli, и анализ спейсера. Адаптировано по S. Shmakov et al., Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems, Mol Cell 60, 385-397 (2015). Гетерологическая экспрессия локуса LshC2c2 выявляет процессинг данной последовательности. Вставка: In silico анализ кофолдинга зрелого прямого повтора.

[216] Фиг. 127A-127D. Повторный скрининг с использованием фага MS2 показал воспроизводимое отсутствие 5'-концевого PAM. (A) Сравнение повторностей контроля (без фага) показало воспроизводимость результатов и отсутствие обогащения или обеднения последовательности. (B) Сравнение повторений эксперимента с использованием фага показало как существенное обеднение, так и обогащение популяции, общей для обоих повторений. (C) Логотип последовательностей из обогащенных спейсеров для 5'-конца показывает отсутствие PAM. (D) Частота встречаемости оснований последовательности 5'-конца из обогащенных спейсеров показывает отсутствие PAM.

[217] Фиг. 128A-128G. Скрининг представленности спейсеров в различных PAM с помощью библиотек фага MS2. (A) График типа "ящик с усами", иллюстрирующий распределение частот встречаемости спейсеров, сгруппированных по их 3'-концевой последовательности при условии обработки фагом. Границами ящика являются первый и третий квартили, концы усов соответствуют 1 и 99 перцентилям. ****, p < 0,0001. (B) Множественное сравнение (ANOVA с критерием Тьюки) для всех возможных пар PAM для распределения обработанных фагом спейсеров. Изображены доверительные интервалы для разности средних между сравниваемыми парами PAM. (C) График типа "ящик с усами", иллюстрирующий распределение частот встречаемости спейсеров, сгруппированных по их 3'-концевой последовательности при отсутствии обработки фагом. Границами ящика являются первый и третий квартили, концы усов соответствуют 1 и 99 перцентилям. ****, p < 0,0001. (D) Множественное сравнение (ANOVA с критерием Тьюки) для всех возможных пар PAM для распределения необработанных фагом спейсеров. Изображены доверительные интервалы для разности средних между сравниваемыми парами PAM. (E) Графики кумулятивной частоты встречаемости для log2-нормированного количества спейсеров. Спейсеры разделены соответствующей PAM-последовательностью с целью показать различия в обогащении для каждого распределения PAM. (F) Средняя разность для кумулятивной частоты встречаемости между кумулятивными кривыми при условии обработки и отсутствия обработки фагом. Разности показаны для каждого распределения PAM. (G) Пунктирный контур из (F), показанный крупным планом с целью подчеркнуть различия между обогащениями для различных PAM.

[218] Фиг. 129A-129B. Лучшие результаты скрининга с помощью фага MS2 демонстрируют интерференцию при анализе литических бляшек. (A) Изображения скрининга посредством анализа литических бляшек фага MS2, показывающие сниженное образование литических бляшек для наилучших результатов. Разведения фага были нанесены на бактериальный газон с уменьшением числа бляшкообразующих единиц (БОЕ). Спейсеры-мишени показаны выше изображений; биологические повторности обозначены как BR1, BR2 или BR3. Ненацеливающим контролем является нативный локус белка LshC2c2. (B) Количественная оценка анализа литических бляшек MS2, демонстрирующая интерференцию с участием наилучших результатов. Интерференция была количественно оценена по наибольшему разведению без образования литических бляшек.

[219] Фиг. 130. Анализ литических бляшек фага MS2, подтверждающий наличие 3'-концевого H-PAM. Четыре спейсера для каждого возможного 3'-концевого (A-, G-, C- и U-) PAM были клонированы в вектор pLshC2c2 и проверены на рестрикцию фага MS2 в анализе литических бляшек. Данные изображения показывают значительно сниженное образование литических бляшек для A-, C- и U-PAM и сниженный уровень рестрикции для G-PAM. Фаговые разведения были нанесены бактериальный газон с уменьшением числа бляшкообразующих единиц (БОЕ). Спейсеры-мишени показаны выше изображений; три биологические повторности приведены друг под другом ниже каждой последовательности протоспейсера. Ненацеливающим контролем являются нативный локус белка LshC2c2 и остов pACYC 184.

[220] Фиг. 131A-131D. Очистка белка LshC2c2. (A) Окрашенный кумасси синим акриламидный гель для поэтапной очистки белка LshC2c2. Выраженная полоса непосредственно выше 150 кДа согласуется с размером белка LshC2c2 (171 кДа). (B) Гель-фильтрация для исключения по размеру белка LshC2c2. LshC2c2 элюирован при заданном размере примерно >160 кДа (62,9 мл). (C) Белковые стандарты, использованы для калибровки колонки Superdex 200. BDex=голубой декстран (объем пустот), Ald=альдолаза (158 кДа), Ov=овальбумин (44 кДа), RibA=Рибонуклеаза A (13,7 кДа), Apr=апротинин (6,5 кДа). (D) Кривая калибровки колонки Superdex 200. Kav рассчитана как (элюированный объем - объем пустот)/(геометрический объем колонки - объем пустот). Стандарты изображены на графике в виде логарифмических кривых.

[221] Фиг. 132A-132B. Дальнейшее описание in vitro кинетики расщепления РНК белком LshC2c2. (A) Временной ряд расщепления оцРНК белком LshC2c2, полученный с помощью меченной с 5 '-и 3'-концов мишени 1. (B) Расщепление меченной с 5'-и 3'-концов РНК-мишени 1 с помощью комплекса LshC2c2-CRISPR-РНК на различных этапах серии полулогарифмических разведений.

[222] Фиг. 133. Зависимость расщепления РНК белком LshC2c2 от присутствия ионов металлов. Различные двухвалентные катионы металлов были добавлены в реакционную среду расщепления посредством LshC2c2 с использованием меченой с 5'-конца мишени 1. Существенное усиление расщепления наблюдается только для Mg+2. Для Ca+2 и Mn+2 наблюдается слабое расщепление.

[223] Фиг. 134A-134D. Белок LshC2c2 не показал заметной активности по расщеплению при использовании в качестве субстратов дцРНК, дцДНК или оцДНК. (A) Схема частично двухцепочечной РНК-мишени. Меченную с 5'-конца мишень 1, подвергали отжигу с двумя короткими РНК, комплементарными областям, фланкирующими протоспейсер. Такие частично двухцепочечные РНК служат для более точной проверки нарезания дцДНК, поскольку должны позволять связывание комплекса LshC2c2 с оцРНК. (B) Активность LshC2c2 по расщеплению мишени-дцРНК, показанной в (A) в сравнении с оцРНК-мишенью 1. При использовании в качестве субстрата дцРНК расщепление не обнаружено. (C) Расщепление белком LshC2c2 плазмидной библиотеки дцДНК. Плазмидная библиотека была создана с целью получения семи случайных нуклеотидов в 5'-концевом протоспейсере 14 с целью учета всех возможных условий для расщепления дцДНК. Никакое расщепление не наблюдается для этой библиотеки дцДНК. (D) Проверка варианта оцДНК-мишени 1 на предмет расщепления белков LshC2c2. Расщепление не обнаружено.

[224] Фиг. 135A-135B. LshC2c2 не демонстриурет заметной активности по расщеплению дцДНК-мишеней согласно анализу котрансляционного расщепления. (A) Схема анализа котрансляционного расщепления. C2c2 был инкубирован с элонгационными комплексами РНК-полимеразы E.coli RNA (RNAP) и rNTP, как это описано выше (P. Samai et al., Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage during Type III CRISPR- Cas Immunity. Cell 161, 1164-1174 (2015)). (B) Расщепление белком LshC2c2 мишени-ДНК после анализа котрансляционного расщепления. Расщепление не обнаружено.

[225] Фиг. 136. Анализ рестрикции MS2 показывает, что мутанты с единичными мутациями в домене HEPN дезактивируют LshC2c2. Все четыре возможных HEPN с единичными мутациями (R597A, H602A, R1278A и H1283A) были получены в векторе pLshC2c2 с протоспейсером 1. Изображения анализа негативных колоний показывают, что такие мутантные локусы HEPN приводят к образованию негативных колоний, сходному с таковым для ненацеливающего локуса, которое значительно больше, чем для локуса WtC2c2. Разведения фага были высеяны на бактериальный газон с уменьшением числа бляшкообразующих единиц (БОЕ). Спейсеры-мишени показаны выше изображений; биологические повторения обозначены как BR1, BR2 или BR3. Ненацеливающим контролем является нативный локус LshC2c2.

[226] Фиг. 137A-137F. Количественная оценка связывания LshC2c2. (A) Расчет аффинности связывания для комплекса LshC2c2-CRISPR-РНК и оцРНК-мишени. Доля связанного белка была количественно определена с помощью денситометрии на фиг. 413, KD была вычислена по изотерме связывания. (B) Расчет аффинности связывания комплекса LshC2c2 с CRISPR-РНК для мутанта по HEPN R1278A в сравнении с мишенью-оцРНК. Доля связанного белка была количественно определена с помощью денситометрии на фиг. 4E, KD была вычислена по изотерме связывания. (C) Анализ способом сдвига электрофоретической подвижности для мутанта по HEPN белка LshC2c2 R1278A в сравнении с мишенью-оцРНК в отсутствие cr-РНК. В реакционную среду был добавлен ЭДТА. (D) Анализ способом сдвига электрофоретической подвижности для cr-РНК в сравнении с оцРНК-мишенью. В реакционную среду был добавлен ЭДТА. (E) Расчет сродства связывания LshC2c2 мутанта по HEPN R1278A с оцРНК-мишенью в сравнении с мишенью-оцРНК. Доля связанного белка была количественно определена с помощью денситометрии на фиг. S12C, KD была вычислена по изотерме связывания. (F) Расчет сродства связывания CRISPR-РНК с оцРНК-мишенью. Доля связанной CRISPR-РНК была количественно определена с помощью денситометрии на фиг. S12D, KD была вычислена по изотерме связывания.

[227] Фиг. 138. Анализ рестрикции в MS2 с целью выявить влияние единичных и двойных нарушений комплементарности на активность LshC2c2. Вектор pLshC2c2 с протоспейсером 41 был модифицирован с целью получения ряда единичных нарушений комплементарности, как это показано на рисунке. Изображения анализа негативных колоний, выполненного с целью проверки таких спейсеров с нарушением комплементарности и выявившего уменьшение образования для спейсеров с единичными нарушениями комплементарности наравне с полностью комплементарным спейсером. Спейсеры с двойными нарушениями комплементарности демонстрируют усиленное образование негативных колоний в случае если это нарушение локализовано в последовательности затравки в середине последовательности спейсера. Разведения фага высевали на чашках с бактериями с последовательным уменьшением бляшкообразующих единиц (БОЕ). Мишени спейсера приведены выше изображений; биологические повторения обозначены как BR1, BR2 или BR3. Ненацеливающим контролем является нативный локус LshC2c2.

[228] Фиг. 139. Мутант по HEPN белка LshC2c2 был проверен на активность нацеливания на мРНК RFP. Вектор pLshC2c2 с протоспейсером 36 был модифицирован таким образом, чтобы были получены единичные мутации по HEPN R597A и R1278A (по одной в каждом из доменов HEPN). Эти мутации привели к небольшому, но обнаружимому нокдауну RFP, согласно данным поточной цитометрии для E.coli.

[229] Фиг. 140A-140B. Биохимическое описание сопутствующего эффекта расщепления. (A) LshCc2 был инкубирован с cr-РНК, нацеливающей на протоспейсер 14, в присутствии и в отсутствие немеченной мишени-оцРНК 1 (содержит протоспейсер 14). В присутствии мишени 1 белка LshC2c2 наблюдается существенное расщепление флуоресцентно меченых некомплементарных мишеней 6-9. (B) Побочная активность мутанта по HEPN в сравнении с WT C2c2. Белки были инкубированы с комплементарной к протоспейсеру 14 cr-РНК в присутствии и в отсутствии немеченых гомополимеров-мишеней 2 или 3 (обе содержат протоспейсер 14). Сопутствующий эффект белков с мутациями по HEPN в отношении флуоресцентно меченой некомплементарной мишени 8 более не наблюдается.

[230] Фиг. 141A-141B. Подавление роста коррелирует с нокдауном RFP в экспрессирующих C2c2 и cr-РНК, нацеленную на RFP, клетках. На фиг. 141A представлено влияние на рост экспрессии RFP вызываемой в E.coli, экспрессирующей C2c2 и cr-РНК, нацеленную на RFP. RFP был экспрессирован с использованием индуцируемой ангидротетрациклином (aTc) системы экспрессии гена. Клеточные культуры были обработаны aTc в указанных концентрациях. Увеличение экспрессии aTc подавляло роста клеток. На фиг. 141B представлено влияние факта замены ненацеленной cr-РНК на нацеленную на RFP cr-РНК на рост индуцибельной экспрессии RFP.

[231] Фиг. 142A-142D. C2c2 предпочтительно расщепляет поли(U)-участки. Расщепление оцРНК белком C2c2 было исследовано с использованием субстрата-оцРНК, содержащего либо не содержащего поли(U)-участки. Меченая на конце оцРНК была инкубирована с C2c2 и cr-РНК с установлением продуктов расщепления. Субстрат-РНК, содержащий поли(U)-участки, расщеплялся эффективно. Расщепление субстрата носило зависимый от cr-РНК характер, как следует из отсутствия продуктов расщепления в присутствии C2c2, но не cr-РНК. Ряды A и B: субстрат, меченый с 3'-конца. Ряды C и D: субстрат, меченый с 5'-конца. Ряды В и D указывают на эффективность и специфичность расщепления субстрата при увеличении концентрации субстрата.

[232] Фиг. 143A-143B. Расщепление РНК-мишени, имеющей нарушение комплементарности cr-РНК в зависимости от ее положения. ОцРНК-мишень была подвергнута воздействию cr-РНК, содержащей двойные (ряд A) или тройные (ряд B) нарушения комплементарности, а также LshC2c2. Продукты реакции расщепления были разделены припомощи электрофореза.

[233] Фиг. 144. Расщепление РНК-мишени чувствительно к мутациям и делециям в области 3'-концевых прямых повторов. ОцРНК-мишень была подвергнута воздействию LshC2c2 и cr-РНК, содержащей нарушения комплементарности или делеции, введенные с целью нарушить вторичную структуру в области прямых повторов (DR). Продукты реакций расщепления были разделены с помощью электрофореза.

[234] Фиг. 145A-145B. C2c2 и MS2-CRISPR-РНК могут связывать оцРНК. Фиг. 145A: определение связывания LshC2c2(R1278A), являющегося дефектным в отношении расщепления субстрата. Фиг. 145B: LshC2c2(R1278A) и MS2-CRISPR-РНК были инкубированы с увеличением количества меченой оцРНК 10 (левый ряд) или меченой обратно комплементарной (RC) оцРНК 10 (правый ряд) (последовательность оцРНК 10 см. в таблице В).

[235] Фиг. 146. Комплекс C2C2 не связывает оцДНК. LshC2c2(R1278A) и MS2-CRISPR-РНК были инкубированы с увеличением количества оцДНК 10 (левый ряд) или обратно комплеметарной оцДНК 10 (RC) (правый ряд) (последовательность оцРНК 10 см. в таблице В).

[236] Чертежи приведены в настоящем описании исключительно в иллюстративных целях и не обязательно выполнены с соблюдением масштаба.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[237] В целом, понятие "система CRISPR-Cas или CRISPR", используемое также в предшествующих документах, таких как W0 2014/093622 (PCT/US2013/074667), используется для совместного обозначения транскриптов и других компонентов, участвующих в экспрессии или управлении активностью CRISPR-ассоциированных ("Cas") генов, включая последовательности, кодирующие ген Cas, последовательность tracr (трансактивирующая CRISPR) (например, tracr-РНК или активная частичная tracr-РНК), последовательность tracr-помощника (включащая "прямой повтор" и процессируемый tracr-РНК частичный прямой повтор в составе эндогенной системы CRISPR), направляющую последовательность (также называемую "спейсером" в составе эндогенной системы CRISPR) или "молекулу(ы) РНК", как этот термин использован в настоящем описании (например, молекулу(ы) РНК, направляющую Cas, такие как Cas9, например, CRISPR-РНК и трансактивирующую (tracr) РНК или одиночную направляющую РНК (sgRNA) (химерная РНК)) или другие последовательности и транскрипты локуса CRISPR. В целом, система CRISPR характеризуется компонентами, которые способствуют формированию комплекса CRISPR на участке последовательности-мишени (в составе эндогенной системы CRISPR также называемый протоспейсером). Если белком CRISPR является белок C2c2, tracr-РНК не требуется.

[238] В контексте формирования комплекса CRISPR, "последовательность-мишень" означает последовательность, для которой целенаправленно разработана комплементарная направляющая последовательность, причем гибридизация между последовательностью-мишенью и направляющей последовательностью способствует образованию комплекса CRISPR. Последовательность-мишень может включать любой полинуклеотид, в том числе полинуклеотиды РНК или ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень расположена в ядре или цитоплазме клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения прямые повторения могут быть идентифицированы in silico путем поиска повторяющихся мотивов, которые удовлетворяют любому или всем из следующих критериев: 1. обнаружены в пределах области геномной последовательности размером 2 т.п.н., фланкирующей локусы CRISPR II типа; 2. длина от 20 до 50 п.н.; и 3. разделяющие их промежутки длиной 20-50 п.н. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут быть использованы любые 2 из этих критериев, например, 1 и 2, 2 и 3 или 1 и 3. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут быть использованы все 3 критерия.

[239] В вариантах осуществления изобретения такие понятия как направляющая последовательность и направляющая РНК, т.е. РНК, способная направлять Cas к целевому локуса генома, используются взаимозаменяемо в предшествующих цитируемых документах, таких как W0 2014/093622 (PCT/US 2013/074667). В целом, направляющей последовательностью является любая полинуклеотидная последовательность, имеющая комплементарность к полинуклеотиду-мишени, достаточную для гибридизации с последовательностью-мишенью и направления последовательности на прямое специфическое связывание комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью. В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень комплементарности между направляющей последовательностью и соответствующей ей последовательностью-мишенью при условии оптимального выравнивания с использованием надлежащего алгоритма выравнивания близок или превосходит значения 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или выше. Оптимальное выравнивание может быть определено с использованием любого надлежащего алгоритма для выравнивания последовательностей включая, но не ограничиваясь следующими: алгоритм Смита-Ватермана, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритмы, основанные на преобразовании Барроуза-Уилера (например, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAST, Novoalign (Novocraft Technologies; доступен на www.novocraft.com), ELAND (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США), SOAP (доступен на soap.genomics.org.cn) и Maq (доступен на maq.sourceforge.net). В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность имеет длину, примерно равную или превышающую 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность имеет длину, меньшую 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 или менее нуклеотидов. Предпочтительная длина направляющей последовательности составляет 10-30 нуклеотидов. Способность направляющей последовательности направлять специфически определяемое последовательностью связывание комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью может быть оценена любой подходящей методикой. Например, компоненты системы CRISPR, достаточные для формирования комплекса CRISPR, включая проверяемую направляющую последовательность, могут быть доставлены в клетку-хозяина, содержащую соответствующую последовательность-мишень, в том числе путем трансфекции с использованием векторов, кодирующих компоненты последовательности CRISPR с последующей количественной оценкой локализации предпочтительного расщепления последовательности-мишени, в частности, с использование анализа, как описано в настоящем описании. Сходным образом расщепление последовательности нуклеотида-мишени может быть оценено in vitro при использовании последовательности-мишени, компонентов комплекса CRISPR, включая проверяемую направляющую последовательность и направляющую последовательность-контроль, отличную от тестируемой направляющей последовательности при сравнении уровня или скорости расщепления последовательности-мишени между реакциями с участием тестируемой и контрольной направляющих последовательностей. Другие способы анализа также допустимы и могут быть выбраны специалистом в данной области.

[240] В классических системах CRISPR-Cas уровень комплементарности между последовательностью направляющей молекулы и соответствующей ей последовательностью-мишенью может быть примерно равен или превышать 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или 100%; направляющая молекула или РНК или sg-РНК могут быть иметь длину, примерно равную или превышающую 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов; либо направляющая молекула или РНК или sg-РНК могут иметь длину, меньшую чем приблизительно 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 или менее нуклеотидов. Однако в одном из своих аспектов изобретение призвано уменьшить нецелевые взаимодействия, например, уменьшить взаимодействие направляющей молекулы с молекулой-мишенью с низкой комплементраностью. Действительно, в примерах показано, что в изобретение вовлекает мутации, делающие систему CRISPR-Cas способной различать последовательности-мишени и последовательности, не являющиеся мишенями, с комплементарностью более 80% до примерно 95%, например, с комплементарностью 83%-84%, 88-89% или 94-95% (к примеру, различая молекулу-мишень, имеющую 18 нуклеотидов молекулы, не являющейся мишенью, длиной в 18 нуклеотидов с 1, 2 или 3 нарушениями комплементарности). В соответствии с этим, в контексте настоящего изобретения уровень комплементарности между направляющей последовательностью и соответствующей ей молекулой-мишенью превышает 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100%. Для молекулы, не являющейся мишенью, он составляет менее 100%, 99,9%, 99,5%, 99%, 99%, 98,5%, 98%, 97,5%, 97%, 96,5%, 96%, 95,5%, 95%, 94,5%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% или 80% комплементарности между ее последовательностью и направляющей молекулой, причем предпочтительно, чтобы не являющаяся мишенью молекула имела комплементарность последовательности 100%, 99,9%, 99,5%, 99%, 99%, 98,5%, 98%, 97,5%, 97%, 96,5%, 96%, 95,5%, 95% или 94,5% с направляющей молекулой.

[241] В некоторых вариантах осуществления изобретения направленные изменения эффективности расщепления могут быть достигнуты за счет введения нарушений комплементарности, например 1 или более нарушений комплементарности, к примеру 1 или 2 нарушения комплементарности между последовательностью спейсера и последовательностью-мишенью, включая положение нарушения комплементарности вдоль спейсера/мишени. Чем более отдаленное от концов (т.е. не 3'- или 5'-концевое) положение занимает, в частности, двойное нарушение комплементарности, тем больше изменится эффективность расщепления. В соответствии с этим, выбирая локализацию нарушения комплементарности на последовательности спейсера, можно направленно изменять эффективность расщепления. К примеру, если желательно расщепление меньше чем 100% молекул-мишеней (например, в популяции клеток), возможно введение 1 или больше, предпочтительно 2-х, нарушений комплементарности между спейсером и последовательностью-мишенью. Чем более центральное положение имеет нарушение комплементарности, тем ниже процент расщепленных молекул.

[242] Согласно изобретению, описанные в настоящем описании способы подразумевают индукцию одной или более модификаций нуклеотидов в эукариотической клетке (in vitro, т.е. в изолированной эукариотической клетке), как описано в настоящем описании, включая доставку в клетку вектора. Такая мутация(и) может подразумевать вставку, удаление или замену одного или более нуклеотидов в каждой последовательности-мишени указанных клеток посредством направляющей(направляющих) РНК или sg-РНК. Мутации могут включать инсерцию, делецию или замену 1-75 нуклеотидов в каждой последовательности-мишени указанной клетки(клеток) с использованием направляющей(их) РНК. Такие мутации могут включать инсерцию, делецию или замену 1, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 или 75 нуклеотидов в каждой последовательности-мишени указанной клетки(клеток) с использованием направляющей(их) РНК. Такие мутации могут включать инсерцию, делецию или замену 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 или 75 нуклеотидов в каждой последовательности-мишени указанной клетки(клеток) с использованием направляющей(их) РНК. Такие мутации могут включать инсерцию, делецию или замену 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 или 75 нуклеотидов в каждой последовательности-мишени указанной клетки(клеток) с использованием направляющей(их) РНК. Такие мутации могут включать инсерцию, делецию или замену 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, или 75 нуклеотидов в каждой последовательности-мишени указанной клетки(клеток) с использованием направляющей(их) РНК. Такие мутации могут включать инсерцию, делецию или замену 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 или 500 нуклеотидов в каждой последовательности-мишени указанной клетки(клеток) с использованием направляющей(их) РНК.

[243] Для минимизации токсичности и побочных эффектов важно управлять концентрациями доставленных мРНК или белка Cas и направляющей РНК. Оптимальные концентрации мРНК или белка Cas и направляющей РНК могут быть определены путем проверки различных концентраций в клеточной или животной (эукариотического животного, отличного от человека) и применения глубокого секвенирования для анализа протяженности модификации на потенциальном геномном локусе, не являющемся целевым.

[244] Как правило, в контексте эндогенной системы CRISPR, образование комплекса CRISPR (содержащего направляющую последовательность, гибридизованную с последовательностью-мишенью и образовавшую комплекс с одним или более белками Cas), приводит к расщеплению непосредственно в последовательности-мишени или вблизи нее (например, на расстоянии в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 или более пар оснований).

[245] Предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая Cas, представляла сбой кодон-оптимизированную последовательность кодонам Cas. Примером оптимизированной по кодонам последовательности в данном случае является последовательность, оптимизированная для экспрессии в эукариоте, например, человеке (т.е. являющаяся оптимизированной для экспрессии в человеке) или другом эукариоте, животном или млекопитающем, как обсуждается в настоящем описании; см, например, кодон-оптимизированную для человека последовательность SaCas9 в WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667). Хотя это будет является предпочтительным, также будет понятно, что возможны другие примеры и оптимизация кодонов для клеток-хозяев, отличных от клеток человека, или оптимизация кодонов для конкретных органов известна. В некоторых вариантах осуществления, кодирующая фермент последовательность кодирует Cas и кодон-оптимизирована для экспрессии в конкретных клетках, например, эукариотических клетках. Такие эукариотические клетки могут принадлежать или быть выделены из конкретного организма, в частности млекопитающего, включая, но не ограничиваясь этим: человека, отличного от человека эукариота, животного или млекопитающего, как описано в настоящем описании, например, мыши, крысы, кролика, собаки, домашнего скота или отличного от человека млекопитающего или примата. В некоторых вариантах осуществления, способы модификации генетической принадлежности зародышевой линии человека и/или способы модификации генетической принадлежности животных, которые с большой долей вероятности могут причинить им страдания без получения существенной медицинской пользы для человека или животных, а также получаемые в результате таких способов животные, могут быть исключены. В целом под оптимизацией кодонов понимается процесс изменения последовательности с целью усиления экспрессии в клетках заданного организма путем замены по меньшей мере одного кодона (например, примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или большего количества кодонов) нативной последовательности на кодоны, которые более часто или наиболее часто используются в генах таковой клеток целевого организма при сохранении исходной аминокислотной последовательности. Различные виды демонстрируют конкретное смещение в частоте встречаемости отдельных кодонов для отдельных аминокислот. Смещение частоты кодонов (различие в использовании кодонов между различными организмами) зачастую коррелирует с эффективностью трансляции матричной РНК (мРНК), которая в свою очередь считается зависящей, в числе прочего, от свойств транслируемых кодонов и доступности отдельных молекул транспортной РНК (тРНК). Преобладание конкретных тРНК в клетке обычно соответствует тем кодонам, которые используются наиболее часто при синтезе пептидов. В соответствии с этим, гены могут быть разработаны с учетом оптимизации кодонов, делающей экспрессию генов оптимальной в некотором организме. Таблицы используемых кодонов доступны, к примеру, в "Базе данных использования кодонов" ("Codon Usage Database"), доступной по ссылке www.kazusa.orjp/codon/, причем такие таблицы могут быть адаптированы рядом способов. См. Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). Также доступны компьютерные алгоритмы оптимизации кодонов для конкретной последовательности и экспрессии в конкретной клетке-хозяине, такие как Gene Forge (Aptagen; Джакобус, Пенсильвания, США). В некоторых вариантах осуществления один или более кодонов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более, либо все кодоны) в последовательности, кодирующей Cas, соответствуют наиболее часто используемым кодонам для определенной аминокислоты.

[246] В некоторых вариантах осуществления изобретения способы, как описано в настоящем описании, могут включать доставку Cas в трансгенную клетку, в которой одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих одну или более молекул направляющих РНК, доставленных или непосредственно введенных, связаны в клетке с регуляторным элементом, содержащим промотор одного или более генов-мишеней. Термин "трансгенная по Cas клетка", как используют в настоящем описании, относится к клетке, в частности, эукариотической клетке, в геном которой встроен ген Cas. Природа, тип или происхождение такой клетки не ограничивается особым образом, согласно данному изобретению. Также способ введения трансгена Cas в клетку может различаться и являться любым из способов, доступных в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения трансгенная клетка Cas получена путем введения трансгена Cas в выделенную клетку. В некоторых других вариантах осуществления изобретения трансгенная клетка Cas может быть получена путем выделения клеток из трансгенного организма Cas. В качестве не ограничивающего примера, трансгенная клетка Cas, как используют в настоящем описании, может быть получена из трансгенного по Cas эукариотического организма, такого как эукориотический организм с встроенным Cas. См. WO 2014/093622 (PCT/US 13/74667), включенную в настоящее описание в качестве ссылки. Способы публикации патентов США № 20120017290 и 20110265198, закрепленных за Sangamo BioSciences, Inc., направленные на нацеливание на локус Rosa, могут быть изменены для использования системы CRISPR Cas данного изобретения. Способы публикации патента США № 20130236946, закрепленных за Cellectis, направленные на нацеливание на локус Rosa, могут также быть изменены для использования системы CRISPR-Cas по настоящему изобретению. В качестве следующего примера приводится ссылка на статью Platt et. al. (Cell; 159(2):440-455 (2014)) с описанием мыши со вставкой Cas9 мыши, включенную в настоящее описание в качестве ссылки. Трансген Cas, кроме того, может включать кассету Lox-Stop-polyA-Lox(LSL), что делает экспрессию Cas управляемой с помощью рекомбиназы Cre. Альтернативно, клетка с трансгенным Cas может быть получена путем введения трансгена Cas в выделенную клетку. Системы доставки трансгенов хорошо известны в данной области. Примером может служить доставка трансгена Cas, напримр, в эукариотическую клетку посредством вектора (например, AAV, аденовируса, лентивируса) и/или частицы и/или наночастицы, как также описано в другой части настоящего описания.

[247] Для квалифицированного специалиста будет понятно, что клетка, такая как трансгенная по Cas клетка в используемом в настоящем описании значении, может содержать дальнейшие изменения генома помимо наличия встроенного гена Cas или мутаций, являющихся результатом последовательность-специфического действия Cas, в комплексе с РНК, способной направлять Cas к локусу-мишени, например, такие как одна или более онкогенных мутаций, как в качестве неограничивающего примера описано в Platt et al. (2014), Chen et al., (2014), или Kumar et al. (2009).

[248] В некоторых вариантах осуществления последовательность Cas объединена с одной или более последовательностями сигнала ядерной локализации (NLS), в частности примерно с или более чем примерно с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS. В некоторых вариантах осуществления Cas содержит примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS на N-конце или вблизи него, примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS на C-конце или их комбинацию (например, ноль или по меньшей мере один или более NLS на N-конце и ноль или по меньшей мере один или более NLS на С-конце). В случае присутствия более одного NLS каждый из них может быть выбран независимо от других, в частности, отдельный NLS может быть представлен более чем одной копией и/или в комбинации с другим одним или более NLS, представленного одной или более копиями. В предпочитаемом варианте осуществления Cas содержит не более 6 NLS. В некоторых вариантах осуществления NLS считается N- или C-концевым, если ближайшая к концу аминокислота NLS находится на расстоянии 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или более аминокислот полипептидной цепи от N- или C-конца. Неограничивающие примеры NLS включают последовательности NLS, полученные на основе: NLS большого T-антигена вируса SV40, имеющего аминокислотную последовательность PKKKRKV (SEQ ID NO: X); NLS из нуклеоплазмина (например, состоящая из двух частей NLS нуклеоплазмана с последовательностью KRPAATKKAGQAKKKK) (SEQ ID NO: X); NLS c-myc, имеющего аминокислотную последовательность PAAKRVKLD (SEQ ID NO: X) или RQRRNELKRSP(SEQ ID NO: X); NLS hRNPA1 M9, имеющего последовательность NQ S SNFGPMKGGNFGGRS SGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ ID NO: X); последовательности RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (SEQ ID NO: X) из домена импортина-альфа; последовательности VSRKRPRP (SEQ ID NO: X) и PPKKARED (SEQ ID NO: X) T-белка миомы; последовательности POPKKKPL (SEQ ID NO: X) p53 человека; последовательности SALIKKKKKMAP (SEQ ID NO: X) c-abi IV мыши, последовательности DRLRR (SEQ ID NO: X) и PKQKKRK (SEQ ID NO: X) вируса гриппа NS1; последовательности RKLKKKIKKL (SEQ ID NO: X) антигена дельта вируса гепатита; последовательности REKKKFLKRR (SEQ ID NO: X) белка Mx1 мыши; последовательности KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (SEQ ID NO: X) поли(АДФ-рибоза) полимеразы человека и последовательности RKCLQAGMNLEARKTKK (SEQ ID NO: X) рецепторов глюкокортикоидных стероидных гормонов (человека). В целом, такая одна или более NLS имеют достаточную силу для того, чтобы вызвать накопление Cas в заметных количествах в ядре эукариотической клетки. В целом сила активности ядерной локализации может определяться рядом NLS в белках Cas, конкретным(и) использованным(и) NLS или комбинацией этих факторов. Например, поддающаяся обнаружению метка может быть связана с Cas таким образом, чтобы визуализировать локализацию в клетке, в частности, за счет сочетания способов определения локализации ядра (например, специфичный ядерный краситель, такой как DAPI). Клеточные ядра могут быть также выделены из клеток, содержимое которых может затем быть проанализировано с помощью любого подходящего способы обнаружения белков, такого как иммуногистохимия, вестерн-блоттинг или анализ активности ферментов. Накопление в ядре может быть определено косвенно, в частности, с помощью анализа эффекта образования комплексов CRISPR (например, анализ расщепления ДНК или мутаций в последовательности-мишени, или анализ изменения экспрессии генов вследствие образования комплексов CRISPR и/или активности ферментов Cas), в сравнении с контролем, не подвергнутым воздействию Cas или комплекса или подвергнутым действия Cas, лишенного одной или более NLS, или сигнала ядерного экспорта (NES). В некоторых вариантах осуществления изобретения с белком Cas могут быть связаны другие метки локализации, неограничивающим примером локализации Cas в конкретных областях клетки могут быть органеллы, такие как митохондрии, пластиды, хлоропласты, везикулы, комплекс Гольджи, (ядерные или клеточные) мембраны, рибосомы, ядрышко, эндоплазматический ретикулум (ER), цитоскелет, вакуоли, центросомы, нуклеосомы, гранулы, центриоли и т.д.

[249] В некоторых аспектах изобретение включает такие векторы, например, для доставки или введения в клетку Cas и/или РНК, способной направлять Cas к локусу-мишени (т.е. направляющей РНК), а также для воспроизведения этих компонентов (например, в прокариотических клетках). В используемом в настоящем описании значении "вектор" представляет собой инструмент, позволяющий или облегчающий перенос некоторого объекта из одного окружения в другое. Он представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг или космида, в который может быть вставлен другой участок ДНК таким образом, чтобы добиться репликации вставленного участка. В целом вектор способен к репликации при условии ассоциации с надлежащими элементами контроля. В целом понятие "вектор" обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Неограничивающими примерами векторов являются молекулы нуклеиновых кислот, являющихся одноцепочечными, двухцепочечными или частично двухцепочечными; молекулы нуклеиновых кислот, имеющие один или более свободных концов, не имеющие свободных концов (например, кольцевые); молекулы нуклеиновых кислот, включающие ДНК, РНК или одновременно и ДНК и РНК и другие известные в данной области разновидности полинуклеотиды. Одним из типов векторов является "плазмида", представляющая собой кольцевую двухцепочечную петлю ДНК, в которую могут быть вставлены дополнительные участки ДНК, в том числе с использованием стандартных способов клонирования. Другим типом вектора является вирусный вектор, содержащий полученную из вирусной ДНК или РНК последовательность, необходимую для упаковки в вирус (например, ретровирусы, дефективные в отношении репликации ретровирусы, аденовирусы, аденовирусы, ретровирусы и аденоасоциированные вирусы (AAV, AAV) с нарушенной репликацией). Вирусные векторы также включают полинуклеотиду, помещенную в вирус с целью трансфекции в клетку-хозяина. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке хозяина, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, векторы млекопитающих, отличные от эписомных) интегрируются в геном клетки хозяина при введении в клетку хозяина и вследствие этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они непосредственно связаны. Такие векторы называются в настоящем описании "экспрессирующими векторами". Распространенной формой экспрессии вспомогательных векторов в способах рекомбинантных ДНК часто являются плазмиды.

[250] Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут включать нуклеиновую кислоту по изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантные экспрессирующие векторы включают один или более регуляторных элементов, которые могут быть подобраны на основе клеток-хозяев, которые будут использоваться для экспрессии, т.е. функционально связаны с последовательностью нуклеиновых кислот, которая будет экспрессирована. В рекомбинантном векторе экспрессии "непосредственно связанный" должно означать, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторным элементом(элементами) таким образом, что обеспечивает экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке-хозяине, когда вектор введен в клетку-хозяина). Относительно рекомбинации и способов клонирования, упоминается заявка на патент США № 10/815730, опубликованная 2 сентября 2004 года как US 2004-0171156 A1, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

[251] Вектор(ы) может включать регуляторный элемент(ы), например, промотор(ы). Вектор(ы) может включать последовательности, кодирующие белки Cas и/или единственную направляющую последовательность РНК, однако возможно также по меньшей мере 3, или 8, или 16, или 32, или 48, или 50 последовательностей, кодирующих направляющие последовательности РНК (например, sg-РНК), например 1-2, 1-3, 1-4 1-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-8, 3-16, 3-30, 3-32, 3-48, 3-50 РНК (например, sg-РНК). Единственный вектор может содержать промотор для каждой РНК (например, sg-РНК), предпочтительно, когда он содержит приблизительно 16 молекул РНК; когда единственный вектор предусматривает больше, чем 16 молекул РНК, один или более промотор(ов) могут управлять экспрессией больше чем одной молекулы РНК, например, когда вектор содержит 32 молекулы РНК, каждый промотор управляет экспрессией двух молекул РНК, и когда вектор содержит 48 молекул РНК, каждый промотор управляет экспрессией трех молекул РНК. С помощью простой арифметики и устоявшихся протоколов клонирования и руководства в данной заявке квалифицированный специалист в данной области может применять изобретение на практике в отношении РНК для подходящего иллюстративного вектора, такого как AAV, и подходящего промотора, такого как промотор U6. Например, предел упаковки AAV составляет ~4,7 т.п.н. Длина единичной конструкции U6-гРНК (включая участки рестрикции для клонирования) составляет 361 п.н. Следовательно, квалифицированный специалист может без труда совместить приблизительно 12-16, например, 13 кассет U6-гРНК в одном векторе. Данная конструкция может быть собрана любыми подходящими способами, такими как стратегия "золотых ворот", используемая для сборки TALE (http://www.genome-engineering.org/taleffectors/). Квалифицированный специалист может также использовать стратегию "тандемного направления" для увеличения числа структур U6-гРНК приблизительно в 1,5 раза, например, от 12-16, например, 13, до приблизительно 18-24, например, приблизительно 19 гРНК U6. Следовательно, квалифицированный специалист в данной области может без труда получить приблизительно 18-24, например, приблизительно 19 структур промотор-РНК, например, U6-гРНК, в единственном векторе, например, векторе AAV. Следующим способом увеличения числа промоторов и РНК в векторе является использование единственного промотора (например, U6) для экспрессии последовательности РНК, разделенных последовательностями, способными к расщеплению. Следующим шагом для увеличения числа структур промотор-РНК в векторе является экспрессия последовательности структур промотор-РНК, разделенных способными к расщеплению последовательностями, в интроне кодирующей последовательности или гене. В этом случае предпочтительно использовать промотор полимеразы II, который может иметь увеличенную экспрессию и обеспечивать транскрипцию длинной РНК, тканеспецифическим образом (см., например, http://nar. oxfordjournals.org/content/34/7/e53.short, http://www.nature.com/mt/journal/v16/n9/abs/mt2008144a.html). В предпочтительном варианте осуществления изобретения в вектор AAV может быть упакован тандем U6-gРНК, нацеленный приблизительно на вплоть до 50 генов. Соответственно, исходя из знаний в данной области и руководства в настоящей заявке, квалифицированный специалист может создавать и использовать вектор(ы), например, единичный вектор, экспрессирующий множественные РНК или другие направляющие молекулы под контролем, оперативно или функционально связанный с одним или более промоторами, особенно для числа РНК или других направляющих молекул, обсуждаемого в настоящем описании, без какого-либо излишнего экспериментирования.

[252] Последовательности, кодирующие направляющие РНК и/или последовательности, кодирующие белки Cas, могут быть функционально или непосредственно связаны с регуляторным элементом(элементами) и, следовательно, регуляторный элемент(элементы) управляет их экспрессией. Промотор(промоторы) может быть конститутивным промотором (промоторами) и/или временным промотором(промоторами), и/или индуцируемым промотором(промоторами), и/или тканеспецифическим промотором(промоторами). Промотор может быть выбран из группы, состоящей из РНК-полимераз: pol I, pol II, pol III, T7, U6, H1, ретровирусного LTR-промотора (LTR) вируса саркомы Рауса (RSV), промотора цитомегаловируса (CMV), промотора вируса SV40, промотора дигидрофолатредуктазы, промотора β-актина, промотора фосфоглицераткиназы (PGK) и промотора EF1α. Предпочтительным промотором является промотор U6.

[253] Локусы системы CRISPR-Cas насчитывают более 50 семейств генов и не имеют строго универсальных генов. Следовательно, для локусов системы CRISPR-Cas ни одно эволюционное дерево не будет единственно верным, и для идентификации новых семейств генов необходим многоплановый подход. На данный момент для 395 профилей 93 белков Cas исчерпывающе идентифицированы гены cas. Для классификации систем CRISPR-Cas используют профили генов и характерные особенности архитектуры локусов. Новая классификация систем CRISPR-Cas предложена на фиг. 1A И 1B. Класс 1 включает многосубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cascade), и Класс 2 включает односубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cas9-подобные). На фиг. 2 изображена молекулярная организация систем CRISPR-Cas. На фиг. 3 изображена структура эффекторных комплексов I и III типов: общая архитектура/общее происхождение прослеживается несмотря на обширную дивергенцию последовательностей. На фиг. 4 CRISPR-Cas изображена как систему, основанную на мотивах распознавания РНК (RRM). На фиг. 5 изображена филогения белка Cas1, показан главный аспект эволюции системы CRISPR-Cas - рекомбинация эффекторных модулей cr-РНК в целях адаптации. На фиг. 6 представлен перечень систем CRISPR-Cas, а именно распространение типов/подтипов систем CRISPR-Cas среди архей и бактерий.

[254] Действие системы CRISPR-Cas обычно делится на три этапа: (1) адаптация или интеграция спейсера, (2) процессинг первичного транскрипта локуса CRISPR (пре-cr-РНК) и созревание cr-РНК, которая включает спейсер и вариабельные регионы, соответствующие фрагментам CRISPR-повторов на 5'- и 3'-концах, и (3) РНК- или ДНК-интерференция. Два белка, Cas1 и Cas2, которые присутствуют в подавляющем большинстве известных систем CRISPR-Cas, достаточны для вставки спейсеров в кассеты CRISPR. Эти два белка формируют комплекс, который необходим для процесса адаптации; деятельность эндонуклеазы Cas1 необходима для интеграции спейсера, тогда как Cas2 выполняет неферментативную функцию. Комплекс Cas1-Cas2 представляет собой высококонсервативный модуль "обработки информации" системой CRISPR-Cas, который квазиавтономен от остальной системы. (См. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Makarova KS, Koonin EV. Methods Mol Biol. 2015; 1311:47-75).

[255] Ранее описанные системы класса 2, а именно, типа II и предполагаемого типа V, состояли только из трех или четырех генов в Cas-опероне, а именно, генов cas1 и cas2, составляющих модуль адаптации (пара генов cas1-cas2 не участвует в интерференции), а также единственного многодоменного эффекторного белка, ответственного за интерференцию, но также способствующего процессингу пре-cr-РНК и адаптации, и часто четвертого гена с неохарактеризованными функциями, который необязателен, по меньшей мере, в некоторых системах типа II (и в некоторых случаях четвертый ген - cas4 (данные биохимических или in silico экспериментов показывают, что cas4 принадлежит к суперсемейству нуклеаз PD-(DE)xK с кластером из трех остатков цистеина на C-конце; обладает 5'-экзонуклеазной активностью для оцДНК), или csn2, который кодирует инактивированную АТФ-азу). В большинстве случаев последовательность CRISPR и ген определенной разновидности РНК, известной как tracr-РНК, транс-закодированная небольшая cr-РНК, прилегают к Cas-оперонам класса 2. tracr-РНК частично гомологична повторам в соответствующей последовательности CRISPR и необходима для процессинга пре-cr-РНК, который катализируется РНК-азой III, широко распространенным бактериальным ферментом, не связанным с локусами системы CRISPR-Cas.

[256] Cas1 является самым консервативным белком, который присутствует в большинстве систем CRISPR-Cas и эволюционирует медленнее, чем другие белки Cas. Соответственно, филогения Cas1 использовалась для классификации систем CRISPR-Cas. Результаты биохимических экспериментов или экспериментов in silico показывают, что Cas1 представляет собой металл-зависимую дезоксирибонуклеазу. Делеции в гене Cas1 в геноме E. coli приводят к увеличению чувствительности к повреждению ДНК и ослаблению расхождения хромосом, как описано в "A dual function of the CRISPR-Cassystem in bacterial antivirus immunity and DNA repair," Babu M et al. Mol Microbiol 79:484-502 (2011). Результаты биохимических экспериментов или in silico экспериментов показывают, что Cas2 является РНК-азой, характерной для регионов, насыщенных U, и является двухцепочечной ДНК-азой.

[257] Аспекты изобретения касаются идентификации и конструирования способами инженерии новых эффекторных белков, связанных с системами CRISPR-Cas класса 2. В предпочтительном варианте осуществления эффекторный белок включает односубъединичный эффекторный модуль. В будущем варианте осуществления изобретения эффекторный белок является функциональным в прокариотических или эукариотических клетках для применения in vitro, in vivo или ex vivo. Один аспект изобретения охватывает вычислительные способы и алгоритмы для прогнозирования новых систем CRISPR-Cas класса 2 и определения составляющих их компонентов.

[258] В одном из вариантов осуществления вычислительный способ идентификации новых локусов системы CRISPR-Cas класса 2 включает следующие шаги: обнаружение всех контигов, кодирующих белок Cas1; идентификация всех предсказанных генов, кодирующих белки, в пределах 20 т.п.н. от гена cas1, более конкретно, в пределах 20 т.п.н. от начала гена cas1 и 20 т.п.н. от конца гена cas1; сравнение идентифицированных генов со специфическими профилями белков Cas и предсказание последовательностей CRISPR путем отбора частичных и/или неклассифицированных возможных локусов CRISPR-Cas, содержащих белки с последовательностями длиной более 500 аминокислот (>500 а.к.); анализ отобранных кандидатов с использованием анализов PSI-BLAST и HHPred для выделения и идентификации новых локусов CRISPR-Cas класса 2. В дополнение к вышеупомянутым шагам возможные кандидаты могут быть дополнительно проанализированы путем поиска гомологов по метагеномным базам данных.

[259] Одним из аспектов обнаружения всех контигов, кодирующих белок Cas1, является использование программы GenemarkS для предсказания генов, как более подробно описано в статье "GeneMarkS: a self-training method for prediction of gene starts in microbial genomes. Implications for finding sequence motifs in regulatory regions," John Besemer, Alexandre Lomsadze and Mark Borodovsky, Nucleic Acids Research (2001) 29, pp 2607-2618, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

[260] В одном аспекте проводится идентификация всех предсказанных генов, кодирующих белки, с помощью сравнения идентифицированных генов со специфическими профилями белков Cas и их аннотирования согласно Базе Данных Консервативных Доменов NCBI (CDD), которая состоит из коллекции хорошо аннотированных многочисленных моделей выравнивания последовательностей для древних доменов и полноразмерных белков. Они доступны в виде позиционных весовых матриц (PSSM) для быстрой идентификации консервативных доменов в последовательностях белков посредством анализа RPS-BLAST. CDD включает домены, курируемые NCBI, которые используют информацию о 3D-структуре, чтобы точно определить границы доменов и обеспечить понимание взаимоотношений между последовательностью/структурой/функцией, а также модели домена, импортированные из многих внешних баз данных (Pfam, SMART, COG, PRK, TIGRFAM). В следующем аспекте для предсказания последовательностей CRISPR использовалась программы PILER-CR, которая является общедоступным программным обеспечением для поиска CRISPR-повторов, как описано в статье "PILER-CR: fast and accurate identification of CRISPR repeats", Edgar, R.C., BMC Bioinformatics, Jan 20:8:18(2007), включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

[261] В следующем аспекте проводят индивидуальный анализ каждого случая с использованием PSI-BLAST (Средство поиска основного локального выравнивания с учетом позиции). Анализ PSI-BLAST использует позиционную весовую матрицу (PSSM) или профиль множественного выравнивания последовательностей, обнаруженных выше заданного весового порога при белок-белковом анализе BLAST. Данная матрица PSSM используется, чтобы далее искать новые совпадения в базе данных и обновляется для последующих итераций с этими недавно обнаруженными последовательностями. Таким образом, PSI-BLAST является способом обнаружения отдаленных отношений между белками.

[262] В другом аспекте индивидуальный анализ каждого случая предполагает использование HHpred, способа поиска по базам данных последовательностей и предсказания структуры, столь же простого в использовании, как BLAST или PSI-BLAST, и в то же время намного более чувствительного при нахождении отдаленных гомологов. Фактически, чувствительность способа HHpred конкурентоспособна по отношению к самым мощным серверам для предсказания структуры, доступным в настоящее время. HHpred является первым сервером, основанным на попарном сравнении профилей скрытых марковских моделей (СММ). В то время как большинство обычных способов поиска последовательностей выполняют поиск по базам данных последовательностей, таким как UniProt или NR, HHpred выполняет поиск по базам данных выравнивания, таким как Pfam или SMART. Это значительно упрощает получение списка совпадений со многим семействами последовательностей вместо разрозненных единичных последовательностей. Все основные общедоступные базы данных профилей и выравниваний доступны через HHpred. HHpred использует в качестве единичного поискового запроса последовательность или множественное выравнивание. В течение всего нескольких минут HHpred представляет результаты поиска в легком для чтения формате, подобном формату PSI-BLAST. Параметры поиска включают локальное или глобальное выравнивание и весовое сходство вторичной структуры. HHpred может произвести попарные выравнивания последовательностей поискового запроса и шаблона, объединенное множественное выравнивание поискового запроса и шаблона (например, для транзитивного поиска), а также модели 3D-структуры, вычисленные программным обеспечением MODELLER на основе выравниваний HHpred.

[263] Термин "система нацеливания на нуклеиновые кислоты", где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК, и в некоторых аспектах может также относится к гибридам РНК-ДНК или их производным, относится собирательно к транскриптам и другим элементам, участвующим в экспрессии или направлении активности нацеливания на ДНК или РНК генов, ассоциированных с системой CRISPR ("Cas"), которые могут содержать последовательности, кодирующие белки Cas, нацеленные ДНК или РНК, и направляющую РНК, нацеленную ДНК или РНК, включая последовательность cr-РНК (cr-РНК) и (в некоторых, но не всех системах) последовательность РНК, транс-активирующей систему CRISPR/Cas (tracr-РНК), или другие последовательности и транскрипты локуса CRISPR, нацеленные на ДНК или РНК. В целом система нацеливания на РНК характеризуется элементами, способствующими формированию нацеленного на ДНК или РНК комплекса на участке последовательности ДНК или РНК, являющейся мишенью. В контексте образования нацеленного на ДНК или РНК комплекса, термин "последовательность-мишень" относится к последовательности ДНК или РНК, которой комплементарна направляющая РНК, нацеливающая на ДНК или РНК, где гибридизация между последовательностью-мишенью и направляющей РНК, нацеливающей на РНК, способствует образованию нацеливающего на РНК комплекса. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень расположена в ядре или цитоплазме клетки.

[264] В одном аспекте изобретения новые системы нацеливания на РНК, также называемые РНК- или РНК-нацеленные CRISPR/Cas или система нацеливания на РНК с помощью системы CRISPR-Cas, описанные в настоящем описании, основаны на идентифицированных белках Cas типа VI, не требующих создания индивидуальных белков для нацеливания на определенные последовательности РНК, кроме единственного фермента, который может быть запрограммирован молекулой РНК для узнавания конкретной ДНК-мишени, иными словами, фермент может быть предназначен для работы с конкретной ДНК-мишенью с помощью указанной молекулы РНК.

[265] В одном аспекте изобретения новые системы нацеливания на ДНК, также называемые ДНК- или ДНК-нацеленные CRISPR/Cas или система нацеливания на ДНК с помощью системы CRISPR-Cas, описанные в настоящем описании, основаны на идентифицированных белках Cas типа VI, не требующих создания индивидуальных белков для нацеливания на конкретные последовательности РНК, кроме единственного фермента, который может быть запрограммирован молекулой РНК для узнавания конкретной ДНК-мишени, иными словами, фермент может быть предназначен для работы с конкретной ДНК-мишени с помощью указанной молекулы РНК.

[266] Системы нацеливания на нуклеиновые кислоты, векторные системы, векторы и композиции, описанные в настоящем описании, могут использоваться в практике нацеливания на нуклеиновые кислоты, изменения или модификация синтеза генных продуктов, таких как белки, расщепления нуклеиновых кислот, редактирования нуклеиновых кислот, сплайсинга нуклеиновых кислот, переноса нуклеиновых кислот-мишеней, отслеживания нуклеиновых кислот-мишеней, выделения нуклеиновых кислот-мишеней, визуализации нуклеиновых кислот-мишеней и т.д.

[267] Термин "белок Cas" или "фермент CRISPR" относится к любому из белков, представленных в новой классификации систем CRISPR-Cas, как описано в настоящем описании.

[268] В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает эффекторные белки, относящиеся к типу VI локусов системы CRISPR-Cas, например, локусам C2c2. В настоящем описании C2c2 относится к кандидату 2 класса 2. Локусы C2c2 включают гены cas1 и cas2 наряду с крупным белком, который заявители обозначают как C2c2p, и последовательности CRISPR; однако, C2c2p часто кодируется вблизи последовательностей CRISPR, но не генами cas1-cas2 (для сравнения фиг. 9 и фиг. 15).

Нуклеаза С2с2

[269] Активность C2c2 зависит от присутствия двух доменов HEPN. Показано, что они являются доменами РНК-азы, т.е. нуклеазы (более конкретно, эндонуклеазы), разрезающей РНК. Домен HEPN белка C2c2 также может быть нацелен на ДНК, или потенциально на ДНК и/или РНК. На основании того, что домены HEPN белка C2c2 способны по меньшей мере к связыванию с и, в форме дикого типа, разрезанию РНК, предпочтительно наличие у эффекторного белка C2c2 функции РНК-азы. Этот белок может также, или альтернативно, иметь функцию ДНК-азы.

[270] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления эффекторный белок может быть белком, связывающим РНК, таким как белок типа "мертвого"-Cas, который может быть необязательно функционализирован, как описано в настоящем описании, например, активатором транскрипции или доменом репрессора, NLS-последовательностью или другим функциональным доменом. В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок может быть РНК-связывающим белком, который расщепляет одиночную цепь РНК. Если связанная РНК является оцРНК, то оцРНК подвергается полному расщеплению. В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок может быть РНК-связывающим белком, который расщепляет двойную цепь РНК, например, если он включает два РНК-азных домена. Если связанная РНК является дцРНК, то дцРНК подвергается полному расщеплению.

[271] РНК-азная функция в системах CRISPR известна, например, нацеливание на мРНК было продемонстрировано для определенных систем CRISPR-Cas типа III (Hale et al., 2014, Genes Dev, vol. 28, 2432-2443; Hale et al., 2009, Cell, vol. 139, 945-956; Peng et al., 2015, Nucleic acids research, vol. 43, 406-417), и было показано, что она обеспечивает значительные преимущества. В системе типа III-A Staphylococcus epidermis, транскрипция мишеней приводит к расщеплению ДНК-мишени и ее транскриптов, опосредуемому независимыми активными центрами в эффекторном комплексе рибонуклеопротеина Cas10-Csm (см. Samai et al., 2015, Cell, vol. 151, 1164-1174). Таким образом, изобретение относится к композиции или способу для нацеливания на РНК с помощью эффекторных белков системы CRISPR-Cas.

[272] РНК-мишенью, т.е. представляющей интерес РНК, является РНК, которая на которое нацелено настоящее изобретение, что приводит к привлечению к и связыванию эффекторного белка с представляющим интерес участком-мишенью на РНК-мишени. РНК-мишень может быть любой подходящей формой РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения она может включать мРНК. В других вариантах осуществления изобретения РНК-мишень может включать тРНК или рРНК. В других вариантах осуществления изобретения РНК-мишень может включать микроРНК. В других вариантах осуществления изобретения РНК-мишень может включать миРНК.

Интерферирующая РНК (РНК-i) и микроРНК (мкРНК)

[273] В других вариантах осуществления изобретения РНК-мишень может включать интерферирующую РНК, т.е. РНК, вовлеченную в процесс интерференции РНК, такую как кшРНК, миРНК и т.д. В других вариантах осуществления изобретения РНК-мишень может включать микроРНК (мкРНК). Контроль над интерферирующей РНК или микроРНК может помочь уменьшить неспецифические эффекты (OTE), наблюдаемые в этих подходах, путем уменьшения долговечности интерферирующей РНК или микроРНК in vivo или in vitro.

[274] В определенных вариантах осуществления изобретения мишенью является не сама микроРНК, а микроРНК-связывающий участок микроРНК-мишени.

[275] В определенных вариантах осуществления изобретения микроРНК могут быть изолированы (включая внутриклеточное перемещение). В некоторых вариантах осуществления изобретения микроРНК могут быть разрезаны, например, но не ограничиваясь этим, в шпильках.

[276] В определенных вариантах осуществления изобретения процессинг микроРНК (включая оборот) увеличивается или уменьшается.

[277] Если эффекторный белок и подходящая направляющая молекула селективно экспрессированы (например, под пространственным или временным контролем подходящего промотора, например, промотора, специфичекского для ткани или фазы клеточного цикла, и/или энхансера), это может быть использовано для "защиты" клетки или системы (in vivo или in vitro) от РНК-интерференции в этих клетках. Это может быть полезно для применения в соседних тканях или клетках, где РНК-интерференция не требуется или в целях сравнения с теми клетками или тканями, где эффекторный белок и подходящая направляющая молекула не экспрессируются (т.е. где РНК-интерференция не находится под контролем и где находится, соответственно). Эффекторный белок может быть использован для контроля или связывания с молекулами, включающими или состоящими из РНК, таким как рибозимы, рибосомы или рибопереключатели. В вариантах осуществления изобретения направляющая РНК может нацелить эффекторный белок на все эти молекулы, чтобы эффекторный белок был способен к связыванию с ними.

[278] Система белков изобретения может быть применена в областях технологий РНК-i, без проведения излишних экспериментов, на основе данной заявки, включая терапевтическое, аналитическое и другие применения (см., например, Guidietal, PLoSNeglTropDis 9(5): e0003801. doi: 10.1371/journal.pntd; Crotty et al., InvivoRNAiscreens: conceptsandapplications.Shane Grotty … 2015 Elsevier Ltd. Published by Elsevier Inc., Pesticide Biochemistry and Physiology (Impact Factor: 2.01). 01/2015; 120. DOI: 10.1016/j.pestbp.2015.01.002 and Makkonen et al., Viruses 2015, 7(4), 2099-2125; doi:10.3390/v7042099), потому что настоящая заявка обеспечивает основу для осознанной модификации системы.

Рибосомная РНК (рРНК)

[279] Азалиды, такие как азитромицин, являются широко известными антибиотиками. Они нацелены на и разрушают рибосомную субъединицу 50S. В некоторых вариантах осуществления изобретения данный эффекторный белок, вместе с подходящей направляющей РНК для нацеливания на рибосомную субъединицу 50S может быть нацелен на связывание с рибосомной субъединицей 50S. Таким образом, изобретение относится к эффекторному белку по настоящему изобретению совместно с подходящей направляющей молекулой, направленной на рибосомную (особенно рибосомную субъединицу 50S) мишень. Использование этого эффекторного белка совместно с подходящей направляющей молекулой, направленной на рибосомную (в особенности субъединицу 50S) мишень, может быть использовано в качестве антибиотика. В частности, действие в качестве антибиотика аналогично действию азалидов, таких как азитромицин. В некоторых вариантах осуществления изобретения мишенью могут быть прокариотические рибосомные субъединицы, такие как субъединица 70S у прокариот, вышеупомянутая субъединица 50S, субъединица 30S, а также 16S и 5S субъединицы. В других вариантах осуществления изобретения мишенью могут быть эукариотические рибосомные субъединицы, такие как субъединица 80S у эукариот, субъединица 60S, субъединица 40S, а также субъединицы 28S, 18S, 5,8S и 5S.

[280] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может быть РНК-связывающим белком, необязательно функционализированным, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может быть РНК-связывающим белком, расщепляющим одиночную цепь РНК. Во всех случаях, но особенно когда РНК-связывающий белок расщепляет одиночную цепь РНК, рибосомная функция может быть модулирована и, в частности, уменьшена или разрушена. Это может относиться к любой рибосомной РНК и любой рибосомной субъединице, так как последовательности рРНК хорошо известны.

[281] Таким образом, предусматривается контроль рибосомной активности посредством использования данного эффекторного белка совместно с подходящей направляющей молекулой для рибосомной мишени. Контроль может осуществляться посредством расщепления или связывания с рибосомой. В частности, предусматривается сокращение активности рибосомы. Это может быть полезно для анализа функций рибосом in vivo или in vitro, но также и как средство контроля в терапевтических способах, основанных на рибосомной активности, in vivo или in vitro. Кроме того, предусматривается контроль (т.е. сокращение) синтеза белка в системах in vivo или in vitro, такой контроль может быть полезен при использовании в качестве антибиотика, а также в исследовательских и диагностических целях.

Рибопереключатели

[282] Рибопереключатель (также известный как аптозим) является регуляторным сегментом молекулы матричной РНК, которая связывает низкомолекулярное соединение. Это связывание, как правило, приводит к изменению синтеза белков, закодированных мРНК. Таким образом, предусматривается контроль активности рибопереключателя посредством использования данного эффекторного белка совместно с подходящей направляющей молекулой для рибопереключателя-мишени. Контроль может осуществляться путем расщепления или связывания с рибопереключателем. В частности, предусматривается сокращение активности рибопереключателя. Это может быть полезно при анализе функций рибопереключателя in vivo или in vitro, но также и как средство контроля терапевтических способах, основанных на активности рибопереключателя, in vivo или in vitro. Кроме того, предусматривается контроль (т.е. сокращение) синтеза белка в системах in vivo или in vitro. Что касается рРНК, этот контроль может быть полезен при использовании в качестве антибиотика, а также в исследовательских и диагностических целях.

Рибозимы

[283] Рибозимы являются молекулами РНК, имеющими каталитические свойства, аналогичные ферментам (которые являются белками). Поскольку рибозимы, как естественные, так и искусственно спроектированные, включают или полностью состоят из РНК, они также могут быть мишенью РНК-связывающего эффекторного белка по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может быть РНК-связывающим белком, расщепляющим рибозимы для их отключения. Так, контроль рибозимной активности предусматривается посредством использования эффекторного белка по настоящему изобретению совместно с подходящей направляющей молекулой для рибозима-мишени. Контроль может осуществляться путем расщепления или связывания с рибозимом. В частности, предусматривается сокращение рибозимной активности. Это может быть полезно при анализе функции рибозим in vivo или in vitro, но также и как средство контроля в способах терапии на основе рибозимной активности, in vivo или in vitro.

Экспрессиягенов, включая процессинг РНК

[284] Эффекторный белок может также использоваться вместе с подходящей направляющей молекулой для нацеливания на экспрессию генов, в том числе посредством контроля процессинга РНК. Контроль процессинга РНК может включать реакции процессинга РНК, такие как сплайсинг РНК, включая альтернативный сплайсинг, путем нацеливания на РНК-полимеразы; вирусную репликацию (в особенности, вирусов-сателлитов, бактериофагов и ретровирусов, таких как вирус гепатита B (HBV), вирус гепатита С (HCV) и ВИЧ и другие, перечисленные в настоящем описании) включая вироиды в растениях; и биосинтез тРНК. Эффекторный белок и подходящая направляющая молекула могут также использоваться для контроля активации РНК (РНК-a). Активация РНК стимулирует экспрессию генов, таким образом, контроль экспрессии генов может быть достигнут посредством нарушения или сокращения активации РНК и таким образом меньшей стимуляции экспрессии генов. Механизмы осуществления контроля подробнее обсуждаются ниже.

Скрининг РНК-интерференции

[285] Генные продукты, нокдаун которых связан с изменениями фенотипа и биологическими каскадами, могут быть проанализированы, а их составные части идентифицированы путем скрининга РНК-i. Контроль может осуществляться во время скрининга при помощи эффекторного белка и подходящей направляющей молекулы, чтобы прекратить РНК-i или уменьшить ее активность во время скрининга и таким образом восстановить активность (ранее участвовавшего в РНК-i) генного продукта (прекращая или уменьшая интерференцию/репрессию).

[286] Сателлитные РНК (sat-РНК) и вирусы-сателлиты могут также быть преобразованы.

[287] Контроль в данном случае осуществляется посредством РНК-азной активности, что обычно означает сокращение, нарушение, нокдаун или нокаут данной активности.

Способы применения РНК in vivo

Ингибирование экспрессии генов

[288] Мишень-специфические РНК-азы, описанные в настоящем описании, позволяют очень точно разрезать РНК-мишень. Интерференция на уровне РНК обеспечивает модулирование в пространстве и времени неинвазивным способом, поскольку не вносит изменений в геном.

[289] Было продемонстрировано, что многие болезни поддаются лечению с помощью нацеливания на мРНК. В то время как большинство этих исследований касается применения малой интерферирующей РНК, ясно, что РНК, нацеливающая эффекторные белки, описанные в настоящем описании, может быть применена сходным образом.

[290] Примерами мРНК-мишеней (и соответствующих способов лечения заболеваний) является VEGF, VEGF-R1 и RTP801 (в лечении старческой дегенерации желтого пятна (AMD) и/или диабетического макулярного отека (DME)), каспаза 2 (в лечении неартериитической передней ишемической невропатии зрительного нерва (NAION)), ADRB2 (в лечении внутриглазного давления), TRFVI (в лечении синдрома сухого глаза), киназа Syk (в лечении астмы), Apo В (в лечении гиперхолестеринемии), PLK1, KSP и VEGF (в лечении солидных опухолей), Ber-Ab1 (в лечении хронического миелоидного лейкоза (CML)) (Burnett and Rossi Chem Biol. 2012, 19(1): 60-71). Точно также была продемонстрирована эффективность нацеливания на РНК при лечении заболеваний, вызываемых РНК-вирусами, такими как ВИЧ (HIV) (нацеливание на Tet и Rev HIV), респираторно-синцитиального вируса (RSV) (нацеливание на нуклеокапсид RSV) и вируса гепатита C (HCV) (нацеливание на miR-122) (Burnett and Rossi Chem Biol. 2012, 19(1): 60-71).

[291] Кроме того, предусматривается, что нацеливание на РНК эффекторного белка по изобретению может использоваться для прицельного нокдауна как определенной мутации так и целого аллеля. Направляющие РНК могут быть разработаны для специфичного нацеливания на последовательность в транскрибированной мРНК, содержащей мутацию или последовательность определенного аллеля. Такой специфический нокдаун особенно подходит для терапевтического применения в случае заболеваний, связанных с генными продуктами, содержащими мутации или определенный аллель. Например, большинство случаев семейной гипобеталипопротеинемии (FHBL) вызвано мутациями в гене ApoB. Этот ген кодирует две версии белка аполипопротеина В: короткую версию (ApoB-48) и более длинную версию (ApoB-100). Несколько мутаций в гене ApoB, которые приводят к FHBL, приводят к тому, что обе версии белка ApoB являются аномально короткими. Специфическое нацеливание на и нокдаун транскриптов мРНК, содержащих мутантный ген ApoB, с помощью РНК-нацеленного эффекторного белка по изобретению, может быть полезен для лечения FHBL. Другим примером может служить болезнь Хантингтона (HD), которую вызывает распространение повторов триплета CAG в гене, кодирующем белок хантингтин, что приводит к производству аномального белка. Специфическое нацеливание на и нокдаун транскриптов мРНК, содержащих мутации или определенный аллель, кодирующий аномальный белок хантингтин, с помощью РНК-нацеленного эффекторного белка по изобретению, может быть полезным для лечения болезни Хантингтона (HD).

[292] Отмечено, что в этом контексте, и более широко для различных способов применения, как описано в настоящем описании, может быть предусмотрено использование разделенной версии РНК-нацеленного эффекторного белка. Действительно, эта версия может не только обеспечить высокую точность, но и быть более удобной для доставки. C2c2 разделен в том смысле, что две части фермента C2c2, по существу, составляют функциональный C2c2. В идеале, разделение не должно затрагивать каталитический домен(ы) С2с2. Этот C2c2 может функционировать как нуклеаза или это может быть "мертвый"-C2c2, который по сути является РНК-связывающим белком с очень небольшой каталитической активностью или полным ее отсутствием, как правило, в результате мутации (мутаций) в каталитических доменах.

[293] Каждая половина разделенного C2c2 может быть слита с партнером по димеризации. В качестве неограничивающего примера, использование доменов димеризации, чувствительных к рапамицину, позволяет производить химически индуцируемое разделение C2c2 для временного контроля активности C2c2. Таким образом, C2c2 может быть химически индуцируемым, будучи разделенным на два фрагмента, и для контролируемой повторной сборки C2c2 могут использоваться чувствительные к рапамицину домены димеризации. Две части разделенного C2c2 могут считаться N'-концевой частью и C'-концевой частью разделенного C2c2. Соединение, как правило, осуществляется в точке разделения C2c2. Иными словами, С'-концевая часть N'-концевой части разделенного C2c2 соединена с одной из половин димера, в то время как N'-концевая часть C'-концевой части соединена с другой половиной димера.

[294] C2c2 не должен быть разделен в том смысле, что разрыв образуется заново. Точка разделения, как правило, определяется in silico и клонируется в конструкции. Вместе две части разделенного C2c2, N'-концевые и C'-концевые части, формируют целый C2c2, включающий предпочтительно по меньшей мере 70% или более аминокислот дикого типа (или нуклеотидов, их кодирующих), предпочтительно по меньшей мере 80% или более, предпочтительно по меньшей мере 90% или более, предпочтительно по меньшей мере 95% или более, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% или более аминокислот дикого типа (или нуклеотидов, их кодирующих). Некоторые модификации возможны, и предусматриваются мутанты. Нефункциональные домены могут быть полностью удалены. Важно, что в результате объединения этих двух частей желаемая функция C2c2 может быть восстановлена или воссоздана. Димер может быть гомодимером или гетеродимером.

[295] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок C2c2, как описано в настоящем описании, может использоваться для нацеливания, специфического для конкретной мутации или аллеля, такого как нокдаун гена, специфический для мутации или аллеля.

[296] РНК-нацеленный эффекторный белок, кроме того, может быть соединен с другим функциональным РНК-азным доменом, таким как неспецифичная РНК-аза или Argonaute 2, для совместного увеличения РНК-азной активности или гарантированной дальнейшей деградации РНК.

[297] Модулирование экспрессии генов посредством модуляции функции РНК

[298] Кроме прямого влияния на экспрессию генов посредством расщепления мРНК, нацеливание на РНК может также использоваться для влияния на конкретные аспекты процессинга РНК в клетке, что может позволить более тонкое модулирование экспрессии генов. В основном модулирование может быть опосредовано, например, вмешательством в связывание белков с РНК, как, например, при блокировании связывания белков или привлечении РНК-связывающих белков. Действительно, модулирование может быть обеспечено на разных уровнях, таких как сплайсинг, транспорт, локализация, трансляция и обновление мРНК. Также в контексте терапии, может быть предусмотрена адресное воздействие на (патогенные) сбои на каждом из этих уровней при помощи РНК-специфичных нацеленных молекул. В этих вариантах осуществления изобретения во многих случаях предпочтительно использование "мертвого" C2c2, который потерял способность разрезать РНК-мишень, но способен к связыванию с ней, такого как мутантные формы C2c2, описанного в настоящем описании, в качестве белка для нацеливания на РНК.

a) альтернативный сплайсинг

[299] Многие гены человека имеют многочисленные мРНК, образованные в результате альтернативного сплайсинга. Показано, что различные болезни связаны с отклонениями сплайсинга, приводящими к потере или приобретению функции экспрессируемым геном. В то время как некоторые из этих болезней вызваны мутациями, которые вызывают дефекты сплайсинга, но много из них - нет. Один вариант терапии состоит в нацеливании непосредственно на механизм сплайсинга. РНК, нацеливающая эффекторные белки, описанные в настоящем описании, может использоваться, например, для блокирования или стимуляции разрезания, включения или исключения экзонов, влияния на экспрессию специфичных изоформ и/или стимуляции экспрессии альтернативных продуктов белка. Такие способы применения более подробно описаны ниже.

[300] Эффекторный белок нацеливания на РНК при связывании с РНК-мишенью может пространственно блокировать доступ факторов сплайсинга к последовательности РНК. Эффекторный белок нацеливания на РНК, нацеленный на участок сплайсинга, может блокировать сплайсинг в этом участке, необязательно перенаправляя сплайсинг к соседнему участку. Например, эффекторный белок нацеливания на РНК при связывании с 5'-концом сайта сплайсинга, может блокировать связывание с компонентом U1 сплайсосомы, что приводит к пропуску этого экзона. Альтернативно, эффекторный белок нацеливания на РНК, нацеливаясь на энхансер или сайленсер сплайсинга, может предотвратить связывание трансактивирующих регуляторных факторов сплайсинга в участке-мишени и эффективно блокировать или стимулировать сплайсинг. Исключение экзона может далее быть достигнуто связыванием ILF2/3 с предшественником мРНК около экзона с помощью эффекторного белка нацеливания на РНК, как описано в настоящем описании. В качестве другого примера, может быть присоединен богатый глицином домен для связывания с hnRNP A1 и исключения экзона (Del Gatto-Konczak et al. Mol Cell Biol. 1999 Jan; 19(1):251-60).

[301] В некоторых вариантах осуществления изобретения посредством соответствующего подбора направляющей РНК, мишенью могут быть конкретные варианты сплайсинга, в то время как другие варианты сплайсинга могут не быть мишенью.

[302] В некоторых случаях эффекторный белок нацеливания на РНК может использоваться, чтобы способствовать сплайсингу (например, в участках, где сплайсинг проходит с нарушениями). Например, эффекторный белок нацеливания на РНК может быть связан с эффектором, способным к стабилизации регуляторной структуры например шпильки, для продолжения сплайсинга. Эффекторный белок нацеливания на РНК может быть связан с консенсусной последовательностью участка связывания для конкретного фактора сплайсинга, чтобы обеспечить связывание белка с ДНК-мишенью.

[303] Примеры заболеваний, связанных с отклонениями сплайсинга, включают, но не ограничиваются ими, паранеопластическую опсоклонус-миоклонус атаксию (POMA), возникающей при утрате белков Nova, регулирующих сплайсинг белков, которые функционируют в синапсах, и муковисцидоз, который вызван нарушенным сплайсингом регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза, приводящим к потере нефункциональности хлоридными каналами. При других заболеваниях отклонения сплайсинга РНК приводят к мутации приобретения функции. Например, в случае миотонической дистрофии, которая вызвана распространением повторов триплета CUG (от 50 до> 1500 повторов) в 3'-нетранслируемой области (3'НТО) мРНК, что вызывает дефекты сплайсинга.

[304] Эффекторный белок нацеливания на РНК может использоваться для включения экзона посредством присоединения фактора сплайсинга (таким как U1) к 5'-сайту сплайсинга, что способствует вырезанию интронов вокруг желаемого экзона. Такое связывание может быть опосредовано путем присоединения домена, богатого аргинином/серином, который функционирует как активатор сплайсинга (Gravely BR and Maniatis T, Mol Cell. 1998 (5):765-71).

[305] Предусматривается, что эффекторный белок нацеливания на РНК может использоваться, чтобы заблокировать механизм сплайсинга в желаемом локусе для предотвращения распознавания экзона и экспрессии другого белка. Примером заболевания, которое может быть вылечено этим способом, является миодистрофия Дюшенна (DMD), которая вызвана мутациями в гене, кодирующем белок дистрофин. Почти все мутации, ведущие к миодистрофии Дюшенна (DMD), являются мутациям сдвига рамки считывания, приводящими к ухудшению трансляции дистрофина. Эффекторный белок нацеливания на РНК может быть соединен с участками сшивки или экзонными энхансерами сплайсинга (ESE), таким образом, предотвращая распознавание экзона, что приводит к трансляции частично функционального белка. Это преобразовывает фенотип Дюшенна, приводящий к смерти, в более мягкий фенотип Беккера с менее серьезными симптомами.

b) Модификация РНК

[306] Редактирование РНК - естественный процесс, посредством которого разнообразие генных продуктов данной последовательности увеличивается в результате незначительной модификации РНК. Как правило, модификация включает преобразование аденозина (A) в инозин (I), что приводит к формированию последовательности РНК, отличающейся от закодированной в геноме. Модификацию РНК обычно производит фермент ADAR, в ходе модификации пре-РНК-мишень формирует несовершенную дуплексную РНК путем спаривания оснований последовательности экзона, который содержит аденозин, нуждающийся в редактировании, и интронного некодирующего элемента. Классическим примером редактирования аденозина (A) в инозин (I) является мРНК рецептора глутамата GluR-B, где редактирование приводит к изменению свойств проводимости канала (Higuchi M, et al.Cell. 1993; 75:1361-70).

[307] У людей гетерозиготная функционально-нулевая мутация в гене ADAR1 приводит к кожному заболеванию, пигментному генодерматозу человека (Miyamura Y, et al.Am J Hum Genet. 2003; 73:693-9). Предусматривается, что эффекторные белки, нацеленные на РНК, по настоящему изобретению могут быть использованы, чтобы исправить сбои в модификации РНК.

[308] Далее предусматривается, что аденозиновая метилаза РНК (N (6)-метиладенозин) может быть присоединена к эффекторным белкам нацеливания на РНК по изобретению и нацелена на представляющий интерес транскрипт. Эта метилаза вызывает обратимое метилирование, выполняет регуляторную роль и может влиять на экспрессию генов и решение судьбы клетки, модулируя многие клеточные процессы, связанные с РНК. (Fu et al Nat Rev Genet. 2014; 15(5):293-306).

c) Полиаденилирование

[309] Полиаденилирование мРНК важно для транспорта в ядро, эффективности трансляции и стабильности мРНК; все эти процессы, как и процесс полиаденилирования, зависят от определенных РНК-связывающих белков. Большинство эукариотических мРНК после транскрипции получают 3'-поли(А)-хвостовую часть приблизительно из 200 нуклеотидов. В полиаденилировании участвуют различные РНК-связывающие белковые комплексы, стимулирующие активность поли(А)-полимеразы (Minvielle-Sebastia L et al. Curr Opin Cell Biol. 1999; 11:352-7). Предусматривается, что эффекторные белки нацеливания на РНК, описанные в настоящем описании, могут быть использованы для вмешательства в или стимуляции взаимодействия между РНК-связывающими белками и РНК.

[310] Примером заболевания, связанного с дефектными белками, участвующими в полиаденилировании, является окулофарингеальная мышечная дистрофия (OPMD) (Brais B, et al. Nat Genet. 1998,18:164-7).

d) Экспорт РНК

[311] После процессинга пре-мРНК, мРНК экспортируется из ядра в цитоплазму. Это обеспечивается клеточным механизмом, который включает образование комплекса белка-переносчика и мРНК, который потом перемещается через ядерную пору и высвобождает мРНК в цитоплазме с последующей переработкой переносчика.

[312] На Xenopus показано, что избыточная экспрессия белков (таких как TAP), играющих роль в экспорте РНК, увеличивает экспорт транскриптов, которые иначе экспортируются неэффективно (Katahira J, et al.EMBO J. 1999; 18:2593-609).

e) Локализация мРНК

[313] Локализация мРНК необходима для пространственного регулирования синтеза белка. Локализация транскриптов в определенных компартментах клетки может быть обеспечена сигналами локализации. В конкретных вариантах осуществления изобретения предусматривается, что эффекторные белки, описанные в настоящем описании, могут использоваться для нацеливания на сигналы локализации в представляющих интерес РНК. Эффекторные белки могут быть сконструированы для связывания транскрипта-мишени и его доставки в определенный клеточный компартмент согласно его сигнальной последовательности. В частности, для изменения локализации РНК может использоваться, например, эффекторный белок нацеливания на РНК слитый с сигналом ядерной локализации (NLS).

[314] Другие примеры сигналов локализации включают связывающий zip-код белок (ZBP1), который обеспечивает локализацию β-актина в цитоплазме некоторых асимметричных типов клеток, последовательность KDEL (локализация в эндоплазматическом ретикулуме), сигнал ядерного экспорта (NES) (локализация в цитоплазме), сигнал нацеливания в митохондрим (локализация в митохондриях), сигнал нацеливания в пероксисомы (локализация в пероксисоме) и m6A-метка/YTHDF2 (локализация в p-телах). Другие подходы, которые предусматриваются, включают слияние эффекторного белка нацеливания на РНК с белками известной локализации (например, мембрана, синапс).

[315] Альтернативно, эффекторный белок согласно изобретению может использоваться, например, в зависимом от локализации нокдауне. Путем слияния эффекторного белка с соответствующим сигналом локализации эффектор может быть нацелен на определенный клеточный компартмент. Эффективное нацеливание будет осуществлено только для РНК-мишеней, находящихся в этом компартменте, тогда как нацеливание на другие мишени, во всех отношениях идентичные, но находящиеся в другом клеточном компартменте, не будет осуществлено, таким образом может быть организован нокдаун, зависящий от локализации.

f) трансляция

[316] Эффекторные белки нацеливания на РНК, описанные в настоящем описании, могут использоваться для усиления или подавления трансляции. Предусматривается, что регуляция трансляции является очень мощным способом управления клеточными процессами. Кроме того, для функциональных исследований скрининг трансляции белка может быть более полезным по сравнению со скринингом повышенной транскрипции, имеющим тот недостаток, что увеличение числа транскриптов не приводит к повышению синтеза белка.

[317] Предусматривается, что эффекторные белки нацеливания на РНК, описанные в настоящем описании, могут использоваться для переноса факторов инициации трансляции, таких как EIF4G около 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) матричной РНК-мишени для управления трансляцией (как описано в De Gregorio et al.EMBO J. 1999; 18(17):4865-74 для неперепрограммируемого РНК-связывающего белка). В качестве другого примера, GLD2, цитоплазматическая поли(А)-полимераза, может быть привлечена к мРНК-мишени эффекторным белком нацеливания на РНК. Таким образом, можно осуществлять направленное полиаденилирование мРНК-мишени в целях стимуляции трансляции.

[318] Точно так же эффекторные белки нацеливания на РНК, предусматриваемые в рамках настоящего изобретения, могут использоваться для блокирования репрессоров трансляции мРНК, таких как ZBP1 (Huttelmaier S, et al.Nature. 2005; 438:512-5). Непосредственная регуляция трансляции может быть достигнута путем связывания с участком инициации трансляции РНК-мишени.

[319] Кроме того, с помощью слияния эффекторных белков нацеливания на РНК с белком, стабилизирующим мРНК, например, предотвращающим его деградацию, таким как ингибиторы РНК-азы, можно увеличить синтез белка с представляющих интерес транскриптов.

[320] Предусматривается, что эффекторные белки нацеливания на РНК, описанные в настоящем описании, могут использоваться для подавления трансляции посредством связывания с 5'-нетранслируемыми областями (5'-НТО) транскрипта РНК, что препятствует сборке рибосомы и началу трансляции.

[321] Далее, эффекторный белок нацеливания на РНК может использоваться для связывания Caf1, компонента комплекса деаденилазы CCR4-NOT, с мРНК-мишенью, что приводит к деаденилированию транскрипта-мишени и ингибированию трансляции белка.

[322] Например, эффекторный белок нацеливания на РНК по изобретению может использоваться, чтобы увеличить или уменьшить трансляцию белков, представляющих терапевтический интерес. Примерами терапевтического применения, где эффекторный белок нацеливания на РНК может использоваться для понижения или повышения трансляции, могут служить боковой амиотрофический склероз (ALS) и сердечно-сосудистые заболевания. При ALS показано снижение уровня глиального транспортера глутамата EAAT2 в двигательной зоне коры головного мозга и спинном мозге, а также множественные аномальные транскрипты мРНК EAAT2 в тканях головного мозга. Считается, что отсутствие белка EAAT2 является главной причиной эксайтотоксичности при ALS. Восстановление уровня белка EAAT2 и его функции может дать терапевтический эффект. Следовательно, эффекторный белок нацеливания на РНК может быть использован для повышения экспрессии белка EAAT2, например, посредством блокирования репрессоров трансляции или стабилизации мРНК, как описано выше. Аполипопротеин A1 (ApoA1) является главным белковым компонентом липопротеинов высокой плотности (HDL), как ApoA1, так и HDL, обычно рассматривают как атеропротекторы (снижают риск развития атеросклероза). Предусматривается, что эффекторный белок нацеливания на РНК может быть использован для повышения экспрессии ApoA1, например, путем блокирования репрессоров трансляции или стабилизации мРНК, как описано выше.

g) Обмен мРНК

[323] Трансляция тесно связана с обменом мРНК и регулируемой стабильностью мРНК. Показано, что конкретные белки поддерживают стабильность транскриптов, такие как белки ELAV/Hu в нейронах (Keene JD, 1999, Proc Natl Acad Sci U S A. 96:5-7) и тристетрапролин (TTP). Эти белки стабилизируют мРНК-мишень, защищая их от деградации в цитоплазме (Peng SS et al., 1988, EMBO J. 17:3461-70).

[324] Предусматривается, что эффекторные белки нацеливания на РНК по настоящему изобретению могут использоваться для вмешательства или стимулирования активности белков, стабилизирующих транскрипты мРНК, и таким образом влиять на обновление мРНК. Например, связывание TTP человека с РНК-мишени с использованием эффекторного белка нацеливания на РНК может приводить к опосредуемой аденилат-уридилат-богатым элементом (AU-богатым элементом) репрессии трансляции и деградации мишени. AU-богатые элементы, способствующие стабильности РНК, найдены в 3'-нетранслируемой области (3'-НТО) многих мРНК, кодирующих протоонкогены, ядерные транскрипционные факторы и цитокины. В качестве другого примера, эффекторный белок нацеливания на РНК может быть слит с HuR, другим белком стабилизации мРНК (Hinman MN and Lou H, Cell Mol Life Sci 2008; 65:3168-81), чтобы присоединить его к транскрипту-мишени для увеличения времени жизни этого транскрипта или стабилизации короткоживущей мРНК.

[325] Далее предусматривается, что эффекторные белки нацеливания на РНК, описанные в настоящем описании, могут использоваться для деградации транскриптов-мишеней. Например, m6A-метилтрансфераза может быть присоединена к транскрипту-мишени, чтобы транспортировать транскрипт к P-телам с целью его последующей деградации.

[326] В качестве другого примера, эффекторный белок нацеливания на РНК, как описано в настоящем описании, может быть слит с неспецифичным эндонуклеазным доменом Pilt N-конца (PIN), чтобы присоединить его к транскрипту-мишени и обеспечить последующую деградацию этого транскрипта.

[327] У пациентов, страдающих энцефаломиелитом и невропатией, связанными с паранеопластическим неврологическим расстройством (PND), вырабатываются аутоантитела против Hu-белков в опухолях за пределами центральной нервной системы (Szabo et al. 1991, Клетка.; 67:325-33), которые потом пересекают гематоэнцефалический барьер. Предусматривается, что эффекторные белки нацеливания на РНК по настоящему изобретению могут использоваться, чтобы препятствовать связыванию аутоантител с транскриптами мРНК.

[328] При миотонической дистрофии типа 1 (DM1), вызванной распространением повторов (CUG)n в 3'-нетранслируемой области (3'-НТО) гена протеинкиназы мышечной дистрофии (DMPK) происходит накопление аномальных транскриптов в ядре. Предусматривается, что эффекторные белки нацеливания на РНК по изобретению, слитые с эндонуклеазой для нацеливания на повторы (CUG)n, могут препятствовать накоплению таких транскриптов.

h) Взаимодействие с многофункциональными белками

[329] Некоторые РНК-связывающие белки связываются со многими участкам на многочисленных РНК, чтобы принимать участие в разнообразных процессах. Например, показано, что белок hnRNP A1 связывает экзонные последовательности сайленсера сплайсинга, противодействуя факторам сплайсинга, ассоциированными с концами теломер (таким образом, стимулируя активность теломер), а также связывает микроРНК, чтобы облегчить Drosha-опосредованный процессинг, таким образом, влияя на созревание. Предусматривается, что РНК-связывающие эффекторные белки по настоящему изобретению изобретения могут вмешиваться в связывание РНК-связывающих белков c РНК в одном или более местоположениях.

i) Фолдинг РНК

[330] РНК принимает определенную структуру для выполнения своих биологических функций. Изменения конформации между альтернативными третичными структурами очень важны для большинства РНК-опосредованных процессов. Однако проблема фолдинга РНК имеет несколько составляющих. Например, РНК может иметь тенденцию сворачиваться и поддерживать неподходящую альтернативную конформацию и/или правильная третичная структура может быть недостаточно термодинамически выгодной по сравнению с альтернативными структурами. Эффекторный белок нацеливания на РНК по изобретению, в особенности, не имеющий способности к расщеплению, или "мертвый" белок нацеливания на РНК, может использоваться непосредственно для фолдинга (м)РНК и/или поддержания ее правильной третичной структуры.

Использование эффекторного белка нацеливания на РНК для изменения состояния клетки

[331] В определенных вариантах осуществления изобретения C2c2 в комплексе с cr-РНК активируется после связывания с РНК-мишенью и впоследствии расщепляет любые соседние оцРНК-мишени (т.е. "побочный эффект" или "эффект свидетеля"). C2c2, однажды активированный собственной мишенью, может расщепить другие (некомплементарные) молекулы РНК. Такое неспецифичное расщепление РНК может потенциально обладать цитотоксическим действием, или иным образом влиять на клеточную физиологию или состояние клетки.

[332] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения, не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки, как описано в настоящем описании, используются или могут использоваться для индукции состояния покоя клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки, как описано в настоящем описании, используются или могут использоваться для индукции остановки клеточного цикла. В некоторых вариантах осуществления изобретения не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки, как описано в настоящем описании, используются или могут использоваться для подавления роста и/или пролиферации клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки, как описано в настоящем описании, используются или могут использоваться для индукции анергии клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки, как описано в настоящем описании, используются или могут использоваться для индукции апоптоза клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки, как описано в настоящем описании, используются или могут использоваться для индукции некроза клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки, как описано в настоящем описании, используются или могут использоваться для индукции клеточной гибели. В некоторых вариантах осуществления изобретения не встречающаяся в природе или сконструированная способами инженерии композиция, векторная система или система доставки, как описано в настоящем описании, используются или могут использоваться для индукции программируемой клеточной гибели.

[333] В некоторых вариантах осуществления изобретение касается способа индукции состояния покоя клетки путем введения не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, векторной системы или системы доставки, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу индукции остановки клеточного цикла путем введения не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, векторной системы или системы доставки, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретение касается способа подавления роста и/или пролиферации клеток путем введения не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, векторной системы или системы доставки, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретение касается способа для индукции анергии клетки путем введения не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, векторной системы или системы доставки, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретение касается способа индукции апоптоза клетки путем введения не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, векторной системы или системы доставки, описанной в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления изобретения изобретение касается способа для индукции некроза клетки путем введения не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, векторной системы или системы доставки, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретение касается способа для индукции клеточной гибели путем введения не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, векторной системы или системы доставки, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения изобретение касается способа для индукции программируемой клеточной гибели путем введения не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, векторной системы или системы доставки, как описано в настоящем описании.

[334] Способы и применения, как описано в настоящем описании, могут быть терапевтическими или профилактическими и могут быть нацелены на отдельные клетки, клеточные (суб)популяции или типы клеток/тканей. В частности, способы и типы использования, как описано в настоящем описании, могут быть терапевтическими или профилактическими и могут быть нацелены на отдельные клетки, клеточные (суб)популяции или типы клеток/тканей, экспрессирующие одну или более последовательностей-мишеней, таких как один или более определенных РНК-мишеней (например, оцРНК). Без ограничения, клетки-мишени могут быть, например, раковыми клетками, экспрессирующими определенный транскрипт, например, нейроны определенного класса, (иммунные) клетки, вызывающие, например, аутоиммуные процессы, или клетки, зараженные конкретным (например, вирусным) патогеном, и т.д.

[335] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения патологических состояний, характеризующихся присутствием нежелательных клеток (клеток-хозяев), включающим введение или индукцию не встречающихся в природе или сконструированных способами инженерии композиций, векторных систем или систем доставки, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к применению не встречающихся в природе или сконструированных способами инженерии композиций, векторных систем или систем доставки, как описано в настоящем описании, для лечения патологических состояний, характеризующихся присутствием нежелательных клеток (клеток-хозяев). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к не встречающимися в природе или сконструированным способами инженерии композициям, векторным системам или системам доставки, как описано в настоящем описании, для применения в лечении патологических состояний, характеризующихся присутствием нежелательных клеток (клеток-хозяев). Необходимо понимать, что система CRISPR-Cas предпочтительно нацелена на мишени, специфические для нежелательных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к применению не встречающихся в природе или сконструированных способами инженерии композиций, векторных систем или систем доставки, как описано в настоящем описании, для лечения, предотвращения или облегчения злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения, предотвращения или облегчения злокачественной опухоли, включая введение или индукцию не встречающихся в природе или сконструированных способами инженерии композиций, векторных систем или систем доставки, как описано в настоящем описании. Необходимо понимать, что система CRISPR-Cas предпочтительно нацелена на мишени, специфичные для злокачественных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к применению не встречающихся в природе или сконструированных способами инженерии композиций, векторных систем или систем доставки, как описано в настоящем описании, для лечения, предотвращения или облегчения инфекции клеток патогенами. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к не встречающимся в природе или сконструированным способами инженерии композициям, векторными системам или системам доставки, как описано в настоящем описании, для применения в лечении, предотвращении или облегчении инфекции клеток патогенами. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения, предотвращения или облегчения инфекции клеток патогенами, включающему введение или индукцию не встречающихся в природе или сконструированных способами инженерии композиций, векторных систем или систем доставки, как описано в настоящем описании. Необходимо понимать, что система CRISPR-Cas предпочтительно нацелена на мишени, специфические для клеток, зараженных патогеном (например, мишень патогенного происхождения). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к применению не встречающихся в природе или сконструированных способами инженерии композиций, векторных систем или систем доставки, как описано в настоящем описании, для лечения, предотвращения или облегчения течения аутоиммунных заболеваний. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к не встречающимся в природе или сконструированным способами инженерии композициям, векторным системам или системам доставки, как описано в настоящем описании, для применения в лечении, предотвращении или облегчении аутоиммунных заболеваний. В некоторых вариантах осуществления изобретение касается способа лечения, предотвращения или облегчения аутоиммунных заболеваний, включающего введение или индукцию не встречающихся в природе или сконструированных способами инженерии композиций, векторных систем или систем доставки, как описано в настоящем описании. Необходимо понимать, что система CRISPR-Cas предпочтительно нацелена мишени, специфические для клеток, ответственных за аутоиммунные заболевания (например, определенные иммунные клетки).

Использование эффекторного белка нацеливания на РНК для обнаружении РНК

[336] Далее предусматривается, что эффекторный белок нацеливания на РНК может использоваться в анализе с использованием нозерн-блоттинга, который включает использование электрофореза для разделения образцов РНК по размеру. Эффекторный белок нацеливания на РНК может использоваться для специфичного связывания и обнаружения последовательности РНК-мишени.

[337] Эффекторный белок нацеливания на РНК может быть слит с флуоресцентным белком (таким как GFP) и использован для отслеживания локализации РНК в живых клетках. В частности, эффекторный белок нацеливания на РНК может быть инактивирован, так что он больше не сможет расщеплять РНК. В конкретных вариантах осуществления изобретения предусматривается, что может использоваться разделенный эффекторный белок нацеливания на РНК, в таком случае сигнал зависит от связывания обеих субъединиц для обеспечения более точной визуализации. Альтернативно, может использоваться разделенный флуоресцентный белок, который собирается, когда множественные комплексы эффекторного белка нацеливания на РНК связываются с транскриптом-мишенью. Далее предусматривается, что транскрипт нацеливается на множественные участки связывания вдоль мРНК, таким образом, флуоресцентный сигнал может усилить истинный сигнал и обеспечивать его фокальную идентификацию. В качестве другой альтернативы, флуоресцентный белок может быть собран из разделенного интеина.

[338] Эффекторные белки нацеливания на РНК, например, в подходящем случае используются для определения локализации РНК или определенных вариантов сплайсинга, количества транскрипта мРНК, повышения или понижения транскрипции и специфической диагностики заболеваний. Эффекторные белки нацеливания на РНК могут использоваться для визуализации РНК в (живых) клетках с использованием, например, флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии, такой как флуоресцентная сортировка клеток (FACS), которая обеспечивает высокую пропускную способность скрининга клеток и выделение живых клеток после сортировки. Далее, уровни экспрессии различных транскриптов могут быть оценены одновременно в условиях стресса, как например, ингибирование развития злокачественной опухоли с помощью воздействия на клетки молекулярных ингибиторов или гипоксических условий. Другой способ применения состоит в том, чтобы отследить транспорт транскриптов к синапсам во время нервного импульса с использованием двухфотонной лазерной микроскопии.

[339] В некоторых вариантах осуществления изобретения компоненты или комплексы согласно изобретению, как описано в настоящем описании, могут использоваться в мультиплексированной устойчивой к ошибкам флуоресцентной гибридизации in situ (MERFISH; Chen et al. Science, 2015, 348(6233)), например, такой как с (флуоресцентно) меченными эффекторами C2c2.

Мечение посредством apex in vitro

[340] Клеточные процессы зависят от сети молекулярных взаимодействий между белком, РНК и ДНК. Точное обнаружение взаимодействий белок-ДНК и белок-РНК является ключевым для понимания этих процессов. В технологии бесконтактной маркировки in vitro используется аффинная метка, соединенная, например, с фотоактивируемым зондом для мечения полипептидов и РНК вблизи белка-мишени или РНК-мишени in vitro. После облучения ультрафиолетом фотоактивируемая группа реагирует с белками и другими молекулами, находящимися в непосредственной близости от меченой молекулы, таким образом маркируя их. Меченые взаимодействующие молекулы могут впоследствии быть выделены и идентифицированы. Эффекторный белок нацеливания на РНК изобретения может, например, использоваться для нацеливания зонда на выбранную последовательность РНК.

[341] Эти способы использования также могут быть применены к модельным животным для визуализации in vivo соответствующих заболеваний или сложных для культивирования типов клеток.

Использование эффекторного белка нацеливании на РНК в РНК-оригами/в сборочных линиях in vitro - комбинаторике

[341] Под "РНК-оригами" понимаются наноразмерные сложенные структуры для создания двумерных или трехмерных конструктов с использованием РНК как интегрированного шаблона. Сложенная структура закодирована в РНК, таким образом, форма получающейся РНК определена синтезируемой последовательностью РНК (Geary, et al. 2014. Science, 345 (6198). pp. 799- 804). РНК-оригами может действовать как каркас для организации других компонентов, таких как белки, в комплексы. Эффекторный белок нацеливания на РНК изобретения может использоваться, например, для нацеливания на белки-мишени на РНК-оригами с использованием подходящей направляющей РНК.

[342] Эти способы использования также могут быть применены к модельным животным для визуализации in vivo соответствующих заболеваний или сложных для культивирования типов клеток.

Использование эффекторного белка нацеливания на РНК для выделения, очистки, обогащения или обеднения РНК определенными последовательностями

[343] Далее предусматривается, что эффекторный белок нацеливания на РНК в комплексе с РНК может использоваться для выделения и/или очистки РНК. Эффекторный белок нацеливания на РНК, может быть, например, присоединен к аффинной метке, которая может использоваться для выделения и/или очистки эффекторного белка нацеливания на РНК. Такие способы применения могут быть полезны, например, при анализе профилей экспрессии генов в клетках.

В конкретных вариантах осуществления изобретения может предусматриваться, что эффекторные белки нацеливания на РНК могут использоваться для нацеливания на конкретную некодирующую РНК (нкРНК), таким образом блокируя ее активность, что может быть применимо для анализа ее функции. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, как описано в настоящем описании, может использоваться для специфического обогащения конкретной РНК (включая, но не ограничиваясь, увеличение стабильности и т.д.), или, наоборот, специфического обеднения конкретной РНК (такой как, без ограничения, например, конкретные варианты сплайсинга, изоформы и т.д.).

Изучение функции linc-РНК и других ядерных РНК

[344] Современные стратегии нокдауна РНК, например, siPHK, имеют недостаток, заключающийся главным образом в том, что они ограничиваются нацеливанием на цитозольные транскрипты, так как белок функционирует в цитозоле. Преимущество эффекторного белка нацеливания на РНК данного изобретения как внешней системы, которая не важна для функций клетки, состоит в том, что он может использоваться в любом компартменте клетки. Путем присоединения последовательности NLS к эффекторному белку нацеливания на РНК, он может быть направлен в ядро для нацеливания на ядерную РНК. Например, этот способ предусматривает исследование функции linc-РНК. Длинные межгенные некодирующие РНК (linсРНК) представляют собой слабоизученную область науки. У большинства linc-РНК есть не известные к настоящему времени функции, которые могут быть исследованы с использованием эффекторного белка нацеливания на РНК по изобретению.

Идентификация РНК-связывающих белков

[345] Идентификация белков, связанных с конкретной РНК, может быть полезна для понимания роли многих РНК. Например, многие linc-РНК ассоциируются с транскрипционными и эпигенетическими регуляторами для контроля транскрипции. Понимание, какие белки связываются с конкретной linc-РНК, может помочь выявить компоненты данного регуляторного процесса. Эффекторный белок нацеливания на РНК по изобретению может быть разработан для присоединения биотин-лигазы к определенному транскрипту, чтобы локально маркировать связанные белки биотином. Потом белки могут быть выделены и проанализированы при помощи масс-спектрометриии с целью идентификации.

Сборка комплексов на РНК и транспортировка субстрата

[346] Эффекторные белки нацеливания на РНК по изобретению могут далее использоваться для сборки комплексов на самой РНК. Это может быть достигнуто путем функционализации эффекторного белка нацеливания на РНК с помощью многих связанных белков (например, компонентов конкретного пути синтеза). Альтернативно, многие эффекторные белки нацеливания на РНК могут быть функционализированы путем связывания с различными белками и нацелены на ту же самую или смежную РНК-мишень. Полезное применение сборки комплексов на РНК состоит, например, в облегчении переноса субстрата между белками.

Синтетическая биология

[347] Создание биологических систем полезно, в том числе для разработки возможных применений в медицине. Предусматривается, что программируемые эффекторные белки нацеливания на РНК по изобретению могут быть использованы путем присоединения к разделенным белкам токсичных доменов для индукции программируемой клеточной гибели, например, с использованием связанной со злокачественной опухолью РНК в качестве транскрипта-мишени. Далее, в синтетических биологических системах на процессы, включающие белок-белковое взаимодействие, можно влиять путем, например, образования комплексов слияния с соответствующими эффекторами, такими как киназы или другими ферментами.

Сплайсинг белков: интеины

[348] Сплайсинг белка - посттрансляционный процесс, при котором полипептид, называемый интеином, катализирует свое собственное вырезание из окружающих его полипептидов, называемых экстеинами, с последующим лигированием экстеинов. Соединение двух или более эффекторных белков нацеливания на РНК, как описано в настоящем описании, на транскрипте-мишени может использоваться, чтобы направить высвобождение разделенного интеина (Topilina and Mills Mob DNA. 2014 Feb 4; 5(1):5), таким образом допуская прямое вычисление существования мРНК транскрипта и последующее высвобождение белкового продукта, такого как метаболический фермент или транскрипционный фактор (для последующего приведения в действие процессов транскрипции). Этот способ применения может быть особенно актуален в синтетической биологии (см. выше), или крупномасштабном биопроизводстве (производство продукта только при определенных условиях).

Индуцируемые, дозируемые и самоинактивирующиеся системы.

[349] В одном варианте осуществления слитые комплексы, включающие эффекторный белок нацеливания на РНК по изобретению и эффекторный компонент, разработаны, чтобы быть индуцируемыми, например, светоиндуцируемыми или химически индуцируемыми. Такая индуцируемость позволяет активировать эффекторный компонент в желаемый момент вовремя.

[350] Например, индуцируемость светом может быть достигнута путем разработки слитого комплекса, в котором для слияния используется образование пары CRY2PHR/CIBN. Эта система особенно полезна для индукции светом белковых взаимодействий в живых клетках (Konermann S, et al. Nature. 2013; 500:472-476).

[351] Например, химическая индуцируемость может быть достигнута путем разработки комплекса слияния, в котором используется образование пары FKBP/FRB (белок, связывающий FK506/FKBP, связывающий рапамицин). При использовании этой системы рапамицин необходим для связывания белков (в Zetsche et al. Nat Biotechnol. 2015; 33(2): 139-42 описано использование этой системы для Cas9).

[352] После введения в клетку в виде ДНК, эффекторный белок нацеливания на РНК по изобретению может быть далее изменен индуцируемыми промоторами для участия в тетрациклин- или доксициклин-контролируемой активации транскрипции (системы экспрессии Tet-On и Tet-Off), системах экспрессии генов, индуцируемых гормонами, таких как индуцируемая экдизоном и индуцируемая арабинозой система экспрессии генов. При введении в клетку в виде РНК, экспрессия эффекторного белка нацеливания на РНК может быть изменена с помощью рибопереключателя, который может выявлять низкомолекулярные соединения, такие как тетрациклин (как описано в Goldfless et al. Nucleic Acids Res. 2012; 40(9):e64).

[353] В одном варианте осуществления доставка эффекторного белка нацеливания на РНК по изобретению может быть модулирована для изменения количества белка или cr-РНК в клетке, таким образом, изменяя величину желаемого эффекта или любых нежелательных неспецифических эффектов.

[354] В одном из вариантов осуществления изобретения может быть разработан самоинактивирующийся эффекторный белкок нацеливания на РНК. При введении в клетку в виде РНК, как мРНК, так и терапевтической РНК (Wrobleska et al. Nat Biotechnol. 2015 Aug; 33(8): 839-841), они могут самостоятельно инактивировать экспрессию и последующие эффекты, разрушив собственную РНК, таким образом, может быть достигнуто сокращение времени нахождения и потенциальных нежелательных эффектов.

[355] Для других способов применения in vivo эффекторных белков нацеливания на РНК, как описано в настоящем описании, см. Mackay JP et al. (Nat Struct Mol Biol. 2011 Mar; 18(3):256-61), Nelles et al. (Bioessays. 2015 Jul; 37(7):732-9) и Abil Z and Zhao H (Mol Biosyst. 2015 Oct; 11(10):2658-65), которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. В частности, следующие способы применения предусматриваются в некоторых вариантах осуществления изобретения, предпочтительно в некоторых вариантах осуществления при помощи каталитически неактивного C2c2: усиление трансляции (например, слияние C2c2 c факторами трансляции (например, слитые конструкции с eIF4)); подавление трансляции (например, направляющая РНК, нацеливающая на участки связывания рибосом); пропуск экзона (например, направляющие РНК, нацеливающие на участки доноров и/или акцепторов сплайсинга); включение экзона (например, направляющая РНК, нацеливающая на участки донора и/или акцептора сплайсинга конкретного экзона для их включения или C2c2, слитый с компонентами сплайсосомы (например, мяРНК U1); доступ к локализации РНК (например, соединение C2c2 с маркером (например, с EGFP)); изменение локализации РНК (например, слияние C2c2 с сигналом локализации (например, слияние с NLS или NES)); деградация РНК (в этом случае не предполагается использование каталитически неактивного C2c2, если предполагается активность C2c2, альтернативно, для увеличения специфичности, может использоваться разделенный C2c2); ингибирование функций некодирующей РНК (например, микроРНК), таких как деградация или связывание направляющей РНК с функциональными участками (возможно титрование в конкретных участках путем релокализации посредством слитых конструкций C2c2-сигнальная последовательность).

[356] Как описано в настоящем описании ранее и продемонстрировано в Примерах, функция C2c2 нечувствительна к 5'- или 3'-удлинению cr-РНК и к удлинению шпилечной структуры cr-РНК. Следовательно, это предусматривает, что шпилечные структуры MS2 и других доменов связывания могут быть добавлены к cr-РНК, не влияя на формирование комплекса и связывание с транскриптами-мишенями. Такие модификации cr-РНК для связывания различных эффекторных доменов применимы в использовании эффекторных белков нацеливания на РНК, описанных выше.

[357] Как продемонстрировано в Примерах, C2c2, в особенности LshC2c2, способен к опосредованию устойчивости к РНК-фагам. Следовательно, предусматривается, что C2c2 может использоваться для иммунизации, например, животных, людей и растений, против патогенов, содержащих только РНК, включая, но не ограничиваясь ими, вирус Эбола и вирус Зика.

[358] Авторы настоящего изобретения показали, что C2c2 может процессировать (расщеплять) его собственную последовательность. Это относится как к дикому типу белка C2c2, так и к мутантному белку C2c2, содержащему один или более мутантных аминокислотных остатков R597, H602, R1278 и H1283, таких как одна или более модификаций, отобранных из R597A, H602A, R1278A и H1283A. Следовательно, предусматривается, что множественные cr-РНК, разработанные для различных транскриптов-мишеней и/или способов применения, могут быть доставлены как единственная пре-cr-РНК или как единственный транскрипт, управляемый одним промотором. Такой способ доставки имеет то преимущество, что он существенно более компактный, обеспечивает более простые синтез и доставку в вирусных системах. Предпочтительно, нумерация аминокислот, описанная в настоящем описании, относится к белку LshC2c2. Будет понятно, что точные положения аминокислот могут отличаться для ортологов LshC2c2, что может быть адекватно определено с помощью выравнивания белка, как известно в данной области, и, как описано в настоящем описании в других пунктах.

[359] Особенности изобретения также охватывают способы и применения композиций и систем, описанных в настоящем описании, в генной инженерии, например, для изменения или манипулирования экспрессией одного или более генов или одного или более генных продуктов, в прокариотических или эукариотических клетках, in vitro, in vivo или ex vivo.

[360] В одном из аспектов изобретение относится к способам и композициям для направленного изменения, например, сокращения, экспрессии РНК-мишени в клетках. В рассматриваемых способах предусматривается система C2c2 по изобретению, которая вмешивается в транскрипцию, стабильность и/или трансляцию РНК.

[361] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффективное количество системы C2c2 используется для расщепления РНК или иного ингибирования экспрессии РНК. В этом отношении система имеет применение, подобное миРНК и кшРНК, таким образом, она также может заменять такие способы. Способ включает, но не ограничивается этим, использование системы C2c2 вместо, например, интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (такой как миРНК или кшРНК) или их матрицы транскрипции, например, ДНК, кодирующей кшРНК. Систему C2c2 вводят в клетку-мишень, например, путем введения млекопитающему, в котором находится клетка-мишень.

[362] Одним из преимуществ системы C2c2 по изобретению является ее специфичность. Например, тогда как полинуклеотидные системы интерферирующих рибонуклеиновых кислот (такие как миРНК или кшРНК) имеют проблемы в области разработки, стабильности и нецелевого связывания, система C2c2 изобретения может быть разработана с высокой специфичностью.

Дестабилизированный C2c2

[363] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок (фермент CRISPR; C2c2) согласно изобретению, как описано в настоящем описании, связан с или присоединен к домену дестабилизации (DD). В некоторых вариантах осуществления изобретения доменом дестабилизации (DD) является ER50. В некоторых вариантах осуществления изобретения соответствующим лигандом стабилизации для этого домена дестабилизации (DD) является 4HT. По существу, в некоторых вариантах осуществления изобретения одним по меньшей мере из одного домена дестабилизации (DD) является ER50, и его стабилизирующим лигандом - 4HT или CMP8. В некоторых вариантах осуществления изобретения доменом дестабилизации (DD) является DHFR50. В некоторых вариантах осуществления изобретения соответствующим лигандом стабилизации для этого домена дестабилизации (DD) является TMP. По существу, в некоторых вариантах осуществления изобретения одним по меньшей мере из одного домена дестабилизации (DD) является DHFR50, и его стабилизирующим лигандом - TMP. В некоторых вариантах осуществления изобретения доменом дестабилизации (DD) является ER50. В некоторых вариантах осуществления изобретения соответствующим лигандом стабилизации для этого домена дестабилизации (DD) является CMP8. Следовательно, CMP8 может быть альтернативным лигандом стабилизации для 4HT в системе ER50. В то время как возможно, что CMP8 и 4HT могут/должны использоваться в качестве конкурентов, некоторые типы клеток могут быть более восприимчивы к одному или другому из этих двух лигандов, и на основе этой заявки и знаний в данной области, квалифицированный специалист может использовать CMP8 и/или 4HT.

[364] В некоторых вариантах осуществления изобретения один или два домена дестабилизации (DD) могут быть присоединены к N-концу фермента CRISPR, и один или два домена дестабилизации (DD) могут быть присоединены к С-концу фермента CRISPR. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере два домена дестабилизации (DD) связаны с ферментом CRISPR, и домены дестабилизации (DD) одинаковы, т.е. гомологичны. Таким образом оба (или два или более) домена дестабилизации (DD) могут быть представлены ER50. Это предпочтительно в некоторых вариантах осуществления изобретения. Альтернативно, оба (или два или более) домена дестабилизации (DD) могут быть представлены DHFR50. Это также предпочтительно в некоторых вариантах осуществления изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере два домена дестабилизации (DD) связаны с ферментом CRISPR, и домены дестабилизации (DD) различны, т.е. гетерологичны. Таким образом. один из доменов дестабилизации (DD) может быть представлен ER50, в то время как один или более доменов дестабилизации (DD) или любого другого DD могут быть представлены DHFR50. Наличие двух или более доменов дестабилизации (DD), которые являются гетерологичными, может быть выгодным, поскольку оно обеспечивает больший уровень контроля деградации. Тандемное соединение более одного домена дестабилизации (DD) на N- или C-конце может увеличивать деградацию, и такое тандемное соединение может представлять собой, например, ER50-ER50-C2c2 или DHFR-DHFR-C2c2. Предусматривается, что высокий уровень деградации возможен в отсутствие любого из стабилизирующих лигандов, промежуточные уровни деградации возможны в случае отсутствия одного из стабилизирующих лигандов и присутствия другого стабилизирующего лиганда, в то время как низкие уровни деградации возможны в присутствии обоих (или двух или более) стабилизирующих лигандов. Контроль деградации С2с2 также возможен при наличии N-концевого домена дестабилизации (DD) ER50 и C-концевого домена дестабилизации (DD) DHFR50.

[365] В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение фермента CRISPR с доменом дестабилизации (DD) включает линкер между DD и ферментом CRISPR. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер представляет собой GlySer. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент DD-CRISPR далее содержит по меньшей мере один сигнал ядерного экспорта (NES). В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент DD-CRISPR включает два или больше сигналов ядерного экспорта (NES). В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент DD-CRISPR включает по меньшей мере один сигнал ядерной локализации (NLS). Это может быть в дополнение к NES. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR содержит, или по существу состоит из, или состоит из сигнала локализации (ядерного импорта или экспорта) или, в качестве составной части, линкера между ферментом CRISPR и доменом дестабилизации (DD). HA-метка или Flag-метка также могут входить в состав изобретения в качестве линкеров. Заявители используют NLS и/или NES в качестве линкеров и также используют глицин-сериновый линкер, такой как всего лишь (GGGGS)3.

[366] Дестабилизирующие домены полезны тем, что придают нестабильность широкому спектру белков, см., например, статью Miyazaki, J Am Chem Soc. Mar 7, 2012; 134(9): 3942-3945, включенную в настоящее описание в качестве ссылки. CMP8 или 4-гидрокситамоксифен может дестабилизировать домены. В общем смысле, показано, что чувствительный к температуре мутант DHFR млекопитающих (DHFRts), дестабилизирующий остаток по правилу N-конца, стабилен при пермиссивной температуре, но нестабилен при 37°C. Добавление метотрексата, высокоаффинного лиганда для DHFR млекопитающих, к клеткам, экспрессирующим DHFRts, частично ингибировало деградацию белка. Это демонстрирует, что небольшая молекула лиганда может стабилизировать белок, в ином случае предназначенный для деградации в клетках. Производное рапамицина использовалось, чтобы стабилизировать нестабильного мутанта по домену FRB mTOR (FRB*) и восстановить функцию слитой киназы, GSK-3β.6,7. Эта система продемонстрировала, что лиганд-зависимая стабильность представляет собой привлекательную стратегию регулирования функции специфичного белка в сложной биологической среде. Система контроля активности белка может включать DD, который становится функциональным, когда происходит комплементация убиквитином, вызванная индуцированной рапамицином димеризацией FK506-связывающего белка и FKBP12. Мутанты белка FKBP12 человека или белка ecDHFR могут быть разработаны таким образом, чтобы быть метаболически нестабильными в отсутствие их высокоаффинных лигандов, Shield-1 или триметоприма (TMP), соответственно. Эти мутанты являются возможными доменами дестабилизации (DD), полезными в практическом применении изобретения; нестабильность DD, слитого с ферментом CRISPR, приводит к деградации протеасомой белка CRISPR в составе всего соединенного белка. Shield-1 и TMP связываются с и стабилизируют DD дозозависимым способом. Лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена (ERLBD, остатки 305-549 из ERS1) также может быть использован в качестве домена дестабилизации. Так как сигнальный путь рецептора эстрогена участвует в развитии ряда заболеваний, таких как рак молочной железы, сигнальный путь хорошо изучен, и получены многочисленные агонисты и антагонисты рецептора эстрогена. Таким образом, известны совместимые пары ERLBD и лекарственных средств. Есть лиганды, которые связывают мутантные, но не формы дикого типа ERLBD. При помощи одного из этих мутантных доменов, кодирующего три мутации (L384M, M421G, G521R)12, можно регулировать стабильность DD, полученного из ERLBD, с использованием лиганда, который не вмешивается в эндогенные эстроген-чувствительные сети. Дополнительная мутация (Y537S) может быть введена, чтобы далее дестабилизировать ERLBD и сделать его потенциальным кандидатом на роль DD. Этот тетра-мутант является предпочтительным для разработки DD. Мутантный ERLBD может быть присоединен к ферменту CRISPR в качестве DD для регулирования или нарушения его стабильности с помощью лиганда. Другой DD может быть создан с помощью метки размером 12 кДа (107 аминокислот) на основе мутантного белка FKBP, стабилизированного лигандом Shield-1; см., например, Nature Methods 5, (2008). Например, DD может быть модифицирован FK506-связывающим белком 12 (FKBP 12), который связывается с и обратимо стабилизируется синтетическим продуктом, биологически инертной небольшой молекулой, Shield-1; см., например, работы Banaszynski LA, Chen LC, Maynard-Smith LA, Ooi AG, Wandless TJ. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 2006; 126:995-1004; Banaszynski LA, Selimyer MA, Contag CH, Wandless TJ, Thome SH. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nat Med. 2008; 14:1123-1127; Maynard-Smith LA, Chen LC, Banaszynski LA, Ooi AG, Wandless TJ. A directed approach for engineering conditional protein stability using biologically silent small molecules. The Journal of biological chemistry. 2007; 282:24866-24872; and Rodriguez, Chem Biol. Mar 23, 2012; 19(3): 391-398 - все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки и могут использоваться в практике изобретения для связывания выбранного DD с ферментом CRISPR. Как видно, в данной области известно множество DD, и DD может быть связан, например, слит, предпочтительно, с помощью линкера, с ферментом CRISPR, посредством чего DD может быть стабилизирован в присутствии лиганда и дестабилизирован в отсутствие лиганда, в результате чего фермент CRISPR полностью дестабилизируется, или DD может быть стабилизирован в отсутствие лиганда и дестабилизирован в присутствии лиганда; DD позволяет регулировать и контролировать фермент CRISPR, а следовательно, комплекс или систему CRISPR-Cas - "включать" или "выключать", если можно так выразиться, таким образом предоставляя средства для регулирования или контроля системы, например, в in vivo или in vitro среде. Например, когда целевой белок экспрессируется в качестве слитой конструкции с меткой DD, он дестабилизирован и подвергается быстрой деградации в клетке, например, в протеасомах. Таким образом, отсутствие стабилизирующего лиганда приводит к деградации белка Cas, связанного с DD. Когда новый DD слит с белком-мишенью, его нестабильность передается белку-мишени, приводя к быстрой деградации всего слитого белка. Пиковая активность иногда выгодна для Cas для уменьшения неспецифических эффектов. Таким образом, предпочтительны кратковременные вспышки высокой активности. Данное изобретение в состоянии обеспечить такие пики. В некоторых смыслах система индуцируема. В некоторых других смыслах, система подавляется отсутствием стабилизирующего лиганда и инициируется присутствием стабилизирующего лиганда.

Применение системы CRISPR, нацеленной на РНК, к растениям и дрожжам

Определения:

[367] В целом термин "растение" касается любых разнообразных фотосинтетических, эукариотических, одноклеточных или многоклеточных организмов царства Растения (Plantae), для которых характерен рост путем клеточного деления, наличие хлоропластов, и клеточных стенок, состоящих из целлюлозы. Термин "растение" включает однодольные и двудольные растения. Более конкретно, предполагается, что растения включают, но не ограничиваются ими, покрытосеменные и голосеменные растения, такие как акация, люцерна, амарант, яблоко, абрикос, артишок, ясень, спаржа, авокадо, банан, ячмень, бобы, свекла, береза, бук, ежевика, черника, брокколи, брюссельская капуста, капуста, канола, мускусная дыня, морковь, маниока, цветная капуста, кедр, хлебные злаки, сельдерей, каштан, вишня, китайская капуста, цитрусовые, клементин, клевер, кофе, кукуруза, хлопок, вигна (коровий горох), огурец, кипарис, баклажан, вяз, эндивий, эвкалипт, фенхель, инжир, ель, герань, виноград, грейпфрут, земляной орех, физалис, тсуга, гикори, кудрявая капуста (кале), киви, кольраби, лиственница, салат-латук, лук-порей, лимон, лайм, робиния, сосна, адиантум, маис, манго, клен, дыня, просо, гриб, горчица, орехи, дуб, овес, масличная пальма, бамия, лук, апельсин, декоративное растение или цветок или дерево, папайя, пальма, петрушка, пастернак, горох, персик, арахис, груша, сфагнум, перец, хурма, голубиный горох (каян), сосна, ананас, подорожник, слива, гранат, картофель, тыква, радиккио, редька, рапс, малина, рис, рожь, сорго, сафлор, ива, соя, шпинат, ель, патиссон, земляника, сахарная свекла, сахарный тростник, подсолнечник, батат, сладкая кукуруза, мандарин, чай, табак, помидор, деревья, тритикале, газонные травы, репа, виноградная лоза, грецкий орех, водяной кресс, арбуз, пшеница, ямс, тис и цукини. Термин растение также охватывает водоросли (Algae), которые являются, главным образом, фотоавтотрофами, объединенными, прежде всего, отсутствием корней, листьев и других органов, которые характеризуют высшие растения.

[368] Способы направленного изменения экспрессии генов, использующие систему нацеливания на РНК, как описано в настоящем описании, могут использоваться для придания желаемых свойств по существу любому растению. Большое разнообразие растений и систем растительных клеток с желаемыми физиологическими и агрономическими характеристиками, описанными в настоящем описании, может быть разработано с использованием конструкции из нуклеиновых кислот, описанных в настоящем описании, и различных упомянутых выше способов преобразования. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения целевые растения и растительные клетки для инженерии включают, но не ограничиваются ими, однодольные и двудольные растения, такие как зерновые культуры, включая хлебные культуры (например, пшеница, кукуруза, рис, просо, ячмень), фруктовые культуры (например, помидор, яблоко, груша, клубника, апельсин), кормовые культуры (например, люцерна), овощные культуры (например, морковь, картофель, сахарная свекла, ямс), листовые овощные культуры (например, салат, шпинат); цветущие растения (например, петуния, роза, хризантема), хвойные деревья и (например, сосна, пихта, ель), растения, используемые в фиторемедиации (например, растения, накапливающие тяжелые металлы); масличные культуры (например, подсолнечник, рапс) и растения, используемые в экспериментальных целях (например, Arabidopsis). Таким образом, способы и системы CRISPR-Cas могут использоваться в широком спектре растений, например, в двудольных растениях, принадлежащих к следующим отрядам: Magnoliales, llliciales, Laurales, Piperales, Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Papaverales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales, Myricales, Fagales, Casuarinales, Caryophyllales, Batales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecythidales, Violales, Salicales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Cornales, Proteales, Santales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales, Juglandales, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemoniales, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Campanulales, Rubiales, Dipsacales и Asterales; способы и системы CRISPR-Cas могут использоваться в однодольных растениях, таких как растения, принадлежащие к следующим отрядам: Alismatales, Hydrocharitales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poales, Juncales, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales, Pandanales, Arales, Lilliales и Orchidales, или в растениях, принадлежащих к голосеменным, например, принадлежащих к отрядам: Pinales, Ginkgoales, Cycadales, Araucariales, Cupressales и Gnetales.

[369] Система CRISPR, нацеленная на РНК, и способы ее применения, описанные в настоящем описании, могут использоваться в широком диапазоне видов растений, включенных в неограниченный список двудольных, однодольных или голосеменных растений, принадлежащих к следующим родам: Atropa, Alseodaphne, Anacardium, Arachis, Beilschmiedia, Brassica, Carthamus, Cocculus, Croton, Cucumis, Citrus, Citrullus, Capsicum, Catharanthus, Cocos, Coffea, Cucurbita, Daucus, Duguetia, Eschscholzia, Ficus, Fragaria, Glaucium, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hyoscyamus, Lactuca, Landolphia, Linum, Litsea, Lycopersicon, Lupinus, Manihot, Majorana, Malus, Medicago, Nicotiana, Olea, Parthenium, Papaver, Persea, Phaseolus, Pistacia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Senecio, Sinomenium, Stephania, Sinapis, Solanum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Vicia, Vinca, Vitis, and Vigna; and the genera Allium, Andropogon, Eragrostis, Asparagus, Avena, Cynodon, Elaeis, Festuca, Festulolium, Heterocallis, Hordeum, Lemna, Lolium, Musa, Oryza, Panicum, Pannesetum, Phleum, Poa, Secale, Sorghum, Triticum, Zea, Abies, Cunninghamia, Ephedra, Picea, Pirns и Pseudotsuga.

[370] Системы CRISPR, нацеленные на РНК, и способы их применения могут также использоваться в широком спектре "водорослей" или "клеток водорослей"; включая, например, водоросли, отобранные из нескольких эукариотических филюмов, включая следующие: Rhodophyta (красные водоросли), Chlorophyta (зеленые водоросли), Phaeophyta (коричневые водоросли), Bacillariophyta (диатомовые водоросли), Eustigmatophyta и динофлагелляты, а также прокариотический филюм Cyanobacteria (сине-зеленые водоросли). Термин "водоросли" включает, например, водоросли, отобранные из следующих родов: Amphora, Anabaena, Ankistrodesmus, Botryococcus, Chaetoceros, Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Cyclotella, Cylindrotheca, Dunaliella, Emiliana, Euglena, Hematococcus, Isochrysis, Monochrysis, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Nodularia, Nostoc, Oochromonas, Oocystis, Oscillatoria, Pavlova, Phaeodactylum, Playtmonas, Pleurochrysis, Porphyra, Pseudoanabaena, Pyramimonas, Stichococcus, Synechococcus, Synechocystis, Tetraselmis, Thalassiosira и Trichodesmium.

[371] Часть растения, т.е. "растительная ткань" может быть обработана согласно способам по настоящему изобретению, чтобы получить растение c улучшенными свойствами. Понятие "растительная ткань" также включает растительные клетки. Термин "растительная клетка", как используют в настоящем описании, относится к отдельным единицам живого растения, как в интактном целом растении, так и в изолированной форме, выращенной в культуре тканей in vitro, на питательных средах или агаре, в суспензии на питательной среде или буфере или в качестве части более высокоорганизованных единиц, например, таких как растительная ткань, орган растения или целое растение.

[372] Термин "протопласт" относится к растительной клетке, защитная клеточная стенка которой была полностью или частично удалена, например, механическим или ферментативным способом, что привело к появлению интактной биохимически компетентной единице живого растения, которая способна заново сформировать клеточную стенку, пролиферировать, регенерировать и вырасти в целое растение при надлежащих условиях выращивания.

[373] Термин "трансформация" в широком смысле относится к процессу генетической модификации растения-хозяина с помощью введения ДНК посредством Agrobacteria или одного из ряда химических или физических способов. Как используют в настоящем описании, термин "растение-хозяин" относится к растениям, включая любые клетки, ткани, органы или потомство растений. Много подходящих растительных тканей или растительных клеток могут быть преобразованы и включают, но не ограничены, следующими: протопласты, соматические эмбрионы, пыльца, листья, саженцы, стебли, каллусы, столоны, микроклубни и побеги. Понятие "растительная ткань" также относится к любому клону такого растения, семени, потомству, черенкам, возникших в результате полового или вегетативного размножения, и потомкам любого из них, такие как черенки или семена.

[374] Термин "трансформированный", как используют в настоящем описании, относится к клетке, ткани, органу или организму, в которые была введена чужеродная конструкция, такая как молекула ДНК. Введенная молекула ДНК может быть интегрирована в ДНК клетки-реципиента, ткани, органа или организма, таким образом, что введенная молекула ДНК передается последующему потомству. В этих вариантах осуществления изобретения "трансформированная" или "трансгенная" клетка или растение также могут включать потомство клетки или растения и потомство, полученное с помощью искусственного разведения, использующего такое преобразованное растение в качестве родителя в скрещивании, и демонстрирующее измененный фенотип в результате присутствия введенной молекулы ДНК. Предпочтительно, трансгенное растение фертильно и способно к передаче введенной ДНК потомству посредством полового размножения.

[375] Термин "потомство", такое как потомство трансгенного растения, относится к тому, что порождается, происходит от или получено из растения или трансгенного растения. Введенная молекула ДНК также может быть временно введена в клетку реципиента, таким образом, что последующее потомство не наследует введенную молекулу ДНК и, таким образом, не считается "трансгенным". Соответственно, как используют в настоящем описании, "нетрансгенное" растение или растительная клетка является растением, не содержащим чужеродную ДНК, устойчиво интегрированную в его геном.

[376] Термин "промотор растения", как используют в настоящем описании, является промотором, способным к инициированию транскрипции в растительных клетках, независимо от того, происходит ли он из растительной клетки. Иллюстративные подходящие промоторы растений включают, но не ограничиваются ими, промоторы, полученные из растений, вирусов растения и бактерий, таких как Agrobacterium или Rhizobium, которые включают гены, экспрессируемые в растительных клетках.

[378] Как используют в настоящем описании, термин "дрожжевая клетка" относится к любой клетке гриба в родов Ascomycota и Basidiomycota. Дрожжевые клетки могут включать почкующиеся дрожжевые клетки, делящиеся дрожжевые клетки и клетки плесени. Не будучи ограниченным этими организмами, многие типы дрожжей, используемых в лабораторных и промышленных условиях, являются частью рода Ascomycota. В некоторых вариантах осуществления изобретения дрожжевая клетка является клеткой S. cerevisiae, Kluyveromyces marxianus или Issatchenkia orientalis cell. Другие дрожжевые клетки могут включать, но не ограничиваться ими, Candida spp. (например, Candida albicans), Yarrowia spp. (например, Yarrowia lipolytica), Pichia spp. (например, Pichia pastoris), Kluyveromyces spp. (например, Kluyveromyces lactis и Kluyveromyces marxianus), Neurospora spp. (например, Neurospora crassa), Fusarium spp. (например, Fusarium oxysporum), и Issatchenkia spp. (например, Issatchenkia orientalis, также именуемые Pichia kudriavzevii и Candida acidothermophilum). В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка гриба является нитевидной клеткой гриба. Как используют в настоящем описании, термин "нитевидная клетка гриба" относится к любому типу клетки гриба, которая растет в виде нитей, т.е. гиф или мицелия. Примеры волокнистых клеток гриба могут включать, но не ограничиваться ими, Aspergillus spp. (например, Aspergillus niger), Trichoderma spp. (например, Trichoderma reesei), Rhizopus spp., (например, Rhizopus oryzae) и Mortierella spp. (например, Mortierella isabellina).

[379] В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка гриба является промышленным штаммом. Как используют в настоящем описании, "промышленный штамм" относится к любому штамму клетки гриба, используемому в или выделенному из производственного процесса, например, производства продукта в коммерческих или промышленных масштабах. Понятие "промышленный штамм" может относиться к виду гриба, который, как правило, используется в производственном процессе, или оно может относиться к изоляту вида гриба, который также может использоваться в непромышленных целях (например, лабораторных исследованиях). Примеры производственных процессов могут включать брожение (например, в производстве продуктов питания или напитков), дистилляцию, производство биотоплива, производство различных соединений и полипептидов. Примеры промышленных штаммов могут включать, но не ограничиваться ими, JAY270 и АТСС4124.

[380] В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка гриба является полиплоидной клеткой. Как используют в настоящем описании, понятие "полиплоидная" клетка может относиться к любой клетке, геном в которой присутствует больше, чем в одной копии. Понятие "полиплоидная клетка" может относиться к клетке, которая естественным образом существует в полиплоидном состоянии, или к клетке, полиплоидное состояние генома которой было вызвано искусственно (например, посредством специфического регулирования, изменения, инактивации, активации, или модификации мейоза, цитокинеза, или репликации ДНК). "Полиплоидная клетка" может относиться к клетке, весь геном которой является полиплоидным, или к клетке, которая является полиплоидом в конкретном геномном локусе-мишени. Чтобы не привязываться к теории, считается, что изобилие направляющих РНК может ограничивать скорость генной инженерии полиплоидных клеток в большей степени, чем гаплоидных клеток, и, таким образом, в способах использования системы CRISPR с белком С2с2, описанных в настоящем описании, могут использоваться преимущества определенного типа клетки гриба.

[381] В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка гриба является диплоидной клеткой. Как используют в настоящем описании, понятие "диплоидная" клетка может относиться к любой клетке, геном которой присутствует в двух копиях. Диплоидная клетка может относиться к типу клетки, которая естественным образом существует в диплоидном состоянии, к клетке, диплоидное состояние генома которой было вызвано искусственно (например, посредством специфического регулирования, изменения, инактивации, активации или модификации мейоза, цитокинеза или репликации ДНК). Например, штамм S. cerevisiae, S228C, может находиться в гаплоидном или диплоидном состоянии. "Диплоидная" клетка может относиться к клетке, весь геном которой является диплоидным, или к клетке, которая является диплоидной в конкретном геномном локусе-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка гриба является гаплоидной клеткой. Как используют в настоящем описании, "гаплоидная" клетка может относиться к любой клетке, геном которой присутствует в одной копии. Гаплоидная клетка может относиться к типу клетки, которая естественно находится в гаплоидном состоянии, или к клетке, гаплоидное состояние генома которой было вызвано искусственно (например, посредством специфичного регулирования, изменения, инактивации, активации или модификации мейоза, цитокинеза или репликации ДНК). Например, штамм S. cerevisiae, S228C, может находиться в гаплоидном или диплоидном состоянии. "Гаплоидная" клетка может относиться к клетке, весь геном которой является гаплоидным, или к клетке, которая является гаплоидной в конкретном геномном локусе-мишени.

[382] Как используют в настоящем описании, "экспрессирующий вектор дрожжей" относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит одну или более последовательностей, кодирующих РНК и/или полипептид, и может далее содержать любые желаемые элементы, которые управляют экспрессией нуклеиновой кислоты (кислот), а также любыми элементами, которые обеспечивают репликацию и сохранение вектора экспрессии в дрожжевой клетке. В данной области известно множество подходящих экспрессирующих векторов дрожжей и их особенностей; например, различные векторы и способы иллюстрированы в Yeast Protocols, 2nd edition, Xiao, W., ed. (Humana Press, New York, 2007) and Buckholz, R.G. and Gleeson, M.A. (1991) Biotechnology (NY) 9(11): 1067-72. Векторы дрожжей могут содержать, без ограничения, центромерную (CEN) последовательность, автономно реплицирующуюся последовательность (ARS), промотор, такой как промотор РНК-полимеразы III, функционально связанный с целевой последовательностью или геном, терминатор, такой как терминатор РНК-полимеразы III, ориджин репликации и маркерный ген (например, ауксотрофии, антибиотика или другие выбранные маркеры). Примеры экспрессирующих векторов для использования в дрожжах могут включать плазмиды, дрожжевые искусственные хромосомы, плазмиды 2μ, дрожжевые интегративные плазмиды, дрожжевые репликативные плазмиды, челночные векторы и эписомы.

Стабильная интеграция компонентов системы CRISPR, нацеленная на РНК, в геном растений и растительных клеток

[383] В конкретных вариантах осуществления изобретения предусматривается, что полинуклеотиды, кодирующие компоненты системы CRISPR, нацеленной на РНК, вводятся для стабильной интеграции в геном растительной клетки. В этих вариантах осуществления изобретения конструкция вектора трансформации или системы экспрессии может быть отрегулирована в зависимости от того, когда, где и при каких условиях направляющая РНК и/или ген(ы) нацеливания на РНК экспрессируются.

[384] В конкретных вариантах осуществления изобретения предусматривается введение компонентов системы CRISPR, нацеленной на РНК, стабильно в геномную ДНК растительной клетки. Дополнительно или альтернативно, предусматривается введение компонентов системы CRISPR, нацеленной РНК, для стабильной интеграции в ДНК органелл растений, таких как, но не ограниченных ими, пластиды, митохондрии или хлоропласты.

[385] Система экспрессии для стабильной интеграции в геном растительной клетки может содержать один или более следующих элементов: элемент промотора, который может использоваться для экспрессии фермента нацеливания на РНК и/или молекулы направляющей РНК в растительной клетке; 5'-нетранслируемые области для увеличения экспрессии; элемент интрона для дальнейшего увеличения экспрессии в определенных клетках, таких как клетки однодольного растения, сайт множественного клонирования, чтобы обеспечить удобные сайты рестрикции для вставки одной или более направляющих РНК и/или последовательностей генов нацеливания на РНК и других желаемых элементов; и 3'-нетранслируемые области для обеспечения эффективной терминации экспрессируемого транскрипта.

[386] Элементы системы экспрессии могут быть на одной или более конструкциях экспрессии, которые являются либо кольцевыми, такими как плазмида или вектор трансформации, либо линейными, такими как двойная спираль ДНК.

В конкретном варианте система экспрессии CRISPR, нацеленная на РНК, включает, по меньшей мере:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую направляющую РНК (гРНК), которая гибридизируется с последовательностью-мишенью в растении, и где направляющая РНК включает направляющую последовательность и последовательность прямого повтора;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок нацеливания на РНК,

где компоненты (a) или (b) расположены на одной и той же или на различных конструкциях, и посредством чего различные нуклеотидные последовательности могут находиться под контролем одного и того же или различных регуляторных элементов, действующих в растительной клетке.

[387] Конструкция (конструкции) ДНК, содержащая компоненты системы CRISPR, нацеленной на РНК, и, когда применимо, последовательность матрицы, может быть введена в геном растения, часть растения или растительную клетку рядом обычных способов. Процесс обычно включает этапы отбора подходящей клетки или ткани, введение конструкции (конструкций) в клетку или ткань и регенерацию растительных клеток или растений из клеток или тканей. В конкретных вариантах осуществления изобретения конструкция ДНК может быть введена в растительную клетку с использованием способов, таких как, но не ограничиваясь этим, электропорация, микроинъекция, аэрозольная инъекция протопластов растительной клетки, или конструкции ДНК могут быть введены непосредственно в растительную ткань с использованием биолистических способов, таких как бомбардировка частицами ДНК (см. также Fu et al., Transgenic Res, 2000 Feb; 9(1):11 -9). Бомбардировка клеток частицами основана на ускорении частиц, покрытых геном(генами)-мишенью, приводящем к проникновению частиц в протоплазму и типично стабильной интеграции в геном, (см., например, Klein et al., Nature (1987), Klein et al., Bio/Technology (1992), Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993)).

[388] В конкретных вариантах осуществления изобретения конструкции ДНК, содержащие компоненты системы CRISPR, нацеленной на РНК, могут быть введены в растение с помощью агробактериальной трансформации. Конструкции ДНК могут быть объединены с подходящими регионами фланкирования T-ДНК и введены в обычный вектор Agrobacterium tumefaciens. Чужеродная ДНК может быть включена в геном растений путем заражения растений или инкубирования протопластов растения с бактериями Agrobacterium, содержащими одну или более Ti-плазмид (индуцирующая опухоль плазмида) (см., например, Fraley et al., (1985), Rogers et al., (1987) и патент США № 5563055).

Промоторы растений

[389] Для обеспечения подходящей экспрессии в растительной клетке, компоненты системы C2c2 CRISPR, описанной в настоящем описании, как правило, помещены под контроль промотора растения, т.е. промотора, действующего в растительных клетках. Предусматривается использование различных типов промоторов.

[390] Конститутивный промотор растения - промотор, который способен экспрессировать открытую рамку считывания (ORF), которую он контролирует во всех или почти всех тканях растения во время всех или почти всех стадий развития растения (называется "конститутивной экспрессией"). Одним не ограничивающим примером конститутивного промотора является промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. Настоящее изобретение предусматривает способы модификации последовательностей РНК, и как таковое также предусматривает регулирование экспрессии биомолекул растения. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения таким образом предпочтительно поместить один или более элементов системы CRISPR, нацеленной на РНК, под контроль промотора, который может быть отрегулирован. Понятие "регулируемый промотор" относится к промоторам, которые управляют экспрессией генов не конститутивно, а регулируемым во времени и/или пространстве образом, и включает тканеспецифичные, тканепредпочтительные и индуцируемые промоторы. Различные промоторы могут управлять экспрессией гена в различных тканях или типах клеток, или на различных стадиях развития, или в ответ на различные условия окружающей среды. В конкретных вариантах осуществления изобретения один или более компонентов системы CRISPR, нацеленной на РНК, экспрессируется под контролем конститутивного промотора, такого как промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. Тканепредпочтительные промоторы могут быть использованы для нацеливания на увеличенную экспрессию в определенных типах клеток в определенных тканях растения, например клеток сосудов в листьях или корнях или в определенных клетках семени. Примеры конкретных промоторов для использования в системе CRISPR, нацеленной на РНК, можно найти в Kawamata et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:792-803; Yamamoto et al., (1997) Plant J 12:255- 65; Hire et al., (1992) Plant Mol Biol 20:207-18,Kuster et al., (1995) Plant Mol Biol 29:759-72, и Capana et al., (1994) Plant Mol Biol 25:681-91. Индуцибельные промоторы, обеспечивающие пространственно-временной контроль редактирования или экспрессии генов, могут использовать энергию. Форма энергии может включать, но не ограничиваться этим, звуковую энергию, электромагнитную радиацию, химическую энергию и/или тепловую энергию. Примеры индуцируемых систем включают тетрациклин-индуцируемые промоторы (Tet-On или Tet-Off), двухгибридные системы активации транскрипции, использующие небольшие молекулы (FKBP, ABA, и т.д.), или системы, индуцируемые светом (фитохромы, домены LOV или криптохромы), такие как эффектор транскрипции, индуцируемый светом (LITE), которые управляют изменениями в транскрипционной активности последовательность-специфическим образом. Компоненты индуцируемой светом системы могут включать фермент CRISPR, нацеленный на РНК, светочувствительный гетеродимер цитохрома (например, из Arabidopsis thaliana), и транскрипционный домен активации/репрессии. Другие примеры индуцируемых ДНК-связывающих белков и способов их применения приведены в US 61/736465 и US 61/721283, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

[391] В определенных вариантах осуществления изобретения временная или индуцируемая экспрессия может быть достигнута при помощи, например, регулируемых химическими стимулами промоторов, т.е. таких, для которых применение экзогенного химического агента вызывает экспрессию генов. Модуляция экспрессии генов может также быть достигнута при использовании репрессируемых химическими стимулами промоторов, т.е. таких, для которых применение химического агента подавляет экспрессию генов. Такие индуцируемые химическими стимулами промоторы включают, не ограничиваются ими, промотор кукурузы ln2-2, активируемый антидотами бензолсульфонамидных гербицидов (De Veylder et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:568-77), промотор кукурузы GST (GST-lI-27, W093/01294), активированный гидрофобными электрофильными соединениями, используемыми в общих гербицидах, наносимых до всхода урожая, и промотор табака PR 1 (Ono et al., (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:803-7), активируемый салициловой кислотой. Промоторы, активность которых регулируется антибиотиками, такие как индуцируемые тетрациклином и репрессируемые тетрациклином промоторы (Gatz et al, (1991) Mol Gen Genet 227:229-37; патенты США № 5814618 и 5789156) также могут быть использованы в рамках насоящего изобретения.

Перемещение к определенным органеллам и/или экспрессия в определенных органеллах растения

[392] Система экспрессии может включать элементы для транслокации в и/или экспрессии в определенной органелле растения.

Нацеливание в хлоропласты

[393] В конкретных вариантах осуществления изобретения предусматривается использование нацеленной на РНК системы CRISPR для того, чтобы специфически изменить экспрессию и/или трансляцию генов хлоропласта или обеспечить экспрессию в хлоропласте. С этой целью используются способы трансформации хлоропласта или компартментализации компонентов системы CRISPR, нацеленной РНК, в хлоропласте. Например, введение генетических модификаций в геноме пластида может снизить проблемы биологической безопасности, такие как перенос генов через пыльцу.

[394] Способы трансформации хлоропласта известны в данной области и включают баллистическую трансформацию с бомбардировкой частицами, обработку ПЭГ и микроинъекцию. Кроме того, можно использовать способы, включающие перемещение кассет трансформации от ядерного генома к пластиду, согласно описанию в WO 2010061186.

[395] Альтернативно этому, предусматривается нацеливание одного или более компонентов CRISPR, нацеленных на РНК, в хлоропласт растения. Это достигается за счет встраивания в конструкцию экспрессии последовательности, кодирующей транзитный пептида хлопласта (CTP) или транзитный пептид пластида, функционально связанный с 5'-концевой областью последовательности, кодирующей нацеленный на РНК белок. CTP удаляется на этапе процессинга во время перемещения в хлоропласт. Квалифицированному специалисту известно о нацеливания экспрессируемых белков в хлоропласт (см., например, Protein Transport into Chloroplasts, 2010, Annual Review of Plant Biology, Vol. 61: 157-180). В таких вариантах осуществления изобретения также желательно нацеливание одной или более направляющих РНК в хлоропласт растения. Способы и конструкции, которые могут использоваться для транслокации направляющей РНК в хлоропласт благодаря последовательности локализации в хлоропласте, описаны, например, в US 20040142476 и включены в настоящее описание в качестве ссылки. Такие изменения конструкций могут быть введены в системы экспрессии по настоящему изобретению с целью эффективного перемещения направляющей(их) РНК, нацеливающей на РНК.

Введение полинуклеотидов, кодирующих систему нацеливания CRISPR-РНК в водорослевые клетки

[396] Трансгенные водоросли (или другие растения, такие как рапс) могут быть особенно полезными для производства растительных масел или биотоплива, такого как спирты (особенно метанол и этанол) или другие продукты. Они могут быть модифицированы способами инженерии таким образом, чтобы экспрессировать или сверхэкспрессировать большие объемы масла или спиртов для использования в отраслях промышленности, использующих нефть или биотопливо.

[397] В US 8945839 описан способ модификации способами инженерии вида микроводорослей (клетки Chlamydomonas reinhardtii) с использованием Cas9. Используя подобную технику, способы с использованием описанной в настоящем описании нацеленной на РНК системы CRISPR могут быть применены для видов рода Chlamydomonas и других водорослей. В определенных вариантах осуществления изобретения нацеленный на РНК белок и направляющая(ие) РНК введены в водоросли, в которых они экспрессируются, с использованием вектора экспрессии нацеленного на РНК белка под контролем конститутивного промотора, такого как Hsp70A-Rbc S2 или бета-2-тубулина. Направляющая РНК необязательно может быть доставлена с использованием вектора, содержащего промотор T7. Альтернативно этому, в клетки водоросли может быть досталвена РНК, нацеливающая на мРНК, и транскрибированная in vitro направляющая РНК. Квалифицированному специалисту доступны протоколы электропорации, в том числе стандартный рекомендуемый протокол из набора GeneArt Chlamydomonas Engineering kit.

Введение полинуклеотидов, кодирующих компоненты нацеливания на РНК, в дрожжевые клетки

[398] В определенных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к применению нацеленной на РНК системы CRISPR для редактирования РНК в дрожжевых клетках. Способы трансформации дрожжевых клеток, которые могут быть использованы для введения полинуклеотидов, кодирующих компоненты нацеленной на РНК системы CRISPR, известны квалифицированному специалисту и рассмотрены в Kawai et al., 2010, Bioeng Bugs. 2010 Nov-Dec, 1(6): 395-403). Неограничивающие примеры включают трансформацию дрожжевых клеток обработкой ацетатом лития (с возможностью дальнейшей обработки ДНК-переносчиком и ПЭГ), баллистического способа или электропорации.

Временная экспрессия компонентов нацеленной на РНК системы CRISPR в растениях и растительной клетке

[399] В определенных вариантах осуществления изобретения предусматривается, что направляющая РНК и/или ген нацеленного на РНК белка экспрессируется в растительной клетке. В таких вариантах осуществления изобретения система CRISPR, нацеленная на РНК, способна обеспечить модификацию РНК-мишеней только тогда, когда и направляющая РНК, и нацеленный на РНК белок присутствуют в клетке, причем в дальнейшем возможен контроль экспрессии генов. Поскольку экспрессия нацеленного на РНК фермента является временной, растения, регенерирующие из таких растительных клеток, как правило, не содержат чужеродной ДНК. В конкретных вариантах осуществления изобретения нацеленный на РНК фермент стабильно экспрессируется растительной клеткой и направляющая последовательность экспрессируется временно.

[400] В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения компоненты системы CRISPR, нацеленной на РНК, могут быть введены в растительные клетки с использованием вирусного вектора растений (Scholthof et al. 1996, Annu Rev Pbytopathol. 1996; 34:299-323). В следующих конкретных вариантах осуществления указанный вирусный вектор является вектором ДНК-вируса. Например, геминивируса (geminivirus) (например, вирус листовой курчавости капусты, вирус желтой карликовости фасоли, вирус карликовости пшеницы, вирус листовой курчавости томата, вирус полосатости кукурузы, вирус листовой курчавости табака или вирус золотой мозаики томата), или нановируса (nanovirus) (например, вирус желтого некроза бобовых). В других конкретных вариантах указанный вирусный вектор является вектором РНК-вируса, например, тобравируса (tobravirus) (например, вирус погремковости табака, вирус табачной мозаики), потексвируса (potexvirus) (например, X-вирус картофеля) или гордеивируса (hordeivirus) (например, вирус полосатой мозаики ячменя). Геномы репликации вирусов растений являются неинтегральными векторами, которые представляет интерес с учетом избегания производства ГМО-растений.

[401] В некоторых вариантах осуществления вектор, используемый для временной экспрессии нацеленных на РНК конструкций CRISPR, может быть, в частности, вектором pEAQ, сконструированным специально для опосредованной Agrobacterium временной экспрессии в протопласте (Sainsbury F. et al., Plant Biotechnol J. 2009 Sep:7(7):682-93). Точное нацеливание на локализацию в геноме было продемонстрировано с использованием вектора на основе модифицированного вируса листовой курчавости капусты (CaLCuV) для экспрессии направляющих РНК в стабильно траснгенных растениях, экспрессирующих фермент CRISPR (Scientific Reports 5, Article number: 14926 (2015), doi: 10.1038/srepl4926).

[402] В конкретных вариантах осуществления изобретения фрагменты двухцепочечной ДНК, кодирующие направляющую РНК и/или ген нацеленного на РНК белка, могут быть временно введены в клетку растения. В таких вариантах осуществления внесенные двухцепочечные фрагменты ДНК присутствуют в количествах, достаточных для модификации молекул(ы) РНК в клетке, но не остаются после окончания рассматриваемого периода времени или после одного или более клеточных делений. Способы прямого переноса ДНК известны квалифицированному специалисту (см., например, Davev et al. Plant Mol Biol 1989 Sep; 13(3):273-85.)

[403] В других вариантах осуществления изобретения полинуклеотид, кодирующий нацеленный на РНК белок, вводят в растительную клетку с его последующей трансляцией и процессированием в клетке, синтезирующей этот белок в количестве, достаточном для изменения молекул(ы) РНК в клетке (в присутствии по меньшей мере одной молекулы направляющей РНК), но который не остается после окончания рассматриваемого периода времени или после одного или более клеточных делений. Способы введения мРНК в протопласт растения известны квалифицированному специалисту ((см., например, Gallie, Plant Cell Reports (1993), 13; 119-122). Также предусматриваются комбинации различных описанных выше способов.

Доставка компонентов CRISPR, нацеленных на РНК, в растительную клетку

[404] В конкретных вариантах осуществления изобретения требуется доставить один или более компонентов системы CRISPR, нацеленных на РНК, напрямую в растительную клетку. Это представляет интерес, среди прочего, для получения нетрансгенных растений (см. ниже). В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или более нацеленных на РНК компонентов получен(ы) вне растения или растительной клетки и доставлен(ы) в клетку. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения нацеленный на РНК белок получен in vitro до введения в растительную клетку. Нацеленный на РНК белок может быть получен различными известными квалифицированному в данной области специалисту способами, в том числе рекомбинантным получением. После экспрессии нацеленный на РНК белок выделяют, подвергают рефолдингу в случае необходимости, очищают и необязательно из него удаляют меток для очистки, такой как His-метка. Когда неочищенный, частично очищенный или более полно очищенный нацеленный РНК белок получают, его можно вводить в растительную клетку.

[405] В определенных вариантах осуществления изобретения нацеленный на РНК белок объединен с направляющей молекулой РНК, нацеливающей на РНК-мишень, для образования предварительно собранного рибонуклеопротеина.

[406] Отдельные компоненты или сам предварительно собранный рибонуклеопротеин могут быть введены в растительную клетку путем электропорации, бомбардировки частицами, покрытыми генным продуктом, ассоциированным с нацеливанием на РНК, химической трансфекции или некоторых другими средств транспорта через клеточную мембрану. Например, была продемонстрирована трансфекция протопласта растения с предварительно собранным рибонуклеопротеином CRISPR с целью подтвердить модификацию генома растения (как описано в Woo et at. Nature Biotechnology, 2015; DQI: 1.0.1038/nbt.3389). Эти способы могут быть изменены с целью достижения направленной модификации молекул РНК в растениях.

[407] В конкретных вариантах осуществления изобретения нацеленная на РНК система CRISPR может быть введена в растительные клетки с использованием наночастиц. Компоненты, такие как белок, нуклеиновая кислота или их сочетание, могут быть загружены или упакованы в наночастицы и применены к растениям (как описано, например, в WO 2008042156 и US 20130185823). В частности, варианты осуществления изобретения включают наночастицы, в которые загружена или в которых содержится молекула(ы) ДНК, кодирующая белок, нацеленный на РНК, молекулы ДНК, кодирующие направляющую РНК, и/или выделенная направляющая РНК, как описано в WO 2015089419.

[408] Следующим средством введения одного или более компонентов нацеленных на РНК систем CRISPR в растительную клетку является использование проникающих в клетку пептидов (CPP). В соответствии с этим отдельные варианты осуществления изобретения включают композиции, содержащие проникающие в клетку пептиды, связанные с нацеленным на РНК белком. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения нацеленный на РНК белок и/или направляющая(ие) РНК сопряжены с одним или более CPP для их эффективной доставки в протопласт растения (Ramakrishna (2014, Genome Res. 2014 Jun; 24(6):1020-7, для Cas9 в клетках человека). В других вариантах осуществления ген нацеленного на РНК белка и/или направляющая(ие) РНК кодируются одной или более кольцевыми или некольцевыми молекулой(ами), сопряженными с одним или более CPP для доставки в протопласт растения. Протопласты растения далее регенерируют в растительные клетки, а далее в растения. CPP в целом представляют собой короткие пептиды длиной менее 35 аминокислот полученные либо из белка, либо из химерных последовательностей, способных транспортировать биомолекулы через клеточную мембрану вне зависимости от рецепторов. CPP могут представлять собой катионные пептиды, пептиды, имеющие гидрофобные последовательности, амфипатические пептиды, пептиды, богатые пролином, и антимикробные последовательности, а также химерные или двухкомпонентные пептиды (Pooga and Langel, 2005). CPP способны проникать через биологические мембраны и при этом запускать движение различных биомолекул через мембраны клеток в цитоплазму и улучшать их внутриклеточное перемещение, тем самым облегчая взаимодействие биомолекулы с мишенью. Примеры CPP в числе прочих включают: Tat, ядерный белок-активатор транскрипции, необходимый для репликации вируса ВИЧ типа I, пенетратин, сигнальная пептидная последовательность фактора роста фибробластов (ФРФ, FGF) Капоши, сигнальная пептидная последовательность интегрина β3; последовательность пептида полиаргинина Args, богатые аргинином молекулярные транспортеры, пептид "sweet arrow".

РНК-мишень, предназначенная для использования в растениях, водорослях или грибах

[409] РНК-мишень, т.е. представляющая интерес РНК представляет собой РНК, подлежащую нацеливанию посредством настоящего изобретения, с последующим привлечением к и связыванием с нацеленным на РНК белком на представляющем интерес целевом участке РНК-мишени. РНК-мишень может представлять собой любую подходящей форму РНК. Последняя в некоторых вариантах осуществления изобретения может являться мРНК. В других вариантах осуществления изобретения РНК-мишень может включать транспортную РНК (тРНК) или рибосомную РНК (рРНК). В других вариантах осуществления изобретения РНК-мишень может включать интерферирующую РНК (РНК-i), микроРНК (миРНК), микропереключатели (microswitches), микрозимы, сателлитные РНК и РНК-содержащие вирусы. РНК-мишень может быть расположена в цитоплазме растительной клетки, или в ядре клетки, или в органелле растительной клетки, такой как митохондрия, хлоропласт или пластида.

[410] В отдельных вариантах осуществления изобретения нацеленная на РНК система CRISPR используется для расщепления РНК или подавления экспрессии РНК иным образом.

Использование нацеленной на РНК системы CRISPR для модулирования экспрессии генов растения через модулирование РНК

[411] Нацеленный на РНК белок может также быть использован вместе с подходящей направляющей РНК для нацеливания на экспрессию генов через контроль процессинга РНК. Контроль процессинга РНК может включать реакции процессирования РНК, такие как сплайсинг РНК, включая альтернативный сплайсинг; вирусную репликацию (в частности, вирусов растений, включая вироиды в растениях и биосинтез тРНК). Нацеленный на РНК белок в сочетании с подходящей направляющей РНК может также быть использован для контроля активации РНК (РНК-а). РНК-а вызывает стимуляцию экспрессии генов, в связи с чем контроль экспрессии генов может быть достигнут путем нарушения или уменьшения РНК-а и как следствие меньшей стимуляции экспрессии генов.

[412] Нацеленный на РНК эффекторный белок, описанный в настоящем описании, может в дальнейшем быть использован для противовирусной активности в растениях, в частности, в отношении РНК-содержащих вирусов. Эффекторный белок может быть нацелен на вирусную РНК с использованием подходящей направляющей РНК, избирательной в отношении выбранной последовательности РНК вируса. В частности, эффекторный белок может быть активной нуклеазой, расщепляющей РНК, в частности, одноцепочечную РНК. Следовательно, возможно использование нацеленного на РНК эффекторного белка в качестве противовирусного средства. Неограничивающими примерами вирусов, нейтрализация которых возможна благодаря этому, являются вирус табачной мозаики (TMV), вирус пятнистого увядания томатов (TSWV), вирус мозаики огурца (CMV), вирус картофеля Y (PVY), вирус мозаики цветной капусты (CaMV) (вирус RT), вирус шарки сливы (PPV), вирус мозаики костра (BMV) и вирус картофеля X (PVX).

[413] Примеры модулирования экспрессии РНК в растениях, водорослях или грибах как альтернативы для целенаправленной генной модификации описаны в настоящем описании далее.

[414] Предметом отдельного интереса является регулируемый контроль экспрессии генов через регулируемое расщепление мРНК. Он может быть достигнут за счет помещения элементов нацеливания на РНК под контроль регулируемых промоторов, как это описано в настоящем описании.

Использование системы CRISPR, нацеленной на РНК, для восстановления функциональности молекул тРНК

[415] Pring et al. описали редактирование РНК в митохондриях и хлоропластах растений, которое включает изменение последовательностей мРНК, кодирующих белки, отличные от кодируемых ДНК. (Plant Mol. Biol. (1993) 21 (6): 1163-1170. doi:10.1007/BF00023611). В некоторых вариантах осуществления изобретения элементы нацеленной на РНК системы CRISPR, специфически нацеленные на мРНК митохондрий и хлоропластов, могут быть введены в растение или клетку растения для экспрессии различных белков в таких органеллах растительных клеток, имитируя процессы, происходящие in vivo.

Использование нацеленной на РНК системы CRISPR как альтернативы РНК-интерференции для ингибирования экспрессии РНК

[416] Нацеленная на РНК система CRISPR имеет применения, сходные с ингибированием РНК или РНК-интерференцией, следовательно, может заменять эти способы. В некоторых вариантах осуществления такие способы по настоящему изобретению включают использование нацеленной на РНК системы CRISPR в качестве замены, например, участвующей в интерференции рибонуклеиновой кислоты (такой как малая интерферирующая миРНК, кшРНК или дцРНК). Примеры ингибирования экспрессии РНК в растениях, водорослях или грибах в качестве альтернативы для направленной генной модификации описаны далее.

Использование нацеленной на РНК системы CRISPR для контроля интерференции РНК

[417] Управление интерферирующей РНК или микроРНК может помочь уменьшить неспецифические эффекты (OTE), описанные в случае использования данных подходов, путем уменьшения продолжительности жизни интерферирующей РНК или микроРНК in vivo или in vitro. В отдельных вариантах осуществления изобретения РНК-мишень может включать интерферирующую РНК, т.е. РНК, вовлеченную в пути интерференции РНК, такую как кшРНК, миРНК и т.д. В других вариантах осуществления изобретения РНК-мишень может включать микроРНК или двухцепочечную РНК (дцРНК).

[418] В других отдельных вариантах осуществления в случае, если нацеленный на РНК белок и подходящая(ие) направляющая(ие) РНК селективно экспрессируются (например, селективно в пространстве или времени под контролем регулируемого промотора, например, специфического для ткани или фазы клеточного цикла промотора и/или энхансера), это может быть использовано для "защиты" клеток или систем (in vivo или in vitro) от РНК-i в таких клетках. Это может быть полезно для соседних тканей или клеток, в которых РНК-i не требуется или в целях сравнения с теми клетками или тканями, где эффекторный белок и подходящая направляющая молекула не экспрессируются (т.е. где РНК-i не контролируется и где она находится под контролем соответственно). Нацеленный на РНК белок может быть использован для контроля или связывания молекул, представляющих собой или включающих РНК, таких как рибозимы, рибосомы или рибопереключатели. В вариантах осуществления изобретения направляющая РНК может привлекать нацеленный на РНК белок к данным молекулам таким образом, чтобы нацеленный на РНК белок мог связываться с ними.

[419] Нацеленная на РНК система CRISPR, описанная в настоящем описании, может быть применена в области технологий РНК-i in planta без проведения избыточных экспериментов, согласно настоящему описанию, включая защиту от насекомых-вредителей, лечение заболеваний растений и изменение устойчивости к гербициду, а также в лабораторном анализе растения и для других применений (см., например, Kim et al., в Pesticide Biochemistry and Physiology (Impact Factor: 2.01). 01/2015; 120. DOI: 10.1016/j.pestbp.2015.01.002; Sharma et al. Academic Journals (2015), Vol. 12(18) pp 2303-2312); Green J.M, в Pest Management Science, Vol 70(9), pp 1351-1357), поскольку данное применение обеспечивает основу для рационального конструирования данной системы.

Использование нацеленной на РНК системы CRISPR для изменения рибопереключателей и контроля метаболической регуляции растений, водорослей и грибов

[420] Рибопереключатели (также известные как аптозимы) являются регуляторными участками матричной РНК, которые связывают низкомолекулярные соединения и в результате регулируют экспрессию генов. Данный механизм позволяет клетке чувствовать внутриклеточную концентрацию таких малых молекул. Конкретный рибопереключатель управляет близлежащим геном путем изменения транскрипции, трансляции или сплайсинга этого гена. Таким образом, в отдельных вариантах осуществления изобретения предусмотрен контроль активности рибопереключателя за счет использования нацеленного на РНК белка в сочетании с подходящей направляющей РНК для нацеливания на рибопереключатель. Это может происходить за счет расщепления или связывания с рибопереключателем. В отдельных вариантах осуществления предусмотрено уменьшение активности рибопереключателя. Недавно был охарактеризован рибопереключатель, связывающийся с тиаминпирофосфатазой (TPP) и описана его роль в регуляции биосинтеза тиамина в растениях и водорослях. Более того, оказалось, что этот элемент является ключевым регулятором первичного метаболизма растений (Bocobza and Aharoni, Plant J. 2014 Aug, 79(4):693-703. doi: 10.1111/tpj.12540. Epub 2014 Jun 17). Рибопереключатели TPP также найдены в определенных грибах, таких как Neurospora crassa, где они управляют альтернативным сплайсингом для получения в определенных условиях вышележащей открытой рамки считывания (uORF), таким образом, влияя на экспрессию расположенных в ниже генов (Cheah MT et al., (2007)Nature 447 (7143): 497-500. doi:10.1038/nature05769). Описанная в настоящем описании нацеленная на РНК система CRISPR может использоваться для управления эндогенной активностью рибопереключателя в растениях, водорослях или грибах и как таковая может изменять экспрессию расположенных ниже генов, которые она регулирует. В конкретных вариантах осуществления изобретения нацеленная на РНК система CRISPR может использоваться для анализа функции рибопереключателя in vivo или in vitro и для изучения его связи с метаболической сетью. В определенных вариантах осуществления изобретения нацеленная на РНК система CRISPR потенциально может использоваться для конструирования способами инженерии рибопереключателей в качестве метаболических сенсоров в растениях и платформах генного контроля.

Использование нацеленной на РНК системы CRISPR для скрининга РНК-интерференции в растениях, водорослях или грибах.

[421] В результате идентификации генных продуктов, нокдаун которых связан с изменениями в фенотипе, могут быть изучены биологические пути с выявлением составляющих с помощью скрининга с использованием РНК-интерференции. В конкретных вариантах осуществления изобретения контроль может проявляться во время самого скрининга с помощью белков Guide 29 или Guide 30 и подходящей направляющей РНК, как описано в настоящем описании, для прекращения или снижения активности РНК-интерференции при скрининге, тем самым восстанавливая активность (в которую ранее произведено вмешательство) генного продукта (путем прекращения или снижения интерференции/экспрессии).

Использование нацеленных на РНК белков для визуализации молекул РНК in vivo и in vitro.

[422] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к связывающей нуклеиновую кислоту системе. Гибридизацию РНК in situ с комплементарными зондами следует считать эффективным способом. Обычно для обнаружения нуклеиновых кислот путем гибридизации используются флуоресцентно меченые олигонуклеотиды ДНК. Увеличенная эффективность была достигнута благодаря использованию определенных модификаций, таких как "закрытые" нуклеиновые кислоты (LNA), однако остается необходимость в эффективных и регулируемых альтернативах. По сути, меченые элементы системы нацеливания РНК могут использоваться в качестве альтернативы эффективной и приспосабливаемой системы для гибридизации in situ.

Дополнительные применения нацеленной на РНК системы CRISPR в растениях и дрожжах

Использование нацеленной на РНК системы CRISPR при производстве биотоплива

[423] Под термином "биотопливо" в настоящем описании понимается альтернативное топливо, полученное из растений и других растительных ресурсов. Возобновляемое биотопливо может быть извлечено из органического вещества, энергия которого была запасена в ходе процесса фиксации углерода или получена посредством использования или конверсии биомассы. Эта биомасса может быть использована в качестве биотоплива или может быть переведена в форму удобных содержащих энергию веществ за счет термической, химической или биохимической переработки. Такая переработка позволит получить топливо в твердой, жидкой или газообразной форме. Существует два типа биотоплива: биоэтанол и биодизель. Биоэтанол получают в основном путем сбраживания углеводов - целлюлозы (крахмала), получаемых главным образом из кукурузы и сахарного тростника. Биодизель, с другой стороны, производится главным образом из масличных культур, таких как рапс, масличная пальма и соя. Биотопливо используется, главным образом, в качестве топлива для транспортных средств.

Улучшение свойств растения для производства биотоплива

[424] В конкретных вариантах осуществления способы с использованием нацеленной на РНК системы CRISPR, как описано в настоящем описании, используют для изменения свойств клеточной стенки с целью облегчения доступа ключевых агентов гидролиза и более эффективного высвобождения сахаров, используемых для брожения. В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть модифицирован биосинтез целлюлозы и/или лигнина. Целлюлоза является главным компонентом клеточной стенки. Биосинтез целлюлозы и лигнина регулируются согласованно. Уменьшая долю лигнина в растении можно увеличить долю целлюлозы. В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в настоящем описании способы используются для снижения уровня биосинтеза лигнина в растении с целью увеличения доли сбраживаемых углеводов. Конкретнее, способы, описанные в настоящем описании, используются для снижения активности по меньшей мере первого гена биосинтеза лигнина, выбранного из группы, состоящей из 4-кумарат-3-гидроксилазы (C3H), фенилаланинаммонийлиазы (PAL), циннамат-4-гидроксилазы (C4H), гидрокслициннамоилттрансферазы (HCT), O-метилтрансферазы кофейной кислоты (COMT), коффеоил-КоА-3-O-метилтрансферазы (CCoAOMT), ферулат-5-гидроксилазы (F5H), дегидрогеназы циннамилового спирта (CAD), циннамоил-КоА-редуктазы (CCR), 4-кумароат-КоА-лигазы (4CL), монолигнол-лигнин-специфической гликозилтрансферазы и альдегиддегидрогеназы (ALDH), как описано в WO 2008064289 A2.

[425] В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в настоящем описании способы используются для производства биомассы растения, образующей более низкие уровни уксусной кислоты при сбраживании (см. также WO 2010096488).

Модификация дрожжей для производства биотоплива

[426] В конкретных вариантах осуществления изобретения предлагаемый нацеленный на РНК фермент используется для производства биоэтанола в рекомбинантных микроорганизмах. Например, нацеленные на РНК ферменты могут быть использованы для получения микроорганизмов, таких как дрожжи, для производства биотоплива или биополимеров из сбраживаемых сахаров и, возможно, для разложения лигноцеллюлозы, полученной из растений, извлеченных из отходов сельского хозяйства в качестве источника сбраживаемых сахаров. Конкретнее, изобретение относится к способам, в которых нацеленный на РНК комплекс CRISPR используется для изменения экспрессии эндогенных генов, необходимых для синтеза биотоплива, и/или изменения эндогенных генов, которые могут препятствовать синтезу биотоплива. Более конкретно, такие способы подразумевают стимуляцию экспрессии в микроорганизмах, таких как дрожжи, одной или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферменты, участвующие в преобразовании пирувата в этанол или иной целевой продукт. В определенных вариантах осуществления такие способы обеспечивают стимуляцию экспрессии одного или более ферментов, позволяющих микроорганизмам разлагать целлюлозу, таких как целлюлаза. В других последующих вариантах осуществления нацеленный на РНК комплекс CRISPR, используется, чтобы подавить эндогенные метаболические процессы, конкурирующие с процессом производства биотоплива.

Модификация водорослей и растений для производства растительных масел или биотоплива

[427] Трансгенные водоросли или другие растения, такие как рапс, могут быть особенно востребованы при производстве растительных масел или биотоплива, например, такого как спирты (особенно метанол и этанол). Они могут быть целенаправленно разработаны для экспрессии или сверхэкспрессии больших объемов масел или спиртов для использования в отраслях промышленности, связанных с нефтью или биотопливом.

[428] В US 8945839 описан способ конструирования микроводорослей (клетки Chlamydomonas reinhardtii) при помощи Cas9. Используя подобные инструменты, способы с использованием описанной в настоящем описании нацеленной на РНК системы CRISPR могут быть применены к видам рода Chlamydomonas и другим водорослям. В отдельных вариантах осуществления изобретения нацеленный на РНК эффекторный белок и направляющая РНК молекула, введенные в водоросль, экспрессируются с помощью вектора, экспрессирующего нацеленный на РНК эффекторный белок под контролем конститутивного промотора, такой как S2 Hsp70A-Rbc или промотор бета-тубулина. Направляющая молекула РНК доставляется с использованием вектора, содержащего промотор T7. Альтернативно этому, транскрибированная in vitro направляющая РНК может быть доставлена в клетки водорослей. Методика электропорации соответствует стандартному рекомендуемому протоколу набора GeneArt Chlamydomonas Engineering kit.

Конкретные способы применения ферментов нацеливания на РНК в растениях

[429] В конкретных вариантах осуществления изобретения предполагается его использование в качестве терапии для удаления вирусов из растительных систем, поскольку оно позволяет расщеплять вирусную РНК. Предыдущие исследования, проведенные для систем человека, продемонстрировали успешное использование CRISPR для нацеливания на вирус гепатита С, содержащий одноцепочечную РНК (A. Price, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 2015). Эти способы могут также быть адаптированы для использования нацеленной на РНК системы CRISPR в растениях.

Улучшение свойств растений

[430] Настоящее изобретение также относится к растениям и дрожжевым клеткам, которые могут быть получены с помощью способов, описанных в настоящем описании. Растения с улучшенными свойствами, полученные описанными в настоящем описании способами, могут быть полезны для производства продуктов питания или кормов путем изменения экспрессии генов, обеспечивающих, в частности, устойчивость к вредителям, гербицидам, засухе, низким или высоким температурам, чрезмерному увлажнению и т.д.

[431] Растения с улучшенными свойствами, полученные описанными в настоящем описании способами, в особенности зерновые культуры и водоросли, могут быть произведены в качестве продуктов питания и кормов для обеспечения, например, более высокого содержания белков, углеводов, питательных веществ или витаминов по сравнения с таковыми для дикого типа. В этом отношении предпочтительны растения с улучшенными свойствами, в особенности бобовые и клубненосные.

[432] Улучшенные водоросли или другие растения, такие как рапс, могут быть особенно полезными для производства растительных масел или биотоплива, например такого, как спирты (особенно метанол и этанол). Они могут быть модифицированы способам инженерии для экспрессии или сверхэкспрессии высоких уровней масел или спиртов с целью использования в отраслях промышленности, связанных с нефтью или биотопливом.

[433] Также изобретение относится к улучшению составляющих частей растений. Такие части растения включают, но не ограничиваются ими, листья, стебли, корни, клубни, семена, эндосперм, яйцеклетки и пыльцу. Такие части растения, как предусматривается в рамках настоящего изобретения, могут быть жизнеспособными, нежизнеспособными, регенерируемыми и/или нерегенерируемыми.

[434] Также настоящее изобретение охватывает получение растительных клеток и растений, полученных согласно способам по изобретению. Гаметы, семена, зародыши, либо зиготические либо соматические, потомство или гибриды растений, несущих генетическую модификацию, которые получены способами традиционного скрещивания, также входят в рамки настоящего изобретения. Такие растения могут содержать гетерологическую или чужеродную последовательность ДНК, встроенную в последовательность-мишень или ее заменяющую. Альтернативно, такие растения могут содержать только одну модификацию (мутация, делеция, инсерция, замена) в одном или более нуклеотидах. По существу такие растения могут отличаться от исходных растений только наличием конкретной модификации.

[435] В одном из вариантов осуществления изобретения система C2c2 используется для разработки устойчивых к патогену растений, например за счет достижения устойчивости в отношении болезней, вызываемых бактериями, грибами или вирусами. В некоторых вариантах осуществления изобретения устойчивость к вредителям может быть достигнута для технических зерновых культур путем получения системы C2c2, съедаемой насекомым-вредителем, что приводит к его гибели. В одном из вариантов осуществления изобретения система C2c2 используется для придания устойчивости к факторам абиотической среды. В другом варианте осуществления изобретения система C2c2 используется для придания устойчивости к засухе, засолению, условиям низких или высоких температур. Younis et al. 2014, Int. J. Biol. Sci. 10; 1150 приводят обзор потенциальных мишеней для способов разведения растения, каждый из которых может быть скорректирован или улучшен за счет использования описанной здесь системы C2c2. Некоторые не ограничивающие примеры зерновых культур-мишеней включают Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., Oryza sativa L., Prunus domestica L., Gossypium hirsutum L., Nicotiana rustica L., Zea mays L., Medicago sativa L., Nicotiana benthamiana Domin.

[436] В одном из вариантов осуществления изобретения система C2c2 используется для контроля над вредителями сельскохозяйственных культур. Например, активная в организме вредителя система C2c2 может быть экспрессирована в растении-хозяине или может быть доставлена непосредственно в мишень, например, с помощью вирусного вектора.

[437] В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу эффективного получения гомозиготных организмов из гетерозиготного исходного организма, отличного от человека. В одном из вариантов осуществления изобретения оно используется для селекции растений. В другом варианте осуществления изобретения оно используется в животноводстве. В таких вариантах осуществления изобретения гомозиготный организм, такой как растение или животное, получен путем предотвращения или подавления рекомбинации путем вмешательства в функционирование по меньшей мере одного гена-мишени, подверженного двухцепочным разрывам цепи, образованию пар хромосом и/или обмену цепи.

Применение белков C2C2 в оптимизированных функциональных системах нацеливания на РНК

[438] В одном аспекте изобретение относится к системе для специфической доставки функциональных компонентов в окружающую среду, содержащую РНК. Это может быть обеспечено с помощью системы CRISPR, включающей нацеленные на РНК эффекторные белки по настоящему изобретению, которые делают возможным точное нацеливание на РНК различных компонентов. В частности, такие компоненты могут быть активаторами или репрессорами, такими как активаторы или репрессоры трансляции РНК, деградации и т.д. Способы применения этой системы описаны в настоящем описании.

[439] Согласно одному своему варианту осуществление, изобретение относится к неприродной или сконструированной способами инженерии композиции, содержащей направляющую РНК, включающую направляющую последовательность, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в представляющем интерес геномном локусе в клетке, причем направляющая РНК модифицирована путем внесения инсерции в одну или более отдельную последовательность(и) РНК, которая связывает адаптерный белок. В определенных вариантах осуществления последовательности РНК могут связываться с одним или более адаптерным белком (например, аптамерами), причем каждый адаптерный белок ассоциирован с одним или более функциональными доменами. Для таких нацеленных на РНК ферментов C2c2, как описано в настоящем описании, продемонстрирована возможность модификации направляющей последовательности. В определенных вариантах направляющая РНК модифицирована путем внесения инсерции в отдельную(ые) последовательность(и) РНК 5'-концевого прямого повтора в самом прямом повторе или 3'-конца направляющей последовательности. В случае наличия более чем одного функционального домена они могут быть одинаковыми или различными, например, два одинаковых или два различных активатора или репрессора. В одном из вариантов изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, в которой один или более функциональных доменов соединены с нацеленным на РНК ферментом таким образом, что при связывании с РНК-мишенью функциональный домен имеет пространственную ориентацию, позволяющую функциональному домену работать согласно соответствующей ему функции. В одном аспекте изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, которая включает комплекс CRISPR-Cas, имеющий по меньшей мере три функциональных домена, по меньшей мере один из которых ассоциирован с нацеленным на РНК ферментом и по меньшей мере два из которых ассоциированы с гРНК.

[440] В соответствии с этим в одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции неприродных или сконструированных способами инженерии комплексов CRISPR-Cas, содержащих направляющую РНК, как описано в настоящем описании, и фермент CRISPR, который является нацеленным на РНК ферментом, причем такой нацеленный на РНК фермент может необязательно иметь как минимум одну мутацию, так что нацеленный на РНК фермент имеет не более 5% нуклеазной активности фермента, не имеющего по меньшей мере этой одной мутации, и необязательно одну или более мутаций, затрагивающих одну или более последовательностей сигнала ядерной локализации. В определенных вариантах осуществления направляющая РНК дополнительно или альтернативно изменена таким образом, чтобы обеспечить сохранение связывания нацеленного на РНК фермента, но при этом предотвратить расщепление нацеленным на РНК ферментом (как подробно описано в настоящем описании).

[441] В конкретных вариантах осуществления нацеленный на РНК фермент является ферментом C2c2 с ослабленной нуклеазной активностью, составляющей по меньшей мере 97% или 100% таковой фермента С2с2, не имеющего по меньшей мере одной мутации. В одном из вариантов изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, в которой фермент C2c2 содержит две или более мутации. Такие мутации могут являться мутациями одного или более из следующих аминокислотных остатков: R597, H602, R1278 и H1283, к примеру, одна или более следующих мутаций: R597A, H602A, R1278A и H1283A для белка C2c2 Leptotrichia shahii или в соответствующих положениях его ортолога.

[442] В определенных вариантах осуществления изобретения описанная в настоящем описании система нацеливания на РНК, как описано в настоящем описании выше, содержит два или более функциональных доменов. В определенных вариантах осуществления изобретения такие два или более функциональных домена являются гетерологичными функциональными доменами. В определенных вариантах осуществления изобретения система включает адаптерный белок, который является слитым белком, включающим функциональный домен, причем слитый белок необязательно содержит линкер между адаптером белком и функциональным доменом. В определенных вариантах осуществления изобретения такой линкер включает линкер GlySer. Дополнительно или альтернативно этому, один или более функциональных доменов могут быть присоединены к эффекторному белку РНК посредством линкера, необязательно линкера GlySer. В конкретных вариантах осуществления изобретения один или более функциональных доменов присоединены к нацеленному на РНК ферменту через один или оба домена HEPN.

[443] В одном из вариантов изобретения описанная в настоящем описании композиция, в которой один или более функциональных доменов, связанных с адаптерным белком или нацеленным на РНК ферментом, является доменом, способным активировать или подавлять трансляцию РНК. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, в которой по меньшей мере один из одного или более функциональных доменов связаны с адаптерным белком, и адаптерный белок имеет одну или более активностей, включающих метилазную активность, деметилазную активность, активность активации транскрипции, активность репрессии транскрипции, активность фактора терминации транскрипции, активность модификации гистона, активность расщепления РНК, активность интеграции ДНК, активность расщепления ДНК, или активность связывания нуклеиновой кислоты, или активность молекулярного выключателя или способность к индукции химическими стимулами или светом.

[444] В одной аспекте изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, включающей последовательность аптамера. В конкретных вариантах осуществления последовательность аптамера представляет собой две или более последовательности аптамера, специфичные к одному и тому же адаптерному белку. В одном аспекте изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, в которой последовательность аптамера представляет собой две или более последовательности аптамера, специфичные к различным адаптерным белкам. В одном из вариантов, изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, в которой адаптерный белок содержит MS2, PP7, Qβ, F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, М11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, ϕCb5, ϕСb8г, ϕСb12г, ϕСb23г, 7s, PRR1. В соответствии с этим в определенных вариантах осуществления изобретения, аптамер выбран из связывающего белка, специфически связывающего любой один из упомянутых выше адаптерных белков. В одной из версий изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, в которой используемая клетка является эукариотической клеткой. В одном из вариантов изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, в которой такая эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего, клеткой растения или дрожжевой клеткой, причем такая клетка млекопитающего может являться клеткой мыши. В одном из вариантов изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, в которой такая клетка млекопитающего является клеткой человека.

[445] В одном из аспектов изобретение относится к описанной в настоящем описании выше композиции, в которой содержится более одной гРНК и гРНК нацелены на различные последовательности, причем при использовании такой конструкции имеет место мультиплексирование. В одном из аспектов изобретение относится к композиции, в которой содержится более одной гРНК, измененной путем инсерции определенной последовательности(ей) РНК, которая связывает один или более адаптерных белков.

[446] В одном из аспектов изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, в которой содержится один или более адаптерных белков, связанных с одним или более функциональными доменами, и такие белки связаны с отдельной последовательностью(ями) РНК, вставленной(ыми) в направляющую(ие) РНК.

[447] В одном аспекте изобретение относится к описанной в настоящем описании композиции, в которой направляющая РНК изменена так, чтобы иметь по меньшей мере одну не кодирующую функциональную шпилечную структуру; например, в которой по меньшей мере одна не кодирующая функциональная шпилечная структура является репрессивной; например, в которой по меньшей мере одна не кодирующая функциональная шпилечная структура включает Alu-повтор.

[448] В одном аспекте изобретение относится к модификации экспрессии генов, включающей введение хозяину или экспрессию в хозяине in vivo одной или более конструкций, как описано в настоящем описании.

[449] В одном из аспектов изобретение относится к описанному в настоящем описании способу, включающему доставку композиции или молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты, кодирующей таковую, причем указанная молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторной(ыми) последовательностью(ями) и экспрессируется in vivo. В одном из вариантов изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором экспрессия осуществляется in vivo в лентивирусе, аденовирусе или AAV.

[450] В одном из аспектов изобретение относится к линии клеток млекопитающего, как описано в настоящем описании, причем такая клеточная линия необязательно может быть линией клеток человека или линией клеток мыши. В одном из аспектов изобретение относится к трансгенной модели млекопитающего, необязательно мыши, причем такая модель трансформирована обсуждаемой в настоящем описании композиции или является потомством указанного трансформанта.

[451] В одном из аспектов изобретение относится к молекуле(ам) нуклеиновой кислоты, кодирующей направляющую РНК молекулу или нацеленный на комплекс CRISPR-Cas или композицию, описанную в настоящем описании. В одном из вариантов изобретение относится к вектору, включающему молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую направляющую РНК (гРНК), включающую последовательность направляющей молекулы, способной к гибридизации с последовательностью-мишенью в геномном локусе-мишени в клетке, где прямой повтор направляющей РНК изменен вставкой определенной последовательности(ей) РНК, которая связывает(ют) два или более адаптерных белка, причем каждый адаптерный белок связан с одним или более функциональными доменами; или направляющая РНК изменена таким образом, чтобы иметь по меньшей мере одну некодирующую функциональную шпилечную структуру. В одном из аспектов изобретение обеспечивает вектор(ы), включающий(ие) молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) неприродную или сконструированную способами инженерии композицию комплекса CRISPR-Cas, включающего направляющую РНК, обсуждаемую в настоящем описании, и фермент нацеливания на РНК, где необязательно фермент нацеливания на РНК включает по меньшей мере одну мутацию, так что фермент нацеливания РНК имеет не более 5% нуклеазной активности фермента нацеливания РНК, не имеющего такой по меньшей мере одной мутации, и необязательно одну или более последовательностей сигнала ядерной локализации. В одном из вариантов изобретения вектор, кроме того, может включать регуляторный элемент(ы), активный в эукариотической клетке, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей направляющую РНК (гРНК), и/или молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент нацеливания на РНК, и/или дополнительной(ые) последовательностью(и) ядерной локализации.

[452] В одном аспекте изобретение относится к набору, содержащему один или более компонентов, описанных в настоящем описании выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения такой набор включает векторную систему, описанную выше и инструкции по использованию набора.

[453] В одном аспекте изобретение относится к способу скрининга приобретения функции (GOF) или потери функции (LOF) или скрининга некодирующих РНК или потенциальных регуляторных областей (например, энхансеров, генов-репрессоров), включающему клеточную линию, как описано в настоящем описании, или клетки описанной в настоящем описании модели, содержащие или экспрессирующие фермент нацеливания на РНК, и введение композиции, как описано в настоящем описании, в клетки клеточной линии или модели, причем направляющая РНК включает активатор или репрессор, и мониторинг приобретения функции (GOF) или потери функции (LOF), соответственно, для тех клеток, в которых введенная направляющая РНК включает активатор, или для тех клеток, в которых введенная направляющая РНК включает репрессор.

[454] В одном аспекте изобретение относится к библиотеке неприродных или сконструированных способами инженерии композиций, каждая из которых содержит направляющую РНК (гРНК) системы CRISPR, нацеленной на РНК, включающую последовательность направляющей молекулы, способной к гибридизации с последовательностью РНК-мишенью в клетке-мишени, фермент нацеливания на РНК, где фермент нацеливания на РНК включает по меньшей мере одну мутацию, так что фермент нацеливания на РНК имеет не более 5% нуклеазной активности фермента нацеливания на РНК, не имеющего такой по меньшей мере одной мутации, и направляющая РНК изменена путем вставки определенной последовательности(ей) РНК, которая связывается с одним или более адаптерными белками, причем адаптерный белок ассоциирован с одним или более функциональными доменами, и где гРНК включают полногеномную библиотеку, содержащую множество направляющих РНК (гРНК), нацеливающих на РНК. В одном аспекте изобретение относится к описанной в настоящем описании библиотеке, где фермент, нацеленный на РНК, имеет сниженную нуклеазную активность, составляющую по меньшей мере 97% или 100% от таковой фермента, нацеленного РНК, не имеющего такой по меньшей мере одной мутации. В одном из аспектов изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, в которой адаптерный белок является слитым белком, содержащим функциональный домен. В одном из вариантов изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, в которой гРНК не изменена вставкой определенной последовательности(ей), которая(ые) связывает(ют) один или более адаптерных белков. В одном из аспектов изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, в которой один, два или более функциональных домена связаны с ферментом нацеливания на РНК. В одном из аспектов изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, в которой популяция клеток является популяцией эукариотических клеток. В одном из аспектов изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, в которой такая эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, растительную клетку или дрожжевую клетку. В одном из аспектов изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, в которой такая клетка млекопитающих является клеткой человека. В одном из аспектов изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, в которой такая популяция клеток является популяцией эмбриональных стволовых клеток (ES).

[455] В одном из аспектов изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, с возможностью нацеливания приблизительно на 100 или более последовательностей РНК. В одном из аспектов изобретение относится к библиотеке, как обсуждается в настоящем описании, с нацеливанием приблизительно на 1000 или более последовательностей РНК. В одном из аспектов изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, с нацеливанием приблизительно на 20000 или более последовательностей РНК. В одном из вариантов изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, с нацеливанием, охватывающим весь транскриптом. В одном из вариантов изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, с нацеливанием на набор последовательностей-мишеней, связанных с существенным или желательным процессом. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, в которой таким процессом является иммунный процесс. В одном из своих воплощений изобретение относится к библиотеке, как описано в настоящем описании, в которой такой процесс представляет собой процесс клеточного деления.

[456] В одной из версий изобретение относится к способу получения модельной эукариотической клетки, содержащей ген с измененной экспрессией. В некоторых вариантах осуществления изобретения под геном заболевания понимается любой ген, связанный с увеличением риска наличия или развития заболевания. В некоторых вариантах осуществления изобретения такой способ включает (a) введение одного или более векторов, кодирующих компоненты системы, описанной в настоящем описании, в эукариотическую клетку и (b) позволение комплексу CRISPR связывать РНК- или ДНК-мишень для изменения экспрессии гена, в результате получая модельную эукариотическую клетку с измененной экспрессией генов.

[457] Структурная информация, приведенная в настоящем описании, позволяет исследовать взаимодействия направляющей РНК и нацеленного на РНК фермента, делая возможным конструирование или изменение направляющей РНК для оптимизации функций всей системы CRISPR-Cas в целом. Например, направляющая РНК может быть удлинена без препятствования белку нацеливания на РНК за счет вставки адаптерных белков, которые могут связывать РНК. Эти адаптерные белки могут далее привлекать эффекторные белки или слитые конструкции, включающие один или более функциональных доменов.

[458] Аспектом изобретения является включение вышеупомянутых элементов в единую композицию или в отдельные композиции. Эти композиции преимущественно могут быть применены у хозяина для индукции функционального эффекта на геномном уровне.

[459] Квалифицированному специалисту будет понятно, что модификации направляющей РНК, которые допускают связывание адаптера+функционального домена, но не надлежащее взаиморасположение адаптера+функционального домена (например, из-за пространственных затруднений в трехмерной структуре комплекса CRISPR), являются нежелательными модификациями. Одна или более измененная(ые) направляющая(ие) молекула(ы) может быть изменена(ы) введением определенной(ых) последовательности(ей) на 5'-конце прямого повтора в самом прямом повторе или на 3'-конце направляющей последовательности.

[460] Измененная направляющая РНК, инактивированный фермент нацеливания на РНК (с функциональными доменами или без них) и связывающий белок с одним или более функциональным(и) доменом(ами), могут находиться в композиции по отдельности и доставляться в организм хозяина по отдельности или вместе. Альтернативно этому, такие компоненты могут быть доставлены в организм хозяина в единой композиции. Введение в организм хозяина может быть выполнено с использованием вирусных векторов, известных квалифицированному специалисту или описанных в настоящем описании для доставки в организм хозяина (например, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора, вектора AAV). Как поясняется в настоящей заявке, использование различных селективных маркеров (например, для селекции лентивирусной гРНК) и концентраций направляющей РНК (например, зависящих от того, используются ли множественные гРНК) может быть преимущественным для обеспечения лучшего эффекта.

[461] Используя описанные композиции квалифицированный в данной области специалист может предпочтительно и специфично осуществить нацеливание на один или более локусов с одинаковыми или различными функциональными доменами для индукции одного или более геномных событий. Такие композиции могут быть использованы во множестве способов скрининга в библиотеках в клетках и функциональном моделировании in vivo (например, активация генов linc-РНК и идентификация функции; моделирование приобретения функции, моделирование потери функции; использование композиции по изобретению для получения клеточных линий и трансгенных животных в целях оптимизации и скрининга).

[462] Настоящее изобретение относится к использованию конструкций по настоящему изобретению для выявления и использования требующих определенных условий или индуцируемых событий нацеливания на РНК (см., например, Platt et al., Cell (2014), http://dx.doi.Org/T0.1016/j.cell.2014.09.014, или цитируемые в настоящем описании патентные публикации PCT, такие как WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667), которые не являются уровнем техники для настоящего изобретения или заявки). Например, клетка-мишень включает нацеленный на РНК фермент CRISRP, кондициональный или индуцируемый (например, в форме Cre-зависимых конструкций), и/или адаптерный белок, кондициональный или индуцируемый, и при экспрессии вектора, введенного в клетку-мишень, происходит индукция или начало состояния экспрессии фермента нацеливания на РНК и/или адаптера в клетке-мишени. В случае применения концепции и композиции по изобретению с известным способом получения комплекса CRISPR, индуцируемая экспрессия генов, измененная функциональными доменами, также является аспектом настоящего изобретения. Альтернативно, адаптерный белок может быть предоставлен в качестве кондиционального или индуцибельного элемента с кондициональным или индуцибельным нацеленным на РНК белком для получения эффективной модели для скрининга, который преимущественно требует только минимального моделирования и внедрения специфических гРНК для широкого круга применений.

Направляющая РНК по изобретению, содержащая "мертвую" направляющую последовательность

[463] В одном возможном варианте осуществления изобретение относится к направляющим последовательностям, модифицированным таким образом, который позволяет образование комплекса CRISPR и успешное связывание с мишенью, в то же время не допуская продуктивной нуклеазной активности (т.е. без нуклеазной активности/без инсерционно/делеционной (indel) активности). Для пояснения такие измененные последовательности направляющей молекулы называются "мертвыми направляющими молекулами" или "мертвыми направляющими последовательностями". Такие мертвые направляющие молекулы или мертвые направляющие последовательности могут рассматриваться как каталитически неактивные или конформационно неактивные в отношении нуклеазной активности. Действительно, мертвые последовательности направляющей молекулы могут недостаточно активно участвовать в продуктивном попарном связывании оснований с учетом способности усиливать каталитическую активность или различать специфическую и неспецифическую активность связывания. В кратком изложении, анализ включает синтез РНК-мишени CRISPR и направляющих РНК, содержащих нарушения комплементарности с РНК-мишенью, комбинируя их с нацеленным на РНК ферментом и анализируя расщепление в гелях на основе присутствия полос, образованных продуктами расщепления, и проводя количественную оценку расщепления на основе относительной интенсивности полос.

[464] Следовательно, в связанном с этим аспекте изобретение относится к неприродной или сконструированной способами инженерии композиции нацеленной на РНК системы CRISPR-Cas, включающей функциональное нацеливание на РНК, как описано в настоящем описании, и направляющую РНК (гРНК), причем направляющая РНК включает мертвую последовательность направляющей молекулы, посредством чего гРНК способна к гибридизации с последовательностью-мишенью, таким образом, что нацеленная на РНК система CRISPR-Cas направляется к представляющему интерес геномному локусу-мишени в клетке без поддающейся обнаружению активности расщепления немутантного нацеленного на РНК фермента такой системы. Следует понимать, что любая из гРНК согласно изобретению, как описано в настоящем описании, может использоваться в качестве мертвых направляющих РНК/направляющих РНК, включающих мертвую направляющую последовательность, как описано в настоящем описании ниже. Любой из способов, продуктов, композиций и применений, как описано в настоящем описании, в равной степени применим к мертвым направляющим РНК/направляющим РНК, включающим мертвую направляющую последовательность, как подробно изложено ниже. Посредством дальнейшего руководства предусматриваются следующие конкретные аспекты и варианты осуществления изобретения.

[465] Способность мертвой направляющей последовательности обеспечивать специфичное к последовательности связывание комплекса CRISPR с последовательностью РНК-мишени может быть оценена любым подходящим способом анализа. Например, компоненты системы CRISPR, достаточные для формирования комплекса CRISPR, включая тестируемую мертвую направляющую последовательность, могут быть доставлены в клетку, имеющую соответствующую последовательность-мишень, например, путем трансфекции векторами, кодирующими компоненты последовательности CRISPR, с последующим установлением участков предпочтительного расщепления в последовательности-мишени. В частности, расщепление последовательности полинуклеотида РНК-мишени может быть оценено в пробирке, при использовании последовательности-мишени, компонентов комплекса CRISPR, включая тестируемую мертвую направляющую последовательность и контрольную направляющую последовательность, отличающуюся от последовательности тестируемой мертвой направляющей последовательности, и сравнении связывания или скорости расщепления реакции последовательности-мишени для тестируемой и контрольной направляющей последовательностей. Другие способы анализа также возможны и будут понятны квалифицированному специалисту в данной области. Мертвая последовательность направляющей молекулы может быть выбрана так, чтобы она была нацелена на любую последовательность-мишень. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень является последовательностью в геноме клетки.

[466] Как объяснено в настоящем описании ниже, несколько структурных параметров обеспечивают надлежащий остов для таких мертвых направляющих молекул. Мертвые направляющие последовательности направляющей, как правило, короче, чем соответствующие последовательности направляющей молекулы, что приводит к активному расщеплению РНК. В конкретных вариантах осуществления изобретения мертвые направляющие молекулы на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% короче, чем соответствующие направляющие молекулы с той же мишенью.

[467] Как объяснено ниже и известно в данной области, одним аспектом специфичности нацеливания на РНК посредством гРНК является последовательность прямого повтора, которая должна быть надлежащим образом связаны с такими направляющими молекулами. В частности, это подразумевает, что последовательности прямых повторов конструируют в соответствии с природой нацеленного на РНК фермента. Таким образом, имеющиеся структурные данные для подтвержденных мертвых направляющих последовательностей могут использоваться для разработки определенных эквивалентов C2c2. Структурное подобие, наблюдаемое, например, для ортологичного домена нуклеазы HEPN и двух или более эффекторных белков C2c2 может использоваться для конструирования эквивалентов мертвых направляющих молекул. Таким образом, длина и последовательность направляющей мертвой молекулы, описанной в настоящем описании, могут быть надлежащим образом изменены для отражения таких определенных эквивалентов C2c2, позволяя образование комплекса CRISPR и успешное связывание с РНК-мишенью, в то же время не допуская продуктивной нуклеазной активности.

[468] Использование мертвых направляющих молекул в контексте настоящего изобретение, а также состояние уровня техники, обеспечивает удивительную и неожиданную платформу для биологии сетей и/или системной биологии и в применениях in vitro, ex vivo и in vivo, делая возможным мультиплексированное нацеливание на гены, и в особенности двунаправленное мультиплексированное нацеливание на гены. До применения мертвых направляющих молекул направленное изменение множественных мишеней было затруднительным и в некоторых случаях невозможным. С использованием мертвых направляющих молекул становятся возможными множественные мишени, и, как следствие, множественные активности, например, в отдельной клетке, в отдельном животном или в отдельном пациенте. Такое мультиплексирование может быть единовременным или разделенным необходимыми промежутками времени.

[469] Например, мертвые направляющие молекулы позволяют использовать гРНК в качестве инструмента нацеливания на гены без сопутствующей нуклеазной активности, в то же время обеспечивая направленный инструмент активации или репрессии. Направляющая РНК, включающая мертвую направляющую молекулу, может быть изменена, чтобы в дополнительно включать элементы таким образом, чтобы допускать активацию или репрессию активности гена, в частности адаптерный белок (например, аптамеры), как описано в настоящем описании, обеспечивая функциональное размещение эффекторов генов (например, активаторы или репрессоры активности гена). Одним из примеров является включение аптамеров, как объяснено в настоящем описании и известно из уровня техники. Путем конструирования такой гРНК, включающей мертвую направляющую молекулу для встраивания взаимодействующих с белком аптамеров (Konermann et al., "Genome-scale transcription activation by an engineered CKISPR-Cas9 complex," doi:10.1038/nature14136, включенная в настоящее описание в качестве ссылки), можно добиться сборки множественных различающихся эффекторных доменов. Ее также можно моделировать на основе природных процессов.

[470] Таким образом, одним аспектом является гРНК по изобретению, включающая мертвую направляющую молекулу, причем направляющая РНК далее включает модификации, которые обеспечивают активацию или репрессию генов, как описано в настоящем описании. Мертвая гРНК может включать один или более аптамеров. Аптамеры могут быть специфичными к генным эффекторам, генным активаторам или генным репрессорам. Альтернативно этому, аптамеры могут быть специфичными к белку, который в свою очередь специфичен и привлекает/связывает определенный генный эффектор, генный активатор или генный репрессор. В случае множественных участков для привлечения активатора или репрессора, предпочтительно, чтобы участки были специфичны либо к активаторам, либо к репрессорам. В случае множественных участков связывания активатора или репрессора, такие участки могут быть специфичными к одним и тем же активаторам или одним и тем же репрессорам. Такие участки могут также быть специфичными к различным активаторам или различным репрессорам. Эффекторы, активаторы, репрессоры могут присутствовать в форме слитых белков.

[471] В одном из аспектов изобретение относится к способу селекции последовательности мертвой направляющей молекулы нацеливания на РНК для направления функционализированной CRISPR системы к локусу в организме, включающему: a) определение местонахождения одного или более мотивов CRISPR в гене локуса; b) анализ последовательность длиной 20 нуклеотидов в нисходящем направлении каждого мотива CRISPR путем: i) определения содержания GC-пар в последовательности; и ii) определения наличия нецелевых соответствий в первых 15 нуклеотидах последовательности в геноме организма; c) отбора последовательности для использования в гРНК, если содержание GC-пар в последовательности составляет 70% или менее и нецелевые соответствия не идентифицированы. В одном варианте осуществления последовательность отбирается, если содержание GC-пар составляет 50% или менее. В одном варианте осуществления последовательность отбирается, если содержание GC-пар составляет 40% или менее. В одном варианте осуществления последовательность отбирается, если содержание GC-пар составляет 30% или менее. В одном варианте осуществления анализируют две или более последовательностей и отбирают последовательность, имеющую самое низкое содержание GC-пар. В одном варианте осуществления нецелевые соответствия обнаруживаются в регуляторных последовательностях организма. В одном варианте осуществления изобретения такой локус является регуляторным регионом. Один аспект обеспечивает мертвую гРНК, включающую нацеливающую последовательность, отобранную согласно вышеупомянутым способам.

[472] В одном из аспектов изобретение относится к мертвой направляющей РНК для нацеливания функционализированной системы CRISPR на локус гена в организме. В одном варианте осуществления изобретения мертвая гРНК включает нацеливающую последовательность, где содержание GC-пар в последовательности-мишени составляет 70% или менее, и первые 15 нуклеотидов нацеливающей последовательности не соответствуют последовательности-мишени в нисходящем направлении от мотива CRISPR в регуляторной последовательности другого локуса в организме. В некоторых вариантах осуществления изобретения содержание GC-пар в нацеливающей последовательности составляет 60% или менее, 55% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее или 30% или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения содержание GC-пар в нацеливающей последовательности составляет от 70% до 60%, от 60% до 50%, от 50% до 40% или от 40% до 30%. В одном варианте осуществления изобретения нацеливающая последовательность имеет самое низкое содержание GC-пар среди потенциальных нацеливающих на локус последовательностей.

[473] В одном варианте осуществления изобретения первые 15 нуклеотидов мертвой направляющей молекулы соответствуют последовательности-мишени. В другом варианте осуществления изобретения первые 14 нуклеотидов мертвой направляющей молекула соответствуют последовательности-мишени. В другом варианте осуществления изобретения первые 13 нуклеотидов мертвой направляющей молекулы соответствуют последовательности-мишени. В другом варианте осуществления изобретения первые 12 нуклеотидов мертвой направляющей молекулы соответствуют последовательности-мишени. В другом варианте осуществления изобретения первые 11 нуклеотидов мертвой направляющей молекулы соответствуют последовательности-мишени. В другом варианте осуществления изобретения первые 10 нуклеотидов мертвой направляющей молекулы соответствуют последовательности-мишени. В одном варианте осуществления изобретения первые 15 нуклеотидов мертвой направляющей молекулы не соответствуют последовательности-мишени в нисходящем направлении от мотива CRISPR в регуляторной области другого локуса. В других вариантах осуществления изобретения первые 14 нуклеотидов, первые 13 нуклеотидов мертвой направляющей молекулы, первые 12 нуклеотидов направляющей молекула, первые 11 нуклеотидов мертвой направляющей молекула или первые 10 нуклеотидов мертвой направляющей молекулы не соответствуют последовательности-мишени в нисходящем направлении от мотива CRISPR в регуляторной области другого локуса. В других вариантах осуществления изобретения первые 15 нуклеотидов, 14 нуклеотидов, 13 нуклеотидов, 12 нуклеотидов или 11 нуклеотидов мертвой направляющей молекулы не соответствуют последовательности-мишени в нисходящем направлении от мотива CRISPR в геноме.

[474] В определенных вариантах осуществления изобретения мертвая направляющая РНК включает дополнительные нуклеотиды на 3'-конце, не соответствующие последовательности-мишени. Таким образом, мертвая направляющая РНК, которая включает первые 20-28 нуклеотидов в нисходящем направлении от мотива CRISPR, может быть удлинена на 3'-конце.

Общие положения

[475] В одном из аспектов изобретение относится к системе связывания нуклеиновой кислоты. Гибридизация РНК in situ с комплементарными зондами является технологией с большими возможностями. Обычно, чтобы обнаружить нуклеиновые кислоты путем гибридизации, используются флуоресцентные олигонуклеотиды ДНК. Увеличение эффективности удалось достигнуть определенными модификациями, такими как закрытые нуклеиновые кислоты (LNA), однако остается потребность в эффективных и универсальных альтернативах. Изобретение обеспечивает эффективную и приспосабливаемую систему для гибридизации in situ.

[476] В вариантах осуществления изобретения понятия "направляющая последовательность" и "направляющая РНК" используются взаимозаменяемо, как и в упоминаемых выше документах, таких как WO 2014/093622 (PCT/US 2013/074667). В широком смысле, направляющая последовательность представляет собой любую нуклеотидную последовательность, имеющую достаточную комплементарность с полинуклеотидной последовательностью-мишенью для гибридизации с последовательностью-мишенью и обеспечения специфичного к последовательности связывания комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью. В некоторым вариантах осуществления, уровень комплементаности между направляющей последовательностью и соответствующей последовательностью-мишенью при условии оптимального выравнивания с использованием надлежащего алгоритма выравнивания составляет примерно или превышает 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более. Оптимальное выравнивание может быть определено с использованием любого подходящего алгоритма для выравнивания последовательностей, не ограничивающими примерами которого являются алгоритм Смита-Ватермана, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритмы, основанные на преобразовании Барроуза-Виллера (например, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; доступен на www.novocraft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (доступен на soap.genomics.org.cn) и Maq (доступен на maq.sourceforge.net). В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность имеет длину примерно или более 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления, направляющая последовательность имеет длину менее чем примерно 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 или менее нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы направляющая последовательность имела длину 10-30 нуклеотидов. Способность направляющей последовательности направлять специфичное к последовательности связывание комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью может быть количественно оценена любым подходящим способом анализа. Например, компоненты системы CRISPR, достаточные для образования комплекса CRISPR, включая тестируемую направляющую последовательность, могут быть доставлены в клетку, содержащую соответствующую последовательность-мишень, например, путем трансфекции векторами, кодирующими компоненты последовательности CRISPR, с последующей количественной оценкой сайтов преимущественного расщепления последовательности-мишени, в частности, анализом Surveyor, как описано в настоящем описании. Сходным образом, расщепление полинуклеотидной последовательности-мишени может быть оценено в пробирке, содержащей последовательность-мишень, компоненты комплекса CRISPR, включая тестируемую направляющую последовательность и контрольную направляющую последовательность, при сравнении связывания или скорости расщепления последовательности-мишени для реакций с тестовой и контрольной направляющими последовательностями. Другие способы анализа также возможны и будут понятны квалифицированному специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень является последовательностью в геноме клетки. Иллюстративные последовательности-мишени включают те, которые являются уникальными в геноме-мишени.

[477] В целом и в описании настоящего изобретения понятие "вектор" обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Векторы включают, но не ограничиваются ими, молекулы нуклеиновых кислот, являющиеся одноцепочечными, двухцепочечными или частично двухцепочечными; нуклеиновые кислоты, которые включают один или более свободных концов, не имеют свободных концов (например, кольцевые); нуклеиновые кислоты, которые представляют собой ДНК, РНК или ту и другую и другие разновидности полинуклеотидов, известных в данной области. Один из типов векторов называется "плазмидой", что означает кольцевую двухцепочечную ДНК-петлю, в которую могут быть внесены дополнительные участки ДНК, в том числе стандартными способами молекулярного клонирования. Другим типом векторов является вирусный вектор, в котором находятся последовательности, полученные из вирусных ДНК или РНК в векторе для упаковки в вирус (например, ретровирусы, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы, дефектные по репликации аденовирусы и аденоассоциированные вирусы). Вирусные векторы также включают полинуклеотиды, переносимые вирусом для трансфекции клетки хозяина. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации и векторы эписом млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) встраиваются в геном клетки-хозяина при введении в клетку хозяина и благодаря этому реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они непосредственно связаны. Такие векторы называются в настоящем описании "экспрессирующими векторами". Векторы для экспрессии и обеспечивающие экспрессию в эукариотической клетке могут называться в настоящем описании "эукариотическими экспрессирующими векторами". Часто используемыми векторами в способах рекомбинантных ДНК являются плазмиды.

[478] Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут включать нуклеиновую кислоту по изобретению в форме, подходящей для экспрессии такой нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что такие рекомбинантные экспрессирующие векторы содержат один или более регуляторных элементов, которые могут быть выбраны в соответствии с используемыми для экспрессии клетками хозяина и которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая должна быть экспрессирована. В рекомбинантном векторе экспрессии "функционально связанный" должно означать, что нуклеотидная последовательность-мишень связана с регуляторным(и) элементом(ами) таким образом, что экспрессия такой нуклеотидной последовательности является возможной (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке хозяина при введении вектора в клетку хозяина).

[479] Термин "регуляторный элемент" используется для обозначения промоторов, энхансеров, участков внутренней посадки рибосомы (IRES) и других элементов контроля экспрессии (например, сигналы терминации транскрипции, такие как сигналы полиаденилирования и поли(U)-последовательности). Такие регуляторные элементы описаны, например, в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Регуляторные элементы включают те, что обеспечивают конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности в различных типах клеток, и те, что обеспечивают экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Тканеспецифический промотор может обеспечивать экспрессию преимущественно в желаемой целевой ткани, такой как мышца, нейрон, кость, кожа, кровь, конкретных органах (например, печень, поджелудочная железа) или конкретных типах клеток (например, лимфоцитах). Регуляторные элементы могут также управлять экспрессией в зависимости от времени, например в зависимости от стадии клеточного цикла или стадии развития, и при этом могут быть также специфичными к тканям или типу клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор включает один или более промоторов РНК-полимеразы III (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов РНК-полимеразы III), один или более промоторов РНК-полимеразы II (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов РНК-полимеразы II), один или более промоторов РНК-полимеразы I (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов РНК-полимеразы I) или их комбинацию. Примеры промоторов РНК-полимеразы III включают, но не ограничиваются ими, промоторы U6 и H1. Примеры промоторов РНК-полимеразы II включают, но не ограничиваются ими, промоторы вируса саркомы Рауса (RSV) (необязательно с энхансером RSV), промотор цитомегаловируса (CMV), (необязательно с энхансером CMV) [см., например, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)], промотор SV40, промотор дигидрофолатредуктазы, промотор p-актина, промотор фосфоглицеролкиназы (PGK) и промотор EF1a. Термин "регуляторный элемент" относится и к элементам-энхансерам, таким как WPRE; энхансеры CMV; R-U5'-сегмент в LTR HTLV-I (Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988); энхансер SV40 и последовательность интрона между 2 и 3 экзонами P-глобина кролика (Proc. Natl, Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981). Квалифицированный специалист в данной области оценит, что конструкция вектора экспрессии может зависеть от таких факторов как выбранная клетка-хозяин, трансфекция которой будет производиться, желаемый уровень экспрессии и т.д. Вектор может быть введен в клетки таким образом, чтобы получались транскрипты, белки или пептиды, включая слитые белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, как описано в настоящем описании (например, транскрипты системы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных кластерами (CRISPR), их белки, ферменты, мутантные формы, слитые белки и т.д.)

[480] Преимущественные векторы включают лентивирусы и аденоассоциированные вирусы, и типы таких векторов могут также быть выбраны для нацеливания на конкретные типы клеток.

[481] Как используют в настоящем описании, термин "cr-РНК" или "направляющая РНК" или "единственная направляющая РНК" или "sg-РНК" или "один или более компонентов нуклеиновых кислот" эффекторного белка локуса типа V или типа VI системы CRISPR Cas включает любую полинуклеотидную последовательность, имеющую достаточную комплементарность с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени для гибридизации с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени и прямого, специфичного к последовательности связывания комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения степень комплементарности при оптимальном выравнивании с использованием подходящего алгоритма выравнивания приблизительно равна 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более. Оптимальное выравнивание может быть проведено с использованием любого подходящего алгоритма выравнивания последовательностей, примеры которого включают, но не ограничиваются ими алгоритм Смита-Ватермана, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритмы, основанные на преобразовании Барроуза - Уилера (например, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAST, Novoalign (Novocraft Technologies; доступен на www.novocraft.com), ELAND (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США), SOAP (доступен на soap.genomics.org.cn) и Maq (доступен на maq.sourceforge.net). Способность направляющей последовательности (в пределах направляющей РНК, нацеливающей на нуклеиновые кислоты) управлять прямым специфичным к последовательности связыванием комплекса, нацеленного на нуклеиновые кислоты, может быть оценена с помощью любого подходящего способа анализа. Например, компоненты системы CRISPR, нацеленной на нуклеиновые кислоты, достаточные для формирования комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, включая направляющую последовательность, подлежащую тестированию, могут быть предоставлены клетке-хозяину, имеющей соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, например, путем трансфекции векторами, кодирующими компоненты комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, с последующей оценкой предпочтительного нацеливания (например, расщепления) в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, например, в анализе Survey, описанном в настоящем описании. Аналогично расщепление последовательности нуклеиновой кислоты-мишени может быть оценено в пробирке путем представления клетке последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, компонентов комплекса, нацеленного на нуклеиновые кислоты, включая направляющую последовательность, подлежащую тестированию, и контрольную направляющую последовательность, отличающаяся от тестируемой направляющей последовательности, и сравнения связывания или уровня расщепления последовательности-мишени между реакциями тестовой и контрольной направляющими последовательностями. Другие способы анализа возможны и понятны специалисту в данной области. Направляющая последовательность, и, следовательно, направляющая РНК, нацеливающая на нуклеиновые кислоты, могут быть выбраны для нацеливания на любую последовательность нуклеиновой кислоты-мишени. Последовательность-мишень может быть представлена ДНК. Последовательность-мишень может быть представлена любой последовательностью РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень может представлять собой последовательность в молекуле РНК, выбранной из группы, состоящей из матричной РНК (мРНК), пре-мРНК, рибосомной РНК (рРНК), транспортной РНК (тРНК), микроРНК, малой интерферирующей РНК (миРНК), малой ядерной РНК (мяРНК), малой ядрышковой РНК (мякРНК), двухцепочечной РНК (дцРНК), некодирующей РНК (нкРНК), длинной некодирующей РНК (днкРНК) и малой цитоплазматической РНК (мцРНК). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень может представлять собой последовательность в молекуле РНК, выбранную из группы, состоящей из мРНК, пре-мРНК и рРНК. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень может представлять собой последовательность в молекуле РНК, выбранную из группы, состоящей из нкРНК и днкРНК. В некоторых более предпочтительных вариантах осуществления изобретения последовательность-мишень может представлять собой последовательность в молекуле мРНК или молекуле пре-мРНК.

[482] В некоторых вариантах осуществления изобретения направляющая РНК, нацеленная на нуклеиновые кислоты, выбрана таким образом, чтобы вторичная структура направляющей РНК, нацеленной на РНК, была более компактной. В некоторых вариантах осуществления изобретения приблизительно или меньше чем приблизительно 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, или менее нуклеотидов направляющей РНК, нацеленной на нуклеиновую кислоту, участвует в самокомплементарном спаривании оснований при оптимальном фолдинге. Оптимальный фолдинг может быть определен любым подходящим алгоритмом выявления фолдинга полинуклеотида. Некоторые программы основаны на вычислении минимальной свободной энергии Гиббса. Примером одного такого алгоритма является mFold, описанный Zuker и Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148). В качестве примера другого алгоритма фолдинга можно привести онлайн вебсервер RNAfold, разработанный в Институте Теоретической Химии в Венском университете, который используют центроидный алгоритм предсказания структуры (см., например, A.R. Gruber et al, 2008, Cell 106(1): 23-24; и PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62).

[483] В определенных вариантах осуществления изобретения направляющая РНК или cr-РНК может включать, по существу состоять из или состоять из последовательности прямого повтора (DR) и последовательности направляющей молекулы или последовательности спейсера. В некоторых вариантах осуществления изобретения направляющая РНК или cr-РНК может включать, по существу состоять из или состоять из последовательности прямого повтора (DR), слитой или связанной с последовательностью направляющей молекулы или последовательностью спейсера. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность прямого повтора (DR) может быть расположена в восходящем направлении (т.е. 5') от последовательности направляющей молекулы или последовательности спейсера. В других вариантах осуществления изобретения последовательность прямого повтора может быть расположена в нисходящем направлении (т.е. 3') от последовательности направляющей молекулы или последовательности спейсера.

[484] В определенных вариантах осуществления изобретения cr-РНК включает шпилечную структуру, предпочтительно единственную шпилечную структуру. В некоторых вариантах осуществления изобретения шпилечная структура, предпочтительно единственная шпилечная структура, формирует последовательность прямого повтора.

[485] В определенных вариантах осуществления изобретения длина спейсера направляющей РНК составляет от 15 до 35 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления изобретения длина спейсера направляющей РНК составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 18 нуклеотидов, например, по меньшей мере 19, 20, 21, 22 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения длина спейсера составляет от 15 до 17 нуклеотидов, например, 15, 16 или 17 нуклеотидов, от 17 до 20 нуклеотидов, например, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, от 20 до 24 нуклеотидов, например, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, от 23 до 25 нуклеотидов, например, 23, 24 или 25 нуклеотидов, от 24 до 27 нуклеотидов, например, 24, 25, 26 или 27 нуклеотидов, от 27-30 нуклеотидов, например, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, 30-35 нуклеотидов, например, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 нуклеотидов или 35 нуклеотидов или более.

[486] Заявители также провели пробный эксперимент для проверки способности белков типа V, таких как C2c1 или C2c3, к нацеливанию и расщеплению ДНК. Этот эксперимент во многом повторяет подобную работу для гетерологичной экспрессии StCas9 в E. coli (Sapranauskas, R. et al. Nucleic Acids Res 39, 9275-9282 (2011)). Заявители ввели плазмиду, содержащую одновременно PAM и ген устойчивости к антибиотикам, в гетерологичный штамм E. coli, и затем поместили на среду, содержащую соответствующий антибиотик. В случае расщепления ДНК плазмиды заявители не наблюдали жизнеспособных колоний.

[487] Более подробно анализ ДНК-мишени может быть проведен следующим образом. В анализе используются два штамма E.coli. Один из штаммов имеет плазмиду, которая кодирует локус эндогенного эффекторного белка бактериального штамма. Другой штамм имеет пустую плазмиду (например, pACYC184, контрольный штамм). Все возможные PAM длиной 7 или 8 п.н. представлены на плазмиде устойчивости к антибиотикам (pUC19 с геном устойчивости к ампициллину). PAM расположена рядом с последовательностью протоспейсера 1 (ДНК-мишень для первого спейсера в локусе эндогенного эффекторного белка). Были клонированы две библиотеки PAM. Одна библиотека содержит последовательности 5'-конца протоспейсера, состоящие из 8 случайных п.н. (например, всего 65 536 различных PAM=комплексность). Другая библиотека содержит последовательности 3'-конца протоспейсера, состоящие из 7 случайных п.н. (например, полная комплексность - 16 384 различных PAM). Обе библиотеки были клонированы, чтобы иметь в среднем 500 плазмид, содержащих каждый возможный PAM. Тестовый и контрольный штаммы были трансформированы библиотеками 5'-PAM и 3'-PAM в ходе отдельных трансформаций, трансформированные клетки были помещены в культуру на среду, содержавшую ампициллин. Распознавание и последующее разрезание/интерференция посредством плазмиды делают клетку неустойчивой к ампициллину и прекращают ее рост. Приблизительно через 12 ч после трансформации все колонии, образованных тестовым и контрольным штаммами, были собраны и из них была выделена плазмидная ДНК. Плазмидная ДНК использовалась в качестве матрицы для ПЦР-амплификации и последующего глубокого секвенирования. Представленность всех PAM в нетрансформированных библиотеках показала ожидаемую представленность PAM в трансформированных клетках. Представленность всех PAM, найденных в штаммах контроля, показала фактическую представленность. Представленность всех PAM в тестовом штамме показала, какие PAM не распознаются ферментом. Сравнение с контрольным штаммом позволяет извлекать последовательности с обедненным PAM.

[488] Для минимизации токсичности и неспецифических эффектов важно управлять концентрацией доставленной направляющей РНК. Оптимальные концентрации направляющей РНК, нацеленной на нуклеиновую кислоту, могут быть определены путем тестирования различных концентраций в клеточных моделях или эукариотических моделях животных, не являющихся человеком, глубокое секвенирование может быть использовано для анализа степени модификации в потенциальных геномных локусах, не являющихся мишенями. Концентрация для доставки in vivo должна быть подобрана так, чтобы обеспечивать наибольший уровень целевой модификации мишени при минимальном уровне нецелевой модификации. Предпочтительным является получение системы нацеливания на нуклеиновые кислоты из системы CRISPR типа VI. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более элементов системы нацеливания на нуклеиновые кислоты получены из конкретного организма, включающего эндогенную систему нацеливания на РНК. В конкретных вариантах осуществления изобретения фермент Cas типа VI, нацеленный на РНК, представляет собой C2c2. Примеры белков Cas включают, но не ограничиваются ими, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (также известный как Csn1 и Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, их гомологи или модифицированные версии. В вариантах осуществления изобретения белок типа VI, такой как C2c2, упомянутый в настоящем описании, также включает гомологи или ортологи белков типа VI, таких как C2c2. Термины "ортолог" (также обозначаемый в настоящем описании как "ortologue") и "гомолог" (также обозначаемый в настоящем описании как "homologue") хорошо известны в данной области. Посредством дальнейшего руководства "гомолог" белка как используют в настоящем описании, представляет собой белок того же самого вида, который выполняет ту же самую или подобную функцию, что и белок, гомологом которого он является. Гомологичные белки могут иметь сходную или частично сходную структуру, но это не обязательно. "Ортолог" белка, как используют в настоящем описании, является белком другого вида, который выполняет ту же самую или подобную функцию, что и белок, ортологом которого он является. Ортологичные белки могут иметь сходную или частично сходную структуру, но это не обязательно. В конкретных вариантах осуществления изобретения гомологи или ортологи белков типа VI, таких как C2c2, упомянутый в настоящем описании, имеют гомологию или идентичность последовательностей по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% с белками типа VI, такими как C2c2. В следующих вариантах осуществления изобретения гомологи или ортологи белков типа VI, таких как C2c2, упомянутый в настоящем описании, имеют идентичность последовательности по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% с белками типа VI дикого типа, такими как C2c2.

[489] В варианте осуществления изобретения белки Cas типа VI, нацеленные на РНК, могут быть ортологами C2c2 организмов из родов, которые включают, но не ограничены следующими: Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma и Campylobacter. Вид организма, принадлежащего к данным родам, может быть обсужден в данной заявке иным образом.

[490] Некоторые способы идентификации ортологов ферментов системы CRISPR-Cas могут включать идентификацию tracr-последовательности в геномах-мишенях. Идентификация tracr-последовательностей может быть связана со следующими шагами: поиск прямых повторов или последовательности tracr-помощника в базе данных, чтобы идентифицировать область CRISPR, включающую фермент CRISPR; поиск гомологичных последовательностей в области CRISPR, фланкирующем фермент CRISPR в смысловом и антисмысловом направлениях; поиск терминаторов транскрипции и вторичных структур; идентификация любой последовательности, которая не является прямым повтором или последовательностью tracr-помощника, но имеет больше чем 50% идентичность с прямым повтором или последовательностью tracr-помощника как потенциальная tracr-последовательность; поиск последовательностей терминатора транскрипции, ассоциированных с потенциальной tracr-последовательностью.

[491] Следует принимать во внимание, что любой из функциональных видов активности, описанных в настоящем описании, может быть встроена способами инженерии в ферменты CRISPR из других ортологов, включая химерные ферменты, включающие фрагменты многих ортологов. Примеры таких ортологов описаны в настоящем описании. Таким образом, химерные ферменты могут включать фрагменты ортологов фермента CRISPR организма, который включает, но не ограничен следующими: Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma и Campylobacter. Химерный фермент может включать первый фрагмент и второй фрагмент, фрагменты могут происходить из ортологов фермента CRISPR организмов, принадлежащих к родам, упомянутым в настоящем описании, или видам, упомянутым в настоящем описании; предпочтительно фрагменты происходят из ортологов фермента CRISPR различных видов.

[492] В вариантах осуществления изобретения, эффекторный белок типа VI, нацеленный на РНК, в частности, белок C2c2, упоминаемый в настоящем описании, также охватывает функциональный вариант C2c2 или его гомолог, или ортолог. "Функциональный вариант" белка, как используют в настоящем описании, относится к варианту такого белка, который сохраняет, по меньшей мере частично, активность этого белка. Функциональные варианты могут включать мутанты (которые могут иметь инсерции, делеции или замены), включая полиморфы, и т.д. Также в функциональные варианты включены продукты слияния такого белка с другим, обычно неродственным, белком, нуклеиновой кислотой, полипептидом или пептидом. Функциональные варианты могут быть естественными или искусственными. Предпочтительные варианты осуществления изобретения могут включать не встречающийся в природе или сконструированный способами инженерии эффекторный белок типа VI, нацеленный на РНК, например, C2c1/C2c3, или его ортолог или гомолог.

[493] В варианте осуществления изобретения кодон молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты, кодирующей эффекторный белок типа VI, нацеленный на РНК, в частности, C2c2, или его ортолог или гомолог, может быть оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке. Эукариотический организм может быть таким, как описано в настоящем описании. Молекула (молекулы) нуклеиновой кислоты может быть сконструирована способами инженерии или не встречаться в природе.

[494] В варианте осуществления изобретения эффекторный белок типа VI, нацеленный на РНК, в частности, C2c2 (или его ортолог или гомолог), может включать одну или более мутаций (следовательно, молекула (молекулы) нуклеиновой кислоты, кодирующая этот белок, имеет ту же самую мутацию (мутации)). Мутации могут быть внесены искусственно и могут включать, но не ограничиваться ими, одну или более мутациий в каталитическом домене. Примеры каталитических доменов в отношении фермента Cas9 могут включать, но не ограничиваться ими, домены RuvC I, RuvC II, RuvC III и HNH.

[495] В варианте осуществления изобретения белок Cas типа VI, такой как C2c2, или его ортолог или гомолог, может включать одну или более мутаций. Мутации могут быть внсены искусственно и могут включать, но не ограничиваться ими, одну или более мутаций в каталитическом домене. Примеры каталитических доменов в отношении фермента Cas могут включать, но не ограничиваться ими, домены RuvC I, RuvC II, RuvC III, HNH и домены HEPN.

[496] В одном варианте осуществления изобретения белок Cas типа VI, такой как C2c2, или его ортолог или гомолог, может использоваться в качестве универсального белка, связывающего нуклеиновые кислоты, в слиянии или будучи функционально связанным с функциональным доменом. Иллюстративные функциональные домены могут включать, но не ограничиваются ими, инициатор трансляции, активатор трансляции, репрессор трансляции, нуклеазы, в частности, рибонуклеазы, сплайсосомы, магнитные гранулы, индуцируемый/контролируемй светом домен или химически индуцируемый/контролируемый домен.

[497] В некоторых вариантах осуществления изобретения ферментативная активность неизмененного эффекторного белка, нацеленного на нуклеиновые кислоты, заключается в расщеплении. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок нацеливания на РНК может направлять расщепление одной или обеих нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) цепи в местоположении около последовательности-мишени, таком как в пределах последовательности-мишени и/или в пределах последовательности, комплементарной последовательности-мишени, или в последовательностях, ассоциированных с последовательностью-мишенью. В некоторых вариантах осуществления изобретения белок Cas, нацеленный на нуклеиновую кислоту, может направлять расщепление одной или обеих цепей ДНК или РНК в пределах приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 или более пар оснований от первого или последнего нуклеотида последовательности-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения расщепление может быть тупым, т.е. производить тупые концы. В некоторых вариантах осуществления изобретения расщепление может быть ступенчатым, т.е. производить липкие концы. В некоторых вариантах осуществления изобретения расщепление может быть ступенчатым с 5'-выступающими концами, например, 5'-выступающими концами длиной 1-5 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения расщепление может быть ступенчатым с 3'-выступающими концами, например, 3'-выступающими концами длиной 1-5 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор кодирует белок Cas, нацеленный на нуклеиновые кислоты, который может быть мутантным по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа, таким образом, что мутантный белок Cas, нацеленный на нуклеиновую кислоту, имеет пониженную способность расщеплять одну или обе цепи ДНК или РНК полинуклеотида-мишени, содержащего последовательность-мишень. В качестве еще одного примера, мутации могут быть внесены в два или более каталитических домена белка Cas (RuvC I, RuvC II и RuvC III или домен HNH или домен HEPN), чтобы мутантный белок Cas практически утратил активность расщепления РНК. Как описано в настоящем описании, мутации могут быть внесены в соответствующие каталитические домены эффекторного белка C2c2, чтобы активность расщепления ДНК эффекторного белка C2c2 была недостаточной или существенно уменьшенной. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоте, считается имеющий существенный недостаток активности расщепления РНК, когда активность расщепления РНК мутантного фермента составляет не больше чем 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% или менее активности расщепления нуклеиновой кислоты немутантной формы фермента; например, когда активность расщепления нуклеиновой кислоты мутантной формы равна нулю или незначительна по сравнению с немутантной формой. Эффекторный белок может быть идентифицирован в отношении общего класса ферментов, которые являются гомологичными самой большой нуклеазе со множественными нуклеазными доменами системы CRISPR типа V/типа VI. Наиболее предпочтительно использование эффекторного белка типа V/типа VI, такого как C2c2. Под "происходящим" заявители подразумевают, что происходящий фермент в значительной степени основан, в смысле наличия высокой степени гомологии последовательности, на ферменте дикого типа, но что он некоторым образом мутирован (модифицирован), как известно в данной области или как описано в настоящем описании.

[498] Снова, следует принимать во внимание, что термины "Cas и фермент CRISPR", "белок CRISPR" и "белок Cas" обычно используются взаимозаменяемо и во всех случаях упоминания в настоящем описании относится относятся по аналогии к новым эффекторным белкам CRISPR, далее описанными в настоящем описании, если иное не очевидно, например, при конкретной отсылке к Cas9. Как упомянуто выше, многие нумерации остатков, используемые в настоящем описании, относятся к эффекторному белку локуса CRISPR типа V/типа VI. Однако следует принимать во внимание, что это изобретение включает еще множество эффекторных белков из других видов микроорганизмов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, Cas может конститутивно присутствовать, или индуцируемо присутствовать, или кондиционально присутствовать, или быть введенным, или быть доставленным. Оптимизация Cas может использоваться для усиления функций или разработки новых функций, могут быть получены химерные белки Cas. Cas может использоваться в качестве универсального белка, связывающего нуклеиновые кислоты.

[499] Как правило, в контексте эндогенной системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, образование комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту (включающего направляющую РНК, гибридизованную с последовательностью-мишенью, и образующую комплекс с одним или более нацеленными на нуклеиновую кислоту эффекторными белками) приводит к расщеплению одной или обеих цепей ДНК или РНК в пределах или рядом (например, в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, или более пар оснований от) с последовательностью-мишенью. Как используют в настоящем описании, термин "последовательность (последовательности), ассоциированная с локусом-мишень", относится к последовательностям вблизи последовательности-мишени (например, в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 или более пар оснований от последовательности-мишени, где последовательность-мишень находится в локусе-мишени).

[500] Примером кодон-оптимизированной последовательности в данном случае является последовательность, оптимизированная для экспрессии в эукариотическом организме, например, в человеке (т.е. являющаяся оптимизированной для экспрессии в человеке) или другом эукариотическом организме, животном или млекопитающем, как описано в настоящем описании; см., например, кодон-оптимизированную для человека последовательность SaCas9 в WO 2014/093622 (PCT/US2G13/074667) в качестве примера кодон-оптимизированной последовательности (как это известно из уровня техники и настоящего описания, кодон оптимизированная кодирующая молекула(ы) нуклеиновой(ых) кислот(ы), особенно в случае эффекторного белка (например, C2c2), входит в компетенцию квалифицированного специалиста). В то время как именно представленное выше описание является предпочтительным, будет также понятно, что другие примеры являются возможными и известна оптимизация кодонов для видов хозяев, отличных от человека, или оптимизация кодонов для определенных органов. В некоторых вариантах осуществления кодирующая фермент последовательность, в которой закодирован нацеленный на ДНК/РНК белок Cas, является кодон-оптимизированной для экспрессии в определенных клетках, в частности, эукариотических клетках. Такие эукариотические клетки конкретного организма, или могут происходить из него, который может быть млекопитающим, включая, но не ограничиваясь этим человека, отличного от человека эукариотического организма, животного или млекопитающего, как описано в настоящем описании, например, мышь, крысу, кролика, собаку, домашний скот или отличного от человека млекопитающего или примата. В некоторых вариантах осуществления процессы модификации генетической принадлежности эмбриональной линии клеток человеческих индивидов и/или процессы модификации генетической принадлежности эмбриональной линии клеток животных, которые с большой долей вероятности могут принести им страдания без получения существенной пользы для медицинских приложений для человека или животных, а также получаемые при этих процессах животные, могут быть исключены. В целом, под оптимизацией кодонов понимается процесс изменения последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках-мишенях хозяина путем замены по меньшей мере одного кодона (например, примерно или более чем 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более кодонов) нативной последовательности кодонами, которые более часто или наиболее часто используются в генах этой клетки-хозяина при сохранении нативной аминокислотной последовательности. Различные виды демонстрируют определенное предпочтение для определенных кодонов конкретных аминокислот. Предпочтение кодонов (различия в использовании кодонов между организмами) часто коррелирует с эффективностью трансляции матричных РНК (мРНК), что в свою очередь считается зависящим от, в числе прочего, от свойств транслируемых кодонов или доступности молекул определенной транспортной РНК (тРНК). Преобладание определенных тРНК обычно отражает наиболее часто используемые при синтезе пептидов кодоны. В соответствии с этим, гены могут быть адаптированы для оптимальной экспрессии генов в конкретном организме на основе оптимизации кодонов. Таблицы частот использования кодонов свободно доступны, например, в базе "Codon Usage Database", доступной на www.kazusa.oijp/codon/, причем такие таблицы могут быть адаптированы различными способами. См. Nakamura, Y. et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res, 28:292 (2000). Также доступны компьютерные алгоритмы для оптимизации кодонов для конкретной последовательности для экспрессии в определенной клетке-хозяине, в частности, такие как Gene Forge (Aptagen; Джакобус, Пенсильвания, США). В некоторых вариантах осуществления один или более кодонов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, более или все кодоны) в последовательности, кодирующей нацеленный на ДНК/РНК белок Cas соответствуют наиболее часто используемым кодонам для конкретной аминокислоты.

[501] В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок, такой как нацеленный на РНК эффекторный белок типа V, в частности C2c2, либо ортолог или гомолог такового, содержащий одну или более последовательностей сигнала ядерной локализации (NLS), к примеру примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS. В некоторых вариантах осуществления такой нацеленный на РНК эффекторный белок содержит примерно или более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS на N-конце или вблизи него, примерно или более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS на C-конце или вблизи него или их сочетание (например, ноль или по меньшей мере один или более NLS на N-конце или более NLS на C-конце). В случае наличия более одной NLS, каждая из них может быть отобрана независимо от других, в частности, отдельная NLS может присутствовать в виде более чем одной копии и/или в сочетании с одной или более NLS, представленной одной или более копией. В некоторых вариантах осуществления NLS считается находящейся вблизи N- или C- конца, когда ближайшая аминокислота NLS находится на расстоянии менее примерно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или более аминокислот полипептидной цепи от N-конца или C-конца. Неограничивающие примеры NLS включают последовательности NLS, полученные из: NLS большого T-антигена вируса SV40, имеющий аминкоислотную последовательность PKKKRKV; NLS нуклеоплазмина (например, двухкомпонентная NLS, имеющий последовательностью KRPAATKKAGQAKKKK); NLS c-myc, имеющий аминокислотную последовательность PAAKRVKLD или RQRRNELKRSP; NLS hRNPA1 M9, имеющий аминокислотную последовательность NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; последовательность RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV домена IBB импортина-альфа; последовательности VSRKRPRP и PPKKARED T-белка миомы; последовательность POPKKKPL p53 человека; последовательность SALIKKKKKMAP c-ab1 IV мыши; последовательности DRLRR и PKQKKRK вируса гриппа NS1; последовательность RKLKKKIKKL дельта-антигена вируса гепатита; последовательность REKKKFLKRR белка Mx1 мыши; последовательность KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK поли(АДФ-рибоза)-полимеразы и последовательность RKCLQAGMNLEARKTKK глюкокортикоида рецепторов стероидных гормонов. В целом, одна или более NLS являются достаточными, чтобы вызвать накопление нацеленного на ДНК/РНК белка Cas в поддающихся обнаружению количествах в ядре эукариотической клетки. В целом, выраженность активности ядерной локализации может быть результатом деятельности ряда NLS в нацеленном на нуклеиновые кислоты эффекторном белке, использования определенных NLS или сочетания этих факторов. Отслеживание накопления в ядре может быть выполнено с помощью любого подходящего способа. Например, отслеживаемый маркер может быть слит с нацеленным на нуклеиновую кислоту белком, так что его расположение в клетке может быть визуализировано, в частности, в комбинации со способами определения расположения ядра (например, с помощью специфичного для ядра красителя, такого как DAPI). Ядра клеток могут также быть выделены из клеток, содержимое которых может затем быть проанализировано с использованием любого подходящего способа отслеживания белка, такого как иммунногистохимия, вестерн-блоттинг или анализ активности белка. Накопление в ядре может быть определено и косвенными способами, например, путем анализа эффекта образования нацеленного на нуклеиновые кислоты комплекса (например, изменения активности экспрессии при образовании нацеленного на ДНК или РНК комплекса и/или активности белка Cas по нацеливанию на РНК), при сравнении с контролем, не подвергнутым воздействию нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas или нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса, или подвергнутым действию нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas, лишенного одного или более NLS. В предпочитаемом варианте описываемые в настоящем описании комплексы и системы эффекторного белка C2c2 и комплексы и системы эффекторного белка C2c2 включают NLS, присоединенный к C-концу белка.

[502] В некоторых вариантах осуществления один или более векторов, управляющих экспрессией одного или более систем нацеливания на нуклеиновые кислоты вводят в клетку таким образом, что экспрессия элементов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту управляет образованием нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса на одном или более участках-мишенях. Например, нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок и нацеливающая на нуклеиновую кислоту направляющая РНК могут быть функционально связаны с отдельными регуляторными элементами в отдельных векторах. Молекула(ы) системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, может быть доставлена к трансгенныму эффекторному белку, нацеленному на нуклеиновую кислоту, являющемуся белком животного или млекопитающего, конститутивно, индуцибельно или кондиционально экспрессирующего эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, или животного или млекопитающего, экспрессирующего эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту иным образом, или имеющего клетки, содержащие эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, находящийся там вследствие предшествующего введения вектора или векторов, кодирующих и экспрессирующих in vivo эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту. Альтернативно этому, два или более элементов, экспрессированных при участии одного или различных регуляторных элементов, могут быть введены в единый вектор, с одним или более дополнительных векторов, обеспечивающих какие-либо компоненты системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, не включенных в первый вектор. Компоненты системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, объединенные в единый вектор, могут быть собраны в любой подходящей ориентации, например, в которой один элемент расположен в восходящем направлении относительно 5'-конца или в нисходящем направлении относительно 3'-конца второго элемента. Кодирующая последовательность одного элемента может быть расположена на той же или противоположной цепи кодирующей последовательности второго элемента и иметь одну и ту же или противоположную ориентацию. В некоторых вариантах осуществления один и тот же промотор контролирует экспрессию транскриптов, кодирующих эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, и направляющую РНК, нацеленную на нуклеиновую кислоту, встроенных в одну или более последовательностей интронов (например, каждая в отдельном интроне, две или более по меньшей мере в одном интроне или все в одном и том же интроне). В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, и нацеливающая на нуклеиновую кислоту направляющая РНК могут быть функционально связаны с или экспрессироваться с одного и того же промотора. Средства доставки, векторы, частицы, наночастицы, составы и их компоненты для экспрессии одного или более элементов системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, используются в вышеупомянутых документах, в частности, в WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667). В некоторых вариантах осуществления вектор содержит одну или более участков вставок, таких как последовательности узнавания эндонуклеаз рестрикции (также называемые "сайтом клонирования"). В некоторых вариантах осуществления один или более участков вставок (например, примерно или более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более участков вставок) расположены в восходящем и/или нисходящем направлении относительно одной или более элементов последовательностей одного или более векторов. В некоторых вариантах осуществления вектор включает два или более участков вставок, что делает возможным введение в качестве вставок направляющих последовательностей в каждый участок. При такой организации две или более направляющих последовательностей могут включать две или более копий единичной направляющей последовательности, две или более различных направляющих последовательностей или их комбинацию. При использовании множества различных направляющих последовательностей единственная конструкция экспрессии может быть использована для нацеливания активности связывания нуклеиновых кислот на множественно различных соответствующих последовательностей-мишеней в клетке. К примеру, единственный вектор может включать примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более направляющих последовательностей. В некоторых вариантах осуществления, может быть предоставлено примерно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более таких содержащих направляющую последовательность векторов, и необязательно они также могут быть доставлены в клетку. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью. Эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту или направляющая РНК или направляющие РНК, нацеливающие на нуклеиновую кислоту, могут быть доставлены независимо; предпочтительно, чтобы по меньшей мере один(одна) из них был(а) доставлен(а) посредством комплекса частиц или наночастиц. мРНК эффекторного белка, нацеленного на нуклеиновую кислоту, может быть доставлена прежде направляющей РНК, нацеливающей на нуклеиновую кислоту, для того, чтобы обеспечить время для экспрессии эффекторного белка, нацеленного на нуклеиновую кислоту. мРНК эффекторного белка, нацеленного на нуклеиновую кислоту, может быть введена на 1-12 часов (предпочтительно примерно 2-6 часов) раньше введения направляющей РНК, нацеливающей на нуклеиновую кислоту. Альтернативно этому, мРНК нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка и направляющая РНК, нацеливающая на нуклеиновую кислоту, могут быть введены одновременно. Предпочтительно, когда вторая усиливающая доза направляющей РНК вводится на протяжении 1-12 часов (предпочтительно примерно 2-6 часов) после начального введения мРНК нацеленного нуклеиновую кислоту эффекторного белка+направляющей РНК. Дополнительные введения нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка могут оказаться полезными, чтобы достичь наиболее эффективных уровней модификации генома и/или транскриптома.

[503] В одном аспекте изобретение относится к способам использования одного или более компонентов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту. Такой нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс по изобретению обеспечивает эффективный инструмент модификации ДНК- или РНК-мишени, являющейся одно- или двухцепочечной, линейной или суперспирализованной. Такой нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс по изобретению имеет разнообразные преимущества, включая модификацию (например, удаление, вставка, перемещение, инактивация, активация) ДНК- или РНК-мишени в множестве типов клеток. Как таковой нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс по изобретению имеет широкий спектр применений, например, в генной терапии, фармакологическом скрининге, диагностике заболеваний и их прогнозировании. Иллюстративный нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс включает нацеленный на ДНК или РНК эффекторный белок в комплексе с направляющей РНК, гибридизованной с последовательностью-мишенью в представляющем интерес локусе-мишени.

[504] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу расщепления РНК-мишени. Данный способ может включать модификацию РНК-мишени с использованием нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса, который связывает РНК-мишень и осуществляет расщепление указанной РНК-мишени. В одном из вариантов осуществления нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс по изобретению при введении в клетку может вносить разрыв (например, одноцепочечный или двухцепочечный разрыв) в последовательность РНК. Например, такой способ может быть использован для расщепления связанной с заболеванием РНК в клетке. Например, экзогенная РНК-матрица, включающая последовательность, которую необходимо встроить, фланкированная вышележащей последовательностью и нижележащей последовательностью, может быть введена в клетку. Такие вышележащие и нижележащие последовательности характеризуются сходством последовательности с обоими концами участка встраивания в РНК. При желании, донорная РНК может представлять собой мРНК. Экзогенная РНК-матрица содержит последовательность, которую необходимо встроить (например, мутированную РНК). Последовательность для встраивания может представлять собой последовательность, эндогенную или экзогенную для клетки. Примерами последовательностей для встраивания являются кодирующая белок РНК или некодирующая РНК (например, микроРНК). Таким образом, последовательность для встраивания может быть функционально связана с надлежащей последовательностью или последовательностями контроля. Альтернативно, встраиваемая последовательность может выполнять регуляторную функцию. Вышележащие и нижележащие последовательности в экзогенной РНК выбирают так, чтобы стимулировать рекомбинацию между РНК-мишенью и донорной РНК. Вышележащая последовательность является последовательностью РНК, имеющей сходство последовательности с последовательностью РНК в восходящем направлении от целевого участка интеграции. Сходным образом, нижележащая последовательность является последовательностью РНК, имеющей сходство последовательности с последовательностью РНК в нисходящем направлении от целевого участка интеграции. Вышележащая и нижележащая последовательности в экзогенной РНК-матрице могут иметь 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичность последовательности с последовательностью РНК-мишени. Предпочтительно, чтобы вышележащая и нижележащая последовательности в экзогенной РНК-матрице имели примерно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с последовательностью РНК-мишени. В некоторых способах вышележащая и нижележащая последовательности экзогенной РНК-матрицы имеют 99% или 100% идентичность последовательности с последовательности РНК-мишени. Вышележащие или нижележащие последовательности могут содержать от примерно 20 п.н. до примерно 2500 п.н., например, примерно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 или 2500 п.н. В некоторых способах иллюстративная вышележащая или нижележащая последовательность имеет от примерно 200 п.н. до примерно 2000 п.н., от примерно 600 п.н. до примерно 1000 п.н. или более конкретно от примерно 700 п.н. до примерно 1000 п.н. В некоторых способах экзогенная РНК-матрица может дополнительно содержать маркер. Такой маркер может облегчить скрининг целевых встраиваний. Примеры подходящих маркеров включают участки рестрикции, флуоресцентные белки или метки, по которым возможен отбор. Экзогенная РНК-матрица по изобретению может быть получена с помощью рекомбинантных способов (см., например, Sambrook et al., 2001 и Ausubel et al., 1996). Согласно способу модификации РНК-мишени путем встраивания экзогенной РНК-мишени разрыв (например, двухцепочечный или одноцепочечный разрыва в одноцепочечной или двухцепочечной ДНК или РНК) вносится в последовательность ДНК или РНК нацеленным на нуклеиновую кислоту комплексом, причем такой разрыв репарируется за счет гомологичной рекомбинации с экзогенной РНК-матрицы таким образом, что матрица оказывается встроенной в РНК-мишень. Присутствие двухцепочечного разрыва облегчает встраивание матрицы. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу модификации экспрессии РНК в эукариотической клетке. Такой способ включает увеличение или уменьшение экспрессии полинуклеотида-мишени путем использования нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса, связывающего ДНК или РНК (например, мРНК или пре-мРНК). В некоторых способах РНК-мишень может быть инактивирована для того, чтобы влиять на модификацию экспрессии в клетке. Например, при связывании нацеленного на РНК комплекса с последовательностью-мишенью в клетке РНК-мишень инактивируется так, что такая последовательность не транслируется, кодируемый ей белок не образуется или такая последовательность не функционирует так, как последовательность дикого типа. Например, белок, или транскрипты микроРНК или пре-микроРНК не образуются. РНК-мишень нацеленного на РНК комплекса может представлять собой любую РНК, эндогенную или экзогенную для данной эукариотической клетки. Например, РНК-мишень может представлять собой РНК, находящуюся в ядре эукариотической клетки. РНК-мишень может представлять собой последовательность (например, мРНК или пре-мРНК), кодирующую генный продукт (например, белок) или некодирующую последовательность (например, нкРНК, lnc-РНК, тРНК или рРНК). Примеры РНК-мишени включают последовательность, ассоциированную с сигнальными биохимическими путями, например, ассоциированную с сигнальными биохимическими путями РНК. Примеры РНК-мишени включают РНК, ассоциированные с заболеваниями. "Ассоциированные с заболеваниями" РНК обозначает любые РНК, используемые для синтеза продуктов трансляции на аномальном уровне или в аномальной форме в клетках, полученных из затронутых заболеванием тканей в сравнении с тканями или клетками не затронутого заболеванием контроля. Это может быть РНК, транскрибированная с гена, которая экспрессируется на аномально высоком уровне; это может быть РНК, транскрибированная с гена, который экспрессируется на аномально низком уровне, причем измененная экспрессия коррелирует с появлением и/или прогрессированием заболевания. Ассоциированные с заболеванием РНК также упоминают как РНК, транскрибированные с гена, несущего мутацию(и) или генетическую вариацию, которые напрямую ответственны или связаны с неравновесностью сцепления с геном(ами), который(ые) вовлечен в этиологию заболевания. Продукт трансляции может быть известен или не известен и его количество может иметь нормальный или аномальный уровень. РНК-мишень нацеленного на РНК комплекса может представлять собой любую РНК, эндогенную или экзогенную для такой эукариотической клетки. Например, РНК-мишень нацеленного на РНК комплекса может представлять собой РНК, находящуюся в ядре эукариотической клетки. Такая РНК-мишень может быть последовательностью (например, мРНК или пре-мРНК), кодирующей продукт гена (например, белок) или некодирующей последовательностью (например, нкРНК, lnc-РНК, тРНК или рРНК).

[505] В некоторых вариантах осуществления изобретения способ может позволять нацеленному на нуклеиновую кислоту комплексу связываться с ДНК- или РНК-мишенью, чтобы произвести расщепление указанной ДНК- или РНК-мишени, таким образом, изменяя ДНК- или РНК-мишень, где нацеленный на нуклеиновые кислоты комплекс включает нацеленный на нуклеиновые кислоты эффекторный белок в комплексе с направляющей РНК, гибридизованной с последовательностью-мишенью в указанной ДНК- или РНК-мишени. В одном аспекте изобретение относится к способу модификации экспрессии ДНК или РНК в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ позволяет нацеленному на нуклеиновые кислоты комплексу связываться с ДНК или РНК, таким образом, что указанное связывание приводит к увеличению или уменьшению экспрессии указанной ДНК или РНК; где нацеленный на нуклеиновые кислоты комплекс включает нацеленный на нуклеиновые кислоты эффекторный белок в комплексе с направляющей РНК. Применимы соображения и условия, сходные с теми, что указаны выше для способов модификации ДНК- или РНК-мишени. В действительности, варианты взятия образцов, культивирования и повторного введения применяются во многих аспектах настоящего изобретения. В одном аспекте изобретение относится к способам модификации ДНК- или РНК-мишени в эукариотической клетке, которая может происходить in vivo, ex vivo или in vitro. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает взятие клетки или популяции клеток у человека или животного, не являющегося человеком, и модификацию этой клетки или клеток. Культивирование ex vivo может происходить на любой стадии. Клетка или клетки могут быть повторно введены в животное, не являющееся человеком, или растение. Для повторно введенных клеток особо предпочтительно, чтобы эти клетки являлись стволовыми клетками.

[506] Действительно, в любом аспекте изобретения нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс может включать нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок в комплексе с направляющей РНК, которая гибридизованной с последовательностью-мишенью.

[507] Изобретение относится к инженерии и оптимизации систем, способов и композиций, используемых для контроля экспрессии генов, включающим нацеливание на последовательности ДНК и РНК, которые связаны с нацеленной на нуклеиновые кислоты системой и ее компонентами. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения эффекторным белком (ферментом) является белок типа VI, такой как C2c2. Преимущество способов по настоящему изобретению состоит в том, что система CRISPR минимизирует или избегает неспецифического связывания и его побочных эффектов. Эта система достигается с использованием систем, организованных так, что они имеют высокую степень специфичности к ДНК- или РНК-мишени.

[508] Что касается нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса или системы, предпочтительно, чтобы tracr-последовательность имела одну или более шпилек и составляла 30 или более нуклеотидов в длину, 40 или более нуклеотидов в длину или 50 или более нуклеотидов в длину; длина последовательности cr-РНК варьировалась между 10 и 30 нуклеотидами, а нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок принадлежал к эффекторным белкам типа VI.

[509] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может представлять собой C2c2p Listeria sp., предпочтительно C2c2p Listeria seeligeria, более предпочтительно C2c2p Listeria seeligeria серовара 1/2b штамма SLCC3954, и последовательность cr-РНК может составлять 44-47 нуклеотидов в длину с прямыми повторами (DR) на 5'-конце длиной 29 нуклеотидов и спейсером длиной от 15 нуклеотидов до 18 нуклеотидов.

[510] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может представлять собой C2c2p Leptotrichia sp., предпочтительно C2c2p Leptotrichia shahii, более предпочтительно C2c2p Leptotrichia shahii DSM 19757, и последовательность cr-РНК может составлять 42-58 нуклеотидов в длину с прямым повтором на 5'-конце длиной по меньшей мере 24 нуклеотидов, таким как прямой повтор (DR) на 5'-конце длиной 24-28 нуклеотидов, и спейсер длиной по меньшей мере 14 нуклеотидов, такой как от 14 нуклеотидов до 28 нуклеотидов, или по меньшей мере 18 нуклеотидов, такой как 19, 20, 21, 22 или более нуклеотидов, такой как 18-28, 19-28, 20-28, 21-28 или 22-28 нуклеотидов.

[511] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может относиться к эффекторным белкам локусов типа VI, более конкретно C2c2p, последовательность cr-РНК может иметь длину 36-63 нуклеотидов, предпочтительно от 37 нуклеотидов до 62 нуклеотидов или от 38 нуклеотидов до 61 нуклеотидов или от 39 нуклеотидов до 60 нуклеотидов, более предпочтительно от 40 нуклеотидов до 59 нуклеотидов или от 41 нуклеотидов до 58 нуклеотидов, наиболее предпочтительно от 42 нуклеотидов до 57 нуклеотидов. Например, cr-РНК может включать, по существу состоять из или состоять из прямого повтора (DR), предпочтительно на 5'-конце длиной от 26 нуклеотидов до 31 нуклеотидов, предпочтительно от 27 нуклеотидов до 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно 28 нуклеотидов или 29 нуклеотидов в длину или по меньшей мере 28 или 29 нуклеотидов в длину, и спейсера длиной от 10 нуклеотидов до 32 нуклеотидов, предпочтительно от 11 нуклеотидов до 31 нуклеотидов, более предпочтительно от 12 нуклеотидов до 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 13 нуклеотидов до 29 нуклеотидов, и наиболее предпочтительно от 14 нуклеотидов до 28 нуклеотидов, например 18-28 нуклеотидов, 19-28 нуклеотидов, 20-28 нуклеотидов, 21-28 нуклеотидов или 22-28 нуклеотидов.

[512] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может относиться к эффекторным белкам локусов типа VI, более конкретно C2c2p, и последовательность tracr-РНК может иметь длину по меньшей мере 60 нуклеотидов, такую как по меньшей мере 65 нуклеотидов или по меньшей мере 70 нуклеотидов, такую как от 60 нуклеотидов до 70 нуклеотидов, или от 60 нуклеотидов до 70 нуклеотидов, или от 70 нуклеотидов до 80 нуклеотидов, или от 80 нуклеотидов до 90 нуклеотидов, или от 90 нуклеотидов до 100 нуклеотидов, или от 100 нуклеотидов до 110 нуклеотидов, или от 110 нуклеотидов до 120 нуклеотидов, или от 120 нуклеотидов до 130 нуклеотидов, или от 130 нуклеотидов до 140 нуклеотидов, или от 140 нуклеотидов до 150 нуклеотидов, или больше, чем 150 нуклеотидов. См. иллюстративные примеры на фиг. 22-37.

[513] В определенных вариантах осуществления изобретения эффекторный белок может относиться к эффекторным белкам локусов типа VI, более конкретно C2c2p, поэтому tracr-РНК для расщепления может не требоваться.

[514] Использование двух различных аптамеров (каждый ассоциирован с отдельной нацеливающей на нуклеиновую кислоту направляющей РНК) позволяет использование слитых слитой конструкции активатор-адаптерный белок и слитых конструкций репрессор-адаптерный белок с различными нацеливающими на нуклеиновые кислоты направляющими РНК, для активации экспрессии только одной ДНК или РНК, подавляя другую. Их, наряду с их различными направляющими РНК можно вводить совместно, или по существу совместно, в мультиплексном подходе. Большое количество таких модифицированных нацеленных на нуклеиновые кислоты направляющих РНК может использоваться одновременно, например 10 или 20 или 30 и т.д., в то время как только одна (или по меньшей мере минимальное число) молекула эффекторного белка должна быть доставлена, так как сравнительно небольшое количество молекул эффекторного белка может использоваться с большим количеством модифицированных направляющих молекул. Адаптерный белок может быть ассоциирован (предпочтительно связан или слит с) одним или более активаторами или одним или более репрессорами. Например, адаптерный белок может быть ассоциирован с первым и вторым активаторами. Первый и второй активаторы могут быть одинаковыми, но предпочтительно они являются различными активаторами. Можно использовать три и более или даже четыре и более активатора (или репрессора), однако допустимый размер упаковки ограничивает их число 5 различными функциональными доменами. Использование линкеров является предпочтительным над прямым слиянием с адаптерным белком, где два или больше функциональных домена ассоциированы с адаптерным белком. Подходящие линкеры могут включать линкер GlySer.

[515] Также предусматривается, что нацеленный на нуклеиновые кислоты комплекс эффекторного белка и направляющей РНК в целом может быть ассоциирован с двумя или более функциональными доменами. Например, может быть два или более функциональных домена, связанных с нацеленным на нуклеиновые кислоты эффекторным белком, или может быть два или более функциональных домена, связанных с направляющей РНК (через один или более адаптерных белков), или может быть один или более функциональных доменов, связанных с нацеленным на нуклеиновые кислоты эффекторным белком, и один или более функциональных доменов, связанных с направляющей РНК (посредством одного или более адаптерных белков).

[516] Слитая конструкция адаптерного белка и активатора или репрессора может включать линкер. Например, могут использоваться линкеры GlySer GGGS. Они могут использоваться в повторах по 3 ((GGGGS)₃) или 6, 9 или даже 12 или более, чтобы обеспечить подходящие длину, как требуется. Линкеры могут использоваться между направляющими РНК и функциональным доменом (активатор или репрессор), или между нацеленным на нуклеиновые кислоты эффекторным белком и функциональным доменом (активатор или репрессор). Линкеры используют для придания белку необходимой "механической гибкости".

[517] Изобретение охватывает нацеленный на нуклеиновую кислоту комплекс, включающий нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок и направляющую РНК, где нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок включает по меньшей мере одну мутацию, такую, что у нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas есть не более 5% активности нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas, не имеющего по меньшей мере одной мутации и необязательно по меньшей мере одну или более последовательностей ядерной локализации; направляющая РНК включает последовательность направляющей молекулы, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в представляющей интерес РНК в клетке; и где нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок ассоциирован с двумя или более функциональными доменами, или по меньшей мере одна шпилечная структура направляющей РНК изменена вставкой отдельной последовательности (последовательностей) РНК, которая связана с одним или более адаптерными белками, и где адаптерный белок связан с двумя или более функциональными доменами; или нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок ассоциирован с одним или более функциональными доменами, и по меньшей мере одна шпилечная структура направляющей РНК изменена вставкой отдельной последовательности (последовательностей) РНК, которая связана с одним или более адаптерными белками, и где адаптерный белок связан с одним или более функциональными доменами.

Общая характеристика доставки

Комплексы эффекторного белка C2c2 могут доставлять функциональные эффекторы

[518] В отличие от опосредованного CRISPR-Cas генного нокаута, который устраняет экспрессию перманентно, внося в ген мутации на уровне ДНК, нокдаун CRISPR-Cas позволяет временно сократить экспрессию генов с помощью искусственной транскрипции или факторов трансляции. Мутация ключевых остатков в доменах расщепления как ДНК, так и РНК, в белке C2c2 приводит к созданию каталитически неактивного C2c2. Каталитически неактивный C2c2 образует комплекс с направляющей РНК и локализуется в последовательности ДНК или РНК, определяемой доменом нацеливания этой направляющей РНК, однако, он не расщепляет ДНК- или РНК-мишень. Слияние неактивного белка C2c2 с эффекторным доменом, например, доменом репрессии транскрипции или трансляции, позволяет привлекать эффектор к любому участку ДНК или РНК, определяемому направляющей РНК. В определенных вариантах осуществления изобретения C2c2 может быть слит с доменом репрессии транскрипции и привлечен в область промотора гена. В частности, для генной репрессии предусматривается, что сайта связывания эндогенного фактора транскрипции может снизить экспрессию генов. В другом варианте осуществления изобретения неактивный C2c2 может быть слит с белком модификации хроматина. Изменение состояния хроматина может привести к уменьшению экспрессии гена-мишени. В следующих вариантах осуществления изобретения C2c2 может быть слит с доменом репрессии трансляции.

[519] В одном варианте осуществления изобретения молекулу направляющей РНК можно нацеливать на известные элементы ответа транскрипции (например, промоторы, энхансеры и т.д.), известные вышележащие активирующие последовательности и/или последовательности неизвестной или известной функции, которые могут иметь способность управлять экспрессией ДНК-мишени.

[520] В некоторых способах полинуклеотид-мишень может быть инактивирован для модификации экспрессии в клетке. Например, после связывания комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью в клетке, целевой полинуклеотид инактивируется таким образом, что последовательность не транскрибируется, закодированный белок не синтезируется, или последовательность не функционирует, в отличие от последовательности дикого типа. Например, последовательности, кодирующие белок или микроРНК, могут быть инактивированы таким образом, что белок не синтезируется. В некоторых способах полинуклеотид-мишень может быть инактивирован, чтобы произвести модификацию экспрессии в клетке. Например, после связывания CRISPR комплекса с последовательностью РНК-мишени в клетке, полинуклеотид-мишень инактивируется таким образом, что последовательность не транслируется, влияя на уровень экспрессии белка в клетке.

[521] В конкретных вариантах осуществления изобретения фермент CRISPR содержит одну или более мутаций, отобранных из группы, состоящей из R597A, H602A, R1278A и H1283A, и/или одну или более мутаций, находящихся в домене HEPN фермента CRISPR, или иную мутацию, описанную в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения фермента CRISPR имеет одну или более мутаций в каталитическом домене, где во время транскрипции последовательность прямого повтора формирует единственную шпилечную структуру и направляющая последовательность руководит специфическим для последовательности связыванием комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью, и где фермент далее включает функциональный домен. В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональный домен представляет собой a. В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональный домен представляет собой домен репрессии транскрипции, предпочтительно KRAB. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен репрессии транскрипции представлен SID или конкатемерами SID (например, SID4X), В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональный домен является эпигенетическим доменом модификации, обеспечивающим работу эпигенетического фермента модификации. В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональный домен является доменом активации, который может быть доменом активации P65.

Доставка комплекса эффекторного белка C2c2 или его компонентов

[522] В настоящем описании, а также из уровня техники, предусматривается, что TALE-нуклеазы, системы CRISPR-Cas или их компоненты, или их молекулы нуклеиновых кислот, или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие или доставляющие их компоненты, могут быть доставлены системой доставки, описанной в настоящем описании как в общем виде, так и более подробно.

[523] Векторная доставка, например, плазмидная, вирусная доставка: фермент CRISPR, например белок типа V, такой как C2c2, и/или любая из РНК по настоящему изобретению, например направляющая РНК, могут быть доставлены с использованием любого подходящего вектора, например, плазмидных или вирусных векторов, таких как аденоассоциированный вирус (AAV), лентивирус, аденовирус или другие типы вирусных векторов или их комбинации. Эффекторные белки и одна или более направляющих РНК могут быть упакованы в один или более векторов, например, плазмидные или вирусные векторы. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор, например, плазмидный или вирусный вектор, доставляется в целевую ткань, например, путем внутримышечной инъекции, в то время как в других случаях доставка осуществляется внутривенно, трансдермально, интраназально, перорально, через слизистые оболочки или другими способами доставки. Такая доставка может быть в виде единичной дозы либо в виде нескольких доз. Специалисту в данной области понятно, что фактическая дозировка, которая должна быть доставлена, может значительно варьироваться в зависимости от ряда факторов, таких как выбор вектора, тип клетки-мишени, самого организма или ткани, общее состояние пациента, желаемая степень трансформации/модификации, способ введения, режим введения, тип желаемой трансформации/модификации и т.д.

[524] Такой препарат может в дальнейшем включать, например, носитель (в составе которого вода, водный раствор хлорида натрия, этанол, глицерин, лактоза, сахароза, фосфат кальция, желатин, декстран, агар, пектин, арахисовое масло, кунжутное масло и т.д.), растворитель, применяемый в фармакологии носитель (например, фосфатный солевой буфер), применяемый в фармакологии наполнитель и/или другие соединения, известные в данной области. Препарат, кроме того, может содержать одну или более применяемых в фармакологии солей, например, таких как соль неорганической кислоты, такая как гидрохлорид, гидробромид, фосфат, сульфат и т.д., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.д. Кроме того, также использоваться могут вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие, буферные растворы, гели или гелеобразователи, вкусовые добавки, красители, микросферы, полимеры, вещества, образующие суспензии и т.д. Кроме того, один или более других стандартно применяемых фармацевтических добавок, таких как консерванты, влагоудерживающие добавки, суспенизирующие добавки, поверхностно-активные добавки, антиоксиданты, противослеживающие добавки, наполнители, хелатирующие добавки, вещества оболочки, химические стабилизаторы и т.д. могут также быть использованы, особенно если дозировка имеет разбавленную форму. Подходящие иллюстративные компоненты включают микрокристаллическую целлюлозу, натрий карбокисметилцеллюлозу, полисорбат 80, фенилэтиловый спирт, хлорбутанол, сорбат калия, сорбиновую кислоту, двуокись серы, пропилгаллат, парабены, этилванилин, глицерин, фенол, парахлорофенол, желатин, альбумин и их комбинацию. Полное обсуждение применяемых в фармакологии наполнителей доступно в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub, Co., N.J. 1991), который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

[525] В одном варианте осуществления изобретения, описанном в настоящем описании, доставка осуществляется с помощью аденовируса, который может быть доставлен в виде единичной вспомогательной дозы, содержащей по меньшей мере 1×10⁵ частиц (также называемых единицами частиц, еч) аденовирусного вектора. В одном варианте осуществления изобретения настоящего изобетения, предпочтительная доза составляет по меньшей мере приблизительно 1×10⁶ частиц (например, приблизительно 1×10⁶-1×10¹² частиц), более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1×10⁷ частиц, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1×10⁸ частиц (например, приблизительно 1×10⁸-1×10¹¹ частиц или приблизительно 1×10⁸-1×10¹² частиц), и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1×10⁹ частиц (например, приблизительно 1×10⁹-1×10¹⁰ частиц или приблизительно 1×10⁹-1×10¹² частиц), или даже по меньшей мере приблизительно 1×10¹⁰ частиц (например, приблизительно 1×10¹⁰-1×10¹² частиц) аденовирусного вектора. Альтернативно, доза включает не больше чем приблизительно 1×10¹⁴ частиц, предпочтительно не больше чем приблизительно 1×10¹³ частиц, еще более предпочтительно не больше чем приблизительно 1×10¹² частиц, еще более предпочтительно не больше чем приблизительно 1×10¹¹ частиц, и наиболее предпочтительно не больше чем приблизительно 1×10¹⁰ частиц (например, не больше чем приблизительно 1×10⁹ частиц). Таким образом, доза может содержать единственную дозу аденовирусного вектора, например, с приблизительно 1×10⁶ единиц частиц (еч), приблизительно 2×10⁶ еч, приблизительно 4×10⁶ еч, 1×10⁷ еч, приблизительно 2×10⁷ еч, приблизительно 4×10⁷ еч, приблизительно 1×10⁸ еч, приблизительно 2×10⁸ еч, приблизительно 4×10⁸ еч, приблизительно 1×10⁹ еч, приблизительно 2×10⁹ еч, приблизительно 4×10⁹ еч, приблизительно 1×10¹⁰ еч, приблизительно 2×10¹⁰ еч, приблизительно 4×10¹⁰ еч, приблизительно 1×10¹¹ еч, приблизительно 2×10¹¹ еч, приблизительно 4×10¹¹ еч, приблизительно 1×10¹² еч, приблизительно 2×10¹² еч или приблизительно 4×10¹² еч аденовирусного вектора. См., например, аденовирусные векторы в заявке на патент США №8454972, B2 Nabel, et al., поданной 4 июня 2013 года, включенной в настоящее описание в качестве ссылки, и в ее колонке 29, строки 36-58. В одном варианте осуществления изобретения, описанном в настоящем описании, аденовирус доставляется посредством нескольких доз.

[526] В описанном в настоящем описании варианте осуществления изобретения доставка осуществляется через AAV. Терапевтически эффективная дозировка для in vivo доставки AAV человеку, как полагают, находится в диапазоне от приблизительно 20 приблизительно до 50 мл солевого раствора, содержащего от приблизительно 1×10¹⁰ до приблизительно 1×10¹⁰ раствора функционального AAV/мл. Дозировка может быть скорректирована для уравновешивания терапевтического эффекта и каких-либо побочных эффектов. В одном варианте осуществления изобретения, описанном в настоящем описнии, доза AAV обычно находится в следующем диапазоне концентраций: от приблизительно 1×10⁵ до 1×10⁵⁰ геномов AAV, от приблизительно 1×10⁸ до 1×10²⁰ геномов AAV, от приблизительно 1×10¹⁰ до приблизительно 1×10¹⁶ геномов или от приблизительно 1×10¹¹ до приблизительно 1×10¹⁶ геномов AAV. Дозировка для человека может составлять приблизительно 1×10¹⁶ геномов AAV. В таких концентрациях можно доставить от приблизительно 0,001 мл до приблизительно 100 мл, от приблизительно 0,05 до приблизительно 50 мл или от приблизительно 10 до приблизительно 25 мл раствора-носителя. Другие эффективные дозировки могут быть легко определены квалифицированным специалистом в данной области посредством стандартных испытаний, на основе которых строится кривая зависимости ответа от дозы. См., например, заявку на патент США №8404658 B2 Hajjar, et al., поданную 26 марта 2013 года, колонка 27, строки 45-60.

[527] В одном варианте осуществления изобретения, описанном в настоящем описании, доставка производится через плазмиду. В случае таких плазмидных конструкций их дозировка должна быть достаточной для того, чтобы вызвать ответ. Например, подходящее количество ДНК-плазмиды в конструкциях плазмиды может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мг, или от приблизительно 1 пг до приблизительно 10 пг на человека массой 70 кг. Плазмиды по изобретению обычно включают (i) промотор: (ii) последовательность, кодирующую нацеленный на нуклеиновую кислоту фермент CRISPR, функционально связанный с указанным промотором; (iii) селективный маркер; (iv) ориджин репликации; и (v) терминатор транскрипции, находящийся ниже и функционально связанный с (ii). Плазмида может также кодировать РНК-компоненты комплекса CRISPR, но один или более из них может кодироваться другим вектором.

[528] Дозы, описанные в настоящем описании, основаны на средней массе человека, равной 70 кг. Определение частоты введения входит в компетенции практикующего медицинского или ветеринарного специалиста (например, врач, ветеринар) или ученого-специалиста в данной области. Также отмечается, что мыши, используемые в экспериментах, как правило, имеют массу приблизительно 20 г, и результаты экспериментов на мышах могут быть экстраполированы на индивида массой 70 кг.

[529] В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулы РНК по изобретению доставляют в составе липосом или в составе, содержащим липофектин и т.п. и могут быть получены с помощью способов, известных специалисту в данной области. Такие способы описаны, например, в патентах США №5593972, 5589466 и 5580859, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Системы доставки для на усиленной и улучшенной доставки миРНК в клетки млекопитающих были разработаны (см., например, Shen et al. FEBS Let. 2003, 539:111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-1010; Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210-216; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003, 327: 761-766; Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107-108 и Simeoni et al., NAR 2003, 31, 11: 2717-2724) и могут быть использованы в рамках настоящего изобретения. Недавно миРНК была успешно использована для ингибирования экспрессии генов у приматов (см., например, Tolentino et al., Retina 24(4):660) и может также быть применена в рамках настоящего изобретения.

[530] Действительно, РНК-доставка является эффективным способом для доставки in vivo. Возможно доставить нацеленный на нуклеиновую кислоту Cas, белок Cas9 и направляющую РНК - гРНК (и, например, матрицу для репарации HR) в клетки с использованием липосом или частиц. Таким образом, доставка нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas/ фермента CRISPR, такого как Cas-белок Cas9 и/или доставка направляющих РНК по изобретения может производится в форме РНК с использованием микровезикул, липосом или частиц. Например, мРНК Cas и направляющая РНК могут быть упакованы в липосомальные частицы для доставки in vivo. Липосомальные реактивы для трансфекции, такие как липофектамин производства Life Technologies и другие реактивы, доступные на рынке, могут эффективно доставить молекулы РНК в печень.

[531] Предпочтительно, чтобы средства доставки РНК также включали доставку РНК через наночастицы (Cho, S, Goldberg, M, Son, S, Xu, Q, Yang, F, Mei, Y, Bogatyrev, S, Langer, R, and Anderson, D, Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery to endothelial cells, Advanced Functional Materials, 19; 3112-3118, 2010) или экзосомы (Schroeder, A, Levins, C, Cortez, C, Langer, R, and Anderson, D, Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21, 2010, PMID: 20059641). Действительно, экзосомы, как показано, особенно полезны при доставке миРНК, системы, обладающей некоторым сходством с системой нацеливания на РНК. Например, El-Andaloussi S et al. ("Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo Nat Protoc. 2012 Dec;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131. Epub 2012 Nov 15.) описали, что экзосомы являются многообещающим инструментом доставки лекарственных средств через различные биологические барьеры и могут использоваться для доставки миРНК in vitro и in vivo. Данный подход состоит в производстве экзосом-мишеней посредством трансфекции вектора экспрессии, включающего экзосомный белок, слитый с лигандом-пептидом. Экзосомы далее проходят очистку и для отделения от клеточного супернатанта, далее РНК загружают в экзосомы. Доставка или введение согласно изобретению могут быть произведены с применением экзосом, к примеру, но не ограничиваясь этим, в мозг. Витамин Е (α-токоферол) может быть связан с нацеленным на нуклеиновую кислоту белком Cas и доставлен в мозг вместе с липопротеином высокой плотности (HDL), например, аналогично тому, как это было сделано Uno et al. (HUMAN GENE THERAPY 22:711-719 (June 2011)) для доставки милой интерферирующей РНК (миРНК)) в мозг. Мышам проводились вливание с применением осмотического микронасоса (модель 1007D; Alzet, Cupertino, Калифорния, США) фосфатного солевого буфера (PBS) или свободных TocsiBACE или Toc-siBACE/HDL и подсоединяли к набору для вливаний в мозг (Brain Infusion Kit 3, Alzet). Используемая для вливаний в мозг канюля помещалась примерно на 0,5 мм позади брегмы по центральной линии для вливания в третий дорзальный желудочек. Uno et al. установили, что не более 3 нмоль Toc-siRNA с HDL могут вызывать целевое уменьшение в степени, сравнимой с таковой при применении интракраниального способа введения (ICV). Сходная дозировка нацеленного на нуклеиновые кислоты эффекторного белка, конъюгированного с α-токоферолом и введенного совместно с нацеленным на мозг HDL, предполагается для человека в рамках настоящего изобретения, например, может предполагаться от примерно 3 нмоль до примерно 3 мкмоль нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка, нацеленного в мозг. Zou et al. (HUMAN GENE THERAPY 22:465-475 (April 2011)) описывают способ опосредованной лентивирусом доставки кшРНК, нацеленной на PKCγ для подавления экспрессии генов in vivo в спинном мозге крыс. Zou et all. вводили примерно 10 мкл рекомбинантного лентивируса, имеющего титр 1×10⁹ трансдуцирующих частиц (тч)/мл, через интратекальный катетер. Сходная дозировка нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка, экспрессированного с лентивирусного вектора, нацеленного в мозг, также может предполагаться в рамках настоящего изобретения, например, также предполагается примерно 10-50 мл нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка, направленного в мозг, с титром лентивируса 1×10⁹ трансдуцирующих частиц (тч)/мл.

[532] В отношении локальной доставки в мозг, возможны различные ее пути. Например, материал может быть доставлен в стриатум, например, путем инъекции. Инъекция может быть произведена стереотактически при трепанации черепа.

[533] Повышение эффективности NHEJ или HR также является полезным для такой доставки. Предпочтительно, чтобы эффективность NHEJ была усилена одновременно экспрессируемыми ферментами процессинга концов, такими как Trex2 (Dumitrache et al. Genetics. 2011 August: 188(4): 787-797). Предпочтительно, чтобы эффективность HR была увеличена временным ингибированием машинерией NHEJ, в частности, Ku70 и Ku86. Эффективность HR может также быть увеличена путем одновременной экспрессии прокариотических или эукариотических ферментов рекомбинации, таких как RecBCD, RecA.

Общая характеристика Упаковки и Промоторов

[534] Способы упаковки молекул нуклеиновых кислот, кодирующих нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок (такой как белок типа V, например C2c2), например, ДНК, в векторы, например, вирусные векторы, для опосредования модификации генома in vivo включают:

Для достижения опосредованного NHEJ нокаута гена:

Вектор на основе одного вируса:

Вектор, содержащий две или более кассет экспрессии:

Промотор-направляющая РНК-терминатор

Промотор-направляющая РНК (N-конец)-терминатор (до предела размера вектора)

Двойной вирусный вектор:

Вектор 1, содержащий одну экпрессирующую кассету для управления экспрессией нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка (такого как белок типа V, например, C2c2)

Промотор-молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок-терминатор

Вектор 2, содержащий одну или более экспрессирующих кассет для управления экспрессией одной или более направляющей(их) РНК

Промотор-направляющая РНК 1-терминатор

Промотор-направляющая РНК 1 (N-конец)-терминатор (до предела длины вектора)

Для опосредования гомологичной репарации.

В дополнение к подходам с одиночным и двойными векторами, дополнительный вектор используется для доставки матрицы репарации на основе гомологии.

[535] Промотор, используемый для управления экспрессией нуклеиновой кислоты, нацеленной на нуклеиновую кислоту эффекторным белком (таким как белок типа V, такой как C2c2) может включать:

ITR AAV может выступать в качестве промотора: это предпочтительно для того, чтобы избавиться от дополнительного промоторного элемента (который занимает место в векторе). Освобожденное в результате этого дополнительное пространство может быть использовано, чтобы управлять экспрессией дополнительных элементов (направляющая РНК и т.д.). Кроме того, активность ITR относительно слабее, так что он может использоваться для уменьшения потенциальной токсичности из-за сверхэкспрессии нацеленного на нуклеиновые кислоты эффекторного белка (такого как белок типа V, такой как C2c2).

Для повсеместной экспрессии можно использовать промоторы: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, тяжелых или легких цепей ферритина, и т.д.

Для экспрессии в мозге или другой экспрессии в ЦНС можно использовать промоторы: промотор синапсина I для всех нейронов, CaMKIIalpha для возбуждающих нейронов, GAD67, GAD65 или VGAT для GABA-ергических нейронов, и т.д.

Для экспрессии в печени можно использовать промотор альбумина.

Для экспрессии в легких можно использовать SP-B.

Для эндотелиальных клеток можно использовать ICAM.

Для гемопоэтических клеток можно использовать IFN-бета или CD45.

Для остеобластов можно использовать OG-2.

[536] Промотор, используемый для нацеливания направляющей РНК, может включать:

промотор РНК-полимеразы III, такой как U6 или H1,

использование промотора РНК-полимеразы II и интронных кассет экспрессии направляющей РНК.

Аденоассоциированный вирус (AAV)

[537] Нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок (такой как белок типа V, такой как C2c2) и одна или более направляющих РНК могут быть доставлены с использованием аденоассоциированного вируса (AAV), лентивируса, аденовируса или других плазмидных или вирусных типов векторов, в частности, с использованием лекарственных форм и доз, приведенных, например, в заявках на патент США №№8454972 (лекарственные формы, дозы для аденовируса), 8404658 (лекарственные формы, дозы для AAV) и 5846946 (лекарственные формы, дозы для ДНК-плазмид) и клинических испытаниях и публикациях на тему клинических испытаний, включающих лентивирус, AAV и аденовирус. Для примера, для AAV способ введения, лекарственная форма и доза приведены в заявке на патент США №8454972 и в клинических испытаниях, включающих AAV. Для аденовируса способ введения, лекарственная форма и доза приведены в заявке на патент США №8404658 и в клинических испытаниях, включающих аденовирус. Для доставки плазмиды способ введения, лекарственная форма и доза приведены в заявке на патент США №5846946 и в клинических испытаниях, включающих плазмиды. Дозы могут быть разработаны на основе среднестатистического человека весом 70 кг (например, взрослого мужчину), и могут быть адаптированы для пациентов, индивидов, млекопитающих различного веса и вида. Частота введения находится в пределах компетенции медицинского или ветеринарного практика (например, врача, ветеринара), в зависимости от обычных факторов включая возраст, пол, общее состояние здоровья, другие состояния пациента или индивида, и конкретное представляющее интерес состояние и симптомы. Вирусные векторы могут быть введены в ткань-мишень. Для специфической для типа клетки модификации генома/транскриптома экспрессия нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка (такого как белок типа V, такой как C2c2) может находиться под контролем специфического для типа клетки промотора. Например, специфическая для печени экспрессия может происходить под контролем промотора альбумина, и специфическая для нейронов экспрессия (например, для нацеливания на расстройства центральной нервной системы) может происходить под контролем промотора синапсина I.

[538] С точки зрения доставки in vivo AAV предпочтительнее других вирусных векторов по двум причинам:

- низкая токсичность (возможно, благодаря способу очистки, не требующему ультрацентрифугирования частей клетки, которые могут вызывать иммунную реакцию), и

- низкая вероятность возникновения инсерционного мутагенеза, потому что AAV не интегрируется в геном хозяина.

[539] Предел упаковывания AAV составляет 4,5 или 4,75 т.п.н. Это означает, что нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок (такой как белок типа V, такой как C2c2), а также промотор и терминатор транскрипции должны быть помещены один и тот же вирусный вектор. Следовательно, варианты осуществления изобретения включают использование гомологов нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка (такого как белок типа V, такого как C2c2), которые короче.

[540] Что касается AAV, то AAV может представлять собой AAV1, AAV2, AAV5 или любую комбинацию. Можно выбрать AAV, исходя из клеток, на которые проводят нацеливание; например, можно выбрать серотипы AAV 1, 2, 5 или AAV1, AAV2, AAV5 с гибридным капсидом или любую их комбинацию для нацеливания в клетки головного мозга или нейроны; можно выбрать AAV4 для нацеливания в сердечную ткань, AAV8 пригоден для доставки в печень. В рамках настоящего изобретения предпочтительными являются индивидуальные промоторы и векторы. Соответствие определенных серотипов AAV и типов клеток (см. Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)) является следующим:

Клеточная линия AAV-1 AAV-2 AAV-3 AAV-4 AAV-5 AAV-6 AAV-8 AAV-9 Huh-7 13 100 2,5 0,0 0,1 10 0,7 0,0 НЕК293 25 100 2,5 0,1 0,1 5 0,7 0,1 HeLa 3 100 2,0 0,1 6,7 1 0,2 0,1 HepG2 3 100 16,7 0,3 1,7 5 0,3 ND Hep LA 20 100 0,2 1,0 0,1 1 0,2 0,0 911 17 100 11 0,2 0,1 17 0,1 ND CHO 100 100 14 1,4 333 50 10 1,0 COS 33 100 33 3,3 5,0 14 2,0 0,5 MeWo 10 100 20 0,3 6,7 10 1,0 0,2 NIH3T3 10 100 2,9 2,9 0,3 10 0,3 ND A549 14 100 20 ND 0,5 10 0,5 0,1 HT1180 20 100 10 0,1 0,3 33 0,5 0,1 Моноциты 1111 100 ND ND 125 1429 ND ND Незрелые DC 2500 100 ND ND 222 2857 ND ND Зрелые DC 2222 jLd jLu jh Au 100 ND ND 333 3333 ND ND

Лентивирус

[541] Лентивирусы представляют собой сложные ретровирусы, способные заражать и экспрессировать свои гены как в митотических, так и в постмитотических клетках. Наиболее известным лентивирусом является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который использует гликопротеины вирусной оболочки других вирусов для нацеливания в широкий диапазон типов клеток.

[542] Лентивирусы могут быть получены следующим образом. После клонирования pCasES10 (который содержит основу трансферной плазмиды лентивируса), HEK293FT при небольшом числе пересевов (p=5) были посеяны в колбе T-75 до 50% смыкания монослоя за день до трансфекции в DMEM с 10% эмбриональной бычьей сывороткой и без антибиотиков. Через 20 часов питательные среды заменяли на среду OptiMEM (без сыворотки) и трансфекция проводили через 4 часа. Клетки трансфицировали 10 мкг лентивирусной плазмиды для переноса (pCasES10) и следующими упаковочными плазмидами: 5 мкг pMD2.G (псевдотип VSV-g) и 7,5 мкг psPAX2 (gag/pol/rev/tat). Трансфекцию проводили в 4 мл OptiMEM со средством доставки катионных липидов (50 мкл Lipofectamine 2000 и 100 мкл реагента Plus). Через 6 часов питательную среду заменяли на DMEM без антибиотика с 10% эмбриональной бычьей сывороткой. В этих способах используется сыворотку во время культивирования, однако предпочтительными являются способы без сыворотки.

[543] Лентивирус может быть очищен следующим образом. Вирусные супернатанты собирали через 48 часов. Супернатанты сначала очищали от дебриса и пропускали через 0,45-мкм фильтр с низким связыванием белков (PVDF). Затем их ультрацентрифугировали в течение 2 часов при скорости 24000 об/мин. Затем осадки с вирусом ресуспендировали в 50 мкл DMEM в течение ночи при 4°C. Потом их были разделяли на аликвоты и сразу же замораживали при -80°C.

[544] В другом варианте осуществления изобретения также предусматривается минимальный вектор на основе лентивируса животного, отличного от примата, основанный на вирусе инфекционной анемии лошадей (EIAV), особенно для генотерапии глаза (см., например, Balagaan, J Gene Med 2006; 8; 275-285). В другом варианте осуществления изобретения также предусматривается RetinoStat®, лентивирусный вектор для генной терапии на основе вируса инфекционной анемии лошадей, экспрессирующий ангиостатические белки эндостатин и ангиостатин, доставляемый через субретинальную инъекцию для лечения возрастной дегенерации желтого пятна (см., например, Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (September 2012)) и этот вектор может быть изменен для использования в систему нацеливания на нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.

[545] В другом варианте осуществления изобретения самоинактивирующиеся лентивирусные векторы с миРНК, нацеленной на экзон, общий для генов tat/rev ВИЧ, локализованной в ядрышке TAR-ловушки и анти-CCR5-специфического рибозима типа "hammerhead" (см, например, DiGiusto et al. (2010) Sci Transl Med 2:36ra43), может использоваться и/ или быть адаптирован для использования в нацеленной на нуклеиновую кислоту системе по настоящему изобретению. Минимум 2,5×10⁶ CD34+ клеток на килограмм веса пациента могут быть получены предварительным стимулированием в течение 16-20 часов в питательной среде X-VIVO 15 (Lonza), содержащей 2 мкМ L-глютамина, фактор стволовых клеток (100 нг/мл), лиганд Flt-3 (Flt-3L) (100 нг/мл) и тромбопоэтин (10 нг/мл) (CellGenix) в плотности 2×10⁶ клеток/мл. Предварительно стимулированные клетки могут быть трансдуцированы лентивирусным вектором при множественности инфекции, равной 5, в течение 16-24 часов в 75-см² колбах для культивирования тканей, покрытых фибронектином (25 мг/см²) (RetroNectin, Takara Bio Inc.).

[546] Лентивирусые векторы описаны для лечения для болезни Паркинсона, см., например, публикацию патентных заявок США №20120295960, №7303910 и №7351585. Лентивирусые векторы описаны как способ лечения заболеваний глаз, см., например, публикации патентных заявок США №20060281180, 20090007284, US 20110117189; US 20090017543; US 20070054961, US 20100317109. Лентивирусные векторы были также описаны как средство доставки в мозг, см., например, публикации патентных заявок США № US 20110293571; US 20110293571, US 20040013648, US 20070025970, US 20090111106 и патент США № US 7259015.

Доставка РНК

[547] Доставка РНК: нацеленный на нуклеиновую кислоту белок Cas, например, белок типа V, такой как C2c2, и/или направляющая РНК, могут также быть доставлены в форме РНК. мРНК нацеленного на нуклеиновую кислоту белка Cas (например, белка типа V, такого как C2c2) может быть синтезирована с использованием ПЦР-кассеты, содержащей следующие элементы: промотор T7-последовательность Козака (GCCACC)-эффекторный белок-3'-нетранслируемая область (UTR) полиА-последовательности бета-глобина (последовательность из 120 или более остатков аденина). Такая кассета может быть использована для транскрипции с участием Т7-полимеразы. Направляющие РНК могут также быть транскрибированы путем транскрипции in vitro с кассеты, содержащей промотор T7-GG-последовательность направляющей РНК.

[548] Для усиления экспрессии и уменьшения возможной токсичности последовательность, кодирующая нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок, и/или направляющая РНК могут быть модифицированы так, чтобы содержать один или более модифицированных нуклеозидов, например, с использованием псевдо-U или 5-метил-C.

[549] Способы доставки мРНК в настоящее время представляются особенно перспективными для доставки в печень.

[550] Значительные клинические усилия по доставке РНК были сфокусированы на РНК-i или антисмысловых молекулах, однако такие системы могут быть адаптированы для доставки РНК с целью осуществления настоящего изобретения. В соответствии с этим следует прочесть ссылки на РНК-I и т.д., приведенные ниже.

Системы доставки частиц и/или составов:

[551] Несколько типов систем доставки частиц и/или составов нашли применение в широком спектре биомедицинских применений. В целом, частица определяется как малый объект, ведущий себя как целая единица в отношении ее перемещения и свойств. Далее частицы подразделяются в соответствии с диаметром. Крупные частицы соответствуют диапазону от 2500 до 10000 нанометров. Тонкие частицы имеют размер от 100 до 2500 нанометров. Ультратонкие частицы или наночастицы в целом от 1 до 100 нанометров в размере. Основой для выбора предела в 100 нм является проявление новых свойств, отличающих частицы от насыпного материала, которые обычно развиваются при переходном масштабе длины менее 100 нм.

[552] Как используют в настоящем описании, система доставки частиц/лекарственная форма определяется как любая биологическая система доставки/лекарственная форма, которая включает частицу в соответствии с настоящим изобретением. Частица в соответствии с настоящем изобретением представляет собой любой объект, имеющий самое большое измерение (например, диаметр) менее 100 микронов (мкм). В некоторых вариантах осуществления изобретения частицы по изобретению имеют самое большое измерение менее 10 мкм. В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретению имеют самое большое измерение меньше, чем 2000 нанометров (нм). В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретени имеют самое большое измерение меньше, чем 1000 нанометров (нм). В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретению имеют самое большое измерение меньше, чем 900 нм, 800 нм, 700 нм, 600 нм, 500 нм, 400 нм, 300 нм, 200 нм или 100 нм. Как правило, частицы по изобретению имеют самое большое измерение (например, диаметр) 500 нм или меньше. В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретению имеют самое большое измерение (например, диаметр) 250 нм или меньше. В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретению имеют самое большое измерение (например, диаметр) 200 нм или меньше. В некоторых вариантах осуществления частицы по изобретению имеют самое большое измерение (например, диаметр) 150 нм или меньше. В некоторых вариантах осуществления изобретения разработанные частицы имеют самое большое измерение (например, диаметр) 100 нм или меньше. Меньшие частицы, например, имеющие самое большое измерение 50 нм или меньше используется в некоторых вариантах осуществления изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения частицы по изобретению имеют самое большое измерение в диапазоне от 25 нм до 200 нм.

[553] Охарактеризацию частиц (включая, например, морфологию, измерение, и т.д.) проводят с использованием ряд различных способов. Общие способы представляют собой электронную микроскопию (ТЕМ, SEM), атомно-силовую микроскопию (AFM), динамическое рассеяние света (DLS), рентгеновскую фотоэлектронную спектроскопию (XPS), порошковую рентгеновскую дифракцию (XRD), инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье (FTIR), времяпролетную матрично-активированную лазерную десорбцию/ионизацию (MALDI-TOF), оптическую спектроскопию, интерферометрию двойной поляризации и ядерный магнитный резонанс (NMR). Охарактеризация (измерение размеров) может быть проведена относительно нативных частиц (т.е. перед загрузкой) или после загрузки груза (в настоящем описании груз относится, например, к одному или более компонентам системы CRISPR-Cas, например, ферменту CRISPR, или мРНК, или направляющей РНК, или любой их комбинации, и может включать дополнительные носители и/или эксципиенты), чтобы обеспечить частицы оптимального размера для доставки в любом способе применения настоящего изобретения in vitro, ex vivo и/или in vivo. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения охарактеризация размеров частиц (например, диаметра) основана на измерении с использованием динамического рассеяния света (DLS). Упоминаются заявка на патент США №8709843; заявка на патент США №6007845, патент США №5855913; патент США №5985309; заявка на патент США №5543158; и публикация James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014) опубликованная через интернет 11 мая 2014 года, doi:10.1038/nnano.2014.84, касающаяся частицы, способов их получения и применения и измерения.

[554] Системы доставки частиц в рамках настоящего изобретения могут быть представлены в любой форме, включая, но не ограничиваясь ими, твердую, полутвердую, эмульсию или коллоидные частицы. По существу любые такие системы доставки, описанные в настоящем описании, включая, но не ограничиваясь ими, например, системы, основанные на липидах, липосомах, мицеллах, микровезикулах, экзосомах или генных пушках, могут быть предоставлены для доставки частиц в рамках настоящего изобретения.

Частицы

[555] мРНК фермента CRISPR и направляющая РНК могут быть доставлены одновременно с использованием частиц или липидных вирусных оболочек; например, фермент CRISPR и РНК по изобретению, например, в виде комплекса, могут быть доставлены с помощью частиц согласно Dahlman et al., WO 2015089419 A2 и документам, цитируемых в них, таких как 7C1 (см., например, работу James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014) опубликованную через интернет 11 мая 2014 года, doi:10.1038/nnano.2014.84), например, частица доставки, включающая липид или липидоид и гидрофильный полимер, например, катионный липид, и гидрофильный полимер, например, такой, где катионный липид включает 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP) или 1,2-дитетрадеканоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC) и/или где гидрофильный полимер включает этиленгликоль или полиэтиленгликоль (ПЭГ); и/или где частица далее включает холестерин (например, частица состава 1=DOTAP 100, DMPC 0, ПЭГ 0, холестерин 0; состава номер 2=DOTAP 90, DMPC 0, ПЭГ 10, холестерин 0; состава номер 3=DOTAP 90, DMPC 0, ПЭГ 5, холестерин 5), где частицы сформированы c использованием эффективного, многоступенчатого процесса, где сначала, эффекторный белок и РНК смешивают вместе, например, в молярном отношении 1:1, например, при комнатной температуре, например, в течение 30 минут, например, в стерильном, свободном от нуклеаз 1X PBS; и отдельно, DOTAP, DMPC, ПЭГ и холестерин, как применимо для состава, растворяют в спирте, например, 100% этаноле; и, эти два раствора смешивают вместе, чтобы сформировать частицы, содержащие комплексы).

[556] мРНК нацеленных на нуклеиновые кислоты эффекторных белков (таких как белки типа VI, таких как C2c2) и направляющая РНК могут быть доставлены одновременно с использованием частиц или липидов вирусных оболочек.

[557] Например, Su X, Fricke J, Kavanagh DG, Irvine DJ ("In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles" Mol Pharm. 2011 Jun 6; 8(3):774-87. doi: 10.1021/mp100390w. Epub 2011 Apr 1) описывают биоразлагаемые структурированные частицы c ядром из поли(β-аминоэфира) (PBAE), окруженным фосфолипидным бислоем. Они были разработаны для доставки мРНК in vivo. pH-зависимый компонент PBAE был выбран, чтобы способствовать эндосомному разрушению, в то время как поверхностный липидный слой был выбран, чтобы минимизировать токсичность ядра поликатиона. Следовательно, такой способ предпочтителен для доставки РНК по настоящему изобретению.

[558] В одном варианте осуществления изобретения рассмотрены частицы на основе самосборки биоадгезивных полимеров, которые могут быть применены для доставки пептидов в головной мозг различными способами доставки: пероральным, внутривенным, назальным. Также предусматриваются другие варианты осуществления, такие как пероральная и окулярная доставка гидрофобных лекарств. Технология молекулярной оболочки включает спроектированную полимерную оболочку, которая защищена и доставлена к области заболевания (см., например, Mazza, M. et al. ACSNano, 2013. 7(2): 1016-1026; Siew, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(1): 14-28; Lalatsa, A., et al. J Contr Rel, 2012. 161(2): 523-36; Lalatsa, A., et al., Mol Pharm, 2012. 9(6): 1665-80; Lalatsa, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(6): 1764-74, Garrett, N.L., et al. J Biophotonics, 2012. 5(5-6): 458-68; Garrett, N.L., et al. J Raman Spect, 2012. 43(5): 681-688, Ahmad, S., et al. J Royal Soc Interface 2010. 7: S423-33; Uchegbu, I.F. Expert Opin Drug Deliv, 2006. 3(5): 629-40; Qu, X. et al. Biomacromolecules, 2006. 7(12): 3452-9 и Uchegbu, IF., et al. Int J Pharm, 2001. 224:185-199). Предусматриваются дозы приблизительно 5 мг/кг с единичными или множественными дозами, в зависимости от ткани-мишени.

[559] В одном варианте осуществления частицы, которые могут доставить РНК в злокачественную клетку, чтобы остановить рост опухоли, разработанные лабораторией Dan Anderson в MIT, могут использоваться/и или адаптированы для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. В частности, лаборатория Anderson разработала полностью автоматизированные, комбинаторные системы для синтеза, очистки, охарактеризации и составляения новых биоматериалов и нанолекарственных форм. См., например, Alabi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Aug 6; 110(32): 12881-6; Zhang et al., Adv Mater. 2013 Sep 6; 25(33): 4641-5; Jiang et al., Nano Lett. 2013 Mar 13; 13(3): 1059-64; Karagiannis et al., ACS Nano. 2012 Oct 23; 6(10): 8484-7; Whitehead et al., ACS Nano. 2012 Aug 28; 6(8):6922-9 and Lee et al., Nat Nanotechnol. 2012 Jun 3, 7(6): 389-93.

[560] Заявка на патент США 20110293703 касается липидоидных комплексов, особенно полезных при введении полинуклеотидов, которые могут быть применены для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. В одном аспекте аминоспиртовые липидоидные соединения комбинируют с агентом для доставки в клетку или индивидууму для формирования микрочастиц, наночастиц, липосом или мицелл. Агент, доставляемый частицами, липосомами или мицеллами, может быть в форме газа, жидкости или твердого тела, и агент может быть полинуклеотидом, белком, пептидом или низкомолекулярным соединением. Аминоспиртовые липидоидные соединения могут быть объединены с другими аминоспиртовыми липидоидными соединениями, полимерами (синтетическими или естественными), поверхностно-активными веществами, холестерином, углеводами, белками, липидами, и т.д. для формирования частиц. Затем эти частицы могут быть произвольно объединены с фармацевтическим наполнителем для получения фармацевтической композиции.

[561] В заявке на патент США №20110293703 также описаны способы получения аминоспиртовое липидоидное соединение. Одному или более эквивалентам амина позволяют реагировать с одним или более эквивалентами соединений с эпоксидной концевой группой, что при подходящих условиях позволяет сформировать аминоспиртовое липидоидное соединение по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения все аминогруппы амина полностью реагируют с эпоксидными концевыми группами с образованием третичных аминов. В других вариантах осуществления изобретения все аминогруппы амина не полностью реагируют с эпоксидными концевыми группами, таким образом, приводя к образованию первичных или вторичных аминов в аминоспиртовом липидоидном соединении. Эти первичные или вторичные амины сохраняют способность реагировать с другими электрофилами, такими как различные соединения с эпоксидной концевой группой. Как может оценить специалист в данной области, реакция амина с недостатком соединения с эпоксидными группами приводит ко множеству различных аминоспиртовых липидоидных соединений с различным числом хвостовых частей. Определенные амины могут быть полностью функционализированы двумя соединениями с эпоксидной концевой группой с образованием двух хвостовых частей, в то время как другие молекулы не являются полностью функционализированными соединениями с эпоксидной концевой группой с образованием хвостовых частей. Например, диамин или полиамин могут включать один, два, три, или четыре полученных из соединений с эпоксидной концевой группой хвостовых частей, присоединенных к разным аминогруппам молекулы, что приводит к образованию первичных, вторичных, и третичных аминов. В некоторых вариантах осуществления изобретения все аминогруппы не полностью функционализируются. В некоторых вариантах осуществления изобретения используются два соединения с эпоксидной концевой группой одного типа. В других вариантах осуществления изобретения используются два или более различных соединений с эпоксидными концевыми группами. Синтез аминоспиртовых липидоидных соединений может происходить с растворителем или без него, и синтез может быть выполнен при более высоких температурах в пределах 30-100°C, предпочтительно приблизительно при 50-90°C. Подготовленные аминоспиртовые липидоидные соединения необязательно могут быть очищены. Например, смесь аминоспиртовых липидоидных соединений может быть очищена, чтобы обеспечить аминоспиртовое липидоидное соединение с конкретным числом полученных из эпоксида составных хвостовых частей. Или смесь может быть очищена, чтобы привести к определенному стерео- или региоизомеру. Аминоспиртовые липидоидные соединения также могут быть алкилированы с использованием алкилгалогенида (например, метилиодида) или другого алкилирующего агента, и/или они могут быть ацилированы.

[562] В заявке на патент США №20110293703 также описаны библиотеки аминоспиртовых липидоидных соединений, полученных способами по изобретению. Эти аминоспиртовые липидоидные соединения могут быть получены и/или исследованы с использованием высокопроизводительных способов, включающих жидкостные манипуляторы, роботы, микропланшеты для титрования, компьютеры, и т.д. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминоспиртовые липидоидные соединения подвергают скринингу в отношении их способности трансфицировать полинуклеотиды или другие агенты (например, белки, пептиды, маленькие молекулы) в клетку.

[563] Заявка на патент США №20130302401 касается класса поли(бета-аминоспиртов) (PBAA), которые получают с помощью комбинаторной полимеризации. Разработанные PBAA могут использоваться в биотехнологии и биомедицинских способах применения как покрытия (такие как покрытия пленок или многослойных пленок для медицинских устройств или имплантатов), добавки, материалы, наполнители, агенты, не подверженные биологическому обрастанию, агенты для микроструктурирования и агенты клеточной инкапсуляции. Использование PBAA в качестве поверхностных покрытий позволило индуцировать разные уровни воспаления, как in vitro, так in vivo, в зависимости от химической структуры. Большое химическое разнообразие этого класса материалов позволило идентифицировать полимерные покрытия, которые ингибируют активацию макрофагов in vitro. Кроме того, эти покрытия уменьшают привлечение клеток воспаления и уменьшают фиброз после подкожной имплантации карбоксилированных микрочастиц полистирола. Эти полимеры могут использоваться для формирования капсулы комплекса полиэлектролита для инкапсуляции клетки. У изобретения может также быть много других биологических способов применения, таких как антибактериальные покрытия, доставка ДНК или миРНК, и тканевая инженерия на основе стволовых клеток. Рекомендации заявки на патент США №20130302401 могут быть применены к нацеленной на нуклеиновые кислоты системе по настоящему изобретению.

[564] В другом варианте осуществления изобретения предусматриваются липидные наночастицы (LNP). Малая интерферирующая РНК против антитранстиретина была заключена в капсулу липидных наночастиц и доставлена в человеческие клетки (например, см. Coelho et al., N Engl J Med 2013; 369:819-29), и такая система может быть а.даптирована и применена для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. Рассмотренные дозы составляют от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 мг на кг массы тела при доставке внутривенно. Для снижения риска инфузионных реакций предусматриваются такие лекарственные препараты как дексаметазон, ацетаминофен, дифенгидрамин, цетиризин и ранитидин. Рассмотрено применение в виде множественных доз, составляющих приблизительно 0,3 мг на килограмм массы тела каждые 4 недели до пяти доз.

[565] Показана высокая эффективность LNP для доставки миРНК в печень (см, например, Tabemero et al, Cancer Discovery, April 2013, Vol. 3, No. 4, pages 363-470), следовательно, LNP могут использоваться для доставки РНК, кодирующей нацеленный на нуклеиновую кислоту эффекторный белок к печени. Дозировка может составлять приблизительно четыре дозы по 6 мг/кг LNP каждые две недели. Tabemero et al. продемонстрировали, что регресс опухоли наблюдался после первых 2 циклов LNP при дозировке на уровне 0,7 мг/кг, к концу 6 циклов пациент достиг частичной ремиссии с полной регрессией метастазов лимфатических узлов и существенным уменьшением опухолей печени, полная ремиссия была достигнута после 40 доз, потом ремиссия сохранилась, лечение было закончено после 26 месяцев. У двух пациентов с RCC и внепеченочными участками заболевания, включая почку, легкое и лимфатические узлы, которые прогрессировали после предшествующей терапии с ингибиторами каскада VEGF, было стабильное заболевание во всех областях в течение приблизительно 8-12 месяцев, и пациент с PNET и метастазами печени продолжил лечение в дополнительном исследовании в течение 18 месяцев (36 доз) со стабильным заболеванием.

[566] Однако заряд LNP также должен быть принят во внимание. Катионные липиды комбинируются с отрицательно заряженными липидами для индукции небислойных структур для облегчения внутриклеточной доставки. Поскольку заряженные LNP быстро покидают кровоток после внутривенной инъекции, были разработаны ионизируемые катионные липиды со значениями pKa ниже 7 (см., например, Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011). Отрицательно заряженные полимеры, такие как РНК могут быть загружены в LNP при низких значениях pH (например, pH 4), когда ионизируемые липиды имеют положительный заряд. Однако при физиологических значениях pH LNP имеют низкий поверхностный заряд, совместимый с более длительным временем циркуляции. Исследование было сосредоточено на четырех видах ионизируемых катионных липидов, а именно, 1,2-дилинеоил-3-диметиламмоний-пропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилокси-3-N, N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилинолеилокси-кето-N,N-диметил-3-аминопропан (DLinKDMA) и 1,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксолан (DLinKC2-DMA). Было показано, что системы миРНК LNP, содержащие эти липиды, показывают значительно отличающиеся свойства подавления экспрессии генов в гепатоцитах in vivo с эффективностью, варьирующей согласно ряду DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAP при использовании моделей подавления экспрессии гена фактора VII (см., например, Rosin et al, Molecular Therapy, vol, 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec, 2011). Может быть рассмотрена дозировка 1 мкг/мл LNP или РНК CRISP-Cas внутри или в ассоциации с LNP, особенно для лекарственного препарата, содержащего DLinKC2-DMA.

[567] Подготовка LNP и инкапсуляция CRISPR-Cas может быть использована или адаптирована из Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec, 2011. Катионные липиды 1,2-дилинеоил-3-диметиламмоний-пропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилокси-3-N, N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилинолеилокси-кето-N,N-диметил-3-аминопропан (DLinKDMA), 1,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксолан (DLinKC2-DMA), (3-o-[2''-(метоксиполиэтиленгликоль 2000)сукциноил]-1,2-димиристоил-sn-гликоль (ПЭГ-S-DMG) и R-3-[(ко-метокси-поли(этиленгликоль)2000) карбамоил]-1,2-димиристилоксипропил-3-амин (ПЭГ-C-DOMG) могут быть приобретены у Tekmira Pharmaceuticals (Ванкувер, Канада) или синтезированы. Холестерин может быть приобретен у Sigma (Сент-Луис, Миссури). РНк конкретного нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса (CRISPR-Cas) может быть заключена в капсулу из LNP, содержащую DLinDAP, DLinDMA, DLinK-DMA и DLinKC2-DMA (катионный липид:DSPC:CHOL:PEGS-DMG или ПЭГ-C-DOMG в молярных отношениях 40:10:40:10). При необходимости 0,2% SP-DiOC18 (Invitrogen, Берлингтон, Канада) может быть включен в состав, чтобы оценить клеточный захват, внутриклеточную доставку и биораспределение. Инкапсуляция может быть выполнена путем растворения липидной смеси, состоящей из катионного липида:DSPC:холестерола:ПЭГ-c-DOMG (молярное отношение 40:10:40:10), в этаноле до конечной концентрации липида 10 ммоль/л. Этот раствор липида в этаноле может быть добавлен по каплям к цитрату с концентрацией 50 ммоль/л, pH 4,0, для формирования многослойных везикул в целях достижения конечной концентрации этанола 30% по объему. Большие однослойные везикулы могут быть сформированы после пропускания многослойных везикул через два сложенных поликарбонатных фильтра Nuclepore на 80 нм с использованием экструдера (Northern Lipids, Ванкувер, Канада). Инкапсуляция может быть достигнута добавлением РНК, растворенной до концентрации 2 мг/мл, в 50 ммоль/л цитрата, pH 4,0, содержащего 30% этанола по объему, по каплям к предварительно сформированным большим однослойным пузырькам и инкубации при температуре 31°C в течение 30 минут с постоянным перемешиванием до конечного отношения РНК/липид по весу, равного 0,06/1. Удаление этанола и нейтрализация полученного состава буфером могут быть выполнены с помощью диализа против натрий-фосфатного буфера (PBS), pH 7,4, в течение 16 часов с использованием восстановленных целлюлозных мембран для диализа Spectra/Por 2. Гранулометрический состав может быть определен динамическим рассеянием света с использованием гранулометра NICOMP 370, режима везикул/интенсивности и Гауссовской аппроксимации (Nicomp Particle Sizing, Санта-Барбара, Калифорния). Размер частиц для всех трех систем LNP может составлять ~70 нм в диаметре. Эффективность инкапсуляции РНК может быть определена удалением свободной РНК с использованием колонки VivaPureD Mini (Sartorius Stedim Biotech) из образцов, собранных до и после диализа. Инкапсулированная РНК может быть извлечена из элюированных частиц и определена количественно на уровне 260 нм. Отношение РНК к липидам может быть определено измерением содержания холестерина в везикулах с использованием ферментативного анализа с холестерином E от Wako Chemicals USA (Ричмонд, Вирджиния). Вместе с обсуждаемыми в настоящем описании LNP и липидами ПЭГ, пегилированные липосомы или LNP так же подходят для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы или ее компонентов.

[568] Получение липидных наночастиц (LNP) возможно производить согласно и/или адаптировано из Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011. Предварительно подготовленный раствор липидной смеси (с общей концентрацией липидов 20,4 мг/мл) может быть получен в этаноле, содержащем DLinKC2-DMA, DSPC и холестерин в молярных соотношениях 50:10:38,5. Ацетат натрия может быть добавлен в предварительно подготовленный раствор липидной смеси в молярном соотношении 0,75:1 (ацетат натрия: DLinKC2-DMA). Липиды могут быть далее гидратированы с использованием смеси 1,85 объема цитратного буфера (10 ммоль/л, pH 3,0) при активном перемешивании, приводящем к спонтанному образования липосом в водном буфере, содержащем 35% этанол. Раствор липосом может быть инкубирован при 37°C, чтобы сделать возможным зависимое от времени увеличение размеров частиц. Аликвоты могут быть удалены в разные моменты времени в ходе инкубации для исследования изменений размера липосом с помощью способа динамического светорассеяния (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, Великобритания). При достижении желаемого размера частиц водный раствор ПЭГ и липидов (исходный раствор=10 мг/мл ПЭГ-DMG в 35% (объем/объем) этанола) может быть добавлен к смеси липосом для достижения конечной концентрации ПЭГ 3,5% от общего липида. При добавлении ПЭГ-липидов липосомы должны быть примерно их размера и эффективно подавляя дальнейший рост. Далее РНК может быть добавлена к пустым липосомам при соотношении РНК к общим липидам примерно 1:10 (вес:вес) с последующей инкубацией на протяжении примерно 30 мин при 37°C для образования загруженных липидных наночастиц (LNP). Такая смесь может быть в дальнейшем подвергнута диализу на протяжении ночи в PBS) и фильтрации через 0,45-пм фильтр-шприц.

[569] Конструкции сферических нуклеиновых кислот (Spherical Nucleic Acid, SNA™) и другие частицы (в частности, частицы золота) также предусматриваются в качестве средства доставки нацеленных на нуклеиновую кислоту систем к предполагаемым мишеням. Значительный объем данных демонстрирует полезность конструкций терапевтических сферических нуклеиновых кислот от AuraSense (SNA™), основанных на функционализированных нуклеиновой кислотой золотых частицах.

[570] Литература, которая может быть использована в совокупности с изложенными в настоящем описании идеями, включает: Cutler et al., J. Am. (Chem. Soc. 2011 133:9254-9257, Hao et al., Small. 2011 7:3158-3162, Zhang et al., ACS Nano. 2011 5:6962-6970, Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:1376-1391, Young et al., Nano Lett. 2012 12:3867-71, Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109:11975-80, Mirkin, Nanomedicine 2012 7:635-638 Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:16488-1691, Weintraub, Nature 2013 495:S14-S16, Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(19):7625-7630, Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ral52 (2013) и Mirkin, et al., Small, 10:186-192.

[571] Самособирающиеся частицы с РНК могут быть произведены из полиэтиленимина (PEI), связанного с ПЭГ через пептидный лиганд Arg-Gly-Asp (RGB), присоединенный к дальнему концу ПЭГ. Такая система была использована, например, в качестве средства для нацеливания на сосуды опухоли, экспрессирующей интегрины, и доставки миРНК, ингибирующей экспрессию рецептора факторов роста эндотелия сосудов 2 (VEGFR2), и достижения, таким образом, ангиогенеза в опухоли (см., например, Sehiffelers et al, Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 19). Наноплексы могут быть приготовлены смешиванием равных объемов водных растворов катионного полимера и нуклеиновой кислоты для получения чистого молярного избытка ионизируемого азота (полимер) относительно фосфата (нуклеиновая кислота) в диапазоне от 2 до 6. Электростатические взаимодействия между катионными полимерами и нуклеиновой кислотой приводят к образованию полиплексов со средним значением распределения размеров примерно 100 нм, в связи с чем в настоящем описании они названы наноплексами. Предусматривается дозировка примерно от 100 до 200 мг РНК комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, для доставки в самособирающихся частицах согласно Sehiffelers et al.

[572] Наноплексы, описанные Bartlett et al. (PNAS, September 25, 2007, vol. 104, no. 39) также могут быть применены в рамках настоящего изобретения. Наноплексы, описанные Bartlett et al., получают смешиванием равных объемов водных растворов катионного полимера и нуклеиновой кислоты для получения чистого молярного избытка ионизируемого азота (полимера) по отношению к фосфату (нуклеиновая кислота) в диапазоне от 2 до 6. Электростатические взаимодействия между катионными полимерами и нуклеиновой кислотой приводят к образованию полиплексов со средним значением распределения размеров примерно 100 нм, в связи с чем здесь они названы наноплексами. DOTA-миРНК, описанная Bartlett et al., была синтезирована следующим образом: 1,4,7,10-тетразациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты моно (N-гидроксисукцинимид эфир) (DOTA-эфир NHS) был заказан у Macrocyclics (Даллас, Техас, США). Кодирующая цепь аминомодифицированной РНК со 100-кратным молярным избытком эфира DOTA-NHS в карбонатном буфере (pH 9) была помещена в пробирку для микроцентрифугирования. Реакция содержимого была проведена при перемешивании на протяжении 4 ч при комнатной температуре. Связанные DOTA-кодирующая РНК были осаждены этанолом, ресуспенидрованы в воде и прошли отжиг на немодифицированную некодирующую цепь для получения DOTA-миРНК. Все жидкости были предварительно обработаны Chelex-100 (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, США) для удаления следов загрязнения металлом. Нацеленные на Tf и ненацеленные частицы миРНК могут быть образованы с использованием содержащих циклодекстрин поликатионов. Обычно частицы образуются в воде при соотношении зарядов (+/-), равном 3, и концентрации миРНК 0,5 г/л. Один процент молекул адамантан-ПЭГ на поверхности нацеленных частиц был модифицирован (адамантан-ПЭГ-Tf). Частицы были суспендированы в 5% (масса/объем) полученного раствора переносчика глюкозы для инъекций.

[573] Davis et al. (Nature, Vol 464, 15 April 2010) провели клинические испытания РНК с использованием системы доставки нацеленных частиц (регистрационный номер клинического испытания NCT00689065). Пациенты с солидным типом злокачественной опухли, нечувствительной к стандартным способам лечения, получали дозировки направленных частиц в дни 1, 3, 8 и 10 21-дневного курса путем 30-минутного внутривенного вливания. Такие частицы включают, по существу состоят или состоят из синтетической системы доставки, содержащей: (1) линейный полимер на основе циклодекстрина (CDP), (2) лиганд, нацеленный на белок трансферрин человека (TF), находящийся снаружи наночастицы для активации рецепторов TF (TFR) на поверхности злокачественных клеток, (3) гидрофильный полимер (полиэтиленгликоль, ПЭГ) используется для увеличения стабильности наночастиц в биологических жидкостях) и (4) миРНК, разработанная для уменьшения экспрессии RRM2 (используемая в клинической практике последовательность ранее была обозначена как siR2B+5). На протяжении долгого времени было известно, что TFR активнее экспрессируется в клетках злокачественных опухолей, поэтому RRM2 является доказанная мишень терапии против злокачественной опухоли. Такие частицы (используемая в клинической практики версия обозначена как CALAA-01) продемонстрировали хорошую переносимость в исследованиях с различными дозировками на отличных от человека приматах. Хотя ранее один пациент с хроническим миелоидным лейкозом получал миРНК путем доставки липосомами, клинические испытания Davis et al. являются первичными для систематической доставки миРНК с нацеленной системой доставки и с целью лечения пациентов с солидными злокачественными опухолями. Для проверки того, может ли система направленной доставки обеспечить эффективную доставку функциональной миРНК в опухоли у человека, Davis et al. исследовали материалы биопсии трех пациентов из трех групп по дозировке: пациенты A, В и C, каждый из которых имел метастазирующую меланому и получал CALAA-01 в дозах 18, 24 и 30 мг/м² миРНК соответственно. Сходные дозы могут также быть предположены для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. Доставка согласно изобретению может быть достигнута с использованием частиц, содержащих линейный полимер на основе циклодекстрина (CDP), лиганд, нацеленный на белок трансферрин человека (TF), находящийся снаружи наночастицы для активации рецепторов TF (TFR) на поверхности злокачественных клеток и/или гидрофильный полимер (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), используемый для повышения стабильности в биологических жидкостях).

[574] В отношении настоящего изобретения, предпочтительно наличие одного или более компонентов нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса, например, нацеленного на нуклеиновую кислоту эффекторного белка или мРНК, либо направляющая РНК, доставленных при помощи частиц или липидной упаковки. Другие системы доставки или векторы могут быть использованы в совокупности с частицами в соответствующих вариантах изобретения.

[575] В целом под "наночастицей" понимают любую частицу с диаметром менее 1000 нм. В определенных предпочитаемых вариантах осуществления наночастицы по настоящему изобретению имеют размер вдоль длинной оси (например, в диаметре) 500 нм или менее. В других предпочитаемых вариантах, описываемых в данном изобретении, наночастицы имеют наибольший размер в диапазоне между 25 нм и 200 нм. В других предпочитаемых вариантах описываемые в данном изобретении наночастицы имеют вдоль длинной оси размер 100 нм или менее. В других предпочитаемых вариантах описываемые в данном изобретении наночастицы имеют размер от 35 нм до 60 нм.

[576] Частицы, относящиеся к настоящему изобретению, могут быть доставлены в различных формах, например, твердые частицы (например, металлы как серебро, золото, железо, титан), неметаллы, твердые частицы на основе липидов, полимеры, суспензии частиц или их комбинации. Могут быть получены частицы из металлов, диэлектриков или полупроводников, как и гибридные структуры (например, с ядром и оболочкой). Частицы из полупроводниковых материалов могут быть также маркированы квантовыми точками, если имеют размер, достаточно малый (обычно менее 10 нм) для возможности квантования электронных уровней. Такие наночастицы используются в биомедицинских применениях в качестве носителей для лекарств или агентов для визуализации и могут быть адаптированы для сходных целей в рамках настоящего изобретения.

[577] Были произведены полутвердые и мягкие частицы, входящие в объем настоящего изобретения. Частицей-прототипом полутвердой природы является липосома. Различные типы липосомных частиц в настоящее время используются в клинической практике в качестве систем доставки для противораковых лекарств и вакцин. Наполовину гидрофильные и наполовину гидрофобные частицы называются янус-частицами и они особенно эффективны для стабилизации эмульсий. Они способны к самостоятельной сборке на поверхностях раздела вода/масло и действуют как твердые поверхностно-активные вещества.

[578] В патенте США №8709843, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, предложена система доставки лекарств для нацеленной доставки содержащих терапевтический агент частиц к тканям, клеткам и внутриклеточным компартментам. Настоящее изобретение относится к нацеленным частицам, содержащим полимер, связанный с поверхностно-активным веществом, гидрофильный полимер или липид.

[579] В патенте США №6007845, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, предложены частицы, имеющие ядро из мультиблочного сополимера, образованное путем ковалентного связывания мультифункционального соединения с одним или более гидрофильными полимерами, и содержащие биологически активный материал.

[580] В патенте США №5855913, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, предложена композиция частиц, включающая аэродинамически легкие частицы с плотностью менее 0,4 г/см³ и средним диаметром от 5 пм до 30 пм, имеющих на поверхности поверхностно-активное вещество для доставки лекарств в систему легких.

[581] В патенте США №5985309, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, предложены частицы, содержащие поверхностно-активное вещество и/или гидрофильный или гидрофобный комплекс с положительно или отрицательно заряженным лекарственным веществом или агентом для диагностики и заряженную частицу с противоположным зарядом для доставки в легкие.

[582] В патенте США №5543158, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, предложены биоразлагаемые инъецируемые частицы с биоразлагаемым твердым ядром, содержащим биологически активный материал и остатки поли(алкиленгликоля) на поверхности.

[583] В WO 2012135025 (также опубликованной как US 20120251560), включенной в настоящем описании в качестве ссылки, описаны полимеры конъюгированного полиэтиленимина (PEI) и конъюгированных азамакроциклов (вместе называемых "конъюгированный липомер" или "липомеры"). В некоторых вариантах осуществления может быть предусмотрено, что такие способы и материалы из цитируемых в настоящем описании документов, например, конъюгированные липомеры, могут быть использованы в контексте нацеленной на нуклеиновую кислоту системы для достижения in vitro, ex vivo и in vivo изменений генома для модификации экспрессии генов, а также экспрессии белков.

[584] В одном варианте осуществления частица может быть модифицированным эпоксидом липидным полимером, предпочтительно 7C1 (см., например, James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014) опубликованная через интернет 11 мая 2014 года, doi:10.1038/nnano.2014.84). C71 был синтезирован в реакции C15 липидов с концевыми эпоксидными группами с PEI600 при молекулярном соотношении 14:1 и составлен с C14PEG2000 для получения частиц (диаметр между 35 и 60 нм), стабильных в растворе PBS (фосфатно-солевой буфер, PBS) на протяжении не менее 40 дней.

[585] Модифицированный эпоксидными группами липид-полимер может быть использован для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению в клетки легких, сердечно-сосудистой системы или почек, однако, квалифицированный специалист в данной области может адаптировать систему для доставки к другим органам-мишеням. Предполагаются дозировки в диапазоне от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,6 мг/кг. Также предусматриваются дозировки, вводимые на протяжении нескольких суток или недель с общей дозой приблизительно 2 мг/кг.

Экзосомы

[586] Экзосомы являются эндогенными нановезикулами, транспортирующими РНК или белки, которые могут доставлять РНК в головной мозг и другие органы-мишени. Для уменьшения иммуногенности Alvarez-Erviti et al. (2011, Nat Biotechnol 29: 341) использовали полученные ими собственные дендритные клетки мышей для получения экзосом. Нацеливание в головной мозг было достигнуто инженерией дендритных клеток, приводящей к экспрессии Lamp2b, экзосомального мембранного белка, слитого со специфическим пептидом нейронов RVG. Очищенные экзосомы были загружены экзогенной РКН с помощью электропорации. миРНК GAPDH, доставленная введенными внутривенно нацеленными на RVG экзосомами в нейроны, микроглию, олигодендроциты в головном мозге вызывает нокдаун конкретного гена. Предварительная обработка экзосомами RVG не ослабляла нокдаун, неспецифический захват в других тканях не наблюдался. Терапевтический потенциал опосредованной экзосомами доставки миРНК был продемонстрирован сильным нокдауном мРНК (60%) и белка (62%) BACE1, терапевтической мишени болезни Альцгеймера.

[587] Для получения совокупности иммунологически инертных экзосом Alvarez-Erviti et al. взяли пробы костного мозга мышей инбредной линии C57BL/6 с однородным гаплотипом по главному комплексу гистосовместимости (MHC). Поскольку незрелые дендритные клетки производят большие объемы экзосом, лишенных активаторов Т-клеток, таких как MHC-II и CD86, Alvarez-Erviti et al. отбирали дендритные клетки с использованием гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) на протяжении 7 дней. Экзосомы были очищены от культурального супернатанта на следующий день с использованием стандартных протоколов ультрацентрифугирования. Полученные экзосомы были физически однородны с распределением размеров, имеющим пик, соответствующий диаметру 80 нм, как установлено путем анализа траекторий частиц (NTA) и электронной микроскопией. Alvarez-Erviti et al. получили 6-12 мкг экзосом (измерено на основе концентрации белка) на 10⁶ клеток.

[588] Далее Alvarez-Erviti et al. исследовали возможность загрузки модифицированных экзосом экзогенным грузом при помощи протоколов электропорации, адаптированных для применения в наномасштабе. Поскольку электропорация мембранных частиц в наноразмерном масштабе недостаточно охарактеризована, неспецифическая маркированная Cy5 РНК была использована для оптимизации протокола электропорации эмпирически. Количество упакованной РНК было оценено после ультрацентрифугирования и лизиса экзосом. Электропорация при 400 В и 125 пФ привела к максимальному удержанию РНК и использовалась во всех последующих экспериментах.

[589] Alvarez-Erviti et al. вводили 150 мкг каждой миРНК BACE1, упакованной в 150 пг экзосом RVG, нормальным мышам C57BL/6 и сравнивали эффективность нокдауна с четырьмя контролями: интактные мыши, мыши, которым вводились только экзосомы RVG, мыши, которым вводились миРНК BACE1 в комплексе с in vivo реагентом катионных липосом и мыши, которым вводились миРНК BACE1 в комплексе с RVG-9R, пептидом RVG, связанным с 9 остатками D-аргинина, электростатически связанными с миРНК. Образцы кортикальной ткани были проанализированы после 3 дней введения, был обнаружен существенный нокдаун белка (45%, P<0,05, против 62%, P<0,01) у получавших экзосомы как с миРНК-RVG-9R, так и с миРНК-RVG, что было следствием существенного уменьшения уровней мРНК BACE1 (66% [+ или -] 15%, P<0,001 и 61% [+ или -] 13% соответственно, P<0,01). Более того, заявители продемонстрировали существенное уменьшение (55%, P<0,05) общих уровней бета-амилоида 1-42, главного компонента амилоидных бляшек при патологии болезни Альцгеймера в случае животных, которым вводили экзосомы RVG. Наблюдаемое уменьшение превосходило уменьшение для бета-амилоида 1-40 у нормальных мышей после внутрижелудочкового введения ингибиторов BACE1. Alvarez-Erviti et al. осуществили быструю амплификацию 5'-концов кДНК (RACE) для продукта расщепления BACE1, что предоставило доказательства опосредованного РНК-интерференцией нокдауна за счет миРНК.

[590] Наконец, Alvarez-Erviti et al. исследовали, вызывают ли экзосомы РНК-RVG иммунный ответ in vivo путем измерения концентраций L-6, IP-10, TNFα и IFN-α в сыворотке. После введения экзосомам для всех цитокинов были зарегистрированы несущественные изменения, сходные с возникающими при введении реагента для трансфекции миРНК, и противоположные возникающим при обработке миРНК-RVG-9R, которая стимулирует высокую секрецию IL-6, что подтверждает иммунологическую инертность при введении экзосом. Учитывая, что экзосомы содержат только 20% миРНК, доставка RVG-экзосомами представляется более эффективной, чем доставка RVG-9R при достижении сравнимого уровня нокдауна мРНК с использованием меньшего в 5 раз количества миРНК без соответствующего уровня иммунной стимуляции. Данный эксперимент продемонстрировал терапевтический потенциал технологии RVG-экзосом, которая может подходить для долговременного сайленсинга генов, связанных с нейродегенеративными заболеваниями. Система доставки с использованием экзосом по Alvarez-Erviti et al. может быть применена для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению к мишеням терапии, особенно в случае нейродегенеративных заболеваний. Доза в диапазоне примерно от 100 до 1000 мг нацеленной на нуклеиновую кислоту системы, упакованной в от ~100 до ~1000 мг RVG-экзосом, может быть предусмотрена в рамках настоящего изобретения.

[591] El-Andaloussi et al. (Nature Protocols 7, 2112-2126(2012)) установили, каким образом полученные из культивируемых клеток экзосомы могут быть использованы для доставки РНК in vitro и in vivo. Данный протокол вначале описывает получение нацеленных экзосом путем трансфекции экспрессирующего вектора, содержащего экзосомальный белок, слитый с пептидным лигандом. Далее El-Andaloussi et al. описывают очистку и охарактеризацию экзосом из супернатанта трансфицированных клеток. Далее El-Andaloussi et al. детализируют ключевые шаги загрузки РНК в экзосомы. В конце El-Andaloussi et al. кратко описывают использование экзосом для эффективной in vitro и in vivo доставки РНК в головной мозг мыши. Примеры ожидаемых результатов, для которых количественно оценена опосредованная экзосомами доставка путем функционального анализа и визуализации, также приведены. Полный протокол занимает ~3 недели. Доставка или введение согласно изобретению могут быть выполнены с использованием экзосом, полученных из дендритных клеток пациента. В соответствии с описанными в настоящем описании идеями, это может быть использовано в практике использования изобретения.

[592] В другом варианте осуществления рассматриваются экзосомы плазмы из Wahlgren et al. (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 el30). Экзосомы являются наноразмерными везикулами (размером 30-90 нм), производимыми многими типами клеток, включая дендритные клетки (DC), В-клетки, T-клетки, тучные клетки, эпителиальные клетки и клетки опухоли. Такие везикулы образуются путем впячивания и отделения поздних эндосом и далее освобождаются во внеклеточную среду при слиянии с плазматической мембраной. Поскольку экзосомы в естественном состоянии переносят РНК между клетками, такое их свойство может быть полезно для генной терапии, и исходя из данного описания экзосомы могут быть использованы при применении настоящего изобретения.

[593] Экзосомы из плазмы могут быть получены путем центрифугирования фракции тромбоцитов и белых клеток крови при 900g на протяжении 20 мин для выделения плазмы с последующим отбором супернатанта, центрифугирования при 300g на протяжении 10 мин для удаления клеток и при 16500g на протяжении 30 мин с последующей фильтрацией через 0,22-мм фильтр. Экзосомы осаждаются при ультрацентрифугировании при 120000g на протяжении 70 мин. Химическая трансфекция миРНК в экзосомы выполнена согласно рекомендациям производителя для начального набора для РНК-i человек/мышь (RNAi Human/Mouse Starter Kit, Quiagen, Хильден, Германия). миРНК добавляется к 100 мл PBS в конечной концентрации 2 ммоль/мл. После добавления реагента для трансфекции HiPerFect смесь инкубируется на протяжении 10 мин при нормальных условиях. Для того, чтобы удалить избыток мицелл, экзосомы вновь выделяют с использованием альдегид/сульфатных латексных шариков. Химическая трансфекция нацеленной на нуклеиновую кислоту системы в экзосомы может быть проведена сходным образом с таковой для миРНК. Такие экзосомы могут быть сокультивированы с моноцитами и лимфоцитами, выделенными из периферической крови здоровых доноров. Следовательно, можно предположить, что экзосомы, содержащие нацеленную на нуклеиновые кислоты систему, могут быть введены в моноциты и лимфоциты и аутологично вновь введены в человека. В соответствии с этим, доставка или введение в соответствии с изобретением могут быть выполнены с применением экзосом плазмы.

Липосомы

[594] Доставка или введение по изобретению могут быть выполнены с помощью липосом. Липосомы представляют собой сферические везикулярные структуры, состоящие из одно- или многослойного липидного бислоя, окружающего внутренние водные компартменты, и относительно непроницаемого внешнего липофильного фосфолипидного бислоя. Липосомы привлекают значительное внимание как переносчики для доставки лекарственных средств, потому что они биологически совместимы, нетоксичны, могут доставлять и гидрофильные и липофильные молекулы препарата, защитить свой груз от деградации ферментами плазмы и переносить свой груз через биологические мембраны и гемато-энцефалический барьер (ГЭБ) (см., например, Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 для обзора).

[595] Липосомы могут состоять из нескольких различных типов липидов; однако, для производства липосом в качестве переносчиков препаратов обычно используются фосфолипиды. Липосомы образуются самопроизвольно при смешивании липидной пленки с водным раствором, но этот процесс может быть ускорен с помощью механического воздействия в виде встряхивания при помощи гомогенизатора, генератора ультразвука или экструдера (см.. например, Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 для обзора).

[596] Несколько других добавок могут быть добавлены к липосомам, чтобы изменить их структуру и свойства. Например, холестерин или сфингомиелин могут быть добавлены к липосомальной смеси для стабилизации структуры липосом и предотвращения потери внутреннего груза. Далее, липосомы могут быть получены из гидрированного фосфатидилхолина яйца или фосфатидилхолина яйца, холестерина и диацетилфосфата, и средние размеры везикул могут быть доведены до приблизительно 50 и 100 нм. (см., например, Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 для подробного обзора).

[597] Лекарственная форма липосомы может состоять, главным образом, из естественных фосфолипидов и липидов, таких как 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин (DSPC), сфингомиелин, фосфатидилхолины яйца и монозиалоганглиозид. Так как эта лекарственная форма составлена только из фосфолипидов, при создании липосом возникло много проблем, в том числе их нестабильность в плазме. Было предпринято несколько попыток преодолеть эти проблемы, в основном путем изменения состава липидной мембраны. Одна из этих попыток заключалась в добавлении холестерина. Добавление холестерина к обычным лекарственным формам замедляет высвобождение инкапсулированного биологически активного вещества в плазму, или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) увеличивает стабильность (см., например, Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 для обзора).

[598] В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения желательно использование липосом, действующих по принципу "троянского коня" (также известный как "молекулярные троянские кони"), и протоколы можно найти по ссылке http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.long.

Эти частицы обеспечивают доставку трансгена ко всему головному мозгу после внутрисосудистой инъекции. Без ограничения, считается, что нейтральные липидные частицы со специфичными антителами, связанными с их поверхностью, способны пересекать гематоэнцефалический барьера путем эндоцитоза. Заявитель утверждает, что липосомы, действующие по принципу "троянского коня", могут быть использованы для доставки семейства нуклеаз CRISPR к головному мозгу путем внутрисосудистой инъекции, что позволило бы создавать животных с трансгенным головным мозгом без потребности в манипуляции с эмбрионами. Приблизительно 1-5 г ДНК или РНК могут быть использованы для введения in vivo в липосомах.

[599] В другом варианте осуществления изобретения нацеленную на нуклеиновую кислоту систему или ее компоненты можно доставить при помощи липосом, например, стабильной нуклео-липидной частицы (SNALP) (см., например, Morissey et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 8, August 2005). Предусматриваются ежедневные внутривенные инъекции приблизительно 1, 3 или 5 мг/кг/сутки конкретной нацеленной на нуклеиновую кислоту системы, нацеленной в SNALP. Ежедневное лечение может быть проведено приблизительно за три дня и затем еженедельно в течение приблизительно пяти недель. В другом варианте осуществления изобретения также предусматривается конкретная нацеленная на нуклеиновую кислоту система, заключенная в SNALP, введенная внутривенной инъекцией в дозах приблизительно 1 или 2,5 мг/кг (см., например, Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006). Состав SNALP может содержать липиды 3-N-[(вметоксиполи(этиленгликоль)2000)карбамоил]-1,2-димиристилокси-пропиламин (ПЭГ-C-DMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DLinDMA), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC) и холестерин, в соотношении 2:40:10:48 молярных процентов (см., например, Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006).

[600] В другом варианте осуществления было доказано, что стабильные нуклео-липидные частицы (SNALP) являются эффективными молекулами для доставки в сильно васкуляризированные опухоли печени, полученные из HepG2, но не в слабо васкуляризированные опухоли печени, образованные из НСТ-116 (см., например, Li, Gene Therapy (2012) 19, 775-780). Липосомы SNALP могут быть получены смешением D-Lin-DMA и ПЭГ-C-DMA с дистероилфосфатидилхолином (DSPC), холестерином и миРНК, использованных в соотношении 25:1 липид/миРНК и молярным соотношением 48/40/10/2 для холестерина/D-Lin-DMA/DSPC/ПЭГ-C-DMA. Полученные липосомы SNALP имеют размер примерно 80-100 нм.

[601] В еще одном варианте осуществления стабильные частицы нуклеиновая кислота-липид (SNALP) могут включать синтетический холестерин (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), дипальмитоилфосфатидилхолин (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Алабама, США), 3-N-[(w-метокси-поли(этиленгликоль)2000)карбамоил]-1,2-димиристоилоксипропиламин и катионный 1,2-дилиеноилокси-3-N,N-диметиламинопропанан (см., например, Geisbert et al., Lancet 2010; 375: 1896-905). Может предусматриваться дозировка примерно 2 мг/кг нацеленной на нуклеиновую кислоту системы, введенная, например, внутривенной болюсной инфузий.

[602] В еще одном варианте осуществления изобретения SNALP может включать синтетический холестерин (Sigma-Aldrich), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC; Avanti Polar Lipids Inc.), ПЭГ-cDMA, и 1,2-дилинолеилокси-3-(N;N-диметил)аминопропан (DLinDMA) (см, например, Judge, J. Clin. Invest. 119:661-673 (2009)). Составы, используемые для исследований in vivo, могут включать конечное соотношение липид/РНК по массе приблизительно 9:1.

[603] Безопасность нанолекарств на основе РНК-i была рассмотрена Barros and Gollob из Alnylam Pharmaceuticals (см., например, Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 1730-1737). Стабильная нуклео-липидная частица кислоты (SNALP) состоит из четырех различных липидов: ионизируемого липида (DLinDMA), который является катионным при низких значениях pH, нейтрального липида-помощника, холестерина и способного к диффузии липида на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ). Частица составляет приблизительно 80 нм в диаметре и имеет нейтральный заряд при физиологическом pH. Ионизируемый липид служит для связывания липида с анионной РНК во время формирования частицы. При увеличении кислотности внутри эндосомы, ионизируемый липид становится положительно заряженным и опосредует слияние SNALP с мембраной эндосомы, высвобождая РНК в цитоплазму. ПЭГ-содержащий липид стабилизирует частицу и уменьшает агрегирование во время сборки, впоследствии обеспечивая нейтральную гидрофильную поверхность, которая улучшает фармакокинетические свойства.

[604] На данный момент две клинические программы были начаты с использованием смесей SNALP с РНК. Tekmira Pharmaceuticals недавно закончили фазу I клинического испытания с применением единственной дозы SNALP-ApoB на взрослых добровольцах с повышенным уровнем холестерина LDL. ApoB преимущественно экспрессируется в печени и тощей кишке и необходим для сборки и секреции VLDL и LDL. Семнадцать участников исследования получили единственную дозу SNALP-ApoB (постепенное увеличение дозы на протяжении 7 уровней). Не было никаких доказательств токсичности для печени (ожидались как потенциальная ограничивающая дозу токсичность на основе доклинических исследований). Один (из двух) испытуемых при получении самой высокой дозы испытал гриппоподобные симптомы, согласующиеся со стимуляцией иммунной системы, и было принято решение завершить испытание.

[605] Alnylam Pharmaceutcals так же занимались продвижением ALN-TTR01, который использует технологию SNALP, описанную выше, и нацелен на продукцию гепатоцитами мутанта и TTR дикого типа для лечения амилоидоза TTR (ATTR). Были описаны три синдрома ATTR: семейная амилоидная полинейропатия (FAP) и семейная амилоидная кардиомиопатия (FAC) - оба вызываемые аутосомными доминирующими мутациями в TTR; и старческий системный амилоидоз (SSA), вызываемый TTR дикого типа. Недавно была закончена фаза I плацебо-контролируемых испытаний на пациентах с ATTR единственный дозы ALN-TTR01 c ее постепенным увеличением. ALN-TTR01 был введен в виде 15-минутного внутривенного вливания 31 пациенту (23 с препаратом исследования и 8 с плацебо) в диапазоне дозы от 0,01 до 1,0 мг/кг (на основе миРНК). Испытуемые хорошо переносили лечение без значительных увеличений функции печени в тестах. Инфузионные реакции были отмечены в 3 из 23 пациентов при дозе более 0,4 мг/кг; все реагировали на замедление скорости вливания и все продолжили участие в исследовании. Минимальное и временное повышение уровня цитокинов IL-6, IP-10 и IL-1ra в сыворотке крови было отмечено у двух пациентов при самой высокой дозе 1 мг/кг (как предполагалось исходя из доклинических испытаний и исследований на приматах). Понижая уровень TTR в сыворотке, ожидаемый фармакодинамический эффект от введения ALN-TTR01, наблюдался при дозе 1 мг/кг.

[606] В еще одном варианте осуществления изобретения SNALP может быть собран с помощью растворения катионного липида, DSPC, холестерина и ПЭГ-липида, например, в этаноле, например, в молярном отношении 40:10:40:10, соответственно (см., например, Semple et al., Nature Biotechnology, Volume 28 Number 2 February 2010, pp. 172-177). Липидная смесь была добавлена к водному буферу (50-мМ цитрата, pH 4) до достижения окончательной концентрации этанола и липидов 30% (по объему) и 6,1 мг/мл, соответственно, и была уравновешена при 22°C в течение 2 минут перед экструзией. Гидратированные липиды были экструдированы через два сложенных фильтра с размером пор 80 нм (Nuclepore) при 22°C с использованием Lipex Extruder (Northern Lipids) до достижения диаметра везикулы 70-90 нм, как определено динамическим анализом рассеяния света. Это обычно требовало 1-3 проходов. миРНК (растворенная в 50 мМ цитрата, водном растворе с pH 4, содержащем 30% этанола), была добавлена к предварительно уравновешенным (35°C) везикулам со скоростью 5 мл/минуту при смешивании. После достижения окончательного целевого отношения миРНК/липид, равного 0,06 (вес/вес), смесь была инкубирована в течение 30 минут при 35°C, чтобы обеспечить реорганизацию везикул и инкапсуляцию миРНК. Потом этанол был удален и внешний буфер заменен на PBS (155 мМ NaCl, 3 мМ Na2HP04, 1 мМ KH2PO4, pH 7,5) либо диализом, либо фильтрованием из тангенциального потока. миРНК была заключена в капсулу из SNALP с использованием контролируемого пошагового процесса растворения. Липидными компонентами KC2-SNALP были DLin-KC2-DMA (катионный липид), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC; Avanti Polar Lipids), синтетический холестерин (Sigma) и ПЭГ-C-DMA в молярном отношении 57,1:7,1:34,3:1,4. После формирования нагруженных частиц SNALP были диализированы против PBS, фильтрат был простерилизован через 0,2 мкм-фильтр перед использованием. Средние размеры частиц составляли 75-85 нм, и 90-95% миРНК были инкапсулированы в липидных частицах. Окончательное отношение миРНК/липид в составах, использовавшихся для in vivo тестирования, составляло ~0,15 (вес/вес). Системы LNP-миРНК, содержавшие миРНК против фактора VII, были сразу растворены до соответствующих концентраций в стерильном PBS перед использованием, и составы были введены внутривенно через боковую хвостовую вену в суммарном объеме 10 мл/кг. Этот способ и эти системы доставки могут быть экстраполированы на нацеленную на нуклеиновую кислоту систему по настоящему изобретению.

[607] Другие липиды

[608] Другие катионные липиды, такие как аминолипид 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (DLin-KC2-DMA) могут быть использованы, чтобы инкапсулировать нацеленную на нуклеиновую кислоту систему, компоненты этой системы или молекулу (молекулы) нуклеиновой кислоты, кодирующие компоненты этой системы, например, подобные миРНК (см., например, Jayaraman, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8529-8533) и, следовательно, могут использоваться в практике изобретения. Может быть рассмотрен предварительно сформированная везикула со следующим липидным составом: аминолипид, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), холестерин и (R)-2,3-бис(октадецилокси)пропил-1-(метоксиполи(этиленгликоль)2000)пропилкарбамат (ПЭГ-липид) в молярном отношении 40/10/40/10, соответственно, и отношении мРНК фактора свертывания крови VII (FVII)/общее количество липидов, приблизительно равном 0,05 (в весовом отношении). Чтобы гарантировать узкое распределение размеров частиц в диапазоне 70-90 нм и низкий индекс полидисперсности 0,11+0,04 (n=56), частицы могут быть экструдированы до трех раз через 80-нм мембраны до добавления направляющей РНК. Могут быть использованы частицы, содержащие сильнодействующий аминолипид 16, в котором молярное отношение четырех липидных компонентов равно 16, DSPC, холестерин и ПЭГ-липид (50/10/38,5/1,5), которое может быть далее оптимизировано, чтобы увеличить активность in vivo.

[609] Michael S D Kormann et al. ("Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volume:29, Pages: 154-157 (2011)) описывают использование липидных оболочек для доставки РНК. Использование липидных оболочек также предпочтительно в данном изобретении.

[610] В другом варианте осуществления изобретения липиды могут быть смешаны с нацеленной на нуклеиновую кислоту системой по настоящему изобретению, ее компонентом(ами) или молекулой(ами) нуклеиновой(ых) кислот(ы), кодирующей таковой(ые), для образования липидных наночастиц (LNP). Липиды включают, без наложения ограничений, DLin-KC2- DMA4, C12-200 и колипиды дистероилфосфатидилхолина, холестерин и ПЭГ-DMG могут быть смешаны с нацеленной на РНК системой вместо миРНК (см., например, Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) I, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3) с использованием процедуры спонтанного образования везикул. Молярное отношение компонентов может быть примерно 50/10/38,5/1,5 (DLin-KC2-DMA или C12-200/дистероилфосфатидилхолин/холестерин/ПЭГ-DMG). Конечное весовое соотношение липид:РНК может составлять 12:1 и 9:1 в случае липидных частиц (LNP) с DLin-KC2-DMA и C12-200, соответственно. Такие составы могут содержать частицы со средним диаметром ~80 нм при эффективности захвата >90%. Может предусматриваться доза 3 мг/кг.

[611] Tekmira располагает портфолио, содержащим примерно 95 семейств патентов в США и в других странах, относящихся к различным аспектам липидных наночастиц (LNP) и их смесей (см., например, патенты США №7982027; 7799565; 8058069; 8283333; 7901708; 7745651; 7803397; 8101741; 8188263; 7915399; 8236943 и 7838658 и европейские патенты №1766035; 1519714; 1781593 и 1664316), все могут быть использованы и/или адаптированы для использования в настоящем изобретении.

[612] Нацеленная на нуклеиновую кислоту система или ее компоненты или молекула(ы), кодирующая(ие) таковые, могут быть доставлены в упакованном в микросферы PLGA виде таким образом, как описано в опубликованных патентных публикациях США 20130252281, 20130245107 и 20130244279 (приписываются Modema Therapeutics), относящихся к аспектам составления композиций, включающих молекулы модифицированной нуклеиновой кислоты, которые могут кодировать белок, предшественник белка или частично или полностью процессированную форму белка или предшественника белка. Смесь может иметь молярное соотношение 50:10:38,5:1,5:3,0 (катионный липид: фузогенный липид:холестерин:ПЭГ-липид). ПЭГ-липид может быть выбран, но не ограничиваясь ими, из ПЭГ-c-DOMG, ПЭГ-DMG. Фузогенным липидом может являться DSPC. См. также Schrum et aJ., Delivery and Formulation of Engineered Nucleic Acids, опубликованное приложение US 20120251618.

[613] Технологии Nanomerics призваны преодолеть трудности, связанные с биодоступностью для широкого круга терапевтических применений, включая низкомолекулярные гидрофобные лекарства, пептиды и основанные на нуклеиновых кислотах препараты (плазмиды, миРНК, микроРНК). Конкретные пути введения, для которых показаны значительные преимущества данной технологии, включают пероральное введение, транспортировка через гематоэнцефалический барьер, доставка в солидные опухоли, а также глаз. См., например, Mazza et al., 2013, ACS Nano. 2013 Feb 26;7(2): 1016-26; Uchegbu and Slew, 2013, J Pharm Sci. 102(2):305-10 и Lalatsa et al., 2012, J Control Release, 2012 Jul 20; 161 (2):523-36.

[614] В публикации патентной заявки США №20050019923 описываны катионные дендримеры для доставки биоактивных молекул, таких как молекулы полинуклеотидов, пептидов или полипептидов, и/или фармакологических агентов, в тело млекопитающего. Такие дендримеры подходят для направления доставки биоактивных молекул, например, в печень, селезенку, легкие, почку или сердце (или даже в головной мозг). Дендримеры представляют собой трехмерные макромолекулы, полученные за несколько этапов из простых разветвленных единиц-мономеров, природа и функциональность которых может легко контролироваться и изменяться. Дендримеры синтезируют путем повторяющегося добавления структурных единиц к мультифункциональному ядру (дивергентный способ синтеза) или их наращивания в направлении мультифункционального ядра (конвергентный способ синтеза), и каждое добавление к трехмерной оболочке структурных единиц приводит к образованию следующего поколения дендримеров. Полипропилениминовые дендимеры образуются, начиная с диаминобутанового ядра, к которому присоединяются вдвое больше аминогруппп в реакции Михаэля с присоединением акрилонитрила к первичным аминам и последующей гидрогенизацией нитрилов. Это приводит к удвоению количества аминогрупп. Полипропилениминовые дендримеры содержат 100% протонируемых азотов и до 64 терминальных аминогрупп (поколение 5, DAB 64). Протонируемыми группами обычно являются аминогруппы, которые способны присоединять протоны при нейтральном pH. Использование дендримеров в качестве агентов доставки генов было в значительной степени сфокусировано на использовании полиамидоамина, и фосфорсодержащие соединения со смесью аминов/амидов или N-P(02)S как конъюгирующих единиц, соответственно, при этом не было сообщений об использовании предшествующих поколений полипропилениминовых дендримеров для доставки генов. Полипропилениминовые дендримеры также исследовались в качестве чувствительных к pH систем контролируемого высвобождения для доставки лекарств и для их упаковки в качестве гостевых молекул при их химической модификации периферическими аминокислотными группами. Цитотоксичность и взаимодействие полипропилениминовых дендримеров с ДНК, а также эффективность трансфекции DAB 64 также были изучены.

[615] Патентная публикация США №20050019923 основана на наблюдении о том, что, в противоречие с более ранними сообщениями, катионные дендримеры, такие как полипропилениминовые дендримеры, демонстрируют подходящие свойства, такие как специфическое нацеливание и низкая токсичность, для использования для направленной доставки биоактивных молекул, таких как молекулы генетического материала. В дополнение к этому, производные катионных дендримеров также демонстрируют подходящие свойства для направленной доставки биоактивных молекул. См. также Bioactive Polymers, опубликованная заявка США 20080267903, в которой описано: "Различные полимеры, включая катионные полиаминные полимеры и дендримерные полимеры, как было показано, обладают антипролиферативной активностью, и следовательно могут быть полезны для лечения заболеваний, характеризуемых нежелательной пролиферацией клеток, таких как новообразования и опухоли, воспалительные заболевания (включая аутоиммунные заболевания), псориаз и атеросклероз. Такие полимеры могут быть использованы как самостоятельно в качестве активных агентов или в качестве "контейнера" для доставки других терапевтических агентов, таких как молекулы лекарств или нуклеиновые кислоты для генной терапии. В таких случаях собственная присущая полимеру противоопухолевая активность может дополнять активность доставляемого агента. Утверждения из данной патентной публикации могут быть использованы в совокупности с приведенными в настоящем описании идеями для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту систем(ы) или ее компонента(ов), или кодирующую таковые молекулу(ы) нуклеиновой кислоты.

Сверхзаряженные белки

[616] Сверхзаряженные белки представляют собой класс полученных способами инженерии или природных белков с исключительно высоким положительным или отрицательным суммарным теоретическим зарядом, которые могут использоваться для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы(систем), или ее компонента(ов), или молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты, кодирующей их. Несущие как сверхположительный, так и сверхотрицательный заряд белки демонстрируют выдающуюся устойчивость к вызванному термически или химически агрегированию. Сверхположительно заряженные белки также способны проникать в клетки млекопитающих. Связывание с этими белками груза, такого как ДНК плазмиды, РНК или другие белки, может сделать возможной функциональную доставку этих макромолекул в клетки млекопитающих in vitro и in vivo. Лаборатория под руководством David Liu сообщила о создании и описании сверхзаряженных белков в 2007 года (Lawrence et. al., 2007, Journal of the American Chemical Society 129, 10110-10112).

[617] Отличная от вирусной доставка РНК и ДНК плазмиды в клетки млекопитающих представляет ценность как для исследований, так и для терапевтических применений (Akinc et al., 2010, Nat. Biotech. 26, 561-569). Очищенный белок +36 GFP (или другой сверхположительно заряженный белок) смешивали с РНК на соответствующих питательных средах без сыворотки и оставляли для образования комплексов перед добавлением к клеткам. Добавление сыворотки на этой стадии ингибирует формирование сверхзаряженных комплексов белок-РНК и снижает эффективность лечения. Приведенный ниже протокол продемонстрировал эффективность для ряда клеточных линий (McNaughton et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 106, 6111-6116). Однако экспериментальные эксперименты, изменяющие дозу белка и РНК, должны быть выполнены, чтобы оптимизировать процедуру специфичных клеточных линий. Однако следует провести пробные эксперименты с изменениями дозы белка и РНК для оптимизации использования процедуры применительно к конкретным клеточным линиям.

(1) За один день до обработки высевают 1×10⁵ клеток на лунку в 48-луночный планшет.

(2) В день обработки растворяют очищенный белок +36 GFP в питательных средах без сыворотки до конечной концентрации 200 нМ. Добавляют РНК до конечной концентрации 50 нМ. Перемешивают при помощи устройства для встряхивания и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут.

(3) Во время инкубации удаляют питательную среду клеток и промывают PBS один раз.

(4) После инкубации +36 GFP с РНК к клеткам добавляют комплексы белок-РНК.

(5) Инкубируют клетки с комплексами при 37°C в течение 4 часов.

(6) После инкубации отбирают питательные среды и промывают три раза раствором гепарина в PBS (20 Е/мл). Инкубируют клетки с содержащими сыворотку питательными средами на протяжении 48 ч или более в зависимости от анализа активности.

(7) Анализируют клетки при помощи иммуноблоттинга, к-ПЦР, анализа фенотипа или другого соответствующего способа.

[618] Лаборатория под руководством David Liu также установила, что белок +36 GFP является эффективным агентом доставки плазмид в различные клетки. Поскольку ДНК плазмиды является большим грузом, чем миРНК, для эффективного образования комплексов с плазмидами требуется пропорционально большее количество белков +36 GFP. Для эффективной доставки плазмиды заявители доставки разработали вариант +36 GFP, несущий C-концевую метку HA2, пептида, для которого известна способность разрушать эндосомы, полученного из белка гемагглютинина вируса гриппа. Следующий протокол продемонстрировал эффективность для ряда клеток, однако как и рекомендовано выше, необходимо, чтобы дозы ДНК плазмиды и сверхзаряженного белка были оптимизированы для конкретных клеточных линий и различных применений способа доставки.

(1) За день до обработки высевают по 1×10⁵ клеток на лунку в 48-луночный планшет.

(2) В день обработки растворяют очищенный белок +36 GFP в питательных средах без сыворотки до конечной концентрации 2 нМ. Добавляют 1 мг ДНК плазмиды. Перемешивают с помощью устройства для встряхивания и инкубируют при комнатной температуре на протяжении 10 мин.

(3) Во время инкубации отбирают питательные среды клеток и промывают PBS один раз.

(4) После инкубации +36 GFP и ДНК плазмиды осторожно добавляют комплексы белок-ДНК к клеткам.

(5) Инкубируют клетки с комплексами при 37°C на протяжении 4 ч.

(6) После инкубации удаляют питательные среды, и промывают клетки PBS. Инкубируют клетки в содержащих сыворотку питательных средах и инкубируют следующие 24-48 часов.

(7) Анализируют доставку плазмиды (например, по управляемой плазмидой экспрессии генов) в зависимости от ситуации.

[619] См. также, например, McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116 (2009); Cronican et al., ACS Chemical Biology 5, 747-752 (2010); Cronican et al., Chemistry & Biology 18, 833-838 (2011); Thompson et al., Methods in Enzymology 503, 293-319 (2012); Thompson, D.B., et al., Chemistry & Biology 19 (7), 831-843 (2012). Способы с применением сверхзаряженных белков могут использоваться и/или адаптированы для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. Такие системы Dr. Lui и приведенные в настоящей заявке документы в совокупности с изложенными в настоящем описании идеями могут использоваться при доставке нацеленной на нуклеиновую кислоту систем(ы) или ее компонента(ов) или кодирующей молекул(ы) нуклеиновой кислот.

Пептиды, проникающие в клетки (CPP)

[620] В еще одном варианте осуществления изобретения рассмотрено использование пептидов, проникающих в клетки (CPP), для доставки системы CRISPR-Cas. CPP представляют собой короткие пептиды, которые облегчают захват клетками различных молекулярных грузов (от наноразмерных частиц до маленьких химических молекул и больших фрагментов ДНК). Термин "груз" как используют в настоящем описании, включает, но не ограничивается ими, состоящую из терапевтических агентов, диагностических зондов, пептидов, нуклеиновых кислот, антисмысловых олигонуклеотидов, плазмид, белков, частиц, включая наночастицы, липосом, хромофоров, низкомолекулярных соединений и радиоактивных материалов. Аспекты изобретения подразумевают также, что груз может также включать любой компонент системы CRISPR-Cas или целую функциональную систему CRISPR-Cas. В одном аспекте изобретение относится к следующим способам доставки желаемого груза индивиду, включающим: (a) получение комплекса, включающего пептид, который способен проникать в клетки, и желаемый груз, и (b) пероральное, внутрисуставное, внутрибрюшинное, интратекальное, внутриартериальное, интраназальное, внутрипаренхимное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, дермальное, ректальное или местное введение комплекса индивиду. Груз связывают с пептидами посредством химической связи (ковалентной) или посредством нековалентных взаимодействий.

[621] Функцией проникающих в клетки пептидов (CPP) является доставка груза в клетки - процесс, который обычно осуществляется посредством эндоцитоза груза, доставленного к эндосомам живых клеток млекопитающих. Проникающие в клетку пептиды (CPP) имеют различные размеры, последовательность аминокислот и заряд, но все CPP объединяет одна отличительная особенность, которая состоит в способности перемещаться через плазменную мембрану и облегчать доставку различных молекулярных грузов в цитоплазму или органеллы. Такое перемещение CPP может быть разделено на три главные группы в соответствии с механизмами входа: прямое проникновение через мембрану, опосредованный эндоцитозом вход и перемещение с формированием переходной структуры. CPP нашли многочисленные способы применения в медицине в качестве агентов доставки лекарственных средств при лечении различных заболеваний, включая противораковые средства и средства для лечения вирусных заболеваний, а также контрастирующих агентов для маркировки клетки. Примеры последних включают использование в качестве переносчика GFP, контрастирующих агентов для МРТ или квантовых точек. CPP имеют большой потенциал в качестве векторов как in vitro, так и in vivo доставки для исследований и использования в медицине. CPP, как правило, либо имеют аминокислотный состав с высоким относительным содержанием положительно заряженных аминокислот, таких как лизин или аргинин, либо содержат последовательности, имеющие чередующийся паттерн полярных/заряженных аминокислот и неполярных, гидрофобных аминокислот. Эти два типа структур обозначают как поликатионные или амфифильные соответственно. Третий класс CPP представляет собой гидрофобные пептиды, содержащие только неполярные остатки с низким суммарным зарядом или имеющие гидрофобные аминокислотные группы, которые крайне важны для клеточного захвата. Один из первых обнаруженных CPP - трансактивирующий активатор транскрипции (Tat) вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), который эффективно захватывается из питательных сред многочисленными типами культивируемых клеток. Позднее количество известных CPP значительно увеличилось, и были получены небольшие молекулярные синтетические аналоги, более эффективные при трансдукции белка. CPP включают, но не ограничиваются ими: пенетратин, Tat (48-60), транспортан и (R-AhX-R4) (Ahx=аминогексаноил).

[622] В патенте США 8372951 описан CPP, полученный из эозинофильного катионного белка (ECP), который демонстрирует высокую эффективность проникания в клетку и низкую токсичность. Также описаны особенности доставки CPP с грузом в представителях позвоночных. Будущие аспекты CPP и их доставки описаны в патентах США 8575305; 8614194 и 8044019. CPP может использоваться для доставки системы CRISPR-Cas или ее компонентов. Использование CPP для доставки системы CRISPR-Cas или ее компонентов также описано в рукописи "Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA", by Suresh Ramakrishna, Abu-Bonsrah Kwaku Dad, Jagadish Beloor, et al. Genome Res. 2014 Apr 2, [Epub в печати], включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном оъеме, где продемонстрировано, что лечение рекомбинантным белком Cas9, конъюгированным с CPP, и направляющими РНК в комплексе с CPP приводит к генным нарушениям эндогенного характера в клеточных линиях человека. В статье белок Cas9 был связан с CPP через тиоэфирную связь, тогда как направляющая РНК была в комплексе с CPP, формируя уплотненные, положительно заряженные частицы. Было показано, что одновременная и последовательная обработка клеток человека, включая эмбриональные стволовые клетки, фибробласты кожи, клетки HEK293T, клетки HeLa и эмбриональные клетки карциномы, модифицированным Cas9 и направляющей РНК, ведет к эффективным генным изменениям с уменьшением количества нецелевых мутаций по сравнению с трансфекцией плазмидами.

Имплантируемые устройства

[623] В другом варианте осуществления изобретения имплантируемые устройства также предусматриваются для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы, ее компонента (компонентов) или молекулы (молекул) нуклеиновых кислот, кодирующих их. Например, в публикации патентной заявки США 20110195123 описано имплантируемое медицинское устройство, которое местно элюирует лекарственное средство и находится в человеке длительное время, включая несколько типов такого устройства, способы лечения и способы имплантации. Устройство, включающее полимерную подложку, такую как матрица, например, которая используется в качестве корпуса устройства, и лекарственное средство, и в некоторых случаях дополнительные каркасные материалы, такие как металлы или дополнительные полимеры и материалы, чтобы увеличить видимость и визуализацию. Имплантируемое устройство может быть предпочтительно для местной доставки лекарственного средства в течение длительного периода, когда препарат доставляется непосредственно во внеклеточный матрикс (ECM) пораженной заболеванием области, такой как опухоль, область воспаления, дегенерации, или для симптоматического лечения, или к травмированным клеткам гладкой мускулатуры, или для профилактики. Одним типом лекарственного средства является РНК, как описано выше, и эта система может быть использована/и или адаптирована для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению. Способы имплантации в некоторых вариантах осуществления изобретения представляют собой существующие способы имплантации, которые разработаны и используются в настоящее время для других способов лечения, включая брахитерапию и биопсию при помощи иглы. В таких случаях размеры нового импланта, описанного в этом изобретении, подобны оригинальному импланту. Как правило, несколько устройств могут быть имплантированы во время одной лечебной процедуры.

[624] В публикации патента США 20110195123 описано лекарственное средство, которое обеспечивает имплантируемую или вставную систему, включая системы, применимые для полостей, таких как брюшная полость, и/или любого другого типа введения, в которых система доставки лекарственного средства не закреплена или прикреплена, содержащую биостабильную и/или разлагаемую и/или биоабсорбируемую полимерную подложку, которая в некоторых случаях может представлять собой, например, матрицу. Следует отметить, что термин "установка" также включает имплантацию. Система доставки лекарственного средства предпочтительно реализуется как "Loder", как описано в публикации патента США 20110195123.

[625] Полимер или множество полимеров являются биосовместимыми, включающими агент и/или множество агентов, что позволяет высвобождать агент с контролируемой скоростью, причем общий объем полимерного субстрата, такого как матрица, например, в некоторых вариантах осуществления необязательно и предпочтительно не превышают максимального объема, который позволяет достичь терапевтического уровня агента. В качестве неограничивающего примера такой объем предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 м³ до 1000 мм³, как того требует объем для загрузки агента. "Loder" в некоторых случаях может быть более крупным, например, когда он включен в устройство, размер которого определяется функциональностью, например, но без ограничения, коленный сустав, кольцо шейки матки и тому подобное.

[626] Система доставки лекарственного средства (для доставки состава) сконструирована в некоторых вариантах осуществления, чтобы предпочтительно использовать разлагаемые полимеры, где основным механизмом высвобождения является объемная эрозия; или в некоторых вариантах осуществления используются нерастворимые или медленно деградирующие полимеры, в которых основным механизмом высвобождения является диффузия, а не объемная эрозия, так что наружная часть функционирует как мембрана, а ее внутренняя часть функционирует как резервуар для лекарственных средств, который практически не испытывает влияния окружения в течение длительного периода времени (например, от недели до нескольких месяцев). Могут также использоваться комбинации различных полимеров с различными механизмами высвобождения. Градиент концентрации на поверхности предпочтительно эффективно поддерживается постоянным в течение значительной части полного периода высвобождения лекарственного средства, и поэтому скорость диффузии является фактически постоянной (называемой диффузией "нулевого режима"). Под термином "постоянная" подразумевается скорость диффузии, которая предпочтительно поддерживается выше нижнего порога терапевтической эффективности, но которая может по-прежнему в некоторых случаях иметь начальный всплеск и/или может колебаться, например увеличиваясь и уменьшаясь в определенной степени. Скорость диффузии предпочтительно поддерживают в течение длительного периода времени, и ее можно считать постоянной до определенного уровня для оптимизации терапевтически эффективного периода, например эффективного периода подавления экспрессии генов.

[627] Система доставки лекарственного средства необязательно и предпочтительно предназначена для защиты терапевтического агента на основе нуклеотидов от деградации, будь то химическая по своей природе или из-за действия ферментов и других факторов в организме индивида.

[628] Система доставки лекарственного средства, описанная в публикации патента США 20110195123, в некоторых случаях связана с чувствительными и/или активирующими устройствами, которые работают во время и/или после имплантации устройства, посредством неинвазивных и/или минимально инвазивных способов активации и/или ускорения/замедления, например, необязательно включая, но не ограничиваясь ими, нагревание и охлаждение, лазерные лучи и ультразвук, включая фокусированные ультразвуковые и/или радиочастотные (RF) способы или устройства.

[629] Согласно некоторым вариантам публикации патента США 010195123, область для местной доставки может необязательно включать целевые области, характеризующиеся высокой аномальной пролиферацией клеток и подавленным апоптозом, включая опухоли, активные и хронические воспаления и инфекции, включая аутоиммунные заболевания, дегенерацию тканей, включая мышцы и нервную ткань, хронические боли, участки дегенерации и места переломов костей и других ран для улучшения регенерации ткани и поврежденной сердечной, гладкой и поперечно-полосатой мускулатуры.

[630] Область для имплантации композиции или целевая область, предпочтительно представляет собой радиус, область и/или объем, который достаточно мал, для целенаправленной локальной доставки. Например, целевой участок произвольно имеет диаметр в диапазоне приблизительно от 0,1 мм до приблизительно 5 см.

[631] Местоположение целевой области должно быть выбрано предпочтительно для максимальной терапевтической эффективности. Например, композицию системы доставки лекарственных средств (необязательно с устройством для имплантации, как описано выше) необязательно и предпочтительно имплантируют непосредственно в саму опухоль или ее ближайшее окружение или связанные с ней кровеносные сосуды.

[632] Например, композицию (необязательно вместе с устройством) необязательно имплантируют непосредственно в или вблизи поджелудочной железы, предстательной железы, молочных желез, печени, через сосок, в сосудистую систему и т.д.

[633] Положение целевой области может быть выбрано из группы, включающей, по существу состоящей или состоящей из следующих примеров (не налагающих ограничений, поскольку любой участок тела может подходить для имплантации Loder): 1. дегенеративные участки мозга в базальных ганглиях, белом и сером веществе при заболеваниях Паркинсона или Альцгеймера, 2. позвоночник, например, в случае бокового амиотрофического склероза (ALS); 3. шейка матки для предотвращения инфекции вирусом папилломы человека (HPV); 4. суставы с острым и хроническим воспалением; 5. кожа, например, в случае псориаза; 6. симпатические и сенсорные нервы для получения обезболивающего эффекта; 7. внутрикостная имплантация; 8. области острой и хронической инфекции; 9. внутривлагалищная имплантация; 10. внутреннее ухо - слуховая система, лабиринт внутреннего уха, вестибулярная система; 11. внутритрахеальная имплантация; 12. внутрисердечная, коронарная, эпикардиальная имплантация; 13. имплантация в мочевой пузырь; 14. имплантация в желчную систему; 15. паренхимная ткань, включающая, не ограничиваясь, почкой, печенью, селезенкой; 16. лимфатические узлы; 17. слюнные железы; 18. десны; 19. внутрисуставная имплантация (в суставы); 20. внутриглазная имплантация; 21. ткани головного мозга; 22. желудочки мозга; 23. полости, включая брюшную полость (включая, не ограничиваясь, рак яичника); 24. внутрь пищевода и 25. ректально.

[634] В некоторых случаях введение системы (например, устройства, содержащего состав), связано с инъекцией материала во внеклеточный матрикс в целевой области и вблизи этой области для изменения локального значения pH, и/или температуры, и/или других биологических факторов, влияющих на диффузию препарата и/или фармакокинетику во внеклеточном матриксе целевой области и вблизи нее.

[635] В некоторых случаях, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, высвобождение указанного агента может быть связано с сенсорами и/или активирующими устройствами, управление которыми производится до и/или во время и/или после имплантации, неинвазивными и/или минимально инвазивными и/или другими способами активации и/или способами ускорения/замедления, включая использование лазерных лучей, радиации, нагревания и охлаждения, и ультразвуковое воздействие, включая фокусированный ультразвук и/или радиочастотные способы или устройства, а также химические активаторы.

[636] Согласно другим вариантам осуществления изобретения, описанным в публикации патента США 20110195123, используемый препарат предпочтительно включает РНК, например для локализованных случаев рака молочной железы, поджелудочной железы, мозга, почки, мочевого пузыря, легкого и простаты, как описано ниже. Несмотря на то, что в качестве примера приводится РНК-интерференция, многие лекарственные препараты применимы при инкапсулирования в "Loder", и могут использоваться совместно с данным изобретением при условии, что такие лекарственные препараты сами по себе могут быть инкапсулированы в субстрат "Loder", например, такой как матрица, и эта система может быть использована и/или адаптирована для доставки нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению.

[637] В качестве другого примера конкретного применения можно привести нервные и мышечные дегенеративные заболевания, развивающиеся из-за аномальной экспрессии генов. Локальная доставка РНК может проявлять терапевтическое действие свойства для изменения аномальной экспрессии генов. Локальная доставка антиапоптотических, противовоспалительных и антидегенеративных лекарственных препаратов, включая небольшие по размеру молекулы препаратов и макромолекулы может также быть терапевтической. В таких случаях "Loder "применяется для длительного высвобождения с постоянной скоростью и/или через специализированное устройство, которое имплантируется отдельно. Все это может быть использовано и/или адаптировано для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению.

[638] В качестве еще одного примера конкретного применения могут быть приведены психиатрические и когнитивные заболевания, которые можно лечить с помощью модификаторов активности генов. Генный нокдаун является вариантом лечения этих заболеваний. "Loder", местно доставляющие терапевтические агенты к участкам центральной нервной системы, являются терапевтическими вариантами лечения психиатрических и когнитивных заболеваний включая, но не ограничиваясь ими, психоз, биполярные расстройства, невротические заболевания и поведенческие расстройства. "Loder" также могут местно доставлять лекарственные препараты, включая небольшие молекулы лекарственных препаратов и макромолекулы после имплантации в конкретные области головного мозга. Все это может быть использовано и/или адаптировано для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению.

[639] Другим примером конкретного применения является подавление экспрессии врожденных и/или адаптивных медиаторов иммунитета в локальных участках, что позволяет предотвратить отторжение трансплантатов. Локальная доставка РНК и иммуномодулирующих реактивов с использованием Loder, имплантированного в пересаженный орган и/или область имплантации, способствует локальному иммунному подавлению, отражая иммуноциты, такие как CD, активированные в отношении пересаженного органа. Все это может быть использовано/и или адаптировано для нацеленной на нуклеиновую кислоту системы по настоящему изобретению.

[640] В качестве другого примера конкретного применения можно привести факторы роста сосудов, включая VEGF, ангиогенин и другие, необходимые для неоваскуляризации. Локальная доставка факторов, пептидов, пептидомиметиков или подавление их репрессоров является важным терапевтическим способом; подавление репрессоров и локальная доставка факторов, пептидов, макромолекул и небольших молекул лекарств, стимулирующих ангиогенез с помощью "Loder", являются терапевтическими для периферических, системных и сердечно-сосудистых заболеваний.

[641] Способ введения, такой как имплантация, может уже использоваться для других типов имплантации тканей и/или для введения и/или для отбора проб тканей, в некоторых случаях без модификаций, или, альтернативно, в некоторых случаях только с незначительными модификациями в таких способах. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, способы брахитерапии, биопсии, эндоскопии вместе с/или без применения ультразвука, такие как ретроградная холангиопанкреатография (ERCP,) стереотаксические способы для тканей головного мозга, лапароскопию, включая имплантацию лапароскопом в суставы, органы брюшной полости, стенку мочевого пузыря и полости тела.

[642] Обсуждаемая в настоящем описании технология имплантируемых устройств может быть использована в рамках настоящего изобретения и, следовательно, благодаря этой информации и знаниям в данной области, система CRISPR-Cas, ее компоненты, их молекулы нуклеиновых кислот, или кодирующие или обеспечивающие их компоненты могут быть доставлены через имплантируемое устройство.

Пациент-специфические способы скрининга

[643] Нацеленная на нуклеиновую кислоту система, которая нацелена на РНК, например, тринуклеотидные повторы, может быть использована для скрининга пациентов или образцов клеток/тканей пациентов на предмет наличия таких повторов. Повторы могут быть мишенью РНК системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, и при наличии связывания с ней с помощью системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, это связывание может быть обнаружено, тем самым указывая на то, что такой повтор присутствует. Таким образом, систему нацеливания на нуклеиновую кислоту можно использовать для скрининга пациентов или образцов клеток/тканей пациентов на наличие повторов. Затем пациенту можно назначить подходящее соединение (соединения) для лечения этого состояния; или может быть введена система нацеливания на нуклеиновую кислоту для связывания, которое приводит к инсерции, делеции или мутации и облегчению состояния.

[644] Изобретение относится к нуклеиновым кислотам для связывания последовательностей РНК-мишеней.

мРНК эффекторного белка CRISPR и направляющая РНК

[645] мРНК эффекторного белка CRISPR и направляющая РНК могут также доставляться отдельно. мРНК эффекторного белка системы CRISPR можно доставить до направляющей РНК, чтобы дать время для экспрессии белка CRISPR. мРНК эффекторного белка системы CRISPR можно вводить за 1-12 часов (предпочтительно приблизительно 2-6 часов) до введения направляющей РНК.

[646] Альтернативно, мРНК эффекторного белка CRISPR и направляющую РНК можно вводить вместе. Предпочтительно вторую усиливающую дозу направляющей РНК можно вводить через 1-12 часов (предпочтительно приблизительно 2-6 часов) после первоначального введения мРНК эффекторного белка CRISPR+направляющей РНК.

[647] Эффекторный белок CRISPR согласно настоящему изобретению, а именно эффекторный белок C2c2, иногда упоминается в настоящем описании как фермент CRISPR. Понятно, что эффекторный белок основан или получен из фермента, поэтому термин "эффекторный белок", безусловно, включает "фермент" в некоторых вариантах осуществления изобретения. Однако также следует понимать, что эффекторный белок может, как требуется в некоторых вариантах осуществления, связывать ДНК или РНК, но не обязательно разрезать или вносить одноцепочечный разрыв, что является функцией "мертвого" эффекторного белка Cas.

[648] Дополнительное введение мРНК эффекторного белка CRISPR и/или направляющей РНК может быть полезным для достижения наиболее эффективных уровней модификации генома. В некоторых вариантах осуществления фенотипическое изменение предпочтительно является результатом модификации генома, когда мишенью является генетическое заболевание, особенно в способах терапии, и предпочтительно, когда обеспечивается матрица репарации для коррекции или изменения фенотипа.

[649] В некоторых вариантах осуществления заболевания, которые могут быть мишенью, включают заболевания, которые связаны с дефектами сплайсинга.

[650] В некоторых вариантах осуществления клеточные мишени включают гемопоэтические стволовые клетки/клетки-предшественники (CD34+); Т-клетки человека; и клетки сетчатки - например, клетки-предшественники фоторецепторов.

[651] В некоторых вариантах осуществления гены-мишени включают: ген бета-глобина человека - HBB (для лечения серповидноклеточной анемии, включая стимуляцию генной конверсии (с использованием близкородственного гена HBD в качестве эндогенной матрицы)); CD3 (Т-клетки) и CEP920 - сетчатка (глаза).

[652] В некоторых вариантах осуществления болезни-мишени также включают: злокачественную опхуоль; серповидноклеточную анемию (основанную на точечной мутации); ВИЧ; бета-талассемию; и офтальмологические или глазные заболевания - например, амавроз Лебера (LCA), вызываемый дефектом сплайсинга.

[653] В некоторых вариантах осуществления способы доставки включают: опосредованную катионными липидами "прямую" доставку комплекса фермент-гид (рибонуклеопротеин) и электропорацию плазмидной ДНК.

[654] Способы по изобретению могут дополнительно включать доставку матриц, таких как матрицы репарации, которые могут представлять собой дцОДН или оцОДН, см. ниже. Доставка матриц может быть произведена одновременно или отдельно от доставки любого или всех эффекторных белков CRISPR или направляющих молекул, и через один и тот же механизм доставки или любой другой. В некоторых вариантах осуществления предпочтительно, чтобы матрица доставлялась вместе с направляющей молекулой и также предпочтительно эффекторным белком CRISPR. Примером может служить вектор AAV.

[655] Способы по изобретению могут дополнительно включать: (а) доставку в клетку двухцепочечного олигодезоксинуклеотида (дцОДН), включающего выступающие концы, комплементарные выступающим концам, созданным упомянутым разрывом двойной цепи, причем указанный дцОДН встраивается в локус-мишень, или - (б) доставку в клетку одноцепочечного олигодезоксинуклеотида (оцОДН), где указанный оцОДН действует как матрица для гомологичной направленной репарации разрыва двойной цепи. Способы по изобретению могут быть предназначены для профилактики или лечения заболевания у индивида, когда указанное заболевание вызвано дефектом в указанном локусе-мишени. Способы по изобретению могут осуществляться in vivo в индивидууме или ex vivo на клетке, взятой у индивида, где в некоторых случаях указанную клетку возвращают индивиду.

[656] Для минимизации токсичности и неспецифических эффектов важно контролировать концентрацию доставляемых мРНК эффекторного белка CRISPR и направляющей РНК. Оптимальные концентрации мРНК эффекторного белка CRISPR и направляющей РНК могут быть определены путем тестирования различных концентраций на клеточной или животной модели и с использованием глубокого секвенирования для анализа степени модификации в потенциально нецелевых геномных локусах. Например, для направляющей последовательности, нацеленной на 5'-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3' в гене EMX1 генома человека, глубокое секвенирование может быть использовано для оценки уровня модификации в следующих двух нецелевых локусах: 1: 5'-GAGTCCTAGC AGGAGAAG AA-3' и 2: 5'-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3'. Концентрация, которая дает наивысший уровень модификации мишени, минимизируя уровень внецелевой модификации, должна быть выбрана для доставки in vivo.

Индуцируемые системы

[657] В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок CRISPR может составлять компонент индуцируемой системы. Индуцируемый характер системы позволяет пространственно-временный контроль редактирования генов или экспрессии генов с использованием энергии. Форма энергии может включать, но не ограничивается ими, электромагнитное излучение, звуковую энергию, химическую энергию и тепловую энергию. Примеры индуцируемой системы включают стимулирующие тетрациклин промоторы (Tet-On или Tet-Off), системы двугибридной активации транскрипции с малой молекулой (FKBP, ABA и т.д.) или светоиндуцируемые системы (фитохром, LOV-домены или криптохром). В одном варианте осуществления эффекторный белок CRISPR может быть частью светоиндуцируемого эффектора транскрипции (LITE) для прямого изменения транскрипционной активности последовательность-специфическим образом. Светоиндуцируемые компоненты могут включать эффекторный белок CRISPR, светочувствительный гетеродимер цитохрома (например, Arabidopsis thaliana) и домен активации/репрессии транскрипции. Другие примеры индуцибельных связывающих ДНК белков и способы их применения приведены в US 61/736465 и US 61/721283 и WO 2014018423 A2, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Иллюстративные способы применения системы CRISPR Cas

[658] Изобретение относится к не встречающейся в природе или сконструированной способами инженерии композиции, или одному или более полинуклеотидам, кодирующим компоненты указанной композиции, или векторам или системам доставки, содержащим один или более полинуклеотидов, кодирующих компоненты указанной композиции, для применения для модификации клетки-мишени in vivo, ex vivo или in vitro, и это может быть осуществлено способом, который изменяет клетку таким образом, что после модификации потомки или клеточная линия модифицированной клетки CRISPR сохраняет измененный фенотип. Модифицированные клетки и их потомки могут быть частью многоклеточного организма, такого как растение или животное, с применением системы CRISPR ex vivo к желаемым типам клеток. Изобретение CRISPR может представлять собой терапевтический способ лечения. Терапевтический способ лечения может включать редактирование гена или генома, или генную терапию.

[659] В одном аспекте изобретение относится к способам модификации полинуклеотида-мишени в эукариотической клетке, которая может быть in vivo, ex vivo или in vitro. В некоторых вариантах осуществления способ включает отбор образца клетки или популяции клеток у человека или животного, не являющегося человеком, и модификацию клетки или клеток. Культивирование может происходить на любом этапе ex vivo. Клетка или клетки могут быть повторно введены в животное или растение, отличное от человека. Для вновь введенных клеток особенно предпочтительно, чтобы клетки были стволовыми клетками.

[660] В некоторых вариантах осуществления способ включает предоставление возможности CRISPR-комплексу связываться с полинуклеотидом-мишенью для осуществления расщепления указанного полинуклеотида-мишени, в результате чего происходит модификация полинуклеотида-мишени, где комплекс CRISPR содержит эффекторный белок CRISPR и направляющую последовательность, гибридизованную или способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде-мишени.

[661] В одном из вариантов изобретение относится к способу модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает предоставление комплексу CRISPR возможности связываться с полинуклеотидом, так что указанное связывание приводит к увеличению или уменьшению экспрессии указанного полинуклеотида; где комплекс CRISPR содержит эффекторный белок CRISPR, объединенный с направляющей последовательностью, гибридизованной или способной к гибридизации с последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде. Аналогичные соображения и условия применяются, как указано выше, для способов модификации полинуклеотида-мишени. Фактически, эти варианты отбора проб, культивирования и повторного введения применяются во всех аспектах настоящего изобретения.

[662] Действительно, в любом аспекте изобретения комплекс CRISPR может содержать эффекторный белок CRISPR в комплексе с направляющей последовательностью, гибридизованной или способной к гибридизации с последовательностью-мишенью. Аналогичные соображения и условия применяются, как указано выше, для способов модификации полинуклеотида-мишени.

[663] Таким образом, любой из не встречающихся в природе эффекторных белков CRISPR, описанных в настоящем описании, имеет по меньшей мере одну модификацию, и, тем самым, эффекторный белок обладает определенными улучшенными возможностями. В частности, любой из эффекторных белков способен образовывать комплекс CRISPR с направляющей РНК. Когда такой комплекс образуется, направляющая РНК способна связываться с полинуклеотидной последовательностью-мишенью, и эффекторный белок способен модифицировать локус-мишень. Кроме того, эффекторный белок в комплексе CRISPR уменьшает способность модифицировать один или более локусов-мишеней по сравнению с немодифицированным ферментом/эффекторным белком.

[664] Кроме того, модифицированные ферменты CRISPR, описанные в настоящем описании, охватывают ферменты которые обеспечивают повышение способности эффекторного белка комплекса CRISPR модифицировать один или более локусов-мишеней по сравнению с немодифицированным ферментом/эффекторным белком. Такая функция может быть предоставлена отдельно или предоставлена в сочетании с вышеописанной уменьшенной способностью модифицировать один или более локусов, не являющихся мишенями. Любые такие эффекторные белки могут быть снабжены любой из дополнительных модификаций в эффекторном белке CRISPR, как описано в настоящем описании, например, в сочетании с любой активностью, обеспечиваемой одним или более связанными гетерологичными функциональными доменами, любыми другими мутациями для снижения активности нуклеазы и т.п.

[665] В предпочтительных вариантах осуществления изобретения модифицированный эффекторный белок CRISPR обладает сниженной способностью модифицировать один или более локусов, не являющихся мишенями, по сравнению с немодифицированным ферментом/эффекторным белком и повышает способность модифицировать один или более локусов-мишеней по сравнению с немодифицированным ферментом/эффекторным белком. В сочетании с дополнительными модификациями эффекторного белка может быть достигнута значительно увеличенная специфичность. Например, комбинация таких предпочтительных вариантов осуществления с одной или более дополнительными мутациями предусматривается в том случае, если одна или более дополнительных мутаций находятся в одном или более активных каталитически активных доменах. В таких эффекторных белках повышенная специфичность может быть достигнута благодаря улучшенной специфичности в отношении активности эффекторного белка.

[666] Модификации для уменьшения нецелевых эффектов и/или усиления целевых эффектов, как описано выше, могут быть сделаны для аминокислотных остатков, расположенных в положительно заряженной области/желобке, расположенных между доменами RuvC-III и HNH. Понятно, что любой из описанных выше функциональных эффектов может быть достигнут путем модификации аминокислот в вышеупомянутом желобке, а также путем модификации аминокислот, смежных с этим желобком или вне него.

[667] Дополнительные функциональные возможности, которые могут быть внесены способами инженерии в модифицированные эффекторные белки CRISPR, как описано в настоящем описании, включают следующие. 1. модифицированные эффекторные белки CRISPR, которые нарушают взаимодействия ДНК:белок, не влияя на третичную или вторичную структуру белка. Это включает остатки, которые контактируют с любой частью дуплекса РНК:ДНК. 2. модифицированные эффекторные белки CRISPR, которые ослабляют внутрибелковые взаимодействия путем поддержания C2c2 в конформации, необходимой для нуклеазного разрезания в ответ на связывание ДНК (целевое или нецелевое). Например, модификация, которая мягко ингибирует, но все равно допускает конформацию нуклеазы домена HNH (расположена на расщепляющемся фосфате), 3. модифицированные эффекторные белки CRISPR, которые усиливают внутрибелковые взаимодействия путем поддержания C2c2 в конформации, ингибирующей активность нуклеазы в реакции связывания ДНК (целевой или нецелевой). Например: модификация, которая стабилизирует HNH-домен в конформации расщепляющегося фосфата. Любое такое дополнительное функциональное усиление может быть обеспечено в сочетании с любой другой модификацией эффекторного белка CRISPR, как подробно описано в данной заявке в другом пункте.

[668] Любая из описанных в настоящем описании улучшенных функциональных возможностей может быть внесена способами инженерии в любой эффекторный белок CRISPR, такой как эффекторный белок C2c2. Однако будет понятно, что любая из описанных в настоящем описании функциональных возможностей может быть внесена способами инженерии в эффекторные белки C2c2 из других ортологов, включая химерные эффекторные белки, содержащие фрагменты из множества ортологов.

[669] В рамках изобретения используются нуклеиновые кислоты для связывания последовательностей ДНК-мишеней. Это перспективно, так как нуклеиновые кислоты намного легче и дешевле производить, чем белки, а также специфичность может варьироваться в зависимости от длины участка, гомологии которого требуется. Например, не требуется сложное трехмерное позиционирование нескольких пальцев. Термины "полинуклеотид", "нуклеотид", "нуклеотидная последовательность", "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" используются взаимозаменяемо. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидов, либо рибонуклеотидов, или их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут выполнять любую из возможных известных или неизвестных функций. Ниже приведены неограничивающие примеры полинуклеотидов: кодирующие или некодирующие области гена или фрагмента гена, локусы (локус), определенные из анализа сцепления, экзоны, интроны, информационные РНК (мРНК), транспортные РНК (тРНК), рибосомные РНК (рРНК), малые интерферирующие РНК (миРНК), короткие шпилечные РНК (кшРНК), микроРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. Этот термин также охватывает структуры, подобные нуклеиновой кислоте, с синтетическими скелетами, см., например, Eckstein, 1991; Baserga et al., 1992; Milligan, 1993; WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, 1997; Strauss-Soukup, 1997; and Samstag, 1996. Полинуклеотид может содержать один или более модифицированных нуклеотидов, таких как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. При их наличии, модификации нуклеотидной структуры могут происходить до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с меченым компонентом. Используемый в настоящем описании термин "дикий тип" является термином, понятным специалистам, и означает типичную форму организма, штамма, гена или характеристик, которая существует в природе, в отличие от мутантных или вариантных форм. "Дикий тип" может быть базовой линией. Как используют в настоящем описании, термин "вариант" следует понимать как проявление качеств, отличающихся от существующих в природе. Термины "не встречающиеся в природе" или "сконструированные способами инженерии" используются взаимозаменяемо и указывают на участие руки человека. Термины, относящиеся к молекулам нуклеиновой кислоты или полипептидам, означают, что молекула нуклеиновой кислоты или полипептид по меньшей мере по существу свободна от по меньшей мере одного другого компонента, с которым они естественно связаны в природе и существуют в природе. "Комплементарность" относится к способности нуклеиновой кислоты образовывать водородную связь (связи) с другой последовательностью нуклеиновой кислоты либо традиционным спариванием оснований Уотсона-Крика, либо другими нетрадиционными типами. Процентная комплементарность обозначает процентное содержание остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать водородные связи (например, уотсон-криковское спаривание оснований) со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10 из 10 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100% комплементарные). "Полностью комплементарные" означает, что все смежные остатки последовательности нуклеиновой кислоты связаны водородной связью с таким же количеством смежных остатков во второй последовательности нуклеиновой кислоты. "По существу комплементарные", как используется в настоящем описании, относится к степени комплементарности, которая составляет по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% в области 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более нуклеотидов или относится к двум нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в жестких условиях. Как используют в настоящем описании, термин "жесткий условия" для гибридизации относится к условиям, при которых нуклеиновая кислота, имеющая комплементарность с последовательностью-мишенью, преимущественно гибридизуется с последовательностью-мишенью и по существу не гибридизуется с последовательностями, не являющимися мишенями. Жесткие условия, как правило, зависят от последовательности и меняются в зависимости от ряда факторов. В общем, чем длиннее последовательность, тем выше температура, при которой последовательность специфически гибридизуется с ее целевой последовательностью. Неограничивающие примеры жестких условий подробно описаны в Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y. Когда приводится полинуклеотидная последовательность, то также предусматриваются комплементарные или частично комплементарные последовательности. Они предпочтительно способны гибридизироваться с упоминаемой последовательностью в очень жестких условиях. Как правило, для максимизации скорости гибридизации выбирают условия относительно низкой гибридизации: примерно на 20-25°C ниже, чем термическая температура плавления (Tm). Tm представляет собой температуру, при которой 50% конкретной последовательности-мишени гибридизуется с идеально комплементарным зондом в растворе при определенной ионной силе и рН. Как правило, для того, чтобы требовать по меньшей мере ~85% нуклеотидной комплементарности гибридизованных последовательностей, выбирают очень жесткие условия промывки примерно на 5-15°C ниже, чем Tm. Чтобы требовать по меньшей мере приблизительно 70% нуклеотидной комплементарности гибридизованных последовательностей, выбирают умеренно жесткие условия промывки примерно на 15-30°C ниже, чем Tm. Условия высокой разрешимости (очень низкая жесткость) могут быть на 50°C ниже Tm, что обеспечивает высокий уровень ошибочного соответствия между гибридизованными последовательностями. Специалисты в данной области понимают, что другие физические и химические параметры на этапах гибридизации и промывки также могут быть изменены для влияния на результат детектируемого сигнала гибридизации с определенного уровня гомологии между последовательностями-мишенями и зондами. Предпочтительные очень жесткие условия включают инкубацию в 50% формамиде, 5×SSC и 1% SDS при 42°C или инкубацию в 5×SSC и 1% SDS при 65°C с промывкой 0,2×SSC и 0,1% SDS при 65°C. "Гибридизация" относится к реакции, в которой один или более полинуклеотидов реагируют с образованием комплекса, который стабилизируется посредством водородной связи между основаниями нуклеотидных остатков. Водородное связывание может происходить по принципу спаривания оснований Уотсона-Крика, хугстиновского связывания или любым другим способом, специфичным для последовательности. Комплекс может содержать две цепи, образующие дуплексную структуру, три или более цепей, образующих многоцепочечный комплекс, одну цепь, которая гибридизируется сама с собой, или любую их комбинацию. Реакция гибридизации может представлять собой стадию в более широком процессе, таком как инициирование ПЦР или расщепление полинуклеотида ферментом. Последовательность, способная к гибридизации с данной последовательностью, называется "комплементарной" данной последовательности. Используемый в настоящем описании термин "геномный локус" или "локус" (множественное число: локусы) представляет собой специфическое местоположение гена или последовательности ДНК на хромосоме. "Ген" относится к участкам ДНК или РНК, которые кодируют полипептид или цепь РНК, которая играет функциональную роль в организме и, следовательно, является молекулярной единицей наследственности в живых организмах. Для целей настоящего изобретения можно считать, что гены включают области, которые регулируют продукцию гена, независимо от того, являются ли такие регулятивные последовательности "смежными" с кодирующими и/или транскрибируемыми последовательностями. Соответственно, ген включает, но не обязательно ограничивается ими, последовательности промоторов, терминаторы, последовательносты регуляторов трансляции, такими как сайты связывания рибосом и внутренние сайты входа рибосомы, энхансеры, сайленсеры, изоляторы, пограничные элементы, точки начала репликации, сайты прикрепления матрикса и области контроля локуса. Как используют в настоящем описании, термин "экспрессия геномного локуса" или "экспрессия гена" представляет собой процесс, посредством которого информация, заключенная в гене, используется для синтеза функционального генного продукта. Продукты экспрессии генов часто являются белками, но в генах, не содержащих белок, таких как гены рРНК или гены тРНК, продукт представляет собой функциональную РНК. Процесс экспрессии генов используется всеми известными живыми организмами - эукариотами (включая многоклеточные организмы), прокариотами (бактериями и археями) и вирусами для выработки функциональных продуктов для выживания. Как используют в настоящем описании, термин "экспрессия" гена или нуклеиновой кислоты охватывает не только экспрессию клеточного гена, но также транскрипцию и трансляцию нуклеиновой кислоты (кислот) в системах клонирования и в любом другом контексте. Как используют в настоящем описании, термин "экспрессия" также относится к способу, посредством которого полинуклеотид транскрибируется из ДНК-матрицы (например, в мРНК или другой транскрипт РНК), и/или к процессу, посредством которого транскрибированная мРНК затем транслируется в пептиды, полипептиды или белки. Транскрипты и кодированные полипептиды могут в совокупности обозначаться как "генный продукт". Если полинуклеотид получен из геномной ДНК, экспрессия может включать сплайсинг мРНК в эукариотической клетке. Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и может быть прерван неаминокислотами. Термины также включают модифицированный аминокислотный полимер; например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидацию, ацетилирование, фосфорилирование или любые другие манипуляции, такие как конъюгация с меченым компонентом. Как используют в настоящем описании, термин "аминокислота" включает природные и/или неприродные или синтетические аминокислоты, включая глицин и оба оптических изомера D или L, а также аминокислотные аналоги и пептидомиметики. Как используют в настоящем описании, термин "домен" или "белковый домен" относится к части белковой последовательности, которая может существовать и функционировать независимо от остальной белковой цепи. Как описано для аспектов данного изобретения, идентичность последовательности связана с гомологией последовательности. Сравнения гомологии могут проводиться на глаз или, чаще всего, с помощью легкодоступных программ сравнения последовательностей. Эти коммерчески доступные компьютерные программы могут вычислять процентную (%) гомологию между двумя или более последовательностями и также могут вычислять идентичность последовательностей, которой обладают две или более последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот.

[670] В определенных вариантах изобретения термин "направляющая РНК" относится к полинуклеотидной последовательности, содержащей одну или более предполагаемых или идентифицированных tracr-последовательностей и предполагаемых или идентифицированных последовательностей cr-РНК или направляющей последовательности. В конкретных вариантах осуществления "направляющая РНК" включает предполагаемую или идентифицированную последовательность cr-РНК или направляющую последовательность. В других вариантах осуществления направляющая РНК не включает предполагаемую или идентифицированную tracr-последовательность.

[671] Как используют в настоящем описании, термин "дикий тип" является термином, понятным квалифицированным специалистам, и означает типичную форму организма, штамма, гена или характеристики в том виде, как они встречаются в природе, в отличие от мутантных или вариантных форм. "Дикий тип" может быть базовой линией.

[672] Как используют в настоящем описании, термин "вариант" следует понимать как проявление свойств, которые имеют характерные черты, по которым эти свойства отличаются от природных свойств.

[673] Термины "неприродный" или "сконструированный способами инженерии" используются взаимозаменяемо и указывают на вмешательство человека. Эти термины, относящиеся к молекулам нуклеиновой кислоты или полипептидам, означают, что молекула нуклеиновой кислоты или полипептид по меньшей мере в некоторой степени лишены одного другого компонента, с которым они естественным образом ассоциированы в своем природном виде. Во всех аспектах и вариантах осуществления, независимо от того, включают ли они эти термины или нет, следует понимать, что использование этих терминов необязательно и, следовательно, не существует предпочтения по их включению. Кроме того, термины "неприродный" или "полученный способами инженерии" могут использоваться взаимозаменяемо и поэтому могут применяться по отдельности или вместе, и то или другое может заменить упоминание обоих вместе. В частности, "полученный способами инженерии" предпочтительнее вместо "неприродный" или "неприродный и/или полученный способами инженерии".

[674] Гомология последовательностей может быть определена любой из ряда компьютерных программ, известных в данной области, например BLAST или FASTA et al. Подходящей для выполнения такого выравнивания компьютерной программой является пакет GCG Wisconsin Bestfit (Университет Висконсина, США, University of Wisconsin, U.S.A; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Примеры другого программного обеспечения, способного выполнять сравнения последовательностей, включают, без наложения ограничений, пакет BLAST (см. Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) и набор инструментов сравнения GENEWORKS. Как BLAST, так и FASTA доступны для поиска оффлайн и онлайн (см. Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60). При этом предпочтительно использование программы GCG Bestfit. Процент (%) гомологии последовательно может быть рассчитан для перекрывающихся последовательностей, т.е. одна последовательность выровнена против другой и аминокислота или нуклеотид одной последовательности напрямую сравнивается с соответствующей другой аминокислотой или нуклеотидом другой последовательности по одной(му) за раз. В этом случае его называют "выравнивание без пропусков". Обычно такое выравнивание без пропусков выполнятся только для сравнительно небольшого числа остатков. Хотя это очень простой и логичный способ, он не способен рассматривать, к примеру, случаи идентичных в других отношениях пары последовательностей, где одна инсерция или делеция может привести к тому, что последующий аминокислотный остаток окажется вне рассмотрения выравнивания, тем самым приводя к возможному большому уменьшению % гомологии при выполнении глобального выравнивания. В результате большинство способов сравнения последовательностей разработаны для проведения оптимального выравнивания с учетом возможных инсерций и делеций без необоснованного наложения штрафа общей гомологии или балла идентичности. Это достигается путем вставления "пропусков" в выравнивании последовательности с целью максимизации локальной гомологии или идентичности. Однако такие более сложные способы налагают "штраф за внесение пропуска" для каждого пропуска, возникающего в выравнивании, так что для того же числа идентичных аминокислот возможно добавление нескольких пропусков - что отражает более близкое родство между двумя сравниваемыми последовательностями - и позволяет достичь более высокого балла, чем в случае одной со многими пропусками. "Цена сродства пропусков" обычно используется для наложения сравнительно большого штрафа за присутствие пропуска и меньшее - за каждый последующий остаток в пропуске. Это наиболее часто используемая система оценки пропусков. Высокие штрафы за пропуски могут, разумеется, давать в результате оптимизированные выравнивания с меньшим числом пропусков. Большинство программ выравнивания допускают внесение изменений в штрафы за пропуски. Однако предпочтительно использование исходных значений при использовании такого программного обеспечения для сравнения последовательностей. Например, при использовании пакета GCG Wisconsin Bestfit исходный штраф за пропуск в аминокислотных последовательностях равен -12 за каждый пропуск и -4 за каждую вставку. Расчет максимального % гомологии, таким образом, сначала требует проведения оптимального выравнивания с рассмотрением штрафов за пропуски. Подходящая компьютерная программа для проведения такого выравнивая - пакет GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984 Niic. Acids Research 12 p387). Примерами другого программного обеспечения, способного выполнять сравнение последовательностей являются, но не ограничиваются ими, пакеты BLAST (см. Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4to Ed. - Chapter 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol Biol. 403-410) и набор инструментов сравнения GENEWORKS. Как BLAST, так и FASTA доступны для поиска оффлайн и онлайн (см. Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60). Однако для решения некоторых задач предпочтительно использование программы GCG Bestfit. Новый инструмент, называющийся BLAST 2 Sequences, также используется для сравнения белковых и нуклеотидных последовательностей (см. FEMS Microbiol Lett. 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett. 1999 177(1): 187-8 и веб-сайт Национального Центра Биотехнологии на веб-сайте Национального Института Здравоохранения США). Хотя конечный % гомологии может быть измерен в смысле идентичности, процесс проведения выравнивания сам по себе не основан на сравнении "все-или-ничего" пар. Вместо этого обычно используется масштабированная матрица оценки сходства для расчета баллов для каждого попарного сравнения на основе химического сходства или эволюционного расстояния. Примером такой часто используемой матрицы является матрица BLOSUM62 - матрица, используемая по умолчанию для набора программ BLAST. Программы GCG Wisconsin обычно используют либо общедоступные значения по умолчанию, либо пользовательскую таблицу сравнения символов при ее наличии (см. руководство пользователя для дальнейших деталей). Для решения некоторых задач предпочтительно использование общедоступных значений по умолчанию пакета GCG или, в случае другого программного обеспечения, матрицы по умолчанию, такой как BLOSUM62. Альтернативно этому, процент гомологии может быть рассчитан с использованием свойства множественного выравнивания из DNASIS™ (Hitachi Software), основанного на алгоритме, аналогичном CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PIVI (1988), Gene 73(1), 237-244). После того как программное обеспечение нашло оптимальное выравнивание, становится возможным рассчитать % гомологии, предпочтительно % идентичности последовательности. Данное программное обеспечение обычно производит это в ходе сравнения последовательностей и приводит численный результат. Последовательности могут также иметь делеции, инсерции или замены аминокислотных остатков, что приводит к изменению без уведомления и получению в результате функционально эквивалентных состояний. Преднамеренные замены аминокислот могут быть сделаны на основе сходства в свойствах аминокислот (таких как полярность, заряд, растворимость, гидрофобность, гидрофильность и/или амфипатическая природа остатков) и, как следствие, полезны для объединения аминокислот в функциональные группы. Аминокислоты могут быть сгруппированы на основе свойств только их боковых цепей. Однако более целесообразно также включать данные о мутациях. Наборы аминокислот, полученные таким образом, с большой вероятностью являются консервативными в связи с их структурой. Такие наборы могут быть описаны в форме диаграмм Венна (Livingstone C.D. and Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl. Biosci. 9: 745-756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol 119, 205-218). Могут быть произведены консервативные замены, например в соответствии с таблицей ниже, которая описывает общепринятую группировку аминокислот в виде диаграммы Венна.

Группа Подгруппа Гидрофобные F W Y H К M I L V A G C Ароматические F W Y H Алифатические I L V Полярные W Y H K R E D C S T N Q Заряженные H K R E D Положительно заряженные H K R Отрицательно заряженные E D Маленькие V C A G S P T N D Очень маленькие A G S

[675] Термины "субъект", "индивид" и "пациент" используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения позвоночного, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека. Млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, мышей, обезьян, людей, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и домашних животных. Также охватываются ткани, клетки и их потомки, полученные от биологического объекта in vivo или культивируемые in vitro.

[676] Термины "терапевтический агент", "терапевтически способный агент" или "лечебный агент" используются взаимозаменяемо и относятся к молекуле или соединению, которые придают какой-либо полезный эффект при введении индивиду. Полезный эффект включает обеспечение диагностических определений; облегчение протекания заболевания, симптома, расстройства или патологического состояния; уменьшение или предотвращение возникновения заболевания, симптома, расстройства или состояния; и в целом противодействие заболеванию, симптому, расстройству или патологическому состоянию.

[677] Как используют в настоящем описании, термины "лечение" или "облегчение" или "улучшение" используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к подходу для получения полезных или желаемых результатов, включая, но не ограничиваясь ими, терапевтический эффект и/или профилактическую пользу. Под терапевтическим эффектом понимается любое терапевтически значимое улучшение или воздействие на одно или более заболеваний, состояний или симптомов, подлежащих лечению. Для профилактической пользы конструкции могут вводиться индивиду, подверженному риску развития конкретного заболевания, состояния или симптома, или индивиду, демонстрирующему один или более физиологических симптомов заболевания, хотя болезнь, состояние или симптом, возможно, еще не проявились.

[678] Термин "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" относится к количеству агента, достаточному для получения полезных или желаемых результатов. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от одного или более факторов: индивид и состояние заболевания, подвергаемого лечению, вес и возраст индивида, тяжесть заболевания, способ введения и т.п., которые могут быть легко определены специалистом в данной области. Этот термин также относится к дозе, которая обеспечит визуализацию для обнаружения любым из способов визуализации, описанных в настоящем описании. Конкретная доза может варьироваться в зависимости от одного или более факторов: выбранный конкретный агент, режим дозирования, который следует соблюдать, введение комбинации с другими соединениями, время введения, подлежащая визуализации ткань и физическая система доставки.

[679] В практике настоящего изобретения используются, если не указано иначе, общепринятые способы иммунологии, биохимии, химии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии, геномики и рекомбинантных ДНК, которые входят в компетенции специалистов. См. Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F, M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Flames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

[680] Несколько аспектов изобретения относятся к векторным системам, содержащим один или более векторов, или к векторам как таковым. Векторы могут быть разработаны для экспрессии транскриптов CRISPR (например, транскриптов нуклеиновых кислот, белков или ферментов) в прокариотических или эукариотических клетках. Например, транскрипты CRISPR могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как Escherichia coli, клетках насекомых (с использованием экспрессирующих векторов бакуловируса), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева обсуждаются далее в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор можно транскрибировать и транслировать in vitro, например, с использованием регуляторных последовательностей промотора T7 и полимеразы T7.

[681] Варианты осуществления изобретения включают последовательности (как полинуклеотидные, так и полипептидные), которые могут содержать гомологичную замену ("замещение" используются в настоящем описании для обозначения обмена существующего аминокислотного остатка или нуклеотида с альтернативным остатком или нуклеотидом), которая может происходить, например, для подобной замены в случае аминокислот, таких как основные для основных, кислотные для кислотных, полярные для полярных и т.д. Негомологичное замещение может также происходить, то есть из одного класса остатков в другой или, в качестве альтернативы, включение неестественных аминокислот, таких как орнитин (далее обозначаемый как Z), орнитин диаминомасляной кислоты (далее называемый B), норлейцин орнитин (далее называемый O), пироариланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин. Вариантные аминокислотные последовательности могут включать подходящие спейсерные группы, которые могут быть вставлены между любыми двумя аминокислотными остатками последовательности, включая алкильные группы, такие как метил-, этил- или пропильные группы, в дополнение к аминокислотным спейсерам, таким как остатки глицина или β-аланина. Специалисты в данной области могут хорошо понимать дальнейшую форму вариации, которая включает присутствие одного или более аминокислотных остатков в пептоидной форме. Во избежание сомнений, "пептоидная форма" используется для обозначения вариантов аминокислотных остатков, в которых α-углеродная заместительная группа находится на атоме азота остатка, а не на α-углероде. Способы получения пептидов в пептоидной форме известны в данной области, например, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 и Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134.

[682] Моделирование гомологии: соответствующие остатки в других ортологах C2c2 могут быть идентифицированы с помощью способов Zhang et al., 2012 (Nature, 490 (7421): 556-60) и Chen et al., 2015 (PLoS Comput Biol; 11 (5): e1004248) - способ вычисления белок-белкового взаимодействия (PP1) для прогнозирования взаимодействий, опосредованных поверхностями контакта домен-мотив. PrePPI (Predicting PPI), основанный на структуре способ прогнозирования PPI, объединяет структурные доказательства с неструктурными данными с использованием байесовской статистической модели. Способ включает взятие пары белков запроса и использование структурного выравнивания для идентификации структурных представителей, соответствующим либо их экспериментально определенным структурам, либо гомологичным моделям. Структурное выравнивание далее используется для идентификации как близких, так и отдаленных структурных соседей путем рассмотрения глобальных и локальных геометрических отношений. Всякий раз, когда два соседа структурных представителей образуют комплекс, указанный в Protein Data Bank, это определяет шаблон для моделирования взаимодействия между двумя белками запросов. Модели комплекса создаются путем наложения репрезентативных структур на соответствующего структурного соседа в шаблоне. Этот подход далее описан в Dey et al, 2013 (Prot Sci, 22: 359-66).

[683] Для целей настоящего изобретения амплификация означает любой способ, использующий праймер и полимеразу, способную реплицировать последовательность-мишень с разумной точностью. Амплификацию можно проводить с помощью природных или рекомбинантных ДНК-полимераз, таких как ДНК-полимераза TaqGold™, T7, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E.coli и обратная транскриптаза. Предпочтительным способом амплификации является ПЦР.

[684] В некоторых вариантах изобретение включает векторы. Как используют в настоящем описании, термин "вектор" представляет собой инструмент, который позволяет или облегчает передачу объекта из одной среды в другую. Это репликон, такой как плазмида, фаг или космида, в которые может быть вставлен другой сегмент ДНК, чтобы вызвать репликацию вставленного сегмента. Как правило, вектор способен к репликации, когда он связан с соответствующими элементами управления. В общем, термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Векторы включают, но не ограничиваются, молекулами нуклеиновых кислот, которые являются однонитевыми, двухцепочечными или частично двухцепочечными; молекулами нуклеиновых кислот, которые содержат один или более свободных концов, или не содержат свободных концов (например, круглые); молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат ДНК, РНК или и то, и другое; и другие разновидности полинуклеотидов, известных в данной области. Один тип вектора представляет собой "плазмиду", которая относится к круглой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть добавлены дополнительные сегменты ДНК стандартными способами молекулярного клонирования. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором в векторе для упаковки в вирус присутствуют вирусные ДНК или РНК (например, ретровирусы, ретровирусы с дефектами репликации, аденовирусы, аденовирусы с дефектами репликации и аденоассоциированные вирусы (AAV)). Вирусные векторы также включают полинуклеотиды, переносимые вирусом для трансфекции в клетку-хозяина. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина, после введения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы упоминаются в настоящем описании как "экспрессирующие векторы". Обычные экспрессирующие векторы, использующиеся в способах рекомбинантной ДНК, часто имеют форму плазмид.

[685] Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут содержать нуклеиновые кислоты по изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновых кислот в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантные экспрессирующие векторы включают один или более регуляторных элементов, которые могут быть выбраны на основе клеток-хозяев, используемых для экспрессии, и которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновых кислот, которая должна быть экспрессирована. Внутри рекомбинантного экспрессирующего вектора "функционально связанный" означает, что целевая нуклеотидная последовательность связана с регуляторным элементом(ами) таким образом, который позволяет экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в системе in vitro транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, когда вектор вводится в клетку-хозяина). Что касается способов рекомбинации и клонирования, может быть упомянута заявка на патент США 10/815730, опубликованная 2 сентября 2004 года в качестве US 2004-0171156 A1, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полом объеме.

[686] Аспекты изобретения относятся к бицистронным векторам для направляющей РНК и РНК дикого типа, модифицированных или мутированных эффекторных белков/ферментов CRISPR (например, C2c2). Бицистронные экспрессирующие векторы направляющей РНК и РНК дикого типа, модифицированных или мутированных эффекторных белков/ферментов CRISPR (например, C2c2). В целом и, в частности, в этом варианте осуществления и диком типе, модифицированные или мутированные эффекторные белки/ферменты CRISPR (например, C2c2) предпочтительно находятся под контролем промотора CBh. РНК может предпочтительно находиться под контролем промотора РНК-полимеразы III, такого как промотор U6. В идеале эти два промотора сочетаются.

[687] В некоторых вариантах осуществления предусмотрена петля в направляющей РНК. Это может быть шпилька или тетрапетля. Петля предпочтительно представляет собой GAAA, но не ограничивается этой последовательностью или даже длиной 4 п.о. Действительно, предпочтительные последовательности формирования петли для использования в структурах шпильки имеют длину четыре нуклеотида и наиболее предпочтительно имеют последовательность GAAA. Однако могут использоваться более длинные или более короткие последовательности петель, а также альтернативные последовательности. Последовательности предпочтительно включают нуклеотидный триплет (например, AAA) и дополнительный нуклеотид (например, C или G). Примеры последовательностей, формирующих петли, включают CAAA и AAAG.

[688] При осуществления любого из способов, описанных в настоящем описании, подходящий вектор может быть введен в клетку или эмбрион посредством одного или более способов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, микроинъекцию, электропорацию, сонопорацию, биолистику, опосредованную фосфатом кальция трансфекцию, катионную трансфекцию, трансфекцию липосом, трансфекцию дендримера, трансфекцию теплового шока, нуклеофекцию, магнитотрансфекцию, липофекцию, импалефекцию, оптическую трансфекцию, запатентованное усиленное агентом поглощение нуклеиновых кислот, доставку посредством липосом, иммунолипосом, виросом или искусственных вирионов. В некоторых способах вектор вводится в эмбрион путем микроинъекции. Вектор или векторы могут быть введены посредством микроинъекции в ядро или цитоплазму эмбриона. В некоторых способах вектор или векторы могут быть введены в клетку путем нуклеофекции.

[689] Термин "регуляторный элемент" используется для обозначения промоторов, энхансеров, участков внутренней посадки рибосомы (IRES) и других элементов управления экспрессией (например, сигналов терминации транскрипции, таких как сигналы полиаденилирования и последовательности поли-U). Такие регуляторные элементы описаны, например, в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Регуляторы включают как те, которые напрямую определяют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, так и те, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Тканеспецифический промотор может управлять экспрессией в основном в желаемой интересующей ткани, такой как мышца, нейрон, кость, кожа, кровь, специфические органы (например, печень, поджелудочная железа) или конкретные типы клеток (например, лимфоциты). Регуляторные элементы также могут управлять экспрессией в зависимости от времени, например, в зависимости от стадии клеточного цикла или стадии развития, и могут быть или не быть специфичным для тканей или клеток. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит один или более промоторов ДНК-полимеразы III (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов ДНК-полимеразы III), один или более промоторов ДНК-полимеразы II (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов ДНК-полимеразы II), один или более промоторов ДНК-полимеразы I (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов ДНК-полимеразы I) или их комбинации. Примеры промоторов ДНК-полимеразы III включают, но не ограничиваются ими, промоторы U6 и HI. Примеры промоторов ДНК-полимеразы II включают, но не ограничиваются ими, ретровирусный промотор LTR RAR-саркомы Рауса (RSV) (необязательно с энхансером RSV), промотор цитомегаловируса (CMV) (необязательно с энхансером CMV) [см., например, Boshart et al., Ceil, 41: 521-530 (1985)], промотор SV40, промотор дигидрофолатредуктазы, промотор 3-актина, промотор фосфоглицерин-киназы (PGK) и промотор EF1a. Кроме того, термин "регуляторный элемент" охватывает энхансерные элементы, такие как WPRE; энхансеры CMV; сегмент R-U5' в LTR HTLV-I (Mol, Cell. Biol, том 8 (1), стр. 466-472, 1988); энхансер SV40; и интронная последовательность между экзонами 2 и 3 белка кролика P-глобина (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., т. 78 (3), p, 1527-31, 1981). Специалистам в данной области будет понятно, что конструкция вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которая должна быть трансфицирована, а также желаемый уровень экспрессии и т.д. Вектор может быть введен в клетки таким образом, чтобы они продуцировали транскрипты, белки или пептиды, включая слитые белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, как описано в настоящем описании (например, транскрипты системы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных кластерами (CRISPR), их белки, ферменты, их мутантные формы, их слитые белки и т.д.). Что касается регуляторных последовательностей, то может быть упомянута заявка на патент США 10/491026, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Что касается промоторов, упоминается публикация РСТ WO 2011/028929 и Приложение США 12/511940, содержание которых включено в настоящее в качестве ссылки в полном объеме.

[690] Векторы могут быть сконструированы для экспрессии транскриптов CRISPR (например, транскриптов нуклеиновых кислот, белков или ферментов) в прокариотических или эукариотических клетках. Например, транскрипты CRISPR могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как Escherichia coli, клетках насекомых (с использованием экспрессирующих векторов бакуловируса), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки обсуждаются далее в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор можно транскрибировать и транслировать in vitro, например, с использованием регуляторных последовательностей промотора T7 и полимеразы T7.

[691] Векторы могут введены и увеличены в количестве в прокариотических организмах или прокариотических клетках. В некоторых вариантах осуществления прокариотический организм используют для амплификации копий вектора, который должен быть введен в эукариотическую клетку или в качестве промежуточного вектора при образовании вектора, который должен быть введен в эукариотическую клетку (например, амплификация плазмиды как части вирусной векторная упаковочная система). В некоторых вариантах осуществления прокариотический организм используется для амплификации копий вектора и экспрессии одной или более нуклеиновых кислот, например, для обеспечения источника одного или более белков для доставки в клетку-хозяина или организм-хозяин. Экспрессия белков в прокариотах чаще всего происходит в Escherichia coli с векторами, содержащими конститутивные или индуцируемые промоторы, которые направляют экспрессию либо слитых, либо неслитых белков. Слитые векторы встраивают ряд аминокислот в кодируемый им белок, например, на N-конце рекомбинантного белка. Такие слитые векторы могут служить одной или более целям, таким как: (i) увеличение экспрессии рекомбинантного белка; (ii) увеличение растворимости рекомбинантного белка; и (iii) содействие очистке рекомбинантного белка, действуя как лиганд в аффинной очистке. Часто в слитых экспрессирующих векторах вводится сайт протеолитического расщепления на стыке области слияния и рекомбинантного белка, чтобы обеспечить отделение рекомбинантного белка от слитого фрагмента после очистки слитого белка. Такие ферменты и их родственные последовательности распознавания включают фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. Примеры экспрессирующих векторов слияния включают pGEX (Pharmacia Biotech Inc, Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) И pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), которые производят слияние глютатион S-трансферазы (GST), связывающего мальтозу белка E или белка A, соответственно, с целевым рекомбинантным белком.

[692] Примеры подходящих индуцибельных неслитых экспрессирующих векторов E.coli включают pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315) и pET lid (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, Сан-Диего, Калифорния (1990) 60-89).

[693] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой экспрессирующий вектор дрожжей. Примеры экспрессирующих векторов в дрожжах Saccharomyces cerivisae включают pYepSeel (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA.) и picZ (InVitrogen Corp, Сан-Диего, Калифорния).

[694] В некоторых вариантах осуществления вектор управляет экспрессией белка в клетках насекомых с использованием экспрессирующих векторов бакуловируса. Бакуловирусные векторы, доступные для экспрессии белков в культивируемых клетках насекомых (например, клетки SF9), включают серию pAc (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol., 3: 2156-2165) и серию pVL (Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39).

[695] В некоторых вариантах осуществления вектор способен приводить к экспрессии одной или более последовательностей в клетках млекопитающих с использованием вектора экспрессии в млекопитающих. Примеры экспрессирующих векторов млекопитающих включают pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) и pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195). При использовании в клетках млекопитающих функции управления вектором экспрессии обычно выполняются одним или более регуляторными элементами. Например, обычно используемые промоторы получают из полиомы, аденовируса 2, цитомегаловируса, вируса SV40 и других, описанных в настоящем описании и известных в данной области. Другие подходящие системы экспрессии как для прокариотических, так и для эукариотических клеток можно изучить по: см., например, главы 16 и 17 Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Laboratory Cold Spring Harbor, Laboratory Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989.

[696] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный экспрессирующий вектор млекопитающих способен направлять экспрессию нуклеиновых кислот предпочтительно в конкретном типе клеток (например, тканеспецифические регуляторные элементы используются для экспрессии нуклеиновой кислоты). Специфические для ткани регуляторные элементы известны в данной области. Не ограничивающие примеры подходящих тканеспецифических промоторов включают промотор альбумина (специфический для печени: Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), лимфоидспецифические промоторы (Calarne and Eaton, 1988. Adv. Immunol 43: 235-275), в частности, промоторы рецепторов Т-клеток (Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) и иммуноглобулины (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), нейроспецифические промоторы (например, промотор нейрофиламентов, Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5473-5477), специфические для поджелудочной железы промоторы (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916) и промоторы молочной железы, специфические для молочной железы (например, промотор молочной сыворотки, патент США №4873,316 и публикация Европейской заявки №264,166). Регулируемые развитием организма промоторы также включают, например, hox-промоторы мыши (Kessel and Grass, 1990. Science 249: 374-379) и промотор α-фетопротеина (Campes and Tilghman, 1989. Гены Dev. 3: 537-546). Что касается этих прокариотических и эукариотических векторов, то может быть упомянут патент США 6750509, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме полноте. Другие варианты осуществления изобретения могут относиться к использованию вирусных векторов, в отношении которых упоминается заявка на патент США 13/1002085, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме. Специфичные для ткани регуляторные элементы известны в данной области, и в этой связи упоминается патент США 7776321, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

[697] В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент функционально связан с одним или более элементами системы CRISPR, чтобы управлять экспрессией одного или более элементов системы CRISPR. В целом, CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные кластерами), также известный как SPIDR (рассеянные между спейсерами прямые повторы), представляют собой семейство локусов ДНК, которые обычно специфичны для конкретных видов бактерий. Локус CRISPR содержит отчетливый класс чередующихся коротких повторов последовательности (SSR), которые были описаны в E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol. 169: 5429-5433 [1987] и Nakata et al., J. Bacteriol., 171: 3553-3556 [1989]) и ассоциированных генов. Аналогичные участки SSR были идентифицированы в Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena и Mycobacterium tuberculosis (см. Groenen et al., Mol. Microbiol., 10: 1057-1065 [1993], Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5: 254-263 [1999], Masepohl et al., Biochim Biophys Acta 1307: 26-30 [1996], Mojica et al., Mol. Microbiol., 17: 85-93 [1995]). Локусы CRISPR, как правило, отличаются от других SSR структурой повторов, которые называются короткими регулярно прерывающимися повторами (SRSR) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6: 23-33 [2002], и Mojica et al., Mol. Microbiol., 36: 244-246 [2000]). В общем случае, повторы представляют собой короткие элементы, которые образуют кластеры, которые регулярно распределены по уникальным перемежаемым последовательностям с примерно постоянной длиной (Mojica et al., [2000], см. выше). Хотя повторяющиеся последовательности очень консервативны для разных штаммов, количество прерывающихся повторов и последовательностей спейсерных областей обычно отличаются для разных штаммов (van Embden et al., J. Bacteriol, 182: 2393-2401 [2000]). Локусы CRISPR были идентифицированы более чем у 40 прокариотов (см., Например, Jansen et al., Mol. Microbiol., 43: 1565-1575 [2002] и Mojica et al., [2005]), включая, но не ограничиваясь, Aeropyrum, Pyrobacidum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermobacterium, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desidfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema и Thermotoga.

[698] В целом понятие "система нацеливания на нуклеиновую кислоту", используемая в настоящем изобретении, относится в совокупности к транскриптам и другим элементам, участвующим в экспрессии или направляющим активность нацеливания на нуклеиновых кислоты CRISPR-ассоциированных ("Cas") генов (также называемых в настоящем описании эффекторными белками), включая последовательности, кодирующие белок (эффекторный), нацеленный на нуклеиновую кислоту, и направляющую РНК (содержащую последовательность cr-РНК и трансактивирующую последовательность РНК (tracr-РНК) системы CRISPR/Cas) или другие последовательности и транскрипты из локуса CRISPR, нацеленного на нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах осуществления один или более элементов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту получены из системы CRISPR, нацеленной на нуклеиновые кислоты, типов V/VI. В некоторых вариантах осуществления один или более элементов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту получают из конкретного организма, включающего эндогенную систему CRISPR, нацеленную на нуклеиновые кислоты. В целом система нацеливания на нуклеиновую кислоту характеризуется элементами, которые способствуют образованию комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, на участке последовательности-мишени. В контексте формирования комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, "последовательность-мишень" относится к последовательности, для которой предназначена направляющая последовательность, и которая имеет комплементарность, необходимую для гибридизации между последовательностью-мишенью и направляющей РНК, что способствует образованию комплекса с ДНК или РНК. Полная комплементарность не обязательна, если имеется достаточная комплементарность, вызывающая гибридизацию и способствующая образованию комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту. Последовательность-мишень может содержать полинуклеотиды РНК. В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень находится в ядре или цитоплазме клетки. В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень может находиться внутри органелл эукариотической клетки, например митохондрий или хлоропластов. Последовательность или матрица, которая может быть использована для рекомбинации в локусе-мишени, содержащем последовательность-мишень, упоминается как "редактирующая матрица или "редактирующая РНК" или "редактирующая последовательность". В аспектах изобретения экзогенная РНК-матрица может упоминаться как матрица редактирования. В любом аспекте изобретения рекомбинация представляет собой гомологичную рекомбинацию.

[699] Как правило, в контексте эндогенной системы нацеливания на нуклеиновую кислоту образование комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту (содержащего направляющую РНК, гибридизованную с последовательностью-мишенью, в комплексе с одним или более эффекторными белками, нацеленными на нуклеиновую кислоту) приводит к расщеплению одной или обеих цепей РНК (примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 или более пар оснований) целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления один или более векторов, управляющих экспрессией одного или более элементов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, вводят в клетку, так что экспрессия элементов системы нацеливания на нуклеиновую кислоту руководит образованием комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, в одном или более участках-мишенях. Например, эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоте, и направляющая РНК могут быть функционально связаны с отдельными регуляторными элементами на отдельных векторах. Альтернативно, два или более элемента, экспрессируемые с участием одних и тех же или разных регуляторных элементов, могут быть объединены в одном векторе с одним или более дополнительными векторами, обеспечивающими другие компоненты системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, не включенные в первый вектор. Компоненты системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, объединенные в одном векторе, могут быть расположены в любой подходящей ориентации, такой как один элемент, расположенный в направлении 5'-конца относительно (в восходящем направлении) или 3'-конца относительно (в нисходящем направлении) второго элемента. Кодирующая последовательность одного элемента может быть расположена на той же или противоположной цепи кодирующей последовательности второго элемента и быть ориентирована в том же или противоположном направлении. В некоторых вариантах осуществления один промотор руководит экспрессией транскрипта, кодирующего эффекторный белок, нацеленный нуклеиновую кислоту, и направляющей РНК, встроенной в одну или более интронных последовательностей (например, каждая в отдельном интроне, два или более по меньшей мере в одном интроне или все в одном интроне). В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, и направляющая РНК функционально связаны и экспрессируются с одного и того же промотора.

[700] В общем, направляющая последовательность представляет собой любую полинуклеотидную последовательность, имеющую достаточную комплементарность с полинуклеотидной последовательностью-мишенью для гибридизации с последовательностью-мишенью и прямого специфического для последовательности связывания комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, с последовательностью-мишенью. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности между направляющей последовательностью и соответствующей ей последовательностью-мишенью при оптимальном выравнивании с использованием подходящего алгоритма выравнивания составляет приблизительно или более чем 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% и более. Оптимальное выравнивание может быть определено с использованием любого подходящего алгоритма для выравнивания последовательностей, неограничивающие примеры которого, включают алгоритм Смита-Уотермана, алгоритм Нидлмана-Вунча, алгоритмы, основанные на преобразовании Берроуза-Уилера (например, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAST, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (iIllumina, Сан-Диего, Калифорния), SOAP (доступно на soap.genornics.org.cn) и Maq (доступно на maq.sourceforge.net). В некоторых вариантах осуществления, направляющая последовательность составляет приблизительно или больше, чем приблизительно 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления изобретения направляющая последовательность меньше чем приблизительно 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 или менее нуклеотидов в длину. Способность направляющей последовательности управлять специфическим для последовательности связыванием нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса с последовательностью-мишенью может быть оценена любым подходящим способом. Например, компоненты нацеленной на нуклеиновую кислоту системы, достаточные для образования данного комплекса, включая направляющую последовательность, подлежащую тестированию, могут быть доставлены в клетку, имеющую соответствующую последовательность-мишень, например, с помощью трансфекции векторами, кодирующими компоненты нацеленной на нуклеиновые кислоты последовательности CRISPR с последующей оценкой предпочтительного расщепления в пределах или вблизи последовательности-мишени, такой как анализ Surveyor, описанный в настоящем описании. Аналогично, расщепление полинуклеотидной последовательности-мишени (или последовательности вблизи нее) может быть оценено в пробирке путем предоставления последовательности-мишени, компонентов нацеленного на нуклеиновую кислоту комплекса, включая направляющую последовательность, подлежащую тестированию, и контрольной направляющей последовательности, отличной от тестируемой направляющей последовательности, и сравнения связывания или скорости расщепления происходящего непосредственно в или вблизи последовательности-мишени между реакциями тестовой и контрольной направляющих последовательностей. Другие способы анализа также возможны и могут быть разработаны специалистами в данной области.

[701] Направляющая последовательность может быть выбрана так, чтобы нацеливать на любую последовательность-мишень. В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень представляет собой последовательность внутри транскрипта гена или мРНК.

[702] В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень представляет собой последовательность в геноме клетки.

[703] В некоторых вариантах осуществления выбирается направляющая последовательность для компактизации вторичной структуры внутри направляющей последовательности. Вторичная структура может быть определена любым подходящим алгоритмом фолдинга полинуклеотидов. Некоторые программы основаны на вычислении минимальной свободной энергии Гиббса. Примером такого алгоритма является mFold, как описано Zuker и Stiegler (Nucleic Acids Res., 9 (1981), 133-148). Другим примером алгоритма выявления фолдинга является вебсервер RNAfold, разработанный в Институте теоретической химии Венского университета, с использованием алгоритма прогнозирования центроида (см., например, AR Gruber era, 2008, Cell 106 (1): 23-24; PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27 (12): 1151-62). Другие алгоритмы могут быть найдены в заявке США серийного номера TBA (номер патентного реестра 44790.11.2022, широкая ссылка В1-2013/004A); включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

[704] В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, является частью слитого белка, содержащего один или более гетерологичных белковых доменов (например, приблизительно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доменов в дополнение к эффекторному белку, нацеленному на нуклеиновую кислоту). В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок/фермент CRISPR является частью слитого белка, содержащего один или более гетерологичных белковых доменов (например, приблизительно или более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, или более доменов в дополнение к ферменту CRISPR). Эффекторный белок/фермента CRISPR может содержать любую дополнительную белковую последовательность и необязательно линкерную последовательность между любыми двумя доменами. Примеры белковых доменов, которые могут быть слиты с эффекторным белком, включают, но не ограничиваются ими, метки эпитопов, последовательности репортерного гена и белковые домены, имеющие одну или более из следующих активностей: метилазная, деметилазная активность, активность активации транскрипции, активность подавления транскрипции, активность фактора терминации транскрипции, активность модификации гистонов, активность расщепления РНК и активность связывания нуклеиновых кислот. Неограничивающие примеры меток эпитопов включают метки гистидина (His), метки V5, метки FLAG, метки гемагглютинина (HA) гриппа, метки Мус, метки VSV-G и теги тиоредоксина (Trx). Примеры репортерных генов включают, но не ограничиваются следующими: глутатион-S-трансфераза (GST), пероксидаза хрена (HRP), бета-галактозидаза ацетитрансферазы хлорамфеникола (CAT), бета-глюкуронидаза, люцифераза, зеленый флуоресцентный белок (GFP), HcRed, DsRed, голубой флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и аутофлуоресцентные белки, включая синий флуоресцентный белок (BFP). Эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, может быть слит с последовательностью гена, кодирующей белок или фрагмент белка, который связывает молекулы ДНК или связывает другие клеточные молекулы, включая, но не ограничиваясь, следующими: мальтоза-связывающий белок (MBP), S-tag, слитые конструкции ДНК-связывающего домена (DBD) Lex A, слитые конструкции ДНК-связывающего домена GAL4 и слитые конструкции белка BP16 вируса простого герпеса (HSV). Дополнительные домены, которые могут быть частью слитого белка, включающего эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, описаны в патентной публикации США 20110059502, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления меченый эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, используется для идентификации местоположения последовательности-мишени.

[705] В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR может являться компонентом индуцируемой системы. Индуцируемый характер системы обеспечивает пространственно-временный контроль над редактированием генов или экспрессией генов с использованием энергии. Форма энергии может включать, но не ограничивается ими, электромагнитное излучение, звуковую энергию, химическую энергию и тепловую энергию. Примеры индуцируемой системы включают индуцируемые тетрациклином промоторы (Tet-On или Tet-Off), двугибридные системы активации транскрипции с малой молекулой (FKBP, ABA и т.д.), светоиндуцируемые системы (фитохром, LOV-домены или криптохром). В варианте одном осуществления изобретения фермент CRISPR может быть частью светоиндуцируемого эффектора транскрипции (LITE) для непосредственного изменения транскрипционной активности, специфичного к последовательности. Светоиндуцируемые компоненты могут включать фермент CRISPR, светочувствительный гетеродимер цитохрома (например, Arabidopsis thaliana) и домен активации/подавления транскрипции. Другие примеры индуцируемых связывающих ДНК белков и способы их использования приведены в US 61/736465 и US 61/721283 и WO 2014/018423 и US 8889418, US 8895308, US 20140186919, US 20140242700, US 20140273234, US 20140335620, WO 2014093635, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

[706] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, включающим доставку одного или более полинуклеотидов, таких как или один или более векторов, как описано в настоящем описании, один или более его транскриптов и/или один или более белков, транскрибируемых с них, в клетку. В некоторых аспектах изобретение, кроме того, относится к клеткам, полученным такими способами, и организмам (таким как животные, растения или грибы), содержащим или полученным из таких клеток. В некоторых вариантах осуществления эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, в сочетании с (и, возможно, в составе комплекса) с направляющей РНК доставляется в клетку. Обычные вирусные и невирусные способы переноса генов могут быть использованы для введения нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих или в целевые ткани. Такие способы могут быть использованы для введения нуклеиновых кислот, кодирующих компоненты системы нацеливания на нуклеиновую кислоту, в клетки культуры или организма. Системы доставки невирусных векторов включают ДНК-плазмиды, РНК (например, транскрипт вектора, описанного в настоящем описании), "голую" нуклеиновую кислоту и нуклеиновую кислоту в комплексе со средством доставки, таким как липосома. Системы вирусной доставки векторов включают ДНК и РНК-вирусы, которые имеют либо эписомальные, либо интегрированные геномы после доставки в клетку. Обзор способов генной терапии см. в Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nab el & Feigner, TIBTECH 11: 211-217 (1993), Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357: 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36 (1995), Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51 (1): 31-44 (1995); Haddada et al., В Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bomm (eds) (1995) и Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994).

[707] Способы невирусной доставки нуклеиновых кислот включают липофекцию, нуклеофекцию, микроинъекцию, генные пушки, виросомы, липосомы, иммунолипосомы, поликатионы или конъюгаты липидов с нуклеиновыми кислотами, "голую" ДНК, искусственные вирионы и усиленное агентом поглощение ДНК. Липофекция описана, например, в патентах США №5049386, 4946787; и 4897355), и липофекционные реагенты продаются на коммерческой основе (например, Transfectam™ и Lipofectin™). Катионные и нейтральные липиды, которые пригодны для эффективного распознавания рецепторов липофекции полинуклеотидов, включают таковые Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024. Доставка может осуществляться в клетки (например, in vitro или ex vivo) или ткани-мишени (например, in vivo).

[708] Получение комплексов липидов с нуклеиновыми кислотами, включая целевые липосомы, такие как иммунолипидные комплексы, хорошо известно специалисту в данной области (см., например, Crystal, Science 270: 404-410 (1995), Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995), Behr et at., Bioconjugate Chem., 5: 382-389 (1994), Remy et al., Bioconjugate Chem., 5: 647-654 (1994), Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995), Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817-4820 (1992), патенты США №№4186183, 4217344, 4235871, 4261975, 4485054, 4501728, 4774085, 4837028 и 4946787).

[709] В применении РНК или ДНК-вирусных систем для доставки нуклеиновых кислот используются современные способы нацеливания вируса на конкретные клетки в организме и передачи вирусного генома в ядро. Вирусные векторы могут вводиться непосредственно пациентам (in vivo) или их можно использовать для обработки клеток in vitro, а модифицированные клетки могут быть введены пациентам (ex vivo). Обычные вирусные системы могут включать ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные, аденоассоциированные и вирусные вирусы простого герпеса для переноса генов. Встраивание в геном хозяина возможно с помощью способов переноса генов ретровирусов, лентивирусов и аденоассоциированных вирусов, часто приводящих к длительной экспрессии введенного трансгена. Кроме того, высокая эффективность трансдукции наблюдалась во многих других типах клеток- и тканей-мишеней.

[710] Тропизм ретровируса может быть изменен путем включения чужеродных белков оболочки, что позволяет расширить потенциальную популяцию клеток, которые могут стать мишенью генного воздействия. Лентивирусные векторы представляют собой ретровирусные векторы, которые способны трансформировать или инфицировать не делящиеся клетки и, как правило, имеют высокие вирусные титры. Поэтому выбор ретровирусной системы переноса генов будет зависеть от ткани-мишени. Ретровирусные векторы состоят из цис-действующих длинных концевых повторов с упаковочной емкостью до 6-10 т.п.н. чужеродной последовательности. Минимальные цис-действующие LTR достаточны для репликации и упаковки векторов, которые затем используются для интеграции терапевтического гена в клетку-мишень для обеспечения постоянной трансгенной экспрессии. Широко используемые ретровирусные векторы включают векторы, основанные на вирусе лейкемии мышей (MuLV), вирусе лейкемии гиббонов (GaLV), вирусе иммунодефицита обезьян (SIV), вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ) и их комбинациях (см., например, Buchscher et al., J. Virol, 66: 2731-2739 (1992), Johann et al., J. Virol. 66: 1635-1640 (1992), Sommnerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1990), Wilson et al., J. Virol, 63: 2374-2378 (1989), Miller et al., J. Virol. 65: 2220-2224 (1991), PCT/US94/05700). В тех вариантах, где предпочтительна временная экспрессия, могут быть использованы аденовирусные системы. Аденовирусные векторы способны к очень высокой эффективности трансдукции во многих типах клеток и не требуют деления клеток. С такими векторами был получен высокий титр и уровни экспрессии. Этот вектор может быть получен в больших количествах в относительно простой системе. Векторы на основе аденоассоциированных вирусов ("AAV") также могут быть использованы для трансдукции клеток целевыми нуклеиновыми кислотами, например, при продуцировании in vitro нуклеиновых кислот и пептидов, а также для процедур генной терапии in vivo и ex vivo (см., например, West et al., Virology 160: 38-47 (1987), US 4797368, WO 93/24641, Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801 (1994), Muzyczka, J. Clin. Invest.: 1351 (1994). Конструирование рекомбинантных векторов AAV описано в ряде публикаций, включая патент США №5173414, Tratschin et al. Mol. Cell, Biol., 5: 3251-3260 (1985), Tratschin, et al., Mol. Cell, Biol., 4: 2072-2081 (1984), Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6466-66470 (1984) и Samulski et al., J. Virol. 63: 03822-3828 (1989).

Модели генетических и эпигенетических условий

[711] Способ по изобретению может быть использован для создания растения, животного или клетки, которые могут быть использованы для моделирования и/или изучения генетических или эпигенетических условий, представляющих интерес, например, посредством модели представляющих интерес мутаций или заболеваний. Как используют в настоящем описании, термин "заболевание" относится к заболеванию, расстройству или симптому у индивида. Например, способ по изобретению может быть использован для создания животного или клетки, которые включают модификацию в одной или более последовательностях нуклеиновых кислот, связанных с заболеванием, или растение, животное или клетку, в которых экспрессия одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, связанных с заболеванием, изменена. Такая последовательность нуклеиновых кислот может кодировать связанную с заболеванием последовательность белка или может быть связанной с заболеванием последовательностью контроля. Соответственно, понятно, что в вариантах осуществления изобретения растение, индивид, пациент, организм или клетка могут быть не являющимися человеком пациентом, организмом или не происходящей от человека клеткой. Таким образом, изобретение относится к растению, животному или клетке, полученным способами по настоящему изобретению, или к их потомству. Потомство может быть клоном произведенного растения или животного или может быть результатом полового размножения путем скрещивания с другими особями одного и того же вида для внедрения других желательных признаков в их потомство. Клетка может находиться in vivo или ex vivo в случае многоклеточных организмов, особенно животных или растений. В случае, когда клетка культивируется, клеточная линия может быть создана, если соответствующие условия культивирования удовлетворяются, и предпочтительно, если клетка подходяще приспособлена для этой цели (например, стволовая клетка). Также предусматриваются бактериальные клеточные линии, полученные с соответствии с изобретением. Таким образом, клеточные линии также предусматриваются.

[712] В некоторых способах модель болезни может быть использована для изучения эффектов мутаций на животное или клетку, развития и/или прогрессирования заболевания с использованием мер, обычно используемых при изучении этого заболевания. Альтернативно, такая модель болезни полезна для изучения влияния фармацевтически активных соединений на заболевание.

[713] В некоторых способах модель болезни может быть использована для оценки эффективности потенциальной стратегии генной терапии. То есть связанный с болезнью ген или полинуклеотид может быть модифицирован таким образом, что развитие заболевания и/или его прогрессирование ингибируются или уменьшаются. В частности, способ включает модификацию связанного с заболеванием гена или полинуклеотида таким образом, что образуется измененный белок и, как результат, животное или клетка имеют измененный ответ. Соответственно, в некоторых способах генетически модифицированное животное можно сравнить с животным, предрасположенным к развитию заболевания, что даст возможность оценить влияние генной терапии.

[714] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам разработки биологически активного агента, который изменяет сигнал клеток, связанных с геном болезни. Способ включает приведение в контакт испытуемого соединения с клеткой, содержащей один или более векторов, управляющих экспрессией одного или более ферментов CRISPR, и последовательность прямого повтора, связанную с направляющей последовательностью; и обнаружение изменения в показаниях, которое указывает на уменьшение или увеличение сигнала клетки, связанного, например, с мутацией в гене болезни, содержащемся в клетке.

[715] Модель клетки или модель на животных может быть создана в сочетании со способом изобретению для диагностики изменения клеточной функции. Такая модель может быть использована для изучения влияния последовательности генома, модифицированной комплексом CRISPR по изобретению, на интересующую клеточную функцию. Например, модель клеточной функции может использоваться для изучения влияния модифицированной последовательности генома на внутриклеточную передачу сигнала или внеклеточную передачу сигнала. Альтернативно, модель клеточной функции может использоваться для изучения эффектов модифицированной последовательности генома на сенсорное восприятие. В некоторых таких моделях модифицирована одна или более геномных последовательностей, связанных с сигнальным биохимическим путем в модели.

[716] Было исследовано несколько моделей заболеваний. К ним относятся исследование de novo генов риска аутизма CHD8, KATNAL2 и SCN2A; и гена синдромного аутизма (синдром Ангельмана) UBE3A. Конечно, эти гены и результирующие модели аутизма предпочтительнее, но служат для того, чтобы показать широкую применимость изобретения для генов и соответствующих моделей.

[717] Измененная экспрессия одной или более геномных последовательностей, связанных с сигнальным биохимическим путем, может быть определена путем анализа разности уровней мРНК соответствующих генов между тестовой модельной клеткой и контрольной клеткой, когда они контактируют с кандидатом. Альтернативно, дифференциальная экспрессия последовательностей, связанных с сигнальным биохимическим путем, определяется путем обнаружения различий в количестве кодируемого полипептида или генного продукта.

[718] Для анализа индуцированного агентом изменения уровня транскриптов мРНК или соответствующих полинуклеотидов нуклеиновую кислоту, содержащуюся в образце, сначала экстрагируют в соответствии со стандартными способами в данной области. Например, мРНК может быть выделена с использованием различных литических ферментов или химических растворов в соответствии с методиками, изложенными в Sambrook et al. (1989) или экстрагирована путем связывания нуклеиновой кислоты со смолами в соответствии с прилагаемыми инструкциями производителей. Затем мРНК, содержащуюся в образце экстрагированной нуклеиновой кислоты, выявляют с помощью способов амплификации или обычных анализов гибридизации (например, нозерн-блоттинга) в соответствии со способами, широко известными в данной области или на основе способов, описанных в настоящем описании.

[719] Для целей настоящего изобретения амплификация означает любой способ, использующий праймер и полимеразу, способную реплицировать последовательность-мишень с достаточной точностью. Амплификацию можно проводить с помощью природных или рекомбинантных ДНК-полимераз, таких как ДНК-полимераза TaqGold™, T7, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E.coli и обратная транскриптаза. Предпочтительным способом амплификации является ПЦР. В частности, выделенная РНК может быть подвергнута анализу с использованием обратной транскрипции, которая сопряжена с количественной полимеразной цепной реакцией (ОТ-РЦР), чтобы количественно определить уровень экспрессии последовательности, связанной с сигнальным биохимическим путем.

[720] Определение уровня экспрессии гена может проводиться в реальном времени в анализе с использованием амплификации. В одном из аспектов амплифицированные продукты могут быть непосредственно визуализированы с помощью флуоресцентных связывающих ДНК агентов, включая, но не ограничиваясь ими: интеркаляторы ДНК и связывающиеся с желобками ДНК агенты. Поскольку количество интеркаляторов, включенных в молекулы двухцепочечной ДНК, как правило, пропорционально количеству амплифицированных продуктов ДНК, удобно определять количество амплифицированных продуктов путем количественной оценки флуоресценции интеркалировавшего красителя с использованием стандартно применяемых оптических приборов, используемых в данной области. ДНК-связывающие красители, подходящие для применения с этой целью, включает SYBR green, SYBR blue, DAPI, пропидия йодид, hoechst, SYBR gold, бромид этидия, акридиновые красители, дауномицин, хлорохин, дистамицин D, хромомицин, митрамицин, полипиридины рутения, антрамицин и т.п.

[721] В другом аспекте в реакции амплификации могут быть использованы другие флуоресцентные метки, такие как специфические для последовательности зонды для облегчения обнаружения и количественного определения амплифицированных продуктов. Количественная амплификация на основе использования зонда зависит от специфического для последовательности определения желаемого продукта амплификации. Она использует флуоресцентные целеспецифичные зонды (например, зонды TaqMan®), что приводит к повышению специфичности и чувствительности. Способы осуществления количественной амплификации на основе использования зонда хорошо известны в данной области и описаны в патенте США №5210015.

[722] В еще одном варианте аспекте могут быть выполнены обычные анализы гибридизации с использованием зондов гибридизации, гомологичных последовательностям, связанным с сигнальным биохимическим путем. Обычно допускается формирование зондами стабильных комплексов с последовательностями, связанными с сигнальным биохимическим путем, содержащимися в биологическом образце, полученном от исследуемого индивидуума, в ходе реакции гибридизации. Квалифицированному специалисту в данной области должно быть понятно, что, когда антисмысловая последовательность используется в нуклеиновой кислоте-зонде, полинуклеотиды-мишени, представленные в образце, выбирают так, чтобы они были комплементарными антисмысловым последовательностям нуклеиновых кислот. Напротив, когда нуклеотидный зонд является смысловой последовательностью нуклеиновой кислоты, в качестве полинуклеотида-мишени выбирают комплементарную к последовательностям смысловую последовательность нуклеиновой кислоты.

[723] Гибридизация может выполняться в условиях, различающихся по уровню жесткости. Подходящие условия гибридизации для практики настоящего изобретения таковы, что взаимодействие при распознавании зондом последовательностей, ассоциированных с сигнальным биохимическим путем, является достаточно специфичным и достаточно стабильным. Условия, которые повышают жесткость условий реакции гибридизации, широко известны и опубликованы в данной области. См., например, (Sambrook, et al., (1989), Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual, Boehringer Mannheim, second edition). Анализ гибридизации может быть проведен с использованием зондов, иммобилизованных на любом твердом носителе, включая, но не ограничиваясь, нитроцеллюлозу, стекло, силикон и множество генных матриц. Является предпочтительным проведение анализа гибридизации на генных чипах высокой плотности, как описано в патенте США №5445934.

[724] Для удобного обнаружения комплексов зонд-мишень, образующихся во время анализа гибридизации, нуклеотидные зонды могут быть конъюгированы с поддающейся обнаружению меткой. Поддающиеся обнаружению метки, подходящие для использования в рамках настоящего изобретения, включают любую конструкцию, детектируемую фотохимическими, биохимическими, спектроскопическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими способами. В данной области известно большое количество подходящих поддающихся обнаружению меток, которые включают флуоресцентные или хемилюминесцентные метки, метки радиоактивного изотопа, ферментативные или другие лиганды. В предпочтительных вариантах осуществления, вероятно, может быть желательным использовать флуоресцентную метку или метку фермента, такую как дигоксигенин, β-галактозидаза, уреаза, щелочная фосфатаза или пероксидаза, комплекс авидин/биотин.

[725] Способы обнаружения, используемые для обнаружения или количественной оценки гибридизации, обычно зависят от выбора метки. Например, радиоактивные метки могут быть обнаружены с использованием фотопленки или прибора Phosphoimager. Флуоресцентные маркеры могут быть обнаружены и количественно определены с помощью фотоприемника для обнаружения испускаемого света. Ферментативные метки обычно обнаруживают путем обеспечения фермента субстратом и измерения количества полученного продукта реакции, создаваемого воздействием фермента на субстрат; и, наконец, колориметрические метки обнаруживаются путем простой визуализации цветной метки.

[726] Индуцированное агентом изменение экспрессии последовательностей, связанных с сигнальным биохимическим путем, также может быть определено путем изучения соответствующих продуктов гена. Определение уровня белка обычно включает: а) проведение реакции белка, содержащегося в биологическом образце, с агентом, который специфически связывается с белком, ассоциированным с сигнальным биохимическим путем; и (b) идентификацию любого образовавшегося комплекса агент-белок. В одном аспекте данного варианта осуществления агент, который специфически связывает белок, связанный с сигнальным биохимическим путем, представляет собой антитело, предпочтительно моноклональное антитело.

[727] Реакцию проводят путем связывания агента с образцом белков, ассоциированных с сигнальным биохимическим путем, полученным из пробных образцов, в условиях, которые позволяют образование комплекса агентом и белками, ассоциированными с сигнальным биохимическим путем. Образование комплекса может быть обнаружено прямо или косвенно в соответствии со стандартными методиками в данной области. При использовании способа прямого обнаружения агенты снабжаются поддающейся обнаружению меткой, и непрореагировавшие агенты могут быть удалены из комплекса; количество неиспользованной метки тем самым позволяет определить количество образовавшегося комплекса. Для такого способа предпочтительно выбирать метки, которые остаются связанными с агентом даже при жестких условиях промывания. Предпочтительно, чтобы метка не мешала реакции связывания. В альтернативном варианте процедура косвенного обнаружения может использовать агент, который содержит метку, введенную либо химическим, либо ферментативным путем. Желательная метка обычно не препятствует связыванию или стабильности полученного комплекса полипептида и агента. Однако метка обычно предназначена для того, чтобы быть доступной для эффективного связывания антителом и, следовательно, генерировать распознаваемый сигнал.

[728] В данной области известно большое количество меток, подходящих для определения уровней белка. Неограничивающие примеры включают радиоизотопы, ферменты, коллоидные металлы, флуоресцентные соединения, биолюминесцентные соединения и хемилюминесцентные соединения

[729] Количество комплексов агент-полипептид, образующихся во время реакции связывания, может быть количественно определено стандартными количественными способами анализа. Как проиллюстрировано выше, образование комплекса агент-полипептид может быть непосредственно измерено по количеству метки, оставшейся в участке связывания. В альтернативном варианте белок, связанный с сигнальным биохимическим путем, тестируют на его способность конкурировать с меченым аналогом за сайты связывания специфического агента. В этом конкурентном анализе количество захваченной метки обратно пропорционально количеству белковых последовательностей, ассоциированных с сигнальным биохимическим путем, присутствующих в тестируемом образце.

[730] Ряд способов анализа белка, основанных на общих принципах, изложенных выше, доступен в данной области. Они включают, но не ограничиваются ими, радиоиммунные способы анализа, ELISA (иммунорадиометрические анализ с ферментным связыванием), "сэндвич-иммуноанализ", иммунорадиометрический анализ, иммунологический анализ in situ (с использованием, например, коллоидного золота, фермента или радиоизотопной метки), анализ с использованием вестерн-блоттинга, анализ иммунопреципитации, иммунофлуоресцентный анализ и SDS-PAGE.

[731] Антитела, которые специфически распознают или связывают с белки, связанные с сигнальным биохимическим путем, являются предпочтительными для проведения вышеупомянутых анализов белка. При желании можно использовать антитела, которые распознают конкретный тип посттрансляционных модификаций (например, индуцирбельные модификации сигнального биохимического пути). Посттрансляционные модификации включают, но не ограничиваются ими: гликозилирование, липидирование, ацетилирование и фосфорилирование. Эти антитела могут быть приобретены у коммерческих поставщиков. Например, доступны антитела к антифосфотирозину, которые специфически распознают тирозин-фосфорилированные белки, ряда поставщиков, включая Invitrogen и Perkin Elmer. Антитела к антифосфотирозину особенно полезны для обнаружения белков, которые по-разному фосфорилируются по остаткам тирозина в ответ на стресс ER. Такие белки включают, но не ограничиваются этим, эукариотический фактор инициации трансляции 2 альфа (eIF-2a). Альтернативно, эти антитела могут быть получены с использованием традиционных технологий поликлональных или моноклональных антител путем иммунизации животного-хозяина или клетки, продуцирующей антитела, целевым белком, который демонстрирует желаемую посттрансляционную модификацию.

[732] При практическом осуществлении способа введения в индивида может быть желательным выявить паттерн экспрессии белка, связанного с сигнальным биохимическим путем в различных тканях организма, в разных типах клеток и/или в разных субклеточных структурах. Эти исследования могут быть выполнены с использованием специфичных для ткани, специфичных для клеток или субклеточных структур антител, способных связываться с маркерами белка, которые предпочтительно экспрессируются в определенных тканях, типах клеток или субклеточных структурах.

[733] Измененная экспрессия гена, связанного с сигнальным биохимическим путем, также может быть определена путем изучения изменения активности генных продуктов в сравнении с контрольной клеткой. Анализ вызванного агентом изменения активности белка, связанного с сигнальным биохимическим путем, будет зависеть от биологической активности и/или пути передачи сигнала, который исследуется. Например, когда белок является киназой, изменение его способности фосфорилировать субстрат (субстраты) ниже в том же пути можно определить с помощью различных анализов, известных в данной области. Типичные способы анализа включают, однако не ограничиваются такими как: иммуноблоттинг и иммунопреципитацию антителами, такими как антитела к антифосфотирозину, которые распознают фосфорилированные белки. Кроме того, активность киназы может быть обнаружена с помощью высокопроизводительных хемилюминесцентных способов анализа, таких как AlphaScreen™ (доступный от Perkin Elmer) и eTag™ (Chan-Hui, et al., (2003) Clinical Immunology 111: 162-174).

[734] Если белок, связанный с сигнальным биохимическим путем, является частью сигнального каскада, приводящего к колебаниям внутриклеточного рН, в качестве репортерных молекул можно использовать чувствительные к рН молекулы, такие как флуоресцентные рН-индикаторы. В другом примере, где белок, связанный с сигнальным биохимическим путем, является ионным каналом, можно контролировать флуктуации мембранного потенциала и/или концентрации внутриклеточных ионов. Ряд коммерческих наборов и высокопроизводительных устройств особенно подходит для быстрого и надежного скрининга модуляторов ионных каналов. Типичные устройства включают FLIPR™ (Molecular Devices, Inc.) и VIPR (Aurora Biosciences). Эти приборы способны одновременно обнаруживать реакции в более чем 1000 лунках образцов микропланшета и обеспечивать измерение и функциональные данные в режиме реального времени в течение секунд или даже миллисекунд.

[735] При использовании любого из описанных в настоящем описании способов подходящий вектор может быть введен в клетку или эмбрион с использованием одного или более способов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь этим, микроинъекции, электропорацию, образование пор с использованием ультразвука, биолистику, опосредованную фосфатом кальция трансфекцию, катионную трансфекцию, липосомную трансфекцию, трансфекцию с использованием дендримеров, трансфекцию с использованием теплового шока, трансфекцию-нуклеофекцию, магнитофекцию, липофекцию, импалефекцию, оптическую трансфекцию, захват нуклеиновых кислот патентованным агентом и доставку с использованием липосом, иммунолипосом, вирусом и искусственных вирионов. В некоторых способах вектор вводится в эмбрион путем микроинъекции. Вектор или векторы могут быть введены посредством микроинъекции в ядро или цитоплазму эмбриона. В некоторых способах вектор или векторы могут быть введены в клетку путем нуклеофекции.

[736] Полинуклеотид-мишень комплекса CRISPR может быть любым полинуклеотидом, эндогенным или экзогенным для эукариотической клетки. Например, полинуклеотид-мишень может представлять собой полинуклеотид, который находится в ядре эукариотической клетки. Полинуклеотид-мишень может представлять собой последовательность, кодирующую генный продукт (например, белок) или некодирующую последовательность (например, регуляторный полинуклеотид или мусорную ДНК).

[737] Примеры полинуклеотидов-мишеней включают последовательность, связанную с сигнальным биохимическим путем, например, сигнальным биохимическим путем, ассоциированным с геном или полинуклеотидом. Примеры полинуклеотидов-мишеней включают связанный с заболеванием ген или полинуклеотид. Понятие ген или полинуклеотид, "ассоциированный с заболеванием" относится к любому гену или полинуклеотиду, который производит продукты транскрипции или трансляции на аномальном уровне или в аномальной форме в клетках, полученных из тканей, пораженных болезнью, по сравнению с контрольными тканями или клетками, не пораженными заболеванием. Это может быть ген, который экспрессируется на аномально высоком уровне; это может быть ген, который экспрессируется на аномально низком уровне, причем изменения уровня экспрессии коррелируют с возникновением и/или прогрессированием заболевания. Ассоциированный с заболеванием ген также относится к гену, имеющему мутацию(и) или генетическую вариацию, которая непосредственно ответственна или находится в неравновесной взаимосвязи с геном (генами), который ответственен за этиологию заболевания. Продукты транскрипции или трансляции могут быть известны или неизвестны и могут быть на нормальном или аномальном уровне.

[738] Полинуклеотид-мишень комплекса CRISPR может быть любым полинуклеотидом, эндогенным или экзогенным, в эукариотической клетке. Например, полинуклеотид-мишень может быть полинуклеотидом, находящимся в ядре эукариотической клетки. Полинуклеотид-мишень может представлять собой последовательность, кодирующую генный продукт (например, белок) или некодирующую последовательность (например, регуляторный полинуклеотид или мусорную ДНК). Не ограничиваясь теорией, считается, что последовательность-мишень должна быть связана с PAM (мотив, находящийся вблизи протоспесера); то есть короткой последовательностью, распознаваемой комплексом CRISPR. Точные требования к последовательности и длине для последовательности PAM различаются в зависимости от используемого фермента CRISPR, но последовательность PAM обычно находится в 2-5 парах оснований от протоспейсера (то есть последовательности-мишени). Примеры последовательностей PAM приведены в разделе примеров ниже, и квалифицированный специалист в данной области сможет идентифицировать дальнейшие последовательности PAM для использования с данным ферментом CRISPR.

[739] Полинуклеотид-мишень комплекса CRISPR может включать ряд ассоциированных с заболеванием генов и полинуклеотидов, а также генов и полинуклеотидов, ассоциированных с сигнальными биохимическими путями, как указано в предварительных патентных заявках США 61/736527 и 61/748427, обе под названием "SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION", поданных 12 декабря 2012 года и 2 января 2013 года, соответственно, и заявке РСТ PCT/US2013/074667, озаглавленной "DELIVERY, ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION AND THERAPEUTIC APPLICATIONS", поданной 12 декабря 2013 года, содержание каждой из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

[740] Примеры полинуклеотидов-мишеней включают последовательность, ассоциированную с сигнальным биохимическим путем, например, ген или нуклеотид, ассоциированный с сигнальным биохимическим путем. Примеры полинуклеотидов-мишеней включают ассоциированный с заболеванием ген или полинуклеотид. Ген или полинуклеотид, "ассоциированный с заболеванием", относится к любому гену или полинуклеотиду, который дает продукты транскрипции или трансляции на аномальном уровне или в аномальной форме в клетках, полученных из тканей, пораженных заболеванием, по сравнению с контрольными тканями или клетками, не пораженными заболеванием. Это может быть ген, который экспрессируется на аномально высоком уровне; это может быть ген, который экспрессируется на аномально низком уровне, когда измененная экспрессия коррелирует с возникновением и/или прогрессированием заболевания. "Ассоциированный с заболеванием ген" также относится к гену, обладающему мутацией (мутациями) или генетической вариацией, которая непосредственно ответственна или находится в неравновесии по сцеплению с геном(ами), который отвечает за этиологию заболевания. Транскрибированные или транслированные продукты могут быть известны или неизвестны и могут быть на нормальном или ненормальном уровне.

Полногеномный скрининг посредством нокаута

[741] Экспериментальные белковые комплексы CRISPR, описанные в настоящем описании, могут быть использованы для проведения эффективного и экономически эффективного функционального геномного скрининга. При таком скрининге можно использовать геномные библиотеки, основанные на эффекторном белке CRISPR. Такой скрининг и библиотеки могут обеспечить определение функций генов, клеточных путей, в которые вовлечены гены, и то, как какое-либо изменение экспрессии гена может привести к определенному биологическому процессу. Преимущество настоящего изобретения состоит в том, что система CRISPR позволяет избежать нецелевого связывания и возникающих в результате неспецифических эффектов. Это достигается с использованием систем, организованных с высокой степенью специфичности последовательности к ДНК-мишени. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения комплексы эффекторных белков CRISPR представляют собой комплексы эффекторных белков C2c2.

[742] В вариантах осуществления изобретения полногеномная библиотека может содержать множество направляющих РНК для С2с2, как описано в настоящем описании, включая направляющие последовательности, которые способны нацеливать на множество последовательностей-мишеней во множестве геномных локусов в популяции эукариотических клеток. Популяция клеток может представлять собой популяцию эмбриональных стволовых (ES) клеток. Последовательность-мишень в геномном локусе может быть некодирующей последовательностью. Некодирующая последовательность может быть интронной, регуляторной последовательностью, сайтом сплайсинга, 3-'UTR, 5'-UTR или сигналом полиаденилирования. Функция одного или более генных продуктов может быть изменена путем нацеливания. Нацеливание может привести к нокауту функции гена. Нацеливание на генный продукт может включать более одной направляющей РНК. Нацеливание на генный продукт может быть осуществлено посредством 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 направляющих РНК, предпочтительно от 3 до 4 на ген. Нецелевые модификации могут быть сведены к минимуму за счет использования ступенчатых разрывов двойной цепи, образуемых эффекторными белковыми комплексами C2c2, или с использованием способов, аналогичных тем, которые используются в системах CRISPR-Cas9 (см., например, DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, O., Cradick, TX, Marraffmi, LA., Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi: 10.1038/nbt.2647 (2013)), включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Нацеливание может охватывать приблизительно 100 или более последовательностей. Нацеливание может охватывать приблизительно 1000 или более последовательностей. Нацеливание может составлять приблизительно 20000 или более последовательностей. Нацеливание может охватывать весь геном. Нацеливание может охватывать ряд последовательностей-мишеней, ориентированных на соответствующий или желательный процесс. Процесс может быть иммунным процессом. Процесс может быть процессом клеточного деления.

[743] Один из вариантов изобретения охватывает геномную или транскриптомную библиотеку, которая может содержать множество направляющих РНК для C2c2, которые могут содержать направляющие последовательности, которые могут нацеливать на множество последовательностей-мишеней во множестве (геномных) локусов, приводя к нокауту/нокдауну функции гена. Эта библиотека может потенциально содержать направляющие РНК, которые нацелены на каждый ген в геноме организма.

[744] В некоторых вариантах осуществления изобретения организм или индивид является эукариотическим организмом (включая млекопитающее, включая человека), или эукариотическим организмом, не являющимся человеком, или животным, не являющимся человеком, или млекопитающим, не являющимся человеком. В некоторых вариантах осуществления организм или индивид является животным, не являющимся человеком, и может быть членистоногим, например насекомым, или может быть нематодой. В некоторых способах изобретения организм или индивид является растением. В некоторых способах по изобретению организм или субъект представляет собой млекопитающее или млекопитающее, не являющееся человеком. Млекопитающее, не являющееся человеком, может быть, например, грызуном (предпочтительно мышью или крысой), копытным или приматом. В некоторых способах по изобретению организм или субъект является водорослью, включая микроводоросли, или грибом.

[745] Нокаут/нокдаун функции гена может включать введение в каждую клетку в популяции клеток векторной системы из одного или более векторов, содержащих сконструированную, не встречающуюся в природе систему, содержащую I. эффекторный белок C2c2, и II. одну или более направляющих РНК, где компоненты I и II могут находиться на одном или разных векторах системы, встраивающих компоненты I и II в каждую клетку, причем направляющая последовательность нацелена на уникальный ген в каждой клетке, где эффекторный белок C2c2 является функционально связанным с регуляторным элементом, где при транскрипции направляющая РНК, содержащая направляющую последовательность, обеспечивает последовательность-специфическое связывание системы эффекторного белка C2c2 с последовательностью-мишенью, соответствующей геномным локусам уникального гена, вызывая расщепление РНК, соответствующей указанному геномному локусу, эффекторным белком C2c2, и подтверждение различных случаев нокдауна во множестве уникальных генов в каждой клетке популяции, тем самым, получая библиотеку клеток с нокдауном гена. Изобретение подразумевает, что популяция клеток представляет собой популяцию эукариотических клеток, и в предпочтительном варианте осуществления популяция клеток представляет собой популяцию эмбриональных стволовых клеток (ES).

[746] Один или более векторов могут быть плазмидными векторами. Вектор может представлять собой один вектор, содержащий эффекторный белок C2c2, одноцепочечную направляющую РНК и необязательно селективный маркер для клеток-мишеней. Без связи с теорией, одновременная доставка эффекторного белка C2c2 и одноцепочечной направляющей РНК с помощью одного вектора позволяет применять этот способ к любому типу клеток-мишеней без необходимости сначала получать клеточные линии, которые экспрессируют эффекторный белок C2c2. Регулирующим элементом может быть индуцибельный промотор. Индуцируемый промотор может быть промотором, индуцируемым доксициклином. В некоторых способах по изобретению экспрессия направляющей последовательности находится под контролем промотора Т7 и направляется экспрессией Т7-полимеразы. Подтверждение различных случаев нокдауна может быть осуществлено полнотранскриптомным секвенированием. Мутация нокаута может быть достигнута в 100 или более уникальных генах. Нокдаун может быть достигнут в 1000 или более уникальных генах. Нокдаун может быть достигнут в 20000 или более уникальных генов. Нокдаун может быть достигнут и во всем геноме. Нокдаун функции гена может быть достигнут во множестве уникальных генов, которые функционируют в определенном физиологическом процессе или состоянии. Процесс или состояние может быть иммунным процессом или состоянием. Процесс или состояние может быть процессом или состоянием деления клеток.

[747] Изобретение также относится к наборам, включающим обширные библиотеки транскриптомов, упомянутые в настоящем описании. Набор может содержать один контейнер, содержащий векторы или плазмиды, содержащие библиотеку по изобретению. Набор может также содержать панель, содержащую отобранный комплект уникальных направляющих РНК системы эффекторных белков C2c2, содержащих направляющие последовательности из библиотеки по изобретению, причем отобранный комплект соответствует конкретному физиологическому состоянию. В рамках изобретения подразумевается, что нацеливанию подвергается приблизительно 100 или более последовательностей, приблизительно 1000 или более последовательностей или приблизительно 20000 или более последовательностей или весь транскриптом. Кроме того, панель последовательностей-мишеней может быть сфокусирована на соответствующем или желательном процессе, таком как иммунный процесс или деление клеток.

[748] В дополнительном аспекте изобретения эффекторный белок C2c2 может содержать одну или более мутаций и может быть использован в качестве общего РНК-связывающего белка с или без слияния с функциональным доменом. Мутации могут быть искусственно введенными мутациями или мутациями приобретения или потери функции. Мутации были охарактеризованы, как описано в настоящем описании. В одном аспекте изобретения функциональный домен может быть доменом активации транскрипции, который может быть VP64. В других аспектах изобретения функциональный домен может быть доменом подавления транскрипции, который может быть KRAB или SID4X. Другие аспекты изобретения относятся к мутантному эффекторному белку C2c2, слитому с доменами, которые включают, но не ограничиваются, ими: активатор транскрипции, репрессор, рекомбиназу, транспозазу, ремоделирующий гистон, деметилазу, ДНК-метилтрансферазу, криптохром, светоиндуцируемый/контролируемый домен или химически индуцируемый/контролируемый домен. Некоторые способы по изобретению могут включать индукцию экспрессии генов-мишеней. В одном варианте осуществления индукция экспрессии путем нацеливания на множество последовательностей-мишеней во множестве геномных локусов в популяции эукариотических клеток осуществляется с использованием функционального домена.

[749] В практике настоящего изобретения, использующего комплексы эффекторного белка C2c2, могут использоваться способы, в которых используются системы CRISPR-Cas9, и может быть приведена ссылка на:

[750] Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, O., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BE., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science Dec 12. (2013). Опубликовано в окончательной редакции как: Science. 2014 Jan 3; 343(6166): 84-87

[751] В Shalem et al. описан новый способ исследования функции гена в масштабе всего генома. Их исследования показали, что доставка полногеномной библиотеки с нокаутом CRISPR-Cas9 (GeCKO), нацеленной на 18080 генов с 64751 уникальными направляющими последовательностями, позволила скрининг как с отрицательной, так и с положительной селекцией в клетках человека. Во-первых, авторы показали использование библиотеки GeCKO для идентификации генов, необходимых для жизнеспособности клеток в злокачественных и плюрипотентных стволовых клетках. Затем, с использованием модели меланомы, авторы провели скрининг генов, утрата которых связана с резистентностью к вемурафенибу, препарату, который ингибирует мутантную протеинкиназу BRAF. Их исследования показали, что кандидаты с самым высоким рейтингом включают ранее подтвержденные гены NF1 и MED 12, также как и новые высокие результаты: NF2, CUL3, TADA2B и TADA1. Авторы наблюдали высокий уровень согласованности между независимыми направляющими РНК, нацеленными на один и тот же ген, и высокий показатель подтверждения высоких результатов, и, таким образом, продемонстрировали перспективность скрининга генома с помощью Cas9.

[752] См. также патент США №20140357530; и публикацию патентной заявки РСТ W02014093701, включенные в настоящее описание в качестве ссылки.

Функциональные изменения и скрининг

[753] В другом аспекте осуществления настоящее изобретение относится к способу функциональной оценки и скрининга генов. Использование системы CRISPR согласно настоящему изобретению для точной доставки функциональных доменов, для активации или подавления генов или для изменения эпигенетического состояния путем точного изменения сайта метилирования в конкретном локусе-мишени может быть выполнено с использованием одной или более направляющих РНК для одной клетки, или популяции клеток, или библиотеки, примененной к геному в совокупности клеток ex vivo или in vivo, включая введение или экспрессию библиотеки, содержащей множество направляющих молекул РНК (sg-РНК), и где скрининг дополнительно включает использование эффекторного белка C2c2, причем содержащий эффекторный белок комплекс CRISPR модифицирован таким образом, чтобы содержать гетерологичный функциональный домен. В одном аспекте изобретение обеспечивает способ скрининга генома/транскриптома, включающий введение хозяину или экспрессию в хозяине библиотеки in vivo. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, дополнительно включающему активатор, вводимый хозяину или экспрессируемый в хозяине. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором активатор присоединен к эффекторному белку C2c2. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором активатор присоединен к N-концу или C-концу эффекторного белка C2c2. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором активатор присоединен к петле sg-РНК. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, дополнительно включающему репрессор, вводимый хозяину или экспрессируемый в хозяине. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, где скрининг включает изменение и обнаружение активации гена, ингибирования гена или расщепления в конкретном локусе.

[754] В одном аспекте изобретение обеспечивает эффективную целевую активность и минимизирует нецелевую активность. В одном аспекте изобретение обеспечивает эффективное целевое расщепление эффекторным белком C2c2 и сводит к минимуму нецелевое расщепление эффекторным белком C2c2. В одном аспекте изобретение обеспечивает направляющее специфическое связывание эффекторного белка C2c2 в локусе без расщепления ДНК. Соответственно, в одном аспекте изобретение обеспечивает мишень-специфическую генную регуляцию. В одном аспекте изобретение обеспечивает направляющее специфическое связывание эффекторного белка C2c2 в локусе гена без расщепления ДНК. Соответственно, в одном варианте изобретение предусматривает расщепление в одном локусе и регуляцию гена в другом локусе с использованием одного эффекторного белка C2c2. В одном аспекте изобретение обеспечивает ортогональную активацию, и/или ингибирование, и/или расщепление множества мишеней с использованием одного или более эффекторных белков C2c2 и/или ферментов.

[755] В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором клетка-хозяин является эукариотической клеткой. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором хозяин представляет собой эукариотический организм, отличный от человека. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором эукариотический организм, отличный от человека, является млекопитающим, отличным от человека. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, где млекопитающее, отличное от человека, представляет собой мышь. Одним аспектом изобретения является способ, описанный в настоящем описании, включающий доставку комплексов эффекторных белков C2c2 или их компонентов или молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты, кодирующей их, где указанная молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связана(ы) с регуляторной последовательностью(ми) и экспрессируется in vivo. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором экспрессия in vivo осуществляется с использованием лентивируса, аденовируса или AAV. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором доставка осуществляется через частицу, наночастицу, липид или проникающий в клетку пептид (CPP).

[756] В одном аспекте изобретение относится к паре комплексов CRISPR, включающих эффекторный белок C2c2, каждый из которых содержит направляющую молекулу РНК (sg-РНК), содержащую направляющую последовательность, способную к гибридизации с последовательностью-мишенью в геномном локусе-мишени в клетке, где по меньшей мере одна петля каждой sg-РНК модифицирована вставкой отдельной последовательности(ей) РНК, которая связана с одним или более адаптерными белками, и где адаптерный белок связан с одним или более функциональными доменами, где каждая sg-РНК каждого комплекса эффекторного белка C2c2 включает функциональный домен, обладающий активностью расщепления ДНК. В одном аспекте изобретение относится к парным комплексам эффекторного белка C2c1 или C2c3, как описано в настоящем описании, где активность расщепления ДНК обусловлена нуклеазой Fok1.

[757] В одном аспекте изобретение относится к способу разрезания последовательности-мишени в представляющем интерес геномном локусе, включающему доставку к клетке комплексов эффекторного белка C2c2, или его компонента или молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты, кодирующей их, причем молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторной последовательностью (последовательностями) и экспрессируется in vivo. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, в котором доставка производится с использованием лентивируса, аденовируса или AAV. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, или парному комплексу эффекторного белка C2c2, как описано в настоящем описании, в котором последовательность-мишень для первого комплекса пары находится на первой цепи двухцепочечной ДНК и последовательность-мишень для второго комплекса пары находится на второй цепи двухцепочечной ДНК. В одном аспекте изобретение относится к способу, описанному в настоящем описании, или парному комплексу эффекторного белка C2c2, как описано в настоящем описании, в котором последовательности-мишени первого и второго комплексов находятся вблизи друг друга, так что ДНК разрезается таким образом, чтобы облегчить направляемую гомологией репарацию. В одном аспекте способ настоящего изобретения может дополнительно включать введение в клетки матрицы ДНК. В одном аспекте описанный в настоящем описании способ или описанные в настоящем описании парные комплексы эффекторного белка C2c2 могут вовлекать случая, где каждый комплекс эффекторного белка C2c2 имеет эффекторный фермент C2c2, в который внесена мутация таким образом, что он имеет не более чем приблизительно 5% активности нуклеазы эффекторного фермента C2c2, который не имеет мутации.

[758] В одном аспекте изобретение относится к библиотеке, способу или комплексу, как описано в настоящем описании, в которых одноцепочечная направляющая sg-РНК модифицирована, чтобы иметь по меньшей мере одну некодирующую функциональную шпильку, например, где по меньшей мере одна некодирующая функциональная шпилька является репрессивнной; например, в которой, по меньшей мере одна некодирующая функциональная петля содержит Alu.

[759] В одном аспекте изобретение относится к способу изменения или модификации экспрессии продукта гена. Указанный способ может включать введение в клетку, содержащую и экспрессирующую молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, сконструированной, не встречающейся в природе системы CRISPR, содержащей эффекторный белок C2c2 и направляющую РНК, которая нацелена на молекулу ДНК, в результате чего направляющая РНК осуществляет нацеливание на молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, и эффекторный белок C2c2 расщепляет молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, в результате чего экспрессия продукта гена изменяется, и где эффекторный белок C2c2 и направляющая РНК не встречаются вместе в естественных условиях. Изобретение охватывает направляющую РНК, содержащую направляющую последовательность, связанную с последовательностью прямого повтора. Кроме того, изобретение подразумевает, что эффекторный белок C2c2 является кодон-оптимизированным для экспрессии в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, а в более предпочтительном варианте осуществления клетка млекопитающего представляет собой клетку человека. В дальнейшем варианте осуществления изобретения экспрессия продукта гена уменьшается.

[760] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов связаны с эффекторным белком C2c2. В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов связаны с адаптерным белком, например, с использованием модифицированных направляющих молекул Konnerman et al. (Nature 517, 583-588, 29 января 2015 года). В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов связаны с "мертвой" одноцепочечной направляющей (sg-РНК, d-РНК). В некоторых вариантах осуществления комплекс d-РНК с активным эффекторным белком C2c2 обеспечивает регуляцию гена посредством функционального домена в локусе гена, тогда как sg-РНК обеспечивает расщепление ДНК активным эффекторным белком C2c2 в другом локусе, например, как описано аналогично для систем CRISPR-Cas9 в Dahlman et al., "Orthogonal gene control with a catalytically active Cas9 nuclease" (в печати). В некоторых вариантах осуществления d-РНК выбирают так, чтобы максимизировать селективность регуляции представляющего интерес локуса гена по сравнению с неспецифической регуляцией. В некоторых вариантах осуществления d-РНК выбирают так, чтобы максимизировать регулирование гена-мишени и минимизировать расщепление мишени.

[761] Для целей последующего обсуждения "функциональный домен" может представлять собой функциональный домен, связанный с эффекторным белком C2c2, или функциональный домен, связанный с адаптерным белком.

[762] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов представляют собой NLS (последовательность ядерной локализации) или NES (ядерный экспортный сигнал). В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов являются доменом активации транскрипции, включающим VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, SET7/9 и гистонацетилтрансферу. Другие случаи упоминания в настоящем описании доменов активации (или доменов-активаторов) в отношении доменов, которые связаны с ферментом CRISPR, включают любой известный домен активации транскрипции и, в частности, VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, SET7/9 или гистонацетилтрансферазу.

[763] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов являются доменами подавления транскрипции. В некоторых вариантах осуществления доменами подавления транскрипции является KRAB-домен. В некоторых вариантах осуществления домен подавления транскрипции является доменом NuE, доменом NcoR, доменом SID или доменом SID4X.

[764] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов имеют одну или более функциональных активностей, включающих активность активации трансляции, активность подавления трансляции, метилазную активность, деметилазную активность, активность активации транскрипции, активность подавления транскрипции, активность фактора терминации транскрипции, активность модификации гистонов, активность расщепления РНК, активность расщепления ДНК, активность интеграции ДНК или активность связывания нуклеиновых кислот.

[765] Домены модификации гистонов также предпочтительны в некоторых вариантах осуществления. Типичные домены модификации гистонов обсуждаются ниже. В качестве функциональных доменов в рамках настоящего изобретения также предпочтительными являются домены транспозазы, домены HR (гомологичной рекомбинации), домены рекомбиназы и/или интегразы. В некоторых вариантах осуществления активность интеграции ДНК включает домены HR, домены интегразы, домены рекомбиназы и/или домены транспозазы. В некоторых вариантах предпочтительны домены гистонацетилтрансферазы.

[766] В некоторых вариантах осуществления активность расщепления ДНК обусловлена нуклеазой. В некоторых вариантах осуществления нуклеаза содержит нуклеазу Fok1. См. "Dimeric CRISPR RNA-guided Fok1 nucleases for highly specific genome editing", Shengdar Q. Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, Jennifer A. Foden, Vishal Thapar, Deepak Reyon, Mathew J. Goodwin, Martin J. Aryee, J. Keith Joung Nature Biotechnology 32(6): 569-77 (2014), которая относится к димерным Fok1-нуклеазам, направляемым РНК, которые распознают расширенные последовательности и могут редактировать эндогенные гены с высокой эффективностью в клетках человека.

[767] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов присоединены к эффекторному белку C2c2, так что при связывании с одноцепочечной направляющей РНК (sg-РНК) и мишенью функциональный домен находится в пространственной ориентации, позволяющей функциональному домену выполнять свойственную ему функцию.

[768] В некоторых вариантах осуществления один или более функциональных доменов присоединены к адаптерному белку, так что после связывания эффекторного белка C2c2 с одноцепочечной направляющей РНК (sg-РНК) и мишенью функциональный домен находится в пространственной ориентации, позволяющей функциональному домену выполнять свойственную ему функцию.

[769] В одном аспекте изобретение относится к композиции, описанной в настоящем описании, в которой один или более функциональных доменов присоединены к эффекторному белку C2c2 или адаптерному белку посредством линкера, необязательно линкера GlySer, как описано в настоящем описании.

[770] Эндогенное подавление транскрипции часто опосредуется ферментами, модифицирующими хроматин, такими как гистон-метилтрансферазы (ГМТ) и деацетилазы (HDAC). Репрессивные эффекторные домены гистонов известны, и их иллюстративный список приведен ниже. В таблице предпочтение отдавалось белкам и функциональным укороченным частям небольшого размера для облегчения эффективной упаковки вирусов (например, посредством AAV). В общем, однако, домены могут включать домены деацетилазы (HDAC), гистон-метилтрансферазы (HMT) и ингибиторы гистонацетилтрансферазы (HAT), а также белки, рекрутирующие HDAC и HMT. Функциональный домен может быть или включать в некоторых вариантах осуществления эффекторные домены HDAC, рекрутирующие эффекторные домены HDAC, эффекторные домены гистонацетилтрансферазы (HMT), рекрутирующие эффекторные домены гистон-метилтрансферазы (HMT), рекрутирующие эффекторные домены гистонацетилтрансферазы.

Эффекторные домены HDAC

Подтип/ комплекс Название Субстрат (если известен) Модификация (если известна) Организм Полный размер (а.к.) Выбранное укорочение (а.к.) Конечный размер (а.к.) Каталитический домен HDAC I HDAC8 - - X. laevis 325 1-325 325 1-272: HDAC HDAC I RPD3 - - S. cerevisiae 433 19-340 322 (Vannier) 19-331: HDAC HDAC IV MesoLo4 - - M. loti 300 1-300
(Gregoretti) 300 - HDAC I HDAC11 - - H. sapiens 347 1-347 (Gao) 347 14-326: HDAC HD2 HDT1 - - A. thaliana 245 1-211 (Wu) 211 - SIRT I SIRT3 H3K9Ac
H4K16Ac
H3K56Ac - H. sapiens 399 143-399 (Scher) 257 126-382: SIRT SIRT I HST2 - C. albicans 331 1-331
(Hnisz) 331 - SIRT I CobB - E. coil (K12) 242 1-242
(Landry) 242 - SIRT I HST2 - S. cerevisiae 357 8-298
(Wilson) 291 - SIRT III SIRT5 H4K8Ac
H4K16Ac - H. sapiens 310 37-310
(Gertz) 274 41-309: SIRT SIRT III Sir2A - P. falciparum 273 1-273
(Zhu) 273 19-273: SIRT SIRT IV SIRT6 H3K9Ac
H3K56Ac - H. sapiens 355 1-289
(Tennen) 289 35-274: SIRT

[771] Соответственно, репрессорные домены по настоящему изобретению могут быть выбраны из гистон-метилтрансферазы (ГМТ), гистондезацетилаз (HDAC), ингибиторов гистонацетилтрансферазы (HAT), а также привлекающих HDAC и HMT белков.

[772] Домен HDAC может быть любым из приведенных в таблице выше: HDAC8, RPD3, MesoLo4, HDAC11, HDT1, SIRT3, HST2, CobB, HST2, SIRT5, Sir2A или SIRT6.

[773] В некотором варианте осуществления функциональный домен может быть рекрутирующим эффекторным доменом HDCP. Предпочтительные примеры включают те, которые приведены в таблице ниже, а именно MeCP2, MBD2b, Sin3a, NcoR, SALL1, RCOR1. NcoR проиллюстрирован в примерах настоящего описания и, хотя использование этого белка предпочтительно, предполагается, что другие представители класса также будут полезны.

Таблица HDAC рекрутирующие эффекторные домены

Подтип/
комплекс Название Субстрат (если известен) Модификация (если известна) Организм Полный размер (а.к.) Выбранное укорочение (а.к.) Конечный размер (а.к.) Каталитический домен Sin3a MeCP2 - - R.norvegicus 492 207-492
(Nan) 286 - Sin3a MBD2b - - H. sapiens 262 45-262
(Boeke) 218 - Sin3a Sin3a - - H. sapiens 1273 524-851
(Laherty) 328 627-829:
взаимодействие с HDAC1 NcoR NcoR - - H. sapiens 2440 420-488
(Zhang) 69 - NuRD SALL1 - - M. musculus 1322 1-93
(Lauberth) 93 - CoREST RCOR1 - - H. sapiens 482 81-300
(Gu, Ouyang) 220 -

[774] В некотором варианте осуществления функциональный домен может быть эффекторным доменом метилтрансферазы (HMT). Предпочтительные примеры включают те, которые приведены в таблице ниже, а именно NUE, vSET, EHMT2/G9A, SUV39H1, dim-5, KYP, SUVR4, SET4, SET1, SETD8 и TgSET8. NUE проиллюстрированы в примерах настоящего описания и, хотя использование этого белка предпочтительно, предполагается, что другие представители класса также будут полезны.

Таблица эффекторных доменов гистонметилтрансферазы (HMT)

Подтип/
комплекс Название Субстрат (если известен) Модификация (если известна) Организм Полный размер (а.к.) Выбранное укорочение (а.к.) Конечный размер (а.к.) Каталитический домен SET NUE H2B,
H3, H4 - C. trachomatis 219 1-219
(Pennini) 219 - SET vSET - H3K27me3 P.Bursaria chlorella virus 119 1-119 (Mujtaba) 119 4-112:
SET2 Семейство SUV39 EHMT2/
G9A H14K2,
H3K9,
H3K27 H3K9me1/2,
H1K25me1 M. musculus 1263 969-1263
(Tachibana) 295 1025-1233:
Пре-SET
SET,
Пост-SET SUV39 SUV39H1 - H3K9me2/3 H. sapiens 412 79-412
(Snowden) 334 172-412:
Пре-SET
SET,
Пост-SET Suvar3-
9 dim-5 - H3K9me3 N. crassa 331 1-331
(Rathert) 3 3 1 77-331:
Пре-SET
SET,
Пост-SET Suvar3-9
(подсемейство SUVH) KYP - H3K9me1/2 A. thaliana 624 335-601 267
(Jackson) - Suvar3-9
(подсемейство SUVR) SUVR4 H3K9me1 H3K9me2/3 A. thaliana 492 180-492 313
(Thorstensen) 192-462:
Пре-SET
SET,
Пост-SET Suvar4-20 SET 4 - H4K20me3 C. elegans 288 1-288
(Vielle) 288 - SETS SET1 - H4K20me1 C. elegans 242 1-242
(Vielle) 242 - SETS SETD8 - H4K20me1 H. sapiens 393 185-393 209
(Couture) 256-382:
SET SETS TgSETS - H4K20me1/2/3 T. gondii 1893 1590-1893
(Sautel) 304 1749-1884:
SET

[775] В одном из вариантов осуществления функциональный домен может представлять собой рекрутирующий эффекторный домен гистон-метилтрансферазы (HMT). Предпочтительные примеры включают примеры, приведенные в таблице ниже, а именно Hp1a, PHF19 и NIPP1.

[776] Таблица эффективности рекрутирующих эффекторных доменов гистонметилтрансферазы (HMT).

Подтип/
комплекс Название Субстрат (если известен) Модификация (если известна) Организм Полный размер (а.к.) Выбранное укорочение (а.к.) Конечный размер (а.к.) Каталитический домен - Hpla - H3K9me3 M. musculu 19
1 73-191 119
(Hathawa) 121-179:
chromoshad - PHF19 - H3K27me3 H. sapiens 58
0 (1-250)
Линкер GGSG+(500-580) 335
() 163-250:
PHD2 - NIPP1 - H3K27me3 H. sapiens 35
1 1-329
(Jin) 329 310-329:
EED

[777] В некотором варианте осуществления функциональный домен может быть ингибиторным эффекторным доменом гистонацетилтрансферазы. Предпочтительные примеры включают SET/TAF-1β, перечисленные в таблице ниже.

[778] Таблица ингибиторных эффекторных доменов гистонацетилтрансферазы.

Подтип/
комплекс Название Субстрат (если известен) Модификация (если известна) Организм Полный размер (а.к.) Выбранное укорочение (а.к.) Конечный размер (а.к.) Каталитический домен - SET/TAF-1β - - M.
musculus 289 1-289
(Cervoni) 289 -

[779] Также является предпочтительным нацеливание на эндогенные элементы контроля (регуляторные), такие как участвующие в трансляции, придающие стабильность или, где применимо (энхансеры и сайленсеры), дополнительно к промотору или элементам, расположенным проксимально относительно промотора. Таким образом, изобретение может также использоваться для нацеливания на эндогенные элементы контроля (включая энхансеры и сайленсеры) в дополнение к нацеливанию на промотор. Эти элементы контроля могут быть расположены в восходящем- и нисходящем-направлении от точки начала транскрипции (TSS), начиная с 200 п.н. от TSS до 100 т.п.н от нее. Нацеливание на известные элементы контроля может быть использовано для активации или подавления гена-мишени. В некоторых случаях один элемент управления может влиять на транскрипцию нескольких генов-мишеней. Таким образом, нацеливания на один элемент контроля может использоваться для управления транскрипцией нескольких генов одновременно.

[780] Нацеливание на предполагаемые элементы контроля с другой стороны, (например, путем охвата области предполагаемого элемента контроля, а также от 200 п.н. до 100 т.п.н. вокруг элемента) может использоваться как средство подтверждения таких элементов (путем измерения транскрипции представляющего интерес гена) или для обнаружения новых элементов контроля (например, путем охвата области, находящейся на расстоянии 100 т.п.н. в восходящем и нисходящем направлении от TSS представляющего интерес гена). Кроме того, нацеливание на предполагаемые элементы контроля может быть полезно в контексте понимания генетических причин заболевания. Многие мутации и распространенные SNP-варианты, связанные с фенотипами заболевания, расположены за пределами кодирующих областей. После нацеливания на такие области с помощью систем активации или подавления, описанных в настоящем описании, можно провести определение данных транскрипции для либо a) набора предполагаемых мишеней (например, набора генов, расположенных в непосредственной близости от элемента контроля), либо b) для всего транскриптома, например, с помощью секвенирования РНК или микрочипа. Это позволило бы идентифицировать вероятные гены-кандидаты, вовлеченные в фенотип болезни. Такие гены-кандидаты могут быть полезны в качестве новых мишеней лекарственных препаратов.

[781] В настоящем описании упоминаются ингибиторы гистонацетилтрансферазы (HAT). Однако в некоторых вариантах осуществления альтернатива заключается в том, что один или более функциональных доменов содержат ацетилтрансферазу, предпочтительно гистонацетилтрансферазу. Они полезны в области эпигеномики, например, в способах исследования эпигенома. Способы исследования эпигенома могут включать, например, нацеливание на эпигеномные последовательности. Нацеливание на эпигемомные последовательностей может включать направляющую молекулу, направленную на эпигеномную последовательность-мишень. В некоторых вариантах осуществления эпигеномная последовательность-мишень может включать последовательность промотора, сайленсера или энхансера.

[782] Использование функционального домена, связанного с эффекторным белком C2c2, как описано в настоящем описании, предпочтительно мертвым эффекторным белком, более предпочтительно мертвым эффекторным белком FnC2c2, для нацеливания на эпигеномные последовательности возможно для активации или подавления промоторов, сайленсеров или энхансеров.

[783] Примеры ацетилтрансфераз известны, но могут включать, в некоторых вариантах осуществления, гистонацетилтрансферазы. В некоторых вариантах осуществления гистонацетилтрансфераза может содержать каталитическое ядро ацетилтрансферазы р300 человека (Gerbasch & Reddy, Nature Biotech, 6th April 2015).

[784] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления функциональный домен связан с мертвым эффекторным белком C2c2 для нацеливания на и активации эпигеномных последовательностей, таких как промоторы или энхансеры. Одна или более направляющих молекул, нацеленных на такие промоторы или энхансеры, также могут быть предоставлены для управления связыванием фермента CRISPR с такими промоторами или энхансерами.

[785] В определенных вариантах осуществления нацеленный на РНК эффекторный белок по изобретению может использоваться для препятствования котранскрипционным модификациям структуры ДНК или хроматина, управляемому РНК метилированию ДНК или управляемому РНК сайленсингу/активации ДНК/хроматина. Управляемое РНК метилирование ДНК (RdDM) представляет собой эпигенетический процесс, впервые обнаруженный в растениях. В ходе RdDM двухцепочечные РНК (дцДНК) процессируются с образованием малых интерферирующих РНК (миРНК) длиной до 21-24 нуклеотидов и направляют метилирование гомологичных локусов ДНК. Помимо молекул РНК, множество белков участвует в создании RdDM, такие как белки Argonaute, ДНК-метилтрансферазы, комплексы ремоделирования хроматина и специфические для растений ДНК-полимераза IV и ДНК-полимераза V. Все они действуют совместно, присоединяя метильную группу в 5'-положении цитозинов. Малые РНК могут модифицировать структуру хроматина и подверженную сайленсингу транскрипцию, направляя комплексы, содержащие Argonaute, к комплементарным наращиваемым (не кодирующим) транскриптам РНК. Затем опосредуется привлечение комплексов модификации хроматина, включая гистон- и ДНК-метилтрансферазы. Нацеленный на РНК эффекторный белок по изобретению можно использовать для нацеливания на такие малые РНК и препятствования взаимодействиям между этими малыми РНК и наращиваемыми некодирующими транскриптами.

[786] Термин "ассоциированный с" используется в настоящем описании в отношении ассоциации функционального домена с эффекторным белком C2c2 или адаптерным белком. Он используется в отношении того, как одна молекула "ассоциирует" (связывается) с другой, например, между адаптерным белком и функциональным доменом, или между эффекторным белком C2c2 и функциональным доменом. В случае таких белок-белковых взаимодействий эту ассоциацию можно рассматривать с точки зрения распознавания, подобно тому, как антитело распознает эпитоп. Альтернативно, один белок может быть связан с другим белком посредством слияния двух субъединиц, например, одна субъединица является слитой с другой субъединицей. Слияние обычно происходит путем добавления одной аминокислотной последовательности к другой, например, путем совместного сплайсинга нуклеотидных последовательностей, которые кодируют каждый белок или субъединицу. Альтернативно, это может по существу рассматриваться как связывание двух молекул или прямое образование связи, такое как слитый белок. В любом случае слитый белок может включать линкер между представляющими интерес субъединицами (то есть между ферментом и функциональным доменом или между адаптерным белком и функциональным доменом). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления эффекторный белок C2c2 или адаптерный белок ассоциирован с функциональным доменом путем связывания с ним. В других вариантах осуществления эффекторный белок C2c2 или адаптерный белок ассоциирован с функциональным доменом, потому что оба слиты вместе, необязательно посредством промежуточного линкера.

Насыщающий мутагенез

[787] Система(ы) эффекторного белка C2c2, описанная в настоящем описании, может быть использована для выполнения насыщающего или глубоко сканирующего мутагенеза геномных локусов в сочетании с клеточным фенотипом, например, для определения критических минимальных признаков и дискретных уязвимостей функциональных элементов, необходимых для экспрессии генов, лекарственной устойчивости и купирования заболевания. Под "насыщающим" или "глубоко сканирующим мутагенезом" подразумевается, что каждое или по существу каждое основание ДНК разрезается внутри геномных локусов. В популяцию клеток можно ввести библиотеку направляющих РНК эффекторных белков C2c2. Библиотека может быть введена таким образом, что каждая клетка получает одну направляющую молекулу РНК (sg-РНК). В случае, когда библиотека вводится путем трансдукции вирусного вектора, как описано в настоящем описании, используется низкая множественность инфекции. Библиотека может включать sg-РНК, нацеленные на каждую последовательность в восходящем направлении от последовательности, прилегающей к протоспейсеру (PAM) в геномном локусе. Библиотека может включать по меньшей мере 100 непересекающихся геномных последовательностей в восходящем направлении от PAM для каждых 1000 пар оснований в геномном локусе. Библиотека может включать sg-РНК, нацеливающие на последовательности в восходящем направлении по меньшей мере от одной отличающейся PAM. Системы эффекторного белка C2c2 могут включать более одного белка C2c2. Можно использовать любой эффекторный белок C2c2, как описано в настоящем описании, включая ортологи или сконструированные эффекторные белки C2c2, которые распознают различные последовательности PAM. Частота не являющихся мишенями сайтов для sg-РНК может составлять менее 500. Оценка нецелевого связывания sg-РНК необходима для отбора sg-РНК с наименьшим уровнем возможного связывания с не являющимися мишенями участками. Любой фенотип, который, как установлено, связан с разрезанием участке-мишени sg-РНК, может быть подтвержден с использованием sg-РНК, нацеленных на один и тот же сайт в одном эксперименте. Валидация участка-мишени также может быть выполнена с использованием модифицированного эффекторного белка C2c2, как описано в настоящем описании, и двух sg-РНК, нацеливающих на участок-мишень в геноме. Без связи с теорией, можно утверждать, что участок-мишень действительно установлен, если изменение фенотипа наблюдается в экспериментах по проверке достоверности.

[788] Что касается описанных в настоящем описании белков, нацеленных ДНК, геномные локусы могут включать по меньшей мере одну непрерывную геномную область. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может включать и весь геном. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать функциональный элемент генома. Функциональный элемент может находиться в некодирующей области, кодирующем гене, интронной области, промоторе или энхансере. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать по меньшей мере 1 т.п.н., предпочтительно по меньшей мере 50 т.п.н. геномной ДНК. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать сайт связывания фактора транскрипции. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать область, гиперчувствительную к расщеплению ДНК-азой I. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать усиливающий транскрипцию энхансер или подавляющий транскрипцию репрессорный элемент. По меньшей мере одна непрерывная геномная область может содержать сайт, обогащенный эпигенетической сигнатурой. По меньшей мере одна непрерывная область геномной ДНК может содержать эпигенетический инсулятор. По меньшей мере, одна непрерывная геномная область может содержать две или более непрерывных геномных областей, которые физически взаимодействуют. Геномные области, которые взаимодействуют, могут определяться "технологией 4C". 4C-технология позволяет провести скрининг всего генома непредвзятым образом для сегментов ДНК, которые физически взаимодействуют с выбранным фрагментом ДНК, как описано в Zhao et al. ((2006) Nat Genet 38, 1341-7) и в патенте США 8642295, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Эпигенетическая сигнатура может представлять собой ацетилирование, метилирование, убиквитинацию, фосфорилирование гистонов, метилирование ДНК или отсутствие всего вышеперечисленного.

[789] Система(ы) эффекторного белка C2c2 для насыщающего или глубоко сканирующего мутагенеза может быть использована в популяции клеток. Система эффекторного белка C2c2 может использоваться в эукариотических клетках, включая, но не ограничиваясь ими, клетки млекопитающих и растений. Популяция клеток может состоять из прокариотических клеток. Популяция эукариотических клеток может быть популяцией эмбриональных стволовых (ES) клеток, нейронов, эпителиальных клеток, иммунных клеток, эндокринных клеток, мышечных клеток, эритроцитов, лимфоцитов, растительных клеток или дрожжевых клеток.

[790] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга функциональных элементов, связанных с изменением фенотипа. Библиотека может быть введена в популяцию клеток, которые адаптированы для содержания эффекторного белка C2c2. Клетки могут быть рассортированы по меньшей мере на две основные группы на основе фенотипа. Фенотип может включать экспрессию гена, рост или жизнеспособность клеток. Может быть определена относительная представленность направляющих РНК, присутствующих в каждой группе, причем геномные сайты, связанные с изменением фенотипа, определяются по представленности направляющих РНК, присутствующих в каждой группе. Изменение фенотипа может быть изменением экспрессии гена-мишени. Экспрессия гена-мишени может быть повышена, понижена, или полностью выключена (нокаут гена). Клетки могут быть отсортированы в группы с высокой и низкой экспрессией. Популяция клеток может включать репортерную конструкцию, которая определяет фенотип. Конструкция репортера может включать поддающийся обнаружению маркер. Клетки могут быть отсортированы с помощью поддающегося обнаружению маркера.

[791] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга геномных сайтов, связанных с устойчивостью к химическому соединению. Химическое соединение может быть лекарственным средством или пестицидом. Библиотека может быть введена в популяцию клеток, адаптированных к содержанию эффекторного белка C2c2, где каждая клетка популяции содержит не более одной направляющей РНК; популяцию клеток обрабатывают химическим соединением; и представленность направляющих РНК определяют после обработки химическим соединением в более поздний момент времени по сравнению с ранним моментом времени, при котором геномные участки, связанные с устойчивостью к химическому соединению, определяются по обогащению направляющими РНК. Представленность sg-РНК может быть определена способами глубокого секвенирования.

[792] Полезными в практике настоящего изобретения с использованием комплексов эффекторных белков C2c2 являются способы, в которых используются системы CRISPR-Cas9, и может быть приведена ссылка на статью под названием "BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis". Canver, M.C., Smith,E.C., Sher, F., Pinello, L., Sanjana, N.E., Shalem, O., Chen, D.D., Schupp, P.G., Vinjamur, D.S., Garcia, S.P., Luc, S., Kurita, R., Nakamura, Y., Fujiwara, Y., Maeda, T., Yuan, G., Zhang, F., Grkin, S.H., & Bauer, D.E. DOI: 10.1038/naturel552I, published online September 16, 2015, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки и кратно обсуждается ниже.

[793] Canver et al. использует новые объединенные библиотеки направляющих cr-РНК-Cas9, чтобы выполнять насыщающий мутагенез in situ человеческих и мышиных эритроидных энхансеров BCL11A, ранее идентифицированных как энхансер, ассоциированный с уровнем фетального гемоглобина (HbF), и мышиный ортолог которого необходим для экспрессии эритроида BCL11A. Этот подход выявил критические минимальные признаки и дискретную уязвимость этих энхансеров. Благодаря редактированию первичных человеческих предшественников и трансгенеза мышей, авторы подтвердили, что эритроидный энхансер BCL11A может быть использован в качестве мишени для реиндукции HbF. Авторы создали подробную карту энхансера, которая может быть использована при терапевтическом редактировании генома.

Способы использования систем C2c2 для модификации клетки или организма

[794] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу модификации клетки или организма. Клетка может быть прокариотической или эукариотической. Клетка может быть клеткой млекопитающего. Клетка может быть не принадлежащей человеку клеткой млекопитающего, клеткой примата, коровы, свиньи, грызуна или мыши. Клетка может быть эукариотической клеткой не млекопитающего, такой как клетка домашней птицы, рыбы или креветки. Клетка также может быть растительной клеткой. Растительная клетка может быть клеткой зерновой культуры, такой как маниока, кукуруза, сорго, пшеница или рис. Растительная клетка может быть клеткой водоросли, дерева или овоща. Модификация, введенная в клетку согласно настоящему изобретению, может быть такой, что клетка и потомки клетки изменяются для улучшения производства биологических продуктов, таких как антитела, крахмал, спирт или другой желаемый клеточной продукции. Модификация, введенная в клетку согласно настоящему изобретению, может быть такой, что клетка и ее потомки включают изменение, которое изменяет продуцируемый ими биологический продукт.

[795] Описываемая система может содержать один или более различных векторов. В одном аспекте изобретения эффекторный белок является кодон-оптимизированным для экспрессии в желаемом типе клеток, предпочтительно эукариотических клеток, предпочтительно клеток млекопитающего или клеток человека.

[796] Упаковочные клетки обычно используются для получения вирусных частиц, которые способны инфицировать клетку-хозяина. Такие клетки включают клетки 293, которые упаковывают аденовирусы и клетки ψ2 или клетки РА317, которые упаковывают ретровирусы. Вирусные векторы, используемые в генной терапии, обычно получают путем создания клеточной линии, которая производит упаковку векторов нуклеиновой кислоты в вирусные частицы. Векторы обычно содержат минимальные вирусные последовательности, необходимые для упаковки и последующей интеграции в клетку-хозяина, при этом другие вирусные последовательности заменяются кассетой экспрессии для полинуклеотида(ов), подлежащего(их) экспрессии. Отсутствующие функции вируса обычно поставляются в процессе доставки упаковочными клетками линии. Например, векторы AAV, используемые в генной терапии, обычно имеют только последовательности ITR из генома AAV, которые необходимы для упаковки и интеграции в геном хозяина. Вирусная ДНК упаковывается с помощью клеточной линии, которая содержит вспомогательную плазмиду, кодирующую другие гены AAV, а именно rep и cap, но не содержащую последовательность ITR. Линия клеток также может быть инфицирована аденовирусом в качестве вспомогательной частицы. Вспомогательный вирус способствует репликации вектора AAV и экспрессии генов AAV из вспомогательной плазмиды. Вспомогательная плазмида не может быть упакована в больших количествах из-за отсутствия последовательности ITR. Контаминация аденовирусом может быть уменьшена, например, с помощью термообработки, к которой аденовирус более чувствителен, чем AAV. Квалифицированным специалистам в данной области известны дополнительные способы доставки нуклеиновых кислот в клетки. См., например, US 20030087817, включенную в настоящее описание в качестве ссылки.

[797] В некоторых вариантах осуществления клетку-хозяина временно или постоянно трансфицируют одним или более векторами, описанными в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления клетку трансфицируют в том виде, в каком она присутствует у индивидуума естественным образом. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетку, которую трансфицируют, извлекают из субъекта, такого как клеточная линия. В данной области известно большое разнообразие клеточных линий для тканевой культуры. Примеры клеточных линий включают, но не ограничиваются ими: C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, ВС-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, эпителий почки обезьяны BS-C-1, фибробласты эмбрионов мыши BALB/3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 фетальные фибробласты человека, фибробласты мыши 10.1, 293-Т, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, ВхРСЗ, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, JY клетки, клетки K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R. MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN /OPCT клеточные линии, Peer, PNT-1A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, клетки Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1, U373, U87, U937, VCaP, клетки Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR и их трансгенные разновидности. Клеточные линии доступны из множества источников, известных квалифицированным специалистам в данной области (см., например, Американскую коллекцию типовых культур (ATCC) (Manassus, Va.)). В некоторых вариантах осуществления клетка, трансфицированная одним или более векторами, описанными в настоящем описании, используется для получения новой клеточной линии, содержащей одну или более последовательностей, полученных из вектора. В некоторых вариантах осуществления клетка, временная трансфицированная компонентами системы, нацеленной на нуклеиновую кислоту, как описано в настоящем описании (например, путем временной трансфекции одного или более векторов или трансфекции РНК) и модифицированная посредством активности комплекса нацеливания на нуклеиновую кислоту, используется для создания новой клеточной линии, содержащей клетки, имеющие модификацию, но не имеющие какой-либо другой экзогенной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, временно или постоянно трансфицированные одним или более векторами, описанными в настоящем описании, или клеточные линии, полученные из таких клеток, используются для оценки одного или более тестируемых соединений.

[798] В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более векторов, описанных в настоящем описании, используются для получения трансгенного животного, отличного от человека, или трансгенного растения. В некоторых вариантах осуществления трансгенное животное представляет собой млекопитающее, такое как мышь, крыса или кролик. В некоторых вариантах осуществления организм или субъект является растением. В некоторых вариантах осуществления организм, субъект или растение являются водорослями. Способы получения трансгенных растений и животных известны в данной области и обычно начинаются с использования способа трансфекции клеток, как описано в настоящем описании.

[799] В одном аспекте изобретение относится к способам модификации полинуклеотида-мишени в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления такой способ включает позволение комплекса, нацеленного на нуклеиновую кислоту, связываться с полинуклеотидом-мишенью для расщепления указанного полинуклеотида-мишени, тем самым модифицируя полинуклеотид-мишень, причем комплекс, нацеленный на нуклеиновую кислоту, включает эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, и направляющую РНК, гибридизованную с последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде-мишени.

[800] В одном аспекте изобретение относится к способу модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает позволение комплексу, нацеленному на нуклеиновую кислоту, связываться с полинуклеотидом, так что указанное связывание приводит к увеличению или уменьшению экспрессии указанного полинуклеотида; где комплекс, нацеленный на нуклеиновую кислоту, содержит эффекторный белок, нацеленный на нуклеиновую кислоту, связанный с направляющей РНК, которая гибридизована с последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде.

Комплексы эффекторного белка C2c2 могут использоваться в растениях

[801] Система(ы) эффекторного белка C2c2 (например, одиночная или мультиплексированная) может использоваться в сочетании с новейшими достижениями в геномике культур. Описанную в настоящем описании систему можно использовать для выполнения результативного и экономически эффективного исследования или манипуляции с геном или геномом растений, например, для быстрого исследования, и/или отбора, и/или выбора, и/или сравнения, и/или манипуляций, и/или трансформации растительных генов или геномов, например, для создания, идентификации, разработки, оптимизации или присвоения определенной характеристики(характеристик) или признака (набора признаков) растениям или для трансформации генома растения. Таким образом, может быть улучшено производство растений, а именно новых растений с новыми комбинациями признаков или характеристик или новых растений с улучшенными признаками. Система или системы из эффекторного белка C2c2 может использоваться на растениях при использовании следующих способов: сайт-направленной интеграции (SDI) или редактирования генов (GE), близкого обратного скрещивания (NRB) или обратного скрещивание (RB). Аспекты использования описанных в настоящем описании эффекторных систем C2c2 могут быть аналогичны использованию систем CRISPR-Cas (например, CRISPR-Cas9) в растениях. В этой связи заслуживает упоминания веб-сайт Университета Аризоны "CRISPR-PLANT" (http:/www.genome.arizona.edu/crispr/) (поддерживается PennState и AGI). Варианты осуществления изобретения могут быть использованы при редактировании генома в растениях или в тех случаях, где ранее применялись способы с использованием иРНК или аналогичных способов редактирования генома; см., например, Nekrasov, "Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR-Cas system," Plant Methods 2013, 9:39 (doi: 10.1186/1746-4811-9-39); Brooks, "Efficient gene editing in tomato in the first generation using the CRISPR-Cas9 system," Plant Physiology September 2014 pp 114.247577; Shan, "Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system," Nature Biotechnology 31, 686-688 (2013); Feng, "Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system," Cell Research (2013) 23:1229-1232 doi: 10.1038/cr.2013.114; published online 20 August 2013; Xie, "RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system," Mol Plant. 2013 Nov; 6(6):1975- 83. doi: 10.1093/mp/sstl 19. Epub 2013 Aug 17; Xu, "Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice," Rice 2014, 7:5 (2014), Zhou et af., "Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate: CoA ligase specificity and Redundancy," New Phytologist (2015) (Forum) 1-4 (доступен через интернет по ссылке wmv.newphytologist.com); Caliando et al, "Targeted DNA degradation using a CRISPR device stably carried in the host genome, NATURE COMMUNICATIONS 6:6989, DOI: 10.1038/ncomms7989, vvwvv.nature.com/naturecommunications DOI: 10.1038/ncomms7989; патент США №6603061 - Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; патент США №7868149 - Plant Genome Sequences and Uses Thereof, и US 2009/0100536 - Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits, содержание каждого из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В практическом воплощении изобретения, содержание и раскрытие Morrell et al. "Crop genomics: advances and applications", NatRevGenet. 2011 Dec 29; 13 (21:85-96; включено в настоящее описание в качестве ссылки, в том числе в отношении того, как данное изобретение может быть применено к растениям. Соответственно, данная ссылка может также применяться и к клеткам животных, с учетом возможных различий, к растительным клеткам, если не указано иное; и в этом случае ферменты, обладающие сниженными неспецифическими эффектами и системы, использующие такие ферменты, могут быть использованы применительно к растениям, в том числе к тем, которые упомянуты в настоящей заявке.

[802] Sugano et al. (Plant Cell Physiol. 2014 Mar; 55(3):475-81. doi: 10.1093/pcp/pcu014. Epub 2014 Jan 18) сообщает о применении CRISPR-Cas9 для направленного мутагенеза печеночника Marchantiapolymorpha L., который стал использоваться как модель для экспериментов для изучения эволюции высших растений. Промотор U6 M. polymorpha идентифицировали и клонировали для экспрессии гРНК. Последовательность, являющаяся мишенью гРНК, была разработана для нарушения работы гена, кодирующего фактор ауксина 1 (ARF1) у M. polymorpha. Используя трансформацию при помощи Agrobacterium, Sugano et al. получили устойчивые мутанты в фазе гаметофита для M. polymorpha. При использовании CRISPR-Cas9 сайт-направленный мутагенез in vivo был получен с помощью промотора мозаики цветной капусты 35S или промотора M. polymorphaEF1α для экспрессии Cas9. Изолированные мутантные индивидуумы, демонстрирующие ауксин-устойчивый фенотип, не были химерами. Более того, стабильные мутанты были получены путем бесполого размножения растений T1. Многочисленные аллели arf1 легко получали с использованием направленного мутагенеза на основе системы CRIPSR/Cas9. Системы C2c2 согласно настоящему изобретению могут быть использованы для регулирования тех же, а также других генов, и сходных систем контроля экспрессии, таких как РНК-i и миРНК. Способ по изобретению может быть индуцируемым и обратимым.

[803] Kabadi et al. (Nucleic Acids Res. 2014 Oct 29; 42(19):e147. doi: 10.1093/nar/gku749. Epub 2014 Aug 13) разработали единую лентивирусную систему, чтобы экспрессировать вариант Cas9, ген-репортер и до четырех sg-РНК с независимых промоторов РНК-полимеразы III, которые включены в вектор с помощью достаточно удобного способа клонирования GoldenGate. Каждая sg-РНК была эффективно экспрессирована и может опосредовать редактирование мультиплексного гена и устойчивую активацию транскрипции в иммортализованных и первичных клетках человека. Настоящее изобретение может быть использовано для регулирования генов растений Kabadi.

[804] Xing et al. (BMCPlantBiology 2014, 14: 327) разработали бинарный векторный набор CRISPR-Cas9 на основе каркаса pGreen или pCAMBIA, а также гРНК. Этот набор инструментов не требует каких-либо дополнительных ферментов рестрикции помимо BsaI для создания конечных конструкций с высокой эффективностью всего за один шаг клонирования. Эти конструкции могут содержать кодон-оптимизированный для кукурузы Cas9 и одну или более гРНК. Инструментарий был подтвержден с использованием протопластов кукурузы, трансгенных линий кукурузы и трансгенных линий Arabidopsis и, как было показано, демонстрирует высокую эффективность и специфичность воздействия. Однако, что видится еще более важным, с использованием этого инструментария были обнаружены направленные мутации трех генов Arabidopsis в трансгенных ростках поколения T1. Более того, мутации с множественными генами могут быть унаследованы следующим поколением. Набор векторных модулей (направляющая РНК) использовался в качестве инструментария для мультиплексного редактирования генома в растениях. Системы C2c2 и белки согласно настоящему изобретению могут использоваться для нацеливания на гены-мишени согласно Xing.

[805] Системы CRISPR C2c2 по изобретению могут использоваться для обнаружения вирусов растений. Gambino et al. (Phytopathology. 2006 Nov; 96(11): 1223-9. doi: 10.1094/PHYTO-96-1223) полагались на амплификацию и мультиплексную ПЦР для одновременного обнаружения девяти вирусов виноградной лозы. Аналогичным образом системы C2c2 и белки по настоящему изобретению могут быть использованы для обнаружения множества мишеней в растении-хозяине. Кроме того, системы по изобретению могут быть использованы для одновременного нокдауна экспрессии вирусного гена в ценных агрикультурах и предотвращения активации или дальнейшего заражения путем нацеливания на экспрессию вирусной РНК.

[806] Murray et al. (ProcBiolSci., 2013 Jun 26, 280 (1765): 20130965. doi: 10.1098/rspb.2013.0965, опубликовано 22 августа 2013 года) проанализировали 12 растительных РНК-вирусов, чтобы выявить скорость эволюции, и обнаружили доказательства эпизодического отбора, возможно, происходившего из-за сдвигов между различными генотипами или видами хозяина. Системы C2c2 и белки согласно настоящему изобретению могут быть использованы для нацеливания на или иммунизации против таких вирусов в хозяине. Например, системы по изобретению могут быть использованы для выключения экспрессии вирусной РНК, а следовательно, и репликации. Кроме того, изобретение может быть использовано как для нацеливания нуклеиновых кислот на расщепления, так и для нацеливания на экспрессию или активацию. Кроме того, системы по изобретению могут быть мультиплексированы таким образом, чтобы поражать несколько целей или множественный изолят того же вируса.

[807] Ma et al. (Mol Plant, 2015 Aug 3, 8 (8): 1274-84. Doi: 10.1016./j.molp.2015.04.007) сообщают о надежной векторной системе CRISPR-Cas9, использующей кодон-оптимизированный для растений ген Cas9 для удобного и высокоэффективного мультиплексного редактирования генома в однодольных и двудольных растениях. Ma et al. разработали специальные процедуры на основе ПЦР, для быстрого получения множественных экспрессирующих кассет для sg-РНК, которые могут быть собраны в бинарные векторы CRISPR-Cas9 за один раунд клонирования путем лигирования по типу GoldenGate или сборки Гиббса (GibsonAssembly). В этой системе Ma et al. отредактировали 46 целевых сайтов риса со средней скоростью мутации 85,4%, в основном в биаллельном и гомозиготном состоянии. Ma et al. приводят примеры моделирования генной мутации - потери функции в растениях риса T0 и Arabidopsis T1 путем одновременного нацеливания на несколько (до восьми) членов семейства генов, множественно генов в биосинтетическом пути или множество участков в одном гене. Аналогично, системы C2c2 по настоящему изобретению могут одновременно и успешно быть нацелены на экспрессию нескольких генов.

[808] Lowder et al. (PlantPhysiol. 2015 Aug 21. doi: pp.00636.2015) также разработали набор инструментов CRISPR-Cas9, позволяющий редактировать мультиплексный геном и транскрипционную регуляцию экспрессированных генов, генов с подавленной экспрессией или некодирующих генов в растениях. Этот набор инструментов предоставляет исследователям протокол и реагенты для быстрой и эффективной сборки функциональных конструкций T-ДНК CRISPR-Cas9 для однодольных и двудольных растений с использованием способов клонирования GoldenGate и Gateway. Он предоставляется с полным набором возможных инструментов, включая мультиплексированное редактирование генов и активацию транскрипции или репрессирование эндогенных генов растений, технологию трансформации на основе Т-ДНК, и имеет фундаментальное значение для современной биотехнологии растений, генетики, молекулярной биологии и физиологии. Поэтому, авторы изобретения разработали способ сборки Cas9 (WT, никазы или dCas9) и одной или более гРНК в представляющий интерес конечный Т-ДНК-вектор. Способ сборки основан как на типе сборки GoldenGate, так и на рекомбинации MultiSite Gateway. Для сборки требуются три модуля. Первый модуль представляет собой исходный вектор Cas9, который содержит гены Cas9 без промоторов или производные от него гены, фланкированные сайтами attL1 и attR5. Второй модуль представляет собой вектор записи гРНК, который содержит входную гРНК. Экспрессирующие кассеты фланкированы сайтами attL5 и attL2. Третий модуль включает attR1-attR2-содержащие конечные Т-ДНК-векторы, которые обеспечивают промоторы выбора для экспрессии Cas9. Инструментарий Lowder et al. могут быть применен к системе эффекторного белка C2c2 согласно настоящему изобретению.

[809] Организмы, такие как дрожжи и микроводоросли, широко используются в синтетической биологии. Stovicek et al. (Metab.Eng. Comm., 2015; 2:13) описывают редактирование генома промышленных дрожжей, например Saccharomyces cerevisae, для эффективного создания устойчивых штаммов в целях промышленного производства. Stovicek использовал кодон-оптимизированную систему CRISPR-Cas9 для дрожжей, чтобы одновременно производить как разрыв аллели эндогенного гена, так и нокин гетерологичного гена. Cas9 и гРНК экспрессировали в геномных или эписомальных положениях на векторе 2μ. Авторы также показали, что эффективность разрушения гена может быть улучшена путем оптимизации уровней экспрессии Cas9 и гРНК. Hlavova et al. (Biotechnol, Adv., 2015) описали развитие видов или штаммов микроводорослей с использованием таких способов, как CRISPR, для нацеливания на ядерные и хлоропластные гены в целях инсерционного мутагенеза и скрининга. Те же самые плазмиды и векторы могут быть применены к системам C2c2 по настоящему изобретению.

[810] Petersen ("Towards precisely glycol engineered plants,", Plant Biotech Denmark Annual Meeting 2015, Копенгаген, Дания) разработал способ использования CRISPR/Cas9 для разработки изменений генома в Arabidopsis, например, для глико-преобразования Arabidopsis в целях производства белков и продуктов, имеющих желаемые посттрансляционные модификации. Hebeistrup et al. (FrontPlantSci., 2015, апрель 23, 6:247) излагают принципы подобных изменений для биоинженерии крахмала непосредственно в растениях, создавая культуры, которые экспрессируют ферменты, модифицирующие крахмал, и непосредственно синтезируют продукты, которые обычно производятся промышленными химическими и/или физическими способами обработки крахмалов. Способы, предложенные Petersen и Hebeistrup, могут быть применены и к эффекторной белковой системе C2c2 согласно настоящему изобретению.

[811] Kurthe et al., J Virol. 2012 Jun, 86 (11): 6002-9. Doi: 10.1128/JVI.00436-12. Epub 2012 Mar 21) разработали вектор на основе РНК-вируса для внедрения желаемых признаков в виноградную лозу без наследственных модификаций генома. Вектор обеспечивал способность регулировать экспрессию эндогенных генов путем подавления экспрессии гена при помощи вируса. Системы и белки C2c2 по настоящему изобретению могут использоваться для подавления экспрессии генов и белков без наследуемой модификации генома.

[812] В одном варианте осуществления изобретения растение может быть бобовым. Настоящее изобретение может использовать описанную в настоящем описании систему CRISP-Cas для изучения и модификации, в качестве неограничивающего примера, соевых бобов, гороха и арахиса. Curtin et al. предоставляет набор инструментов для функциональной геномики бобовых. (См. Curtin et al., "A genome engineering toolbox for legume Functional genomics", International Plant and Animal Genome Conference XXII 2014). Curtin использовал генетическую трансформацию CRISPR для нокаута/нокдауна одиночной копии и дублированных генов бобовых как в культуре "волосатых" корней, так и в целых системах растений. Некоторые из генов-мишеней были выбраны для изучения и оптимизации особенностей систем нокаут/нокдаун (например, фитоэндесатуразы), в то время как другие были идентифицированы по гомологии генов сои с Dicer-подобным генами Arabidopsis или с помощью исследований полногеномной ассоциации для нодуляции в Medicago. Системы и белки C2c2 по настоящему изобретению могут быть применены в системах нокаута/нокдауна.

[813] Аллергические реакции на арахис и бобовые обычно являются серьезной проблемой для здоровья. Система на основе эффекторного белка C2c2 согласно настоящему изобретению может быть использована для идентификации, а затем и редактирования или подавления экспрессии генов, кодирующих аллергенные белки таких бобовых. Без ограничений касательно таких генов и белков Nicolaou et al. идентифицировали аллергенные белки в арахисе, соевых бобах, чечевице, горохе, люпине, зеленой фасоли и маше (бобах мунг). См. Nicolaou et al., Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 2011; 11 (3): 222).

[814] В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение может быть деревом. Настоящее изобретение также может использовать описанную в настоящем описании систему CRISPR-Cas для трав (см., например, Belhaj et al., Plant Methods 9: 39 и Harrison et al., Genes&Development, 28: 1859-1872). В особенно предпочтительном варианте осуществления система CRISPR-Cas по настоящему изобретению может быть нацелена на однонуклеотидный полиморфизм (SNP) в деревьях (см., например, Zhou et al., NewPhytologist, Volume 208, Issue 2, pages 298-301, October 2015). Zhou et al. применили систему CRISPR-Cas на древесном многолетнем Populus с использованием семейства генов 4-кумарата:КоА-лигазы (4CL) в качестве примера и достигли 100% мутационной эффективности для двух преобразованных таким образом генов 4CL, при этом каждый трансформированный организм был исследован на предмет переноса двуаллельных модификаций. В исследовании Zhou et al. система CRISPR-Cas9 была очень чувствительна к однонуклеотидным полиморфизмам (SNP), поскольку расщепление третьего гена 4CL устранялось из-за SNP в последовательности-мишени. Эти способы могут быть применены к системе эффекторного белка C2c2 согласно настоящему изобретению.

[815] Способы Zhou et al. (NewPhytologist, Volume 208, Issue 2, pages 298-301, October 2015) можно применить к настоящему изобретению следующим образом. Два гена 4CL, 4CL1 и 4CL2, связанные с биосинтезом лигнина и флавоноидов, соответственно, являются мишенью для редактирования CRISPR-Cas9. Populustremula x alba клон 717-1B4, обычно используемый для трансформации, отличается от генотипа Populus trichocarpa. Таким образом, гРНК 4CL1 и 4CL2, сконструированные на основе эталонного генома, могут быть проанализированы при помощи собственно полученных данных 717 секвенирований РНК, чтобы убедиться в отсутствии SNP, которые могут ограничивать эффективность Cas. Также предусматривается третья гРНК, предназначенная для 4CL5, дубликата 4CL1. Соответствующие 717 последовательностей содержат один SNP в каждом аллеле вблизи/внутри PAM, оба из которых, как ожидается, устраняют нацеливание посредством 4CL5-гРНК. Все три сайта-мишени гРНК расположены в пределах первого экзона. Для 717 трансформаций гРНК экспрессируется с промотора Medicago U6.6 вместе с кодон-оптимизированным Cas человека под контролем промотора CaMV 35S в бинарном векторе. Трансформация только с помощью вектора Cas может служить в качестве контроля. Случайно выбранные линии 4CL1 и 4CL2 подвергаются секвенированию ампликонов. Затем данные обрабатываются, а биаллельные мутации подтверждаются во всех случаях. Эти способы могут быть применены к системе эффекторного белка C2c2 согласно настоящему изобретению.

[816] В растениях патогены часто специфичны по отношению к хозяину. Например, Fusariumoxysporum f. sp. lycopersici поражает только томат, а F. oxysporum f. dianthii Pucciniagraminis f. sp. tritici только пшеницу. Растения имеют естественную и индуцируемую защиту, чтобы противостоять большинству патогенов. Мутации и явления рекомбинации между поколениями растений приводят к генетической изменчивости, которая приводит к восприимчивости к болезням, особенно в том случае, когда патогены воспроизводятся с большей частотой, чем растения. В растениях может наблюдаться "нехозяйская" устойчивость, например, когда хозяин и патоген не совместимы. Также может наблюдаться горизонтальная устойчивость, например, частичная устойчивость к аллелям расы патогенных организмов, обычно контролируемая многими генами, и вертикальная устойчивость, например, полная устойчивость к некоторым расам патогена, но не к другим расам, обычно контролируемым несколькими генами. На уровне отношений "ген против гена" растения и патогены развиваются вместе, происходит извечное нарушение и восстановление баланса: генетические изменения в одном приводят к нарушениям в другом. Соответственно, используя природную вариативность генома, селекционеры объединяют в одном растении наиболее полезные гены для урожайности, качества, однородности, выносливости, сопротивления различным болезням. Источниками генов устойчивости являются местные или иностранные сорта, старые сорта негибридного происхождения, родственники диких растений и сорта с индуцированной мутацией, например, после обработки растительного материала мутагенными агентами. Так, в соответствии с настоящим изобретением селекционерам предлагается новый инструмент стимуляции мутаций. Соответственно, специалист в данной области сможет проанализировать геномы разных сортов - возможных источников резистентных генов, имеющих желаемые характеристики или признаки, и сможет использовать настоящее изобретение, чтобы индуцировать появление генов устойчивости со значительно большей точностью, чем предыдущие мутагенные агенты, что, следовательно, приведет к ускорению и улучшению селекции растений.

[817] Помимо растений, которые обсуждались здесь и выше, модифицированные способами инженерии растения включают также растения, измененные эффекторным белком и соответствующей направляющей молекулой, а также их потомство, если таковое предусмотрено. Они могут включать культуры, устойчивые к болезням или засухе, такие как пшеница, ячмень, рис, соя или кукуруза; растения, модифицированные для полного подавления или уменьшения способности к самоопылению (но которые, по возможности, способны к образованию гибридов); и аллергенные продукты питания, такие как арахис и орехи, где иммуногенные белки были отключены, разрушены или разрушены путем нацеливания через эффекторный белок и подходящую направляющую молекулу.

Терапевтическое лечение

[818] Система по изобретению может быть применена в областях ранее применявшихся технологий производства разрыва РНК без проведения излишних экспериментов. Исходя из настоящего описания, возможные применения включают терапевтические, аналитические и другие прикладные задачи, поскольку настоящая заявка обеспечивает основу для осознанного конструирования способами инженерии системы. Настоящее изобретение относится к терапевтическому лечению заболевания, вызванного сверхэкспрессией РНК, токсичной РНК и/или мутантной РНК (такой как, имеющей дефекты сплайсинга или усечение). Экспрессия токсичной РНК может быть связана с образованием ядерных включений и поздними дегенеративными изменениями в мозге, сердце или скелетной мышце. В наиболее изученном примере болезни Штейнерта или миотонической дистрофии оказывается, что основным патогенным результатом токсической РНК является секвестрирование связываемых белков и нарушение регуляции альтернативного сплайсинга (Hum.Mol. Genet. (2006) 15 (suppl 2): R162-R169). Миотоническая дистрофия [dystrophia myotonica (DM)] интересна генетикам, поскольку она демонстрирует чрезвычайно широкий спектр клинических признаков, неполное перечисление которых может включает мышечное истощение, катаракту, резистентность к инсулину, атрофию яичка, замедление сердечной проводимости, кожные опухоли и влияние на когнитивные функции. Классическая форма DM, которая теперь называется DM 1 типа (DM1), вызвана распространением CTG-повторов в 3'-нетранслируемой области (UTR) DMPK, гена, кодирующего цитозольную протеинкиназу.

[819] В приведенной ниже таблице представлен список экзонов, для которых были показаны нарушения в альтернативном сплайсинге в скелетоной (поперечно-полосатой) мышечной ткани, сердце или головном мозге при болезни первого типа - DM1.

Ткань/ген-мишень Ссылка на литературу

Скелетная (поперечно-полосатая) мышечная ткань

Сердце

Головной мозг

[820] Ферменты по настоящему изобретению могут быть нацелены на сверхэкспрессированную РНК или токсичную РНК, например, такую как РНК гена DMPK или любого неправильно регулируемого альтернативного сплайсинга при заболевании DM1 в скелетной мышце, сердце или головном мозге, которые приведены, например, в таблице выше.

[821] Ферменты по настоящему изобретению также могут быть нацелены на транс-действующие мутации, влияющие на РНК-зависимые функции, которые вызывают заболевание (обобщенно представлены в Cell., 2009, февраль 20, 136 (4): 777-793), как указано в таблице ниже.

Заболевание Ген/мутация Функция Синдром Прадера-Вилли SNORD116 биогенез рибосом Спинальная мышечная атрофия (СМА) SMN2 сплайсинг
Дискератоз врожденный (сцепленный с Х-хромосомой/ аутосомно-рецессивный) DKC1 теломераза/трансляция Дискератоз врожденный (аутосомно-доминантный) TERC теломераза Дискератоз врожденный (аутосомно-доминантный) TERT теломераза Анемия Даймонда-Блэкфэна RPS19, RPS24 биогенез рибосом Синдром Швахмана-Даймонда SBDS биогенез рибосом Синдром Тричера Коллинза TCOF1 биогенез рибосом Рак простаты SNHG5 биогенез рибосом Митоническая дистрофия (тип1) DMPK (приобретение функций РНК) протеин-киназа Митоническая дистрофия (тип2) ZNF9(приобретение функций РНК) РНК-связывание Спиноцеребеллярная атаксия (SCA8) ATXN8/ATXN8OS (РНК-приобретение функции) неизвестные/некодирующие РНК Синдром Гентингтона (HDL2) JPH3 (приобретение функций РНК) функция ионных каналов Синдром FXTAS (тремор/атаксия, ассоциированные с ломкой Х-хромосомой) FMR1 (приобретение функций РНК) трансляция/мРНК локализация Синдром ломкой X-хромосомы FMR1 трансляция/мРНК локализация Синдром фрагильной Х-хромосомы UPF3B трансляция/ Нонсенс-опосредованный распад мРНК Окулофарингеальная мышечная дистрофия (ОФМД) PABPN1 образование 3'-конца Пигментый генодерматоз человека DSRAD редактирование Пигментная дистрофия сетчатки PRPF31 сплайсинг Пигментная дистрофия сетчатки PRPF8 сплайсинг Пигментная дистрофия сетчатки HPRP3 сплайсинг Пигментная дистрофия сетчатки PAP1 сплайсинг Хрящево-волосяная гипоплазия (рейессивная) RMRP сплайсинг Аутизм i 7q22-q33 locus breakpoint некодирующая РНК Синдром Беквита-Видемана H19 некодирующая РНК Наследственная моторно-сенсорная нейропатия GRS трансляция Наследственная моторно-сенсорная нейропатия YRS трансляция Амиотрофический латеральный склероз TARDBP Сплайсинг, транскрипция Лейкоэнцефалопатия с исчезающим белым веществом EIF2B1 трансляция

[822] Фермент по настоящему изобретению также может быть использован для лечения различных таупатий, включая первичные и вторичные таупатии, такие как первичная возрастная таупатия (PART)/старческое слабоумие с преобладанием нейрофибриллярных клубков, нейрофибриллярные клубки (NFT), сходные с таковыми при Болезни Альцгеймера (AD), но без образования бляшек, dementia pugilistica (хроническая травматическая энцефалопатия), прогрессирующий супрануклеарный парез взора, кортикобазальная дегенерация, лобно-височная деменция и паркинсонизм, связанные с хромосомой 17, болезнь Айото-Бодига (комплекс Паркинсона-деменции Гуама), ганглиоглиома и ганглиоцитома, менингиоангиоматоз, постэнцефалитный паркинсонизм, подострый склерозирующий панэнцефалит, а также свинцовая энцефалопатия, туберозный склероз, болезнь Халвервордена-Спатца и липофусциноз, болезнь Альцгеймера. Ферменты по настоящему изобретению также могут быть нацелены на мутации, нарушающие цис-действующий код сплайсинга, вызывают дефекты сплайсинга и заболевание (обзор в Cell, 2009 Feb 20; 136 (4): 777-793). Болезнь двигательного нейрона (SMA) связана с делецией гена SMN1. Оставшийся ген SMN2 имеет C->T-замещение в экзоне 7, которое инактивирует экзонный энхансер сплайсинга (ESE) и создает экзонный сайленсер сплайсера (ESS), что приводит к тому, что экзон 7 пропускается и получается усеченный белок (SMNA7). Замена T-> A в экзоне 31 гена дистрофина одновременно создает кодон преждевременной терминации (STOP) и экзонный сайленсер сплайсинга (ESS), приводящий к пропусканию экзона 31. Эта мутация вызывает умеренную форму DMD, потому что мРНК, лишенная экзона 31, продуцирует частично функциональный белок. Мутации внутри и после экзона 10 гена МАРТ, кодирующего белок tau, влияют на регуляторные элементы сплайсинга и нарушают нормальное соотношение мРНК 1:1, включая или исключая экзон 10. Это приводит к нарушенному равновесию между белками tau, содержащими либо четыре, либо три микротрубочки (4R-tau и 3R-tau соответственно), вызывая невропатологическое расстройство FTDP-17. Приведенный пример представляет собой мутацию N279K, которая усиливает функцию ESE, способствующую включению экзона 10, и смещение баланса в сторону увеличения 4R-tau. Полиморфные (UG)m(U)n тракты в 3'- сайте сплайсинга в экзоне 9 гена CFTR влияют на степень включения экзона 9 и уровень полноразмерного функционального белка, варьируя тяжесть муковисцидоза (CF), вызванного мутациями в другом месте в гене CFTR.

[823] Врожденная иммунная система обнаруживает вирусную инфекцию прежде всего путем распознавания вирусных нуклеиновых кислот внутри инфицированной клетки, обозначаемой ДНК или РНК-чувствительностью. Анализы чувствительности РНК in vitro могут быть использованы для обнаружения специфических субстратов РНК. Нацеленный на РНК эффекторный белок может быть, например, использован для обнаружения РНК в живых клетках. Примером таких применений является диагностика путем выявления специфичных для болезни РНК.

[824] Эффекторный белок, нацеленный на РНК, согласно изобретению может также быть использован для противовирусной активности, в частности против вирусов РНК. Эффекторный белок может быть нацелен вирусную РНК при использовании подходящей направляющей РНК, избирательной для выбранной последовательности вирусной РНК. В частности, эффекторный белок может быть активной нуклеазой, которая расщепляет РНК, например одноцепочечную. Таким образом, предлагается использование нацеленного на РНК эффекторного белка в качестве противовирусного агента согласно изобретению.

[825] Терапевтические дозы ферментной системы согласно настоящему изобретению для нацеливания на вышеописанные типы РНК предполагаются в дозировках, равных от примерно 0,1 до примерно 2 мг/кг, которые могут вводиться последовательно с контролем ответа и при необходимости повторным дозированием до 7-10 доз на пациента. Преимущественно образцы получают от каждого пациента во время проведения лечения для определения эффективности лечения. Например, образцы РНК могут быть выделены и количественно определены, чтобы определить, уменьшена или увеличена экспрессия. Проведение диагностики такого рода находится в компетенции специалистов в данной области.

[826] Что касается наиболее общей информации по системам CRISPR-Cas, то заявители упоминают следующие работы (также включенные в настоящую заявку посредством отсылки)

- Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong, L, Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, PI), Wu, X., Jiang, W., Marraffmi, L.A., & Zhang, F. Science Feb 15; 339(6121):819-23 (2013);

- RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cassystems. Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F, Marraffmi LA. Nat Biotechnol Mar; 31(3):233-9 (2013);

- One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas - Mediated Genome Engineering. Wang H., Yang R, Shivalila CS., Dawlaty MM., Cheng AW., Zhang F., Jaeniseh R. Cell May 9; 153(4); 910-8 (2013);

- Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Konermann S, Brigham AID, Trevino AE, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L, Platt RJ, Scott DA, Church GM, Zhang F. Nature. Aug 22;500(7463):472-6. doi; 10.1038/Naturel2466. Epub 2013 Aug 23 (2013);

- Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Ran, FA., Hsu, PD., Lin, CY., Gootenberg, JS., Konermann, S., Trevino, AE., Scott, DA \, Inoue, A., Matoba, S., Zhang, Y., & Zhang, F. Cell Aug 28, pii: S0092-8674(13)01015-5 (2013-A);

- DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases, Hsu, P., Scott, D, Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X, Shalem, O, Cradick, TJ, Marraffini, LA, Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647 (2013);

- Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Ran, FA, Hsu, PD., Wright J., Agarwala, V, Scott, DA., Zhang, F, Nature Protocols Nov; 8(11):2281-308 (2013-B);

- A Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells, Shalem, Q., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BE., Root, DE, Doench, JG, Zhang, F. Science Dec 12. (2013). [Epub ahead of print];

- Crystal staicture of cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Nishimasu, H., Ran, FA., Hsu, PD., Konermann, S., Shehata, SI, Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F., Nureki, (), Cell Feb 27, 156(5):935-49 (2014);

- Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Wu X., Scott DA., Kriz AJ., Chiu AC., Hsu PD., Dadon DB, Cheng AW., Trevino AE, Konermann S., Chen S., Jaenisch R., Zhang F., Sharp PA. Nat Bioteehnol. Apr 20. doi: 10. lQ38/nbt.2889 (2014);

- CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Platt RJ, Chen S, Zhou Y, Yim MJ, Swiech L, Kempton HR, Dahlman JE, Parnas G, Eisenhaure TM, Jovanovic M, Graham DB, Jhunjhunwala S, Heidenreich M, Xavier RJ, Danger R, Anderson DG, Hacohen N, Regev A, Feng G, Sharp PA, Zhang F. Cell 159(2): 440-455 DOI: 10.1016/j. cell.2014.09.014 (2014);

- Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering, Hsu PD, Lander ES, Zhang F., Cell. Jun 5, 157(6): 1262-78 (2014).

- Genetic screens in human cells using the CRISPR/Cas9 system, Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES., Science. January 3; 343(6166): 80-84. doi: 10.1126/science. 1246981 (2014);

- Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation, Doench JG, Hartenian E, Graham DB, Tothova Z, Hegde M, Smith I, Sullender M, Ebert BL, Xavier RJ, Root DE., (published online 3 September 2014) Nat Bioteehnol. Dec;32(12): 1262-7 (2014);

- In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9, Swiech L, Heidenreich M, Banerjee A, Habib N, Li Y, Trombetta J, Sur M, Zhang F., (published online 19 October 2014) Nat Bioteehnol, Jan, 33(1): 102-6 (2015);

- Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex, Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F., Nature. Jan 29; 517(7536):583-8 (2015).

- A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation, Zetsche B, Volz SE, Zhang F., (published online 02 February 2015) Nat Bioteehnol. Feb; 33(2): 139-42 (2015);

- Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis, Chen S, Sanjana NE, Zheng K, Shalem O, Lee K, Shi X, Scott DA, Song J, Pan JQ, Weissleder R, Lee H, Zhang F, Sharp PA. Cell 160, 1246-1260, March 12, 2015 (multiplex screen in mouse), and

- In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9, Ran FA, Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz AJ, Zetsche B, Shalem Q, Wu X, Makarova KS, Koonin EV, Sharp PA, Zhang F., (published online 01 April 2015), Nature. Apr 9;520(7546): 186-91 (2015).

- Shalem et. al, "High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9," Nature Reviews Genetics 16, 299-311 (May 2015).

- Xu et al., "Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design," Genome Research 25, 1147-1157 (August 2015).

- Parnas et al., "A Genome-wide CRISPR Screen in Primary Immune Cells to Dissect Regulatory Networks," Cell 162, 675-686 (July 30, 2015).

- Ramanan et al., CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis В virus," Scientific Reports 5:10833, doi: 10.1038/srepl0833 (June 2, 2015),

- Nishimasu et al., Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9," Cell 162, 1113-1126 (Aug, 27, 2015),

- BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis, Canver et al., Nature 527(7577): 192-7 (Nov. 12, 2015) doi: 10.1038/naturel5521. Epub 2015 Sep 16.

- Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System, Zetsche et al..Cell 163, 759-71 (Sep 25, 2015),

- Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems.Shmakov et al, Molecular Cell, 60(3), 385-397 doi: 10.1016/j.molcel.2015,10.008 Epub October 22, 2015.

- Rationally engineered Cash nucleases with improved specificity, Slaymaker et al., Science 2016 Jan 1, 351(6268): 84-88 doi: 10.1126/science.aad5227. Epub 2015 Dec 1. [Epub ahead of print],

каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки, может рассматриваться в практике настоящего изобретения и кратко обсуждается ниже:

- Cong et al. разработали системы CRISPR-Cas типа II для использования в эукариотических клетках на основе как Streptococcus thermophilus Cas9, так и Streptococcus pyogenes Cas9 и показали, что нуклеазы Cas9 могут быть направлены короткой РНК, чтобы индуцировать точное расщепление ДНК в клетках человека и мыши. Их исследование также показало, что Cas9, превращенный в создающий однонитевые разрывы фермент, может быть использован для облегчения гомологической репарации в эукариотических клетках с минимальной мутагенной активностью. Кроме того, их исследование показало, что несколько направляющих последовательностей могут быть закодированы в единую последовательность CRISPR, чтобы обеспечить одновременное редактирование нескольких участков на эндогенных геномных локусах в геноме млекопитающих, демонстрируя легкость в программировании и широкую применимость технологии нуклеазы, основанной на РНК. Эта возможность использовать РНК для программирования последовательность-специфичного расщепления ДНК в клетке определила новый класс инструментов для геномной инженерии. Эти исследования также показали, что другие локусы CRISPR, вероятно, могут быть трансплантированы в клетки млекопитающих для опосредования расщепления в целевых участках генома млекопитающих. Важно отметить, что в будущем некоторые аспекты системы CRISPR-Cas могут быть дополнительно улучшены для повышения ее эффективности и универсальности.

- Jiang et al. использовали короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные кластерами (CRISPR), связанные с эндонуклеазой Cas9, объединенные с двойными РНК, для введения точных мутаций в геномы Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli. Этот подход основан на двойной РНК: расщепление, направляемое Cas9, на целевом геномном участке уничтожает немутированные клетки и позволяет обойти необходимость выбора маркеров или систем отрицательного отбора. В исследовании сообщается о перепрограммировании специфики комплекса двойной РНК: Cas9 путем изменения последовательности короткой CRISPRPHK (cr-РНК) для внесения одно- и мультинуклеотидные изменений в матрицы редактирования. Исследование показало, что одновременное использование двух cr-РНК обеспечивало мультиплексный мутагенез. Кроме того, когда подход использовался в сочетании с рекомбинацией, у S. pneumoniae почти 100% клеток, которые были восстановлены с использованием описанного подхода, содержали желаемую мутацию, а в E.coli 65% клеток, которые были восстановлены, содержали мутацию.

- Wang et al., 2013 использовали систему CRISPR/Cas для одношаговой генерации мышей, несущих мутации в нескольких генах, которые традиционно генерировались на нескольких стадиях путем последовательной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках и/или трудоемким скрещиванием мышей с единственная мутация. Система CRISPR/Cas значительно ускорит исследование in vivo функционально избыточных генов и эпистатических генных взаимодействий.

- Konermann et al. (2013) рассмотрели необходимость в универсальных и надежных технологий для оптической и химической модуляции ДНК-связывающих доменов на основе фермента CRISPR Cas9, а также подобных эффекторам активаторов транскрипции (TALE).

- Ran et al. (2013-А) описали подход, в котором объединены никазный мутант Cas9 с парными направляющими РНК для введения целенаправленных двунитевых разрывов. Это касается нуклеазы Cas9 из микробной системы CRISPR-Cas, которая нацелена на конкретные геномные локусы с помощью направляющей последовательности, которая может переносить определенные несоответствия с ДНК-мишенью и тем самым способствовать нежелательному нецелевому мутагенезу. Поскольку отдельные однонитевые разрывы в геноме восстанавливаются с высокой точностью, одновременное внесение однонитевых разрывов с помощью надлежащим образом смещенных направляющих РНК требуется для двухцепочечных разрывов и увеличивает количество специфично распознаваемых оснований для целевого расщепления. Авторы продемонстрировали, что использование парного внесения одноцепочечных разрывов может снизить нецелевую активность в 50-100 раз в клеточных линиях и облегчить нокаут генов у зигот мышей без ущерба для эффективности расщепления мишеней. Эта универсальная стратегия позволяет использовать широкий спектр приложений для редактирования генома, которые требуют высокой специфичности.

- Hsu et al. (2013) охарактеризовали специфичность нацеливания, осуществляемого SpCas9 в клетках человека, чтобы получить данные о выборе целевых сайтов и избегать нецелевого воздействия. В исследовании оценивали> 700 вариантов направляющей РНК и индуцированные SpCas9 уровни инсерции/делеции (indel-мутации)на > 100 предсказанных геномных нецелевых локусов в клетках 293T и 293FT. Авторы показали, что SpCas9 допускают несоответствия между направляющей РНК и ДНК-мишенью в разных положениях зависимым от последовательности образом, чувствительны к числу, положению и распределению несоответствий. Авторы также показали, что SpAas9-опосредованное расщепление не подвержено влиянию метилирования ДНК и что доза SpCas9 и одноцепочечной направляющей РНК (sgRNA) может быть титрована для минимизации нецелевой модификации. Кроме того, для облегчения применения приложений для инженерии генома млекопитающих авторы разработали программного обеспечения для выбора и проверки целевых последовательностей, а также нецелевого анализа.

- Ran et al. (2013-B) описали набор инструментов для Cas9-опосредованного редактирования генома путем негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологичной репарации (HDR) в клетках млекопитающих, а также создания модифицированных клеточных линий для последующих функциональных исследований. Для минимизации нецелевого расщепления, авторы описали стратегию внесения двойных одноцепочечных разрывов, использующую никазный мутант Cas9 с парными направляющими РНК. Протокол, предоставленный авторами, экспериментально выработал руководящие принципы для выбора целевых участков, оценки эффективности расщепления и анализа нецелевой активности. Исследования показали, что, начиная с разработки мишени, модификации генов могут быть достигнуты всего за 1-2 недели, а модифицированные клональные клеточные линии могут быть получены в течение 2-3 недель.

- Shalem et al. описали новый способ исследования функции гена в масштабе всего генома. Их исследования показали, что доставка полногеномной библиотеки нокаутов CRISPR-Cas9 (GeCKO), нацеленной на 18080 генов с 64751 уникальными направляющими последовательностями, позволила провести скрининг c помощью как отрицательного, так и положительного отбора в клетках человека. Во-первых, авторы показали использование библиотеки GeCKO для идентификации генов, необходимых для жизнеспособности клеток при раке и плюрипотентных стволовых клеток. Далее, в модели меланомы авторы провели скрининг для поиска генов, потеря которых связана с резистентностью к вемурафенибу, терапевтическому препарату, который ингибирует мутантную протеинкиназу BRAF. Их исследования показали, что кандидаты высшего ранга включали ранее проверенные гены NF1 и MED12, а также новые: NF2, CUL3, TADA2B и TADA1. Авторы наблюдали высокий уровень согласованности между независимыми направляющими РНК, нацеленными на один и тот же ген, и высоким показателем подтверждения полученного результата, и, таким образом, продемонстрировали возможность скрининга целого генома с помощью Cas9.

- Nishimasu et al. исследовали кристаллической структуре Cas9 Streptococcus pyogenes в комплексе с одноцепочечной направляющей РНК (sg-РНК) и его ДНК-мишени при разрешении 2,5 A°. Обнаружена "двулопастная" архитектура структуры, состоящая из субъединицы для распознавания мишени и нуклеазной субъединицы, вмещающих гетеродуплекс sg-РНК:ДНК в положительно заряженном желобке на их поверхности. В то время как субъединица ("доля") для распознавания необходима для связывания sg-РНК и ДНК, нуклеазная субъединица ("доля") содержит домены HNH и RuvC-нуклеазы, которые должным образом расположены для расщепления комплементарных и не комплементарных цепей ДНК-мишени соответственно. Нуклеазная субъединица также содержит карбоксильный концевой домен, ответственный за взаимодействие с последовательностью, прилегающей к протоспейсеру (PAM). Эта структура с высоким разрешением и сопутствующие функциональные анализы выявили молекулярный механизм РНК-направленного нацеливания на ДНК, осуществляемого Cas9, таким образом прокладывая путь для рационального проектирования новых, универсальных технологий редактирования генома.

- Wu et al. картировали во всем геноме сайты связывания каталитически неактивного Cas9 (dCas9) из Streptococcus pyogenes, нагруженных одноцепочечными направляющими РНК (sg-РНК) в эмбриональных стволовых клетках мыши (mESC). Авторы показали, что каждая из четырех sg-РНК тестировала мишени dCas9 между десятками и тысячами геномных участков, часто характеризующихся 5-нуклеотидной областью-затравкой в sg-РНК и NGG-соседним мотивом, прилегающим к протоспейсеру (PAM). Недоступность хроматина уменьшает связывание dCas9 с другими сайтами с соответствующими "seed"-последовательностями; таким образом, 70% нецелевых сайтов связаны с генами. Авторы показали, что целенаправленное секвенирование 295 сайтов связывания dCas9 в mESC, трансфицированных каталитически активным Cas9, выявило только один сайт, мутированный выше фоновых уровней. Авторы предложили модель с двумя состояниями для связывания и расщепления Cas9, в которой совпадение "seed"-последовательности вызывает связывание, но для расщепления требуется обширное спаривание оснований с ДНК-мишенью.

- Platt et al. создали Cre-зависимую мышь с нокином Cas9. Авторы продемонстрировали как in vivo, так и ex vivo редактирование генома с использованием аденоассоциированного вируса (AAV), лентивируса или опосредованной частицами доставки направляющей РНК в нейроны, иммунные клетки и эндотелиальные клетки.

- Hsu et al. (2014) - обзорная статья, в которой обсуждается история CRISPR-Cas9 от йогурта до редактирования генома, включая генетический скрининг клеток.

- Wang et al. (2014) относится к объединенному способу генетического скрининга, основанному на потере функциональности, подходящему как для положительного, так и для отрицательного отбора, который использует полногеномную лентивирусную библиотеку одноцепочечной направляющей РНК (sg-РНК).

- Doench et al. создали пул одноцепочечных направляющих РНК (sg-РНК), чередуя все возможные целевые сайты группы из шести эндогенных мышиных и трех эндогенных генов человека и количественно оценили их способность продуцировать нулевые аллели их целевого гена путем окрашивания антителом и проточной цитометрии. Авторы показали, что оптимизация PAM улучшила активность, а также предоставила интерактивный инструмент для разработки одноцепочечных направляющих sg-РНК.

- Swiech et al. продемонстрировали, что AAV-опосредованное редактирование генома с помощью SpCas9 может позволить провести ретроспективные генетические исследования функции гена в головном мозге.

- Konermann et al. (2015) обсуждают возможность присоединения нескольких эффекторных доменов, например активаторов транскрипции, функциональных и эпигеномных регуляторов в соответствующих положениях на направляющей молекуле, таких как шпилька или тетрапетля с линкерами и без них.

- Zetsche et al. демонстрируют, что фермент Cas9 можно разделить на два и, следовательно, можно контролировать сборку Cas9 для активации.

- Chen et al. c помощью мультиплексного полногеномного скрининга in vivo посредством CRISPR-Cas9 обнаружили у мышей гены, регулирующие метастазы в легкие.

- Ran et al. (2015) исследовали SaCas9 и его способность редактировать геномы и продемонстрировали, что нельзя экстраполировать биохимические анализы. Shalem et al. (2015) описаны способы использования каталитически неактивные слияния Cas9 (dCas9) для синтетического подавления (CRISPRi) или активации (CRISPRa) экспрессии и продемонстрированы преимущества использования Cas9 для полногеномного скрининга, включая упорядоченный и объединенные скрининг, нокаутные подходы, инактивирующие геномные локусы, и стратегии, модулирующие активность транскрипции.

Окончательные изменения

- Shalem et al. (2015) описали способы использования каталитически неактивные слияния Cas9 (dCas9) для синтетического подавления (CRISPRi) или активации (CRISPRa) экспрессии и продемонстрированы преимущества использования Cas9 для полногеномного скрининга, включая упорядоченный и объединенные скрининг, нокаутные подходы, инактивирующие геномные локусы, и стратегии, модулирующие активность транскрипции.

- Xu et al. (2015) оценили характеристики последовательности ДНК, которые способствуют эффективности одноцепочечной направляющей РНК (sg-РНК) в скрининге на основе CRISPR. Авторы исследовали эффективность нокаута CRISPR/Cas9 и предпочтение нуклеотидов на участке расщепления. Авторы также обнаружили, что предпочтительные последовательности для CRISPR-интерференции/CRISPR-активации (CRISPRi/a) существенно отличаются от таковых для нокаута CRISPR/Cas9.

- Paraas et al. (2015) ввели полногеномные объединенные библиотеки CRISPR-Cas9 в дендритные клетки для идентификации генов, контролирующих индукцию фактора некроза опухолей (Tnf) бактериальным липополисахаридом (LPS). Известные регуляторы сигналинга Tlr4 и ранее неизвестные кандидаты были идентифицированы и классифицированы на три функциональных модуля с явным влиянием на канонические ответы на LPS.

- Ramananetal (2015) продемонстрировали расщепление вирусной эписомальной ДНК (cccDNA) в инфицированных клетках. Геном HBV существует в ядрах инфицированных гепатоцитов в виде двухцепочечных эписомальных ДНК длиной 3,2 т.п.н., которые называются ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (cccDNA), которая является ключевым компонентом жизненного цикла HBV, репликация которого не ингибируется современной терапией. Авторы показали, что одноцепочечные направляющие молекулы РНК (sg-РНК), специально предназначенные для высококонсервативных областей HBV, эффективно подавляют репликацию вируса и обедненную cccDNA.

- Nishimasu et al. (2015) сообщили о кристаллических структурах SaCas9 в комплексе с одной направляющей РНК (sg-РНК) и ее двухцепочечными ДНК-мишенями, содержащими 5'-TTGAAT-3' PAM-последовательность и 5'-TTGGGT-3' PAM-последовательность. Структурное сравнение SaCas9 с SpCas9 выявило как консервативность структуры, так и расхождение, объяснив отчетливую специфичность их PAM и ортологическое распознавание sg-РНК.

- Canver et al. (2015) продемонстрировали функциональное исследование не кодирующих геномных элементов на основе CRISPR-Cas9. Авторы разработали объединенные библиотеки направляющей РНК CRISPR-Cas9 для насыщающего мутагенеза insitu энхансеров BCL11A человека и мыши, которые выявили важные особенности этих энхансеров.

- Zetsche et al. (2015) сообщили о характеристике Cpf1, нуклеазы класса 2 CRISPR из Francisellanovicida U112, имеющей особенности, отличные от Cas9. Cpf1 представляет собой единственную РНК-направляемую эндонуклеазу, не имеющую tracr-РНК, использующую T-богатый мотив, прилегающий к протоспейсеру, и расщепляющую ДНК путем ступенчатого двухцепочечного разрыва.

- Shmakov et al. (2015) сообщили о трех разных классах систем CRISPR-Cas. Два фермента системы CRISPR (C2c1 и C2c3) содержат RuvC-подобные эндонуклеазные домены, отдаленно связанные с Cpf1. В отличие от Cpf1, C2c1 зависит как от cr-РНК, так и от tracr-РНК для расщепления ДНК. Третий фермент (C2c2) содержит два предсказанных РНК-азных домена HEPN и является независимым от tracr-РНК.

- Slaymaker et al. (2016) сообщили об использовании структурной белковой инженерии для улучшения специфичности Cas9 Streptococcus pyogenes (SpCas9). Авторы разработали варианты "расширенной специфичности" SpCas9 (eSpCas9), которые поддерживали устойчивое целевое расщепление с уменьшением нецелевых эффектов.

[827] Кроме того, "Dimeric CRISPR RNA-guided Fok1 nucleases for highly specific genome editing", Shengdar Q. Tsai, Nicolas Wyvekens, CydKhayter, Jennifer A. Foden, Vishal Thapar, Deepak Reyon, Mathew J, Goodwin, Martin J, Aryee, J. Keith Joung Nature Biotechnology 32(6): 569-77 (2014), относится к димерным РНК-направленным Fok1-нуклеазам, которые распознают расширенные последовательности и могут редактировать эндогенные гены с высокой эффективностью в клетках человека.

[828] Что касается общей информации о системах CRISPR-Cas, их компонентах и доставке таких компонентов, включаяс пособы, материалы, транспортные средства доставки, векторы, частицы, AAV, а также их изготовление и использование, в том числе что касается количества и формул, все полезное на практике для настоящего изобретения, приводится в настоящем описании в качестве ссылки на следующие номера патентов США: №8999641, 8993233, 8945839, 8932814, 8906616, 8895308, 8889418, 8889356, 8871445, 8865406, 8795965, 8771945 и 8697359; публикация заявки на патент США US 2014-0310830 (US APP.Ser. No. 14/105031), US 2014-0287938 A1 (US App. Ser. No. 14/213991), US 2014-0273234 A1 (U.S. App, Ser. No. 14/293674), US 2014-0273232 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/290575), US 2014-0273231 (U.S. App. Ser. No. 14/259420), US 2014-0256046 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/226274), US 2014-0248702 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/258458), US 2014-0242700 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/222930), US 2014-0242699 A1 (U.S. App. Ser. No, 14/183512), US 2014-0242664 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/104990), US 2014-0234972 A1 (U.S, App. Ser. No. 14/183471), US 2014-0227787 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/256912), US 2014-0189896 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/105035), US 2014-0186958 (U.S. App. Ser. No. 14/105017), US 2014-0186919 Al (U.S. App. Ser. No. 14/104977), US 2014-0186843 A1 (U.S. App. Ser. No. 14/104900), US 2014-0179770 A1 (US. App. Ser. No. 14/104837) и US 2014-0179006 A1 (US. App. Ser. No. 14/183,486), US 2014-0170753 (US App. Ser. No. 14/183429), US 2015-0184139 (US. App. Ser. No. 14/324960), 14/054414; Европейские патенты: EP 2 764 103 (EP 13824232.6), EP 2 784 162 (EP 14170383.5) и EP 2 771 468 (EP 13818570.7); и публикации патентных заявок PCT: WO 2014/093661 (PCT/US 2013/074743), WO 2014/093694 (PCT/US 2013/074790), WO 2014/093595 (PCT/US 2013/074611), WO 2014/093718 (PCTAJS 2013/074825), WO 2014/093709 (PCT/US 2013/074812), WO 2014/093622 (PCT/US 2013/074667), WO 2014/093635 (PCT/US 2013/074691), WO 2014/093655 (PCT/US 2013/07473 6), WO 2014/093712 (PCT/US 2013/074819), WO 2014/093701 (PCT/US 2013/074800), WO 2014/018423 (PCT/US 2013/051418), WO 2014/204723 (PCT/US 2014/041790), WO 2014/204724 (PCT/US 2014/041800), WO 2014/204725 (PCTAJS 2014/041803), WO 2014/204726 (PCT.AJS 2014/041804), WO 2014/204727 (PCT/US 2014/041806), WO 2014/204728 (PCT/US 2014/041808), WO 2014/204729 (PCT/US 2014/041809), WO 2015/089351 (PCT/US 2014/069897), WO 2015/089354 (PCT/US 2014/069902), WO 2015/089364 (PCT/US 2014/069925), WO 2015/089427 (PCT7US 2014/070068), WO 2015/089462 (PCT/US 2014/070127), WO 2015/089419 (PCT/US 2014/070057), WO 2015/089465 (PCT/US 2014/070135), WO 2015/089486 (PCT/US 2014/070175), PCT/US 2015/051691, PCT/US 2015/051830. Также упоминается предварительная патентная заявка США 61/758468; 61/802174; 61/806375; 61/814263; 61/819803 и 61/828130, поданная 30 января 2013 года; 15 марта 2013 года; 28 марта 2013 года; 20 апреля 2013 года; 6 мая 2013 года и 28 мая 2013 года соответственно. Также упоминается предварительная патентная заявка США 61/836123, поданная 17 июня 2013 года. См. Также дополнительные заявки на патент США 61/835931, 61/835936, 61/836127, 61/836101, 61/836080 и 61/835973, поданные 17 июня 2013 года. Дальнейшая ссылка делается на временные заявки на патент США 61/862468 и 61/862355, поданные 5 августа 2013 года, 61/871301, поданная 28 августа 2013 года, 61/960777, поданную 25 сентября 2013 года и 61/961980, поданную 28 октября 2013 года. Далее делается ссылка на: PCX/US 2014/041803, PCT/US 2014/041809, PCT/US 2014/041804 и PCT/US 2014/041806, каждый из которых подан 10 июня 2014 года; PCT/US 2014/041808, поданную 11 июня 2014 года; и PCT/US 2014/62558, поданную 28 октября 2014 года, и в патенты США №: 61/915148, 61/915150, 61/915153, 61/915203, 61/915251, 61/915301, 61/915267, 61/915260 и 61/915397, поданных 12 декабря 2013 года; 61/757972 и 61/768959, поданные 29 января 2013 года и 25 февраля 2013 года; 61/835936, 61/836127, 61/836101, 61/836080, 61/835973 и 61/835931, поданные 17 июня 2013 года; 62/010888 и 62/010879, поданные 11 июня 2014 года; 62/010329 и 62/010441, поданные 10 июня 2014 года; 61/939228 и 61/939242, каждая из которых была опубликована 12 февраля 2014 года, 61/980012, поданную 15 апреля 2010 года; 62/038358, поданную 17 августа 2014 года; 62/054490, 62/055484, 62/055460 и 62/055487, поданные 25 сентября 2014 года, и 62/069243, поданную 27 октября 2014 года. Ссылка делается на временную заявку США 61/930214, поданную 22 января 2014 года

[829] Упоминается также заявка США 62/180 709, поданная 17 июня 2015 года, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); заявка США 62/091455, поданная 12 декабря 2014 года, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); заявка США 62/096708, поданная 24 декабря 2014 года, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); заявка США 62/091462, поданная 12 декабря 2014 года, DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS; заявка США 62/096324, поданная 23 декабря 2014 года, 62/180681, 17 июня 2015 года, и 62/237496, 5 октября 2015 года, DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS; заявка США 62/091456, 12 декабря 2014 года и 62/180692, 17 июля 2015 года, ESCORTED AND FUNCTIONALIZED GUIDES FOR CRISPR-CAS SYSTEMS, заявка США 62/091461, 12 декабря 2014 года, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING AS TO HEMATOPOETIC STEM CELLS (I ISC's); заявка США 62/094903, 19 декабря 2014 года, UNBIASED IDENTIFICATION OF DOUBLE-STRAND BREAKS AND GENOMIC REARRANGEMENT BY GENOME-WISE INSERT CAPTURE SEQUENCING; заявка США 62/096761, 24 декабря 2014 года, ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED ENZYME AND GUIDE FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; заявка США 62/087475, 4 декабря 2014 года, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; заявка США 62/055487, 25 сентября 2014 года, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; заявка США 62/087546, 4 декабря 2014 года, и 62/181687, MULTIFUNCTIONAL CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYIFUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; и заявка США 62/098285, 30 декабря 2014 года, CRISPR MEDIATED IN VIVO MODELING AND GENETIC SCREENING OF TUMOR GROWTH AND METASTASIS.

[830] Упоминаются следующие заявки США 62/181659, 18 июня 2015 года, и 62/207318, 19 августа 2015 года, ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS, ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS OF CAS9 ORTHOLOGS AND VARIANTS FOR SEQUENCE MANIPULATION. Упоминаются заявки США 62/181675, 18 июня 2015 года и номер патентного реестра - 46783.01.2128, поданные 22 октября 2015 года, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS, заявка США 62/232067, 24 сентября 2015 года, заявка США 62/205733, 16 августа 2015 года, заявка США 62/201542, 5 августа 2015 года, заявка США 62/193507, 16 июля 2015 года, и заявка США 62/181739, 18 июня 2015 года, каждая из которых озаглавлена NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS, а также в заявке США 62/245270, 22 октября 2015 года, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS. Также упоминается заявка США 61/939256, 12 февраля 2014 года, и WO 2015/089473 (PCT/US 2014/070152), 12 декабря 2014 года, каждая из которых озаглавлена ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED GUIDE COMPOSITIONS WITH NEW ARCHITECTURES FOR SEQUENCE MANIPULATION. Также упоминаются PCT.AJS 2015/045504, 15 августа 2015 года, заявка США 62/180699, 17 июня 2015 года, и заявка США 62/038358, 17 августа 2014, каждая из которых озаглавлена GENOME EDITING USING CAS9 NICKASES.

[831] Каждый из этих патентов, патентных публикаций и заявлений и всех документов, цитируемых в нем или во время их делопроизводства ("приложенные к делу документы"), и всех документов, цитируемых или упоминаемых в приведенных в данном приложении документах, вместе с любыми инструкциями, описаниями, спецификациями и технологическими картами продуктов для любых продуктов, упомянутых в нем или в любом документе и включенных в настоящее описание посредством ссылки, включены в настоящее описание в качестве ссылки и могут быть использованы в практике изобретения. Все документы (например, эти патенты, патентные публикации и заявки и приведенные в приложении документы) включены сюда путем отсылки так же как если бы каждый отдельный документ был специально и индивидуально указан для включения в качестве отсылки.

[832] Кроме того, упоминается заявка PCT PCT/US 14/70057, номер патентного реестра 47627.99.2060 и BI-2013/107, озаглавленная "DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS" (притязающая на приоритет по одной или более или всех предварительных заявок на патент США: 62/054490, поданная 24 сентября 2014 года, 62/010441, поданная 10 июня 2014 года, и 61/915118, 61/915215 и 61/915148, каждая из которых подана 12 декабря 2013 года) ("PCT для доставки частиц"), включенной в настоящее описание в качестве отсылки, в отношении способа получения sg-РНК и,tkrf Cas9, включающего смешивание смеси, содержащей sg-РНК и белок Cas9 (и необязательно матрицу HDR) со смесью, содержащей или состоящей только из или состоящей из поверхностно-активного вещества, фосфолипида, биоразлагаемого полимера, липопротеина и спирта; и частицы из такого процесса. Например, когда белок Cas9 и sg-РНК смешивали вместе при подходящем молярном соотношении, например, от 3:1 до 1:3 или от 2:1 до 1:2 или 1:1 при подходящей температуре, например 15-30°С, например, 20-25°C, например, комнатной температуре, в течение подходящего времени, например 15-45, например 30 минут, преимущественно в стерильном, свободном от нуклеазы буфере, например IX PBS. Отдельно компоненты частиц, такие как или содержащие: поверхностно-активное вещество, например, катионный липид, например, 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP); фосфолипид, например димиристоилфосфатидилхолин (DMPC); биодеградируемый полимер, такой как полимер этиленгликоля или ПЭГ, или липопротеин, такой как липопротеин низкой плотности, например холестерин, были растворены в спирте, преимущественно C_1-6-алкиловом спирте, таком как метанол, этанол, изопропанол, например 100% этанол. Оба раствора смешивали вместе до образования частиц, содержащих комплексы Cas9-sg-РНК. Соответственно, sg-РНК может быть предварительно скомбинирована с белком Cas9 перед формированием всего комплекса в частице. Препараты могут быть получены с другим молярным соотношением различных компонентов, которые, как известно, способствуют доставке нуклеиновых кислот в клетки (например, 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP), 1,2-дитретраканоил-s-глицеро-3-фосфохолин (DMPC), полиэтиленгликоль (ПЭГ) и холестерин). Например, молярные соотношения DOTAP: DMPC: ПЭГ: холестерина могут быть DOTAP 100, DMPC 0, ПЭГ 0, холестерин 0; или DOTAP 90, DMPC 0, ПЭГ 10, холестерин 0; или DOTAP 90, DMPC 0, ПЭГ 5, холестерин 5. DOTAP 100, DMPC 0, ПЭГ 0, холестерин 0. Настоящее описание соответственно охватывает смешение sg-РНК, белка Cas9 и компонентов, которые образуют частицу; а также частиц от такого смешивания. Варианты настоящего изобретения могут включать частицы; например, частицы, используемые в способе, аналогичном способу PCT доставки частиц, например, путем смешивания смеси, содержащей sg-РНК и/или Cas9, как в настоящем изобретении, и компонентов, которые образуют частицу, например, как в для PCT доставки частиц, образуют частицу и частицы из такой смеси (или, конечно, другие частицы, содержащие sg-РНК и/или Cas9, как в настоящем изобретении).

[833] Данное изобретение будет дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах, которые приведены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения изобретения каким-либо образом.

Пример 1: Происхождение и эволюция систем адаптивного иммунитета

[834] Классификация и аннотация систем CRISPR-Cas в геномах архей и бактерий. Локусы CRISPR-Cas имеют более чем 50 семейств генов, при этом не существует строго универсальных генов, происходит быстрая эволюция и наблюдается значительное разнообразие архитектуры локусов. Поэтому не существует возможного древа и комплексный подход особенно необходим. Сейчас существует подробная идентификация cas-генов в рамках 395 профилей для 93 cas белков. Классификация включает профили экспрессии генов и профили архитектуры локусов

[835] Последняя классификация систем CRISPR-Cas представлена на фиг. 1. Класс l включает мультисубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cascade), а класс 2 включает односубъединичные эффекторные комплексы cr-РНК (Cas-9 типа). Фиг. 2 представляет молекулярную организацию CRISPR-Cas. Фиг. 3 демонстрирует структуры эффекторных комплексов I и III типов: они имеют общую структуру/ общую природу несмотря на значительные различия в последовательностях. Фиг. 4 показывает CRISPR-Cas как систему, основанную на мотивах узнавания РНК (RRM). На фиг. 5 представлена филогения cas1, где рекомбинация адаптационного и cr-РНК эффекторого модулей показывают основной аспект эволюции систем CRISPR-Cas. На фиг. 6 представлен перечень систем CRISPR-Cas, в особенности распределение типов и подтипов CRISPR-Cas среди архей и бактерий.

[836] Белок Cas1 не всегда связан только с системами CRISPR-Cas, поэтому возможно, что существуют две ветви отдельных "соло" Cas 1, что говорит о том, что возможны различия как в функционировании, так и в происхождении, а также возможно обнаружение новых мобильных элементов (см. Makarova, Krupovic, Koonin, Frontiers Genet 2014). Геномная организация трех семейств казпозонов может предоставить возможные ответы. Вдобавок к cas 1 и PolB, казпозоны имеют различные гены включая нуклеазы (Krupovic et al. BMC Biology 2014). Одно семейство имеет праймированную белком полимеразу, другое семейство имеет РНК-праймированную полимеразу. В добавок к представителям типов Euryarchaeota и Thaumarchaeota, казпозоны, обнаруженные в нескольких бактериях предполагают горизонтальный перенос генов. Казпозон Cas1 (транспозаза/интеграза) предполагает наличие общей базальной филогенетической группы в развитии Cas1.

[837] Бактерии и археи используют CRISPR - систему для адаптивной иммунной защиты в клетках про- и эукариот посредством геномной манипуляции. Белок cas 1 представляет собой уже существующий способ геномной манипуляции. Существуют похожие механизмы интеграции в каспозоны и CRISPR, в особенности репликационно-заваисимое приобретение посредством процессов копирования и вставки, а не вырезания и вставки (Krupovic et al. BMC Biology 2014). Cas1 - есть эталонный образец интегразы (Nunez JK, Lee AS, Engelman A, Doudna JA. Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity. Nature. 2015 Feb 18). Есть определенное сходство между терминальными обратными повторами каспозонов и врожденным локусом иммунитета (Koonin, Kmpovic, Nature Rev Genet, 2015). Эволюция систем адаптивного иммунитета в прокариотах и животных возможно шла параллельными путями при помощи интеграции транспозонов в локусы врожденного иммунитета (Koonin, Krupovic, Nature Rev Genet, 2015). Транспозаза RAG1 (ключевой энзим V(D)J-рекомбинации позвоночных) возможно произошел из транспозонов класса Transib (Kapitonov VV, Jurka J.. RAG1 core and V(D)J recombination signal sequences were derived from Transib transposons.. PLoS Biol. 2005 Jun; 3(6):el81), однако ни один из транспозонов класса Transibs не кодирует белок RAG2. RAG1 и RAG2 кодирующие транспозоны описаны в Kapitonov, Koonin, Biol Direct 2015 и филогения транспозазы класса Transib представлена в Kapitonov, Koonin, Biol Direct 2015. Защитное уничтожение ДНК в инфузориях эволюционировало из транспозона PiggyMAc, что вместе с РНК-i образуют врожденный иммунитет (Swart EC, Nowacki M. The eukaryotic way to defend and edit genomes by sRNA-targeted DNA deletion. Ann N Y Acad Sci. 2015).

[838] Относительная стабильность классификации означает, что наиболее часто встречающиеся варианты CRISPR-Cas уже известны. Однако существование редких и до сих пор не включенных в классификацию вариантов также говорит о том, что дополнительные типы и подтипы все ждут своего описания (Makarova et al, 2015. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems and cas genes).

[839] Транспозоны играют ключевую роль в эволюции адаптивного иммунитета и других систем, участвующих в изменении ДНК. Класс 1 CRISPR-Cas возник из транспозонов, однако это касается только адаптационного функционального модуля системы. Класс 2 CRISPR-Cas имеет и адаптационную и эффекторную функции, модули которых могут происходить из разных транспозонов.

Пример 2: Новые предсказанные системы CRISPR-Cas класса 2 и доказательства их независимого происхождения из транспозонов

[840] Системы CRISPR-Cas адаптивного иммунитета бактерий и архей демонстрируют огромное разнообразие состава Cas белков, а также разновидной структурой геномных локусов. Однако эти системы разделяются в целом на два класса: Класс 1 (Class 1), имеющий мульти-протеиновый (многоблоковый) эффекторный комплекс и Класс 2 (Class 2), где эффекторный комплекс состоит из одного большого белка (одноблоковый комплекс), например белка cas-9 (фиг. 1А и 1В). Заявители разработали простую биоинформатическую методику (фиг. 7) для обработки все время пополняемых геномных и метагеномных баз данных, сопровождающихся углублением понимания систем CRISPR-cas для поиска возможных кандидатов для системы CRISPR-Cas класса 2. Анализ базы данных полных (полностью отсеквенированных) геномов при помощи разработанной нами вычислительной методики привело к индентефикации трех новых вариантов, каждый из которых представлен в различных бактериях и имеет в своем составе гены cas1 и cas2, а также третий ген, кодирующий большой белок, который как предполагается функционирует как эффекторный модуль.

В первом из этих локусов, возможный эффекторный белок (C2c1p) имеет похожий на RuvC науклеазный домен и напоминает ранее описанный белок Cpf1, предсказанный эффектор для типа V CRISPR -cas систем, соответственно новая предсказанная система классифицируется как подтип V-B. Всестороннее сравнение белковых последовательностей показало, что эффекторные белки Cas9 Cpf1 и C2Cip, содержащие домен RuvC, возникли из различных групп кодируемых транспозонами TnpB-белков. Вторая группа новых кандидатов для локусов CRISPR-Cas включает большой белок, содержащий два HEPN домена с предсказанной РНК-азной активностью. Учитывая новизну предсказанного эффекторного белка, эти локусы были причислены к новому VI типу CRISPR-Cas, который наиболее вероятно способен к нацеливанию на РНК. В целом, результаты анализа показывают, что системы CRISPR-Cas класса 2 возникли различными, часто не зависимыми друг от друга путями, путем соединения различных кодирующих Cas1-Cas2 адаптационных модулей с эффекторными белками, образованными от различных мобильных генетических элементов. Путь эволюции с наибольшей вероятностью привел к появлению различных вариантов систем класса 2, некоторые из которых еще не открыты.

[840] Системы адаптивного иммунитета CRISPR-Cas присутствуют в геномах 45% бактерий и 90% архей и они демонстрируют значительное разнообразие в составе cas белков, их последовательности, а также архитектуры геномных локусов. Согласно архитектуре эффекторных комплексов cr-РНК, эти системы подразделяются на два класса: Класс 1 имеет мультисубъединичный эффекторный комплекс, а Класс 2 - единственный эффекторный белок (фиг. 1A и 1B). Системы класса 1 встречаются намного чаще и более разнообразны, чем системы класса 2. В настоящей классификации Класс 1 представлен 12-ю отдельными подтипами, кодируемыми многочисленным геномами бактерий и архей, а то время как класс 2 включает 3 подтипа система 2 типа и возможный V тип, который в целом можно обнаружить в 10% отсеквенированных бактериальных геномах (вместе с единственным геномом архей включающим возможную систему данного типа). Системы класса 2 обычно содержат только три или четыре гена в опероне cas, а именно пару генов cas1 ~cas2, которые участвуют в адаптации, но не в интерференции, один многодоменный эффекторный белок, который отвечает за интерференцию, но также способствует процессингу и адаптации пре-cr-РНК. Также часто имеется и четвертый ген с еще неизвестными функциями, которые могут встречаться, по меньшей мере, в некоторых системах II типа. В большинстве случаев CRISPR кассета и ген для определенного типа РНК, известного как tracr-РНК (трансактивирующая небольшая cr-РНК), находятся рядом с оперонами класса 2 (Chylinski, 2014). Tracr-РНК частично гомологична повторам в соответствующей области CRISPR кассеты и имеет важное значение для процессинга пре-cr-РНК, которая катализируется RNAse III, распространенным ферментом бактерий, не связанным с локусами CRISPR-cas (Deltcheva, 2011)(Chylinski, 20I4;Chylinski, 2013).

[842] Эффекторный белок второго типа систем CRISPR-Cas - Cas9 был изучен в мельчайших подробностях в отношении его функций и структуры. В различных бактериях, белки Cas9 включают от ~950 до более чем 1600 аминокислот, а размер варьируются от 950 до 1400 аминокислот. Он содержит два типа нуклеазных доменов, а именно RuvC подобный домен (РНК-аза H консервативный домен) и HNH (MrcA подобный консервативный домен) домен (Makarova, 2011). Кристаллическая структура cas9 показывает "двулопастную" организацию белка с явно выраженным участком узнавания и нуклеазной активности, при этом последний связывается и с RuvC и с HNH доменами (Nishimasu, 2014)(Jinek, 2014). Каждый из нуклеазных доменов Cas9 необходим для разрезания одной из цепочек ДНК-мишени (Jinek, 2012; Sapranauskas, 2011). Недавно было показано что Cas9 участвует во всех трех стадиях CRISPR иммунного ответа, то есть не только приводит к расщеплению ДНК-мишени (стадия интерференции) но также участвует в стадиях адаптации и процессинга пре-cr-РНК (Jinek, 2012). Более конкретно было показано, что определенный домен в участке, обладающем науклеазной активностью узнает и связывается с последовательностью, прилегающей к протоспейсеру (PAM) в вирусной ДНК на стадии адаптации (Nishimasu, 2014)(Jinek, 2014)(Heler, 2015; Wei, 2015). На стадии иммунного ответа CRISPR, Cas9 формирует комплекс с белками Cas l и Cas2, которые непосредственно участвуют в встраивании новых спейсеров во всех системах CRISPR-Cas (Heier, 2015; Wei, 2015).

[843] Белок Cas9, соединенный с tracr-РНК недавно стал ключевым инструментом в создании нового поколения способов редактирования геномов и генной инженерии (Gasiunas, 2013; Mali, 2013; Sampson, 2014; Cong, 2015). Такая ценность Cas9 в генной инженерии основывается на том, что во втором типе CRISPR-Cas в отличие от других систем CRISPR-Cas все операции необходимые для узнавания ДНК-мишени и ее последующего расщепления сосредоточены в рамках одного, но большого мультидоменного белка. Эта особенность систем II типа значительно упрощает разработку эффективных инструментов манипуляции генома. Важно и то, что не все варианты cas9 похожи. На сегодняшний момент большая часть работы по искомому белку была выполнена на cas9 из Streptococcus pyogenes но и другие виды могут предложить существенные преимущества. Что касается рассматриваемого случая последние эксперименты с cas9, который на 300 аминокислот короче чем S. pyogenes позволили упаковать в адено-ассоциированный вирусный вектор, что привело к существенному улучшению возможностей использования системы CRISPR- Cas для редактирования генома in vivo (Ran, 2015).

[844] Системы CRISPR-Cas второго типа в настоящее время подразделяются на три подтипа ((II-A, II-B и II-C) (Makarova, 2011) (Fonfara, 2014; Chylinski, 2013; Chylinski, 2014). Помимо генов cas1, cas2 и cas9, которые характерны для всех локусов II типа, подтип II-A характеризуется дополнительным геном, csn2, который кодирует инактивированную АТФазу (Nam, 2011, Koo, 2012, Lee, 2012), роль которой в приобретении новых спейсеров еще изучена слабо (Barrangou, 2007; Arslan, 2013) (Heler, 2015). В системах подтипа II-B отсутствует csn2, но вместо этого содержится ген cas4, который наоборот более типичен для систем типа I и кодирует 5'-3' экзонуклеазу семейства recB, которая способствует накоплению спейсеров путем генерации рекомбиногенных концов ДНК (Zhang, 2012) (Lemak, 2013, Lemak, 2014). Гены cas1 и cas2 подтипа II-B наиболее тесно связаны с соответствующими белками систем I типа CRISPR-Cas, что подразумевает рекомбинантное происхождение этого подтипа (Chylinski, 2014).

[845] Подтип II-C систем CRISPR-Cas демонстрирует минимальное разнообразие и состоит только из генов casl, cas2 и cas9 (Chylinski, 2013; Koonin, 2013; Chylinski, 2014). Примечательно, однако, что в приобретении спейсера Campylobacter jejuni системами типа II-C требуется участие Cas4, кодируемого бактериофагом (Hooton, 2014). Другой отличительной особенностью подтипа II-C является образование некоторых cr-РНК посредством транскрипции, включая транскрипцию из внутренних альтернативных промоторов, что отличается от процессинга, наблюдаемого во всех других описанных экспериментально системах CRISPR-Cas (Zhang, 2013).

[846] Существование типа V систем CRISPR-Cas было недавно предсказано путем сравнительного анализа бактериальных геномов. Эти предполагаемые новые системы CRISPR-Cas представлены в нескольких бактериальных геномах, в частности, из рода Francisella и одной археи Methanomethylophilus alvus (Vestergaard, 2014). Все предполагаемые локусы типа V включают casl, cas2, отдельный ген, обозначенный как cpf1, и CRISPR кассету (Schunder, 20I3) (Макарова, 2015). Cpf1 представляет собой большой белок (приблизительно 1300 аминокислот), который содержит RuvC-подобный нуклеазный домен, гомологичный соответствующему домену Cas9, а также аналог типичного богатого аргинином кластера Cas9. Однако Cpf1 не обладает нуклеазным доменом HNH, который присутствует во всех белках Cas9, и RuvC-подобный домен является прилегает к последовательности Cpf1, в отличие от Cas9, где он содержит длинные вставки, включая домен HNH (Chylinski, 2014; Makarova, 2015). Эти основные отличия в доменных архитектурах Cas9 и Cpf1 предполагают, что системы содержащие Cpf1, следует классифицировать как новый тип. Состав предполагаемых систем типа V подразумевает, что Cpf1 представляет собой одноблоковый эффекторный комплекс, и, соответственно, эти системы относятся ко второму классу систем CRISPR-Cas. Некоторые из предполагаемых локусов типа V кодируют Cas4 и соответственно напоминают подтипы П-В локусов, тогда как другие не имеют Cas4 и, следовательно, аналогичны подтипу II-C.

[847] Недавно было показано, что самыми близкими гомологами белков Cas9 и Cpf1 являются белки TnpB, которые кодируются транспозонами семейства IS605 и содержат RuvC-подобный нуклеазный домен, а также домен цинкового пальца, который имеет аналог в Cpf1. Кроме того, были идентифицированы гомологи TnpB, которые содержат домен HNH, вставленный в RuvC-подобный домен и показывающий высокое сходство последовательностей с Cas9. Роль TnpB в транспозонах остается неопределенной, поскольку было показано, что этот белок не требуется для транспозиции.

[848] Учитывая гомологию Cas9 и Cpf1 и белков, кодируемых транспозонами, заявители предположили, что системы CRISPR-Cas класса 2 могут возникать многократно в результате рекомбинации между транспозоном и локусом casl-cas2. Соответственно, заявители разработали простую вычислительную стратегию для идентификации геномных локусов, которые могут быть кандидатами для вариантов второго класса. Настоящей заявкой Заявители описывают первое применение этого подхода, в результате которого идентифицируются три группы таких кандидатов, два из которых кажутся принадлежащими к различным подтипам типа V, тогда как третий, по-видимому, подходит к VI типу. Новые варианты систем CRISPR-Cas класса 2 представляют очевидный интерес так как могут быть использованы в качестве инструментов для редактирования и регуляции экспрессии.

[849]Стратегия поиска по базам данных для обнаружения новых кандидатов для CRISPR-Cas локуса класса 2. Заявители использовали простой биоинформатический подход для обнаружения новых претендентов для систем CRISPR-Cas класса 2 (фиг. 7. схема). Поскольку подавляющее большинство локусов CRISPR-Cas включает ген cas1 (Makarova, 2011, Makarova, 2015) а последовательность Cas1 является наиболее консервативной для всех белков Cas (Takeuchi, 2012), Заявители предположили, что cas1 является лучшей из возможных зацепок для определения и поиска возможных новых локусов при помощи PSI-BLAST. После обнаружения всех контигов, кодирующих Casl, путем поиска следующих баз данных WGS (содержащий весь геном) и NT (нуклеотидных) в NCBI, кодирующие белок гены были предсказаны с использованием GenemarkS в районе 20 т.п.н. вышележащих и нижележащих последовательностей от гена casl. Эти предсказанные гены были аннотированы с использованием профилей по базе данных NCBI Conserved Domain Database (CDD) и специфических Cas-белковых профилей (Makarova et al., 2015, Nat Rev Microbiol. 2015, doi: 10.1038/nrmiero3569), а CRISPR кассеты были предсказаны с использованием программы PILER- CR. Эта процедура дала возможность определения обнаруженных локусов CRISPR-Cas в рамках уже известных подтипов. Частичные и/или не поддающиеся классификации возможные локусы CRISPR-Cas, содержащие большие (> 500 ак) белки, были выбраны в качестве возможных кандидатов для новых систем класса 2 основываясь на характерном присутствии таких больших одноблоковых эффекторных белков в системах типов II и V (Cas9 и Cpf1, соответственно). Все 63 возможных локуса, обнаруженные с использованием этих критериев (перечислены в таблице, представленной на фиг. 40A-D), анализировались далее каждый в отдельности с использованием программ PSI-BLAST и HHpred. Последовательности белка, кодированные в локусах-кандидатах, далее использовались в качестве запроса для поиска метагеномных баз данных для дополнительных гомологов, при этом обнаруженные длинные контиги анализировались, как указано выше. В этом вычислительном конвейере было получено в общей сложности 53 новых локуса (некоторые из первоначально идентифицированных 63 локусов-кандидатов были отброшены как ложные, в то время как несколько неполных локусов с отсутствующим cas1 были добавлены) с характерными особенностями CRISPR-Cas, систем класса 2 которые, основываясь на природе предсказанных эффекторных белков, могли бы быть классифицированы на три группы локусов (см. Фиг. 8А и 8В, фиг. 9, 14 и 15 и фиг. 41А-В, 42А-В и 43А-В) Хотя и бактериофаги, заражающие бактерии, которые могли бы иметь недавно открытые системы CRISPR-Cas класса 2, на практике неизвестны, для каждой из этих систем авторы изобретения обнаружили спейсеры, которые соответствуют фагам или предсказанным профагам.

[850] Используя вышеописанную вычислительную стратегию, Заявители обнаружили три новые системы CRISPR-Cas класса 2, а именно C2e1 и C2c3, которые классифицируются как подтипы ранее описанного предполагаемого типа V и C2c2, который Заявители приписывают новому предполагаемому VI типу. Заявители представляют несколько стратегий доказательства того, что эти локусы кодируют функциональные системы CRISPR-Cas. Основываясь на сравнении геномов, авторы изобретения определили фаго-специфические спейсеры для каждой из трех предполагаемых новых систем, а также показали, что наборы спейсеров полностью различаются даже в близкородственных бактериальных геномах, что указывает на активный, функционирующий иммунитет. Многие из этих новых систем встречаются в бактериальных геномах, которые не содержат других локусов CRISPR-Cas, что говорит о том, что системы типа V и типа VI могут функционировать автономно. Более того, даже когда другие системы CRISPR-Cas были идентифицированы в одних и тех же геномах, ассоциированные повторяющиеся структуры были явно отличны от других типов в типах V и VI, что свидетельствует об их независимой функциональности.

[851] Предполагаемая система типа V-B. Первая группа возможных локусов, условно обозначенная как C2c1 (класс 2, кандидат 1), представлена в бактериальных геномах четырех основных таксонов, включая Bacilli, Verrucomicrobia, альфа-протеобактерии и дельта-протеобактерии (фиг. 8A-B "Организация полных локусов систем класса 2" фиг. 41А-В). Все локусы C2c1 кодируют слитый белок Cas1-Cas4, Cas2 и большой белок, обозначаемый Заявителями как C2c1p и, как правило, находятся рядом с CRISPR кассетой (фиг. 9, окрестности C2c1, фиг. 41A-B). В филогенетическом дереве Cas1, соответствующий белковый кластер соединяется с системой типа I-U (фиг. 10A и 10B, фиг. 10C-W, дерево Cas1) и является единственным, в котором обнаружено слияние Cas1-Cas4. Длина белков C2c1p, идентифицированных здесь, варьируется 1100 до 1500 аминокислот, например, может состоять примерно из 1200 аминокислот. HHpred поиск обнаруживает значительное сходство между С-концевой частью белков C2c1p и подмножеством белков TnpB закодированных в транспозонах семейства IS6G5 (фиг. 13А и 13С). Напротив, не было обнаружено никакого существенного сходства между C2c1p и Cas9 или Cpf1, которые аналогичны другим группам белков TnpB (Chylinski, 2014) (Makarova, 2015; Makarova, 2015).

Таким образом, доменная архитектура C2c1p аналогична домену Cpf1 и отличается от архитектуры Cas9 (фиг. 13A), хотя все три белка Cas, по-видимому, эволюционировали из семейства TnpB (фиг. 11 "Организация домена семейств 2-го класса"; фиг. 13А). N-концевая область C2c1p не имеет существенного сходства с другими белками. Прогнозирование вторичной структуры указывает на то, что этот регион принимает преимущественно альфа-спиральную конформацию. Два сегмента сходства с TnpB охватывают три каталитических мотива типа нуклеазы, подобной RuvC, с диагностической сигнатурой D..E..D каталитических аминокислотных остатков (Aravind et al, 2000, Nucleic Acids Res, том 28, 3417-3432) (фиг. 12, "Области гомологии TnpB в белках класса 2"); область, соответствующая мостиковой спирали (также известная как богатый аргинином кластер), который в белке Cas9 участвует в связывании cr-РНК; и небольшую область, которая, по-видимому, является аналогом цинкового пальца TnpB (однако в большинстве белков C2c1 отсутствуют Zn-связывающие цистеиновые остатки, что указывает на то, что такие белки не связывают цинк, более того, C2c1 содержит множественные вставки и делеции в этой области, что указывает на функциональную дивергенцию (фиг. 13А, фиг. 13D-H, фиг. 131). Сохранение каталитических остатков (фиг. 13А) явно указывает на то, что гомологичные домены RuvC всех этих белков являются активными нуклеазами. N-концевые области C2c1 не показывают значительного сходства с любыми известными белками. Предсказание вторичной структуры показывают, что N-концевые области белков C2c1 принимают смешанную α/β-конформацию (фиг. 13D-H, фиг. 1 131). Сходство доменных архитектур C2c1p и Cpf1 предполагает, что локусы C2c1 лучше всего классифицировать как подтип VB, при этом локусы кодирующие Cpf1 - как подтип VA.

[852] Несмотря на то, что гены cas1, связанные с этой системой, очень похожи, повторы CRISPR в соответствующих кассетах являются сильно гетерогенными, хотя все они имеют длину 36-37 п. н. и могут быть классифицированы как неструктурированные (энергия фолдинга AG составляет -0,5-4,5 ккал/моль, тогда как высоко палиндромная CRISPR имеют АГ ниже -7 ккал/моль). Согласно схеме CRISPR (Lange, 2013) несколько повторов V-B подтипа имеют некоторую последовательность или структурное сходство с повторами II типа (фиг. 41А-Т). Однако большинство повторов нельзя было отнести к известным семействам последовательностей или структур они могут быть отнесены к четырем из 6 суперклассов.

[853] Рассматривая возможность того, что предположительные CRISPR-Cas подтипа V-B структурно аналогичны системам II типа, Заявители предприняли попытку идентифицировать tracr-РНК в соответствующих геномных локусах.

[854] Сравнение спейсеров CRISPR кассет типа V-B с небезызбыточной базой данных нуклеотидных последовательностей привело к обнаружению нескольких совпадений с различными бактериальными геномами. В частности, один из спейсеров из Alicyclobacillus acidoterrestris и один из спейсеров от Brevibacillus agri соответствовали неопределенным генам в пределах прогнозируемых профагов, интегрированных в соответствующие бактериальные геномы (фиг. 41А-L).

[855] Предполагаемые системы типа VI. Вторая группа потенциальных локусов CRISPR-Cas, обозначенная как C2c2 (класса 2, кандидат 2), была обнаружена в геномах 5 основных бактериальных таксонов, включая альфа-протеобактерии, бациллы, клостридии, фузобактерии и бактероиды (фиг. 8А-В. "Организация полных локусов систем 2 класса" на фиг. 42А-В). Определенное число локусов C2c2 включают cas1 и cas2 гены, а также большой белок (C2c2p), который не демонстрирует сходства последовательностей с C2c1, Cpf1 или Cas9 и CRISPR кассетой; однако, в отличие от C2c1, C2c2p часто кодируется рядом с CRISPR кассетой, но не casl-cas2 (фиг. 15, окрестности C2c2, фиг. 42A-B). Хотя в вычислительной стратегии авторов изобретения изначально идентифицированные локусы C2c2 охватывали гены cas1 и cas2, последующие поиски показали, что большинство таких локусов может состоять только из гена c2c2 и CRISPR-кассеты. Такие, по-видимому, неполные локусы могут либо кодировать дефектные системы CRISPR-Cas, либо могут функционировать в купе с адаптационным модулем, закодированным в ином месте генома, как это было, к примеру обнаружено для некоторых систем типа III (Majumdar et al., 2015, RNA, vol. 21, 1147-1158). В филогенетическом дереве Cas1 белки Cas1 из локусов C2c2 распределены среди двух клад. Первая клада включает Cas1 от Clostridia и расположена в поддереве II типа вместе с небольшой ветвью типа III-А (фиг. 10А и 10B, фиг. 10C-V, дерево Cas1). Второй клад состоит из белков Cas1 из локусов C2c2 Leptotrichia и расположен внутри смешанной ветви, которая в основном содержит белки Cas1 из систем CRISPR-Cas типа III-A. Поиск по базе данных с использованием HHpred и PSI-BLAST не обнаружил сходства последовательностей между C2c2p и другими белками. Тем не менее, проверка множественных выравниваний белковых последовательностей C2c2p привела к идентификации двух строго консервативных мотивов RxxxxH, которые характерны для доменов HEPN (нуклеотид-связывающий участок высших эукариотических и прокариотических организмов) (Anantharaman et al., 2013, Biol Direct, том 8, 15, Grynberg et al., 2003, Trends in biochemical sciences, vol 28, 224-226) (фиг. 11 и фиг. 13В, фиг. 13J-N). Предсказание вторичной структуры белка указывает на то, что эти мотивы находятся в структурных контекстах, совместимых с доменной структурой HEPN, также как и в целом предсказание вторичной структуры для соответствующих части C2c2p. Домены HEPN представляют собой небольшие (-150 а/к) альфа-спиральные домены с различными последовательностями, но с крайне консервативными каталитическими мотивами, для которых была показана или предсказана РНК-азная активность, а также, что они часто связаны с различными системами защиты (Anantharaman, 2013) (фиг. 13B и 16, Мотив HEPN RxxxxH в семействе C2c2). Последовательности доменов HEPN мало консервативны, за исключением каталитического мотива RxxxxH.

Хотя последовательности двух предполагаемых HEPN-доменов C2c2 мало похожи на другие HEPN-домены, за исключением каталитических мотивов RxxxxH, тип домена в значительной степени подкрепляется предсказанием вторичной структуры, которые указывают на то, что каждый мотив находится в рамках совместимых структурных контекстов (фиг. 13B, фиг. 13J-N). Кроме того, предсказанная вторичная структура всей последовательности для каждого предполагаемого домена также согласуется с укладкой домена HEPN (фиг. 13J-N). Таким образом, представляется вероятным, что C2c2p содержит два активных домена HEPN. Домен HEPN не является новым для систем CRISPR-Cas, поскольку он часто ассоциирован с доменом CARF (CRISPR-Associated Rossmann Fold) в белках Csm6 и Csx1, которые присутствуют во многих системах CRISPR-Cas типа III (Makarova, 2014). Эти белки не относятся ни к адаптационным модулям, ни к эффекторным комплексам, но предполагается, что они способны выполнять некоторые вспомогательные, но еще не охарактеризованные функции в родственных системах CRISPR, а именно, они могут быть компонентами связанного модуля иммунитета, который присутствует в большинстве систем CRISPR-Cas, и работает при запрограммированной гибели клеток (апоптозе), а также выполняет регулятивные функции во время CRISPR ответа (Koonin, 2013; Makarova, 2012; Makarova, 2013). Однако C2c2p отличается от Csmo и Csx1 тем, что этот больший белок является единственным общим белком, кодируемым в локусах C2c2, за исключением Cas1 и Cas2. Таким образом, представляется вероятным, что C2c2p является эффектором в предполагаемых новых системах CRISPR-Cas, а HEPN-домены соответственно являются их каталитическими остатками. Вне предсказанных доменов HEPN последовательность C2c2p не обнаруживала сходства с другими белками и, согласно прогнозам, принимала смешанную альфа/бета вторичную структуру без заметного сходства с любыми известными способами фолдинга белка (фиг. 13J-N).

[856] CRISPR кассеты в локусах C2c2 весьма неоднородны, с длиной от 35 до 39 п.н. и неструктурированны (энергия фолдинга от -0,9 до 4,7 ккал/моль). Согласно картированию CRISPR (Lange, 2013), эти CRISPR не принадлежат ни к одному из установленных структурных классов и относятся к 3 из 6 суперклассов. Только CRISPR от Listeria seeligeri можно было приписать семейству последовательностей номер 24, которое обычно ассоциировано с системами типа II-C (фиг. 42A-L).

[857] Анализ спейсеров локусов C2c2 идентифицировал одну 30 нуклеотидную область, идентичную геномной последовательности Listeria weihenstephanensis, и два неполных совпадения с геномами бактериофагов, в частности, спейсер из Listeria weihenstephanensis совпадал с хвостовым геном бактериофага Listeria (фиг.42A-L).

[858] Учитывая уникальность предсказанного эффекторного комплекса C2c2, эти системы могут быть классифицированы как предположительный тип VI систем CRISPR-Cas. Более того, поскольку все экспериментально охарактеризованные и ферментативно активные HEPN-домены являются РНК-азами, системы типа VI вероятно, действуют на уровне РНК, таких как мРНК,

[859] Предполагаемые системы типа V-С. Третья группа локусов-кандидатов включает исключительно метагеномные последовательности и, следовательно, не может быть отнесена к конкретным таксонам. Эти локусы включают только два кодирующих белок гена, которые кодируют Cas1 и большой белок, обозначенный C2c3 (класса 3, кандидат 3) (фиг. 8A "Организация полных локусов систем 2 класса"; фиг. 14, окрестности C2c3, фиг. 44A-Б). Белки C2c3 находятся в том же диапазоне размеров, что и Cpf1 и C2c1, и аналогично содержат TnpB-гомологичный домен на своих C-концах, который, в отличие от соответствующего домена C2c1, продемонстрировал ограниченное, но значительное сходство с Cpf1 (фиг. 13А и 13С). Области гомологичности TnpB C2c3 содержат три каталитических мотива типа RuvC-подобной нуклеазы, с диагностической триадой D..E..D каталитических аминокислотных остатков (Aravind et al., 2000, выше), область, соответствующую мостиковой спирали (также известную как богатый аргинином кластер), который участвует в cr-РНК-связывании в Cas9, и небольшую область, которая представляется соответствующей "цинковому пальцу" TnpB (Zn-связывающие остатки цистеина сохраняются в C2c3). Сохранение каталитических остатков явно свидетельствует о том, что гомологичные домены RuvC всех этих белков являются активными нуклеазами. N-концевые области C2c1 и C2c3 не демонстрируют существенного сходства друг с другом или с любыми известными белками. Предсказание вторичной структуры показывает, что N-концевые области белков C2c3 принимают смешанную конформацию cx/j3. Таким образом, общие архитектуры доменов C2c1 и C2c3 и, в частности, организация домена RuvC аналогичны областям Cpf1, но отличаются от архитектуры Cas9. Это говорит о том, что локусы C2c1 и C2c3 правильнее классифицировать как подтипы V-B (см. выше) и V-C, соответственно, с локусами кодирующими Cpf1 на настоящий момент обозначенными подтипом V-A,

[860] Среди c2c3 локусов только один содержит CRISPR кассету с нехарактерно короткими спейсерами длиной 17-18 нуклеотидов. Повторы в кассетах имеют длину 25 п.н. и оказывается, что они неструктурированные и имеют энергию 1,6 ккал/моль (фиг. 43A-F).

[861] Спейсеры из единственного континга C2c3, содержащего CRISPR кассету, слишком коротки, чтобы иметь статистически значимые совпадения. Тем не менее, было обнаружено несколько совпадений с последовательностями из предсказанных профагов (ФИГ. 43 A-F).

[862] Подтипы белков TnpB имеющие значительное сходство с известным (Cas9) и тремя описанными здесь предполагаемыми эффекторами класса 2 (Cpf1, C2c1 и C2c3) не совпадали (фиг. 13А и 13С). Хотя расхождение в последовательности TnpB-подобных доменов слишком велико для обеспечения надежного филогенетического анализа, эти данные свидетельствуют о том, что четыре известных в настоящее время больших эффекторных белка класса 2, Cas9, Cpf1, C2c1 и C2c3 развивались независимо от генов различных мобильных генетических элементов.

[863] Хотя большинство спейсеров в новых локусах CRISPR-Cas, описанных в настоящем описании, не были в значительной степени похожи на любые доступные последовательности, существование спейсеров, совпадающих с геномом фага, подразумевает, что эти локусы могут кодировать активные функциональные адаптивные системы иммунитета. Малая доля фаго-специфических спейсеров типична для систем CRISPR-Cas и, скорее всего, указывает на их динамическую эволюцию и малую долю вирусного разнообразия, которая представлена в современных базах данных последовательностей. Эта интерпретация соотносится с наблюдением, что близкородственные бактериальные штаммы, кодирующие гомологичные локусы CRISPR-Cas, обычно содержат несвязанные коллекции спейсеров, примером которых являются локусы C2c2 из Listeria weihemtephanensis и Listeria newyorkensis (фиг. 45А-С).

[864] Заявители применили простую и понятную вычислительную стратегию для прогнозирования новых CRISPR-cas систем класса 2. Ранее описанные системы класса 2, а именно тип II и предполагаемый тип V, состояли из генов cas1 и cas2 (а в некоторых случаях и cas4), содержащих адаптационный модуль и один большой белок, который составляет эффекторный модуль. Поэтому заявители предположили, что любой геномный локус, содержащий cas1 и большой белок, может быть потенциальным кандидатом на новую систему класса 2 и заслуживает тщательного исследования. Такой анализ с использованием чувствительных способов сравнения белковых последовательностей привел к идентификации трех наиболее вероятных кандидатов, два из которых являются отдельными подтипами ранее описанного предполагаемого типа V (подтипы VB и VC), тогда как третий может быть классифицирован как новый предполагаемый тип VI, в силу наличия нового предсказанного эффекторного белка. Многие из этих новых систем встречаются в бактериальных геномах, которые не содержат других локусов CRISPR-Cas (фиг. 44А-E), что указывает на возможность автономного функционирования систем типа V и типа VI. Рассматриваемые в настоящем описании локусы-кандидаты были проверены с помощью функциональных способов, которые выявили экспрессию и процессинг соответствующих CRISPR-кассет, производящих зрелые cr-РНК, определили предполагаемую tracr-РНК (где возможно), продемонстрировали интерференцию при экспрессии в E.coli, определили PAM и выявили минимальные компонентов, необходимые для расщепления лизата.

[865] Системы типа V кодируют предсказанные эффекторные белки, которые по общей доменной архитектуре напоминают Cas9, но, в отличие от Cas9, RuvC-подобные домены Cpf1, C2c1 и C2c3 являются соседними и не имеют вставок, характерных для Cas9, в частности домена нуклеазы HNH. Наличие одного вместо двух доменов нуклеазы указывает на то, что эффекторные белки типа V механически отличаются от Cas9, в которых домены HNH и RuvC отвечают за расщепление комплементарных и не комплементарных цепей ДНК-мишени соответственно (Chen et al., 2014, The Journal of biological chemistry7, vol. 289, 13284- 13294, Gasiunas et al., 2012, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 109, E2579-2586; Jinek et al., 2012, Science, vol. 337, 816-821). Предсказанные белки-эффекторы типа V могут образовывать димеры, в которых два домена, подобные RuvC, могут расщеплять противоположные цепи молекулы-мишени.

[866] В основе предполагаемых систем CRISPR-Cas типа VI по-видимому лежит новый эффекторный белок, который содержит два предсказанных домена HEPN, которые, подобно ранее характеризованным доменам HEPN, могут обладать РНК-азной активностью, что системы типа VI могут быть нацелены на и расщеплять мРНК. Ранее сообщалось о нацеливании на мРНК для некоторых систем типа CRISPR-Cas типа III (Hale et al., 2014, Genes Dev, том 28, 2432-2443, Hale et al, 2009, Cell, vol. 139, 945-956, Peng et al., 2015, Nucleic acid research, vol. 43, 406-417). Альтернативная возможность заключается в том, что C2c2 является первой ДНК-азой в суперсемействе HEPN, возможно, с двумя доменами HEPN, каждый из которых расщепляет одну цепь ДНК. Таким образом, кажется возможным преобразование C2c1 и C2c2 в инструменты редактирования генома с различными классами целей.

[867] Чтобы проверить функциональность этих систем CRISPR-Cas класса 2, заявители показали, что две C2c1 CRISPR-кассеты экспрессируются, процессируются в зрелые cr-РНК и способны к интерференции в случае экспрессии в E. coli. Эти эксперименты выявили более характеристик локуса C2c'l, включая: (i) процессируемые прямые повторы (DR) на 5'-конце cr-РНК, (ii) 5' PAM и (iii) наличие короткой РНК с гомологией повтор-антиповтор по отношению к процессируемому 5' DR, то есть предполагаемая tracr-РНК. Открытие процессируемых DR на 5'-конце cr-РНК и 5' PAM поддерживает такое развитие событий при котором C2c1 происходит из систем класса 1, потому что эти системы демонстрируют процессинг 5'-концов (I типа и III типа) и 5'-концевой последовательности PAM (I типа) (Mojica et al., 2009, Microbiology, vol. 155, 733-740; Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbioln, т. 9, 467-477). В данном случае для С2с1 идентифицирована AT-богатая последовательность PAM, в противоположность ГЦ-богатым последовательностям PAM хорошо охарактеризованных систем II класса. Для локусов C2c1, охарактеризованных в настоящем описании экспериментально, Заявители определили cr-РНК, которые обрабатываются до длины, при которой сохраняется возможность к связыванию и кофолдингу с предполагаемыми tracr-PHKs, что указывает на то, что tracr-PHKs могут быть вовлечены и, возможно, даже необходимы для образования комплексов. Затем авторы изобретения использовали экспрессию C2c1 в культуре клеток человека для экспериментальной верификации того, что в этих условиях участвовала tracr-РНК и была необходима для in vitro расщепления ДНК-мишени конкретной исследуемой нуклеазой C2c1.

[868] Заявители также показали, что, когда C2c2 локус из L.seeligeri экспрессируется в E.coli, он процессируется в cr-РНК с прямым повтором (DR) на 5'-конце 29 нуклеотидов длиной, похожие результаты были получены для локуса C2c2 из L.shahii. В этом случае, вырожденный повтор находится в начале последовательности, а не в конце, как это типично для большинства CRISPR-последовательностей, и последовательность и гены cas транскрибируются сонаправленно. Заявители не обнаружили предполагаемую tracr-РНК в данных секвенирования РНК C2c2 РНК. Однако прогнозируемая вторичная структура прямого повтора (DR) 29 нуклеотидов длиной показывает стабильную "шпильку", которая может быть потенциально важной для образования комплекса с эффекторным белком C2c2.

[869] На фиг. 94 показано, что процессинг последовательности C2c2 в E. coli требует белка С2с2, как оценено с помощью in vitro транскрибированных последовательностей спейсеров, инкубированных с белком С2с2.

[870] В сочетании с результатами предыдущих анализов, (Chylinski, 2014; Makarova, 2011), идентификация новых систем CRISPR-Cas класса 2 обнаруживает главную тенденцию в развитии систем CRISPR-Cas класса 2. Эффекторные белки двух или трех типов в этом классе, по-видимому, эволюционировали из пула мобильные генетических элементов, которые кодируют белки TnpB, содержащие RuvC-подобный домен. Последовательности RuvC-подобных доменов TnpB и гомологичных доменов эффекторных белков класса 2 слишком сильно дивергировали для надежного филогенетического анализа. Тем не менее, для Cas9, эффекторного белка системы II Типа, специфичная группа предков, по-видимому, легко идентифицируется, а именно семейство TnpB-подобных белков, особенно обильных в цианобактериях, которые показывают относительно высокое сходство с Cas9 и разделяют с Cas9 всю доменную архитектуру, а именно RuvC-подобные домены, нуклеазные домены HNH и богатую аргинином мостиковую спираль (Chylinski, 2014) (Рисунок 11, Фиг. 13A и 13B, "Доменная организация семейств 2 класса"; Рисунок 12, Фиг. 13A и 13B, "области гомологии TnpB в белках 2 класса"). В отличии от Cas9, невозможно отнести Cpf1, C2c1, и C2c3 к определенному семейству, несмотря на сохранение всех мотивов, сконцентрированных в каталитических остатках RuvC-подобных нуклеаз, эти белки показывают только ограниченное сходство с родовыми профилями TnpB. Однако, учитывая, что C2clp не показывает обнаружимого сходства последовательностей с Cpf1, что Cpf1, C2c1, и C2c3 содержат различные вставки между мотивами RuvC и явно неродственными N-концевыми областями, наиболее вероятно, что Cpf1, C2c1, и C2c3 возникли независимо из различных семейств в пуле кодирующих элементов TnpB.

[871] Любопытно, что белки TnpB, во-видимому, "предопределены" для использования в эффекторных комплексах систем CRISPR-Cas класса 2, так что они, по-видимому, были рекрутированы во множестве разных случаев. По-видимому, такая полезность белков TnpB связана с их предсказанной способностью разрезать одноцепочечную ДНК, будучи связанными с молекулой РНК через R-богатую мостиковую спираль, которая, как это было показано, в Cas9 связывает cr-РНК (Jinek, 2014; Nishimasu, 2014; Anders et al., 2014, Nature, vol. 513, 569-573). Функции TnpB в жизненных циклах соответствующих транспозонов плохо изучены. Эти белки не нужны для транспозиции, и в одном случае было показано, что белок TnpB снижает транспозицию (Pasternak, 2013), но их механизм действия остается неизвестным. Экспериментальное исследование TnpB, вероятно, прольет свет на механические аспекты систем CRISPR-Cas класса 2. Стоит отметить, что механизмы Cpf1 и C2c1 могут быть похожими друг на друга, но они существенно отличаются от Cas9, так как в первых двух белках отсутствует домен HNH, который в Cas9 отвечает за разрыв одной из цепей ДНК-мишени (Gasiunas, 2012)(Jinek, 2012)(Chen, 2014). Соответственно, использование Cpf1 и C2c1 может привести к дополнительным возможностям редактирования генома.

[872] С точки зрения эволюции поразительно, что системы CRISPR-Cas класса 2, по-видимому, полностью произошли из различных мобильных генетических элементов, учитывая недавние данные о вероятном возникновении генов cas1 из отдельного семейства транспозонов (Koonin, 2015, Krupovic, 2014). Более того, вероятное независимое происхождение эффекторных белков из разных семейств TnpB, наряду с различной филогенетической близостью соответствующих cas1 белков, настоятельно свидетельствует о том, что системы класса 2 развивались неоднократно посредством сочетания различных адаптационных модулей и полученных из транспозонов нуклеаз, что привело к появлению эффекторных белков. Этот способ эволюции, по-видимому, является окончательным проявлением модульности, характерной для эволюции системы CRISPR-Cas (Makarova, 2015), что подразумевает, что в природе могут существовать дополнительные комбинации адаптационного и эффекторного модулей.

[873] Предсказанные системы CRISPR-Cas типа VI содержат предсказанный эффекторный белок, в составе которого присутствуют два предсказанных домена HEPN, которые, вероятно, обладают РНК-азной активностью. Эти домены HEPN не являются частями эффекторных комплексов в других системах CRISPR-Cas, но задействованы в осуществления различных защитных функций, включая прогнозируемую вспомогательную роль (Anantharaman, 2013) (Makarova, 2015) в различных системах CRISPR Cas. Присутствие HEPN-доменов в качестве каталитических единиц предсказанного эффекторного модуля подразумевает, что системы типа VI нацеливаются на и расщепляют мРНК. Ранее для систем CRISPR-Cas III Типа уже сообщалось о таргетировании мРНК (Hale, 2014; Hale, 2009) (Peng, 2015). Несмотря на то, что домены HEPN до сих пор не были обнаружены в настоящих транспозонах, они характеризуются высокой горизонтальной подвижностью и являются неотъемлемой частью мобильных элементов, таких как системы токсин-антитоксин (Anantharaman, 2013). Таким образом, предполагаемые системы типа VI, похоже, соответствуют общей парадигме модульной эволюции CRISPR-Cas класса 2 от мобильных элементов, и ожидается, что новые варианты и новые типы систем будут обнаружены путем анализа данных геномики и метагеномики. Учитывая, что белок C2c2 не связан с другими эффекторами класса 2 (все они содержат RuvC-подобные домены, даже при условии, отдаленного родства), открытие типа VI можно считать подтверждением независимого происхождения других вариантов класса 2.

[874] Учитывая вырисовывающийся сценарий эволюции систем класса 2 из мобильных элементов, представляется полезным изучить общую эволюцию локусов CRISPR-Cas и, в частности, вклад мобильных элементов в этот процесс (фиг. 53). Предшественники адаптивной иммунной системы, скорее всего, возникли из-за вставки каспозона (транспозона, кодирующего Cas), примыкающего к локусу, который кодировал примитивную систему врожденного иммунитета (iKoonin и Krupovic, 2015, Nature reviews Genetics, vol. 16, 184-192; Krupovic et al., 2014, BMC Biology, vol. 12, 36). Важным результатом было также включение системы токсин-антитоксин, которая передавала ген cas2 и могла появиться либо в предковом каспазоне, либо в изменяющемся локусе адаптивного иммунитета (фиг. 51).

[875] Учитывая чрезвычайно широкое распространение систем класса 1 в археях и бактериях и распространение в них древних доменов RRM (мотив распознавания РНК, RNA Recognition Motif - RRM), не возникает сомнений, что предковая система принадлежала к классу 1 (фиг. 51). Скорее всего, предковая архитектура напоминала существующий тип III и включала ферментативно активный белок Cas10 (Makarova et al, 2011, Biol Direct, том 6, 38; Makarova et al, 2013, Biochem Soc Trans, том 41, 1392-1400). Белок Cas10 представляет собой гомолог ДНК-полимераз семейства В и нуклеотидных циклаз семейства GGDEF, который показывает значительное сходство последовательностей с этими ферментами и сохраняет все каталитические аминокислотные остатки (Makarova et al., 2011, Biol Direct, том 6, 38, Makarova et al., 2006, Biol Direct, том 1, 7). Структурный анализ подтвердил наличие в Cas10 полимеразоциклазоподобного домена и дополнительно выявил второй, вырожденный и, по-видимому, неактивный домен этого семейства (Khachatryan et al., 2015, Phys Rev Lett, vol. 114, 051801; Shao et al., 2013, Structure, vol. 21, 376-384, Zhu and Ye, 2012, FEBS Lett, том 586, 939-945). Точный характер каталитической активности Cas10 остается неясным, но было показано, что каталитические остатки полимеразоциклазоподобного домена являются существенными для расщепления ДНК-мишени (Saniai et al., 2015, Cell, vol. 161, 1164-1174). Белки Cas8, присутствующие в системах типа CRISPR-Cas I Типа, сходны по размерам с Cas10 и занимают эквивалентные положения в эффекторных комплексах (Jackson et al., 2014, Science, vol. 345, 1473-1479; Jackson and Wiedenheft, 2015, Mol Cell, vol. 58, 722-728, Staals et al., 2014, Molecular cell, vol. 56, 518-530), что наводящий на размышления об эволюционном родстве между большими субъединицами эффекторных комплексов III Типа и I Типа. Более конкретно, белки Cas8, которые сильно расходятся в последовательности между подтипами I Типа, могут быть каталитически неактивными производными Cas10 (Makarova et al., 2011, Biol Direct, том 6, 38, Makarova et al., 2015). Этот сценарий предполагает правдоподобную направленность эволюции, от подобного типу III предкового системы класса 1 до систем типа I. Дивергенция систем типа III и типа I могла быть ускорена за счет получения гелиазы Cas3 во время возникновения типа I (фиг. 53). Различные типы и подтипы класса 2 затем эволюционировали посредством множественных замещений блока гена, кодирующего эффекторные комплексы класса 1, путем введения транспозируемых элементов, кодирующих различные нуклеазы (фиг. 53). Эта конкретная направленность эволюции вытекает из наблюдения того, что адаптационные модули разных вариантов класса 2 происходят из разных типов 1-го класса (фиг. 10А и 10В).

[876] Системы класса 2 CRISPR-Cas, по-видимому, полностью получены из разных мобильных элементов. В частности, по-видимому, было, по меньшей мере, два (в подтипе V-C), но обычно три или, в случае II Типа, даже четыре представителя мобильных элементов: (i) предковый каспозон, (ii) модуль токсин-антитоксин, который дал начало Cas 2 (iii) транспозируемый элемент, во многих случаях кодирующий TnpB, который был предком эффекторного комплекса класса 2, и (iv) в случае II Типа нуклеаза HNH могла быть пожертвована предковому транспозону с помощью самосплайсирующегося интрона группы I или группы II (Stoddard, 2005, Q Rev Biophys, vol. 38, 49-95) (фиг.53). Локусы предполагаемого типа V-C, описанные в настоящем описании, кодируют конечную минимальную систему CRISPR-Cas, единственную в настоящее время идентифицированную, которой не хватает Cas2; по-видимому, сильно расходящиеся подтипы V-C Cas1-белков способны самостоятельно формировать адаптационный комплекс без вспомогательной субъединицы Cas2. Многократное возникновение систем класса 2 из мобильных элементов представляет собой окончательное проявление модульности, характерное для эволюции CRISPR-Cas (Makarova et al., 2015).

[877] Демонстрация того, что различные разновидности систем класса 2 CRISPR-Cas, независимо от того, что они эволюционировали из разных транспозонов, подразумевает, что дополнительные варианты и новые типы еще предстоит идентифицировать. Хотя большинство, если не все новые системы CRISPR-Cas, как ожидается, будут редкими, они могут использовать новые стратегии и молекулярные механизмы и могут стать важным ресурсом для новых, разнообразных приложений в области инженерии генома и биотехнологии.

[878] Модульная эволюция является ключевой особенностью систем CRISPR-Cas. Этот способ эволюции, по-видимому, наиболее выражен в системах класса 2, которые развиваются благодаря сочетанию адаптационных модулей от различных других систем CRISPR-Cas с эффекторными белками, которые, как представляется, рекрутируются из мобильных элементов в нескольких независимых случаях. Учитывая экстремальное разнообразие мобильных элементов в бактериях, представляется вероятным, что эффекторные модули систем класса 2 CRISPR-Cas также очень разнообразны. Здесь заявители использовали простой вычислительный метод для определения трех новых вариантов систем CRISPR-Cas, но многие другие, вероятно, будут содержаться в бактериальных геномах, которые еще не были секвенированы. Хотя большинство, если не все из этих новых систем CRISPR-Cas, как ожидается, будут редкими, они могут использовать новые стратегии и молекулярные механизмы и станут важным ресурсом для новых приложений в области инженерии генома и биотехнологии.

[879] Программа TBLASTN со значением отсечки 0,01 и отключенной фильтрацией низкой сложности была использована для поиска для профиля Cas1 (Makarova et al., 2015) в качестве запроса к базе данных NCSI WGS. Последовательности контигов или полных геномов, в которых был обнаружено попадание (результат с высокими баллами), были извлечены из той же базы данных. Область вокруг гена Cas1 (область 20 т.п.н. от начала гена Cas1 и 20 т.п.н. от конца гена Casl) была извлечена и транслирована с использованием GeneMarkS (Besemer et al, 2001, выше). Для предсказанных белков каждой Casl-кодирующей области производился поиск с использованием набора профилей из базы данных CDD (Marchler-Bauer, 2009) и конкретным профилям белков Cas (Makarova et al., 2015) с использованием программы RPS-BLAST (Marchler-Bauer et al, 2002, Nucleic Acids Res, том 30, 281-283). Процедура определения полноты локусов CRISPR и классификации систем CRISPR-Cas в существующие типы и подтипы (Makarova et al., 2015), разработанные ранее, были применены к каждому локусу.

[880] CRISPRmap (Lange, 2013) использовался для повторной классификации.

[881] Частичные и/или неклассифицированные локусы, которые охватывали белки размером более 500 аминокислот, анализировали на индивидуальной основе. В частности, для каждого предсказанного белка, кодируемый этими локусами, был произведен поиск с использованием итеративных поисков профилей с PSI-BLAST (Altschul, 1997), и композиционная статистика с отключенной фильтрацией низкой сложности для поиска удаленных аналогичных последовательностей против базы данных "безызбыточных" (NR) белков NCBF. Для каждого идентифицированного "безызбыточного" белка производился поиск в базе данных WGS с использованием программы TBLAST (Altschul, 1997). Программа HHpred использовалась с параметрами по умолчанию для идентификации сходства отдаленной последовательности (Soding, 2005), используя в качестве запросов все белки, идентифицированные в поисках BLAST. Множественные выравнивания последовательностей были построены с использованием MUSCLE (Edgar, 2004) и MAFFT (Katoh and Standiey, 2013, Mol Biol Evol, vol, 30, 772-780). Филогенетический анализ проводился с использованием программы FastTree с эволюционной моделью WAG и дискретной гамма-моделью с 20 категориями скоростей (Price et al., 2010, PLoS One, том 5, e9490). Вторичная структура белка была предсказана с использованием Jpred 4 (Drozdetskiy, 2015).

[882] Повторы CRISPR были идентифицированы с использованием PILER-CR (Edgar, 2007, supra) или, для вырожденных повторов, CRISPRfinder (Grissa et at., 2007, Nucleic Acids Res, vol.35, W52-57). Программа Mfold (Zuker, 2003, Nucleic Acids Res, том 31, 3406-3415) была использована для определения наиболее стабильной структуры повторяющихся последовательностей. Для спейсерных последовательностей производился поиск по базам данных нуклеотидов NCBI NR и WGS с использованием MEGABLAST (Morgulis et at., 2008, Bioinformatics, том 24, 1757-1764) с использованием параметров по умолчанию, за исключением размера слова был установлен равным 20.

[882] CRISPR-повторы были обнаружены при помощи PILER-CR (Edgar, 2007, выше) или для вырожденных повторов - CRISPRfinder (Grissa et al., 2007, Nucleic Acids Res, vol. 35, W52-57). Программа Mfold (Zukler, 2003, Nucleic Acids Res, vol 31, 3406-3415) были использованы для обнаружения наиболее стабильных структур для повторяющихся последовательностей.

[883] Был выполнен поиск последовательностей спейсеров был выполнен по базам данных NCBI: NR and WGS database при помощи MEGABLAST (Morgulis et al., 2008, Bioinformatics, vol. 24, 1757-1764) с заданными параметрами по умолчанию за исключением того, что параметр wordsize был задан на 20

[884] Выбранные кандидаты генов

[885] ГeнID: A;

Тип гена:C2C1;

Организм: 5. бактерия Opitutaceae TAV5;

Длина спейсера - мода (диапазон): 34 (33-37);

DR1: ;

DR2: нет;

tracr-РНК1:

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[886] ID гена: B;

Тип гена: C2C1;

Организм: 7. Bacillus thermoamylovorans штамма B4166;

Длинаспейсера - мода (диапазон): 37 (35-38);

DR1:

DR2: нет;

tracr-РНК1;

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[887] ID гена: C;

Тип гена: C2CI;

Организм: 9. Bacillus sp. NSP2.1;

Длина спейсера - мода (диапазон): 36 (35-42);

DR1:

DR2: нет;

tracr-РНК1:

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[888] ID гена: D;

Тип гена: C2C2;

Организм: 4. Бактерия Lachnospiraceae NK4A144 G619;

Длина спейсера - мода (диапазон): 35;

DR1:

DR2:

tracr-РНК1: нет;

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[889] ID гена: E;

Тип гена: C2C2;

Организм: 8. Listeria seeligeri серовар 1/2b штамм SLCC3954;

Длина спейсера - мода (диапазон): 30;

DR1:

DR2: нет;

tracr-РНК1:

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[890]

ID гена: F;

Тип гена: C2C2;

Организм: 12. Leptotrichiawadei F0279;

Длина спейсера - мода(диапазон): 31;

DR1:

DR2: нет;

tracr-РНК1:

tracr-РНК2:

Последовательность белка:

[891] ID гена: G;

Тип гена: C2C2;

Организм: l4. Leptotrichiashahii DSM 19757 B031;

Длина спейсера - мода (диапазон): 30 (30-32);

DR1:

DR2: нет;

tracr-РНК1:

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[892] ID гена: H;

Тип гена: Cpf1;

Организм: Francisellaularensis subsp. novicida U112,

Длина спейсера - мода (диапазон): 31;

DR1:

DR2: нет;

tracr-РНК1:

tracr-РНК2: нет;

Последовательность белка:

[893] Гены для синтеза

[894] Для генов от А-Н заявители оптимизируют гены для экспрессии в человеке и добавляют следующую последовательность ДНК в конец каждого гена. Обратите внимание, что эта последовательность ДНК содержит стоп-кодон (подчеркнутый), поэтому стоп-кодон не добавляется к последовательности, оптимизированной кодоном гена:

[895] Для оптимизации избегайте следующих сайтов рестрикции: BamHI, EcoRI, HindIII, BsmBI, BsaI, BbsI, AgeI, XhoI, Ndel, NotI, Kpnl, BSrGI, SpeI, XbaI, NheI

[896] Эти гены клонированы в простой экспрессирующий вектор млекопитающих:

[897] A

[898]

[899] B

[900]

[901] C

[902]

[903] D

[904]

[905] E

[906]

[907] F

[908]

[909] G

[910]

[911] H

[912]

[913] Локусы от A до G клонированы и вставлены в плазмиду с низким количеством копий. Используется вектор, не содержащий имеет резистентности к Amp.

[914] A-локус

[915]

[916] В-локус

[917]

[918] C-локус

[919]

[920] D-локус

[921]

[922] Е-локус

[923]

[924] F-локус

[925]

[926] G-локус

[927]

Пример 3: Дальнейшая оценка C2c2p и ассоциированных компонентов

[928] Заявители выделили оба локуса С2с2 из Carnobacterium gallinarum (фиг. 46) и изучили доменную структуру и организацию, а также экспрессию последовательности CRISPR. В первом локусе С2с2 наблюдается низкая экспрессия двух последовательностей CRISPR в направлении гена С2с2 (См. Фиг. 47). Второй локус также имеет низкую экспрессию транскрипции в направлении гена С2с2 (См. Фиг. 48). Заявители определили, что оба локуса могут иметь минимальную экспрессию, поскольку ни один локус не имеет ассоциированных генов Cas (Cas1/Cas2). Такие связанные гены могут быть необходимы для функционального локуса CRISPR. Заявители оптимизировали способы получения локусов C2c2 из других бактериальных штаммов.

[929] Заявители выполняют секвенирование РНК следующих культивируемых штаммов: Clostridium aminophilum DSMI0710, Carnobacterium gallinarum DSM4847, Leptotrichia wade F0279, Leptotrichia shahii DSM19757 и Rhodobacter capsulatus SB1003.

[930] Заявители разрабатывают pACYC клонирование из следующих источников ДНК. Претенденты клонируют весь локус С2с2 в E.coli - основу для экспериментов по разрезанию ДНК/РНК.

1) Выделенная геномная бактериальная ДНК: Lachnospiraceae bacterium MA2020, Lachnospiraceae bacterium NK4A179, Lachnospiraceae bacterium NK4A144

2) ДНК из культивируемого штамма: Clostridium aminophilum DSM10710, Carnobacterium gallinarum DSM4847, Leptotrichia wade F0279, Leptotrichia shahii DSM19757, Rhodobacter capsulatus SB1003

[931] Претенденты разрабатывают библиотеки фрагментов PAM для разрезания ДНК для оценки способности к разрезанию эффекторного белка С2с2. Претенденты разрабатывают эксперименты по разрезанию РНК на основе разрезания транскрипта гена устойчивости.

[932] Заявители тестируют функцию в клетках млекопитающих с использованием продуктов PCR промотора U6: спейсер (DR-спейсер-DR) (в некоторых аспектах спейсеры могут относиться к cr-РНК или направляющей РНК или аналогичным термином, как написано в этой заявке) и tracr для следующих штаммов: Lachnospiraceae bacterium, Listeria seeligeri serovar 12b, Leptotrichia wadei, Leptotrichia shahii. Кодирующую белок C2c2 ДНК Заявители оптимизировали кодоном для экспрессии в млекопитающих, и клонировали в плазмиду из Genscript.

[933] Заявители проанализировали репрезентативный локус С2с2, т.е. CRISPR локус C2c2 Listeria seeligeri серовара 1 /2b штамма SLCC3954 (LseC2c2). Заявители выполняли секвенирование РНК локуса C2c2 L. seeligeri, который был клонирован в E. coli. Локус LseC2c2 был синтезирован плазмидами Genscript в pET-28 вектор. Клетки, содержащие плазмиды, были сделаны компетентными при помощи Z-компонентного набора (Zymo). E. coli, содержащая гетерологичные конструкции, была культивирована в среде Luria broth с добавлением соответствующих антибиотиков в суспензию при 37°C и 300 об/мин. Бактерии выращивали в аэробных условиях и собирали в стационарной фазе роста.

[934] РНК была выделена из бактерий в стационарной фазе, сначала бактерии были ресуспендированы в TRIzol, а затем гомогенизированы с шариками циркония/кремния (BioSpec Products) в BeadBeater (BioSpec Products) в течение 7 одноминутных циклов. Общая РНК была очищена из гомогенизированных образцов с помощью протокола Miniprep Direct-Zol RNA (Zymo), обработаны ДНК-азой TURBO DNAase (Life Technologies), и 3'-дефосфорилирована T4-полинуклеотид-киназой (New England Biolabs). рРНК удаляли с помощью набора для удаления бактериальной рРНК Ribo-Zero (Illumina). Библиотеки секвенирования РНК были получены из рРНК-обедненной РНК с использованием модификации ранее описанного способа секвенирования cr-РНК (Heidrich et al., 2015, Methods Mol Biol, vol. 1311, 1-21). Кратко, транскрипты получили поли-А-хвост с помощью поли-(A)-полимеразы E. coli (New England Biolabs), были лигированы с 5'-РНК-адаптерами с использованием T4 РНК-лигазы 1 (оцРНК-лигаза), высокой концентрации (High Concentration, New England Biolabs) и обратно транскрибированы многотемпературной обратной транскриптазой AffmityScript (Agilent Technologies). кДНК была амплифицирована ПЦР с помощью штрих-кодированных праймеров с использованием полимеразы Herculase II (Agilent Technologies).

[935] Готовые библиотеки кДНК секвенировали на MiSeq (Alumina). Считывания из каждого образца были идентифицированы на основе ассоциированных с ними штрих-кодов и выровнены в соответствии с эталонным геномом RefSeq с использованием BWA (Li and Durbin, 2009, Bioinformatics, vol. 25, 1754-1760). Попарные выравнивания были использованы для выделения последовательностей целых транскриптов с помощью инструментов Picard (http://broadinstitute.github.io/picard) и эти последовательности были проанализированы с использованием Geneious 8.1.5.

[936] Заявители наблюдали высокий уровень экспрессии в локусе и образование мелких cr-РНК с прямыми повторами (DR) на 5'-конце длиной 29 нуклеотидов и спейсерами длиной 15-18 нуклеотидов (фиг. 49A). Хотя локус LseC2c2 содержит предсказанную предполагаемую tracr-РНК (фиг. 15), Заявители не наблюдали его экспрессии (фиг. 49A). Эти данные свидетельствуют о том, что вторичная структура, присутствующая в pre-cr-РНК локуса LseC2c2 может быть достаточной для процессинга для получения зрелой cr-РНК, а также загрузки cr-РНК на белок C2c2. РНК-фолдинг процессированной cr-РНК демонстрирует надежно предсказанную шпильку внутри прямого повтора, которая потенциально может служить в качестве "ручки" для белка C2c2 (фиг. 49А).

[937] Заявители также экспрессировали локус C2c2 в Leptotrichia shahii str. SLCC3954 в E. coli и анализировали его экспрессию с использованием Нозерн-блоттинга. Процедура проводилась, по существу, как описано в Pougach and Severinov, 2012 (Methods Mol Biol, vol. 905, 73-86). Клетки E. coli BL21 AI трансформировали плазмидой pACYCduet-1, содержащей контролируемый T7-промотором cas operon Leptotrichia shahii, и плазмидой pCDF-lb, содержащей минимальную кассету CRISPR с одним спейсером. Общая РНК была экстрагирована из 5 мл клеток E.coli, индуцированных 1 мМ арабинозы/0,2 мМ IPTG и выращенных до OD600 0,8-1,0. Клетки лизировали с помощью 5-минутной обработки с использованием Max Bacterial Enhancement Reagent с последующей очисткой РНК реагентом TRIzol (Thermo Fisher Scientific). 15 пг общей РНК разделяли в денатурирующей 8 М мочевине - 12% полиакриламидном геле и электрофоретически переносили на мембрану Hybond-XL (GE Healthcare) с использованием Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad). Мембрану высушивали, а затем подвергали кросс-линкингу ультрафиолетовым излучением. Раствор для гибридизации ExpHyb (Clontech) использовали для гибридизации в соответствии с инструкциями производителя в течение 1 часа при 40°C с олигонуклеотидными зондами с 32P-мечеными концами. Заявители обнаружили, что матрица CRISPR экспрессируется и процессируется в cr-РНК длиной 44 п.н. (фиг. 49B), экспрессию и образование cr-РНК как показано здесь, по меньшей мере, в двух различных локусах C2c2, используя независимые способы.

[938] Заявители стремились предсказать потенциальные tracr-РНК для остальной части идентифицированных локусов C2c2 путем поиска последовательностей анти-повторов в каждом локусе. Во многих локусах CRISPR-Cas повтор, расположенный на дальнем от промотора конце последовательности CRISPR, является вырожденным и имеет последовательность, которая явно отличается от остальных повторов (Biswas et al., 2014, Bioinformatics, vol. 30, 1805 -1813). Такие вырожденные повторы были обнаружены в нескольких системах C2c2 и C2c1, что позволило Заявителям предсказать направление транскрипции последовательности. Интегрируя эту информацию, были идентифицированы предполагаемые tracr-РНК для 4 из 17 локусов C2c2 и 4 из 13 локусов C2c1. В некоторых подтипах II-В и II-С последовательности CRISPR транскрибируется в противоположном направлении, начиная с вырожденного повтора (Sampson et al., 2013, Nature, vol. 497, 254-257; Zhang et al, 2013, Mol Cell, vol. 50, 488-503). Соответственно, авторы изобретения попытались предсказать tracr-РНК в разных положениях по отношению к последовательности CRISPR, но не смогли идентифицировать дополнительные последовательности tracr-РНК-кандидатов. Разумеется, предсказание tracr-РНК для других локусов было затруднено из-за сочетания таких факторов, как неполная комплементарность повторов, отсутствие связанной последовательности CRISPR и/или потенциальная неполнота локусов. Кроме того, существует вероятность того, что не все системы CRISPR класса 2 требуют tracr-РНК.

[939] Заявители идентифицировали обедненные мотивы последовательности, чтобы идентифицировать нуклеотиды последовательностей PAM. Библиотека PAM была перенесена в бактериальный вектор для трансформации штамма E.coli, экспрессирующего LshC2c2 (фиг. 54). Более подробный анализ для РНК-мишени приведен ниже, при условии, что для прямого распознавания требуется последовательность PAM. В этом анализе используют два штамма E.coli. Один из них несет плазмиду, кодирующую эндогенный локус эффекторного белка из бактериального штамма. Другой штамм несет пустую плазмиду (например, PACYC184, контрольный штамм). Все возможные последовательности PAM 7 или 8 п.н. представлены на плазмиде резистентности к антибиотику (pUC19 с геном устойчивости к ампициллину). Последовательность PAM расположена рядом с последовательностью прото-спейсера 1 (мишень РНК к первому спейсеру в эндогенном локусе эффекторного белка). Были клонированы две библиотеки PAM. Одна из них имеет 8 случайных п.н. на 5'-конце протоспейсера (например, всего 65536 различных последовательностей PAM=сложность). Другая библиотека имеет 7 случайных п.н. на 3'-конце протоспейсера (например, общая сложность составляет 16384 различных последовательностей PAM). Обе библиотеки были клонированы так, чтобы иметь в среднем 500 плазмид на каждую возможную последовательность PAM. Тестовый штамм и контрольный штамм трансформировали библиотеками 5'-PAM и 3'-PAM в отдельных трансформациях, а трансформированные клетки высевали отдельно на планшетах с ампициллином. Распознавание и последующее разрезание/интерференция в плазмиде делает клетки чувствительными к ампициллину и предотвращает рост. Примерно через 12 ч после трансформации все колонии, образованные тестовыми и контрольными штаммами, были отобраны и выделена плазмидная РНК. Плазмидную РНК использовали в качестве матрицы для амплификации ПЦР и последующего глубокого секвенирования. Представленность всех последовательностей PAM в нетрансформированных библиотеках показала ожидаемую представленность PAM в трансформированных клетках. Представленность всех PAM, обнаруженных в контрольных штаммах, показало фактическую представленность. Представленность всех PAM в тестируемом штамме показала, что PAM не распознаются ферментом, а сравнение с контрольным штаммом позволяет получить обедненную последовательность PAM. Интерференция CRISPR приводит к неэффективной трансформации плазмидами, содержащими эффективную последовательность-мишень. Трансформированные плазмиды секвенировали для идентификации нецелевых последовательностей. Обедненные последовательности идентифицируют 5'-PAM-нуклеотиды (фиг. 55). Гетерологичное нацеливание таргетинг в E. coli наблюдалось для трех мишеней. Повышенная интерференция наблюдалась для более активно транскрибированных мишеней. В частности, мишень в транскрибируемой области ("РНК") совпала с увеличением интерференции по сравнению с минимально транскрибируемой мишенью "ДНК1" и "ДНК2" (фиг. 56). На 5'-PAM-скрининге ДНК не было обнаружено расщепления ДНК (фиг. 85). LshC2c2 не расщепляет нетранскрибируемую или транскрибируемую ДНК в анализе in vitro с использованием E. coli RNAP (фиг. 83). LshC2c2 не расщепляет оцДНК или дцДНК in vitro (фиг. 84).

[940] Компоненты LshC2c2 очищали для испытаний in vitro (фиг. 57). Первоначально в тестовых реакциях наблюдалось, что cr-РНК расщепляется C2c2. Расщепление cr-РНК не зависит от Mg²⁺, и может быть увеличено при отсутствие мишени (фиг. 58). Кроме того, было обнаружено, что в отсутствие Mg (фиг. 108) наблюдается уменьшение расщепления.

[941] Показывая способность локуса LshC2c2 CRISPR опосредовать интерференцию оцРНК, авторы изобретения хотели продемонстрировать два дополнительных аспекта активности C2c2: 1) Интерференция РНК с использованием ортогонального анализа и 2) способность перенацелить (ретаргетировать) C2c2 на эндогенно экспрессируемые транскрипты в клетке. Авторы изобретения разработали флуоресцентный способ считывания активности LshC2c2 путем экспрессии RFP из трансфицированной плазмиды в E. coli (фиг. 63A). Затем авторы изобретения разработали три спейсера для каждой из трех возможных H-PAM (всего 9 спейсеров), нацеленных на мРНК RFP, и клонировали их в остов pLshC2c2, как и раньше. Авторы изобретения трансфицировали этими плазмидами E. coli, уже экспрессирующую плазмиду RFP и выращивали в течение ночи в условиях двойной селекции. Анализируя уровни RFP в E.coli с помощью проточной цитометрии, авторы изобретения наблюдали надежный нокдаун RFP для всех трех PAM и отсутствие нокдауна RFP для спейсеров, нацеливающих на антисмысловую цепь ДНК, или ненацеливающих спейсеров (фиг. 63B-C). Для дальнейшего исследования активности LshC2c2 в отношении нацеливания и расщепления, спейсеры, нацеливающие на RFP, клонировали в локус LshC2c2, и локус экспрессировали в E. coli, несущей плазмиду, кодирующую экспрессируемый RFP, или контрольную плазмиду pUC19. На фиг. 61 показано, что C2c2 нацелен на транскрибированный RFP. Зависимость интерференции от цепи была исследована путем выбора последовательностей-мишеней, совпадающих с транскрибированными областями или комплементарными им. Высокие уровни интерференции наблюдались с использованием нацеливающих последовательностей, комплементарных транскрибированной РНК (фиг. 62). Также наблюдалось, что степень интерференции варьирует между транскрибируемыми мишенями, возможно, связано с уровнями транскрипции (фиг. 63).

[942] Нацеливание на РНК и выбор цели были изучены с использованием модельной транскрипции и тестирования различных целей (фиг. 65). Расщепление РНК было протестировано с помощью РНК-мишеней (фиг. 66 и 67) и РНК, транскрибируемой с матрицы ДНК (фиг. 68 и 69). Наблюдаемые продукты расщепления РНК совпадали по размеру с ожидаемыми от модельного транскрипта (фиг. 70). Фиг. 87 демонстрирует, что LshC2c 2 не требует малой РНК для расщепления РНК.

Пример 4: C2C2 нацеливается на и разрезает РНК in vitro

C2c2 Leptrichia shahii способен к интерференции в оцРНК фага MS2

[943] C2c2 был впервые обнаружен при компьютерном поиске консервативных неизвестных белков вблизи адаптационного белка Cas2, чтобы выявить новые системы CRISPR класса 2 (Shmakov et al) и предположительно является функциональным эффектором нового подтипа VI CRISPR из-за небольшой гомологии с другими известными белками CRISPR. Белки C2c2 имеют два консервативных домена HEPN, которые демонстрируют сильную консервативность активных остатков, но мало гомологичны с другими известными белками суперсемейства домена HEPN или эффекторами CRISPR. Однако C2c2 отличается от других белков HEPN, в частности CRISPR-ассоциированных белков типа Csx1 и Csm6, которые обычно димеризуются до расщепления РНК, поскольку у них есть два домена HEPN, а не один. Многие из этих уникальных особенностей привели к классификации C2c2 как предполагаемого типа VI. Учитывая эти наблюдения и распространенность белков C2c2-семейства у разных видов бактерий, авторы изобретения попытались определить, являются ли C2c2 биологически активными локусами CRISPR-Cas и могут ли опосредовать интерференцию против РНК.

[944] Чтобы определить, является ли C2c2 (LshC2c2) Leptotrichia shahii функциональной нацеленной на РНК системой, авторы изобретения клонировали весь локус LshC2c2 CRISPR-Cas в низкокопийные плазмиды (pLshC2c2), чтобы обеспечить гетерологичную репарацию в E. coli. В охарактеризованных на настоящий момент нацеленных на ДНК и РНК системах CRISPR расщепление мишеней зависит от двух факторов: 1) комплементарности между спейсерной последовательностью cr-РНК и целевым сайтом (протоспейсером) и 2) наличием соответствующего прилегающего мотива (PAM), фланкирующего протоспейсер. В связи с необходимостью для PAM отчетливого разделения "своего" и "чужого", неясно, необходима ли системе специфичного нацеливания на РНК последовательность PAM, поскольку тогда, по-видимому, не будет ауто-РНК для нацеливания.

[945] Чтобы исследовать требования к PAM и активность LshC2c2, авторы изобретения использовали анализ рестрикции фага MS2 (фиг. 73). Фаг MS2 является идеальной моделью для исследования расщепления РНК, поскольку он представляет собой литический одноцепочечный РНК-содержащий фаг, который не имеет ДНК-интермедиатов в жизненном цикле. Он легко заражает E. coli путем прикрепления к F-пилям и, таким образом, может использоваться для тестирования гетерологичной интерференции в сравнении с оцРНК. Авторы изобретения синтезировали библиотеку последовательностей cr-РНК для разбивки каждого возможного целевого участка длиной 28 п.н. в геноме фага MS2, чтобы определить, какие целевые участки были значительнее обеднены, чем другие. Библиотека cr-РНК была клонирована в pLshC2c2, так что каждый уникальный спейсер был первым спейсером в последовательности из двух спейсеров. Авторы изобретения трансформировали этой библиотекой E. coli NovaBlue (DE3, F +) и выращивали культуры с фагом MS2 или без него в течение ночи. Используя этот анализ, авторы изобретения смогли идентифицировать однонуклеотидную PAM, анализируя фланкирующие области целевых последовательностей cr-РНК, которые были обогащены из-за устойчивости к инфекции MS2. Анализ выявил 3'H-PAM (не G-PAM) на РНК-мишени, что указывает на то, что комплекс LshC2c2 избирателен в отношении последовательности (фиг. 75А-В). Помимо идентификации PAM, скрининг показал, что гетерологично экспресированный локус LshC2c2 способен к значительной интерференции с оцРНК и защите от инфекции фагом MS2.

[946] Чтобы проверить результаты скрининга, авторы изобретения клонировали четыре наиболее обогащенных спейсера и показали от 3- до 4-log-кратное снижение эффективности образования бляшек в соответствии с уровнем обогащения, наблюдаемым в скрининге. Более того, авторы изобретения хотели еще раз подтвердить обнаружение PAM, и поэтому клонировали серию из четырех направляющих молекул на один возможный нуклеотид PAM (всего 16 направляющих молекул), все нацеливающие на область гена mat MS2. Авторы изобретения обнаружили, что было осуществлено эффективное нацеливание на все 16 мишеней были с более сильным предпочтением C, A и U. Поскольку G-PAM, тем не менее, были нацеленными, и их меньшинство было обогащено в скрининге интерференции, этот PAM может быть более релаксированным, чем 3'-H PAM.

[947] Белок C2C2 из Leptotrichia shahii был экспрессирован в E. coli и очищен с использованием гистидиновой метки (His-tag) с тремя последующими раундами гель-фильтрации на Akta FPLC с использованием колонки Superdex 200. Для экспериментов по расщеплению in vitro 175-нуклеотидная РНК-мишень (меченые t1 и t3 соответственно, последовательности см. ниже) объединяли с 5-кратным молярным избытком белка C2c2 и cr-РНК (с использованием 28-нуклеотидных спейсеров и 28-нуклеотидных прямых повторов, последовательности см. ниже) и инкубировали при 37°С в течение 15 минут в буферах, указанных на рисунке рядами. Реакцию останавливали инкубированием протеиназой К в течение 15 мин при 37°С и затем денатурировали в загрузочном буфере для TBE-мочевины при 85°С в течение 5 мин. Образцы анализировали на денатурирующем геле TBE Urea PAGE.

[948] Результаты показывают, что C2C2 опосредует эффективную деградацию РНК-мишени зависимым от cr-РНК образом. (фиг. 71, фиг. 79, фиг. 80). Кроме того, сама cr-РНК также расщепляется во время этого процесса.

[949] Нацеливание на транскрипты RFT у бактерий показало, что скорость роста снижается (фиг. 77). Без связи с теорией, это может указывать на то, что система HEPN представляет собой суицидальную систему защиты фагов.

[950] Фрагменты расщепления были отображены, как показано на фиг. 81 и 114.

[951] Секвенирование РНК IVC (расщепление in vitro) проводили, как показано на фиг.82.

[952] Последовательность РНК-мишени 1

[953]

[954] Последовательность РНК-мишени 3

[955]

[956] Последовательность cr-РНК

[957] CCACCCCAATATCGAAGGGGACTAAAACtagattgctgttctaccaagtaatccat

[958] Последовательность белка C2c2 L.shahii

[959]

[960] Скрининг РНК PAM-последовательностей, идентифицированных с использованием интерференции фага MS2, см. Фиг. 73-78. Было определено, что LshC2c2 имеет 3'-PAM для расщепления РНК (фиг. 86). Фиг. 88 и 89 также демонстрируют, что LshC2c2 является перепрограммируемым и чувствительным к PAM.

[961] Фиг. 90 демонстрирует, что LshC2c2 не может использовать спейсеры меньше 18-22 нуклеотидов.

[962] Фиг. 91-93 показывают влияние шпильки (ее модификаций) на активность по расщеплению. Показано, что без шпильки cr-РНК не расщепляются (фиг. 91) и что в целом если в стебле и возможны замены отдельных оснований, то активность нарушается только при изменениях вторичной структуры. Эксперименты по укорочению DR также указывают на то, что разрушение стеблевой структуры предотвращает расщепление (фиг. 92 и фиг. 93).

[963] Фиг. 100 показывает влияние двухвалентных катионов на активность C2c2.

[964] Было показано, что C2c2 отщепляет 3'-конец от целевого сайта (фиг. 102 и фиг. 103)

[965] На фиг. 104-106 показано, что C2c2 можно перепрограммировать с помощью cr-РНК.

[966] Не ограничиваясь теорией, по-видимому, будучи активированным, C2c2 становится активным и деградирует другие РНК (фиг. 98, фиг. 108).

[967] Было показано, что C2c2 может быть перепрограммирован с помощью cr-РНК (фиг. 104-106) и что нацеливание может осуществляться на длинные мишени (фиг. 107)

[968]

[969] Фиг. 112 предполагает, что cr-РНК C2c2 имеют seed-последовательность, о чем свидетельствует анализ одиночного и двойного нарушения комплементарности. Действительно, двойное нарушение комплементарности в нуклеотидах 1-11 мишени заметно влияет на расщепление, однако в меньшей степени, если находится в области, охватывающей нуклеотиды 16-26. Эти цифры также указывают на специфичность расщепления эффекторного белка C2c2.

[970] Фиг. 113 и фиг. 114, предполагают, что изменения контекстов последовательности влияли на паттерн расщепления. В действительности целевые последовательности, предоставленные в другом контексте, расщепляются по-другому.

Пример 5: Мутация в любом из доменов HEPN устраняет направленное расщепление

[971] Были созданы варианты Cpc2, содержащие мутации R597A и R1278A. Как показано на фиг. 72, обе мутации прекращают расщепление РНК, см. Также фиг. 97, который демонстрирует, что R597A, 11602Л, R1278A и H1283A прекращают расщепление РНК

[972] Мутанты по домену HEPN продолжают процессировать естественную последовательность (фиг. 95).

Пример 6:

[973] Мутанты по домену HEPN сохраняют целевую связывающую активность, как показано на фиг. 111 (анализ EMSA). Верхний ряд: связывание дикого типа C2c2. Нижний ряд: связывание R1278A с мутантным Lsh C2c2.

[974] Соответствующие остатки в других ортологах C2c2 были идентифицированы структурным выравниванием для идентификации структурных представителей, которые соответствуют либо их экспериментально определенным структурам, либо гомологическим моделям. Фиг. 109 иллюстрирует выравнивание последовательностей следующих ортологов Leptotrichia shahii DSM 19757 C2c2; Rhodohacter capsulatus SB 1003 (RcS); Rhodobacter capsulatus R121 (RcR); Rhodohacter capsulatus 1) 17442 (RcD); Lachnospiraceae bacterium MA2020 (Lb (X)); Lachnospiraceae bacterium NK4A179 (Lb (X), [Clostridium] aminophilum DSM 10710 (CaC), Lachnospiraceae bacteriumNK4A144 (Lb (X), Leptotrichia wadei F0279 (Lew), Leptotrichia wadei F0279 (Lew), Carnobacterium gallinarum DSM 4847 (Cg); Carnobacterium gallinarum DSM 4847 (Cg), Paludibacter propionicigenes WB4 (Pp), Listeria seeligeri serovar l/2b (Ls), Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317 (Liw) и Listeria bacterium FSL M6-0635 (Lib). Фиг. 110 демонстрирует, что ортологи C2c2 сохраняют домены HEPN.

[975] Использование нумерации из консенсусной последовательности, полученной с использованием выравнивания MUSCLE (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) были идентифицированы следующие консервативные остатки: K36, КЗ9, V40, E479, L514, V518, N524, G534, K535, E580, L597, V602, D630, F676, L709, I713, R717 (HEPN), N718, H722 (HEPN), E773, P823, V828, I879, Y880, F884, Y997, L1001, F1009, L1013, Y1093, L1099, L1111, Y1114, L1203, D1222, Y1244, L1250, L1253, K1261, I1334, L1355, L1359, R1362, Y1366, E1371, R1372, D1373, R1509 (HEPN), H1514 (HEPN), Y1543, D1544, K1546, K1548, V1551, 11558. Парное совпадение консервативных остатков в консенсусной последовательности с аминокислотами Leptotrichia wadei C2c2 (последовательность F здесь) представляет собой: K36,K2; K39,K5; V40,V6; E479,E301; L514,L331; V518J335; N524,N341; G534,G351; K535,K352; E580,E375; L597,L392; V602,L396; D630,D403; F676,F446; L709,I466; 1713,1470; R717 (HEPN),R474; N718,H475; H722 (HEPN),H479; E773,E508; P823,P556; V828,L561; 1879,1595; Y880,Y596; F884,F600; Y997,Y669; L1001,I673; F1009,F681; L1013,L685; Y1093,Y761; L1099,L676; L1111,L779; Y1114,Y782; L1203,L836; D1222,D847; Y1244,Y863; L1250,L869; L1253,I872; K1261,K879; 11334,1933; L1355,L954; L1359,I958; R1362,R961; Y1366,Y965; E1371,E970; R1372,R971; D1373,D972; R1509 (HEPN),R1046; H1514 (HEPN), H1051; Y1543,Y1075; D1544,D1076; K1546,K1078; K1548,K1080; V1551,I1083; 11558,11090.

Пример 7: Создание мутантов C2c2 с повышенной специфичностью

[976] Недавно был описан способ создания ортологов Cas9 с повышенной специфичностью (Slaymaker et al., 2015). Эта стратегия может быть использована для повышения специфичности ортологов C2c2. Первичные остатки для мутагенеза - все положительно заряженные остатки в пределах домена HEPN, так как это единственная известная структура в отсутствие кристалла, и известно, что специфичные мутанты по RuvC работали в Cas9. Консервативными остатками аргинина в домене HEPN являются R717 и R1509.

[977] Дополнительные кандидаты представляют собой положительно заряженные остатки, консервативные среди различных ортологов, таких как K2, K39, K535, K1261, R1362, R1372, K1546 и K1548. Они могут быть использованы для получения мутантов C2c2 с повышенной специфичностью.

Пример 8: C2c2 представляет собой однокомпонентный программируемый направленный на РНК РНК-нацеливающий эффектор CRISPR

Таблица А. Последовательности cr-РНК, использованные для экспериментов in vitro.

Таблица В. оцРНК-мишени, использованные в настоящем исследовании

Таблица С. Спейсеры, использованные для экспериментов in vivo.

Гетерологическое реконструирование локуса L. shahii C2c2 в Escherichia coli подтверждает РНК-опосредованный иммунитет против РНК бактериофагов

[978] В качестве первого шага авторы изобретения исследовали, можно ли использовать LshC2c2 для обеспечения иммунитета к MS2 (G. Tamulaitis et al., Programmable RNA shredding by the type 111-A CRISPR-Cas system of Streptococcus thermophilus. Mol Cell 56, 506-517 (2014)), литическому одноцепочечному (ss) РНК-фагу, чей жизненный цикл проходит без образования ДНК-посредника и который легко заражает E. coli. Авторы изобретения сконструировали низкокопийную плазмиду, несущую весь локус LshC2c2 (pLshC2c2), чтобы обеспечить гетерологичное восстановление в E. coli (фиг. 126A). Учитывая, что экспрессированные зрелые cr-РНК из локуса LshC2c2 имеют максимальную длину спейсера 28 нуклеотидов (фиг. 126A) (S. Shmakov et al., Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. Mol. Cell 60, 385-397 (2015)), авторы изобретения синтезировали библиотеку из 3473 спейсерных последовательностей, выбирая все возможные сайты- мишени из 28 нуклеотидов в геноме фага MS2 и клонировали их как спейсеры в последовательность CRISPR pLshC2c2. После трансформации в E.coli клетки были инфицированы MS2 и далее были определены спейсерные последовательности в клетках, выживших в результате инфекции. Клетки, содержащие спейсеры, которые обеспечивают надежную защиту против MS2, будут пролиферировать быстрее, что приведет к обогащению этих спейсеров после роста в течение последующих 16 часов. Ряд спейсеров последовательно обогащался в двух независимых повторностях, что указывало на то, что они обеспечивали сильную защиту против MS2 (107 спейсеров показали> 1,3 log2-кратное обогащение в обеих репликах, фиг. 116B и ФИГ. 127A-B). Анализируя фланкирующие области протоспасера на геноме MS2, соответствующем 107 обогащенным спейсерам, авторы изобретения обнаружили, что спейсеры с G, непосредственно прилегающие к 3'-концу протоспейсера, работали хуже, чем в случае H (то есть A, U или С), что указывает на единый нуклеотидный PAM, H (фиг. 116C и фиг. 127C-D, 128).

[979] Для подтверждения интерференционной активности обогащенных спейсеров авторы изобретения индивидуально клонировали четыре самых обогащенных спейсера в pLshC2c2 последовательностях CRISPR и наблюдали 3-4-log-кратное уменьшение (10³-10⁴) образования бляшек в соответствии с уровнем обогащения, наблюдаемым при скрининге (фиг. 116B и фиг. 129). Чтобы подтвердить PAM, авторы изобретения клонировали шестнадцать направляющих молекул, нацеливающих на различные области гена mat фага MS2 (4 направляющих на один возможный однонуклеотидный PAM). Авторы изобретения обнаружили, что все 16 cr-РНК опосредуют интерференцию MS2, хотя более высокие уровни резистентности наблюдаются для С, A и U PAM-нацеливающих направляющих молекул (фиг. 116D, 116E и фиг,130), что указывает на то, что C2c2 можно эффективно перепрограммировать с помощью cr-РНК для нацеливания на сайты в геноме MS2.

C2c2 является одноэффекторной эндонуклеазой, которая опосредует расщепление оцРНК при помощи одной напрявляющей последовательности cr-РНК

[980] Чтобы проверить, опосредует ли LshC2c2 интерференцию фага, способствуя расщеплению оцРНК, направляемому cr-РНК, авторы изобретения очистили белок LshC2c2 (фиг. 131) и проанализировали его способность расщеплять in vitro мишень оцРНК длиной 173 нуклеотидов (фиг. 117A и фиг. 132), содержащую протоспейсер С-PAM (оцРНК-мишень 1 с протоспейсером 14). Ранее авторы изобретения обнаружили, что зрелые cr-РНК LshC2c2 содержат прямой повтор (DR) длиной 28 нуклеотидов и спейсер длиной 28 нуклеотидов (фиг. 126А) (S. Shmakov et al., Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. Mol Cell 60, 385-397 (2015)), и поэтому авторы изобретения сконструировали транскрибированную invitro cr-РНК со спейсером длинной 28 нуклеотидов, комплементарным протоспейсеру 14 на оцРНК-мишени 1. Авторы изобретения обнаружили, что LshC2c2 эффективно расщепляет оцРНК в условиях, зависящих от хелатируемого Mg2+- и cr-РНК (фиг. 117В и фиг. 133). Чтобы исследовать расщепление субстратов дцРНК, авторы изобретения произвели отжиг комплементарных олигонуклеотидов РНК в областях, фланкирующих сайт мишени cr-РНК. Этот частично двухцепочечный РНК-субстрат не был расщеплен LshC2c2, что указывает на его специфичность для оцРНК (фиг. 134A-B).

[981] Чтобы далее охарактеризовать ограничения, накладываемые последовательностью на расщепление РНК белком LshC2c2, авторы изобретения проверили дополнительные cr-РНК, комплементарные различным версиям оцРНК-мишени l, где протоспейсеру 14 предшествует каждый из вариантов PAM. Результаты этого эксперимента подтвердили предпочтение С, А и U PAM-последовательностей с небольшой активностью расщепления, обнаруженной для мишени с G PAM (фиг. 117C). Кроме того, авторы изобретения разработали 5 cr-РНК для каждого возможного PAM (всего 20) для оцРНК-мишени 1 и оценили ферментативную активность для LshC2c2 в паре с каждой из этих cr-РНК. Как и ожидалось, авторы изобретения обнаружили меньшую активность расщепления для G-PAM, нацеливающих cr-РНК, по сравнению с другими тестируемыми cr-РНК (фиг. 117D).

[982] LshC2c2 тестировали на активность по расщеплению ДНК in vitro. Авторы изобретения создали библиотеку дц ДНК-плазмид с протоспейсером 14, которому предшествовали 7 случайных нуклеотидов для учета любых требований к PAM. При инкубировании с белком LshC2c2 и в случае комплементарности cr-РНК протоспейсеру 14, никакого расщепления библиотеки плазмиды дцДНК не наблюдалось (фиг. 134C). Авторы изобретения также не наблюдали расщепления при нацеливании на оцДНК-версию оцРНК-мишени 1 (фиг. 134D). Дабы исключить совместное транскрипционное расщепление ДНК, которое наблюдалось в системах CRISPR-Cas типа III (P. Samai et al., Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage during Type III CRISPR-Cas Immunity. Cell 161, 1164-1174 (2015)), авторы изобретения повторили анализ ко-транскрипционного расщепления РНК-полимеразы в E. coli (P. Samai et al., Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage during Type III CRISPR-Cas Immunity. Cell 161, 1164-1174 (2015)) (фиг. 135A), экспрессирующий оцРНК-мишень из ДНК-субстрата. Используя этот способ анализа с очищенным LshC2c2 и cr-РНК, тартерирующую оцРНК-мишень 1, авторы изобретения все рано не наблюдали никакого расщепления ДНК (фиг. 135B). В целом, эти результаты показывают, что C2c2 расщепляет специфические сайты оцРНК, направленные комплементарностью к мишени, закодированной в cr-РНК, при 3' H PAM.

Ферментативная активность C2c2 зависит от последовательности-мишени и вторичной структуры

[983] Учитывая неэффективность C2c2 при расщеплении дцРНК и тот факт, что оцРНК образует сложные вторичные структуры, авторы изобретения полагали, что на расщепление C2c2 может влиять вторичная структура мишени оцРНК. При конструировании различных cr-РНК для всех возможных участков на оцРНК-мишени 1 (фиг. 117D) такая же картина расщепления наблюдалась независимо от положения cr-РНК вдоль РНК-мишени, что указывало на то, что зависимое от cr-РНК расщепление определялось некоторыми признаками последовательности-мишени, а не расстоянием от места взаимодействия. Авторы изобретения предположили, что комплекс LshC2c2-cr-РНК связывает мишень и расщепляет открытые области вторичных структурных элементов оцРНК, демонстрируя потенциальное предпочтение для некоторых нуклеотидов. Авторы изобретения проанализировали эффективность расщепления мишеней гомополимерной РНК (протоспейсер длиной 28 нуклеотидов, увеличенный при помощи 120 нуклеотидов A или U, регулярно перемежающихся с одиночными основаниями G или C, чтобы обеспечить синтез олигонуклеотида, и обнаружили, что LshC2c2 предпочтительно расщепляет мишень урацила по сравнению с аденином (фиг. 118А-В). Чтобы оценить влияние РНК-мишени на картину расщепления, авторы изобретения протестировали расщепление трех мишеней оцРНК с различными последовательностями, фланкирующими постоянный протоспейсер длиной 28 нуклеотидов, и обнаружили три различных типа расщепления (фиг. 118C). Секвенирование РНК продуктов расщепления для трех мишеней показало, что сайты расщепления в основном локализованы в богатых урацилом областях оцРНК или участках соединения оцРНК-дцДНК внутри предсказанных in silico участков со-фолдинга последовательности-мишени при помощи cr-РНК (фиг. 118D-I).

HEPN-домены C2c2 опосредуют РНК-направляемое расщепление оц-РНК

[984] Предшествующий анализ C2c2 проведенный способами биоинформатики предположил, что домены HEPN потенциально ответственны за наблюдаемую нами каталитическую активность (S. Shmakov et al., Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. Mol Cell 60, 385-397 (2015)). Каждый из двух доменов HEPN эффектора C2c2 содержит диаду консервативных остатков аргинина и гистидина (фиг. 119A), что согласуется с каталитическим механизмом HEPN эндо-РНК-азы endoRNAse (V. Anantharaman, K. S. Makarova, A. M. Burroughs, E. V. Koonin, L. Aravind, Comprehensive analysis of the HEPN superfamily: identification of novel roles in intra-genomic conflicts, defense, pathogenesis and RNA processing. Biol Direct 8, 15 (2013); O. Niewoehner, M. Jinek, Structural basis for the endoribonuclease activity of the type III-A CRISPR-associated protein Csm6. RNA 22, 318-329 (2016); N. F. Sheppard, С. V. Glover, 3rd, R. M. Terns, M. P. Terns, The CRISPR-associated Csx1 protein of Pyrococcus furiosus is an adenosine-specific endoribonuclease. RNA 22, 216-224 (2016)). Чтобы проверить, необходимы ли эти предсказанные каталитические остатки для обеднения оцРНК in vivo, путем внесения мутаций авторы изобретения отдельно заменили каждый участок на аланин (R597A, H602A, R1278A, H1283A) в локусных плазмидах LshC2c2 и анализировали на наличие интерференции MS2. Ни одна из четырех мутантных плазмид не могла защитить E.coli от проникновения фага в клетку (фиг. 119B и фиг. 136).

[985] Для подтверждения этих результатов in vitro четыре мутантных белка c точечной мутацией были очищены и протестированы на наличие способности расщеплять 5'-концевую меченую мишень оцРНК 1 (фиг. 119C). Полностью подтверждая результаты, полученные авторами изобретения in vivo, все четыре мутации отменяли реакцию расщепления. Неспособность любого из двух доменов HEPN дикого типа компенсировать инактивацию другого подразумевает совместную работу двух доменов, что согласуется с наблюдениями, что в качестве димеров функционируют несколько бактериальных и эукариотических одиночных HEPN-белков (O. Niewoehner, M. Jinek, Structural basis for the endoribonuclease activity of the type Ш-А CRISPR-associated protein Csm6. RNA. 22, 318-329 (2016); N. F. Sheppard, С. V. Glover, 3rd, R. M. Terns, M. P. Terns, The CRISPR- associated Csx1 protein of Pyrococcus furiosus is an adenosine-specific endoribonuclease, RNA 22, 216-224 (2016); G. Kozlov et al., Structural Basis of Defects in the Sacsin HEPN Domain Responsible for Autosomal Recessive Spastic Ataxia of Charlevoix-Saguenay (ARSACS). I Biol Chem 286, 20407-20412 (2011)).

[986] Каталитически неактивные варианты Cas9 сохраняют способность к связыванию с ДНК-мишенью, что позволяет создавать программируемые ДНК-связывающие белки (G. Gasilinas, R. Barrangou, P. Horvath, V, Siksnys, Cas9-cr-РНК ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 109, E2579-2586 (2012); M. Jinek et al., A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012)). Для определения того, являются ли связывание с мишенью и активность расщепления LshC2c2 таким же образом разделяемыми, анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) были выполнены как на диком типе (фиг. 119D), так и с R1278A-мутантом LshC2c2 (фиг. 119E) в комплексе с cr-РНК. Комплекс LshC2c2 дикого типа демонстрировал сильное связывание (KD ~46 нМ, фиг. 137A), в частности, с мишенью 10 оцРНК, но не с не-мишенью оцРНК (обратно комплементарной мишени 10 оцРНК). У мутантного C2c2 комплекса R1278A обнаружено еще более сильное (KD ~7 нМ, фиг. , 137B) специфическое связывание, что указывает на то, что эта мутация домена HEPN приводит к каталитически неактивному РНК-программируемому РНК-связывающему белку. Только белок LshC2c2 или только cr-РНК по отдельности показали существенно уменьшенные уровни сродства к мишени, как и ожидалось (фиг. 137C-E).

[987] Эти результаты демонстрируют, что C2c2 расщепляет РНК с использованием каталитического механизма, отличного от других известных CRSSPR-ассоциированных РНК-аз. В частности, мультибелковые комплексы Csm и Cmr типа III основаны на кислых остатках каталитических доменов RRM, тогда как C2c2 расщепляет РНК с помощью консервативныхи основных остатков двух его доменов HEPN.

Структурные требования и необходимые последовательности для cr-РНК C2c2

[988] Подобно системам типа V-B (Cpf1) (B. Zetsche et al., Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell 163, 759-771 (2015) cr-РНК LshC2c2 содержит единственную шпильку в прямом повторе (DR), поэтому можно предположить, что вторичная структура cr-РНК облегчает взаимодействие с LshC2c2. Для изучения такой возможности, авторы изобретения сначала исследовали требования к длине спейсерной последовательности для расщепления оцРНК и обнаружили, что LshC2c2 требует спейсеров длиной не менее 22 нуклеотидов для эффективного расщепления мишени 1 оцРНК (фиг. 120A). Авторы изобретения также обнаружили, что структура шпильки cr-РНК имеет определяющее значение для расщепления оцРНК, поскольку укорочение прямых повторов (DR) нарушало структуру шпильки, а следовательно, и отменяло расщепление мишени (фиг. 120B). Таким образом, требуется DR более 24 нуклеотидов длиной для поддержания структуры шпильки, необходимой LshC2c2 для опосредованного расщепления оцРНК.

[989] Затем авторы изобретения изучили влияние модификаций в стебле и петле прямых повторов cr-РНК на активность расщепления. Одиночные инверсии в парах оснований стебля, при которых он сохранял свою структуру, не влияли на активность комплекса LshC2c2, но инвертирования всех четырех пар G-C в стебле прекращало расщепление, несмотря на сохранение структуры дуплекса (фиг. 121 А). Другие видоизменения, которые привносили изломы и уменьшали или увеличивали спаривание оснований в стебле, также приводили к полному прекращению или значительному подавлению расщепления, делая возможным предположение, что длина стебля cr-РНК важна для образования комплекса (с LshC2c2) и активности расщепления (фиг. 121 A). Посредством ряда модификаций авторы изобретения обнаружили, что удаление петель прекращает процесс расщепления, тогда как вставки и замены в основном поддерживают некоторый уровень активности расщепления (фиг. 121B). В целом эти результаты показывают, что LshC2c2 распознает структурные характеристики родственной ему cr-РНК, но допускает возможность как вставки петель, так и других протестированных замен оснований. Эти результаты имеют значение для дальнейшей разработки и применения инструментов на основе C2c2, для которых требуется разработка направляющих (guide) молекул для привлечения эффекторов или модулирования активности (S. Kiani et al., Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nat Methods 12, 1051-1054 (2015); S. Konermann et al., Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 517, 583-588 (2015); J. E. Dahlman et al., Orthogonal gene knockout and activation with a cataiytically active Cas9 nuclease. Nat Biotechnol 33, 1159-1161 (2015)).

Расщепление при помощи C2c2 чувствительно к двойным нарушениям комплементарности в дуплексе cr-РНК-мишени

[990] Авторы изобретения проверили чувствительность системы LshC2c2 на возможность продолжать активность при единичных нарушениях комплементарности между направляющей cr-РНК и РНК-мишенью путем мутации отдельных оснований на всей длине спейсера соответствующими изменениями комплементарных оснований (например, A на U) и количественного образования бляшек с этими некомплементарными спейсерами при заражении фагом MS2 (фиг. 122A и фиг. 138). Авторы изобретения обнаружили, что C2c2 полностью толерантен к единичным нарушениям комплементарности по длине спейсера, поскольку такие некомплементарные спейсеры препятствуют распространению фага с такой же эффективностью, как и полностью комплементарные спейсеры. Однако, когда авторы изобретения вводили последовательные двойные замены в спейсер, авторы изобретения обнаружили сокращение эффективности защиты в 1000 раз ~при некомплементарности в центре, но не на 5'- или 3'-конце, cr-РНК (фиг. 122B и фиг. 138). Это наблюдение указывает на наличие чувствительной к рассогласованию в области затравки в центре дуплекса cr-РНК-мишени.

[991] Авторы изобретения также оценили необходимые LshC2c2 условия для связывания направляющей и последовательности-мишени in vitro. С этой целью авторы изобретения создали множество транскрибируемых in vitro cr-РНК с нарушениями комплементарности, расположенными одинаково на всей длине спейсера. При проведении инкубации с белком LshC2c2 все единичные нарушения комплементарности в cr-РНК не приводили к нарушениям расщепления (фиг. 122C), что согласуется с результатами, полученными авторами изобретения in vivo. При тестировании при помощи набора последовательных двойных мутантных cr-РНКs, LshC2c2 был неспособен расщеплять РНК-мишень, в случае локализации нарушений в центре, но не на 5'- или 3'-конце cr-РНК (фиг. 122D), что подтверждает существование сердцевинной области-затравки.

[992] Была также оценена чувствительность системы LshC2c2 к двойным и тройным нарушениям комплементаности. Двойные несоответствия были локализованы в разных местах (фиг. 143A), тогда как тройные несоответствия были расположены последовательно (фиг. 143B). Было показано, что чувствительность расщепления зависит от расположения нарушения комплементарности. Нарушения комплементарности, близкие к области прямых повторов (DR), не способствовали расщеплению мишени, тогда как дистальные приводили к обнаружимому расщеплению.

[993] Система LshC2c2 также чувствительна к нарушениям комплементарности и делециям в области прямого повтора. Единичные нарушения комплементарности и одиночные делеции оснований, как правило, достаточны, чтобы нарушить расщепление оцРНК. Только одно нарушение комплементарности (мутант 7) все же позволяло сохранить низкий уровень расщепления (фиг. 144).

C2c2 может быть перепрограммирован для опосредования специфичного нокдауна мРНК in vivo

[994] Учитывая способность C2c2 расщеплять оцРНК-мишень специфичным к последовательности cr-РНК образом, авторы изобретения проверили, можно ли перепрограммировать LshC2c2 для деградации выбранных нефаговых мишеней оцРНК и, в частности, мРНК in vivo. С этой целью авторы изобретения одновременно трансформировали E. coli с помощью плазмиды, кодирующей LshC2c2, и cr-РНК, нацеливающей на мРНК красного флуоресцентного белка (RFP), а также совместимой плазмиды, экспрессирующей RFP (фиг. 123A). Авторы изобретения наблюдали уменьшение RFP-положительных клеток примерно на 20% до 92% для cr-РНК, нацеливающей на протоспейсеры, фланкированные С, A или U-PAM для образцов, совпадающих по оптической плотности (фиг. 123B, C). В качестве контроля авторы изобретения тестировали cr-РНК, содержащие обратно комплементарные последовательности (нацеливающие на дцДНК-плазмиду) к наиболее эффективным нацеленным на мРНК спейсерам RFP. Как и ожидалось, авторы изобретения не наблюдали снижения флуоресценции RFP при воздействии cr-РНК (фиг. 123B). Авторы изобретения также подтвердили, что мутация каталитических остатков аргинина в домене HEPN до аланина исключает нокдаун RFP (фиг. 139). Таким образом, C2c2 способен к общему перенацеливанию на произвольные субстраты оцРНК, регулируемые только предсказуемыми взаимодействиями нуклеиновых кислот.

[995] Когда авторы изобретения исследовали скорость роста клеток, имеющих спейсер, нацеливающий на RFP, с наибольшим уровнем нокдауна RFP, авторы изобретения заметили, что скорость значительно уменьшилась (фиг. 123 A, спейсер 7). Чтобы определить причину этого ограничения роста, авторы изобретения исследовали, было ли влияние на рост опосредовано активностью LshC2c2 по нацеливанию на мРНК RFP путем введения плазмиды, индуцируемой RFP, и с локуса LshC2c2, нацеленного на RFP, в E.coli. Используя эту систему, авторы изобретения обнаружили, что при индукции транскрипции RFP клетки с нокаутом RFP показали существенное подавление роста, которое не наблюдалось при контрольных экспериментах без нацеливания (фиг. 123D, E). Однако при отсутствии транскрипции RFP авторы изобретения не наблюдали ограничения роста, так же, как не наблюдали зависимого от транскрипции нацеливания на ДНК биохимическом эксперименте (фиг. 135), что позволяет предположить, что нацеливание на РНК, вероятно, является основным фактором появления этого фенотипа с ограничением роста. Не ограничиваясь только теорией, одним из возможных объяснений этого эффекта является то, что системы CRISPR с эффекторным белком C2c2 могут функционировать для предотвращения размножения вируса, неспецифично расщепляя клеточные мРНК и индуцируя снижение клеточного деления, запрограммированную гибель клеток (PCD) или состояние покоя ((K. S. Makarova, Y. I. Wolf, E. V. Koonin, Comprehensive comparative-genomic analysis of type 2 toxin-antitoxin systems and related mobile stress response systems in prokaryotes. Biol Direct 4, 19 (2009); F. Hayes, L. Van Melderen, Toxins-antitoxins: diversity, evolution and function. Crit Rev Biochem Mol Biol 46, 386-408 (2011)).

C2c2 расщепляет побочную РНК в дополнение к оцРНК, на которую нацелена cr-РНК

[996] По сравнению с Cas9 и Cpf1, которые расщепляют ДНК внутри гетеродуплекса мишени cr-РНК в определенном положении, возвращаясь в неактивное состояние после расщепления, C2c2 расщепляет РНК-мишень вне сайта связывания cr-РНК на разных расстояниях в зависимости от фланкирующей последовательности, предположительно в пределах выступающих петель оцРНК (фиг. 118D-I). Эта наблюдаемая гибкость в расщеплении позволяет нам рассмотреть возможность расщепления соседних нецелевых оцРНК при связывании и активации мишеней C2c2. Соответственно, C2c2 может вызывать PCD через механизм из двух составляющих: стадию прайминга, в которой комплексы C2c2-cr-РНК связываются с целевыми сайтами и расщепляют оцРНК, направляемые cr-РНК, на второй стадии, в которой праймированный C2c2 расщепляет нецелевую, побочную РНК неспецифически. Чтобы проверить эту гипотезу, авторы изобретения проводили реакции расщепления in vitro, которые включали, помимо LshC2c2, cr-РНК и ее РНК-мишень, одну из четырех несвязанных с ними молекул РНК без какой-либо комплементарностью к направляющей cr-РНК (фиг. 124A). Эти эксперименты показали, что, в то время как комплекс LshC2c2-cr-РНК не опосредовал расщепление любой из четырех коллатеральных (побочных) РНК в отсутствие целевой РНК, все четыре были эффективно деградированы в присутствии целевой РНК (фиг. 124B и фиг. 140А). Кроме того, мутанты R597A и R1278A по домену HEPN не смогли отщеплять побочную РНК (фиг. 140B). Эти результаты указывают на HEPN-зависимый механизм, посредством которого C2c2 в комплексе с cr-РНК активируется при связывании с целевой РНК и затем расщепляет любые ближайшие оцРНК-мишени. Такое неизбирательное расщепление РНК может вызывать цитотоксичность, что приводит к наблюдаемому ингибированию роста. Эти данные указывают на то, что в дополнение к их роли в прямом подавлении РНК-вирусов системы CRISPR-Cas типа VI могут функционировать в качестве медиаторов различного рода индукции программируемой клеточной гибели (PCD)/покоящегося состояния, которые специфически инициируются распознаваемыми чужеродными геномами (фиг. 125). Согласно этому сценарию, состояние покоя замедляло бы инфекцию и предоставляло бы дополнительное время адаптивному иммунитету для подавления инфекции; в случае неуспеха адаптивного иммунитета, суицидальная роль C2c2 будет преобладать, и распространение инфекции будет ограничено. Такой механизм входит в ранее предложенную схему связи между адаптивным иммунитетом и программируемой клеточной гибелью (PCD) во время защитной реакции CRISPR-Cas (K. S. Makarova, V. Anantharaman, L. Aravind, E. V. Koonin, Live virus-free or die: coupling of antivirus immunity and programmed suicide or dormancy in prokaryotes. Biol Direct 7, 40 (2012)).

Пример 8: Экспрессия C2c2 в эукариотических клетках

[997] Ряд ортологов C2c2 были кодон-оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих с использованием вектора экспрессии млекопитающих. Различные ортологи C2c2 были трансфицированы в клетки HEK293T, и клеточную локализацию оценивали на основе экспрессии mCerry. Наблюдалась локализация цитоплазмы, а также ядерная локализация белка C2c2.

Пример 9: Активность C2c2 в эукариотических клетках

[998]. Анализ нацеливания на люциферазу проводили с различными гРНК, направленными против белка C2c2. Наблюдался эффективный нокдаун.

[999] Анализ нацеливания на основе экспрессии GFP выполнялся с помощью гРНК, нацеленных против EGFP. Экспрессию GFP определяли и сравнивали с ненацеливающей РНК (NT). Здесь тоже наблюдался эффективный нокдаун.

[1000] Анализ нацеливания проводили на разных эндогенных генах-мишенях в клетках HEK293 вместе с гРНК, направленными против эндогенных генов-мишеней C2c2. Определяли экспрессию белка соответствующих генов-мишеней (по сравнению с ненацеливающей (NT) гРНК). Наблюдался эффективный нокдаун различных генов-мишеней.

Методология для раздела примеры

Клонирование локуса С2с2 и библиотеки скрининга

[1001] Геномная ДНК из Leptotrichia shahii DSM 19757 (ATCC) была экстрагирована при помощи набора Blood & Cell Culture DNA Mini Kit (Qiagen), а локус С2с2 CRISPR был амплифицирован ПЦР и клонирован в остов pACYC184 с устойчивостью к хлорамфениколу. Для перенацеливания на локус фага MS2 или эндогенные мишени спейсеры дикого типа удаляли из последовательности или заменяли посадочной площадкой ECO31I, дополненной спейсером и вырожденным повтором, совместимым с клонированием Golden Gate.

[1002] Пользовательская библиотека, состоящая из всех возможных спейсеров, нацеленных на геном бактериофага MS2, за исключением спейсеров, содержащих сайт рестрикции Eco31I, была синтезирована при помощи Twist Biosciences, клонированной в остов для перенацеливания клонированием Golden Gate, трансформированную в электрокомпетентные клетки Endura Duo (Lucigen) и затем очищенной с использованием NucleoBond XtraMaxiPrep EF (Machery-Nagel).

Бактериальный анализ интерференции

[1003] Для фагового скрининга 50 нг библиотеки плазмид трансформировали в компетентные клетки NovaBlue(DE3) (EMD Millipore) с последующим разрастания при 37°C в течение 30 минут. Затем клетки выращивали в Luria broth (LB), дополненном 25 мкг/мл хлорамфениколом (Sigma) в объеме 4,5 мл. Условия для культивирования фага обрабатывали 7×10¹⁰ б.о.е. бактериофага MS2 (ATCC). После 3 часов инкубирования при встряхивании при 37°C образцы наносили на чашки с агаром Луриа-Бертани (LB-agar), дополненные хлорамфениколом, и отбирали через 16 часов. ДНК была выделена с использованием NucleoBond Xtra Maxi Prep EF (Machery-Nagel), амплифицирована ПЦР и секвенирована с использованием MiSeq (Illumina) с набором парных концов на 150 циклов.

[1004] Для определения обогащенных спейсеров, спейсерные области были извлечены, подсчитаны и нормализованы на общее число считываний для каждого образца. Для данного PAM обогащение измеряли, как логарифмическое отношение в сравнении с исходной библиотекой с корректировкой псевдоотсчета 0,01. PAM выше порога обогащения 1,3, которые встречались в обоих биологических повторениях, были использованы для создания логотипов последовательностей (G. E. Crooks, G. Hon, J. M. Chandonia, S. E. Brenner, Web Logo: a sequence logo generator. Genome research 14, 1188- 1190 (2004)).

[1005] Для тестирования отдельных спейсеров на интерференцию фага MS2 олигонуклеотиды были заказаны из IDT, был произведен их отжиг, фосфорилирование полинуклеотид-киназой (New England Biosciences) и клонирование в остов локуса с помощью клонирования Golden Gate. Плазмиды трансформировали в штамм E.coli C3000, который был сделан компетентным с помощью набора Mix and Go kit (Zymo Research). Клетки С3000 высевались из культуры, полученной в течение ночи до OD600 равного 2, после чего были разведены 1:13 в Top Agar и помещены на чашки с LB-хлорамфениколом. Разведения фага MS2 были нанесены на чашки с помощью многоканальной пипетки и образование бляшек было зарегистрировано после инкубирования в течение ночи.

Анализ нацеливания на RFP

[1006] Устойчивая к ампициллину RFP-экспрессирующая плазмида (pRFP) была трансформирована в клетки DH5-alpha (New England Biolabs). Клетки, содержащие pRFP, затем были сделаны химически компетентными (Zymo Research Mix и Go) для использования в экспериментах по нацеливанию в нисходящем направлении с pLshC2c2. Спейсеры, нацеливающие на мРНК RFP, были клонированы в pLshC2c2, и эти плазмиды были трансформированы в химически компетентные клетки DH5-alpha pRFP. Затем клетки культивировали в течение ночи при двойном отборе в LB и подвергали анализу с помощью проточной цитометрии, когда они достигли OD600 4,0. Эффективность нокдауна была определена количественно как процент RFP-положительных клеток по сравнению с ненацеливающим спейсером в контроле (эндогенный локус LshC2c2 в pACYC184).

[1008] Для определения влияния активности LshC2c2 на рост клеток, авторы изобретения создали TetR-индуцируемую версию плазмиды RFP в pBR322 (pBR322_RFP). Авторы изобретения трансформировали клетки E.coli с этим вектором и затем сделали их химически компетентными (Zymo Research Mix and Go), чтобы подготовить к дальнейшим экспериментам. Авторы изобретения клонировали плазмиды pLshC2c2 с различными спейсерами, нацеленными на мРНК RFP, а также обратно комплементарными им контрольными спейсерами и трансформировали их в E.coli, несущую pBR322_RFP и просеивали их на чашки двойного отбора для поддержания обеих плазмид. Колонии затем собирали и культивировали в течение ночи в LB с двойным отбором. Бактерии разводили до OD600 0,1 и выращивали при температуре 37°С в течение часа с отбором только на устойчивость к хлорамфениколу. Затем экспрессию RFP вызывали использованием 350 нг/мл ангидротетрациклина, а измерения OD проводили каждые 5 минут при непрерывном встряхивании в ридере микропланшетов BioTek Synergy 2.

Получение нуклеиновой кислоты С2с2

[1009] Кодон-оптимизированный для экспрессии в млекопитающих ген С2с2 (Leptotrichia shahii) был синтезирован и клонирован в бактериальную экспрессионную плазмиду. Клетки E.coli (BL21(DE3)) были трансформированы и культивированы в течение одной ночи при температуре 37°С. Белок был очищен при помощи гистидиновых меток и аффинной хроматографии с колонками с Ni-NTA и затем дополнительно очищен при помощи гель-фильтрации FPLC.

[1010] Матрицы нуклеиновой кислоты для транскрипции Т7 были синтезированы из IDT. Был произведен отжиг матриц cr-РНК до короткого праймера Т7 и инкубация с полимеразой Т7 в течение ночи при температуре 30°С.

[1011] 5'-концевое мечение была выполнена с использованием 5'-олигонуклеотидного набора (VectorLabs) и с зондом maleimide-IR800 (Licor). 3'-концевое мечение было выполнено с использованием 3'-олигонуклеотидного набора (Sigma) с использованием ddUTP-Cy5. Маркированные зонды были очищены с использованием колонок Clean and Concentrator (Zymo).

Очистка белка С2с2

[1012] Кодон-оптимизированный для экспрессии в млекопитающих ген C2c2 (Leptotrichia shahii) был синтезирован (GenScript) и клонирован в бактериальный экспрессирующий вектор (6-His-MBP-TEV-Cpf1, вектор на основе pET, любезно предоставленный нам Doug Daniels). 12 литров культуральной среды Terrific Broth growth с 100 мкг/мл ампициллина инокулировали с 10 мл культуры One Shot® BL21(DE3)pLysE (Invitrogen), содержащей конструкцию для экспрессии LshC2c2, на протяжении ночи. Культуральную среду и инокулянт выращивали при температуре 37°С до тех пор, пока плотность клеток не достигала OD600 0,2, затем температуру снижали до 21°С. Рост клеток продолжался до достижения OD600 0,6, когда была добавлена конечная концентрация 500 мкМ IPTG для индуцирования экспрессии MBP-C2c2. Культуру индуцировали в течение 14-18 часов перед отбором клеток и замораживанием до -80°С перед очисткой.

[1013] Клеточную массу ресуспендировали в 200 мл буфера для лизиса (50 мкМ Hepes pH 7, 2M NaCl, 5 мМ MgCl2, 20 мМ имидазола), дополненного ингибиторами протеазы (Roche cOmplete, свободный от EDTA) и лизоцимом. После гомогенизации клетки лизировали ультразвуком (Branson Sonifier 450), затем центрифугировали при 10000g в течение 1 часа, чтобы очистить лизат. Лизат фильтровали через 0,22-микронные фильтры (Millipore, Steric-up), нанесенные на Ni-NTA-сверхчистую никелевую смолу (Qiagen), промывали, а затем элюировали в градиенте имидазола. Фракции, содержащие белок ожидаемого размера, объединяли, добавляли протеазу TEV (Sigma) и образец диализировали в течение одной ночи в TEV-буфере (500 мкМ NaCl, 50 мМ Hepes pH 7,5 мМ MgCl, 2 мМ DTT). После диализа расщепление TEV подтверждали SDS-PAGE и образец концентрировали до 500 мкл перед загрузкой на гель-фильтрационную колонку (HiLoad 16/600 Superdex 200) через FPLC (АКТА Pure). Фракции гель-фильтрации анализировали с помощью SDS-PAGE; фракции, содержащие C2c2, объединяли и концентрировали до 200 мкл и либо использовали непосредственно для биохимических анализов, либо замораживали при -80°C для хранения. Стандарты для гель-фильтрации использовались на той же колонке, уравновешенной в 2 М NaCl, Hepes pH 7,0 для расчета приблизительного размера LshC2c2.

Подготовка нуклеиновой кислоты-мишени

[1014] ДНК-олиго-матрицы для транскрипции T7 были заказаны из IDT. Матрицы для cr-РНК отжигали на коротком праймере T7 и инкубировали с T7-полимеразой в течение ночи при 30°C с использованием набора для синтеза РНК HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis (New England Biolabs). Матрицы-мишени были амплифицировали ПЦР с получением дцДНК и затем инкубированы с T7-полимеразой при 30°C в течение ночи с использованием того же набора.

[1015] 5'-концевое мечение было проведено с использованием 5'-олигонуклеотидного набора (VectorLabs) и с зондом maleimide-IR80Q (Licor). 3'-концевое мечение было проведено с использованием 3'-олигонуклеотидного набора для маркировки (Sigma) с использованием ddUTP-Cy5. Маркированные зонды очищали с использованием колонок Clean и Concentrator (Zymo Research).

Способы исследования нуклеазы

[1016]. Анализ нуклеазы проводили с 160 нМ меченной на конце оцРНК-мишени. 200 нМ очищенного LshC2c2 и 100 нМ cr-РНК, если не указано иначе, в буфере для анализа нуклеазы (40 мМ Трис-HCl, 60 мМ NaCl, 6 мМ MgCl2, pH 7,3). Реакции проводили в течение 1 часа при 37°C (если не указано иное), а затем останавливали протеиназой К и ЭДТА в течение 15 минут при 37°С. Реакции затем денатурировали денатрурирующим буфер 6 М мочевины при 95°С в течение 5 минут. Образцы анализировали с помощью гель-электрофореза с 10% PAGE и TBE-мочевиной при 45°C. Гели были визуализированы с помощью сканера Licor Odyssey.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

[1017] Эксперименты по связыванию оцРНК-мишени выполнялись с помощью серии полулогарифмических разведений (cr-РНК и LshC2c2) с концентрациями от 2 мкМ до 0,2 пМ (или от 1 мкМ до 0,1 пМ в случае LshC2c2 R1278A). Анализ связывания проводили в буфере для определения нуклеазы, дополненном 10 мМ ЭДТА, для предотвращения разрезания, 5% глицерина и 10 мкг/мл гепарина во избежание неспецифических взаимодействий комплекса с РНК-мишенью. Реакции инкубировали при 37°С в течение 20 минут, затем они были разрешены на 6% гелях PAGE TBE при 4°C (используя буфер 0,5X TBE). Гели были визуализированы с помощью сканера Licor Odyssey.

NGS in vitro расщепленной РНК

[1018] Способы на определение нуклеазы in vitro проводили, как описано выше, с использованием немаркированных мишеней оцРНК. Через час реакцию останавливали при помощи протеиназы К+ЭДТА, а затем очищали в колонке (Zymo Clean с концентратором). Образцы РНК были затем обработаны PNK и 5'-полифосфатазой (Epicenter) перед подготовкой библиотеки для NGS с использованием NEBNext Small RNA Library Prep Set для секвенирования с помощью Illumina. Библиотеки были секвенированы на Illumina MiSeq с достаточной глубиной и проанализированы с использованием инструмента для выравнивания BWA (H. Li, R. Durbin, Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754-1760 (2009)).

Анализ расщепления ко-транскрипционной ДНК in vitro

[1019] Анализ котранскрипционного расщепления ДНК комплексом RNAP в E. coli, проводился так, как описано ранее (Samai et al., Cell, 2015). В кратком изложении, для 0,8 пмоль цепи оцДНК-матрицы проводили отжиг 1,6 пмоль РНК в буфере транскрипции (из центральной части фермента RNAP E. coli New England Biolabs) без магния для предотвращения гидролиза РНК. Реакцию проводили с 0,75 мкл коровой части фермента RNAP E. coli и магния, инкубировали при 25°C в течение 3 минут, а затем переносили на 37°C. Добавляли 1 пмоль свежеденатурированной некодирующей цепи (NTS) и инкубировали при 37°C в течение 15 минут для получения элонгационных комплексов (EC). К EC добавляли 4 пмоль комплексов LshC2C2-cr-РНК вместе с 1,25 мМ RNTP, и транскрипции давали возможность протекать 1 ч при 37°C. ДНК была разведена в 10%-гелях PAGE TBE-Urea после обработки РНК-азой и протеиназой К.

[1020] Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были продемонстрированы и описаны в настоящем описании, специалистам в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления предоставляются только в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены теперь могут быть разработаны специалистами в данной области без отступления от изобретения. Следует понимать, что различные альтернативы вариантам осуществления изобретения, описанным в настоящем описании, могут быть использованы при осуществлении изобретения. Предполагается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем изобретения и что способы и структуры, входящие в объем этих притязаний и их эквиваленты, будут охвачены таким образом.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> The Broad Institute, Inc.

The United States of America, as represented by the

Secretary, Department of Health and Human Services

Massachusetts Institute of Technology

President and Fellows of Harvard College

Rutgers, The State University of New Jersey

Skolkovo Institute of Science and Technology

Severinov, Konstantin

Zhang, Feng

Wolf, Yuri I.

Shmakov, Sergey

Semenova, Ekaterina

Minakhin, Leonid

Makarova, Kira S.

Koonin, Eugene

Konermann, Silvana

Joung, Julia

Gootenberg, Jonathan S.

Abudayyeh, Omar O.

Lander, Eric S.

<120> NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS

<130> BROD-3480US1

<140> US 15/482,603

<141> 2017-04-07

<150> PCT/US2016/038258

<151> 2016-06-17

<150> US 62/320,231

<151> 2016-04-08

<150> US 62/296,522

<151> 2016-02-17

<150> US 62/285,349

<151> 2015-10-22

<150> US 62/181,675

<151> 2015-06-18

<160> 2233

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Simian virus 40

<400> 1

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> source

<222> (1)..(16)

<223> /note="Description of Unknown: Nucleoplasmin bipartite NLS

sequence"

<400> 2

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> source

<222> (1)..(9)

<223> /note="Description of Unknown: C-myc NLS sequence"

<400> 3

Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> source

<222> (1)..(11)

<223> /note="Description of Unknown: C-myc NLS sequence"

<400> 4

Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro

20 25 30

Arg Asn Gln Gly Gly Tyr

35

<210> 6

<211> 42

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> source

<222> (1)..(42)

<223> /note="Description of Unknown: IBB domain from importin-alpha

sequence"

<400> 6

Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys

20 25 30

Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val

35 40

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> source

<222> (1)..(8)

<223> /note="Description of Unknown: Myoma T protein sequence"

<400> 7

Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> source

<222> (1)..(8)

<223> /note="Description of Unknown: Myoma T protein sequence"

<400> 8

Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu

1 5

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro

1 5 10

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 11

Asp Arg Leu Arg Arg

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 12

Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Hepatitis delta virus

<400> 13

Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys

1 5 10 15

Lys Ser Lys Lys

20

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys

1 5 10 15

Lys

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> source

<222> (1)..(4)

<223> /note="Description of Unknown: 'KDEL' family motif peptide"

<400> 17

Lys Asp Glu Leu

1

<210> 18

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 18

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 19

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 20

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 21

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 21

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

<210> 22

<211> 60

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

50 55 60

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Aminohexanoyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Aminohexanoyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Aminohexanoyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Aminohexanoyl

<400> 23

Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg

1 5 10

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 24

gagtccgagc agaagaagaa 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25

gagtcctagc aggagaagaa 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 26

gagtctaagc agaagaagaa 20

<210> 27

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 27

gccgcagcga augccguuuc acgaaucguc aggcgg 36

<210> 28

<211> 75

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 28

gcuggagacg uuuuuugaaa cggcgagugc ugcggauagc gaguuucucu uggggaggcg 60

cucgcggcca cuuuu 75

<210> 29

<211> 1388

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> source

<222> (1)..(1388)

<223> /note="Description of Unknown: Opitutaceae bacterium sequence"

<400> 29

Met Ser Leu Asn Arg Ile Tyr Gln Gly Arg Val Ala Ala Val Glu Thr

1 5 10 15

Gly Thr Ala Leu Ala Lys Gly Asn Val Glu Trp Met Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Asp Glu Val Leu Trp Gln His His Glu Leu Phe Gln Ala Ala Ile

35 40 45

Asn Tyr Tyr Leu Val Ala Leu Leu Ala Leu Ala Asp Lys Asn Asn Pro

50 55 60

Val Leu Gly Pro Leu Ile Ser Gln Met Asp Asn Pro Gln Ser Pro Tyr

65 70 75 80

His Val Trp Gly Ser Phe Arg Arg Gln Gly Arg Gln Arg Thr Gly Leu

85 90 95

Ser Gln Ala Val Ala Pro Tyr Ile Thr Pro Gly Asn Asn Ala Pro Thr

100 105 110

Leu Asp Glu Val Phe Arg Ser Ile Leu Ala Gly Asn Pro Thr Asp Arg

115 120 125

Ala Thr Leu Asp Ala Ala Leu Met Gln Leu Leu Lys Ala Cys Asp Gly

130 135 140

Ala Gly Ala Ile Gln Gln Glu Gly Arg Ser Tyr Trp Pro Lys Phe Cys

145 150 155 160

Asp Pro Asp Ser Thr Ala Asn Phe Ala Gly Asp Pro Ala Met Leu Arg

165 170 175

Arg Glu Gln His Arg Leu Leu Leu Pro Gln Val Leu His Asp Pro Ala

180 185 190

Ile Thr His Asp Ser Pro Ala Leu Gly Ser Phe Asp Thr Tyr Ser Ile

195 200 205

Ala Thr Pro Asp Thr Arg Thr Pro Gln Leu Thr Gly Pro Lys Ala Arg

210 215 220

Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ile Thr Leu Trp Arg Val Arg Leu Pro Glu

225 230 235 240

Ser Ala Ala Asp Phe Asp Arg Leu Ala Ser Ser Leu Lys Lys Ile Pro

245 250 255

Asp Asp Asp Ser Arg Leu Asn Leu Gln Gly Tyr Val Gly Ser Ser Ala

260 265 270

Lys Gly Glu Val Gln Ala Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Phe Arg His

275 280 285

Leu Glu Arg Ser Ser Phe Thr Leu Gly Leu Leu Arg Ser Ala Thr Pro

290 295 300

Pro Pro Lys Asn Ala Glu Thr Pro Pro Pro Ala Gly Val Pro Leu Pro

305 310 315 320

Ala Ala Ser Ala Ala Asp Pro Val Arg Ile Ala Arg Gly Lys Arg Ser

325 330 335

Phe Val Phe Arg Ala Phe Thr Ser Leu Pro Cys Trp His Gly Gly Asp

340 345 350

Asn Ile His Pro Thr Trp Lys Ser Phe Asp Ile Ala Ala Phe Lys Tyr

355 360 365

Ala Leu Thr Val Ile Asn Gln Ile Glu Glu Lys Thr Lys Glu Arg Gln

370 375 380

Lys Glu Cys Ala Glu Leu Glu Thr Asp Phe Asp Tyr Met His Gly Arg

385 390 395 400

Leu Ala Lys Ile Pro Val Lys Tyr Thr Thr Gly Glu Ala Glu Pro Pro

405 410 415

Pro Ile Leu Ala Asn Asp Leu Arg Ile Pro Leu Leu Arg Glu Leu Leu

420 425 430

Gln Asn Ile Lys Val Asp Thr Ala Leu Thr Asp Gly Glu Ala Val Ser

435 440 445

Tyr Gly Leu Gln Arg Arg Thr Ile Arg Gly Phe Arg Glu Leu Arg Arg

450 455 460

Ile Trp Arg Gly His Ala Pro Ala Gly Thr Val Phe Ser Ser Glu Leu

465 470 475 480

Lys Glu Lys Leu Ala Gly Glu Leu Arg Gln Phe Gln Thr Asp Asn Ser

485 490 495

Thr Thr Ile Gly Ser Val Gln Leu Phe Asn Glu Leu Ile Gln Asn Pro

500 505 510

Lys Tyr Trp Pro Ile Trp Gln Ala Pro Asp Val Glu Thr Ala Arg Gln

515 520 525

Trp Ala Asp Ala Gly Phe Ala Asp Asp Pro Leu Ala Ala Leu Val Gln

530 535 540

Glu Ala Glu Leu Gln Glu Asp Ile Asp Ala Leu Lys Ala Pro Val Lys

545 550 555 560

Leu Thr Pro Ala Asp Pro Glu Tyr Ser Arg Arg Gln Tyr Asp Phe Asn

565 570 575

Ala Val Ser Lys Phe Gly Ala Gly Ser Arg Ser Ala Asn Arg His Glu

580 585 590

Pro Gly Gln Thr Glu Arg Gly His Asn Thr Phe Thr Thr Glu Ile Ala

595 600 605

Ala Arg Asn Ala Ala Asp Gly Asn Arg Trp Arg Ala Thr His Val Arg

610 615 620

Ile His Tyr Ser Ala Pro Arg Leu Leu Arg Asp Gly Leu Arg Arg Pro

625 630 635 640

Asp Thr Asp Gly Asn Glu Ala Leu Glu Ala Val Pro Trp Leu Gln Pro

645 650 655

Met Met Glu Ala Leu Ala Pro Leu Pro Thr Leu Pro Gln Asp Leu Thr

660 665 670

Gly Met Pro Val Phe Leu Met Pro Asp Val Thr Leu Ser Gly Glu Arg

675 680 685

Arg Ile Leu Leu Asn Leu Pro Val Thr Leu Glu Pro Ala Ala Leu Val

690 695 700

Glu Gln Leu Gly Asn Ala Gly Arg Trp Gln Asn Gln Phe Phe Gly Ser

705 710 715 720

Arg Glu Asp Pro Phe Ala Leu Arg Trp Pro Ala Asp Gly Ala Val Lys

725 730 735

Thr Ala Lys Gly Lys Thr His Ile Pro Trp His Gln Asp Arg Asp His

740 745 750

Phe Thr Val Leu Gly Val Asp Leu Gly Thr Arg Asp Ala Gly Ala Leu

755 760 765

Ala Leu Leu Asn Val Thr Ala Gln Lys Pro Ala Lys Pro Val His Arg

770 775 780

Ile Ile Gly Glu Ala Asp Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Ser Leu Ala Asp

785 790 795 800

Ala Arg Met Ile Arg Leu Pro Gly Glu Asp Ala Arg Leu Phe Val Arg

805 810 815

Gly Lys Leu Val Gln Glu Pro Tyr Gly Glu Arg Gly Arg Asn Ala Ser

820 825 830

Leu Leu Glu Trp Glu Asp Ala Arg Asn Ile Ile Leu Arg Leu Gly Gln

835 840 845

Asn Pro Asp Glu Leu Leu Gly Ala Asp Pro Arg Arg His Ser Tyr Pro

850 855 860

Glu Ile Asn Asp Lys Leu Leu Val Ala Leu Arg Arg Ala Gln Ala Arg

865 870 875 880

Leu Ala Arg Leu Gln Asn Arg Ser Trp Arg Leu Arg Asp Leu Ala Glu

885 890 895

Ser Asp Lys Ala Leu Asp Glu Ile His Ala Glu Arg Ala Gly Glu Lys

900 905 910

Pro Ser Pro Leu Pro Pro Leu Ala Arg Asp Asp Ala Ile Lys Ser Thr

915 920 925

Asp Glu Ala Leu Leu Ser Gln Arg Asp Ile Ile Arg Arg Ser Phe Val

930 935 940

Gln Ile Ala Asn Leu Ile Leu Pro Leu Arg Gly Arg Arg Trp Glu Trp

945 950 955 960

Arg Pro His Val Glu Val Pro Asp Cys His Ile Leu Ala Gln Ser Asp

965 970 975

Pro Gly Thr Asp Asp Thr Lys Arg Leu Val Ala Gly Gln Arg Gly Ile

980 985 990

Ser His Glu Arg Ile Glu Gln Ile Glu Glu Leu Arg Arg Arg Cys Gln

995 1000 1005

Ser Leu Asn Arg Ala Leu Arg His Lys Pro Gly Glu Arg Pro Val

1010 1015 1020

Leu Gly Arg Pro Ala Lys Gly Glu Glu Ile Ala Asp Pro Cys Pro

1025 1030 1035

Ala Leu Leu Glu Lys Ile Asn Arg Leu Arg Asp Gln Arg Val Asp

1040 1045 1050

Gln Thr Ala His Ala Ile Leu Ala Ala Ala Leu Gly Val Arg Leu

1055 1060 1065

Arg Ala Pro Ser Lys Asp Arg Ala Glu Arg Arg His Arg Asp Ile

1070 1075 1080

His Gly Glu Tyr Glu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Asp Phe Val Val

1085 1090 1095

Ile Glu Asn Leu Ser Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Asp Arg Ala Arg

1100 1105 1110

Ser Glu Asn Thr Arg Leu Met Gln Trp Cys His Arg Gln Ile Val

1115 1120 1125

Gln Lys Leu Arg Gln Leu Cys Glu Thr Tyr Gly Ile Pro Val Leu

1130 1135 1140

Ala Val Pro Ala Ala Tyr Ser Ser Arg Phe Ser Ser Arg Asp Gly

1145 1150 1155

Ser Ala Gly Phe Arg Ala Val His Leu Thr Pro Asp His Arg His

1160 1165 1170

Arg Met Pro Trp Ser Arg Ile Leu Ala Arg Leu Lys Ala His Glu

1175 1180 1185

Glu Asp Gly Lys Arg Leu Glu Lys Thr Val Leu Asp Glu Ala Arg

1190 1195 1200

Ala Val Arg Gly Leu Phe Asp Arg Leu Asp Arg Phe Asn Ala Gly

1205 1210 1215

His Val Pro Gly Lys Pro Trp Arg Thr Leu Leu Ala Pro Leu Pro

1220 1225 1230

Gly Gly Pro Val Phe Val Pro Leu Gly Asp Ala Thr Pro Met Gln

1235 1240 1245

Ala Asp Leu Asn Ala Ala Ile Asn Ile Ala Leu Arg Gly Ile Ala

1250 1255 1260

Ala Pro Asp Arg His Asp Ile His His Arg Leu Arg Ala Glu Asn

1265 1270 1275

Lys Lys Arg Ile Leu Ser Leu Arg Leu Gly Thr Gln Arg Glu Lys

1280 1285 1290

Ala Arg Trp Pro Gly Gly Ala Pro Ala Val Thr Leu Ser Thr Pro

1295 1300 1305

Asn Asn Gly Ala Ser Pro Glu Asp Ser Asp Ala Leu Pro Glu Arg

1310 1315 1320

Val Ser Asn Leu Phe Val Asp Ile Ala Gly Val Ala Asn Phe Glu

1325 1330 1335

Arg Val Thr Ile Glu Gly Val Ser Gln Lys Phe Ala Thr Gly Arg

1340 1345 1350

Gly Leu Trp Ala Ser Val Lys Gln Arg Ala Trp Asn Arg Val Ala

1355 1360 1365

Arg Leu Asn Glu Thr Val Thr Asp Asn Asn Arg Asn Glu Glu Glu

1370 1375 1380

Asp Asp Ile Pro Met

1385

<210> 30

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 30

guccaagaaa aaagaaauga uacgaggcau uagcac 36

<210> 31

<211> 107

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 31

cuggacgaug ucucuuuuau uucuuuuuuc uuggaucuga guacgagcac ccacauugga 60

cauuucgcau ggugggugcu cguacuauag guaaaacaaa ccuuuuu 107

<210> 32

<211> 1108

<212> PRT

<213> Bacillus thermoamylovorans

<400> 32

Met Ala Thr Arg Ser Phe Ile Leu Lys Ile Glu Pro Asn Glu Glu Val

1 5 10 15

Lys Lys Gly Leu Trp Lys Thr His Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ala

20 25 30

Tyr Tyr Met Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ala Ile Tyr Glu

35 40 45

His His Glu Gln Asp Pro Lys Asn Pro Lys Lys Val Ser Lys Ala Glu

50 55 60

Ile Gln Ala Glu Leu Trp Asp Phe Val Leu Lys Met Gln Lys Cys Asn

65 70 75 80

Ser Phe Thr His Glu Val Asp Lys Asp Val Val Phe Asn Ile Leu Arg

85 90 95

Glu Leu Tyr Glu Glu Leu Val Pro Ser Ser Val Glu Lys Lys Gly Glu

100 105 110

Ala Asn Gln Leu Ser Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn

115 120 125

Ser Gln Ser Gly Lys Gly Thr Ala Ser Ser Gly Arg Lys Pro Arg Trp

130 135 140

Tyr Asn Leu Lys Ile Ala Gly Asp Pro Ser Trp Glu Glu Glu Lys Lys

145 150 155 160

Lys Trp Glu Glu Asp Lys Lys Lys Asp Pro Leu Ala Lys Ile Leu Gly

165 170 175

Lys Leu Ala Glu Tyr Gly Leu Ile Pro Leu Phe Ile Pro Phe Thr Asp

180 185 190

Ser Asn Glu Pro Ile Val Lys Glu Ile Lys Trp Met Glu Lys Ser Arg

195 200 205

Asn Gln Ser Val Arg Arg Leu Asp Lys Asp Met Phe Ile Gln Ala Leu

210 215 220

Glu Arg Phe Leu Ser Trp Glu Ser Trp Asn Leu Lys Val Lys Glu Glu

225 230 235 240

Tyr Glu Lys Val Glu Lys Glu His Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ile Lys

245 250 255

Glu Asp Ile Gln Ala Phe Lys Ser Leu Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Arg

260 265 270

Gln Glu Gln Leu Leu Arg Asp Thr Leu Asn Thr Asn Glu Tyr Arg Leu

275 280 285

Ser Lys Arg Gly Leu Arg Gly Trp Arg Glu Ile Ile Gln Lys Trp Leu

290 295 300

Lys Met Asp Glu Asn Glu Pro Ser Glu Lys Tyr Leu Glu Val Phe Lys

305 310 315 320

Asp Tyr Gln Arg Lys His Pro Arg Glu Ala Gly Asp Tyr Ser Val Tyr

325 330 335

Glu Phe Leu Ser Lys Lys Glu Asn His Phe Ile Trp Arg Asn His Pro

340 345 350

Glu Tyr Pro Tyr Leu Tyr Ala Thr Phe Cys Glu Ile Asp Lys Lys Lys

355 360 365

Lys Asp Ala Lys Gln Gln Ala Thr Phe Thr Leu Ala Asp Pro Ile Asn

370 375 380

His Pro Leu Trp Val Arg Phe Glu Glu Arg Ser Gly Ser Asn Leu Asn

385 390 395 400

Lys Tyr Arg Ile Leu Thr Glu Gln Leu His Thr Glu Lys Leu Lys Lys

405 410 415

Lys Leu Thr Val Gln Leu Asp Arg Leu Ile Tyr Pro Thr Glu Ser Gly

420 425 430

Gly Trp Glu Glu Lys Gly Lys Val Asp Ile Val Leu Leu Pro Ser Arg

435 440 445

Gln Phe Tyr Asn Gln Ile Phe Leu Asp Ile Glu Glu Lys Gly Lys His

450 455 460

Ala Phe Thr Tyr Lys Asp Glu Ser Ile Lys Phe Pro Leu Lys Gly Thr

465 470 475 480

Leu Gly Gly Ala Arg Val Gln Phe Asp Arg Asp His Leu Arg Arg Tyr

485 490 495

Pro His Lys Val Glu Ser Gly Asn Val Gly Arg Ile Tyr Phe Asn Met

500 505 510

Thr Val Asn Ile Glu Pro Thr Glu Ser Pro Val Ser Lys Ser Leu Lys

515 520 525

Ile His Arg Asp Asp Phe Pro Lys Phe Val Asn Phe Lys Pro Lys Glu

530 535 540

Leu Thr Glu Trp Ile Lys Asp Ser Lys Gly Lys Lys Leu Lys Ser Gly

545 550 555 560

Ile Glu Ser Leu Glu Ile Gly Leu Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly

565 570 575

Gln Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ile Phe Glu Val Val Asp Gln Lys

580 585 590

Pro Asp Ile Glu Gly Lys Leu Phe Phe Pro Ile Lys Gly Thr Glu Leu

595 600 605

Tyr Ala Val His Arg Ala Ser Phe Asn Ile Lys Leu Pro Gly Glu Thr

610 615 620

Leu Val Lys Ser Arg Glu Val Leu Arg Lys Ala Arg Glu Asp Asn Leu

625 630 635 640

Lys Leu Met Asn Gln Lys Leu Asn Phe Leu Arg Asn Val Leu His Phe

645 650 655

Gln Gln Phe Glu Asp Ile Thr Glu Arg Glu Lys Arg Val Thr Lys Trp

660 665 670

Ile Ser Arg Gln Glu Asn Ser Asp Val Pro Leu Val Tyr Gln Asp Glu

675 680 685

Leu Ile Gln Ile Arg Glu Leu Met Tyr Lys Pro Tyr Lys Asp Trp Val

690 695 700

Ala Phe Leu Lys Gln Leu His Lys Arg Leu Glu Val Glu Ile Gly Lys

705 710 715 720

Glu Val Lys His Trp Arg Lys Ser Leu Ser Asp Gly Arg Lys Gly Leu

725 730 735

Tyr Gly Ile Ser Leu Lys Asn Ile Asp Glu Ile Asp Arg Thr Arg Lys

740 745 750

Phe Leu Leu Arg Trp Ser Leu Arg Pro Thr Glu Pro Gly Glu Val Arg

755 760 765

Arg Leu Glu Pro Gly Gln Arg Phe Ala Ile Asp Gln Leu Asn His Leu

770 775 780

Asn Ala Leu Lys Glu Asp Arg Leu Lys Lys Met Ala Asn Thr Ile Ile

785 790 795 800

Met His Ala Leu Gly Tyr Cys Tyr Asp Val Arg Lys Lys Lys Trp Gln

805 810 815

Ala Lys Asn Pro Ala Cys Gln Ile Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ser Asn

820 825 830

Tyr Asn Pro Tyr Glu Glu Arg Ser Arg Phe Glu Asn Ser Lys Leu Met

835 840 845

Lys Trp Ser Arg Arg Glu Ile Pro Arg Gln Val Ala Leu Gln Gly Glu

850 855 860

Ile Tyr Gly Leu Gln Val Gly Glu Val Gly Ala Gln Phe Ser Ser Arg

865 870 875 880

Phe His Ala Lys Thr Gly Ser Pro Gly Ile Arg Cys Ser Val Val Thr

885 890 895

Lys Glu Lys Leu Gln Asp Asn Arg Phe Phe Lys Asn Leu Gln Arg Glu

900 905 910

Gly Arg Leu Thr Leu Asp Lys Ile Ala Val Leu Lys Glu Gly Asp Leu

915 920 925

Tyr Pro Asp Lys Gly Gly Glu Lys Phe Ile Ser Leu Ser Lys Asp Arg

930 935 940

Lys Leu Val Thr Thr His Ala Asp Ile Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln

945 950 955 960

Lys Arg Phe Trp Thr Arg Thr His Gly Phe Tyr Lys Val Tyr Cys Lys

965 970 975

Ala Tyr Gln Val Asp Gly Gln Thr Val Tyr Ile Pro Glu Ser Lys Asp

980 985 990

Gln Lys Gln Lys Ile Ile Glu Glu Phe Gly Glu Gly Tyr Phe Ile Leu

995 1000 1005

Lys Asp Gly Val Tyr Glu Trp Gly Asn Ala Gly Lys Leu Lys Ile

1010 1015 1020

Lys Lys Gly Ser Ser Lys Gln Ser Ser Ser Glu Leu Val Asp Ser

1025 1030 1035

Asp Ile Leu Lys Asp Ser Phe Asp Leu Ala Ser Glu Leu Lys Gly

1040 1045 1050

Glu Lys Leu Met Leu Tyr Arg Asp Pro Ser Gly Asn Val Phe Pro

1055 1060 1065

Ser Asp Lys Trp Met Ala Ala Gly Val Phe Phe Gly Lys Leu Glu

1070 1075 1080

Arg Ile Leu Ile Ser Lys Leu Thr Asn Gln Tyr Ser Ile Ser Thr

1085 1090 1095

Ile Glu Asp Asp Ser Ser Lys Gln Ser Met

1100 1105

<210> 33

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 33

guucgaaagc uuaguggaaa gcuucguggu uagcac 36

<210> 34

<211> 69

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 34

cacggauaau cacgacuuuc cacuaagcuu ucgaauuuua ugaugcgagc auccucucag 60

gucaaaaaa 69

<210> 35

<211> 1108

<212> PRT

<213> Bacillus sp.

<400> 35

Met Ala Ile Arg Ser Ile Lys Leu Lys Leu Lys Thr His Thr Gly Pro

1 5 10 15

Glu Ala Gln Asn Leu Arg Lys Gly Ile Trp Arg Thr His Arg Leu Leu

20 25 30

Asn Glu Gly Val Ala Tyr Tyr Met Lys Met Leu Leu Leu Phe Arg Gln

35 40 45

Glu Ser Thr Gly Glu Arg Pro Lys Glu Glu Leu Gln Glu Glu Leu Ile

50 55 60

Cys His Ile Arg Glu Gln Gln Gln Arg Asn Gln Ala Asp Lys Asn Thr

65 70 75 80

Gln Ala Leu Pro Leu Asp Lys Ala Leu Glu Ala Leu Arg Gln Leu Tyr

85 90 95

Glu Leu Leu Val Pro Ser Ser Val Gly Gln Ser Gly Asp Ala Gln Ile

100 105 110

Ile Ser Arg Lys Phe Leu Ser Pro Leu Val Asp Pro Asn Ser Glu Gly

115 120 125

Gly Lys Gly Thr Ser Lys Ala Gly Ala Lys Pro Thr Trp Gln Lys Lys

130 135 140

Lys Glu Ala Asn Asp Pro Thr Trp Glu Gln Asp Tyr Glu Lys Trp Lys

145 150 155 160

Lys Arg Arg Glu Glu Asp Pro Thr Ala Ser Val Ile Thr Thr Leu Glu

165 170 175

Glu Tyr Gly Ile Arg Pro Ile Phe Pro Leu Tyr Thr Asn Thr Val Thr

180 185 190

Asp Ile Ala Trp Leu Pro Leu Gln Ser Asn Gln Phe Val Arg Thr Trp

195 200 205

Asp Arg Asp Met Leu Gln Gln Ala Ile Glu Arg Leu Leu Ser Trp Glu

210 215 220

Ser Trp Asn Lys Arg Val Gln Glu Glu Tyr Ala Lys Leu Lys Glu Lys

225 230 235 240

Met Ala Gln Leu Asn Glu Gln Leu Glu Gly Gly Gln Glu Trp Ile Ser

245 250 255

Leu Leu Glu Gln Tyr Glu Glu Asn Arg Glu Arg Glu Leu Arg Glu Asn

260 265 270

Met Thr Ala Ala Asn Asp Lys Tyr Arg Ile Thr Lys Arg Gln Met Lys

275 280 285

Gly Trp Asn Glu Leu Tyr Glu Leu Trp Ser Thr Phe Pro Ala Ser Ala

290 295 300

Ser His Glu Gln Tyr Lys Glu Ala Leu Lys Arg Val Gln Gln Arg Leu

305 310 315 320

Arg Gly Arg Phe Gly Asp Ala His Phe Phe Gln Tyr Leu Met Glu Glu

325 330 335

Lys Asn Arg Leu Ile Trp Lys Gly Asn Pro Gln Arg Ile His Tyr Phe

340 345 350

Val Ala Arg Asn Glu Leu Thr Lys Arg Leu Glu Glu Ala Lys Gln Ser

355 360 365

Ala Thr Met Thr Leu Pro Asn Ala Arg Lys His Pro Leu Trp Val Arg

370 375 380

Phe Asp Ala Arg Gly Gly Asn Leu Gln Asp Tyr Tyr Leu Thr Ala Glu

385 390 395 400

Ala Asp Lys Pro Arg Ser Arg Arg Phe Val Thr Phe Ser Gln Leu Ile

405 410 415

Trp Pro Ser Glu Ser Gly Trp Met Glu Lys Lys Asp Val Glu Val Glu

420 425 430

Leu Ala Leu Ser Arg Gln Phe Tyr Gln Gln Val Lys Leu Leu Lys Asn

435 440 445

Asp Lys Gly Lys Gln Lys Ile Glu Phe Lys Asp Lys Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Thr Phe Asn Gly His Leu Gly Gly Ala Lys Leu Gln Leu Glu Arg Gly

465 470 475 480

Asp Leu Glu Lys Glu Glu Lys Asn Phe Glu Asp Gly Glu Ile Gly Ser

485 490 495

Val Tyr Leu Asn Val Val Ile Asp Phe Glu Pro Leu Gln Glu Val Lys

500 505 510

Asn Gly Arg Val Gln Ala Pro Tyr Gly Gln Val Leu Gln Leu Ile Arg

515 520 525

Arg Pro Asn Glu Phe Pro Lys Val Thr Thr Tyr Lys Ser Glu Gln Leu

530 535 540

Val Glu Trp Ile Lys Ala Ser Pro Gln His Ser Ala Gly Val Glu Ser

545 550 555 560

Leu Ala Ser Gly Phe Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly Leu Arg Ala

565 570 575

Ala Ala Ala Thr Ser Ile Phe Ser Val Glu Glu Ser Ser Asp Lys Asn

580 585 590

Ala Ala Asp Phe Ser Tyr Trp Ile Glu Gly Thr Pro Leu Val Ala Val

595 600 605

His Gln Arg Ser Tyr Met Leu Arg Leu Pro Gly Glu Gln Val Glu Lys

610 615 620

Gln Val Met Glu Lys Arg Asp Glu Arg Phe Gln Leu His Gln Arg Val

625 630 635 640

Lys Phe Gln Ile Arg Val Leu Ala Gln Ile Met Arg Met Ala Asn Lys

645 650 655

Gln Tyr Gly Asp Arg Trp Asp Glu Leu Asp Ser Leu Lys Gln Ala Val

660 665 670

Glu Gln Lys Lys Ser Pro Leu Asp Gln Thr Asp Arg Thr Phe Trp Glu

675 680 685

Gly Ile Val Cys Asp Leu Thr Lys Val Leu Pro Arg Asn Glu Ala Asp

690 695 700

Trp Glu Gln Ala Val Val Gln Ile His Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Val

705 710 715 720

Gly Lys Ala Val Gln Ala Trp Arg Lys Arg Phe Ala Ala Asp Glu Arg

725 730 735

Lys Gly Ile Ala Gly Leu Ser Met Trp Asn Ile Glu Glu Leu Glu Gly

740 745 750

Leu Arg Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ser Arg Arg Thr Arg Asn Pro Gln

755 760 765

Glu Val Asn Arg Phe Glu Arg Gly His Thr Ser His Gln Arg Leu Leu

770 775 780

Thr His Ile Gln Asn Val Lys Glu Asp Arg Leu Lys Gln Leu Ser His

785 790 795 800

Ala Ile Val Met Thr Ala Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Glu Arg Lys Gln

805 810 815

Glu Trp Cys Ala Glu Tyr Pro Ala Cys Gln Val Ile Leu Phe Glu Asn

820 825 830

Leu Ser Gln Tyr Arg Ser Asn Leu Asp Arg Ser Thr Lys Glu Asn Ser

835 840 845

Thr Leu Met Lys Trp Ala His Arg Ser Ile Pro Lys Tyr Val His Met

850 855 860

Gln Ala Glu Pro Tyr Gly Ile Gln Ile Gly Asp Val Arg Ala Glu Tyr

865 870 875 880

Ser Ser Arg Phe Tyr Ala Lys Thr Gly Thr Pro Gly Ile Arg Cys Lys

885 890 895

Lys Val Arg Gly Gln Asp Leu Gln Gly Arg Arg Phe Glu Asn Leu Gln

900 905 910

Lys Arg Leu Val Asn Glu Gln Phe Leu Thr Glu Glu Gln Val Lys Gln

915 920 925

Leu Arg Pro Gly Asp Ile Val Pro Asp Asp Ser Gly Glu Leu Phe Met

930 935 940

Thr Leu Thr Asp Gly Ser Gly Ser Lys Glu Val Val Phe Leu Gln Ala

945 950 955 960

Asp Ile Asn Ala Ala His Asn Leu Gln Lys Arg Phe Trp Gln Arg Tyr

965 970 975

Asn Glu Leu Phe Lys Val Ser Cys Arg Val Ile Val Arg Asp Glu Glu

980 985 990

Glu Tyr Leu Val Pro Lys Thr Lys Ser Val Gln Ala Lys Leu Gly Lys

995 1000 1005

Gly Leu Phe Val Lys Lys Ser Asp Thr Ala Trp Lys Asp Val Tyr

1010 1015 1020

Val Trp Asp Ser Gln Ala Lys Leu Lys Gly Lys Thr Thr Phe Thr

1025 1030 1035

Glu Glu Ser Glu Ser Pro Glu Gln Leu Glu Asp Phe Gln Glu Ile

1040 1045 1050

Ile Glu Glu Ala Glu Glu Ala Lys Gly Thr Tyr Arg Thr Leu Phe

1055 1060 1065

Arg Asp Pro Ser Gly Val Phe Phe Pro Glu Ser Val Trp Tyr Pro

1070 1075 1080

Gln Lys Asp Phe Trp Gly Glu Val Lys Arg Lys Leu Tyr Gly Lys

1085 1090 1095

Leu Arg Glu Arg Phe Leu Thr Lys Ala Arg

1100 1105

<210> 36

<211> 35

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 36

guuuugagaa uagcccgaca uagagggcaa uagac 35

<210> 37

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 37

guuaugaaaa cagcccgaca uagagggcaa uagaca 36

<210> 38

<211> 1334

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> source

<222> (1)..(1334)

<223> /note="Description of Unknown: Lachnospiraceae bacterium

sequence"

<400> 38

Met Lys Ile Ser Lys Val Asp His Thr Arg Met Ala Val Ala Lys Gly

1 5 10 15

Asn Gln His Arg Arg Asp Glu Ile Ser Gly Ile Leu Tyr Lys Asp Pro

20 25 30

Thr Lys Thr Gly Ser Ile Asp Phe Asp Glu Arg Phe Lys Lys Leu Asn

35 40 45

Cys Ser Ala Lys Ile Leu Tyr His Val Phe Asn Gly Ile Ala Glu Gly

50 55 60

Ser Asn Lys Tyr Lys Asn Ile Val Asp Lys Val Asn Asn Asn Leu Asp

65 70 75 80

Arg Val Leu Phe Thr Gly Lys Ser Tyr Asp Arg Lys Ser Ile Ile Asp

85 90 95

Ile Asp Thr Val Leu Arg Asn Val Glu Lys Ile Asn Ala Phe Asp Arg

100 105 110

Ile Ser Thr Glu Glu Arg Glu Gln Ile Ile Asp Asp Leu Leu Glu Ile

115 120 125

Gln Leu Arg Lys Gly Leu Arg Lys Gly Lys Ala Gly Leu Arg Glu Val

130 135 140

Leu Leu Ile Gly Ala Gly Val Ile Val Arg Thr Asp Lys Lys Gln Glu

145 150 155 160

Ile Ala Asp Phe Leu Glu Ile Leu Asp Glu Asp Phe Asn Lys Thr Asn

165 170 175

Gln Ala Lys Asn Ile Lys Leu Ser Ile Glu Asn Gln Gly Leu Val Val

180 185 190

Ser Pro Val Ser Arg Gly Glu Glu Arg Ile Phe Asp Val Ser Gly Ala

195 200 205

Gln Lys Gly Lys Ser Ser Lys Lys Ala Gln Glu Lys Glu Ala Leu Ser

210 215 220

Ala Phe Leu Leu Asp Tyr Ala Asp Leu Asp Lys Asn Val Arg Phe Glu

225 230 235 240

Tyr Leu Arg Lys Ile Arg Arg Leu Ile Asn Leu Tyr Phe Tyr Val Lys

245 250 255

Asn Asp Asp Val Met Ser Leu Thr Glu Ile Pro Ala Glu Val Asn Leu

260 265 270

Glu Lys Asp Phe Asp Ile Trp Arg Asp His Glu Gln Arg Lys Glu Glu

275 280 285

Asn Gly Asp Phe Val Gly Cys Pro Asp Ile Leu Leu Ala Asp Arg Asp

290 295 300

Val Lys Lys Ser Asn Ser Lys Gln Val Lys Ile Ala Glu Arg Gln Leu

305 310 315 320

Arg Glu Ser Ile Arg Glu Lys Asn Ile Lys Arg Tyr Arg Phe Ser Ile

325 330 335

Lys Thr Ile Glu Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Phe Phe Ala Asn Lys Gln

340 345 350

Ile Ser Val Phe Trp Ile His Arg Ile Glu Asn Ala Val Glu Arg Ile

355 360 365

Leu Gly Ser Ile Asn Asp Lys Lys Leu Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Tyr

370 375 380

Leu Gly Glu Lys Val Trp Lys Asp Ile Leu Asn Phe Leu Ser Ile Lys

385 390 395 400

Tyr Ile Ala Val Gly Lys Ala Val Phe Asn Phe Ala Met Asp Asp Leu

405 410 415

Gln Glu Lys Asp Arg Asp Ile Glu Pro Gly Lys Ile Ser Glu Asn Ala

420 425 430

Val Asn Gly Leu Thr Ser Phe Asp Tyr Glu Gln Ile Lys Ala Asp Glu

435 440 445

Met Leu Gln Arg Glu Val Ala Val Asn Val Ala Phe Ala Ala Asn Asn

450 455 460

Leu Ala Arg Val Thr Val Asp Ile Pro Gln Asn Gly Glu Lys Glu Asp

465 470 475 480

Ile Leu Leu Trp Asn Lys Ser Asp Ile Lys Lys Tyr Lys Lys Asn Ser

485 490 495

Lys Lys Gly Ile Leu Lys Ser Ile Leu Gln Phe Phe Gly Gly Ala Ser

500 505 510

Thr Trp Asn Met Lys Met Phe Glu Ile Ala Tyr His Asp Gln Pro Gly

515 520 525

Asp Tyr Glu Glu Asn Tyr Leu Tyr Asp Ile Ile Gln Ile Ile Tyr Ser

530 535 540

Leu Arg Asn Lys Ser Phe His Phe Lys Thr Tyr Asp His Gly Asp Lys

545 550 555 560

Asn Trp Asn Arg Glu Leu Ile Gly Lys Met Ile Glu His Asp Ala Glu

565 570 575

Arg Val Ile Ser Val Glu Arg Glu Lys Phe His Ser Asn Asn Leu Pro

580 585 590

Met Phe Tyr Lys Asp Ala Asp Leu Lys Lys Ile Leu Asp Leu Leu Tyr

595 600 605

Ser Asp Tyr Ala Gly Arg Ala Ser Gln Val Pro Ala Phe Asn Thr Val

610 615 620

Leu Val Arg Lys Asn Phe Pro Glu Phe Leu Arg Lys Asp Met Gly Tyr

625 630 635 640

Lys Val His Phe Asn Asn Pro Glu Val Glu Asn Gln Trp His Ser Ala

645 650 655

Val Tyr Tyr Leu Tyr Lys Glu Ile Tyr Tyr Asn Leu Phe Leu Arg Asp

660 665 670

Lys Glu Val Lys Asn Leu Phe Tyr Thr Ser Leu Lys Asn Ile Arg Ser

675 680 685

Glu Val Ser Asp Lys Lys Gln Lys Leu Ala Ser Asp Asp Phe Ala Ser

690 695 700

Arg Cys Glu Glu Ile Glu Asp Arg Ser Leu Pro Glu Ile Cys Gln Ile

705 710 715 720

Ile Met Thr Glu Tyr Asn Ala Gln Asn Phe Gly Asn Arg Lys Val Lys

725 730 735

Ser Gln Arg Val Ile Glu Lys Asn Lys Asp Ile Phe Arg His Tyr Lys

740 745 750

Met Leu Leu Ile Lys Thr Leu Ala Gly Ala Phe Ser Leu Tyr Leu Lys

755 760 765

Gln Glu Arg Phe Ala Phe Ile Gly Lys Ala Thr Pro Ile Pro Tyr Glu

770 775 780

Thr Thr Asp Val Lys Asn Phe Leu Pro Glu Trp Lys Ser Gly Met Tyr

785 790 795 800

Ala Ser Phe Val Glu Glu Ile Lys Asn Asn Leu Asp Leu Gln Glu Trp

805 810 815

Tyr Ile Val Gly Arg Phe Leu Asn Gly Arg Met Leu Asn Gln Leu Ala

820 825 830

Gly Ser Leu Arg Ser Tyr Ile Gln Tyr Ala Glu Asp Ile Glu Arg Arg

835 840 845

Ala Ala Glu Asn Arg Asn Lys Leu Phe Ser Lys Pro Asp Glu Lys Ile

850 855 860

Glu Ala Cys Lys Lys Ala Val Arg Val Leu Asp Leu Cys Ile Lys Ile

865 870 875 880

Ser Thr Arg Ile Ser Ala Glu Phe Thr Asp Tyr Phe Asp Ser Glu Asp

885 890 895

Asp Tyr Ala Asp Tyr Leu Glu Lys Tyr Leu Lys Tyr Gln Asp Asp Ala

900 905 910

Ile Lys Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Ala Ala Leu Asp His Phe Cys

915 920 925

Asn Lys Asp Asp Leu Lys Phe Asp Ile Tyr Val Asn Ala Gly Gln Lys

930 935 940

Pro Ile Leu Gln Arg Asn Ile Val Met Ala Lys Leu Phe Gly Pro Asp

945 950 955 960

Asn Ile Leu Ser Glu Val Met Glu Lys Val Thr Glu Ser Ala Ile Arg

965 970 975

Glu Tyr Tyr Asp Tyr Leu Lys Lys Val Ser Gly Tyr Arg Val Arg Gly

980 985 990

Lys Cys Ser Thr Glu Lys Glu Gln Glu Asp Leu Leu Lys Phe Gln Arg

995 1000 1005

Leu Lys Asn Ala Val Glu Phe Arg Asp Val Thr Glu Tyr Ala Glu

1010 1015 1020

Val Ile Asn Glu Leu Leu Gly Gln Leu Ile Ser Trp Ser Tyr Leu

1025 1030 1035

Arg Glu Arg Asp Leu Leu Tyr Phe Gln Leu Gly Phe His Tyr Met

1040 1045 1050

Cys Leu Lys Asn Lys Ser Phe Lys Pro Ala Glu Tyr Val Asp Ile

1055 1060 1065

Arg Arg Asn Asn Gly Thr Ile Ile His Asn Ala Ile Leu Tyr Gln

1070 1075 1080

Ile Val Ser Met Tyr Ile Asn Gly Leu Asp Phe Tyr Ser Cys Asp

1085 1090 1095

Lys Glu Gly Lys Thr Leu Lys Pro Ile Glu Thr Gly Lys Gly Val

1100 1105 1110

Gly Ser Lys Ile Gly Gln Phe Ile Lys Tyr Ser Gln Tyr Leu Tyr

1115 1120 1125

Asn Asp Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Ile Tyr Asn Ala Gly Leu Glu

1130 1135 1140

Val Phe Glu Asn Ile Asp Glu His Asp Asn Ile Thr Asp Leu Arg

1145 1150 1155

Lys Tyr Val Asp His Phe Lys Tyr Tyr Ala Tyr Gly Asn Lys Met

1160 1165 1170

Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Ser Glu Phe Phe Asp Arg Phe Phe Thr

1175 1180 1185

Tyr Asp Met Lys Tyr Gln Lys Asn Val Val Asn Val Leu Glu Asn

1190 1195 1200

Ile Leu Leu Arg His Phe Val Ile Phe Tyr Pro Lys Phe Gly Ser

1205 1210 1215

Gly Lys Lys Asp Val Gly Ile Arg Asp Cys Lys Lys Glu Arg Ala

1220 1225 1230

Gln Ile Glu Ile Ser Glu Gln Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Met

1235 1240 1245

Phe Lys Leu Asp Asp Lys Ala Gly Glu Glu Ala Lys Lys Phe Pro

1250 1255 1260

Ala Arg Asp Glu Arg Tyr Leu Gln Thr Ile Ala Lys Leu Leu Tyr

1265 1270 1275

Tyr Pro Asn Glu Ile Glu Asp Met Asn Arg Phe Met Lys Lys Gly

1280 1285 1290

Glu Thr Ile Asn Lys Lys Val Gln Phe Asn Arg Lys Lys Lys Ile

1295 1300 1305

Thr Arg Lys Gln Lys Asn Asn Ser Ser Asn Glu Val Leu Ser Ser

1310 1315 1320

Thr Met Gly Tyr Leu Phe Lys Asn Ile Lys Leu

1325 1330

<210> 39

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 39

guuuuagucc ucuuucauau agagguaguc ucuuac 36

<210> 40

<211> 99

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 40

augaaaagag gacuaaaacu gaaagaggac uaaaacacca gauguggaua acuauauuag 60

uggcuauuaa aaauucgucg auauuagaga ggaaacuuu 99

<210> 41

<211> 1120

<212> PRT

<213> Listeria seeligeri

<400> 41

Met Trp Ile Ser Ile Lys Thr Leu Ile His His Leu Gly Val Leu Phe

1 5 10 15

Phe Cys Asp Tyr Met Tyr Asn Arg Arg Glu Lys Lys Ile Ile Glu Val

20 25 30

Lys Thr Met Arg Ile Thr Lys Val Glu Val Asp Arg Lys Lys Val Leu

35 40 45

Ile Ser Arg Asp Lys Asn Gly Gly Lys Leu Val Tyr Glu Asn Glu Met

50 55 60

Gln Asp Asn Thr Glu Gln Ile Met His His Lys Lys Ser Ser Phe Tyr

65 70 75 80

Lys Ser Val Val Asn Lys Thr Ile Cys Arg Pro Glu Gln Lys Gln Met

85 90 95

Lys Lys Leu Val His Gly Leu Leu Gln Glu Asn Ser Gln Glu Lys Ile

100 105 110

Lys Val Ser Asp Val Thr Lys Leu Asn Ile Ser Asn Phe Leu Asn His

115 120 125

Arg Phe Lys Lys Ser Leu Tyr Tyr Phe Pro Glu Asn Ser Pro Asp Lys

130 135 140

Ser Glu Glu Tyr Arg Ile Glu Ile Asn Leu Ser Gln Leu Leu Glu Asp

145 150 155 160

Ser Leu Lys Lys Gln Gln Gly Thr Phe Ile Cys Trp Glu Ser Phe Ser

165 170 175

Lys Asp Met Glu Leu Tyr Ile Asn Trp Ala Glu Asn Tyr Ile Ser Ser

180 185 190

Lys Thr Lys Leu Ile Lys Lys Ser Ile Arg Asn Asn Arg Ile Gln Ser

195 200 205

Thr Glu Ser Arg Ser Gly Gln Leu Met Asp Arg Tyr Met Lys Asp Ile

210 215 220

Leu Asn Lys Asn Lys Pro Phe Asp Ile Gln Ser Val Ser Glu Lys Tyr

225 230 235 240

Gln Leu Glu Lys Leu Thr Ser Ala Leu Lys Ala Thr Phe Lys Glu Ala

245 250 255

Lys Lys Asn Asp Lys Glu Ile Asn Tyr Lys Leu Lys Ser Thr Leu Gln

260 265 270

Asn His Glu Arg Gln Ile Ile Glu Glu Leu Lys Glu Asn Ser Glu Leu

275 280 285

Asn Gln Phe Asn Ile Glu Ile Arg Lys His Leu Glu Thr Tyr Phe Pro

290 295 300

Ile Lys Lys Thr Asn Arg Lys Val Gly Asp Ile Arg Asn Leu Glu Ile

305 310 315 320

Gly Glu Ile Gln Lys Ile Val Asn His Arg Leu Lys Asn Lys Ile Val

325 330 335

Gln Arg Ile Leu Gln Glu Gly Lys Leu Ala Ser Tyr Glu Ile Glu Ser

340 345 350

Thr Val Asn Ser Asn Ser Leu Gln Lys Ile Lys Ile Glu Glu Ala Phe

355 360 365

Ala Leu Lys Phe Ile Asn Ala Cys Leu Phe Ala Ser Asn Asn Leu Arg

370 375 380

Asn Met Val Tyr Pro Val Cys Lys Lys Asp Ile Leu Met Ile Gly Glu

385 390 395 400

Phe Lys Asn Ser Phe Lys Glu Ile Lys His Lys Lys Phe Ile Arg Gln

405 410 415

Trp Ser Gln Phe Phe Ser Gln Glu Ile Thr Val Asp Asp Ile Glu Leu

420 425 430

Ala Ser Trp Gly Leu Arg Gly Ala Ile Ala Pro Ile Arg Asn Glu Ile

435 440 445

Ile His Leu Lys Lys His Ser Trp Lys Lys Phe Phe Asn Asn Pro Thr

450 455 460

Phe Lys Val Lys Lys Ser Lys Ile Ile Asn Gly Lys Thr Lys Asp Val

465 470 475 480

Thr Ser Glu Phe Leu Tyr Lys Glu Thr Leu Phe Lys Asp Tyr Phe Tyr

485 490 495

Ser Glu Leu Asp Ser Val Pro Glu Leu Ile Ile Asn Lys Met Glu Ser

500 505 510

Ser Lys Ile Leu Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Gln Leu Asn Gln Val Phe

515 520 525

Thr Ile Pro Asn Phe Glu Leu Ser Leu Leu Thr Ser Ala Val Pro Phe

530 535 540

Ala Pro Ser Phe Lys Arg Val Tyr Leu Lys Gly Phe Asp Tyr Gln Asn

545 550 555 560

Gln Asp Glu Ala Gln Pro Asp Tyr Asn Leu Lys Leu Asn Ile Tyr Asn

565 570 575

Glu Lys Ala Phe Asn Ser Glu Ala Phe Gln Ala Gln Tyr Ser Leu Phe

580 585 590

Lys Met Val Tyr Tyr Gln Val Phe Leu Pro Gln Phe Thr Thr Asn Asn

595 600 605

Asp Leu Phe Lys Ser Ser Val Asp Phe Ile Leu Thr Leu Asn Lys Glu

610 615 620

Arg Lys Gly Tyr Ala Lys Ala Phe Gln Asp Ile Arg Lys Met Asn Lys

625 630 635 640

Asp Glu Lys Pro Ser Glu Tyr Met Ser Tyr Ile Gln Ser Gln Leu Met

645 650 655

Leu Tyr Gln Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Lys Ile Asn His Phe Glu

660 665 670

Lys Phe Ile Asn Gln Val Phe Ile Lys Gly Phe Asn Ser Phe Ile Glu

675 680 685

Lys Asn Arg Leu Thr Tyr Ile Cys His Pro Thr Lys Asn Thr Val Pro

690 695 700

Glu Asn Asp Asn Ile Glu Ile Pro Phe His Thr Asp Met Asp Asp Ser

705 710 715 720

Asn Ile Ala Phe Trp Leu Met Cys Lys Leu Leu Asp Ala Lys Gln Leu

725 730 735

Ser Glu Leu Arg Asn Glu Met Ile Lys Phe Ser Cys Ser Leu Gln Ser

740 745 750

Thr Glu Glu Ile Ser Thr Phe Thr Lys Ala Arg Glu Val Ile Gly Leu

755 760 765

Ala Leu Leu Asn Gly Glu Lys Gly Cys Asn Asp Trp Lys Glu Leu Phe

770 775 780

Asp Asp Lys Glu Ala Trp Lys Lys Asn Met Ser Leu Tyr Val Ser Glu

785 790 795 800

Glu Leu Leu Gln Ser Leu Pro Tyr Thr Gln Glu Asp Gly Gln Thr Pro

805 810 815

Val Ile Asn Arg Ser Ile Asp Leu Val Lys Lys Tyr Gly Thr Glu Thr

820 825 830

Ile Leu Glu Lys Leu Phe Ser Ser Ser Asp Asp Tyr Lys Val Ser Ala

835 840 845

Lys Asp Ile Ala Lys Leu His Glu Tyr Asp Val Thr Glu Lys Ile Ala

850 855 860

Gln Gln Glu Ser Leu His Lys Gln Trp Ile Glu Lys Pro Gly Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asp Ser Ala Trp Thr Lys Lys Tyr Gln Asn Val Ile Asn Asp Ile

885 890 895

Ser Asn Tyr Gln Trp Ala Lys Thr Lys Val Glu Leu Thr Gln Val Arg

900 905 910

His Leu His Gln Leu Thr Ile Asp Leu Leu Ser Arg Leu Ala Gly Tyr

915 920 925

Met Ser Ile Ala Asp Arg Asp Phe Gln Phe Ser Ser Asn Tyr Ile Leu

930 935 940

Glu Arg Glu Asn Ser Glu Tyr Arg Val Thr Ser Trp Ile Leu Leu Ser

945 950 955 960

Glu Asn Lys Asn Lys Asn Lys Tyr Asn Asp Tyr Glu Leu Tyr Asn Leu

965 970 975

Lys Asn Ala Ser Ile Lys Val Ser Ser Lys Asn Asp Pro Gln Leu Lys

980 985 990

Val Asp Leu Lys Gln Leu Arg Leu Thr Leu Glu Tyr Leu Glu Leu Phe

995 1000 1005

Asp Asn Arg Leu Lys Glu Lys Arg Asn Asn Ile Ser His Phe Asn

1010 1015 1020

Tyr Leu Asn Gly Gln Leu Gly Asn Ser Ile Leu Glu Leu Phe Asp

1025 1030 1035

Asp Ala Arg Asp Val Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala

1040 1045 1050

Val Ser Lys Ser Leu Lys Glu Ile Leu Ser Ser His Gly Met Glu

1055 1060 1065

Val Thr Phe Lys Pro Leu Tyr Gln Thr Asn His His Leu Lys Ile

1070 1075 1080

Asp Lys Leu Gln Pro Lys Lys Ile His His Leu Gly Glu Lys Ser

1085 1090 1095

Thr Val Ser Ser Asn Gln Val Ser Asn Glu Tyr Cys Gln Leu Val

1100 1105 1110

Arg Thr Leu Leu Thr Met Lys

1115 1120

<210> 42

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 42

guuuuagucc ccuucguuuu ugggguaguc uaaauc 36

<210> 43

<211> 113

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 43

gauuuagagc accccaaaag uaaugaaaau uugcaauuaa auaaggaaua uuaaaaaaau 60

gugauuuuaa aaaaauugaa gaaauuaaau gaaaaauugu ccaaguaaaa aaa 113

<210> 44

<211> 70

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 44

auuuagauua ccccuuuaau uuauuuuacc auauuuuucu cauaaugcaa acuaauauuc 60

caaaauuuuu 70

<210> 45

<211> 1389

<212> PRT

<213> Leptotrichia wadei

<400> 45

Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys

1 5 10 15

Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp

20 25 30

Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys

35 40 45

Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn

50 55 60

Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile

65 70 75 80

Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn

85 90 95

Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr

100 105 110

Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile

115 120 125

Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile

130 135 140

Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg

145 150 155 160

Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg

165 170 175

Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile

180 185 190

Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile

195 200 205

Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His

210 215 220

Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr

225 230 235 240

Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu

245 250 255

Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser

260 265 270

Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp

275 280 285

Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe

290 295 300

Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Val Asn Asn Glu

305 310 315 320

Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu

325 330 335

Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp

340 345 350

Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys

355 360 365

Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asp Glu Leu Ile

370 375 380

Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile

385 390 395 400

Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys

405 410 415

Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr

420 425 430

Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys

435 440 445

Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn

450 455 460

Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr

465 470 475 480

Leu Glu His Ile Met Tyr Leu Gly Lys Leu Arg His Asn Asp Ile Asp

485 490 495

Met Thr Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu

500 505 510

Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu

515 520 525

Leu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Glu Asn Ile Asn Asn Asp Glu Asn Ile

530 535 540

Asp Phe Phe Gly Gly Asp Arg Glu Lys Asn Tyr Val Leu Asp Lys Lys

545 550 555 560

Ile Leu Asn Ser Lys Ile Lys Ile Ile Arg Asp Leu Asp Phe Ile Asp

565 570 575

Asn Lys Asn Asn Ile Thr Asn Asn Phe Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile

580 585 590

Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu His Ala Ile Ser Lys Glu Arg

595 600 605

Asp Leu Gln Gly Thr Gln Asp Asp Tyr Asn Lys Val Ile Asn Ile Ile

610 615 620

Gln Asn Leu Lys Ile Ser Asp Glu Glu Val Ser Lys Ala Leu Asn Leu

625 630 635 640

Asp Val Val Phe Lys Asp Lys Lys Asn Ile Ile Thr Lys Ile Asn Asp

645 650 655

Ile Lys Ile Ser Glu Glu Asn Asn Asn Asp Ile Lys Tyr Leu Pro Ser

660 665 670

Phe Ser Lys Val Leu Pro Glu Ile Leu Asn Leu Tyr Arg Asn Asn Pro

675 680 685

Lys Asn Glu Pro Phe Asp Thr Ile Glu Thr Glu Lys Ile Val Leu Asn

690 695 700

Ala Leu Ile Tyr Val Asn Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ile Leu Glu

705 710 715 720

Asp Asp Leu Glu Glu Asn Glu Ser Lys Asn Ile Phe Leu Gln Glu Leu

725 730 735

Lys Lys Thr Leu Gly Asn Ile Asp Glu Ile Asp Glu Asn Ile Ile Glu

740 745 750

Asn Tyr Tyr Lys Asn Ala Gln Ile Ser Ala Ser Lys Gly Asn Asn Lys

755 760 765

Ala Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Lys Val Ile Glu Cys Tyr Ile Gly Tyr

770 775 780

Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Phe Ser Asp Phe Lys Met

785 790 795 800

Asn Ile Gln Glu Ile Lys Lys Gln Ile Lys Asp Ile Asn Asp Asn Lys

805 810 815

Thr Tyr Glu Arg Ile Thr Val Lys Thr Ser Asp Lys Thr Ile Val Ile

820 825 830

Asn Asp Asp Phe Glu Tyr Ile Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser

835 840 845

Asn Ala Val Ile Asn Lys Ile Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val

850 855 860

Trp Leu Asn Thr Ser Glu Tyr Gln Asn Ile Ile Asp Ile Leu Asp Glu

865 870 875 880

Ile Met Gln Leu Asn Thr Leu Arg Asn Glu Cys Ile Thr Glu Asn Trp

885 890 895

Asn Leu Asn Leu Glu Glu Phe Ile Gln Lys Met Lys Glu Ile Glu Lys

900 905 910

Asp Phe Asp Asp Phe Lys Ile Gln Thr Lys Lys Glu Ile Phe Asn Asn

915 920 925

Tyr Tyr Glu Asp Ile Lys Asn Asn Ile Leu Thr Glu Phe Lys Asp Asp

930 935 940

Ile Asn Gly Cys Asp Val Leu Glu Lys Lys Leu Glu Lys Ile Val Ile

945 950 955 960

Phe Asp Asp Glu Thr Lys Phe Glu Ile Asp Lys Lys Ser Asn Ile Leu

965 970 975

Gln Asp Glu Gln Arg Lys Leu Ser Asn Ile Asn Lys Lys Asp Leu Lys

980 985 990

Lys Lys Val Asp Gln Tyr Ile Lys Asp Lys Asp Gln Glu Ile Lys Ser

995 1000 1005

Lys Ile Leu Cys Arg Ile Ile Phe Asn Ser Asp Phe Leu Lys Lys

1010 1015 1020

Tyr Lys Lys Glu Ile Asp Asn Leu Ile Glu Asp Met Glu Ser Glu

1025 1030 1035

Asn Glu Asn Lys Phe Gln Glu Ile Tyr Tyr Pro Lys Glu Arg Lys

1040 1045 1050

Asn Glu Leu Tyr Ile Tyr Lys Lys Asn Leu Phe Leu Asn Ile Gly

1055 1060 1065

Asn Pro Asn Phe Asp Lys Ile Tyr Gly Leu Ile Ser Asn Asp Ile

1070 1075 1080

Lys Met Ala Asp Ala Lys Phe Leu Phe Asn Ile Asp Gly Lys Asn

1085 1090 1095

Ile Arg Lys Asn Lys Ile Ser Glu Ile Asp Ala Ile Leu Lys Asn

1100 1105 1110

Leu Asn Asp Lys Leu Asn Gly Tyr Ser Lys Glu Tyr Lys Glu Lys

1115 1120 1125

Tyr Ile Lys Lys Leu Lys Glu Asn Asp Asp Phe Phe Ala Lys Asn

1130 1135 1140

Ile Gln Asn Lys Asn Tyr Lys Ser Phe Glu Lys Asp Tyr Asn Arg

1145 1150 1155

Val Ser Glu Tyr Lys Lys Ile Arg Asp Leu Val Glu Phe Asn Tyr

1160 1165 1170

Leu Asn Lys Ile Glu Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Trp Lys Leu

1175 1180 1185

Ala Ile Gln Met Ala Arg Phe Glu Arg Asp Met His Tyr Ile Val

1190 1195 1200

Asn Gly Leu Arg Glu Leu Gly Ile Ile Lys Leu Ser Gly Tyr Asn

1205 1210 1215

Thr Gly Ile Ser Arg Ala Tyr Pro Lys Arg Asn Gly Ser Asp Gly

1220 1225 1230

Phe Tyr Thr Thr Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser

1235 1240 1245

Tyr Lys Lys Phe Glu Lys Ile Cys Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Leu

1250 1255 1260

Ser Glu Asn Ser Glu Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg

1265 1270 1275

Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp

1280 1285 1290

Tyr Ser Ile Ala Glu Gln Ile Asp Arg Val Ser Asn Leu Leu Ser

1295 1300 1305

Tyr Ser Thr Arg Tyr Asn Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Val Phe Glu

1310 1315 1320

Val Phe Lys Lys Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys

1325 1330 1335

Lys Phe Lys Leu Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met

1340 1345 1350

Lys Pro Lys Lys Val Ser Val Leu Glu Leu Glu Ser Tyr Asn Ser

1355 1360 1365

Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu

1370 1375 1380

Asn Thr Asn Asp Thr Leu

1385

<210> 46

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 46

guuuuagucc ccuucgauau uggggugguc uauauc 36

<210> 47

<211> 95

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 47

auugaugugg uauacuaaaa auggaaaauu guauuuuuga uuagaaagau guaaaauuga 60

uuuaauuuaa aaauauuuua uuagauuaaa guaga 95

<210> 48

<211> 1300

<212> PRT

<213> Leptotrichia shahii

<400> 48

Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys

20 25 30

Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys

35 40 45

Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu

50 55 60

Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser

65 70 75 80

Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys

85 90 95

Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr

100 105 110

Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile

115 120 125

Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln

130 135 140

Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr

145 150 155 160

Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr

165 170 175

Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser

180 185 190

Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu

195 200 205

Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu

225 230 235 240

Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg

245 250 255

Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr

260 265 270

Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile

290 295 300

Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys

305 310 315 320

Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser

325 330 335

Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met

340 345 350

Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys

355 360 365

Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln

370 375 380

Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr

385 390 395 400

Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala

405 410 415

Val Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn

420 425 430

Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala

435 440 445

Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn

450 455 460

Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala

465 470 475 480

Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys

485 490 495

Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys

500 505 510

Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp

515 520 525

Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His

530 535 540

Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His

545 550 555 560

Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val

565 570 575

Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser

580 585 590

Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly

595 600 605

Trp Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys

610 615 620

Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile

625 630 635 640

Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys

645 650 655

Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val

660 665 670

Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile

675 680 685

Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln

690 695 700

Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe

705 710 715 720

Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp

725 730 735

Phe Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu

740 745 750

Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn

755 760 765

Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr

770 775 780

Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg

785 790 795 800

Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn

805 810 815

Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr

820 825 830

Arg Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala

835 840 845

Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu

850 855 860

Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe

865 870 875 880

His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe

885 890 895

Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His

900 905 910

Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu

915 920 925

Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile

930 935 940

Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile

945 950 955 960

Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn

965 970 975

Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile

980 985 990

Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu

995 1000 1005

Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val

1010 1015 1020

Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu

1025 1030 1035

Val Phe Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg

1040 1045 1050

Ala Tyr Gln Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly

1055 1060 1065

Lys Gln Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser

1070 1075 1080

Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys

1085 1090 1095

Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp

1100 1105 1110

Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe

1115 1120 1125

Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr

1130 1135 1140

Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn Phe Arg Asn Ser Asp

1145 1150 1155

Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr Pro Thr Lys Glu

1160 1165 1170

Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr Gly His Gly

1175 1180 1185

Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys Lys Phe

1190 1195 1200

Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg

1205 1210 1215

Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val

1220 1225 1230

Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys

1235 1240 1245

Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly

1250 1255 1260

Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu

1265 1270 1275

Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu

1280 1285 1290

Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn

1295 1300

<210> 49

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 49

gucuaagaac uuuaaauaau uucuacuguu guagau 36

<210> 50

<211> 71

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 50

aucuacaaaa uuauaaacua aauaaagauu cuuauaauaa cuuuauauau aaucgaaaug 60

uagagaauuu u 71

<210> 51

<211> 1300

<212> PRT

<213> Francisella ularensis

<400> 51

Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys

20 25 30

Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys

35 40 45

Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu

50 55 60

Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser

65 70 75 80

Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys

85 90 95

Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr

100 105 110

Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile

115 120 125

Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln

130 135 140

Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr

145 150 155 160

Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr

165 170 175

Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser

180 185 190

Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu

195 200 205

Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu

225 230 235 240

Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg

245 250 255

Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr

260 265 270

Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile

290 295 300

Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys

305 310 315 320

Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser

325 330 335

Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met

340 345 350

Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys

355 360 365

Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln

370 375 380

Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr

385 390 395 400

Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala

405 410 415

Val Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn

420 425 430

Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala

435 440 445

Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn

450 455 460

Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala

465 470 475 480

Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys

485 490 495

Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys

500 505 510

Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp

515 520 525

Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His

530 535 540

Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His

545 550 555 560

Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val

565 570 575

Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser

580 585 590

Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly

595 600 605

Trp Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys

610 615 620

Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile

625 630 635 640

Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys

645 650 655

Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val

660 665 670

Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile

675 680 685

Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln

690 695 700

Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe

705 710 715 720

Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp

725 730 735

Phe Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu

740 745 750

Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn

755 760 765

Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr

770 775 780

Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg

785 790 795 800

Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn

805 810 815

Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr

820 825 830

Arg Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala

835 840 845

Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu

850 855 860

Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe

865 870 875 880

His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe

885 890 895

Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His

900 905 910

Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu

915 920 925

Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile

930 935 940

Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile

945 950 955 960

Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn

965 970 975

Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile

980 985 990

Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu

995 1000 1005

Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val

1010 1015 1020

Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu

1025 1030 1035

Val Phe Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg

1040 1045 1050

Ala Tyr Gln Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly

1055 1060 1065

Lys Gln Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser

1070 1075 1080

Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys

1085 1090 1095

Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp

1100 1105 1110

Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe

1115 1120 1125

Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr

1130 1135 1140

Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn Phe Arg Asn Ser Asp

1145 1150 1155

Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr Pro Thr Lys Glu

1160 1165 1170

Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr Gly His Gly

1175 1180 1185

Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys Lys Phe

1190 1195 1200

Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg

1205 1210 1215

Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val

1220 1225 1230

Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys

1235 1240 1245

Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly

1250 1255 1260

Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu

1265 1270 1275

Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu

1280 1285 1290

Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn

1295 1300

<210> 52

<211> 138

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 52

aaaaggccgg cggccacgaa aaaggccggc caggcaaaaa agaaaaaggg atcctaccca 60

tacgatgttc cagattacgc ttatccctac gacgtgcctg attatgcata cccatatgat 120

gtccccgact atgcctaa 138

<210> 53

<211> 1388

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 53

Met Ser Leu Asn Arg Ile Tyr Gln Gly Arg Val Ala Ala Val Glu Thr

1 5 10 15

Gly Thr Ala Leu Ala Lys Gly Asn Val Glu Trp Met Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Asp Glu Val Leu Trp Gln His His Glu Leu Phe Gln Ala Ala Ile

35 40 45

Asn Tyr Tyr Leu Val Ala Leu Leu Ala Leu Ala Asp Lys Asn Asn Pro

50 55 60

Val Leu Gly Pro Leu Ile Ser Gln Met Asp Asn Pro Gln Ser Pro Tyr

65 70 75 80

His Val Trp Gly Ser Phe Arg Arg Gln Gly Arg Gln Arg Thr Gly Leu

85 90 95

Ser Gln Ala Val Ala Pro Tyr Ile Thr Pro Gly Asn Asn Ala Pro Thr

100 105 110

Leu Asp Glu Val Phe Arg Ser Ile Leu Ala Gly Asn Pro Thr Asp Arg

115 120 125

Ala Thr Leu Asp Ala Ala Leu Met Gln Leu Leu Lys Ala Cys Asp Gly

130 135 140

Ala Gly Ala Ile Gln Gln Glu Gly Arg Ser Tyr Trp Pro Lys Phe Cys

145 150 155 160

Asp Pro Asp Ser Thr Ala Asn Phe Ala Gly Asp Pro Ala Met Leu Arg

165 170 175

Arg Glu Gln His Arg Leu Leu Leu Pro Gln Val Leu His Asp Pro Ala

180 185 190

Ile Thr His Asp Ser Pro Ala Leu Gly Ser Phe Asp Thr Tyr Ser Ile

195 200 205

Ala Thr Pro Asp Thr Arg Thr Pro Gln Leu Thr Gly Pro Lys Ala Arg

210 215 220

Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ile Thr Leu Trp Arg Val Arg Leu Pro Glu

225 230 235 240

Ser Ala Ala Asp Phe Asp Arg Leu Ala Ser Ser Leu Lys Lys Ile Pro

245 250 255

Asp Asp Asp Ser Arg Leu Asn Leu Gln Gly Tyr Val Gly Ser Ser Ala

260 265 270

Lys Gly Glu Val Gln Ala Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Phe Arg His

275 280 285

Leu Glu Arg Ser Ser Phe Thr Leu Gly Leu Leu Arg Ser Ala Thr Pro

290 295 300

Pro Pro Lys Asn Ala Glu Thr Pro Pro Pro Ala Gly Val Pro Leu Pro

305 310 315 320

Ala Ala Ser Ala Ala Asp Pro Val Arg Ile Ala Arg Gly Lys Arg Ser

325 330 335

Phe Val Phe Arg Ala Phe Thr Ser Leu Pro Cys Trp His Gly Gly Asp

340 345 350

Asn Ile His Pro Thr Trp Lys Ser Phe Asp Ile Ala Ala Phe Lys Tyr

355 360 365

Ala Leu Thr Val Ile Asn Gln Ile Glu Glu Lys Thr Lys Glu Arg Gln

370 375 380

Lys Glu Cys Ala Glu Leu Glu Thr Asp Phe Asp Tyr Met His Gly Arg

385 390 395 400

Leu Ala Lys Ile Pro Val Lys Tyr Thr Thr Gly Glu Ala Glu Pro Pro

405 410 415

Pro Ile Leu Ala Asn Asp Leu Arg Ile Pro Leu Leu Arg Glu Leu Leu

420 425 430

Gln Asn Ile Lys Val Asp Thr Ala Leu Thr Asp Gly Glu Ala Val Ser

435 440 445

Tyr Gly Leu Gln Arg Arg Thr Ile Arg Gly Phe Arg Glu Leu Arg Arg

450 455 460

Ile Trp Arg Gly His Ala Pro Ala Gly Thr Val Phe Ser Ser Glu Leu

465 470 475 480

Lys Glu Lys Leu Ala Gly Glu Leu Arg Gln Phe Gln Thr Asp Asn Ser

485 490 495

Thr Thr Ile Gly Ser Val Gln Leu Phe Asn Glu Leu Ile Gln Asn Pro

500 505 510

Lys Tyr Trp Pro Ile Trp Gln Ala Pro Asp Val Glu Thr Ala Arg Gln

515 520 525

Trp Ala Asp Ala Gly Phe Ala Asp Asp Pro Leu Ala Ala Leu Val Gln

530 535 540

Glu Ala Glu Leu Gln Glu Asp Ile Asp Ala Leu Lys Ala Pro Val Lys

545 550 555 560

Leu Thr Pro Ala Asp Pro Glu Tyr Ser Arg Arg Gln Tyr Asp Phe Asn

565 570 575

Ala Val Ser Lys Phe Gly Ala Gly Ser Arg Ser Ala Asn Arg His Glu

580 585 590

Pro Gly Gln Thr Glu Arg Gly His Asn Thr Phe Thr Thr Glu Ile Ala

595 600 605

Ala Arg Asn Ala Ala Asp Gly Asn Arg Trp Arg Ala Thr His Val Arg

610 615 620

Ile His Tyr Ser Ala Pro Arg Leu Leu Arg Asp Gly Leu Arg Arg Pro

625 630 635 640

Asp Thr Asp Gly Asn Glu Ala Leu Glu Ala Val Pro Trp Leu Gln Pro

645 650 655

Met Met Glu Ala Leu Ala Pro Leu Pro Thr Leu Pro Gln Asp Leu Thr

660 665 670

Gly Met Pro Val Phe Leu Met Pro Asp Val Thr Leu Ser Gly Glu Arg

675 680 685

Arg Ile Leu Leu Asn Leu Pro Val Thr Leu Glu Pro Ala Ala Leu Val

690 695 700

Glu Gln Leu Gly Asn Ala Gly Arg Trp Gln Asn Gln Phe Phe Gly Ser

705 710 715 720

Arg Glu Asp Pro Phe Ala Leu Arg Trp Pro Ala Asp Gly Ala Val Lys

725 730 735

Thr Ala Lys Gly Lys Thr His Ile Pro Trp His Gln Asp Arg Asp His

740 745 750

Phe Thr Val Leu Gly Val Asp Leu Gly Thr Arg Asp Ala Gly Ala Leu

755 760 765

Ala Leu Leu Asn Val Thr Ala Gln Lys Pro Ala Lys Pro Val His Arg

770 775 780

Ile Ile Gly Glu Ala Asp Gly Arg Thr Trp Tyr Ala Ser Leu Ala Asp

785 790 795 800

Ala Arg Met Ile Arg Leu Pro Gly Glu Asp Ala Arg Leu Phe Val Arg

805 810 815

Gly Lys Leu Val Gln Glu Pro Tyr Gly Glu Arg Gly Arg Asn Ala Ser

820 825 830

Leu Leu Glu Trp Glu Asp Ala Arg Asn Ile Ile Leu Arg Leu Gly Gln

835 840 845

Asn Pro Asp Glu Leu Leu Gly Ala Asp Pro Arg Arg His Ser Tyr Pro

850 855 860

Glu Ile Asn Asp Lys Leu Leu Val Ala Leu Arg Arg Ala Gln Ala Arg

865 870 875 880

Leu Ala Arg Leu Gln Asn Arg Ser Trp Arg Leu Arg Asp Leu Ala Glu

885 890 895

Ser Asp Lys Ala Leu Asp Glu Ile His Ala Glu Arg Ala Gly Glu Lys

900 905 910

Pro Ser Pro Leu Pro Pro Leu Ala Arg Asp Asp Ala Ile Lys Ser Thr

915 920 925

Asp Glu Ala Leu Leu Ser Gln Arg Asp Ile Ile Arg Arg Ser Phe Val

930 935 940

Gln Ile Ala Asn Leu Ile Leu Pro Leu Arg Gly Arg Arg Trp Glu Trp

945 950 955 960

Arg Pro His Val Glu Val Pro Asp Cys His Ile Leu Ala Gln Ser Asp

965 970 975

Pro Gly Thr Asp Asp Thr Lys Arg Leu Val Ala Gly Gln Arg Gly Ile

980 985 990

Ser His Glu Arg Ile Glu Gln Ile Glu Glu Leu Arg Arg Arg Cys Gln

995 1000 1005

Ser Leu Asn Arg Ala Leu Arg His Lys Pro Gly Glu Arg Pro Val

1010 1015 1020

Leu Gly Arg Pro Ala Lys Gly Glu Glu Ile Ala Asp Pro Cys Pro

1025 1030 1035

Ala Leu Leu Glu Lys Ile Asn Arg Leu Arg Asp Gln Arg Val Asp

1040 1045 1050

Gln Thr Ala His Ala Ile Leu Ala Ala Ala Leu Gly Val Arg Leu

1055 1060 1065

Arg Ala Pro Ser Lys Asp Arg Ala Glu Arg Arg His Arg Asp Ile

1070 1075 1080

His Gly Glu Tyr Glu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Asp Phe Val Val

1085 1090 1095

Ile Glu Asn Leu Ser Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Asp Arg Ala Arg

1100 1105 1110

Ser Glu Asn Thr Arg Leu Met Gln Trp Cys His Arg Gln Ile Val

1115 1120 1125

Gln Lys Leu Arg Gln Leu Cys Glu Thr Tyr Gly Ile Pro Val Leu

1130 1135 1140

Ala Val Pro Ala Ala Tyr Ser Ser Arg Phe Ser Ser Arg Asp Gly

1145 1150 1155

Ser Ala Gly Phe Arg Ala Val His Leu Thr Pro Asp His Arg His

1160 1165 1170

Arg Met Pro Trp Ser Arg Ile Leu Ala Arg Leu Lys Ala His Glu

1175 1180 1185

Glu Asp Gly Lys Arg Leu Glu Lys Thr Val Leu Asp Glu Ala Arg

1190 1195 1200

Ala Val Arg Gly Leu Phe Asp Arg Leu Asp Arg Phe Asn Ala Gly

1205 1210 1215

His Val Pro Gly Lys Pro Trp Arg Thr Leu Leu Ala Pro Leu Pro

1220 1225 1230

Gly Gly Pro Val Phe Val Pro Leu Gly Asp Ala Thr Pro Met Gln

1235 1240 1245

Ala Asp Leu Asn Ala Ala Ile Asn Ile Ala Leu Arg Gly Ile Ala

1250 1255 1260

Ala Pro Asp Arg His Asp Ile His His Arg Leu Arg Ala Glu Asn

1265 1270 1275

Lys Lys Arg Ile Leu Ser Leu Arg Leu Gly Thr Gln Arg Glu Lys

1280 1285 1290

Ala Arg Trp Pro Gly Gly Ala Pro Ala Val Thr Leu Ser Thr Pro

1295 1300 1305

Asn Asn Gly Ala Ser Pro Glu Asp Ser Asp Ala Leu Pro Glu Arg

1310 1315 1320

Val Ser Asn Leu Phe Val Asp Ile Ala Gly Val Ala Asn Phe Glu

1325 1330 1335

Arg Val Thr Ile Glu Gly Val Ser Gln Lys Phe Ala Thr Gly Arg

1340 1345 1350

Gly Leu Trp Ala Ser Val Lys Gln Arg Ala Trp Asn Arg Val Ala

1355 1360 1365

Arg Leu Asn Glu Thr Val Thr Asp Asn Asn Arg Asn Glu Glu Glu

1370 1375 1380

Asp Asp Ile Pro Met

1385

<210> 54

<211> 1108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 54

Met Ala Thr Arg Ser Phe Ile Leu Lys Ile Glu Pro Asn Glu Glu Val

1 5 10 15

Lys Lys Gly Leu Trp Lys Thr His Glu Val Leu Asn His Gly Ile Ala

20 25 30

Tyr Tyr Met Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg Gln Glu Ala Ile Tyr Glu

35 40 45

His His Glu Gln Asp Pro Lys Asn Pro Lys Lys Val Ser Lys Ala Glu

50 55 60

Ile Gln Ala Glu Leu Trp Asp Phe Val Leu Lys Met Gln Lys Cys Asn

65 70 75 80

Ser Phe Thr His Glu Val Asp Lys Asp Val Val Phe Asn Ile Leu Arg

85 90 95

Glu Leu Tyr Glu Glu Leu Val Pro Ser Ser Val Glu Lys Lys Gly Glu

100 105 110

Ala Asn Gln Leu Ser Asn Lys Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Pro Asn

115 120 125

Ser Gln Ser Gly Lys Gly Thr Ala Ser Ser Gly Arg Lys Pro Arg Trp

130 135 140

Tyr Asn Leu Lys Ile Ala Gly Asp Pro Ser Trp Glu Glu Glu Lys Lys

145 150 155 160

Lys Trp Glu Glu Asp Lys Lys Lys Asp Pro Leu Ala Lys Ile Leu Gly

165 170 175

Lys Leu Ala Glu Tyr Gly Leu Ile Pro Leu Phe Ile Pro Phe Thr Asp

180 185 190

Ser Asn Glu Pro Ile Val Lys Glu Ile Lys Trp Met Glu Lys Ser Arg

195 200 205

Asn Gln Ser Val Arg Arg Leu Asp Lys Asp Met Phe Ile Gln Ala Leu

210 215 220

Glu Arg Phe Leu Ser Trp Glu Ser Trp Asn Leu Lys Val Lys Glu Glu

225 230 235 240

Tyr Glu Lys Val Glu Lys Glu His Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ile Lys

245 250 255

Glu Asp Ile Gln Ala Phe Lys Ser Leu Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Arg

260 265 270

Gln Glu Gln Leu Leu Arg Asp Thr Leu Asn Thr Asn Glu Tyr Arg Leu

275 280 285

Ser Lys Arg Gly Leu Arg Gly Trp Arg Glu Ile Ile Gln Lys Trp Leu

290 295 300

Lys Met Asp Glu Asn Glu Pro Ser Glu Lys Tyr Leu Glu Val Phe Lys

305 310 315 320

Asp Tyr Gln Arg Lys His Pro Arg Glu Ala Gly Asp Tyr Ser Val Tyr

325 330 335

Glu Phe Leu Ser Lys Lys Glu Asn His Phe Ile Trp Arg Asn His Pro

340 345 350

Glu Tyr Pro Tyr Leu Tyr Ala Thr Phe Cys Glu Ile Asp Lys Lys Lys

355 360 365

Lys Asp Ala Lys Gln Gln Ala Thr Phe Thr Leu Ala Asp Pro Ile Asn

370 375 380

His Pro Leu Trp Val Arg Phe Glu Glu Arg Ser Gly Ser Asn Leu Asn

385 390 395 400

Lys Tyr Arg Ile Leu Thr Glu Gln Leu His Thr Glu Lys Leu Lys Lys

405 410 415

Lys Leu Thr Val Gln Leu Asp Arg Leu Ile Tyr Pro Thr Glu Ser Gly

420 425 430

Gly Trp Glu Glu Lys Gly Lys Val Asp Ile Val Leu Leu Pro Ser Arg

435 440 445

Gln Phe Tyr Asn Gln Ile Phe Leu Asp Ile Glu Glu Lys Gly Lys His

450 455 460

Ala Phe Thr Tyr Lys Asp Glu Ser Ile Lys Phe Pro Leu Lys Gly Thr

465 470 475 480

Leu Gly Gly Ala Arg Val Gln Phe Asp Arg Asp His Leu Arg Arg Tyr

485 490 495

Pro His Lys Val Glu Ser Gly Asn Val Gly Arg Ile Tyr Phe Asn Met

500 505 510

Thr Val Asn Ile Glu Pro Thr Glu Ser Pro Val Ser Lys Ser Leu Lys

515 520 525

Ile His Arg Asp Asp Phe Pro Lys Phe Val Asn Phe Lys Pro Lys Glu

530 535 540

Leu Thr Glu Trp Ile Lys Asp Ser Lys Gly Lys Lys Leu Lys Ser Gly

545 550 555 560

Ile Glu Ser Leu Glu Ile Gly Leu Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly

565 570 575

Gln Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ile Phe Glu Val Val Asp Gln Lys

580 585 590

Pro Asp Ile Glu Gly Lys Leu Phe Phe Pro Ile Lys Gly Thr Glu Leu

595 600 605

Tyr Ala Val His Arg Ala Ser Phe Asn Ile Lys Leu Pro Gly Glu Thr

610 615 620

Leu Val Lys Ser Arg Glu Val Leu Arg Lys Ala Arg Glu Asp Asn Leu

625 630 635 640

Lys Leu Met Asn Gln Lys Leu Asn Phe Leu Arg Asn Val Leu His Phe

645 650 655

Gln Gln Phe Glu Asp Ile Thr Glu Arg Glu Lys Arg Val Thr Lys Trp

660 665 670

Ile Ser Arg Gln Glu Asn Ser Asp Val Pro Leu Val Tyr Gln Asp Glu

675 680 685

Leu Ile Gln Ile Arg Glu Leu Met Tyr Lys Pro Tyr Lys Asp Trp Val

690 695 700

Ala Phe Leu Lys Gln Leu His Lys Arg Leu Glu Val Glu Ile Gly Lys

705 710 715 720

Glu Val Lys His Trp Arg Lys Ser Leu Ser Asp Gly Arg Lys Gly Leu

725 730 735

Tyr Gly Ile Ser Leu Lys Asn Ile Asp Glu Ile Asp Arg Thr Arg Lys

740 745 750

Phe Leu Leu Arg Trp Ser Leu Arg Pro Thr Glu Pro Gly Glu Val Arg

755 760 765

Arg Leu Glu Pro Gly Gln Arg Phe Ala Ile Asp Gln Leu Asn His Leu

770 775 780

Asn Ala Leu Lys Glu Asp Arg Leu Lys Lys Met Ala Asn Thr Ile Ile

785 790 795 800

Met His Ala Leu Gly Tyr Cys Tyr Asp Val Arg Lys Lys Lys Trp Gln

805 810 815

Ala Lys Asn Pro Ala Cys Gln Ile Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ser Asn

820 825 830

Tyr Asn Pro Tyr Glu Glu Arg Ser Arg Phe Glu Asn Ser Lys Leu Met

835 840 845

Lys Trp Ser Arg Arg Glu Ile Pro Arg Gln Val Ala Leu Gln Gly Glu

850 855 860

Ile Tyr Gly Leu Gln Val Gly Glu Val Gly Ala Gln Phe Ser Ser Arg

865 870 875 880

Phe His Ala Lys Thr Gly Ser Pro Gly Ile Arg Cys Ser Val Val Thr

885 890 895

Lys Glu Lys Leu Gln Asp Asn Arg Phe Phe Lys Asn Leu Gln Arg Glu

900 905 910

Gly Arg Leu Thr Leu Asp Lys Ile Ala Val Leu Lys Glu Gly Asp Leu

915 920 925

Tyr Pro Asp Lys Gly Gly Glu Lys Phe Ile Ser Leu Ser Lys Asp Arg

930 935 940

Lys Leu Val Thr Thr His Ala Asp Ile Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln

945 950 955 960

Lys Arg Phe Trp Thr Arg Thr His Gly Phe Tyr Lys Val Tyr Cys Lys

965 970 975

Ala Tyr Gln Val Asp Gly Gln Thr Val Tyr Ile Pro Glu Ser Lys Asp

980 985 990

Gln Lys Gln Lys Ile Ile Glu Glu Phe Gly Glu Gly Tyr Phe Ile Leu

995 1000 1005

Lys Asp Gly Val Tyr Glu Trp Gly Asn Ala Gly Lys Leu Lys Ile

1010 1015 1020

Lys Lys Gly Ser Ser Lys Gln Ser Ser Ser Glu Leu Val Asp Ser

1025 1030 1035

Asp Ile Leu Lys Asp Ser Phe Asp Leu Ala Ser Glu Leu Lys Gly

1040 1045 1050

Glu Lys Leu Met Leu Tyr Arg Asp Pro Ser Gly Asn Val Phe Pro

1055 1060 1065

Ser Asp Lys Trp Met Ala Ala Gly Val Phe Phe Gly Lys Leu Glu

1070 1075 1080

Arg Ile Leu Ile Ser Lys Leu Thr Asn Gln Tyr Ser Ile Ser Thr

1085 1090 1095

Ile Glu Asp Asp Ser Ser Lys Gln Ser Met

1100 1105

<210> 55

<211> 1108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 55

Met Ala Ile Arg Ser Ile Lys Leu Lys Leu Lys Thr His Thr Gly Pro

1 5 10 15

Glu Ala Gln Asn Leu Arg Lys Gly Ile Trp Arg Thr His Arg Leu Leu

20 25 30

Asn Glu Gly Val Ala Tyr Tyr Met Lys Met Leu Leu Leu Phe Arg Gln

35 40 45

Glu Ser Thr Gly Glu Arg Pro Lys Glu Glu Leu Gln Glu Glu Leu Ile

50 55 60

Cys His Ile Arg Glu Gln Gln Gln Arg Asn Gln Ala Asp Lys Asn Thr

65 70 75 80

Gln Ala Leu Pro Leu Asp Lys Ala Leu Glu Ala Leu Arg Gln Leu Tyr

85 90 95

Glu Leu Leu Val Pro Ser Ser Val Gly Gln Ser Gly Asp Ala Gln Ile

100 105 110

Ile Ser Arg Lys Phe Leu Ser Pro Leu Val Asp Pro Asn Ser Glu Gly

115 120 125

Gly Lys Gly Thr Ser Lys Ala Gly Ala Lys Pro Thr Trp Gln Lys Lys

130 135 140

Lys Glu Ala Asn Asp Pro Thr Trp Glu Gln Asp Tyr Glu Lys Trp Lys

145 150 155 160

Lys Arg Arg Glu Glu Asp Pro Thr Ala Ser Val Ile Thr Thr Leu Glu

165 170 175

Glu Tyr Gly Ile Arg Pro Ile Phe Pro Leu Tyr Thr Asn Thr Val Thr

180 185 190

Asp Ile Ala Trp Leu Pro Leu Gln Ser Asn Gln Phe Val Arg Thr Trp

195 200 205

Asp Arg Asp Met Leu Gln Gln Ala Ile Glu Arg Leu Leu Ser Trp Glu

210 215 220

Ser Trp Asn Lys Arg Val Gln Glu Glu Tyr Ala Lys Leu Lys Glu Lys

225 230 235 240

Met Ala Gln Leu Asn Glu Gln Leu Glu Gly Gly Gln Glu Trp Ile Ser

245 250 255

Leu Leu Glu Gln Tyr Glu Glu Asn Arg Glu Arg Glu Leu Arg Glu Asn

260 265 270

Met Thr Ala Ala Asn Asp Lys Tyr Arg Ile Thr Lys Arg Gln Met Lys

275 280 285

Gly Trp Asn Glu Leu Tyr Glu Leu Trp Ser Thr Phe Pro Ala Ser Ala

290 295 300

Ser His Glu Gln Tyr Lys Glu Ala Leu Lys Arg Val Gln Gln Arg Leu

305 310 315 320

Arg Gly Arg Phe Gly Asp Ala His Phe Phe Gln Tyr Leu Met Glu Glu

325 330 335

Lys Asn Arg Leu Ile Trp Lys Gly Asn Pro Gln Arg Ile His Tyr Phe

340 345 350

Val Ala Arg Asn Glu Leu Thr Lys Arg Leu Glu Glu Ala Lys Gln Ser

355 360 365

Ala Thr Met Thr Leu Pro Asn Ala Arg Lys His Pro Leu Trp Val Arg

370 375 380

Phe Asp Ala Arg Gly Gly Asn Leu Gln Asp Tyr Tyr Leu Thr Ala Glu

385 390 395 400

Ala Asp Lys Pro Arg Ser Arg Arg Phe Val Thr Phe Ser Gln Leu Ile

405 410 415

Trp Pro Ser Glu Ser Gly Trp Met Glu Lys Lys Asp Val Glu Val Glu

420 425 430

Leu Ala Leu Ser Arg Gln Phe Tyr Gln Gln Val Lys Leu Leu Lys Asn

435 440 445

Asp Lys Gly Lys Gln Lys Ile Glu Phe Lys Asp Lys Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Thr Phe Asn Gly His Leu Gly Gly Ala Lys Leu Gln Leu Glu Arg Gly

465 470 475 480

Asp Leu Glu Lys Glu Glu Lys Asn Phe Glu Asp Gly Glu Ile Gly Ser

485 490 495

Val Tyr Leu Asn Val Val Ile Asp Phe Glu Pro Leu Gln Glu Val Lys

500 505 510

Asn Gly Arg Val Gln Ala Pro Tyr Gly Gln Val Leu Gln Leu Ile Arg

515 520 525

Arg Pro Asn Glu Phe Pro Lys Val Thr Thr Tyr Lys Ser Glu Gln Leu

530 535 540

Val Glu Trp Ile Lys Ala Ser Pro Gln His Ser Ala Gly Val Glu Ser

545 550 555 560

Leu Ala Ser Gly Phe Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly Leu Arg Ala

565 570 575

Ala Ala Ala Thr Ser Ile Phe Ser Val Glu Glu Ser Ser Asp Lys Asn

580 585 590

Ala Ala Asp Phe Ser Tyr Trp Ile Glu Gly Thr Pro Leu Val Ala Val

595 600 605

His Gln Arg Ser Tyr Met Leu Arg Leu Pro Gly Glu Gln Val Glu Lys

610 615 620

Gln Val Met Glu Lys Arg Asp Glu Arg Phe Gln Leu His Gln Arg Val

625 630 635 640

Lys Phe Gln Ile Arg Val Leu Ala Gln Ile Met Arg Met Ala Asn Lys

645 650 655

Gln Tyr Gly Asp Arg Trp Asp Glu Leu Asp Ser Leu Lys Gln Ala Val

660 665 670

Glu Gln Lys Lys Ser Pro Leu Asp Gln Thr Asp Arg Thr Phe Trp Glu

675 680 685

Gly Ile Val Cys Asp Leu Thr Lys Val Leu Pro Arg Asn Glu Ala Asp

690 695 700

Trp Glu Gln Ala Val Val Gln Ile His Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Val

705 710 715 720

Gly Lys Ala Val Gln Ala Trp Arg Lys Arg Phe Ala Ala Asp Glu Arg

725 730 735

Lys Gly Ile Ala Gly Leu Ser Met Trp Asn Ile Glu Glu Leu Glu Gly

740 745 750

Leu Arg Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ser Arg Arg Thr Arg Asn Pro Gln

755 760 765

Glu Val Asn Arg Phe Glu Arg Gly His Thr Ser His Gln Arg Leu Leu

770 775 780

Thr His Ile Gln Asn Val Lys Glu Asp Arg Leu Lys Gln Leu Ser His

785 790 795 800

Ala Ile Val Met Thr Ala Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Glu Arg Lys Gln

805 810 815

Glu Trp Cys Ala Glu Tyr Pro Ala Cys Gln Val Ile Leu Phe Glu Asn

820 825 830

Leu Ser Gln Tyr Arg Ser Asn Leu Asp Arg Ser Thr Lys Glu Asn Ser

835 840 845

Thr Leu Met Lys Trp Ala His Arg Ser Ile Pro Lys Tyr Val His Met

850 855 860

Gln Ala Glu Pro Tyr Gly Ile Gln Ile Gly Asp Val Arg Ala Glu Tyr

865 870 875 880

Ser Ser Arg Phe Tyr Ala Lys Thr Gly Thr Pro Gly Ile Arg Cys Lys

885 890 895

Lys Val Arg Gly Gln Asp Leu Gln Gly Arg Arg Phe Glu Asn Leu Gln

900 905 910

Lys Arg Leu Val Asn Glu Gln Phe Leu Thr Glu Glu Gln Val Lys Gln

915 920 925

Leu Arg Pro Gly Asp Ile Val Pro Asp Asp Ser Gly Glu Leu Phe Met

930 935 940

Thr Leu Thr Asp Gly Ser Gly Ser Lys Glu Val Val Phe Leu Gln Ala

945 950 955 960

Asp Ile Asn Ala Ala His Asn Leu Gln Lys Arg Phe Trp Gln Arg Tyr

965 970 975

Asn Glu Leu Phe Lys Val Ser Cys Arg Val Ile Val Arg Asp Glu Glu

980 985 990

Glu Tyr Leu Val Pro Lys Thr Lys Ser Val Gln Ala Lys Leu Gly Lys

995 1000 1005

Gly Leu Phe Val Lys Lys Ser Asp Thr Ala Trp Lys Asp Val Tyr

1010 1015 1020

Val Trp Asp Ser Gln Ala Lys Leu Lys Gly Lys Thr Thr Phe Thr

1025 1030 1035

Glu Glu Ser Glu Ser Pro Glu Gln Leu Glu Asp Phe Gln Glu Ile

1040 1045 1050

Ile Glu Glu Ala Glu Glu Ala Lys Gly Thr Tyr Arg Thr Leu Phe

1055 1060 1065

Arg Asp Pro Ser Gly Val Phe Phe Pro Glu Ser Val Trp Tyr Pro

1070 1075 1080

Gln Lys Asp Phe Trp Gly Glu Val Lys Arg Lys Leu Tyr Gly Lys

1085 1090 1095

Leu Arg Glu Arg Phe Leu Thr Lys Ala Arg

1100 1105

<210> 56

<211> 1334

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 56

Met Lys Ile Ser Lys Val Asp His Thr Arg Met Ala Val Ala Lys Gly

1 5 10 15

Asn Gln His Arg Arg Asp Glu Ile Ser Gly Ile Leu Tyr Lys Asp Pro

20 25 30

Thr Lys Thr Gly Ser Ile Asp Phe Asp Glu Arg Phe Lys Lys Leu Asn

35 40 45

Cys Ser Ala Lys Ile Leu Tyr His Val Phe Asn Gly Ile Ala Glu Gly

50 55 60

Ser Asn Lys Tyr Lys Asn Ile Val Asp Lys Val Asn Asn Asn Leu Asp

65 70 75 80

Arg Val Leu Phe Thr Gly Lys Ser Tyr Asp Arg Lys Ser Ile Ile Asp

85 90 95

Ile Asp Thr Val Leu Arg Asn Val Glu Lys Ile Asn Ala Phe Asp Arg

100 105 110

Ile Ser Thr Glu Glu Arg Glu Gln Ile Ile Asp Asp Leu Leu Glu Ile

115 120 125

Gln Leu Arg Lys Gly Leu Arg Lys Gly Lys Ala Gly Leu Arg Glu Val

130 135 140

Leu Leu Ile Gly Ala Gly Val Ile Val Arg Thr Asp Lys Lys Gln Glu

145 150 155 160

Ile Ala Asp Phe Leu Glu Ile Leu Asp Glu Asp Phe Asn Lys Thr Asn

165 170 175

Gln Ala Lys Asn Ile Lys Leu Ser Ile Glu Asn Gln Gly Leu Val Val

180 185 190

Ser Pro Val Ser Arg Gly Glu Glu Arg Ile Phe Asp Val Ser Gly Ala

195 200 205

Gln Lys Gly Lys Ser Ser Lys Lys Ala Gln Glu Lys Glu Ala Leu Ser

210 215 220

Ala Phe Leu Leu Asp Tyr Ala Asp Leu Asp Lys Asn Val Arg Phe Glu

225 230 235 240

Tyr Leu Arg Lys Ile Arg Arg Leu Ile Asn Leu Tyr Phe Tyr Val Lys

245 250 255

Asn Asp Asp Val Met Ser Leu Thr Glu Ile Pro Ala Glu Val Asn Leu

260 265 270

Glu Lys Asp Phe Asp Ile Trp Arg Asp His Glu Gln Arg Lys Glu Glu

275 280 285

Asn Gly Asp Phe Val Gly Cys Pro Asp Ile Leu Leu Ala Asp Arg Asp

290 295 300

Val Lys Lys Ser Asn Ser Lys Gln Val Lys Ile Ala Glu Arg Gln Leu

305 310 315 320

Arg Glu Ser Ile Arg Glu Lys Asn Ile Lys Arg Tyr Arg Phe Ser Ile

325 330 335

Lys Thr Ile Glu Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Phe Phe Ala Asn Lys Gln

340 345 350

Ile Ser Val Phe Trp Ile His Arg Ile Glu Asn Ala Val Glu Arg Ile

355 360 365

Leu Gly Ser Ile Asn Asp Lys Lys Leu Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Tyr

370 375 380

Leu Gly Glu Lys Val Trp Lys Asp Ile Leu Asn Phe Leu Ser Ile Lys

385 390 395 400

Tyr Ile Ala Val Gly Lys Ala Val Phe Asn Phe Ala Met Asp Asp Leu

405 410 415

Gln Glu Lys Asp Arg Asp Ile Glu Pro Gly Lys Ile Ser Glu Asn Ala

420 425 430

Val Asn Gly Leu Thr Ser Phe Asp Tyr Glu Gln Ile Lys Ala Asp Glu

435 440 445

Met Leu Gln Arg Glu Val Ala Val Asn Val Ala Phe Ala Ala Asn Asn

450 455 460

Leu Ala Arg Val Thr Val Asp Ile Pro Gln Asn Gly Glu Lys Glu Asp

465 470 475 480

Ile Leu Leu Trp Asn Lys Ser Asp Ile Lys Lys Tyr Lys Lys Asn Ser

485 490 495

Lys Lys Gly Ile Leu Lys Ser Ile Leu Gln Phe Phe Gly Gly Ala Ser

500 505 510

Thr Trp Asn Met Lys Met Phe Glu Ile Ala Tyr His Asp Gln Pro Gly

515 520 525

Asp Tyr Glu Glu Asn Tyr Leu Tyr Asp Ile Ile Gln Ile Ile Tyr Ser

530 535 540

Leu Arg Asn Lys Ser Phe His Phe Lys Thr Tyr Asp His Gly Asp Lys

545 550 555 560

Asn Trp Asn Arg Glu Leu Ile Gly Lys Met Ile Glu His Asp Ala Glu

565 570 575

Arg Val Ile Ser Val Glu Arg Glu Lys Phe His Ser Asn Asn Leu Pro

580 585 590

Met Phe Tyr Lys Asp Ala Asp Leu Lys Lys Ile Leu Asp Leu Leu Tyr

595 600 605

Ser Asp Tyr Ala Gly Arg Ala Ser Gln Val Pro Ala Phe Asn Thr Val

610 615 620

Leu Val Arg Lys Asn Phe Pro Glu Phe Leu Arg Lys Asp Met Gly Tyr

625 630 635 640

Lys Val His Phe Asn Asn Pro Glu Val Glu Asn Gln Trp His Ser Ala

645 650 655

Val Tyr Tyr Leu Tyr Lys Glu Ile Tyr Tyr Asn Leu Phe Leu Arg Asp

660 665 670

Lys Glu Val Lys Asn Leu Phe Tyr Thr Ser Leu Lys Asn Ile Arg Ser

675 680 685

Glu Val Ser Asp Lys Lys Gln Lys Leu Ala Ser Asp Asp Phe Ala Ser

690 695 700

Arg Cys Glu Glu Ile Glu Asp Arg Ser Leu Pro Glu Ile Cys Gln Ile

705 710 715 720

Ile Met Thr Glu Tyr Asn Ala Gln Asn Phe Gly Asn Arg Lys Val Lys

725 730 735

Ser Gln Arg Val Ile Glu Lys Asn Lys Asp Ile Phe Arg His Tyr Lys

740 745 750

Met Leu Leu Ile Lys Thr Leu Ala Gly Ala Phe Ser Leu Tyr Leu Lys

755 760 765

Gln Glu Arg Phe Ala Phe Ile Gly Lys Ala Thr Pro Ile Pro Tyr Glu

770 775 780

Thr Thr Asp Val Lys Asn Phe Leu Pro Glu Trp Lys Ser Gly Met Tyr

785 790 795 800

Ala Ser Phe Val Glu Glu Ile Lys Asn Asn Leu Asp Leu Gln Glu Trp

805 810 815

Tyr Ile Val Gly Arg Phe Leu Asn Gly Arg Met Leu Asn Gln Leu Ala

820 825 830

Gly Ser Leu Arg Ser Tyr Ile Gln Tyr Ala Glu Asp Ile Glu Arg Arg

835 840 845

Ala Ala Glu Asn Arg Asn Lys Leu Phe Ser Lys Pro Asp Glu Lys Ile

850 855 860

Glu Ala Cys Lys Lys Ala Val Arg Val Leu Asp Leu Cys Ile Lys Ile

865 870 875 880

Ser Thr Arg Ile Ser Ala Glu Phe Thr Asp Tyr Phe Asp Ser Glu Asp

885 890 895

Asp Tyr Ala Asp Tyr Leu Glu Lys Tyr Leu Lys Tyr Gln Asp Asp Ala

900 905 910

Ile Lys Glu Leu Ser Gly Ser Ser Tyr Ala Ala Leu Asp His Phe Cys

915 920 925

Asn Lys Asp Asp Leu Lys Phe Asp Ile Tyr Val Asn Ala Gly Gln Lys

930 935 940

Pro Ile Leu Gln Arg Asn Ile Val Met Ala Lys Leu Phe Gly Pro Asp

945 950 955 960

Asn Ile Leu Ser Glu Val Met Glu Lys Val Thr Glu Ser Ala Ile Arg

965 970 975

Glu Tyr Tyr Asp Tyr Leu Lys Lys Val Ser Gly Tyr Arg Val Arg Gly

980 985 990

Lys Cys Ser Thr Glu Lys Glu Gln Glu Asp Leu Leu Lys Phe Gln Arg

995 1000 1005

Leu Lys Asn Ala Val Glu Phe Arg Asp Val Thr Glu Tyr Ala Glu

1010 1015 1020

Val Ile Asn Glu Leu Leu Gly Gln Leu Ile Ser Trp Ser Tyr Leu

1025 1030 1035

Arg Glu Arg Asp Leu Leu Tyr Phe Gln Leu Gly Phe His Tyr Met

1040 1045 1050

Cys Leu Lys Asn Lys Ser Phe Lys Pro Ala Glu Tyr Val Asp Ile

1055 1060 1065

Arg Arg Asn Asn Gly Thr Ile Ile His Asn Ala Ile Leu Tyr Gln

1070 1075 1080

Ile Val Ser Met Tyr Ile Asn Gly Leu Asp Phe Tyr Ser Cys Asp

1085 1090 1095

Lys Glu Gly Lys Thr Leu Lys Pro Ile Glu Thr Gly Lys Gly Val

1100 1105 1110

Gly Ser Lys Ile Gly Gln Phe Ile Lys Tyr Ser Gln Tyr Leu Tyr

1115 1120 1125

Asn Asp Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Ile Tyr Asn Ala Gly Leu Glu

1130 1135 1140

Val Phe Glu Asn Ile Asp Glu His Asp Asn Ile Thr Asp Leu Arg

1145 1150 1155

Lys Tyr Val Asp His Phe Lys Tyr Tyr Ala Tyr Gly Asn Lys Met

1160 1165 1170

Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Ser Glu Phe Phe Asp Arg Phe Phe Thr

1175 1180 1185

Tyr Asp Met Lys Tyr Gln Lys Asn Val Val Asn Val Leu Glu Asn

1190 1195 1200

Ile Leu Leu Arg His Phe Val Ile Phe Tyr Pro Lys Phe Gly Ser

1205 1210 1215

Gly Lys Lys Asp Val Gly Ile Arg Asp Cys Lys Lys Glu Arg Ala

1220 1225 1230

Gln Ile Glu Ile Ser Glu Gln Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Met

1235 1240 1245

Phe Lys Leu Asp Asp Lys Ala Gly Glu Glu Ala Lys Lys Phe Pro

1250 1255 1260

Ala Arg Asp Glu Arg Tyr Leu Gln Thr Ile Ala Lys Leu Leu Tyr

1265 1270 1275

Tyr Pro Asn Glu Ile Glu Asp Met Asn Arg Phe Met Lys Lys Gly

1280 1285 1290

Glu Thr Ile Asn Lys Lys Val Gln Phe Asn Arg Lys Lys Lys Ile

1295 1300 1305

Thr Arg Lys Gln Lys Asn Asn Ser Ser Asn Glu Val Leu Ser Ser

1310 1315 1320

Thr Met Gly Tyr Leu Phe Lys Asn Ile Lys Leu

1325 1330

<210> 57

<211> 1120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 57

Met Trp Ile Ser Ile Lys Thr Leu Ile His His Leu Gly Val Leu Phe

1 5 10 15

Phe Cys Asp Tyr Met Tyr Asn Arg Arg Glu Lys Lys Ile Ile Glu Val

20 25 30

Lys Thr Met Arg Ile Thr Lys Val Glu Val Asp Arg Lys Lys Val Leu

35 40 45

Ile Ser Arg Asp Lys Asn Gly Gly Lys Leu Val Tyr Glu Asn Glu Met

50 55 60

Gln Asp Asn Thr Glu Gln Ile Met His His Lys Lys Ser Ser Phe Tyr

65 70 75 80

Lys Ser Val Val Asn Lys Thr Ile Cys Arg Pro Glu Gln Lys Gln Met

85 90 95

Lys Lys Leu Val His Gly Leu Leu Gln Glu Asn Ser Gln Glu Lys Ile

100 105 110

Lys Val Ser Asp Val Thr Lys Leu Asn Ile Ser Asn Phe Leu Asn His

115 120 125

Arg Phe Lys Lys Ser Leu Tyr Tyr Phe Pro Glu Asn Ser Pro Asp Lys

130 135 140

Ser Glu Glu Tyr Arg Ile Glu Ile Asn Leu Ser Gln Leu Leu Glu Asp

145 150 155 160

Ser Leu Lys Lys Gln Gln Gly Thr Phe Ile Cys Trp Glu Ser Phe Ser

165 170 175

Lys Asp Met Glu Leu Tyr Ile Asn Trp Ala Glu Asn Tyr Ile Ser Ser

180 185 190

Lys Thr Lys Leu Ile Lys Lys Ser Ile Arg Asn Asn Arg Ile Gln Ser

195 200 205

Thr Glu Ser Arg Ser Gly Gln Leu Met Asp Arg Tyr Met Lys Asp Ile

210 215 220

Leu Asn Lys Asn Lys Pro Phe Asp Ile Gln Ser Val Ser Glu Lys Tyr

225 230 235 240

Gln Leu Glu Lys Leu Thr Ser Ala Leu Lys Ala Thr Phe Lys Glu Ala

245 250 255

Lys Lys Asn Asp Lys Glu Ile Asn Tyr Lys Leu Lys Ser Thr Leu Gln

260 265 270

Asn His Glu Arg Gln Ile Ile Glu Glu Leu Lys Glu Asn Ser Glu Leu

275 280 285

Asn Gln Phe Asn Ile Glu Ile Arg Lys His Leu Glu Thr Tyr Phe Pro

290 295 300

Ile Lys Lys Thr Asn Arg Lys Val Gly Asp Ile Arg Asn Leu Glu Ile

305 310 315 320

Gly Glu Ile Gln Lys Ile Val Asn His Arg Leu Lys Asn Lys Ile Val

325 330 335

Gln Arg Ile Leu Gln Glu Gly Lys Leu Ala Ser Tyr Glu Ile Glu Ser

340 345 350

Thr Val Asn Ser Asn Ser Leu Gln Lys Ile Lys Ile Glu Glu Ala Phe

355 360 365

Ala Leu Lys Phe Ile Asn Ala Cys Leu Phe Ala Ser Asn Asn Leu Arg

370 375 380

Asn Met Val Tyr Pro Val Cys Lys Lys Asp Ile Leu Met Ile Gly Glu

385 390 395 400

Phe Lys Asn Ser Phe Lys Glu Ile Lys His Lys Lys Phe Ile Arg Gln

405 410 415

Trp Ser Gln Phe Phe Ser Gln Glu Ile Thr Val Asp Asp Ile Glu Leu

420 425 430

Ala Ser Trp Gly Leu Arg Gly Ala Ile Ala Pro Ile Arg Asn Glu Ile

435 440 445

Ile His Leu Lys Lys His Ser Trp Lys Lys Phe Phe Asn Asn Pro Thr

450 455 460

Phe Lys Val Lys Lys Ser Lys Ile Ile Asn Gly Lys Thr Lys Asp Val

465 470 475 480

Thr Ser Glu Phe Leu Tyr Lys Glu Thr Leu Phe Lys Asp Tyr Phe Tyr

485 490 495

Ser Glu Leu Asp Ser Val Pro Glu Leu Ile Ile Asn Lys Met Glu Ser

500 505 510

Ser Lys Ile Leu Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Gln Leu Asn Gln Val Phe

515 520 525

Thr Ile Pro Asn Phe Glu Leu Ser Leu Leu Thr Ser Ala Val Pro Phe

530 535 540

Ala Pro Ser Phe Lys Arg Val Tyr Leu Lys Gly Phe Asp Tyr Gln Asn

545 550 555 560

Gln Asp Glu Ala Gln Pro Asp Tyr Asn Leu Lys Leu Asn Ile Tyr Asn

565 570 575

Glu Lys Ala Phe Asn Ser Glu Ala Phe Gln Ala Gln Tyr Ser Leu Phe

580 585 590

Lys Met Val Tyr Tyr Gln Val Phe Leu Pro Gln Phe Thr Thr Asn Asn

595 600 605

Asp Leu Phe Lys Ser Ser Val Asp Phe Ile Leu Thr Leu Asn Lys Glu

610 615 620

Arg Lys Gly Tyr Ala Lys Ala Phe Gln Asp Ile Arg Lys Met Asn Lys

625 630 635 640

Asp Glu Lys Pro Ser Glu Tyr Met Ser Tyr Ile Gln Ser Gln Leu Met

645 650 655

Leu Tyr Gln Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Lys Ile Asn His Phe Glu

660 665 670

Lys Phe Ile Asn Gln Val Phe Ile Lys Gly Phe Asn Ser Phe Ile Glu

675 680 685

Lys Asn Arg Leu Thr Tyr Ile Cys His Pro Thr Lys Asn Thr Val Pro

690 695 700

Glu Asn Asp Asn Ile Glu Ile Pro Phe His Thr Asp Met Asp Asp Ser

705 710 715 720

Asn Ile Ala Phe Trp Leu Met Cys Lys Leu Leu Asp Ala Lys Gln Leu

725 730 735

Ser Glu Leu Arg Asn Glu Met Ile Lys Phe Ser Cys Ser Leu Gln Ser

740 745 750

Thr Glu Glu Ile Ser Thr Phe Thr Lys Ala Arg Glu Val Ile Gly Leu

755 760 765

Ala Leu Leu Asn Gly Glu Lys Gly Cys Asn Asp Trp Lys Glu Leu Phe

770 775 780

Asp Asp Lys Glu Ala Trp Lys Lys Asn Met Ser Leu Tyr Val Ser Glu

785 790 795 800

Glu Leu Leu Gln Ser Leu Pro Tyr Thr Gln Glu Asp Gly Gln Thr Pro

805 810 815

Val Ile Asn Arg Ser Ile Asp Leu Val Lys Lys Tyr Gly Thr Glu Thr

820 825 830

Ile Leu Glu Lys Leu Phe Ser Ser Ser Asp Asp Tyr Lys Val Ser Ala

835 840 845

Lys Asp Ile Ala Lys Leu His Glu Tyr Asp Val Thr Glu Lys Ile Ala

850 855 860

Gln Gln Glu Ser Leu His Lys Gln Trp Ile Glu Lys Pro Gly Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asp Ser Ala Trp Thr Lys Lys Tyr Gln Asn Val Ile Asn Asp Ile

885 890 895

Ser Asn Tyr Gln Trp Ala Lys Thr Lys Val Glu Leu Thr Gln Val Arg

900 905 910

His Leu His Gln Leu Thr Ile Asp Leu Leu Ser Arg Leu Ala Gly Tyr

915 920 925

Met Ser Ile Ala Asp Arg Asp Phe Gln Phe Ser Ser Asn Tyr Ile Leu

930 935 940

Glu Arg Glu Asn Ser Glu Tyr Arg Val Thr Ser Trp Ile Leu Leu Ser

945 950 955 960

Glu Asn Lys Asn Lys Asn Lys Tyr Asn Asp Tyr Glu Leu Tyr Asn Leu

965 970 975

Lys Asn Ala Ser Ile Lys Val Ser Ser Lys Asn Asp Pro Gln Leu Lys

980 985 990

Val Asp Leu Lys Gln Leu Arg Leu Thr Leu Glu Tyr Leu Glu Leu Phe

995 1000 1005

Asp Asn Arg Leu Lys Glu Lys Arg Asn Asn Ile Ser His Phe Asn

1010 1015 1020

Tyr Leu Asn Gly Gln Leu Gly Asn Ser Ile Leu Glu Leu Phe Asp

1025 1030 1035

Asp Ala Arg Asp Val Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala

1040 1045 1050

Val Ser Lys Ser Leu Lys Glu Ile Leu Ser Ser His Gly Met Glu

1055 1060 1065

Val Thr Phe Lys Pro Leu Tyr Gln Thr Asn His His Leu Lys Ile

1070 1075 1080

Asp Lys Leu Gln Pro Lys Lys Ile His His Leu Gly Glu Lys Ser

1085 1090 1095

Thr Val Ser Ser Asn Gln Val Ser Asn Glu Tyr Cys Gln Leu Val

1100 1105 1110

Arg Thr Leu Leu Thr Met Lys

1115 1120

<210> 58

<211> 1152

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 58

Met Lys Val Thr Lys Val Asp Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Ile Glu

1 5 10 15

Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu

20 25 30

Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr Ile Lys Asn

35 40 45

Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp Ser Val Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp Lys Asn Tyr

85 90 95

Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Lys Asn Lys Asn Ser Phe

100 105 110

Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala Lys Leu Asn Lys Ile Asn

130 135 140

Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile

145 150 155 160

Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile

165 170 175

Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asn Asp Tyr Ile Asn

180 185 190

Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu Asp Ile Glu

195 200 205

Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys Lys His Glu Lys Tyr Lys

210 215 220

Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu

225 230 235 240

Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Ile

245 250 255

Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser

260 265 270

Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys

275 280 285

Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln

290 295 300

Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp

305 310 315 320

Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu

325 330 335

Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys

340 345 350

Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile

355 360 365

Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val

370 375 380

Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn

385 390 395 400

Glu Asn Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn

405 410 415

Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn

420 425 430

Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser

435 440 445

Tyr Asp Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala

450 455 460

Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe

465 470 475 480

Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala

485 490 495

Pro Ser Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys

500 505 510

Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe

515 520 525

Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys Tyr Leu Lys Asn Thr Lys

530 535 540

Phe Asn Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys

545 550 555 560

Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn Thr Leu Lys Phe Phe Trp

565 570 575

Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu

580 585 590

Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Lys Phe Val Lys Asn Ser

595 600 605

Lys Val Phe Phe Lys Ile Thr Asn Glu Val Ile Lys Ile Asn Lys Gln

610 615 620

Arg Asn Gln Lys Thr Gly His Tyr Lys Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Ile

625 630 635 640

Glu Lys Thr Val Pro Val Glu Tyr Leu Ala Ile Ile Gln Ser Arg Glu

645 650 655

Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile Asp Phe

660 665 670

Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Lys Asn

675 680 685

Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ser Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asn Asp Ile

690 695 700

Phe Ser Lys Ile Lys Ile Lys Lys Asp Asn Lys Glu Lys Tyr Asp Lys

705 710 715 720

Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg Asn Lys Glu Ile Pro His

725 730 735

Glu Ile Asn Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys Leu Gly Lys Ile Leu Lys

740 745 750

Tyr Thr Glu Asn Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu Leu Asn

755 760 765

His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Ser

770 775 780

Ala Asn Lys Glu Glu Thr Phe Ser Asp Glu Leu Glu Leu Ile Asn Leu

785 790 795 800

Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu Glu Ala

805 810 815

Asn Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Glu Asn Lys Ile Lys Asp

820 825 830

Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe Asp Gly

835 840 845

Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys Tyr Gly

850 855 860

Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile

865 870 875 880

Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu Ile Glu

885 890 895

Lys Asn Tyr Thr Met Gln Gln Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala Arg Pro

900 905 910

Lys Lys Asp Glu Lys Phe Asn Asp Glu Asp Tyr Lys Glu Tyr Glu Lys

915 920 925

Ala Ile Gly Asn Ile Gln Lys Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys Val Glu

930 935 940

Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Lys Ile Leu His

945 950 955 960

Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg Phe Arg

965 970 975

Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn His Tyr Ile Glu Glu Ile Phe Asn

980 985 990

Phe Asp Asn Ser Lys Asn Val Lys Tyr Lys Ser Gly Gln Ile Val Glu

995 1000 1005

Lys Tyr Ile Asn Phe Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Asp Asn Val Glu

1010 1015 1020

Lys Arg Ser Ile Tyr Ser Asp Lys Lys Val Lys Lys Leu Lys Gln

1025 1030 1035

Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn

1040 1045 1050

Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn

1055 1060 1065

Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Ile

1070 1075 1080

Met Lys Ser Ile Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala

1085 1090 1095

Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Glu Ile Gln Thr Leu

1100 1105 1110

Glu Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys

1115 1120 1125

Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys

1130 1135 1140

Val Met Phe Glu Tyr Lys Ala Leu Glu

1145 1150

<210> 59

<211> 1389

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 59

Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys

1 5 10 15

Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp

20 25 30

Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys

35 40 45

Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn

50 55 60

Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile

65 70 75 80

Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn

85 90 95

Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr

100 105 110

Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile

115 120 125

Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile

130 135 140

Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg

145 150 155 160

Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg

165 170 175

Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile

180 185 190

Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile

195 200 205

Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His

210 215 220

Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr

225 230 235 240

Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu

245 250 255

Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser

260 265 270

Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp

275 280 285

Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe

290 295 300

Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Val Asn Asn Glu

305 310 315 320

Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu

325 330 335

Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp

340 345 350

Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys

355 360 365

Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asp Glu Leu Ile

370 375 380

Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile

385 390 395 400

Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys

405 410 415

Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr

420 425 430

Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys

435 440 445

Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn

450 455 460

Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr

465 470 475 480

Leu Glu His Ile Met Tyr Leu Gly Lys Leu Arg His Asn Asp Ile Asp

485 490 495

Met Thr Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu

500 505 510

Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu

515 520 525

Leu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Glu Asn Ile Asn Asn Asp Glu Asn Ile

530 535 540

Asp Phe Phe Gly Gly Asp Arg Glu Lys Asn Tyr Val Leu Asp Lys Lys

545 550 555 560

Ile Leu Asn Ser Lys Ile Lys Ile Ile Arg Asp Leu Asp Phe Ile Asp

565 570 575

Asn Lys Asn Asn Ile Thr Asn Asn Phe Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile

580 585 590

Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu His Ala Ile Ser Lys Glu Arg

595 600 605

Asp Leu Gln Gly Thr Gln Asp Asp Tyr Asn Lys Val Ile Asn Ile Ile

610 615 620

Gln Asn Leu Lys Ile Ser Asp Glu Glu Val Ser Lys Ala Leu Asn Leu

625 630 635 640

Asp Val Val Phe Lys Asp Lys Lys Asn Ile Ile Thr Lys Ile Asn Asp

645 650 655

Ile Lys Ile Ser Glu Glu Asn Asn Asn Asp Ile Lys Tyr Leu Pro Ser

660 665 670

Phe Ser Lys Val Leu Pro Glu Ile Leu Asn Leu Tyr Arg Asn Asn Pro

675 680 685

Lys Asn Glu Pro Phe Asp Thr Ile Glu Thr Glu Lys Ile Val Leu Asn

690 695 700

Ala Leu Ile Tyr Val Asn Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ile Leu Glu

705 710 715 720

Asp Asp Leu Glu Glu Asn Glu Ser Lys Asn Ile Phe Leu Gln Glu Leu

725 730 735

Lys Lys Thr Leu Gly Asn Ile Asp Glu Ile Asp Glu Asn Ile Ile Glu

740 745 750

Asn Tyr Tyr Lys Asn Ala Gln Ile Ser Ala Ser Lys Gly Asn Asn Lys

755 760 765

Ala Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Lys Val Ile Glu Cys Tyr Ile Gly Tyr

770 775 780

Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Phe Ser Asp Phe Lys Met

785 790 795 800

Asn Ile Gln Glu Ile Lys Lys Gln Ile Lys Asp Ile Asn Asp Asn Lys

805 810 815

Thr Tyr Glu Arg Ile Thr Val Lys Thr Ser Asp Lys Thr Ile Val Ile

820 825 830

Asn Asp Asp Phe Glu Tyr Ile Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser

835 840 845

Asn Ala Val Ile Asn Lys Ile Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val

850 855 860

Trp Leu Asn Thr Ser Glu Tyr Gln Asn Ile Ile Asp Ile Leu Asp Glu

865 870 875 880

Ile Met Gln Leu Asn Thr Leu Arg Asn Glu Cys Ile Thr Glu Asn Trp

885 890 895

Asn Leu Asn Leu Glu Glu Phe Ile Gln Lys Met Lys Glu Ile Glu Lys

900 905 910

Asp Phe Asp Asp Phe Lys Ile Gln Thr Lys Lys Glu Ile Phe Asn Asn

915 920 925

Tyr Tyr Glu Asp Ile Lys Asn Asn Ile Leu Thr Glu Phe Lys Asp Asp

930 935 940

Ile Asn Gly Cys Asp Val Leu Glu Lys Lys Leu Glu Lys Ile Val Ile

945 950 955 960

Phe Asp Asp Glu Thr Lys Phe Glu Ile Asp Lys Lys Ser Asn Ile Leu

965 970 975

Gln Asp Glu Gln Arg Lys Leu Ser Asn Ile Asn Lys Lys Asp Leu Lys

980 985 990

Lys Lys Val Asp Gln Tyr Ile Lys Asp Lys Asp Gln Glu Ile Lys Ser

995 1000 1005

Lys Ile Leu Cys Arg Ile Ile Phe Asn Ser Asp Phe Leu Lys Lys

1010 1015 1020

Tyr Lys Lys Glu Ile Asp Asn Leu Ile Glu Asp Met Glu Ser Glu

1025 1030 1035

Asn Glu Asn Lys Phe Gln Glu Ile Tyr Tyr Pro Lys Glu Arg Lys

1040 1045 1050

Asn Glu Leu Tyr Ile Tyr Lys Lys Asn Leu Phe Leu Asn Ile Gly

1055 1060 1065

Asn Pro Asn Phe Asp Lys Ile Tyr Gly Leu Ile Ser Asn Asp Ile

1070 1075 1080

Lys Met Ala Asp Ala Lys Phe Leu Phe Asn Ile Asp Gly Lys Asn

1085 1090 1095

Ile Arg Lys Asn Lys Ile Ser Glu Ile Asp Ala Ile Leu Lys Asn

1100 1105 1110

Leu Asn Asp Lys Leu Asn Gly Tyr Ser Lys Glu Tyr Lys Glu Lys

1115 1120 1125

Tyr Ile Lys Lys Leu Lys Glu Asn Asp Asp Phe Phe Ala Lys Asn

1130 1135 1140

Ile Gln Asn Lys Asn Tyr Lys Ser Phe Glu Lys Asp Tyr Asn Arg

1145 1150 1155

Val Ser Glu Tyr Lys Lys Ile Arg Asp Leu Val Glu Phe Asn Tyr

1160 1165 1170

Leu Asn Lys Ile Glu Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Trp Lys Leu

1175 1180 1185

Ala Ile Gln Met Ala Arg Phe Glu Arg Asp Met His Tyr Ile Val

1190 1195 1200

Asn Gly Leu Arg Glu Leu Gly Ile Ile Lys Leu Ser Gly Tyr Asn

1205 1210 1215

Thr Gly Ile Ser Arg Ala Tyr Pro Lys Arg Asn Gly Ser Asp Gly

1220 1225 1230

Phe Tyr Thr Thr Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser

1235 1240 1245

Tyr Lys Lys Phe Glu Lys Ile Cys Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Leu

1250 1255 1260

Ser Glu Asn Ser Glu Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg

1265 1270 1275

Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp

1280 1285 1290

Tyr Ser Ile Ala Glu Gln Ile Asp Arg Val Ser Asn Leu Leu Ser

1295 1300 1305

Tyr Ser Thr Arg Tyr Asn Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Val Phe Glu

1310 1315 1320

Val Phe Lys Lys Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys

1325 1330 1335

Lys Phe Lys Leu Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met

1340 1345 1350

Lys Pro Lys Lys Val Ser Val Leu Glu Leu Glu Ser Tyr Asn Ser

1355 1360 1365

Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu

1370 1375 1380

Asn Thr Asn Asp Thr Leu

1385

<210> 60

<211> 1300

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 60

Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys

20 25 30

Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys

35 40 45

Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu

50 55 60

Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser

65 70 75 80

Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys

85 90 95

Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr

100 105 110

Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile

115 120 125

Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln

130 135 140

Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr

145 150 155 160

Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr

165 170 175

Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser

180 185 190

Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu

195 200 205

Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu

225 230 235 240

Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg

245 250 255

Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr

260 265 270

Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile

290 295 300

Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys

305 310 315 320

Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser

325 330 335

Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met

340 345 350

Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys

355 360 365

Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln

370 375 380

Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr

385 390 395 400

Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala

405 410 415

Val Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn

420 425 430

Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala

435 440 445

Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn

450 455 460

Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala

465 470 475 480

Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys

485 490 495

Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys

500 505 510

Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp

515 520 525

Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His

530 535 540

Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His

545 550 555 560

Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val

565 570 575

Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser

580 585 590

Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly

595 600 605

Trp Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys

610 615 620

Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile

625 630 635 640

Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys

645 650 655

Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val

660 665 670

Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile

675 680 685

Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln

690 695 700

Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe

705 710 715 720

Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp

725 730 735

Phe Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu

740 745 750

Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn

755 760 765

Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr

770 775 780

Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg

785 790 795 800

Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn

805 810 815

Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr

820 825 830

Arg Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala

835 840 845

Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu

850 855 860

Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe

865 870 875 880

His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe

885 890 895

Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His

900 905 910

Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu

915 920 925

Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile

930 935 940

Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile

945 950 955 960

Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn

965 970 975

Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile

980 985 990

Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu

995 1000 1005

Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val

1010 1015 1020

Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu

1025 1030 1035

Val Phe Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg

1040 1045 1050

Ala Tyr Gln Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly

1055 1060 1065

Lys Gln Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser

1070 1075 1080

Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys

1085 1090 1095

Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp

1100 1105 1110

Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe

1115 1120 1125

Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr

1130 1135 1140

Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn Phe Arg Asn Ser Asp

1145 1150 1155

Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr Pro Thr Lys Glu

1160 1165 1170

Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr Gly His Gly

1175 1180 1185

Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys Lys Phe

1190 1195 1200

Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg

1205 1210 1215

Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val

1220 1225 1230

Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys

1235 1240 1245

Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly

1250 1255 1260

Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu

1265 1270 1275

Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu

1280 1285 1290

Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn

1295 1300

<210> 61

<211> 7403

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 61

tatccggtcg aatcgagaat gacgaccgct acgtcttgga ctacgaagcc gtggcccttg 60

ccgatgctct cggtgtggat gttgccgacc tgttccgcaa gatcgattgc cccaagaacc 120

tgctgcgcag gcgggcaggg taggggagcg gtttccggcg gagattttcg gaggcgccgg 180

taacgttatg tcggggaatt tgctatacat cgacgataat tagttttgtt gattcaggat 240

cgaaatgcgc tcaaacaaag aacgttccgc gtttccctca tgcgctacta cgcccacacc 300

gccatctttc ggcacgcaaa caaagcagat gggttgcctg tcaatgggtg atcattgcct 360

gaagttacca tccatcaata atataaatca tccttactcc gaatgtccct caatcgcatc 420

tatcaaggcc gcgtggcggc cgtcgaaaca ggaacggcct tagcgaaagg taatgtcgaa 480

tggatgcctg ccgcaggagg cgacgaagtt ctctggcagc accacgaact tttccaagct 540

gccatcaact actatctcgt cgccctgctc gcactcgccg acaaaaacaa tcccgtactt 600

ggcccgctga tcagccagat ggataatccc caaagccctt accatgtctg gggaagtttc 660

cgccgccaag gacgtcagcg cacaggtctc agtcaagccg ttgcacctta tatcacgccg 720

ggcaataacg ctcccaccct tgacgaagtt ttccgctcca ttcttgcggg caacccaacc 780

gaccgcgcaa ctttggacgc tgcactcatg caattgctca aggcttgtga cggcgcgggc 840

gctatccagc aggaaggtcg ttcctactgg cccaaattct gcgatcctga ctccactgcc 900

aacttcgcgg gagatccggc catgctccgg cgtgaacaac accgcctcct ccttccgcaa 960

gttctccacg atccggcgat tactcacgac agtcctgccc ttggctcgtt cgacacttat 1020

tcgattgcta cccccgacac cagaactcct caactcaccg gccccaaggc acgcgcccgt 1080

cttgagcagg cgatcaccct ctggcgcgtc cgtcttcccg aatcggctgc tgacttcgat 1140

cgccttgcca gttccctcaa aaaaattccg gacgacgatt ctcgccttaa ccttcagggc 1200

tacgtcggca gcagtgcgaa aggcgaagtt caggcccgtc ttttcgccct tctgctattc 1260

cgtcacctgg agcgttcctc ctttacgctt ggccttctcc gttccgccac cccgccgccc 1320

aagaacgctg aaacacctcc tcccgccggc gttcctttac ctgcggcgtc cgcagccgat 1380

ccggtgcgga tagcccgtgg caaacgcagt tttgtttttc gcgcattcac cagtctcccc 1440

tgctggcatg gcggtgataa catccatccc acctggaagt cattcgacat cgcagcgttc 1500

aaatatgccc tcacggtcat caaccagatc gaggaaaaga cgaaagaacg ccaaaaagaa 1560

tgtgcggaac ttgaaactga tttcgactac atgcacggac ggctcgccaa gattccggta 1620

aaatacacga ccggcgaagc cgaaccgccc cccattctcg caaacgatct ccgcatcccc 1680

ctcctccgcg aacttctcca gaatatcaag gtcgacaccg cactcaccga tggcgaagcc 1740

gtctcctatg gtctccaacg ccgcaccatt cgcggtttcc gcgagctgcg ccgcatctgg 1800

cgcggccatg cccccgctgg cacggtcttt tccagcgagt tgaaagaaaa actagccggc 1860

gaactccgcc agttccagac cgacaactcc accaccatcg gcagcgtcca actcttcaac 1920

gaactcatcc aaaacccgaa atactggccc atctggcagg ctcctgacgt cgaaaccgcc 1980

cgccaatggg ccgatgccgg ttttgccgac gatccgctcg ccgcccttgt gcaagaagcc 2040

gaactccagg aagacatcga cgccctcaag gctccagtca aactcactcc ggccgatcct 2100

gagtattcaa gaaggcaata cgatttcaat gccgtcagca aattcggggc cggctcccgc 2160

tccgccaatc gccacgaacc cgggcagacg gagcgcggcc acaacacctt taccaccgaa 2220

atcgccgccc gtaacgcggc ggacgggaac cgctggcggg caacccacgt ccgcatccat 2280

tactccgctc cccgccttct tcgtgacgga ctccgccgac ctgacaccga cggcaacgaa 2340

gccctggaag ccgtcccttg gctccagccc atgatggaag ccctcgcccc tctcccgacg 2400

cttccgcaag acctcacagg catgccggtc ttcctcatgc ccgacgtcac cctttccggt 2460

gagcgtcgca tcctcctcaa tcttcctgtc accctcgaac cagccgctct tgtcgaacaa 2520

ctgggcaacg ccggtcgctg gcaaaaccag ttcttcggct cccgcgaaga tccattcgct 2580

ctccgatggc ccgccgacgg tgctgtaaaa accgccaagg ggaaaaccca cataccttgg 2640

caccaggacc gcgatcactt caccgtactc ggcgtggatc tcggcacgcg cgatgccggg 2700

gcgctcgctc ttctcaacgt cactgcgcaa aaaccggcca agccggtcca ccgcatcatt 2760

ggtgaggccg acggacgcac ctggtatgcc agccttgccg acgctcgcat gatccgcctg 2820

cccggggagg atgcccggct ctttgtccgg ggaaaactcg ttcaggaacc ctatggtgaa 2880

cgcgggcgaa acgcgtctct tctcgaatgg gaagacgccc gcaatatcat ccttcgcctt 2940

ggccaaaatc ccgacgaact cctcggcgcc gatccccggc gccattcgta tccggaaata 3000

aacgataaac ttctcgtcgc ccttcgccgc gctcaggccc gtcttgcccg tctccagaac 3060

cggagctggc ggttgcgcga ccttgcagaa tcggacaagg cccttgatga aatccatgcc 3120

gagcgtgccg gggagaagcc ttctccgctt ccgcccttgg ctcgcgacga tgccatcaaa 3180

agcaccgacg aagccctcct ttcccagcgt gacatcatcc ggcgatcctt cgttcagatc 3240

gccaacttga tccttcccct tcgcggacgc cgatgggaat ggcggcccca tgtcgaggtc 3300

ccggattgcc acatccttgc gcagagcgat cccggtacgg atgacaccaa gcgtcttgtc 3360

gccggacaac gcggcatctc tcacgagcgt atcgagcaaa tcgaagaact ccgtcgtcgc 3420

tgccaatccc tcaaccgtgc cctgcgtcac aaacccggag agcgtcccgt gctcggacgc 3480

cccgccaagg gcgaggaaat cgccgatccc tgtcccgcgc tcctcgaaaa gatcaaccgt 3540

ctccgggacc agcgcgttga ccaaaccgcg catgccatcc tcgccgccgc tctcggtgtt 3600

cgactccgcg ccccctcaaa agaccgcgcc gaacgccgcc atcgcgacat ccatggcgaa 3660

tacgaacgct ttcgtgcgcc cgctgatttt gtcgtcatcg aaaacctctc ccgttatctc 3720

agctcgcagg atcgtgctcg tagtgaaaac acccgtctca tgcagtggtg ccatcgccag 3780

atcgtgcaaa aactccgtca gctctgcgag acctacggca tccccgtcct cgccgtcccg 3840

gcggcctact catcgcgttt ttcttcccgg gacggctcgg ccggattccg ggccgtccat 3900

ctgacaccgg accaccgtca ccggatgcca tggagccgca tcctcgcccg cctcaaggcc 3960

cacgaggaag acggaaaaag actcgaaaag acggtgctcg acgaggctcg cgccgtccgg 4020

ggactctttg accggctcga ccggttcaac gccgggcatg tcccgggaaa accttggcgc 4080

acgctcctcg cgccgctccc cggcggccct gtgtttgtcc ccctcgggga cgccacaccc 4140

atgcaggccg atctgaacgc cgccatcaac atcgccctcc ggggcatcgc ggctcccgac 4200

cgccacgaca tccatcaccg gctccgtgcc gaaaacaaaa aacgcatcct gagcttgcgt 4260

ctcggcactc agcgcgagaa agcccgctgg cctggaggag ctccggcggt gacactctcc 4320

actccgaaca acggcgcctc tcccgaagat tccgatgcgt tgcccgaacg ggtatccaac 4380

ctgtttgtgg acatcgccgg tgtcgccaac ttcgagcgag tcacgatcga aggagtctcg 4440

caaaaattcg ccaccgggcg tggcctttgg gcctccgtca agcaacgtgc atggaaccgc 4500

gttgccagac tcaacgagac agtaacagat aacaacagga acgaagagga ggacgacatt 4560

ccgatgtaac cattgcttca ttacatctga gtctcccctc aatccctctg ccccatgcgt 4620

gatataacct ccacctcatg tcccggatcg gcgccggcaa cctgtagttc ccttccatcc 4680

tccaacactc ccgcagatcg cgatccgctg ccgccgatgc cggtgcgccg ccttcacaac 4740

tatctctact gtccgcggct tttttatctc cagtgggtcg agaatctctt tgaggaaaat 4800

gccgacacca ttgccggcag cgccgtgcat cgtcacgccg acaaacctac gcgttacgat 4860

gatgaaaaag ccgaggcact tcgcactggt ctccctgaag gcgcgcacat acgcagcctt 4920

cgcctggaaa acgcccaact cggtctcgtt ggcgtggtgg atatcgtgga gggaggcccc 4980

gacggactcg aactcgtcga ctacaaaaaa ggttccgcct tccgcctcga cgacggcacg 5040

ctcgctccca aggaaaacga caccgtgcaa cttgccgcct acgctcttct cctggctgcc 5100

gatggtgcgc gcgttgcgcc catggcgacg gtctattacg ctgccgatcg ccggcgtgtc 5160

accttcccgc tcgatgacgc cctctacgcc cgcacccgtt ccgccctcga agaggcccgc 5220

gccgttgcaa cctcggggcg catacctccg ccgctcgtct ctgacgtccg ctgcctccat 5280

tgttcctcct atgcgctttg ccttccccgc gagtccgcct ggtggtgccg ccatcgcagc 5340

acgccgcggg gagccggcca cacccccatg ttgccgggct ttgaggatga cgccgccgcc 5400

attcaccaaa tctccgaacc tgacaccgag ccaccacccg atcttgccag ccagcctccc 5460

cgtcccccgc ggctcgatgg agaattgttg gttgtccaga ctccgggagc gatgatcgga 5520

caaagcggcg gtgagtttac cgtgtccgtc aagggtgagg ttttgcgcaa gcttccggtt 5580

catcaactcc gggccattta cgtttacgga gccgtgcaac tcacggcgca tgctgtgcag 5640

accgcccttg aggaggatat cgacgtctcc tattttgcgc ccagcggccg ctttcttggc 5700

ctcctccgcg gcctgcccgc atccggcgtg gatgcgcgtc tcgggcaata caccctgttt 5760

cgcgaaccct ttggccgtct ccgtctcgcc tgcgaggcga ttcgggccaa gatccataac 5820

cagcgcgtcc tcctcatgcg taacggcgag cccggggagg gcgtcttgcg cgaactcgcc 5880

cgtctgcgcg acgccaccag tgaggcgact tcgctcgacg aactcctcgg catcgagggc 5940

atcgccgcgc atttctattt ccagtatttt cccaccatgc tgaaagaacg ggcggcctgg 6000

gcctttgatt tttccggacg caatcgccgc ccgccgcgcg acccggtcaa cgccctgctt 6060

tcgttcggtt acagcgtgtt gtccaaggaa cttgccggcg tctgccacgc tgttggccta 6120

gacccgtttt tcggcttcat gcaccagccg cgttacgggc gccccgcact cgctctcgat 6180

ctgatggagg agtttcgccc tctcatcgcc gacagtgttg ccctgaatct catcaaccgt 6240

ggcgaactcg acgaagggga ctttatccgg tcggccaatg gcaccgcgct caatgatcgg 6300

ggccgccggc gtttttggga ggcatggttc cggcgtctcg acagcgaagt cagccatcct 6360

gaatttggtt acaagatgag ctatcgacgg atgcttgaag tgcaggcgcg ccagctatgg 6420

cgctatgtgc gcggtgacgc cttccgctac cacggattca ccacccgttg attccgatgt 6480

cagatccccg ccgccgttat cttgtgtgtt acgacatcgc caatccgaag cgattgcgcc 6540

aagtggccaa gctgctggag agctatggca cgcgtctgca atactcggtt ttcgaatgtc 6600

ctttggacga tcttcgtctt gaacaggcga aggctgattt gcgcgacacg attaatgccg 6660

accaagacca ggtgttattt gtttcgcttg gccccgaagc caacgatgcc acgttgatca 6720

tcgccacgct tgggctccct tataccgtgc gctcgcgagt gacgattatc tgacccataa 6780

cccacgtgtt gaagaggctg aaaacagacg gacctctatg aagaacaatt gacgttttgg 6840

ccgaactcag cagaccttta tgcggctaag gccaatgatc atccatccta ccgccattgg 6900

gctggagacg ttttttgaaa cggcgagtgc tgcggatagc gagtttctct tggggaggcg 6960

ctcgcggcca cttttacaga ggagatgttc gggcgaactg gccgacctaa caaggcgtac 7020

ccggctcaaa atcgaggcac gctcgcacgg gatgatgtaa ttcgttgttt ttcagcatac 7080

cgtgcgagca cgggccgcag cgaatgccgt ttcacgaatc gtcaggcggc ggggagaagt 7140

catttaataa ggccactgtt aaaagccgca gcgaatgccg tttcacgaat cgtcaggcgg 7200

gcagtggatg tttttccatg aggcgaagaa tttcatcgcc gcagtgaatg ccgtttcacc 7260

attgatgaag aatgcgaggt gaaaacagag aaattgggtc aactctatca ctcttattca 7320

gccatcgttt caagaaagga tacctcgtat tggatacaac acagctcgtt cgttctctct 7380

acctccctcg acaatctcaa gga 7403

<210> 62

<211> 6789

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 62

taataaaatt gaaatatcac tatggattat tgtaatatta ccataaagat aggtgacgtt 60

tttttgaaaa ttgtaaacct aatttgaaga aaaccaatta aaaatcgctt cggctttttt 120

ttaagtgcca ggtagcattg atgctaaccc atgtgtaata aaggtttgtt ttccttcggg 180

gcacgaacac attataaggg aaacctaaag attccctttc ttgtttaata ttataaccag 240

tgaaaataag aataatgcac ctaaaactaa tatacagaaa ataagaatta aaagtactaa 300

tatatacatc atatgttatc ctccaatgct ttatttttta ataattgatg ttagtattag 360

ttttatttta atttctaaac ataagaattt gaaaaggatg tgtttattat ggcgacacgc 420

agttttattt taaaaattga accaaatgaa gaagttaaaa agggattatg gaagacgcat 480

gaggtattga atcatggaat tgcctactac atgaatattc tgaaactaat tagacaggaa 540

gctatttatg aacatcatga acaagatcct aaaaatccga aaaaagtttc aaaagcagaa 600

atacaagccg agttatggga ttttgtttta aaaatgcaaa aatgtaatag ttttacacat 660

gaagttgaca aagatgttgt ttttaacatc ctgcgtgaac tatatgaaga gttggtccct 720

agttcagtcg agaaaaaggg tgaagccaat caattatcga ataagtttct gtacccgcta 780

gttgatccga acagtcaaag tgggaaaggg acggcatcat ccggacgtaa acctcggtgg 840

tataatttaa aaatagcagg cgacccatcg tgggaggaag aaaagaaaaa atgggaagag 900

gataaaaaga aagatcccct tgctaaaatc ttaggtaagt tagcagaata tgggcttatt 960

ccgctattta ttccatttac tgacagcaac gaaccaattg taaaagaaat taaatggatg 1020

gaaaaaagtc gtaatcaaag tgtccggcga cttgataagg atatgtttat ccaagcatta 1080

gagcgttttc tttcatggga aagctggaac cttaaagtaa aggaagagta tgaaaaagtt 1140

gaaaaggaac acaaaacact agaggaaagg ataaaagagg acattcaagc atttaaatcc 1200

cttgaacaat atgaaaaaga acggcaggag caacttctta gagatacatt gaatacaaat 1260

gaataccgat taagcaaaag aggattacgt ggttggcgtg aaattatcca aaaatggcta 1320

aagatggatg aaaatgaacc atcagaaaaa tatttagaag tatttaaaga ttatcaacgg 1380

aaacatccac gagaagccgg ggactattct gtctatgaat ttttaagcaa gaaagaaaat 1440

cattttattt ggcgaaatca tcctgaatat ccttatttgt atgctacatt ttgtgaaatt 1500

gacaaaaaaa agaaagacgc taagcaacag gcaactttta ctttggctga cccgattaac 1560

catccgttat gggtacgatt tgaagaaaga agcggttcga acttaaacaa atatcgaatt 1620

ttaacagagc aattacacac tgaaaagtta aaaaagaaat taacagttca acttgatcgt 1680

ttaatttatc caactgaatc cggcggttgg gaggaaaaag gtaaagtaga tatcgttttg 1740

ttgccgtcaa gacaatttta taatcaaatc ttccttgata tagaagaaaa ggggaaacat 1800

gcttttactt ataaggatga aagtattaaa ttccccctta aaggtacact tggtggtgca 1860

agagtgcagt ttgaccgtga ccatttgcgg agatatccgc ataaagtaga atcaggaaat 1920

gttggacgga tttattttaa catgacagta aatattgaac caactgagag ccctgttagt 1980

aagtctttga aaatacatag ggacgatttc cccaagttcg ttaattttaa accgaaagag 2040

ctcaccgaat ggataaaaga tagtaaaggg aaaaaattaa aaagtggtat agaatccctt 2100

gaaattggtc tacgggtgat gagtatcgac ttaggtcaac gtcaagcggc tgctgcatcg 2160

atttttgaag tagttgatca gaaaccggat attgaaggga agttattttt tccaatcaaa 2220

ggaactgagc tttatgctgt tcaccgggca agttttaaca ttaaattacc gggtgaaaca 2280

ttagtaaaat cacgggaagt attgcggaaa gctcgggagg acaacttaaa attaatgaat 2340

caaaagttaa actttctaag aaatgttcta catttccaac agtttgaaga tatcacagaa 2400

agagagaagc gtgtaactaa atggatttct agacaagaaa atagtgatgt tcctcttgta 2460

tatcaagatg agctaattca aattcgtgaa ttaatgtata aaccctataa agattgggtt 2520

gcctttttaa aacaactcca taaacggcta gaagtcgaga ttggcaaaga ggttaagcat 2580

tggcgaaaat cattaagtga cgggagaaaa ggtctttacg gaatctccct aaaaaatatt 2640

gatgaaattg atcgaacaag gaaattcctt ttaagatgga gcttacgtcc aacagaacct 2700

ggggaagtaa gacgcttgga accaggacag cgttttgcga ttgatcaatt aaaccaccta 2760

aatgcattaa aagaagatcg attaaaaaag atggcaaata cgattatcat gcatgcctta 2820

ggttactgtt atgatgtaag aaagaaaaag tggcaggcaa aaaatccagc atgtcaaatt 2880

attttatttg aagatttatc taactacaat ccttacgagg aaaggtcccg ttttgaaaac 2940

tcaaaactga tgaagtggtc acggagagaa attccacgac aagtcgcctt acaaggtgaa 3000

atttacggat tacaagttgg ggaagtaggt gcccaattca gttcaagatt ccatgcgaaa 3060

accgggtcgc cgggaattcg ttgcagtgtt gtaacgaaag aaaaattgca ggataatcgc 3120

ttttttaaaa atttacaaag agaaggacga cttactcttg ataaaatcgc agttttaaaa 3180

gaaggagact tatatccaga taaaggtgga gaaaagttta tttctttatc aaaggatcga 3240

aagttggtaa ctacgcatgc tgatattaac gcggcccaaa atttacagaa gcgtttttgg 3300

acaagaacac atggatttta taaagtttac tgcaaagcct atcaggttga tggacaaact 3360

gtttatattc cggagagcaa ggaccaaaaa caaaaaataa ttgaagaatt tggggaaggc 3420

tattttattt taaaagatgg tgtatatgaa tggggtaatg cggggaaact aaaaattaaa 3480

aaaggttcct ctaaacaatc atcgagtgaa ttagtagatt cggacatact gaaagattca 3540

tttgatttag caagtgaact taagggagag aaactcatgt tatatcgaga tccgagtgga 3600

aacgtatttc cttccgacaa gtggatggca gcaggagtat tttttggcaa attagaaaga 3660

atattgattt ctaagttaac aaatcaatac tcaatatcaa caatagaaga tgattcttca 3720

aaacaatcaa tgtaaaagtt tgcccgtata agaacttaat taattaggat ggtaggatgt 3780

tactaaatat gtctgtaggc atcattccta ctatccgttt tgtccgaata tcagagcatt 3840

aggtgaggaa tggtaagaaa ggaaaattta tatgaaccaa ccgattccta ttcgaatgtt 3900

aaatgaaata caatattgtg agcgactttt ttactttatg catgtccaaa agctatttga 3960

tgagaatgca gatacagttg aaggaagtgc acagcatgag cgggcagaaa gaagcaaaag 4020

accaagtaaa atgggaccaa aggaattatg gggtgaggcg ccaagaagtc ttaagcttgg 4080

tgatgagctg ttaaatatta ccggtgttct tgatgccata agtcatgaag agaacagttg 4140

gatcccggtt gaatcaaaac acagttccgc accggatgga ttgaaccctt ttaaagtaga 4200

tggctttcta cttgacgggt ctgcatggcc aaacgatcaa attcaacttt gtgcacaagg 4260

cttgctcttg aatgccaatg gatacccgtg tgattatggg tatttatttt atcgtggtaa 4320

taagaaaaag gtgaaaattt attttactga agatttaatc gctgccacaa agtactatat 4380

taaaaaagca cacgagatac tagtattatc tggtgatgaa tcagctattc ctaagccttt 4440

aattgattct aataagtgtt ttcgctgttc tttaaactat atctgtcttc cggatgaaac 4500

gaactatcta ttaggggcaa gttcaacaat tcgtaaaatt gtgccttcaa ggacagatgg 4560

tggcgtttta tatgtatcag agtctggtac aaaattagga aaatcgggtg aggagttaat 4620

cattcagtat aaagatggcc aaaagcaggg tgttcctata aaagatatta ttcaagtttc 4680

gttaattgga aatgttcaat gctcaacgca attacttcat tttttaatgc aatcaaatat 4740

tcctgtaagt tatttatcat cccacggtcg tttgattggt gtcagttcat ctttagttac 4800

aaaaaatgtt ttaacaaggc agcaacagtt cattaaattt acaaatcctg agtttggact 4860

aaatctagca aaacaaattg tttatgccaa gattcgaaat caacgaactt tacttagaag 4920

aaatgggggg agtgaggtaa aggagatttt aacagattta aaatctttaa gtgacagtgc 4980

actgaacgca atatcaatag aacaattacg gggtattgaa gggatttctg caaaacatta 5040

tttcgcagga tttccgttta tgttgaaaaa tgaattacgt gaattgaatt taatgaaagg 5100

gcgtaatagg agaccgccaa aagatcctgt aaatgtactt ctttctcttg gttatacttt 5160

attgacacgt gatattcatg ctgcgtgtgg ttcagtcgga ttggatccga tgtttggttg 5220

ttaccatcgt ccagaagcag gtcgaccggc tctagtatta gatgttatgg aaacatttcg 5280

accacttatt gtagacagta ttgtcatccg agctttgaat acgggtgaaa tctcattaaa 5340

agatttttat ataggaaaag atagttgtca attattaaaa catggccgcg attccttttt 5400

tgccatttat gaaagaagaa tgcatgaaac tattaccgat ccaattttcg gctataagat 5460

tagctatcgc cgtatgctcg atttgcacat tcgaatgctt gcaaggttta ttgaagggga 5520

actgccggaa tataaaccat taatgacccg gtgagtttgt ttattaggtt aaaagaaggt 5580

gaagacatgc agcaatacgt ccttgtttct tatgatattt cggaccaaaa aagatggaga 5640

aaagtattta aactgatgaa aggatacgga gaacatgttc aatattccgt attcatatgc 5700

cagttaactg aattacagaa ggcaaaatta caagcctctt tagaagacat tatccatcat 5760

aagaatgacc aagtaatgtt tgttcacatc gggccagtga aagatggtca actatctaaa 5820

aaaatctcaa caattgggaa agaatttgtt ccattggatt taaagcggct tatattttga 5880

aaagatatag caaagaaatc ttatgaaaaa aatacaaaaa tatattgtta aaaaataggg 5940

aatattatat aatggactta cgaggttctg tcttttggtc aggacaaccg tctagctata 6000

agtgctgcag gggtgtgaga aactcctatt gctggacgat gtctctttta tttctttttt 6060

cttggatctg agtacgagca cccacattgg acatttcgca tggtgggtgc tcgtactata 6120

ggtaaaacaa acctttttaa gaagaataca aaaataacca caatattttt taaaaggaat 6180

tttgatggat ttacataacc tctcgcaaca tgcttctaaa acccaagccc accatagccc 6240

aaaaccccct gcggtccaag aaaaaagaaa tgatacgagg cattagcacc ggggagaagt 6300

catttaataa ggccactgtt aaaagtccaa gaaaaaagaa atgatacgag gcattagcac 6360

aacaatataa acgactactt taccgtgttc aagaaaaaag aaatgatatg aggcattagc 6420

acgatgggat gggagagaga ggacagttct actcttgctg tatccagctt cttttacttt 6480

atccggtatc atttcttcac ttctttctgc acataaaaaa gcacctaact atttggataa 6540

gttaagtgct tttatttccg tttgaagttg tctattgctt ttttcttcat atcttcaaat 6600

tttttctgtt tctcagagtc aactttacca actgtaatcc cttttctttt tggcattggg 6660

gtatctttcc accttagtgt gttcataagg cttatattta tcactcattg tattcctcca 6720

acacaattat aatttttccg tcatcctcaa tccaaccgtc aactgtgaca aaagacgaat 6780

ctctcttat 6789

<210> 63

<211> 6214

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 63

gtttcatttg gaaagggaga gcattggctt ttctctttgt aaataaagtg caagctttgt 60

aataagcttc tagtggagaa gtgattgttt gaatcaccca atgcacacgc actaaagtta 120

gacgaaccta taattcgtat tagtaagtat agtacatgaa gaaaaatgca acaagcattt 180

actctctttt aaataaagaa ttgatagctg ttaatattga tagtatatta taccttatag 240

atgttcgatt ttttttgaaa ttcaaaaatc atacttagta aagaaaggaa ataacgtcat 300

ggacaagcga aagcgtagaa gttacgagtt taggtgggaa gcgggaggca ccagtcatgg 360

caatccgtag cataaaacta aaactaaaaa cccacacagg cccggaagcg caaaacctcc 420

gaaaaggaat atggcggacg catcggttgt taaatgaagg cgtcgcctat tacatgaaaa 480

tgctcctgct ctttcgtcag gaaagcactg gtgaacggcc aaaagaagaa ctacaggaag 540

aactgatttg tcacatacgc gaacagcaac aacgaaatca ggcagataaa aatacgcaag 600

cgcttccgct agataaggca ctggaagctt tgcgccaact atatgaactg cttgtcccct 660

cctcggtcgg acaaagtggc gacgcccaga tcatcagccg aaagtttctc agcccgctcg 720

tcgatccgaa cagcgaaggc ggcaaaggta cttcgaaggc aggggcaaaa cccacttggc 780

agaagaaaaa agaagcgaac gacccaacct gggaacagga ttacgaaaaa tggaaaaaaa 840

gacgcgagga agacccaacc gcttctgtga ttactacttt ggaggaatac ggcattagac 900

cgatctttcc cctgtacacg aacaccgtaa cagatatcgc gtggttgcca cttcaatcca 960

atcagtttgt gcgaacctgg gacagagaca tgcttcaaca agcgattgaa agactgctca 1020

gttgggagag ctggaacaaa cgtgtccagg aagagtatgc caagctgaaa gaaaaaatgg 1080

ctcaactgaa cgagcaactc gaaggcggtc aggaatggat cagcttgcta gagcagtacg 1140

aagaaaaccg agagcgagag cttagggaaa acatgaccgc tgccaatgac aagtatcgga 1200

ttaccaagcg gcaaatgaaa ggctggaacg agctgtacga gctatggtca acctttcccg 1260

ccagtgccag tcacgagcaa tacaaagagg cgctcaagcg tgtgcagcag cgactgagag 1320

ggcggtttgg ggatgctcat ttcttccagt atctgatgga agagaagaac cgcctgatct 1380

ggaaggggaa tccgcagcgt atccattatt ttgtcgcgcg caacgaactg acgaaacggc 1440

tggaggaagc caagcaaagc gccacgatga cgttgcccaa tgccaggaag catccattgt 1500

gggtgcgctt cgatgcacgg ggaggaaatt tgcaagacta ctacttgacg gctgaagcgg 1560

acaaaccgag aagcagacgt tttgtaacgt ttagtcagtt gatatggcca agcgaatcgg 1620

gatggatgga aaagaaagac gtcgaggtcg agctagcttt gtccaggcag ttttaccagc 1680

aggtgaagtt gctgaaaaat gacaaaggca agcagaaaat cgagttcaag gataaaggtt 1740

cgggctcgac gtttaacgga cacttggggg gagcaaagct acaactggag cggggcgatt 1800

tggagaagga agaaaaaaac ttcgaggacg gggaaatcgg cagcgtttac cttaacgttg 1860

tcattgattt cgaacctttg caagaagtga aaaatggccg cgtgcaggcg ccgtatggac 1920

aagtactgca actcattcgt cgccccaacg agtttcccaa ggtcactacc tataagtcgg 1980

agcaacttgt tgaatggata aaagcttcgc cacaacactc ggctggggtg gagtcgctgg 2040

catccggttt tcgtgtaatg agcatagacc ttgggctgcg cgcggctgca gcgacttcta 2100

ttttttctgt agaagagagt agcgataaaa atgcggctga tttttcctac tggattgaag 2160

gaacgccgct ggtcgctgtc catcagcgga gctatatgct caggttgcct ggtgaacagg 2220

tagaaaaaca ggtgatggaa aaacgggacg agcggttcca gctacaccaa cgtgtgaagt 2280

ttcaaatcag agtgctcgcc caaatcatgc gtatggcaaa taagcagtat ggagatcgct 2340

gggatgaact cgacagcctg aaacaagcgg ttgagcagaa aaagtcgccg ctcgatcaaa 2400

cagaccggac attttgggag gggattgtct gcgacttaac aaaggttttg cctcgaaacg 2460

aagcggactg ggaacaagcg gtagtgcaaa tacaccgaaa agcagaggaa tacgtcggaa 2520

aagccgttca ggcatggcgc aagcgctttg ctgctgacga gcgaaaaggc atcgcaggtc 2580

tgagcatgtg gaacatagaa gaattggagg gcttgcgcaa gctgttgatt tcctggagcc 2640

gcaggacgag gaatccgcag gaggttaatc gctttgagcg aggccatacc agccaccagc 2700

gtctgttgac ccatatccaa aacgtcaaag aggatcgcct gaagcagtta agtcacgcca 2760

ttgtcatgac tgccttgggg tatgtttacg acgagcggaa acaagagtgg tgcgccgaat 2820

acccggcttg ccaggtcatt ctgtttgaaa atctgagcca gtaccgttct aacctggatc 2880

gctcgaccaa agaaaactcc accttgatga agtgggcgca tcgcagcatt ccgaaatacg 2940

tccacatgca ggcggagcca tacgggattc agattggcga tgtccgggcg gaatattcct 3000

ctcgttttta cgccaagaca ggaacgccag gcattcgttg taaaaaggtg agaggccaag 3060

acctgcaggg cagacggttt gagaacttgc agaagaggtt agtcaacgag caatttttga 3120

cggaagaaca agtgaaacag ctaaggcccg gcgacattgt cccggatgat agcggagaac 3180

tgttcatgac cttgacagac ggaagcggaa gcaaggaggt cgtgtttctc caggccgata 3240

ttaacgcggc gcacaatctg caaaaacgtt tttggcagcg atacaatgaa ctgttcaagg 3300

ttagctgccg cgtcatcgtc cgagacgagg aagagtatct cgttcccaag acaaaatcgg 3360

tgcaggcaaa gctgggcaaa gggctttttg tgaaaaaatc ggatacagcc tggaaagatg 3420

tatatgtgtg ggacagccag gcaaagctta aaggtaaaac aacctttaca gaagagtctg 3480

agtcgcccga acaactggaa gactttcagg agatcatcga ggaagcagaa gaggcgaaag 3540

gaacataccg tacactgttc cgcgatccta gcggagtctt ttttcccgaa tccgtatggt 3600

atccccaaaa agatttttgg ggcgaggtga aaaggaagct gtacggaaaa ttgcgggaac 3660

ggtttttgac aaaggctcgg taagggtgtg caaggagagt gaatggcttg tcctggatac 3720

ctgtccgcat gctaaatgaa attcagtatt gtgagcgact gtaccatatt atgcatgtgc 3780

aggggctgtt tgaggaaagc gcagacacgg tcgaaggagc agcacaacac aagcgtgcag 3840

agacacatct gcgcaaaagc aaggcagcgc cggaagagat gtggggggac gctccgttta 3900

gcttgcagct cggcgaccct gtgcttggca ttacgggaaa gctggatgcc gtctgtctgg 3960

aagaaggtaa gcagtggatt ccggtagaag gaaagcattc ggcgtcgcca gaaggcgggc 4020

agatgttcac tgtaggcgtg tattcgctgg acggttctgc ctggcccaac gaccaaatcc 4080

aattgtgtgc gcaaggcttg ctgcttcgcg cgaatggata tgaatccgat tatggctact 4140

tatactaccg tggcaataaa aagaaggttc gcattccttt ttcgcaggaa ctcatagcgg 4200

ctactcacgc ctgcattcaa aaagctcatc agcttcggga agccgaaatt ccccctccgt 4260

tgcaggagtc gaaaaagtgc tttcgatgct cgttaaatta cgtatgcatg cctgacgaga 4320

cgaattacat gttggggttg agcgcaaaca tcagaaagat tgtgcccagt cgtccagatg 4380

gcggggtact gtatgttaca gagcaggggg caaaactggg cagaagcgga gaaagcttga 4440

ccatcacctg ccggggcgaa aagatagacg aaatcccgat caaagacttg attcacgtga 4500

gcttgatggg gcatgtgcaa tgctctacgc agcttctgca caccttgatg aactgtggcg 4560

tccacgtcag ctacttgact acgcatggca cattgacagg aataatgact ccccctttat 4620

cgaaaaacat tcgaacaaga gccaagcagt ttatcaaatt tcagcacgcg gagatcgccc 4680

ttggaatcgc gagaagggtc gtgtatgcga aaatttccaa tcagcgcacg atgctgcgcc 4740

gcaatggctc accagataaa gcagttttaa aagagttaaa agagcttaga gatcgcgcgt 4800

gggaggcgcc atcactggaa atagtgagag gtatcgaggg acgtgcagca cagttgtaca 4860

tgcagttttt ccctaccatg ttaaagcacc cagtagtaga cggtatggcg atcatgaacg 4920

gtcgcaaccg tcgcccgccc aaagatccgg tcaatgcgct gctctccctc ggctatacgc 4980

ttctttcacg ggatgtttac tccgcatgtg ccaatgtcgg actcgatcca ctgttcggct 5040

ttttccatac gatggagccg ggcagaccag ctttggcact cgatctgatg gaaccgttcc 5100

gcgccttgat tgccgatagc gtagcgatac gtaccttgaa tacggaggaa ctcaccctcg 5160

gggactttta ttggggaaaa gacagttgtt atttgaaaaa ggcaggaaga caaacgtatt 5220

tcgctgccta tgaaagacgg atgaacgaga cgctgacgca tccgcaattt gggtataagc 5280

tcagctatcg ccgtatgctg gagctggaag caaggttttt ggcccggtat ctggatggag 5340

agctggtgga atatacgccg ctcatgacaa ggtaggaaat gaccatgcga caatttgttc 5400

tggtaagcta tgatattgcc gatcaaaaac gttggagaaa agtattcaag ctgatgaagg 5460

ggcaaggcga gcacgtccag tactcggtgt ttctgtgcca actcaccgag attcagcaag 5520

ccaagctaaa ggtaagcctg gcggagctgg ttcaccatgg agaagaccag gtcatgtttg 5580

taaaaatcgg cccagtgacg agagatcaac tggacaagcg gatatctact gttggcaggg 5640

agtttctgcc tcgcgatttg accaaattta tctattaagg aatgaagaaa gctagttgta 5700

acaaaagtgg aaaaagagta aaataaaggt gtcagtcgca cgctataggc cataagtcga 5760

cttacatatc cgtgcgtgtg cattatgggc ccatccacag gtctattccc acggataatc 5820

acgactttcc actaagcttt cgaattttat gatgcgagca tcctctcagg tcaaaaaagc 5880

cgggggatgc tcgaactctt tgtgggcgta ggctttccag agttttttag gggaagaggc 5940

agccgatgga taagaggaat ggcgattgaa ttttggcttg ctcgaaaaac gggtctgtaa 6000

ggcttgcggc tgtaggggtt gagtgggaag gagttcgaaa gcttagtgga aagcttcgtg 6060

gttagcaccg gggagaagtc atttaataag gccactgtta aaagttcgaa agcttagtgg 6120

aaagcttcgt ggttagcacg ctaaagtccg tctaaactac tgagatctta aatcggcgct 6180

caaataaaaa acctcgctaa tgcgaggttt cagc 6214

<210> 64

<211> 12338

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 64

gaagttatgt tgataaaatg gtttatgaaa acgtgagtct gtggtagtat tataaacaat 60

gatggaataa agtgtttttt gcgccgcacg gcatgaattc aggggttagc ttggttttgt 120

gtataaataa atgttctaca tatttatttt gttttttgcg ccgcaaaatg caactgaaag 180

ccgcatctag agcaccctgt agaagacagg gttttgagaa tagcccgaca tagagggcaa 240

tagacacggg gagaagtcat ttaataaggc cactgttaaa agttttgaga atagcccgac 300

atagagggca atagactttt gcttcgtcac ggatggactt cacaatggca acaacgtttt 360

gagaatagcc cgacatagtt atagagatgt ataaatataa ccgataaaca ttgactaatt 420

tgttgaagtc agtgtttatc ggttttttgt gtaaatatag gagttgttag aatgatactt 480

tttgcctaat tttggaactt tatgaggata taagatagac ttgataaaaa ggtaaaagaa 540

aggttaaaga gcatggcagg aatagtgacc tgtgatgaag atgatggtag aattaaaagt 600

gttcttaaag aaaaacaata ttggataagg aaaataattc aatagataaa aaatttaggg 660

ggaaaaatga aaatatcaaa agtcgatcat accagaatgg cggttgctaa aggtaatcaa 720

cacaggagag atgagattag tgggattctc tataaggatc cgacaaagac aggaagtata 780

gattttgatg aacgattcaa aaaactgaat tgttcggcga agatacttta tcatgtattc 840

aatggaattg ctgagggaag caataaatac aaaaatattg ttgataaagt aaataacaat 900

ttagataggg tcttatttac aggtaagagc tatgatcgaa aatctatcat agacatagat 960

actgttctta gaaatgttga gaaaattaat gcatttgatc gaatttcaac agaggaaaga 1020

gaacaaataa ttgacgattt gttagaaata caattgagga aggggttaag gaaaggaaaa 1080

gctggattaa gagaggtatt actaattggt gctggtgtaa tagttagaac cgataagaag 1140

caggaaatag ctgattttct ggagatttta gatgaagatt tcaataagac gaatcaggct 1200

aagaacataa aattgtctat tgagaatcag gggttggtgg tctcgcctgt atcaagggga 1260

gaggaacgga tttttgatgt cagtggcgca caaaagggaa aaagcagcaa aaaagcgcag 1320

gagaaagagg cactatctgc atttctgtta gattatgctg atcttgataa gaatgtcagg 1380

tttgagtatt tacgtaaaat tagaagactg ataaatctat atttctatgt caaaaatgat 1440

gatgttatgt ctttaactga aattccggca gaagtgaatc tggaaaaaga ttttgatatc 1500

tggagagatc acgaacaaag aaaggaagag aatggagatt ttgttggatg tccggacata 1560

cttttggcag atcgtgatgt gaagaaaagt aacagtaagc aggtaaaaat tgcagagagg 1620

caattaaggg agtcaatacg tgaaaaaaat ataaaacgat atagatttag cataaaaacg 1680

attgaaaagg atgatggaac atactttttt gcaaataagc agataagtgt attttggatt 1740

catcgcattg aaaatgctgt agaacgtata ttaggatcta ttaatgataa aaaactgtat 1800

agattacgtt taggatatct aggagaaaaa gtatggaagg acatactcaa ttttctcagc 1860

ataaaataca ttgcagtagg caaggcagta ttcaattttg caatggatga tctgcaggag 1920

aaggatagag atatagaacc cggcaagata tcagaaaatg cagtaaatgg attgacttcg 1980

tttgattatg agcaaataaa ggcagatgag atgctgcaga gagaagttgc tgttaatgta 2040

gcattcgcag caaataatct tgctagagta actgtagata ttccgcaaaa tggagaaaaa 2100

gaggatatcc ttctttggaa taaaagtgac ataaaaaaat acaaaaagaa ttcaaagaaa 2160

ggtattctga aatctatact tcagtttttt ggtggtgctt caacttggaa tatgaaaatg 2220

tttgagattg catatcatga tcagccaggt gattacgaag aaaactacct atatgacatt 2280

attcagatca tttactcgct cagaaataag agctttcatt tcaagacata tgatcatggg 2340

gataagaatt ggaatagaga actgatagga aagatgattg agcatgatgc tgaaagagtc 2400

atttctgttg agagggaaaa gtttcattcc aataacctgc cgatgtttta taaagacgct 2460

gatctaaaga aaatattgga tctcttgtat agcgattatg caggacgtgc atctcaggtt 2520

ccggcattta acactgtctt ggttcgaaag aactttccgg aatttcttag gaaagatatg 2580

ggctacaagg ttcattttaa caatcctgaa gtagagaatc agtggcacag tgcggtgtat 2640

tacctatata aagagattta ttacaatcta tttttgagag ataaagaggt aaagaatctt 2700

ttttatactt cattaaaaaa tataagaagt gaagtttcgg acaaaaaaca aaagttagct 2760

tcagatgatt ttgcatccag gtgtgaagaa atagaggata gaagtcttcc ggaaatttgt 2820

cagataataa tgacagaata caatgcgcag aactttggta atagaaaagt taaatctcag 2880

cgtgttattg aaaaaaataa ggatattttc agacattata aaatgctttt gataaagact 2940

ttagcaggtg ctttttctct ttatttgaag caggaaagat ttgcatttat tggtaaggca 3000

acacctatac catacgaaac aaccgatgtt aagaattttt tgcctgaatg gaaatccgga 3060

atgtatgcat cgtttgtaga ggagataaag aataatcttg atcttcaaga atggtatatc 3120

gtcggacgat tccttaatgg gaggatgctc aatcaattgg caggaagcct gcggtcatac 3180

atacagtatg cggaagatat agaacgtcgt gctgcagaaa ataggaataa gcttttctcc 3240

aagcctgatg aaaagattga agcatgtaaa aaagcggtca gagtgcttga tttgtgtata 3300

aaaatttcaa ctagaatatc tgcggaattt actgactatt ttgatagtga agatgattat 3360

gcagattatc ttgaaaaata tctcaagtat caggatgatg ccattaagga attgtcagga 3420

tcttcgtatg ctgcgttgga tcatttttgc aacaaggatg atctgaaatt tgatatctat 3480

gtaaatgccg gacagaagcc tatcttacag agaaatatcg tgatggcaaa gctttttgga 3540

ccagataaca ttttgtctga agttatggaa aaggtaacag aaagtgccat acgagaatac 3600

tatgactatc tgaagaaagt ttcaggatat cgggtaaggg gaaaatgtag tacagagaaa 3660

gaacaggaag atctgctaaa gttccaaaga ttgaaaaacg cagtagaatt ccgggatgtt 3720

actgaatatg ctgaggttat taatgagctt ttaggacagt tgataagttg gtcatatctt 3780

agggagaggg atctattata tttccagctg ggattccatt acatgtgtct gaaaaacaaa 3840

tctttcaaac cggcagaata tgtggatatt cgtagaaata atggtacgat tatacataat 3900

gcgatacttt accagattgt ttcgatgtat attaatggac tggatttcta tagttgtgat 3960

aaagaaggga aaacgctcaa accaattgaa acaggaaagg gcgtaggaag taagatagga 4020

caatttataa agtattccca gtatttatac aatgatccgt catataagct tgagatctat 4080

aatgcaggat tagaagtttt tgaaaacatt gatgaacatg ataatattac agatcttaga 4140

aagtatgtgg atcattttaa gtattatgca tatggtaata aaatgagcct gcttgatctg 4200

tatagtgaat tcttcgatcg tttctttaca tatgatatga agtatcagaa gaatgtagtg 4260

aatgtgttgg agaatatcct tttaaggcat tttgtaattt tctatccgaa gtttggatca 4320

ggaaaaaaag atgttggaat tagggattgt aaaaaagaaa gagctcagat tgaaataagt 4380

gagcagagcc tcacatcgga agacttcatg tttaagcttg acgacaaagc aggagaagaa 4440

gcaaagaagt ttccggcaag ggatgaacgt tatctccaga caatagccaa gttgctctat 4500

tatcctaacg aaattgagga tatgaacaga ttcatgaaga aaggagaaac gataaataaa 4560

aaagttcagt ttaatagaaa aaagaagata accaggaaac aaaagaataa ttcatcaaac 4620

gaggtattgt cttcaactat gggttattta tttaagaaca ttaaattgta aaaaagattc 4680

gttgtagata attgataggt aaaagctgac cggagccttt ggctccggac agttgtatat 4740

aagaggatat taatgactga aaatgatttt tgttggaagt cagttttttc tgtggaaagc 4800

gaaatcgaat atgatgagta tgcatatggc agaagagctg tagaaggcga gaatacatat 4860

gattacatta ctaaggaaga aagaccggaa cttaatgacg aatatgtagc gagacgttgc 4920

attttcggta aaaaagcagg aaaaatatcc aggtcggatt ttagtaggat aagatctgcg 4980

ttggatcatg cgatgataaa taatacacat acagcatttg ccagatttat cactgaaaat 5040

ctgacgagac tcaatcacaa agaacatttt ctgaatgtga cacgtgcata ttctaaacct 5100

gattctgaaa aattgataca accgagatac tggcagtcgc ctgtagttcc aaaggataaa 5160

caaatatatt atagcaagaa tgcgattaaa aaatggtgtg gttacgaaga tgatattccg 5220

cctcgttctg tgatagttca gatgtgtcta ttgtggggga ctgatcatga agaggcagat 5280

catatccttc gcagttcagg atacgcggcg cttagtcctg ttgtacttcg agatcttatc 5340

tatatgtatt atctggatca tcaggatttg caaaaaaatg agttgatatg ggaagtaaaa 5400

aagcagttgg atcacttcga tttgacaaat agaaattatg atacaaatcc ttttgatgta 5460

gggggcagcg taaatgatca tatctgtgaa ctgagcgagc atatagcgaa ggctcattat 5520

atttatgaga gggctaagga aggaccattg caaaatgtaa ttcgggatat tttgggagat 5580

acacctgccc tttattctga aatggcattt cctcagctag catctataaa caggtgtgct 5640

tgcaattcgc tttcttcata tcaaaaaaat atttttgata ctgacatagc tatatatgca 5700

gatgaaaagg acacaagagg taaatcagac cgtatccttg ttgagggcgc atcttcgaaa 5760

tggtatgaat tgaagaaacg cgatgctaat aatgtcaaaa tttctgaaaa gctgagtata 5820

ctcaatacta ttcttaaatt taatagtgtt ttttgggaag aatgttacct tgatggaaat 5880

ataaaacaat cgagcggaaa gcgatctgag gcaggaaaaa ttctttatgg tcgcgacaac 5940

ggaaaagaaa atgtcggagt ttcaaaattg gaattggtgc ggtatatgat agctgcaggt 6000

caggaacaaa atctgggaaa ttacctggtg agttcaggat tttggagaaa aaatcatatg 6060

ctgtcattta tacaaggcaa tgatatagcg cttgatgaga tggatgaatt ggatctctta 6120

gactatattc tgatatatgc atggggattt agggaaaata tcattaaaaa gaacagtaat 6180

gtgaattctt tggatgaaaa gactagaaaa gtgcagtttc cgtttataaa gttactcatg 6240

gcaattgcaa gagatatcca gatacttata tgttcagcac atgaaaaaac agtcgatgag 6300

tcatctcgaa atgcagcaaa gaagatagat atattgggaa attatattcc ttttcagatt 6360

catcttcaga gaactaaaaa agatggtgga agagtggtaa tggatacatt gtgtgctgat 6420

tggattgcgg attatgaatg gtacattgat cttgagaaag gaacacttgg atgagcagtg 6480

atgaaaggat atttaaaaaa tttttggaaa aaggatcgat ttctgagcag aaaaagatgc 6540

ttttagaaga aaagaaatgt tcggataaac taactgcact gcttgggaat tactgcatac 6600

cgatagacaa tatttcagag tcagacggaa aaatatatgc ggtctataag cttccaaaaa 6660

atgttaaacc tttgtccgaa atcattaatg atgtatcctt ttctgattgt acgatgagag 6720

tacgtttgct tctcataaag agaattctgg aactcgtgtg tgcttttcac gaaaaaaaat 6780

ggtattgtct cagtatttca ccgggaatgc tcatggttga agattttgat ataccgatgg 6840

gaaatgtcgg aaaagtattg atatatgatt tcagaaatcc tgttccgttc gagtcagtaa 6900

atgaaagaca taattttaac gtttcaaata aatacacttc accggagctg ctcatccatt 6960

caagatatga cgagtcgaaa tctgtgagtg aaaaatcaga tttgtattct gttgcaaaaa 7020

ttgcggaaac aataatagga gattttaaca gtattattgc aaatggaaat ttgatactac 7080

ttgcaatgct tagagttttt atcagtacag ggaaaagtcc ggaacctgag tatcggtttg 7140

aatcgtcgga aaatatgctt tcagtatttg aaaatttgat caaagaaaat tgtttttttg 7200

aaaaaaacga ttatacatct atgtttcatc aggcgtatga caattttttt gaatggcagg 7260

aatgtttgat atcaccggat cacttggata aaaatatgtt cgaggcagct ttatcaaatc 7320

ttgaggatca gctgcttagg gttgatattg ataagtatag agcagagtac ttctataagc 7380

ttctccgaga gttgtctaat aaatataaaa atacaattac tgatgaacaa aaggtaaggt 7440

tggcaatact tggaatcaga gcgaaaaata atctgggaaa aagttttgat gcattggaaa 7500

tatatgagtc agtacgtgat ttagaaacta tgttggagga gatggcagag cttagtcctg 7560

tcattgcttc gacatatatg gattgctacc gatatgcaga tgcgcagaaa gtggcggaag 7620

aaaacattat caggcttcat aatagtaata ttcgtatgga gaaaaaaaga atactgcttg 7680

gaaggtcata tagttcaaaa gggtgcagca tggggtttca gcatattctt ggtgcggatg 7740

agtcatttga acaggcttta tatttcttta acgaaaagga caatttttgg aaagaaatat 7800

ttgagagcag aaatttagag gacagcgata gacttataaa gtctttacga agcaatacgc 7860

atattacgct gtttcattac atgcaatatg catgtgaaac aaggagaaag gaattatatg 7920

gagcactttc agacaaatat tttataggta aagaatggac agaaagactc aaagcatata 7980

taagcaacaa ggatatatgg aaaaactatt atgagatata tattctgcta aagggtattt 8040

attgcttcta tccagaagtc atgtgttcgt ctgcgtttta tgatgaaatc caaaaaatgt 8100

acgatcttga atttgaaaag gaaaaaatgt tttacccatt gagtctgata gaactgtatc 8160

ttgctctgat agagataaaa gttaatggga gtctgacgga gaatgccgag aagttgttta 8220

aacaggcatt gacacatgac aatgaagtca aaaaaggaaa tatgaatatt cagaccgcca 8280

tttggtatcg aatatatgca ctgtataacg atgtaaaaga tgaaactgat aagaataaaa 8340

ggcttttaaa acggcttatg attctttgcc gacgatttgg ttgggcggat atgtatagtg 8400

ctttggagaa ggatgggaag ttaattgatt ttttgagatt tgaggtatgt taaatgataa 8460

cacttgcatt agatgaaaat ggcaaatttg aagatgcttt ttctaaaaaa aatgaaaaac 8520

cgataatgat tgcggggata atctatgatg acaaggggaa agagtatgat gctgagaatg 8580

aacgctacag gatatccagt tatctgcgag cagtatgtga cagtttgggt gcgaaatacc 8640

ctcaggatct acattcaaat agtaatggaa ataaggcgac tgttgggaaa gtaaaatgta 8700

aaattggtga aacactaaag gaattcttga gagaaggaac ctatgaaaaa aaggaattgc 8760

cgacaaagaa cggttattta aataagagat ctggaaaata tgtaatgttt gcagaactca 8820

ggagtagtca gggagttaaa aagcgtgtta gtggttggaa tgacaatgat ctgactcagg 8880

atgaaaaggt cagcaatctg taccttcata tggcagaaaa tgccgttgtc agaatgctct 8940

tccataatcc tatatatgaa gatgtaacag atgtaaatct ctattttccc acgcgaaaag 9000

ttgttctgaa agatagagat agagaatacg ataaacaaga tttcaaaata tatggtgata 9060

aggacaagtg cgaagcagaa agcgggagat tggtgcatta tgatatcgtg tcatcggatt 9120

tttaccgtac gataatggag aacgaatgta caagaattaa taaaaagcaa ttaaatgttc 9180

attatatgaa cacaagccca atttcgtact gggagaaaaa tgaaaaatat aatacatttt 9240

tatatttggc tgacatagtt tgttctatgc tggattatta caaaaagggt tcgagtccgg 9300

cagagtggat ggattctttt gccgaatggg gaaacaaata ttttggtgat gatcagataa 9360

tcttatttgg gtatgatgat atagatgaca aatacatgga ggctgtagat gcagtaggac 9420

agggagagta ttttcatgcg ctggatatta tatatgatgc ggaatgtagt ggaagtgaat 9480

ttgagaagca ctacaaagat tattggtttc caaagcttat aaaaaagata cgaataacag 9540

caactgtgga taatttatgc agatcgatct cagatctgga gagttttaca tatcgaagta 9600

atcttgatca gcagaaactt ttgtggattt ttgaggaaat caaagctatc gtcgataagg 9660

gagattttgg aaagaaatat catacagatc aggttatgtt tgatatgtgt aatgccggta 9720

ttgctgtgta caatcatatc ggagattttg ggactgcaaa ggaatactat gatgagtgca 9780

tgaaacacac tggggatgtg gatctggtaa agatacttcg tgcatcaaat aaaatggtgg 9840

tctttcttga cgatgctttt aggtatggtg acgcgacaga acgtgccagg aagaatgttg 9900

aataccaaaa agctttgcac gatataaaga gtgagatttg tccggaaaag aaagatgaag 9960

acttgaacta tgccatatcg ctcagtcaat ttggacaggc gcttgcgtgt gaaaaaaatt 10020

ctgatgcaga gagtgttttc ctagagtcgt tgcggcatat gaggaaaggg actgccaatt 10080

atcagattac tctttcatat ttactccatt tttatctgga tatgggaatg acagattctt 10140

atcgagaaaa aacaaaggac tattttggaa gtgaaaaacc aaaggaacag ctgaaagaat 10200

tgctgaagtt atcgggaaag gatgatagta tagttacttt caaatttgca atgtatgtct 10260

atttacgtgc actttgggta ttacaggaac cgcttactga ttttatcaga acaagattag 10320

aggacatacg tgagactctt gtaaagaaga aaatgagtga acatatggtt ggacatccgt 10380

gggagttgat ttataaatat ctggcatttc ttttttatcg tgatggaaat tgtgaagctg 10440

ctgaaaaata tattcataaa agtgaagagt gcttggaaac acaaggactg actatagatg 10500

cgattattca taatggtaag tatgaatatg cagaattgtc aggtgacgag gagatgatgg 10560

caagagagaa agcgtacttt gatgaaaaag ggatagatag aaaaaatgtt tgtactttta 10620

tgtatcattg atgtttaata agatttgacc gaggagtgac aggtaatcgc cggtatatct 10680

ggtattacct gtcatttttt gatgaaataa gctacttttt gcctaaaaaa cgaaactgtt 10740

ggtgttttat gatgattgtg tcaacaaaag agagcaaaag aagaggagaa aagtaatgtc 10800

aatgatttca tgtccgaatt gtggtggaga gatatctgaa aggtcaaaga aatgtgttca 10860

ttgtggatat gtgttagtcg aagaagctaa agtagtgtgc acagaatgtg gaactgaggt 10920

agagagtggc gctgctgtat gtccgaagtg cggctgtcct gtaaatgata gtgagacgcc 10980

tcagaaagtt gaagtgacta gggtaaatgt atcttccgta atcagcaaaa aagtcgttgt 11040

aagcatactg atcgcagtga ttacaattgc aggttttttc tatggagtga agtattcgca 11100

ggaaaagaaa gcaattgaag agtcagtaaa gcagaaggaa gactatcaaa gtacgctaga 11160

gcttgcttcg ctaatgatgc ttcaaggagc ttcggatgca gaaacttgtg ggaatttggt 11220

taggaaagtg tggagcaact gcatttataa ggagagggat gaagaaaccg acaagtatac 11280

gtgtgatagc aggggtgcag gatggtttta tgatgatttt aatgatgcat taatggctct 11340

ttacagtgac agcagttttg gcaagaagat aaatgaaatc aaaaacggtc aggaaaccgt 11400

tgcggcgatg atgaaagatc tgaaaaatcc gccggatgag atggcagatg cctatgagga 11460

tattcaaaat ttttatgtgt cctatctaac gctgacagaa atggttgtga atccaactgg 11520

aagtttgagt tctttttcat ctgatttttc cgatgcggat acggaggtgt ccaatgccta 11580

tagccggatg aagttgtatt tagattaaac tattgaggaa aaaatggagg tgctttaatg 11640

cgggggagaa actgtggagg gtcatcaggc gacggactgc tggtacttct cgtactgctt 11700

gtcctttttt ataaaatcat gccattcata ggtttatgga ttttaatttt tggtgatgct 11760

gaacgtaaag atctgggtat gggtatgatt attgtcggga tagttctata tgtattatta 11820

gaggtttttt aatgtgagtt tctgtggtaa actataaaag tacaagcttt tgcgccgcac 11880

cgcataaata gcggatttat gaccattatt tggtgaaaaa aatggtgtac acctgtgttt 11940

ttttgttttg cgccgcaaaa tgcgccacgg aaccgcatgc agagcaccct gcaagagaca 12000

gggttatgaa aacagcccga catagagggc aatagacacg gggagaagtc atttaataag 12060

gccactgtta aaagttatga aaacagcccg acatagaggg caatagacat aaagaccaaa 12120

aacaggtcat ctgcatactg tgttatgaaa acagcccgat atagagggtg tgagagatat 12180

agttctcgtc acagtgcaga aaatgaccta ttatgtgccg aaaaacaaaa tgaaaaaaga 12240

atggaaaggc gtatttaatg aaatgctgat ctgttgattt gaattaacaa aaaaaggtcg 12300

ccccacggat gacaaaaaca tccgggggcg accctttt 12338

<210> 65

<211> 6098

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 65

tactgtgtgc ataagtcttc cttagatcca taggtacagc agttttattt attagcctta 60

gaaaatggaa aatagagctt ataaatgata tgatatttat gaataaaatg attgcattct 120

cgtgcaaact ttaaatatat tgattatatc ctttacattg gttgttttaa ttactattat 180

taagtaggaa tacgatatac ctctaaatga aagaggacta aaacccgcca aaagtatcag 240

aaaatgttat tgcagtaaga gactacctct atatgaaaga ggactaaaac ttttaacagt 300

ggccttatta aatgacttct gtaagagact acctctatat gaaagaggac taaaacgtct 360

aatgtggata agtataaaaa cgcttatcca tcatttaggt gttttatttt tttgtgatta 420

tatgtacaat agaagagaga aaaaaatcat tgaggtgaaa actatgagaa ttactaaagt 480

agaggttgat agaaaaaaag tactaatttc tagggataaa aacgggggca agttagttta 540

tgaaaatgaa atgcaagata atacagaaca aatcatgcat cacaaaaaaa gttcttttta 600

caaaagtgtg gtaaacaaaa ctatttgtcg tcctgaacaa aaacaaatga aaaaattagt 660

tcatggatta ttacaagaaa atagtcaaga aaaaataaaa gtttcagatg tcactaaact 720

taatatctca aatttcttaa atcatcgttt caaaaaaagt ttatattatt ttcctgaaaa 780

tagtcctgac aaaagcgaag aatacagaat agaaataaat ctctcccaat tgttagaaga 840

tagcttaaaa aaacagcaag ggacatttat atgttgggaa tcttttagca aagacatgga 900

attatacatt aattgggcgg aaaattatat ttcatcaaaa acgaagctaa taaaaaaatc 960

cattcgaaac aatagaattc aatctactga atcaagaagt ggacaactaa tggatagata 1020

tatgaaagac attttaaata aaaacaaacc tttcgatatc caatcagtta gcgaaaagta 1080

ccaacttgaa aaattgacta gtgctttaaa agctactttt aaagaagcga agaaaaacga 1140

caaagagatt aactataagc ttaagtccac tctccaaaac catgaaagac aaataataga 1200

agaattgaag gaaaattccg aactgaacca atttaatata gaaataagaa aacatcttga 1260

aacttatttt cctattaaga aaacaaacag aaaagttgga gatataagga atttagaaat 1320

aggagaaatc caaaaaatag taaatcatcg gttgaaaaat aaaatagttc aacgcattct 1380

ccaagaaggg aaattagctt cttatgagat tgaatcaaca gttaactcta attccttaca 1440

aaaaattaaa attgaagaag catttgcctt aaagtttatc aatgcttgtt tatttgcttc 1500

taacaattta aggaatatgg tatatcctgt ttgcaaaaag gatatattaa tgataggtga 1560

atttaaaaat agttttaaag aaataaaaca caaaaaattc attcgtcaat ggtcgcaatt 1620

cttctctcaa gaaataactg ttgatgacat tgaattagct tcatgggggc tgagaggagc 1680

cattgcacca ataagaaatg aaataattca tttaaagaag catagctgga aaaaattttt 1740

taataaccct actttcaaag tgaaaaaaag taaaataata aatgggaaaa cgaaagatgt 1800

tacatctgaa ttcctttata aagaaacttt atttaaggat tatttctata gtgagttaga 1860

ttctgttcca gaattgatta ttaataaaat ggaaagtagc aaaattttag attattattc 1920

cagtgaccag cttaaccaag tttttacaat tccgaatttc gaattatctt tactgacttc 1980

ggccgttccc tttgcaccta gctttaaacg agtttatttg aaaggctttg attatcagaa 2040

tcaagatgaa gcacaaccgg attataatct taaattaaat atctataacg aaaaagcctt 2100

taattcggag gcatttcagg cgcaatattc attatttaaa atggtttatt atcaagtctt 2160

tttaccgcaa ttcactacaa ataacgattt atttaagtca agtgtggatt ttattttaac 2220

attaaacaaa gaacggaaag gttacgccaa agcatttcaa gatattcgaa agatgaataa 2280

agatgaaaag ccctcagaat atatgagtta cattcagagt caattaatgc tctatcaaaa 2340

aaagcaagaa gaaaaagaga aaattaatca ttttgaaaaa tttataaatc aagtgtttat 2400

taaaggtttc aattctttta tagaaaagaa tagattaacc tatatttgcc atccaaccaa 2460

aaacacagtg ccagaaaatg ataatataga aatacctttc cacacggata tggatgattc 2520

caatattgca ttttggctta tgtgtaaatt attagatgct aaacaactta gcgaattacg 2580

taatgaaatg ataaaattca gttgttcctt acaatcaact gaagaaataa gcacatttac 2640

caaggcgcga gaagtgattg gtttagctct tttaaatggc gaaaaaggat gtaatgattg 2700

gaaagaactt tttgatgata aagaagcttg gaaaaagaac atgtccttat atgtttccga 2760

ggaattgctt caatcattgc cgtacacaca agaagatggt caaacacctg taattaatcg 2820

aagtatcgat ttagtaaaaa aatacggtac agaaacaata ctagagaaat tattttcctc 2880

ctcagatgat tataaagttt cagctaaaga tatcgcaaaa ttacatgaat atgatgtaac 2940

ggagaaaata gcacagcaag agagtctaca taagcaatgg atagaaaagc ccggtttagc 3000

ccgtgactca gcatggacaa aaaaatacca aaatgtgatt aatgatatta gtaattacca 3060

atgggctaag acaaaggtcg aattaacaca agtaaggcat cttcatcaat taactattga 3120

tttgctttca aggttagcag gatatatgtc tatcgctgac cgtgatttcc agttttctag 3180

taattatatt ttagaaagag agaactctga gtatagagtt acaagttgga tattattaag 3240

tgaaaataaa aataaaaata aatataacga ctacgaattg tataatctaa aaaatgcctc 3300

tataaaagta tcatcaaaaa atgatcccca gttaaaagtt gatcttaagc aattacgatt 3360

aaccttagag tacttagaac tttttgataa ccgattgaaa gaaaaacgaa ataacatttc 3420

acattttaat taccttaacg gacagttagg gaactctatt ttagaattat ttgacgatgc 3480

tcgagatgta ctttcctatg atcgtaaact aaagaatgcg gtgtctaaat ctttgaaaga 3540

aattttaagc tctcatggaa tggaagtgac atttaaacca ctatatcaaa ccaatcatca 3600

tttaaaaatt gataaactcc aacctaaaaa aatacaccac ttaggtgaaa aaagtactgt 3660

ttcttcaaat caagtttcta atgaatactg tcaactagta agaacgctat taacgatgaa 3720

gtaattcttt taaagcacat taattacctc taaatgaaaa gaggactaaa actgaaagag 3780

gactaaaaca ccagatgtgg ataactatat tagtggctat taaaaattcg tcgatattag 3840

agaggaaact ttagatgaag atgaaatgga aattaaaaga aaatgacgtt cgcaaagggg 3900

tggtggtcat tgagtaaaat tgacatcgga gaagtaaccc actttttaca aggtctaaag 3960

aaaagtaacg aaaacgcccg aaaaatgata gaagacattc aatcggctgt caaagcctac 4020

gctgatgata caactttaaa aggaaaagca gtggattctt cacaaagata ctttgatgaa 4080

acgtatactg ttatttgtaa aagtatcata gaagcattag atgaaagcga agagagatta 4140

caacaatata ttcatgattt tggagatcaa gtggattctt cacctaacgc acgaattgat 4200

gcggaattac tacaagaagc aatgagtagg ttagctgaca taaagcggaa gcaagaagca 4260

cttatgcaat ccttatcttc ttctacagca acgctttacg aaggcaagca acaagcgtta 4320

cacactcaat tcacggatgc gctggagcaa gaaaaaatat tggaacgcta tattactttt 4380

gaacaaactc acgggaattt ttttgactca tttggagaac ttgtctatcg aacgggacaa 4440

gcagtgcgtg aattagctaa taacgtcaca ttcgagagcc aaacaggaag ctatcatttt 4500

gataaaatag atgcttctag attccaaact ttgcaagaaa tgttgccaaa ggcaaagaaa 4560

aaagcattta attttaatga ctaccaaata acatggaatg gcaccacgca ccttttatgg 4620

aaaaatggta aagtggatgc agaagcaacc aaagcttata acgaggcgaa actgaatgga 4680

aagctaccaa aggaaggtaa tgtagcaaca caagatgcag aactattaaa aggcattttg 4740

gcttcactga aaaacaagaa agatcctatc actggagcag atataagcag tgtgcatgta 4800

ttatctatcc ttagcgggct cgcattctcc tatacagctg ggaattataa gggaagaaaa 4860

cttactgttc caaaaagttt cttagacaaa ttaaagaaaa accgaaaatc taaagtacct 4920

aaactatcta gtttatcaga aaaacaacaa ctaaaactcg caaataaata caagaaaaaa 4980

tcacctattc caattccaga tgatgctaaa atcaaagctc agacgaaaaa ggctggttat 5040

gaacaaatat cttataaatg gaaagagaat gggataacct ttgaagttag atggcatact 5100

aggacaccag gtgcaccaaa ggaacaagga aatacgtttg ttatagaaag aaaaattcag 5160

ggtacagcag aagggaaaac aaaagttcaa caaatattgg ttggagataa taagtgggtg 5220

agtaaaagtg agtggcaaaa ggctataact gataagaaaa atggtgtaag tacctcggag 5280

caaaataaaa tgttgtctga tggacattgg aaagaataga aaggagcaaa atgatggaag 5340

attattataa aggttttgag ggatatccag agatagattt ttatacgtat atagatgata 5400

tgaaattggg tatagcaatg tgggaaggat actttgacaa cattatgaaa gaaattaatc 5460

caagtaacgg aagatggact tcattagcgt attattatca tttagatgag gggtggtatg 5520

atgaaagtcc ttgggaaata ccaagtaata cagaagcatt agaattattg gaaacaatcc 5580

atatatctaa tctagatact atcacacaag agatattact taaattaata aatttattaa 5640

agaagaatat aaatagacaa gtttatattg aatactcata aaaaagatga ttatgatata 5700

ttatagaaca aacgaacaag ccccaaatac gaggtttgtt cgtttgtttt caatataatt 5760

atttgccacc aagtgagata ttacggtttt aaatagctta tttgacgata ccaaaccctg 5820

ataagagaaa gaagaaagag aaagctggtg tagttgtttt aagtgaacta gataaaaaat 5880

taatagcaaa acttgaaaaa gatggtgtga aaatatcaaa agaagatgtt ataggaataa 5940

aataattgcc agatgatgag aaatcgtttg gctggaaaaa ggaaatccat ccgctggatt 6000

tgagcatatt cttattgaac atggtgaaca atttgctaaa tagggaattt caaaagctga 6060

gttacctgat tttttgatga ctgctttaga aaaggaaa 6098

<210> 66

<211> 6222

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 66

attctttaaa aatatctaat aatttattta ctatatactc taatacatct tttaacctat 60

ctaaaacatc atcacctaca acatcccaaa aatcatctaa aaagttaaaa aaatccatct 120

ttatcaactc ctatatctat tttttattgt gtaattcctg agttacaaaa ccattataac 180

acgtattaca cacgtagtca atacttcaaa aaaatttttt gtatattttt ttgaataagt 240

aaataaaaag agctgtgtag ctctttatta aaatcaatat ttttattttg ttaacaaact 300

tagacaacat taaatttaga aacctatata tatttcagta cttttcattt ttaggtagtc 360

taaatcagaa atggttttgt ctaaatgatg tatgtaagtt ttagtcccct tcgtttttag 420

ggtagtctaa atcagaagtc atttaataag gccactgtta aaagttttag tccccttcgt 480

ttttagggta gtctaaatcc catccaaatt atgggataat atgttacttt ttattttaat 540

atttgattat ttattgtttt tttactgatt tagattaccc ctttaattta ttttaccata 600

tttttctcat aatgcaaact aatattccaa aatttttgtt tcttttctta tgatcttttc 660

tccgatagtt atttctccag ataagatttt catttttttg aattgatctt ctgttagaat 720

taatgttctt actgatgaat tttctggaac tatcattgac aactgatttt cataggaaat 780

tattttttct tttgtgctag aacttacaat gtatactgat ttttgtacct gataatatcc 840

ttttcttata atttcttttc taaattttgc atattctttt ttttcttttc ctgtttgcat 900

tggaaaatca tacattagaa tccctacata attagtactc ataatcctct atccttaact 960

caggaatttc tacttctgac atttctcctg taaaataatt tctaatatta tctaaaaaat 1020

aatcaatcac ttgagccaat tcatattttt tatttttcca ataaactttt tgtgttaata 1080

ccaataacaa tttttgtctt aatgatttat tcaaacttac ttcttcctgt tgattaaaat 1140

atacgatata atctaccatt ggacgaaata tttcaataat atcatctgca aaattataat 1200

tattaaattg tgaactgtga tgtattccca aacttggatg aaatccttta gccacaattt 1260

ttgaagagat taagcttctc aaaaccatat acccataatt taatgccgaa tttgtcccgt 1320

cttcaccaaa tctcttaaat tttttcccaa aaagttcacc aaaatacatt cttgcagcaa 1380

ttgcttcctg atgttccgct tcttttcctt ttaatctaat attattttca tatgcttcca 1440

acttatatga tacttcctga gattttttca aaaactgcaa taaatttctt tgattttcta 1500

tttttctcat tacaattttt ctccagattt cttctttttt atcgtcaatc cagctcactt 1560

gctcattaat tcttgttgtt acttgaaaat gattatacag tcctaatgaa tgtaaaactg 1620

gctgatgttt ttcattacaa attatcagtg gaatattatg ttctgataat cttaactgta 1680

atattccgct aattttacat ctgcaatttt caactacaat tgccatgata tcatttaaag 1740

atactttatc agccttattt tcatcatctt catttatcat cacaagctgg ttatttaaaa 1800

ctgataattc attgactctt gttacatgga taatattaga catttttatt actcctttac 1860

tctaaagctt tatattcaaa cataactttc acaagttcac acaattcttc tgaatttcta 1920

tcagtcatta attttttctt ttttaaattt ttcaaatgta caattttttc cgattctaaa 1980

gtctgaattt ctattttctt atctgctcct attttaaatg ttgctacaaa accatattcc 2040

tttaatatat ccactattga tttcataatt gcatttttaa gttttctatc ataagaaagt 2100

aattttctta aattttccag cacttctaaa agtgaaattt cagcatgcgg aatatagtta 2160

aaatgtgcaa tatagtttcg tatatacaaa tcttttttct cttgttttaa tttttttact 2220

tttttatcag aatagatgct tcttttttct acattatctt tgtataattc tttataaaaa 2280

tttatatatt tttcaacaat ttgcccactt ttatatttta catttttact gttatcaaaa 2340

ttaaatattt cttcaatata atgattttca ggaaattcac ctttcaatct aaatcttaag 2400

tccctttccc agatcgaagt atatcccaca agtctgtgga gtatttttaa taacaagcct 2460

tgcaacaagt ttaattcatt aaattccact ttatttttca aatgagtata tttttgtata 2520

tttccaattg ctttttcata ttctttataa tcttcatcat taaatttttc atctttttta 2580

ggtcttgcat attttctatg taaattttgc tgcattgtat aatttttttc tatttcattt 2640

tttttattgc tgtattcttt caattctttt aaacttattt tatacttcgc tttatcagct 2700

attttttcaa gtaaatttaa catcccatat ttttttatat tataaaaagc tctatgcttt 2760

ataatatttt ctccatcaaa atatatttta tttgtgtcaa atttcttcaa ttctttccta 2820

tcttttattt tattttcatt aaaatctaaa aattttccaa tttcattcgc ttctaattca 2880

aaatcttctg ttactctatt attatctaaa tttaaaagat ttataagttc aagttcatct 2940

gaaaaagttt cttctttatt tgcactctga tatttttcaa gacttccctt caaattagtc 3000

aattctttat gattaagcaa ttttaaaatt aaataaaaca tattcaaatt ttcagtgtat 3060

tttaatatct ttcctaattt tatctctctt acaaattcat ttatttcatg tggaatttct 3120

ttattcctat tatgtttttc ataatttttt aaaattttat catatttttc tttattatct 3180

ttttttattt ttattttaga aaatatatca ttattatcat tgttattatt actttctata 3240

tattttaaat tatttttatt caaataatct ataaaacctt ttaaaaatat ttgttgtata 3300

aaatcaatgt atgtattttt ttcttcttta tcttgattat taatcatctc cctactttgt 3360

ataatagcaa gatattctac tggtacagtt ttttctatat tttcaaattt ttgatattta 3420

taatgtcctg ttttttgatt tctttgttta tttattttta ttacttcatt agttatttta 3480

aaaaaaactt tactattttt aacaaattta ttaagaaatt caccataata aatatttttc 3540

aaaagatata tttgagcatc tttttcttct ttatccttag gaacactcca aaaaaatttt 3600

aaagtatttc ttaaatcttc tattttatta tataatttcg taaaagaagg aacaaaagga 3660

atattcttat ttacaaaatt aaattttgta ttttttaaat atttaattat cacatccttt 3720

tcataataat taaatacatt tgcactattt aactgcttaa atatcttcaa tttcaatttt 3780

ttctcattta tttcattttg aaacattttt tttgaaattt cagaaggagc tatattttta 3840

aatgcaaata tatctttccc ttctaattcc aaattaaaat gcacaatccc atgtctaata 3900

ctgctaatag cttcatcaat atttgcaaaa aaatcttcta tctcattttt attatccata 3960

ttaaaatcat aactatagaa catttttaaa ttttctttta cttcattttg cttgttttca 4020

ttatatattt tatcaacttc tccagaaaca tatttttctt cgcccttatt attttttaca 4080

gtttttcctc tcattctacc tgtaatatca ttctcatttt cagtttcaag aatatttctc 4140

aatgaaaaat atgcaaccga agaaactcca attatatttc gtaaaaatgc ttcattttgt 4200

ctattcctag caataaaatc acttgttgca atctctccaa cttgtaaata ataattgtat 4260

ttcccacaat ttcttacata agtatccaat ttatttagta atttgttttc aattaatttt 4320

tttaaatttt gatattcaaa tattctctta attttatcgt tacttatgtt actcagtctt 4380

ttatacacat aatttttcaa aagctgactc atttcaattt ccacaaaatg acaaaaagca 4440

tattttatat ttttatcatt aagttcttct ttatccaaat aatatttata aaacacttgt 4500

gattttttta attcactcat atccggaatt ttttcaatta attcttttat attatttaca 4560

ttttgtattt cttcgtaaat aattttagca aaattttctt tatcattttt tcttccaatt 4620

attttgtgat agtattctct tattttatat ttttcatgtt tttttgaatt ttctattaaa 4680

aaaaataact tctcaatatc ttctttttta tacaatttat caaatgcttc ctgtacatta 4740

tttatataat cattacgctt tgctgattct ctataataat cataaataat atttcttttg 4800

ctcttccctc caactttttc aacattattt tcattaattt tctgataatt agccttattt 4860

tcttcaaatg aatattttaa agaatttatc ttattcaatt ttgcctcaac atcttttcta 4920

aatatttcta attcttcaga gttcacatct tcatttaaca atattttctt taaaactgaa 4980

aaactatttt tattttttaa atcatattct gaaatatctt cttcagaata atttttatcc 5040

tgtactgcat ttttctcttt cctattcttt aaatacagaa cactatcttt tagatgcaat 5100

actttatttg aaaaaaactt ttttaaattt tctcttctta ttctattttc ttcttcactt 5160

gcattatcag gattttttat atatatatcc agtcttatac ttaaaagctc tgacaatctc 5220

tcactagtcc tattttcttc gctcgtactt tttactaatt ttccctcttc aatatatttt 5280

ttatgcgaaa ttccatcaac ttttgtaact ttcatatata aaaacctcct aatatctata 5340

ttttttactc aatacctaat tcttttttca atgctttttg taaaatttgt gaaaaattca 5400

gatttttttc ctgtgccaat atatctaacc aaacaggaat tgttaaagtt ttctttttaa 5460

gtgcatttgt aacttttgcc acttcataca ctggatcaac agataaaata tacaaatact 5520

gattttcttt cagtttcaca tcctccactt ttgaaggctc aggaaatttt tttcttacat 5580

ccaaaaaatc agccaaatgc agacccaatg tctctctcaa attggaaaca gcctcctcca 5640

tgctatctcc aaatgtagca taataattta tctctccatc ttcaaactta tcaaaatcaa 5700

caatacaacc ataataagtc ccatcttcct tagttaccac tgctggataa aatacatcca 5760

ttttaattat ctccaatcta taccacgtgt taaatacgtg tttaaaaata tttataaaat 5820

tttttagcat ctctgctaaa ataaaacaat tatttcaaat ttttctattc cttaatcact 5880

cattgttagt gattcttttt ttacttggac aatttttcat ttaatttctt caattttttt 5940

aaaatcacat ttttttaata ttccttattt aattgcaaat tttcattact tttggggtgc 6000

tctaaatccc atccaaatta tgggataata atttttagtg aaagcaagaa gggactagaa 6060

tttaatccca acttgttttt caatacttct taatgttcct acaggtatat cttttgaata 6120

tggtactgtg accacacctt ccacacctgg gatcatccat tgataatgac tacctcttat 6180

acgcacaact tttccgccta attttctaaa tcttttttcg at 6222

<210> 67

<211> 6337

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 67

ctttctatct ttttcaaata aaattaggct ctagttagcc taatcgcata attatttatt 60

atagtataat tcttattttt tttcaaccta aaaatttaaa acatctccaa aaattttcgt 120

ttcagaacaa ccaagcaacc atattcaaaa aacaataaaa aatgagcaag aattgaaatt 180

ttattctcac tcagaagtta tttttattaa atatcacttt tcgatattgg ggtggtctat 240

atcaatttaa aagacagaat agataattct ttagagtttt agtccccttc gatattgggg 300

tggtctatat cagaagtcat ttaataaggc cactgttaaa agttttagtc cccttcgata 360

ttggggtggt ctatatccca tcctaatttc ttgctgatga gatatttatt tctaattttt 420

ctattttgtc tttattttca atactttcaa tcctattttt ctctttatta ataatataga 480

accaccctat actattatac catatttttt gatttttcaa aattccaata ttttgttttg 540

tgaaattttt tctcccattg tcacttctcc tgcaagtacc ttcatttttt gaaactgatc 600

ttctgtcagg ataatggaac ggattgatga attttctgga gcgagcattg ataactgttt 660

ttctgccagt tcgatttttt cttttgtttt cgacctcatt atatataccg atttttgaag 720

ctgataatat cccttttcta tcaatttttt cctaaaagtc ctatattcaa atctctcaac 780

atctgtctgc ataggaaaat catacataag cagaccaaaa tactcaatac tcatagtcca 840

tcacgctcaa tgtcggaatt atcacttctt catcttttac aaaataattt cgtatactat 900

ccaaataata gtctaccgct tggaaaaaat catatttctt attgttaaat aataccttct 960

gctgtgctac aagaagtatt ttttgcctta tttccttact taatttcact tcattcaaaa 1020

tatccttgta catataaaca agataatcca ccataggacg aaaaacctct attatatcat 1080

cagaaaaatt ataggcatta aactgtgact tatgatgtaa tcctaaactt ggatgaaatc 1140

cttttgctac aatctttgat gatattatag ctcttaaaat catatatcca taattaagtg 1200

cagaattcac tccatcttca tcaaatcttt taaaactatt actatacaat tcctgaaaat 1260

atatccttga agctattgct tcctgatgtt ctgcactcgc atcatctttt ttcaagtttt 1320

ccttatatgt tttcagtctt tcaatggaaa tatcactttt ttcaagatac tctaacaatg 1380

ctctttgatt ttcaatctta ttctccacta tcctgctcca caatttttcc tttttctctt 1440

tttcccactc aatctgctca tttattcgta aagtcacttg aaaatgatta aataatccca 1500

gcgaatgaat ttcaggctga tgtttctcgt tgcaaataat aatcggaatg ttattttcca 1560

ccagcctcaa ctgcaaaatc gcactaatct tacaatagca gttttcaata actatcgcag 1620

atatatcatt caaagaaatc ttatttttct catcattatt gtcttcatca accattataa 1680

gctgattatt cgatattgac aaatcatcag cccttgttat gtgaattata ttgggcattt 1740

taatcatact ccttataaat ttcattctta taacgtatca ttcgtatttt ctatttttgt 1800

taaaagttct attatcaagt ttttaatata atcagaatta taactttcta attctaaaac 1860

agaaactttt ttaggtttca ttaatctttc aagtatatca ttattaccga taagtttaaa 1920

ttttttcttt aattcatcat aatctaaatt cacatctttt ttaaatactt caaatacact 1980

tgcataagtt gaattattat aacgtgtact atatgataat aaattagaaa ctctatcaat 2040

ttgttctgca atactgtaat cagcaaacgg atttcttaca atatagaaat gtgaaatata 2100

gtttctaata ctttcatttt ccggcttatt aatttcagaa ttttcagaca aatcaattcc 2160

aaatccataa catattttct caaatttttt ataagattct tcatcaaaaa atttatagta 2220

tgctgttgtt gtataaaagc catcagatcc attacgctta ggataagctc tacttattcc 2280

agtattgtag ccacttaact taataattcc taattctctt agcccattta caatatagtg 2340

catatctctt tcaaatctag ccatttgaat agcaagtttc caatttatat ctatcaaata 2400

actttctatt ttattcaaat aattaaattc taccaaatct ctaatttttt tgtattcaga 2460

aactctatta taatcttttt caaatgattt atagttttta ttttgtatat tttttgcaaa 2520

aaagtcatca ttttctttca atttttttat atacttctct ttgtattctt tagaatatcc 2580

atttagttta tcatttagat ttttcaatat tgcatcaatt tcagatattt tattttttct 2640

aatattttta ccatcaatat taaataaaaa ttttgcatca gccattttaa tatcatttga 2700

aattaatcca taaattttat caaaatttgg atttccaata tttaaaaata aattcttttt 2760

ataaatatat aattcattct tacgttcttt aggataatat atttcttgaa atttattttc 2820

attctctgat tccatatctt ctattaaatt atctatttct tttttgtatt tttttaaaaa 2880

atcagaatta aatattattc tacacaatat tttactcttt atttcctgat ctttatcttt 2940

tatatactga tcaacctttt ttttcaaatc ctttttattt atgtttgata actttctttg 3000

ttcatcttgt aatatattcg attttttatc tatctcaaat ttagtttcat catcaaaaat 3060

tacaattttt tctaattttt tctctaaaac atcacaacca ttaatatcat ctttaaattc 3120

agttaatata ttatttttta tatcctcata ataattatta aaaatttctt ttttagtttg 3180

tattttaaaa tcatcaaagt ctttttctat ctctttcatt ttttgaataa attcttctaa 3240

attaagattc caattttcag ttatacattc atttctcaaa gtatttaatt gcattatttc 3300

atctaaaata tctataatat tttgatattc tgaagtattt aaccaaactg atgttgcaaa 3360

aaatctattt ctaattttat ttataaccgc attactattt aacagtgcaa atattgaaat 3420

tatatattca aaatcatcat ttattactat agttttatca ctagtcttta cagttattct 3480

ttcgtaagtt ttattatcat taatgtcttt tatttgtttc ttaatttctt gaatattcat 3540

tttaaaatct gaaaaatcaa aaagttcctc ataatttttt ctcaaatatc caatataaca 3600

ttctattact tttttctgat attttttaat agctttatta ttaccttttg aagcagaaat 3660

ctgagcattt ttataataat tttctataat attttcatct atttcatcaa tgtttcctaa 3720

agttttcttt aattcttgta aaaatatatt cttactttca ttttcttcta aatcatcttc 3780

taaaattaat ttcttataca attctttatt cacatatatt aaagcattta atactatttt 3840

ttctgtttct atagtatcaa atggttcatt cttaggatta ttcctatata aatttaatat 3900

ttcaggaagt actttagaaa aggatggtaa atatttaata tcattattat tttcttctga 3960

aattttaata tcatttattt tagtaattat atttttttta tctttaaata ctacatctaa 4020

atttaatgct tttgacactt cttcatctga tatttttaaa ttttgaatta tatttatgac 4080

tttattatag tcatcttgcg ttccttgtaa atctctttcc ttgctaatcg catgtaatat 4140

cctgtttctt tcatttgttc ctatctttgt aaatttccta ataaaattat ttgtaatgtt 4200

atttttatta tctataaaat ctaagtctct tattattttt atttttgaat ttaaaatttt 4260

tttatcaagt acgtaatttt tttctcgatc tcctccaaag aaatctatat tttcatcatt 4320

atttatattt tctctagaaa aaatcttatt taattccata ttggtagaag caaaaaaagt 4380

aatcaattct aaatccaatt cctctttagc gtgaagtcta gaaaaatcat cagtatttac 4440

tgttgtcata tctatatcat tatgtcttaa tttccctaaa tacataatat gctctaacgt 4500

atattgctta actcttttta aaattttttc agataatata ctttcattta aaattttttc 4560

tatttctatt ttttccattt tctttaatct gactttttgt tcatttacca atattttttc 4620

aattcttcct ttcaaatatc gatatatgat tttatatagt tctttttctt catcagattt 4680

ctttgaaaat tttttcgaat caaaattaac tttataatgt tttttaaata ttccaaaaat 4740

ttctgtatca caatttcctt tttttagttc tttttctaat ttttttatta attcatctat 4800

tttaaattct gctaaaattt tttctatttt ttcttttata ctattatttt ttatattttc 4860

tacaaaaaat tttacaattt tatctttttt attttctctt tctattttaa atttttcgtg 4920

cttatctaat agtacataag attttatata tgttctattt cttctctttt caagaaattc 4980

attattaact ttttttactt tttcaattct tttagtaata ttccaaaatt ctaactcttt 5040

tataacaaaa tcagctatat cttctactgt taaatctaca tttatattta aaattttttc 5100

aacaagcatt tttttatttt tagatttctt tttatcacca ccaacattaa gataaaattt 5160

tacaaaaccc agaatttcta aattactttt tattttttct cttatttcca taaaattagt 5220

caaaataaca tctattttat catctttcaa taatttttct cttaaatgtt cttcataata 5280

tcgattttca aatacttttt ctgtttcatt ttcaattatt ttttctataa tcttatataa 5340

actcatgtta atatttttaa aaatttcgta aattgatttt tttgtttcta attcatcatt 5400

ttctattatt cttaatatta ttgaacaatc atttagtgtt ttattagtat actcatctct 5460

gatatctatc tctatttctt cttcattctc ttgtctcttt atttctattt ttttatcatc 5520

tttagttatt ccttgcctaa ttgcttcatc tattattttc ttttttgtaa tccccaatgc 5580

tttcaatttc tcagattttc catatgcttc tatatataat acaacttctt ctgtttccaa 5640

aaaatcatca ttattttcta ttcttatgat tccttcttta cctttcaact taaatagaat 5700

atttcctgca tgaaattttc ttgtaaattc tttaagaata ttatcatttt ttttgtaatt 5760

aatatatttt ctaataaatt tattattatc aattttttct ttattattat tttcattaat 5820

atttaaaatg tatttgtttc catcatagtt ccttttaact tttactttcc gttttatttt 5880

aaaatctttt ttatcacgaa cttcatacca tctcttatgt ccaaataaat ttcccattcc 5940

aatctcctcg tttctacttt aatctaataa aatattttta aattaaatca attttacatc 6000

tttctaatca aaaatacaat tttccatttt tagtatacca catcaatatt aaatctcaaa 6060

aaaataagga gccgtcaaac atagctccct acttctattt actcataatc cccatctatc 6120

cttacttttc gtaaaatcaa tccttctttc gcctttagat ccaacttaat tttcccattt 6180

gaacctgttc taaatgttct gccttctgtt accaaatcaa taaatctttc atcctgataa 6240

tttgtttcaa attccacatt ttcccagctg ttaaacgaat tatttattac aacaataatt 6300

aaatgatcct cgattactct ttcatacaca attattt 6337

<210> 68

<211> 173

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 68

aatatggatt acttggtaga acagcaatct acgccagtga attcgagctc ggtacccggg 60

gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 120

cctgtgttta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aag 173

<210> 69

<211> 173

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 69

ggccagtgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga aatatggatt acttggtaga 60

acagcaatct actcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 120

cctgtgttta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aag 173

<210> 70

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 70

ccaccccaat atcgaagggg actaaaacta gattgctgtt ctaccaagta atccat 56

<210> 71

<211> 1434

<212> PRT

<213> Leptotrichia shahii

<400> 71

Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys

1 5 10 15

Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp

20 25 30

Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys

35 40 45

Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn

50 55 60

Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile

65 70 75 80

Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn

85 90 95

Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr

100 105 110

Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile

115 120 125

Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile

130 135 140

Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg

145 150 155 160

Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg

165 170 175

Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile

180 185 190

Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile

195 200 205

Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His

210 215 220

Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr

225 230 235 240

Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu

245 250 255

Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser

260 265 270

Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp

275 280 285

Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe

290 295 300

Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Val Asn Asn Glu

305 310 315 320

Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu

325 330 335

Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp

340 345 350

Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys

355 360 365

Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asp Glu Leu Ile

370 375 380

Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile

385 390 395 400

Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys

405 410 415

Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr

420 425 430

Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys

435 440 445

Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn

450 455 460

Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr

465 470 475 480

Leu Glu His Ile Met Tyr Leu Gly Lys Leu Arg His Asn Asp Ile Asp

485 490 495

Met Thr Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu

500 505 510

Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu

515 520 525

Leu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Glu Asn Ile Asn Asn Asp Glu Asn Ile

530 535 540

Asp Phe Phe Gly Gly Asp Arg Glu Lys Asn Tyr Val Leu Asp Lys Lys

545 550 555 560

Ile Leu Asn Ser Lys Ile Lys Ile Ile Arg Asp Leu Asp Phe Ile Asp

565 570 575

Asn Lys Asn Asn Ile Thr Asn Asn Phe Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile

580 585 590

Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu His Ala Ile Ser Lys Glu Arg

595 600 605

Asp Leu Gln Gly Thr Gln Asp Asp Tyr Asn Lys Val Ile Asn Ile Ile

610 615 620

Gln Asn Leu Lys Ile Ser Asp Glu Glu Val Ser Lys Ala Leu Asn Leu

625 630 635 640

Asp Val Val Phe Lys Asp Lys Lys Asn Ile Ile Thr Lys Ile Asn Asp

645 650 655

Ile Lys Ile Ser Glu Glu Asn Asn Asn Asp Ile Lys Tyr Leu Pro Ser

660 665 670

Phe Ser Lys Val Leu Pro Glu Ile Leu Asn Leu Tyr Arg Asn Asn Pro

675 680 685

Lys Asn Glu Pro Phe Asp Thr Ile Glu Thr Glu Lys Ile Val Leu Asn

690 695 700

Ala Leu Ile Tyr Val Asn Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ile Leu Glu

705 710 715 720

Asp Asp Leu Glu Glu Asn Glu Ser Lys Asn Ile Phe Leu Gln Glu Leu

725 730 735

Lys Lys Thr Leu Gly Asn Ile Asp Glu Ile Asp Glu Asn Ile Ile Glu

740 745 750

Asn Tyr Tyr Lys Asn Ala Gln Ile Ser Ala Ser Lys Gly Asn Asn Lys

755 760 765

Ala Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Lys Val Ile Glu Cys Tyr Ile Gly Tyr

770 775 780

Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Phe Ser Asp Phe Lys Met

785 790 795 800

Asn Ile Gln Glu Ile Lys Lys Gln Ile Lys Asp Ile Asn Asp Asn Lys

805 810 815

Thr Tyr Glu Arg Ile Thr Val Lys Thr Ser Asp Lys Thr Ile Val Ile

820 825 830

Asn Asp Asp Phe Glu Tyr Ile Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser

835 840 845

Asn Ala Val Ile Asn Lys Ile Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val

850 855 860

Trp Leu Asn Thr Ser Glu Tyr Gln Asn Ile Ile Asp Ile Leu Asp Glu

865 870 875 880

Ile Met Gln Leu Asn Thr Leu Arg Asn Glu Cys Ile Thr Glu Asn Trp

885 890 895

Asn Leu Asn Leu Glu Glu Phe Ile Gln Lys Met Lys Glu Ile Glu Lys

900 905 910

Asp Phe Asp Asp Phe Lys Ile Gln Thr Lys Lys Glu Ile Phe Asn Asn

915 920 925

Tyr Tyr Glu Asp Ile Lys Asn Asn Ile Leu Thr Glu Phe Lys Asp Asp

930 935 940

Ile Asn Gly Cys Asp Val Leu Glu Lys Lys Leu Glu Lys Ile Val Ile

945 950 955 960

Phe Asp Asp Glu Thr Lys Phe Glu Ile Asp Lys Lys Ser Asn Ile Leu

965 970 975

Gln Asp Glu Gln Arg Lys Leu Ser Asn Ile Asn Lys Lys Asp Leu Lys

980 985 990

Lys Lys Val Asp Gln Tyr Ile Lys Asp Lys Asp Gln Glu Ile Lys Ser

995 1000 1005

Lys Ile Leu Cys Arg Ile Ile Phe Asn Ser Asp Phe Leu Lys Lys

1010 1015 1020

Tyr Lys Lys Glu Ile Asp Asn Leu Ile Glu Asp Met Glu Ser Glu

1025 1030 1035

Asn Glu Asn Lys Phe Gln Glu Ile Tyr Tyr Pro Lys Glu Arg Lys

1040 1045 1050

Asn Glu Leu Tyr Ile Tyr Lys Lys Asn Leu Phe Leu Asn Ile Gly

1055 1060 1065

Asn Pro Asn Phe Asp Lys Ile Tyr Gly Leu Ile Ser Asn Asp Ile

1070 1075 1080

Lys Met Ala Asp Ala Lys Phe Leu Phe Asn Ile Asp Gly Lys Asn

1085 1090 1095

Ile Arg Lys Asn Lys Ile Ser Glu Ile Asp Ala Ile Leu Lys Asn

1100 1105 1110

Leu Asn Asp Lys Leu Asn Gly Tyr Ser Lys Glu Tyr Lys Glu Lys

1115 1120 1125

Tyr Ile Lys Lys Leu Lys Glu Asn Asp Asp Phe Phe Ala Lys Asn

1130 1135 1140

Ile Gln Asn Lys Asn Tyr Lys Ser Phe Glu Lys Asp Tyr Asn Arg

1145 1150 1155

Val Ser Glu Tyr Lys Lys Ile Arg Asp Leu Val Glu Phe Asn Tyr

1160 1165 1170

Leu Asn Lys Ile Glu Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Trp Lys Leu

1175 1180 1185

Ala Ile Gln Met Ala Arg Phe Glu Arg Asp Met His Tyr Ile Val

1190 1195 1200

Asn Gly Leu Arg Glu Leu Gly Ile Ile Lys Leu Ser Gly Tyr Asn

1205 1210 1215

Thr Gly Ile Ser Arg Ala Tyr Pro Lys Arg Asn Gly Ser Asp Gly

1220 1225 1230

Phe Tyr Thr Thr Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser

1235 1240 1245

Tyr Lys Lys Phe Glu Lys Ile Cys Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Leu

1250 1255 1260

Ser Glu Asn Ser Glu Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg

1265 1270 1275

Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp

1280 1285 1290

Tyr Ser Ile Ala Glu Gln Ile Asp Arg Val Ser Asn Leu Leu Ser

1295 1300 1305

Tyr Ser Thr Arg Tyr Asn Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Val Phe Glu

1310 1315 1320

Val Phe Lys Lys Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys

1325 1330 1335

Lys Phe Lys Leu Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met

1340 1345 1350

Lys Pro Lys Lys Val Ser Val Leu Glu Leu Glu Ser Tyr Asn Ser

1355 1360 1365

Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu

1370 1375 1380

Asn Thr Asn Asp Thr Leu Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala

1385 1390 1395

Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro

1400 1405 1410

Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr

1415 1420 1425

Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1430

<210> 72

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 72

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 73

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 73

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacuu ucuagaggau ccccggguac cgagcu 56

<210> 74

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 74

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacag uaauccauau uucuagagga uccccg 56

<210> 75

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 75

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 76

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 76

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacca ugccugcagg ucgaguagau ugcugu 56

<210> 77

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 77

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacgc augccugcag gucgaguaga uugcug 56

<210> 78

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 78

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacaa gcuugcaugc cugcaggucg aguaga 56

<210> 79

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 79

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaaccg ccaagcuugc augccugcag gucgag 56

<210> 80

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 80

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacga uuacgccaag cuugcaugcc ugcagg 56

<210> 81

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 81

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacug auuacgccaa gcuugcaugc cugcag 56

<210> 82

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 82

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacau gaccaugauu acgccaagcu ugcaug 56

<210> 83

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 83

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua ugaccaugau uacgccaagc uugcau 56

<210> 84

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 84

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacag cuaugaccau gauuacgcca agcuug 56

<210> 85

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 85

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacga aacagcuaug accaugauua cgccaa 56

<210> 86

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 86

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacac aggaaacagc uaugaccaug auuacg 56

<210> 87

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 87

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacaa cacaggaaac agcuaugacc augauu 56

<210> 88

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 88

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacaa acacaggaaa cagcuaugac caugau 56

<210> 89

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 89

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacau aaacacagga aacagcuaug accaug 56

<210> 90

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 90

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacgg auaaacacag gaaacagcua ugacca 56

<210> 91

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 91

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacag cggauaaaca caggaaacag cuauga 56

<210> 92

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 92

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacga gcggauaaac acaggaaaca gcuaug 56

<210> 93

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 93

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 94

<211> 54

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 94

accccaauau cgaaggggac uaaaacuaga uugcuguucu accaaguaau ccau 54

<210> 95

<211> 52

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 95

cccaauaucg aaggggacua aaacuagauu gcuguucuac caaguaaucc au 52

<210> 96

<211> 50

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 96

caauaucgaa ggggacuaaa acuagauugc uguucuacca aguaauccau 50

<210> 97

<211> 48

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 97

auaucgaagg ggacuaaaac uagauugcug uucuaccaag uaauccau 48

<210> 98

<211> 47

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 98

uaucgaaggg gacuaaaacu agauugcugu ucuaccaagu aauccau 47

<210> 99

<211> 46

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 99

aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 46

<210> 100

<211> 52

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 100

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua au 52

<210> 101

<211> 51

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 101

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua a 51

<210> 102

<211> 50

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 102

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua 50

<210> 103

<211> 49

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 103

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagu 49

<210> 104

<211> 48

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 104

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaag 48

<210> 105

<211> 47

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 105

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaa 47

<210> 106

<211> 46

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 106

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuacca 46

<210> 107

<211> 45

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 107

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuacc 45

<210> 108

<211> 44

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 108

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuac 44

<210> 109

<211> 40

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 109

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu 40

<210> 110

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 110

ccacccgaau aucgaacggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 111

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 111

ccaccgcaau aucgaagcgg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 112

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 112

ccacgccaau aucgaaggcg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 113

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 113

ccagcccaau aucgaagggc acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 114

<211> 57

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 114

ccagggggaa uaucgaaccc cacuaaaacu agauugcugu ucuaccaagu aauccau 57

<210> 115

<211> 57

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 115

ccaccaccaa uaucgaaggg gacuaaaacu agauugcugu ucuaccaagu aauccau 57

<210> 116

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 116

ccaacccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 117

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 117

ccacccaaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 118

<211> 58

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 118

ccacccccaa uaucgaaggg ggacuaaaac uagauugcug uucuaccaag uaauccau 58

<210> 119

<211> 55

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 119

ccaccccaua ucgaagggga cuaaaacuag auugcuguuc uaccaaguaa uccau 55

<210> 120

<211> 53

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 120

ccaccccauc gaaggggacu aaaacuagau ugcuguucua ccaaguaauc cau 53

<210> 121

<211> 49

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 121

ccaccccaag gggacuaaaa cuagauugcu guucuaccaa guaauccau 49

<210> 122

<211> 57

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 122

ccaccccaaa uaucgaaggg gacuaaaacu agauugcugu ucuaccaagu aauccau 57

<210> 123

<211> 59

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 123

ccaccccaaa aauaucgaag gggacuaaaa cuagauugcu guucuaccaa guaauccau 59

<210> 124

<211> 63

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 124

ccaccccaaa aaaaaauauc gaaggggacu aaaacuagau ugcuguucua ccaaguaauc 60

cau 63

<210> 125

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 125

ccaccccgau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 126

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 126

ccaccccaaa aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 127

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 127

ccaccccaau auccaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 128

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 128

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacaa gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 129

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 129

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gaaugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 130

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 130

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcaguu cuaccaagua auccau 56

<210> 131

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 131

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu guaccaagua auccau 56

<210> 132

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 132

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuacgaagua auccau 56

<210> 133

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 133

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagaa auccau 56

<210> 134

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 134

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua augcau 56

<210> 135

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 135

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua auccaa 56

<210> 136

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 136

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacau gauugcuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 137

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 137

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauaccuguu cuaccaagua auccau 56

<210> 138

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 138

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcugaa cuaccaagua auccau 56

<210> 139

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 139

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaggaagua auccau 56

<210> 140

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 140

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagau auccau 56

<210> 141

<211> 56

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 141

ccaccccaau aucgaagggg acuaaaacua gauugcuguu cuaccaagua aucguu 56

<210> 142

<211> 173

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 142

ggccagugaa uucgagcucg guacccgggg auccucuaga aauauggauu acuugguaga 60

acagcaaucu acucgaccug caggcaugca agcuuggcgu aaucaugguc auagcuguuu 120

ccuguguuua uccgcucaca auuccacaca acauacgagc cggaagcaua aag 173

<210> 143

<211> 152

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 143

aauauggauu acuugguaga acagcaaucu acaaaaaaaa aaaaaaaaaa agaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa agaaaaaaaa aaaaaaaaaa agaaaaaaaa aaaaaaaaaa agaaaaaaaa 120

aaaaaaaaaa agaaaaaaaa aaaaaaaaaa ag 152

<210> 144

<211> 152

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 144

aauauggauu acuugguaga acagcaaucu acuuuuuuuu uuuuuuuuuu ucuuuuuuuu 60

uuuuuuuuuu ucuuuuuuuu uuuuuuuuuu ucuuuuuuuu uuuuuuuuuu ucuuuuuuuu 120

uuuuuuuuuu ucuuuuuuuu uuuuuuuuuu uc 152

<210> 145

<211> 176

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 145

ggguaggugu uccacagggu agccagcagc auccugcgau gcaaauaugg auuacuuggu 60

agaacagcaa ucuaauccgg aacauaaugg ugcagggcgc ugacuuccgc guuuccagac 120

uuuacgaaac acggaaaccg aagaccauuc auguuguugc ugccggaagc auaaag 176

<210> 146

<211> 176

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 146

gggccccucc guucgcguuu acgcggacgg ugagacugaa gauaauaugg auuacuuggu 60

agaacagcaa ucuaaacuca uucucuuuaa aauaucguuc gaacuggacu cccggucguu 120

uuaacucgac uggggccaaa acgaaacagu ggcacuaccc cgccggaagc auaaag 176

<210> 147

<211> 173

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 147

ggccagugaa uucgagcucg guacccgggg auccucuaga aauauggauu acuugguaga 60

acagcaaucu agucgaccug caggcaugca agcuuggcgu aaucaugguc auagcuguuu 120

ccuguguuua uccgcucaca auuccacaca acauacgagc cggaagcaua aag 173

<210> 148

<211> 173

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 148

ggccagugaa uucgagcucg guacccgggg auccucuaga aauauggauu acuugguaga 60

acagcaaucu aaucgaccug caggcaugca agcuuggcgu aaucaugguc auagcuguuu 120

ccuguguuua uccgcucaca auuccacaca acauacgagc cggaagcaua aag 173

<210> 149

<211> 173

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 149

ggccagugaa uucgagcucg guacccgggg auccucuaga aauauggauu acuugguaga 60

acagcaaucu auucgaccug caggcaugca agcuuggcgu aaucaugguc auagcuguuu 120

ccuguguuua uccgcucaca auuccacaca acauacgagc cggaagcaua aag 173

<210> 150

<211> 175

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 150

accgaucguc guuguuuggg caaugcacgu ucuccaacgg ugcuccuaug gggcacaagu 60

ugcaggaugc agcgccuuac aagaaguucg cugaacaagc aaccguuacc ccccgcgcuc 120

ugagagcggc ucuauugguc cgagaccaau gugcgccgug gaucagacac gcggu 175

<210> 151

<211> 175

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 151

acuguuggug guguagagcu uccuguagcc gcauggcguu cguacuuaaa uauggaacua 60

accauuccaa uuuucgcuac gaauuccgac ugcgagcuua uuguuaaggc aaugcaaggu 120

cuccuaaaag auggaaaccc gauucccuca gcaaucgcag caaacuccgg caucu 175

<210> 152

<211> 175

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 152

gguaacaugc ucgagggccu uacggccccc gugggaugcu ccuacauguc aggaacaguu 60

acugacguaa uaacggguga guccaucaua agcguugacg cucccuacgg guggacugug 120

gagagacagg gcacugcuaa ggcccaaauc ucagccaugc aucgaggggu acaau 175

<210> 153

<211> 175

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 153

uucguaaaac guucgugucc gggcucuuuc gcgagagcug cggcgcgcac uuuuaccgug 60

gugucgaugu caaaccguuu uacaucaaga aaccuguuga caaucucuuc gcccugaugc 120

ugauauuaaa ucggcuacgg gguuggggag uugucggagg uaugucagau ccacg 175

<210> 154

<211> 70

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 154

auaggccagu gaauucgagc ucgaauaugg auuacuuggu agaacagcaa ucuacgccgg 60

aagcauaaag 70

<210> 155

<211> 70

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 155

cuuuaugcuu ccggcguaga uugcuguucu accaaguaau ccauauucga gcucgaauuc 60

acuggccuau 70

<210> 156

<211> 198

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 156

ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataaacac aggaaacagc 60

tatgaccatg attacgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg agaatatgga ttacttggta 120

gaacagcaat ctatctagag gatccccggg taccgagctc gaattcactg gccccctata 180

gtgagtcgta ttaatttc 198

<210> 157

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 157

gaaguuugca gcuggauacg acagacgg 28

<210> 158

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 158

ugucuggaag uuugcagcug gauacgac 28

<210> 159

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 159

agcuggauac gacagacggc caucuaac 28

<210> 160

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 160

uacgucgcga uauguugcac guugucug 28

<210> 161

<211> 31

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 161

uacggacgac cuucaccuuc accuucgauu u 31

<210> 162

<211> 31

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 162

ucguacggac gaccuucacc uucaccuucg a 31

<210> 163

<211> 31

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 163

cggucugggu accuucguac ggacgaccuu c 31

<210> 164

<211> 31

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 164

gcggucuggg uaccuucgua cggacgaccu u 31

<210> 165

<211> 31

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 165

agcggucugg guaccuucgu acggacgacc u 31

<210> 166

<211> 31

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 166

aguucauaac acguucccau uugaaaccuu c 31

<210> 167

<211> 31

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 167

uuaacuuugu agaugaacuc accgucuugc a 31

<210> 168

<211> 31

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 168

uuuaacuuug uagaugaacu caccgucuug c 31

<210> 169

<211> 31

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 169

guuuaacuuu guagaugaac ucaccgucuu g 31

<210> 170

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 170

aaguuugcag cuggauacga cagacggc 28

<210> 171

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 171

acaggauguc ccaagcgaac ggcagcgg 28

<210> 172

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 172

gcuuguucag cgaacuucuu guaaggcg 28

<210> 173

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 173

uaagcucgca gucggaauuc guagcgaa 28

<210> 174

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 174

cgucaacgcu uaugauggac ucacccgu 28

<210> 175

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 175

ucaacagguu ucuugaugua aaacgguu 28

<210> 176

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 176

aaguuugcag cuggauacga cagacggc 28

<210> 177

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 177

uuugcagcug gauacgacag acggccau 28

<210> 178

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 178

cagcuggaua cgacagacgg ccaucuaa 28

<210> 179

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 179

guugucugga aguuugcagc uggauacg 28

<210> 180

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 180

gcgauauguu gcacguuguc uggaaguu 28

<210> 181

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 181

acguugucug gaaguuugca gcuggaua 28

<210> 182

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 182

auguugcacg uugucuggaa guuugcag 28

<210> 183

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 183

ugcagcugga uacgacagac ggccaucu 28

<210> 184

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 184

cuggaaguuu gcagcuggau acgacaga 28

<210> 185

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 185

aguuugcagc uggauacgac agacggcc 28

<210> 186

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 186

gcuggauacg acagacggcc aucuaacu 28

<210> 187

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 187

guuugcagcu ggauacgaca gacggcca 28

<210> 188

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 188

uaguuugcag cuggauacga cagacggc 28

<210> 189

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 189

aaguaugcag cuggauacga cagacggc 28

<210> 190

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 190

aaguuugcug cuggauacga cagacggc 28

<210> 191

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 191

aaguuugcag cucgauacga cagacggc 28

<210> 192

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 192

aaguuugcag cuggauucga cagacggc 28

<210> 193

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 193

aaguuugcag cuggauacga gagacggc 28

<210> 194

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 194

aaguuugcag cuggauacga cagagggc 28

<210> 195

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 195

uuguuugcag cuggauacga cagacggc 28

<210> 196

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 196

aaguuaccag cuggauacga cagacggc 28

<210> 197

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 197

aaguuugcag gaggauacga cagacggc 28

<210> 198

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 198

aaguuugcag cuggaaucga cagacggc 28

<210> 199

<211> 28

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 199

aaguuugcag cuggauacga gugacggc 28

<210> 200

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> source

<222> (1)..(6)

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag"

<400> 200

His His His His His His

1 5

<210> 201

<211> 5

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> source

<222> (1)..(5)

<223> /note="Description of Unknown: 'GGDEF' family motif peptide"

<400> 201

Gly Gly Asp Glu Phe

1 5

<210> 202

<211> 18

<212> PRT

<213> Alicyclobacillus acidoterrestris

<400> 202

Leu Arg Val Met Ser Val Asp Leu Gly Leu Arg Thr Ser Ala Ser Ile

1 5 10 15

Ser Val

<210> 203

<211> 22

<212> PRT

<213> Alicyclobacillus acidoterrestris

<400> 203

Gln Arg Thr Leu Arg Gln Leu Arg Thr Gln Leu Ala Tyr Leu Arg Leu

1 5 10 15

Leu Val Arg Cys Gly Ser

20

<210> 204

<211> 12

<212> PRT

<213> Alicyclobacillus acidoterrestris

<400> 204

Cys Gln Leu Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Glu Tyr

1 5 10

<210> 205

<211> 16

<212> PRT

<213> Alicyclobacillus acidoterrestris

<400> 205

His Gln Ile His Ala Asp Leu Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln Gln Arg

1 5 10 15

<210> 206

<211> 18

<212> PRT

<213> Alicyclobacillus contaminans

<400> 206

Val Arg Val Met Ser Val Asp Leu Gly Val Arg Tyr Gly Ala Ala Ile

1 5 10 15

Ser Val

<210> 207

<211> 22

<212> PRT

<213> Alicyclobacillus contaminans

<400> 207

Lys Gln Ala Leu Ala Ala Ile Arg Ala Glu Met Ser Ile Leu Arg Lys

1 5 10 15

Trp Leu Arg Val Ser Gln

20

<210> 208

<211> 12

<212> PRT

<213> Alicyclobacillus contaminans

<400> 208

Cys Asp Leu Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ser Arg Tyr

1 5 10

<210> 209

<211> 16

<212> PRT

<213> Alicyclobacillus contaminans

<400> 209

Lys Cys Val His Ala Asp Ile Asn Ala Ala His Asn Leu Gln Arg Arg

1 5 10 15

<210> 210

<211> 18

<212> PRT

<213> Desulfovibrio inopinatus

<400> 210

Leu Arg Val Leu Ser Val Asp Leu Gly Met Arg Thr Phe Ala Ser Cys

1 5 10 15

Ser Val

<210> 211

<211> 22

<212> PRT

<213> Desulfovibrio inopinatus

<400> 211

Arg Ala Glu Ile Tyr Ala Leu Lys Arg Asp Ile Gln Arg Leu Lys Ser

1 5 10 15

Leu Leu Arg Leu Gly Glu

20

<210> 212

<211> 12

<212> PRT

<213> Desulfovibrio inopinatus

<400> 212

Cys Gln Leu Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ala Arg Tyr

1 5 10

<210> 213

<211> 16

<212> PRT

<213> Desulfovibrio inopinatus

<400> 213

Cys Val Ile His Ala Asp Met Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln Arg Arg

1 5 10 15

<210> 214

<211> 18

<212> PRT

<213> Desulfonatronum thiodismutans

<400> 214

Leu Arg Val Leu Ser Val Asp Leu Gly Val Arg Ser Phe Ala Ala Cys

1 5 10 15

Ser Val

<210> 215

<211> 22

<212> PRT

<213> Desulfonatronum thiodismutans

<400> 215

Met Glu Glu Leu Arg Ser Leu Asn Gly Asp Ile Arg Arg Leu Lys Ala

1 5 10 15

Ile Leu Arg Leu Ser Val

20

<210> 216

<211> 12

<212> PRT

<213> Desulfonatronum thiodismutans

<400> 216

Cys Arg Leu Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ala Arg Tyr

1 5 10

<210> 217

<211> 16

<212> PRT