СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ТРОФОБЛАСТИЧЕСКОГО БЕТА-1-ГЛИКОПРОТЕИНА Российский патент 2008 года по МПК A61K35/16 A61K38/17 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в медицине, биотехнологии для получения препарата трофобластического β-1-гликопротеина (ТБГ), используемого в качестве компонента диагностических систем и средства для лечения онкологических, аутоиммунных и аллергических заболеваний. Способ позволяет увеличить выход и чистоту целевого продукта.

Известно, что ТБГ, являясь специфическим маркером беременности, синтезируется трофобластом и выделяется в кровоток матери. По мнению большинства авторов ТБГ является гликопротеином, содержащим до 28% углеводов и имеющим молекулярную массу от 90000 Д (Bohn Н., 1974) до 113000 Д (Татаринов Ю.С. и др., 1974). Однако в литературе присутствуют данные о том, что ТБГ образует семейство, состоящее из 4 белков с молекулярной массой 72, 64, 62 и 54 кД (Plouzek C.A. и Chou J.Y, 1991). Другие же авторы полагают, что ТБГ является гетерогенным белком, гетерогенность которого обусловлена наличием двух вариантов ТБГ - альфа и бета (Pola A. et al., 1992). При этом молекулярный вес ТБГ-альфа равен 110 кД, а ТБГ-бета - 75 кД (Ito M. et al., 1981). Отсутствие достоверно подтвержденных данных о молекулярной гетерогенности ТБГ и точного описания структуры молекулы в значительной степени является причиной отсутствия эффективной системы его выделения и очистки. Источником для получения ТБГ является ретроплацентарная кровь.

Известен многоэтапный способ выделения ТБГ из ретроплацентарной крови человека [1]. Сыворотку, полученную из ретроплацентарной крови, фракционировали последовательно риванолом и сульфатом аммония, после чего подвергали гельфильтрации на сефадексе G-25. Полученный материал подвергали ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Фракции, содержащие ТБГ, объединяли, фракционировали сульфатом аммония и проводили гельфильтрацию на сефадексе G-200. После очередного сульфатаммонийного фракционирования и диализа проводили хроматографию на колонке с гидроксилапатитом и следом после осветления центрифугированием ионообменную хроматографию на микрогранулярной целлюлозе КМ-32. Завершающим этапом очистки являлось препаративное изоэлектрофокусирование на амфолинах с диапазоном 3,0-10,0. Результатом всей процедуры очистки являлось получение препарата ТБГ со степенью очистки 93%. Выход составлял 1,1%.

Процедура очистки, позволившая получить 1,8 мг относительно чистого искомого белка из пробы, содержащей 160 мг, предусматривает две процедуры гельфильтрационной, две ионообменной, одну гидрофобной хроматографий, три процедуры сульфатаммонийного фракционирования и изоэлектрофокусирование.

Таким образом, явными недостатками описанного метода являются чрезвычайная громоздкость и трудоемкость, очень высокая затратность, особенно с учетом чрезвычайно низкого выхода целевого продукта равного 1,1%.

Известен способ выделения ТБГ из отходов производства гамма-глобулина из ретроплацентарной крови [2], предусматривающий суспендирование твердого осадка, содержащего ТБГ в воде, центрифугирование и последующее сульфат аммонийное фракционирование. После 4-суточного диализа и центрифугирования полученный супернатант обрабатывают гидроксилапатитом и, проинкубировав 30-60 минут, вновь центрифугируют. Супернатант подвергают концентрированию на ультрафильтрах и двухсуточному диализу, после чего центрифугируют и лиофилизируют. Лиофилизированный препарат растворяют в фосфатном буфере и подвергают колоночной хроматографии на гидроксилапатите. Элюат диализуют в течение 36 часов и лиофилизируют. Выход составляет 35,5%, чистота препарата - 95%. Описанный способ превосходит предыдущий и по чистоте получаемого препарата и по выходу, однако также весьма трудоемок, занимает существенное время и приводит к неоправданным потерям за счет многочисленных процедур диализа.

Ближайшим аналогом заявляемого изобретения является способ получения ТБГ из сыворотки ретроплацентарной крови или осадка, полученного при производстве гамма-глобулина из сыворотки ретроплацентарной крови [3], предусматривающий сульфат аммонийное фракционирование с последующим диализом в течение 4-х суток. После центрифугирования супернатант подвергают ионообменной хроматографии. Элюат концентрируют и диализуют в течение 72 часов. Отдиализованный препарат центрифугируют и пропускают через сорбент, содержащий лектин (конканавалин А). Элюированную фракцию, содержащую ТБГ, диализуют и лиофилизируют. Выход препарата при чистоте 96% составляет 20%.

В самой процедуре так называемого байч варианта описанной ионообменной хроматографии на гексилсефарозе заложены высокие количественные потери белка. Длительность осуществления способа, а также низкий выход целевого продукта не позволяют рассматривать описанный способ как решение проблемы выделения и очистки такого сложного белка как трофобластический бета-1-гликопротеин.

Технической задачей изобретения является увеличение выхода и чистоты выделяемого ТБГ. Поставленная задача достигается следующим образом.

Проверенную на отсутствие вируса гепатита В антител к ВИЧ, гепатиту С ретроплацентарную кровь центрифугируют, добавляют в нее натрия хлорид (0,1-1,0 моль/л) и тритон Х-100 (0,01-0,05%) для блокирования неспецифической сорбции и инактивации вирусов, вновь центрифугируют. Подготовленную таким образом сыворотку насыщают сульфатом аммония до 30%, инкубируют в течение ночи при +4°С и перемешивании и центрифугируют. Осадок трижды отмывают 30% сульфатом аммония, суспендируют в 0,15 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,5, содержащем 0,5 М хлорида натрия, и диализуют в ультрафильтрационной ячейке, пропуская 10-кратный объем буфера. Полученный препарат наносят на первый аффинный сорбент с иммобилизованными моноклональными антителами к ТБГ. Неспецифически сорбировавшиеся компоненты сыворотки вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами 0,15 М фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,0-7,5, содержащего 0,5 М хлорида натрия, и таким же объемом 0,15 М раствора хлорида натрия. Аффинно-связанный ТБГ элюируют 0,1 М глицин-HCl буферным раствором.

Элюат быстро нейтрализуют до рН 6,5-7,5, диализуют против фосфатно-солевого буферного раствора и наносят на сорбент с иммобилизованным белком G, где происходит избирательная аффинная сорбция (негативная хроматография) контаминирующих иммуноглобулинов. Контаминация препарата иммуноглобулинами G человека после первой аффинной очистки верифицирована исследованием методом LC-MS/MS спектроскопии. Эффективность использования указанного сорбента обусловлена способностью белка G, выделенного из клеточной стенки стрептококка, чрезвычайно эффективно связываться с Fc-фрагментами иммуноглобулинов G большинства млекопитающих и в первую очередь со всеми типами IgG человека.

Определяющим преимуществом предлагаемого способа является возможность двухстадийного получения препарата ТБГ с высокой степенью чистоты и эффективным выходом целевого продукта.

Аффинный сорбент с моноклональными антителами получают следующим образом. 200 мг моноклональных антител к трофобластическому бета-1-гликопротеину) инкубируют с суспензией 50 мл BrCN-сефарозы FF, предварительно уравновешенной в 0,1М карбонатно-бикарбонатном буфере рН 8,3 с 0,5М хлорида натрия (КББ) в течение ночи на шейкере при +4°С. После отмывки 15 объемами КББ сорбент инкубируют с 1,0 М раствором этаноламина 2 часа при комнатной температуре и перемешивании. Завершается синтез сорбента пятью циклами отмывки поочередно 0,1 М ацететным буфером с 0,5 М NaCl рН 3,5 и 0,1 М ТрисHCl буфером с 0,5 М NaCl рН 8,5. Хранится сорбент в забуференном физрастворе с 0,1% азида натрия.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Все процедуры проводят при +4°С. 1,0 л ретроплацентарной крови центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа, осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют натрия хлорид до конечной концентрации 0,5 М и тритон Х-100 до конечной концентрации 0,02%. Центрифугирование повторяют. Сыворотку, содержащую 52 мг ТБГ, подготовленную таким образом, насыщают сульфатом аммония до 30%, инкубируют в течение ночи при перемешивании и центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа. Осадок трижды отмывают 30% сульфатом аммония, суспендируют в 0,15 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,5, содержащем 0,5 М хлорида натрия, и диализуют в ультрафильтрационной ячейке, пропуская 10-кратный объем буфера. Полученный препарат объединяют с 50 мл сефарозы FF, модифицированной моноклональными антителами к ТБГ. Инкубацию осуществляют в течение 12 ч при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты сыворотки вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,5 М натрия хлорида и таким же количеством 0,15 М раствора натрия хлорида. Сорбент помещают в хроматографическую колонку 2,5×8,0 см. После отмывки сорбента раствором натрия хлорида проводят элюцию 0,1 М глицин-HCl буферным раствором с рН 2,55 со скоростью 80 мл/час, контролируя процесс по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюцию проводят до достижения нулевых значений оптической плотности. Фракции элюата, содержащие целевой продукт, объединяют, немедленно нейтрализуют до рН 6,5-7,5, диализуют против фосфатно-солевого буферного раствора и наносят на колонку с сефарозой с белком G. Скорость нанесения 60 мл/ч.

Полученный препарат, содержащий ТБГ, очищенный от примесных белков, концентрируют и диализуют в ультрафильтрационной ячейке относительно физиологического раствора и лиофилизируют.

Чистота полученного препарата, анализируемая методом электрофореза в градиенте плотности полиакриламидного геля, составляет 98%. Выход препарата по данным иммуноферментного анализа составляет 35,9 мг (69%). Полученный препарат тестируют на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.

Пример 2. Все процедуры проводят при +4°С. 1,0 л ретроплацентарной крови центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа, осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют натрия хлорид до конечной концентрации 0,5 М и тритон Х-100 до конечной концентрации 0,02%. Центрифугирование повторяют. Сыворотку, содержащую 52 мг ТБГ, подготовленную таким образом, насыщают сульфатом аммония до 30%, инкубируют в течение ночи при перемешивании и центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа. Осадок трижды отмывают 30% сульфатом аммония, суспендируют в 0,15 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,5, содержащем 0,5 М хлорида натрия, и диализуют в ультрафильтрационной ячейке, пропуская 10-кратный объем буфера. Препарат наносят на хроматографическую колонку 2,5×8,0, заполненную 50 мл сефарозы FF с иммобилизованными моноклональными антителами к ТБГ, эквилибрированную фосфатно-солевым буферным раствором. Скорость нанесения 40 мл/ч. Нанесение осуществляют трехкратным прохождением наносимого объема через колонку.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымывают с сорбента последовательно фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,5 М натрия хлорида и 0,15 М раствором натрия хлорида, со скоростью 80 мл/ч до достижения нулевых значений оптической плотности.

После отмывки сорбента проводят элюцию 0,1 М глицин-НС буферным раствором с рН 2,55 и скоростью 40 мл/ч. Процесс элюции контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюция проводится до достижения нулевых значений оптической плотности. Элюируемые фракции, содержащий целевой продукт, объединяют, немедленно нейтрализуют до рН 6,5-7,5, диализуют против фосфатно-солевого буферного раствора и наносят на колонку с сефарозой с белком G. Скорость нанесения 60 мл/ч.

Весь прошедший через колонку раствор, содержащий ТБГ, концентрируют и диализуют относительно физиологического раствора и лиофилизируют.

Чистота полученного препарата, анализируемая методом электрофореза в градиенте плотности полиакриламидного геля, составляет 98%. Выход препарата по данным иммуноферментного анализа составляет 39,5 мг (76%). Полученный препарат тестируют на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.

Использование предлагаемого способа позволяет получать целевой продукт с высокой степенью чистоты (не менее 98%) и высоким - 69-76% выходом. Полученные результаты достигаются за счет применения двух высокоаффинных сорбентов, эксплуатирующих уникальные свойства моноклональных антител и белка G стрептококка.

Источники информации

1. А.В.Соколов, Г.А.Козляев, Н.В.Меснянкин, Ю.С.Татаринов. Выделение и очистка специфичного β1-г-глобулина. «Вопросы медицинской химии», 1978, №24, с.с.240-244.

2. С.В.Мороз, С.К.Кривоносов, А.Ф.Павленко, Ю.С.Оводов, Ю.С.Татаринов. Способ получения трофобластического бета-1-гликопротеина из отходов ретроплацентарной крови при производстве гамма-глобулина. А.с. №1341736, приоритет 28.03.85.

3. С.К.Кривоносов, А.А.Терентьев, И.И.Коптева, И.В.Москвичева, П.П.Хохлов, А.К.Барсуков, Ю.С.Татаринов. Способ получения трофобластического бетаргликопротеина. А.с. №1783644, приоритет 04.12.89.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа выделения трофобластического бета-1-гликопротеина. Трофобластический бета-1 -гликопротеин выделяют из сыворотки, полученной в результате дифференциального центрифугирования ретроплацентарной крови человека. Супернатант после первого центрифугирования насыщают хлоридом натрия (0,1-1,0 моль/л) для предотвращения неспецифической сорбции и тритоном Х-100 (0,01-0,05%) для инактивации вирусов и вновь центрифугируют, затем наносят на аффинный сорбент, представляющий собой сефарозу с иммобилизованными моноклональными антителами к трофобластическому бета-1-гликопротеину. Белок элюируют 0,1 М глицин-HCl буферным раствором и после нейтрализации и исчерпывающего диализа проводят вторую аффинную хроматографию на сефарозе с модифицированным белком G, выделенным из клеточной стенки стрептококка, для освобождения от иммуноглобулиновой контаминации. Раствор, прошедший через колонку и содержащий трофобластический бета-1-гликопротеин, концентрируют, диализуют против физраствора и лиофилизируют. Способ обеспечивает повышение выхода и степени чистоты целевого продукта.

Способ выделения и очистки трофобластического бета-1-гликопротеина из сыворотки ретроплацентарной крови путем фракционирования сульфатом аммония, отмывки и центрифугирования растворенного осадка, диализа и хроматографии, отличающийся тем, что сыворотку после центрифугирования при 10000 об/мин и насыщения хлоридом натрия до конечной концентрации 0,1-1,0 моль/л и тритоном Х-100 до конечной концентрации 0,01-0,05%, обработанную сульфатом аммония до 30% насыщения и отдиализованную в ультрафильтрационной ячейке, подвергают двойной аффинной хроматографии, а именно: нанасят на первый аффинный сорбент, представляющий собой сефарозу с иммобилизированными моноклональными антителами к трофобластическому бета-1-гликопротеину, аффинносвязанный ТБГ элюируют 0,1М глицин-HCl буферным раствором рН 2,55, элюат немедленно нейтрализуют, диализуют против фосфатно-солевого буферного раствора и наносят на второй аффинный сорбент, представляющий собой сефарозу, модифицированную белком G, выделенным из клеточной стенки стрептококка, раствор, прошедший через колонку и содержащий ТБГ, концентрируют, диализуют против физраствора и лиофилизируют.