СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНГИОГЕНИНА Российский патент 1998 года по МПК C07K14/515 

Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской и фармацевтической промышленности, а именно к способам выделения биологически активных препаратов.

Известен способ выделения ангиогенина из культуральной среды клеток НТ-29 [1].

Однако выход ангиогенина составляет около 0,5 мкг/л, поэтому для получения ангиогенина данный источник является неэффективным.

Также известен способ выделения ангиогенина из плазмы или сыворотки крови. Бычья кровь собирается в пластиковый сосуд, очищается центрифугированием и замораживается при минус 20^oC. После очистки на ватмановском стеклянном микроскопическом фильтре плазму пропускают через СМ-52 катионобменную смолу. Переносят в колонку диаметром 2,50 мм и элюируют буфером. Фракцию, содержащую ангиогенин, обозначают "СМ 2". Фракцию концентрируют ультрафильтрацией. Второй этап очистки проводят моно-S катион-обменной хроматографией. На основе конкурентной пробы проводится отбор проб, содержащих ангиогенин. Объединенную фракцию направляют на высокожидкостную хроматографию. Третий этап очистки проводится на HPLC колонках размером 4,6 мм х 250 мм (Synchrom. Inc. ). Выход чистого биологически активного ангиогенина составляет 30-80 мг/л плазмы или сыворотки [2].

Недостаток этого способа - использование дорогостоящей аппаратуры (HPLC), длительность и многоэтапность очистки.

Задачей изобретения является разработка простого, эффективного и дешевого способа выделения ангиогенина.

Это достигается тем, что предлагаемый способ предусматривает очистку от жировой фракции, сорбцию белков, хроматографическое их разделение, определение фракций, содержащих ангиогенин. При этом в качестве сырья для выделения ангиогенина используют биологическую жидкость, продуцируемую молочной железой млекопитающих, например коровье молоко. Очистку сырья осуществляют центрифугированием, сорбцию белков проводят ионообменной хроматографией, элюируют фракции белка с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед. После диализа белки фракционируют хроматографией на сорбенте СМ Toyopearl 650 S (ионообменная хроматография). Определяют фракции, содержащие ангиогенин. Объединяют их и наносят для дальнейшей очистки на хроматографическую колонку с сорбентом Butyl-Toyopearl 650 S (гидрофобная хроматография). В результате получают фракции белка, представленные чистым ангиогенином. После обессоливания и концентрирования диализом белок ангиогенина стабилизируют добавлением сульфата аммония.

Разработан простой 3-х этапный метод получения молочного ангиогенина, исключающий обычно используемую для получения ангиогенина из биологических жидкостей хроматографию высокого давления с применением дорогостоящей аппаратуры. Впервые для хроматографической очистки ангиогенина применены сорбенты CM-Toyopearl 650 S и Butyl- Toyopearl 650 S.

Условия проведения ионообменной и гидрофобной хроматографии на этих сорбентах определены с учетом их свойств и свойств ангиогенина. На этапе хроматографической очистки на CM-Toyopearl 650 S белки элюировали 100 мл 0,05 M трис- HCl, pH 8,3 с градиентом концентраций NaCl от 0,05 до 3 M. Условия гидрофобной хроматографии на Butyl- Toyopearl 650 S: элюция 100 мл 0,05 M К-фосфатным буфером, pH 7,0 с градиентом концентрации сульфата аммония от 2 до О M.

В процессе хроматографической очистки для идентификации ангиогенина в белковых фракциях, наряду с ранее используемыми для этой цели показателями, введен экспресс-тест, основанный на субстратной специфичности ангиогенина (учитывалась величина отношения РНКазной активности белка относительно РНК и полиуридиловой или полицитидиловой кислоты). На этапе ионообменной хроматографии ангиогенин элюируется с колонки при концентрациях NaCl 0,12-0,14 M, а на конечном этапе очистки на Butyl-Toyopearl 650 S при концентрациях сульфата аммония 1,5- 1,6 M. Очищенный ангиогенин электрофоретически чистый, обладает характерной для ангиогенина ферментативной и биологической активностью относительно тканей животных.

Способ осуществляется следующим образом.

Ангиогенинсодержащее сырье, а именно биологические жидкости, продуцируемые молочной железой млекопитающих, например коровье молоко, подвергают центрифугированию, проводят сорбцию белков молока на ионообменнике. Целлюлозу отделяют и жидкую фракцию переносят на колонку. Промывают буфером и элюируют. Все фракции с оптической плотностью A₂₈₀ > 0,1_ед объединяют и проводят диализ. Выпавший при диализе осадок удаляют центрифугированием и диализат наносят для ионообменной хроматографии на колонку с сорбентом СМ-Toyopearl 650 S ("Tosoh", Япония), элюируют буфером, собирают фракции объемом 3 мл и определяют в них содержание белка по Лоури.

Дальнейшая очистка ангиогенина осуществляется гидрофобной хроматографией на Butyl-Toyopearl 650 S. Фракции, содержащие ангиогенин, объединяют, обессоливают и концентрируют диализом. Выделенный ангиогенин стабилизируют сульфатом аммония.

Полученный препарат ангиогенина проверяют на ферментативную и биологическую активность по методике Комоловой.

Пример 1. Коровье молоко в количестве 3 л подвергается центрифугированию, далее обезжиренную фракцию наносят на колонку с сорбентом КМ-целлюлозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируют, собирая фракции с A₂₈₀ > 0,1. Диализируют против буфера и полученный диализат наносят на колонку с сорбентом CM-Toyopearl 650 S (Tosoh, Япония). Элюируют буфером и в полученных фракциях определяют содержание белка по Лоури. Фракции, содержащие ангиогенин, объединяют и дальнейшую очистку ангиогенина осуществляют гидрофобной хроматографией на сорбенте Butyl-Toyoperl 650 S, обессоливают диализом. Полученный ангиогенин стабилизируют добавлением сульфата аммония. В результате выделения из 3 л коровьего молока выход биологически активного ангиогенина составил 3,27 мг.

Пример 2. Козье молоко в количестве 1 л подвергается центрифугированию, далее обезжиренную фракцию наносят на колонку с сорбентом КМ-целлюлозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируют, собирая фракции с A₂₈₀ > 0,1. Диализируют против буфера и полученный диализат наносят на колонку с сорбентом CM-Toyopearl 650 S (Tosoh, Япония). Элюируют буфером. Фракции, содержащие ангиогенин, объединяют и дальнейшую очистку ангиогенина осуществляют гидрофобной хроматографией на сорбенте Butyl-Toyoperl 650 S, обессоливают диализом. Полученный ангиогенин стабилизируют добавлением сульфата аммония. В результате выделения из 1 л козьего молока выход ангиогенина составил 0,27 мг.

Таким образом, предлагаемый способ исключает использование дорогостоящей аппаратуры и при этом обеспечивает высокий выход биологически и ферментативно активного препарата ангиогенина.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе заявки.

1. Fett J.W., Strydom D.L., Lobb R.R., Alderman E.M., Bethune J.I., Riordan Y.F., Vallee B.L. Isolation and chasactesization of angiogenin, an angiogenic protein from human carcinoma cells. Biochemistry, V 24, N 20, p. 5480-5486, 1985.

2. Bond M.D., Vallee B.L. Isolation of bovine angiogenin using a placental ribonuclease inhibitor binding ussag. Biochemistry, V 27, N 17, p. 6282-6287, 1988.

Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской и фармацевтической отраслям промышленности, а именно к способам выделения биологически активных препаратов. Изобретение позволяет разработать простой, эффективный и дешевый способ выделения ангиогенина. В качестве сырья для выделения ангиогенина используют биологическую жидкость, продуцируемую молочной железой млекопитающих, например коровье молоко. Сырье очищают центрифугированием, проводят сорбцию белков на ионообменнике, элюируют фракции белка с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед. Затем осуществляют диализ и проводят ионообменную хроматографию. Определяют фракции, содержащие ангиогенин, объединяют их и проводят гидрофобную хроматографию. Далее обессоливают и концентрируют диализом и полученный ангиогенин стабилизируют сульфатом аммония. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ выделения ангиогенина, включающий очистку сырья от жировой фракции, сорбцию белков, хроматографическое их разделение, определение фракций, содержащих ангиогенин, отличающийся тем, что в качестве сырья используют биологическую жидкость, продуцируемую молочной железой млекопитающих, очистку от жировой фракции осуществляют центрифугированием, сорбцию белков проводят на ионообменнике, элюируют фракции белка с оптической плотностью при длине волн 280 нм более 0,1 ед., затем осуществляют диализ, хроматографическое разделение проводят ионообменной хроматографией с сорбентом СМ Toyopearl 650 S, после определения фракций, содержащих ангиогенин, их объединяют, затем проводят гидрофобную хроматографию с сорбентом Butyl Toyopearl 650 S, обессоливают и концентрируют диализом, полученный ангиогенин стабилизируют сульфатом аммония. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости, продуцируемой молочной железой млекопитающих, используют коровье молоко.