Способ подтверждения структуры рекомбинантного интерферона бета-1b Российский патент 2022 года по МПК A61K38/19 C07K14/565 

Изобретение относится к области фармации, биотехнологии, биологии, химии, медицины, в частности, к подтверждению первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb пептидным картированием в лабораторной экспертизе биологических лекарственных препаратов.

Уровень техники

Интерфероны - это цитокины, которые представлены семейством белков, обладающих антивирусной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью, что позволяет их отнести к полифункциональным биорегуляторам широко спектра действия. Лекарственные препараты на основе рекомбинантного интерферона бета используются в клинической практике в качестве препаратов первой линии при терапии рассеянного склероза. Основным действующим веществом данных лекарственных препаратов является рекомбинантный интерферон бета-1а или бета-lb [1, 2]. Препараты интерферона альфа-2b и альфа-2а широко применяют для лечения гепатита В, гепатита С, а также при противоопухолевой терапии.

Интерфероны бета-1а и бета-lb имеют ряд существенных структурных различий в силу особенностей технологий производства. Характер данных различий, а именно, различие молекулярных масс, отсутствие в молекуле интерферона бета-lb гликанов и Mi, замена Ci6 на Si6, носит принципиальный характер для обязательного подтверждения подлинности структуры пептидным картированием для терапевтических белков, полученных с применением технологии рекомбинантной ДНК [3,4].

Из уровня техники известен один способ подтверждения структуры с помощью пептидного картирования интерферона бета-1а в сравнении со стандартным образцом, в соответствии с которым гидролиз белка проводят с помощью эндопротеиназы LysC в 0,05М трисгидрохлоридном буферном растворе pH 9,0 [4].

Из уровня техники известен другой способ подтверждения структуры с помощью пептидного картирования интерферона альфа-2а и альфа-2b в сравнении со стандартным образцом, в соответствии с которым гидролиз белка проводят с помощью трипсина в фосфатном буферном растворе pH 8,0 [5].

В вышеописанных способах раскрыты условия хроматографического разделения: параметры колонки, длина волны детектора, режим элюирования, скорость потока подвижной фазы, температура термостата хроматографической колонки, объем пробы.

К недостатку известных способов следует отнести условия гидролиза, а именно, в нейтральной и щелочной средах происходит быстрая денатурация интерферона бета-lb, которая препятствует дальнейшему проведению испытания из-за образующегося осадка интерферона бета-1b.

Авторами было обнаружено, что в настоящее время способ пептидного картирования для подтверждения подлинности первичной структуры интерферона бета-1b отсутствует.

Прототипом заявляемого изобретения выбран способ оценки подлинности интерферона альфа-2а и альфа-1b с помощью пептидного картирования [5].

Специалисту из области техники известно, что интерферон бета-1b является негликозилированным белком, стабильным в кислой среде.

Стабильность субстанции интерферона бета-lb в одном случае достигается с использованием ацетатного буферного раствора с pH 3,7-4,3, а в другом случае - внесением стабилизатора белковой природы, что позволяет поддерживать стабильность субстанции при значениях pH 7,1-7,8, более предпочтительных для формировании парентерального лекарственного средства. Однако наличие стабилизатора белковой природы является препятствующим фактором для подтверждения подлинности структуры целевого белка (интерферона бета-lb) методом пептидного картирования, поскольку данный стабилизатор также подвержен ферментативному гидролизу и получаемая таким образом пептидная карта содержит пики, не специфичные для целевого белка (интерферона бета-lb).

Существует явная потребность в разработке способа подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb пептидным картированием, где субстанция рекомбинантного интерферона бета-lb не содержит стабилизатора белковой природы.

Описание и сущность изобретения

Технической задачей является разработка специфического, эффективного способа подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb пептидным картированием, где субстанция рекомбинантного интерферона бета-lb не содержит стабилизаторов белкового происхождения, таких как белки (протеины) или пептиды или аминокислоты.

Техническим результатом изобретения является подтверждение подлинности первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb пептидным картированием в сравнении со стандартным образцом рекомбинантного интерферона бета-1b.

Достижение технического результата обеспечивается благодаря:

- эффективной концентрации раствора рекомбинантного интерферона бета-1b обеспечивающей получение пептидной карты с пиками, интенсивность которых достаточна для их визуальной и инструментальной интерпретации;

- реагентам, представляющим собой фермент для гидролиза рекомбинантного интерферона бета-lb и ацетатный буферный раствор, взятых в эффективных количественных соотношениях;

- условиям гидролиза, включающего буферный раствор, pH буферного раствора, время гидролиза, температуру гидролиза;

- использованию раствора рекомбинантного интерферона бета-lb без содержания стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот).

Осуществление заявленного способа

Для разработки заявленного способа использовали раствор рекомбинантного интерферона бета-lb без содержания стабилизаторов белкового происхождения, таких как белки (протеины) или пептиды или аминокислот.

Рекомбинантный интерферон бета-lb, полученный технологией рекомбинантного ДНК, является негликозилированным белком, стабильным в кислой среде, с молекулярной массой около 18,5 кДа (18500 Да), не содержащий N-концевой метионин и состоящий из 165 аминокислотных остатков в следующей последовательности:

SYNLLGFLQR SSNFQSQKLL WQLNGRLEYC LKDRMNFDIP

EEIKQLQQFQ KEDAALTIYE MLQNIFAIFR QDSSSTGWNE

TIVENLLANV YHQINHLKT V LEEKLEKEDF TRGKLMSSLH

LKRYYGRILH YLKAKEYSHC AWTIVRVEIL RNFYFINRLT

GYLRN

Основой для производства лекарственных препаратов интерферона бета-lb является субстанция, представляющая собой очищенный рекомбинантный интерферон бета-lb. В настоящее время в Российской Федерации зарегистрированы две субстанции интерферона бета-lb (далее - субстанция 1 и субстанция 2). В соответствии с международными и отечественными фармакопейными требованиями оценка качества субстанции интерферона бета-lb должна включать подтверждение подлинности структуры интерферона бета-1b.

Для подтверждения подлинности первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb проводят пептидное картирование с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сравнении с его стандартным образцом.

Раствор рекомбинантного интерферона бета-lb, не содержащий стабилизаторов белкового происхождения, в виде белков или пептидов или аминокислот (далее - рекомбинантный интерферон бета-lb), берут в эффективном количестве с концентрацией рекомбинантного интерферона бета-lb не менее 0,6 мг/мл, поскольку данная концентрация интерферона бета-lb является эффективной для получения пиков, интенсивность которых приемлема для визуальной и инструментальной оценки. В случае, если раствор рекомбинантного интерферона бета-lb, не содержащий стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот), имеет концентрацию интерферона бета-lb менее 0,6 мг/мл, то его концентрируют с помощью центрифугирования при 3800g с применением центрифужных фильтров с диаметром пор 10 кДа.

Выбор центрифужных фильтров с диаметром пор 10 кДа обусловлен тем, что молекулярная масса интерферона бета-lb составляет около 18,5 кДа.

Используемый фермент для ферментативного гидролиза представляет собой водный раствор эндопротеиназы Glu-C с концентрацией 1 мг/мл, где Эндопротеиназа Glu-C из Staphylococcus aureus V8, Sigma-Aldrich (кат № P2922).

Ацетатный буферный раствор с pH 4,50-4,57, представляет собой водную композицию, содержащую 5,7 мл 0,2М раствора уксусной кислоты и 4,3 мл 0,2М раствора натрия ацетата, где входящие компоненты смешивают между собой и при необходимости корректируют pH путем добавления 0,2М раствора уксусной кислоты или 0,2М раствора натрия ацетата.

Контрольная карта пептидного картирования применяется для определения отсутствия аутогидролиза фермента, используемого в гидролизе (см. пример 4, фиг. 10).

Для образования пептидных фрагментов рекомбинантного интерферона бета-lb проводят ферментативный гидролиз рекомбинантного интерферона бета-lb с применением раствора фермента Эндопротеиназа Glu-C с концентрацией 1 мг/мл и с заранее приготовленным ацетатным буферным раствором с pH от 4,50 до 4,57. При получении реакционной смеси для проведения ферментативного гидролиза берут эффективное количество (около 50 мкл) водного раствора рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот) с эффективной концентрацией не менее 0,6 мг/мл, помещают в пробирку или флакон, и далее последовательно прибавляют эффективное количество (около 3 мкл) водного раствора Эндопротеиназы Glu-C с концентрацией 1 мг/мл, а затем эффективное количество (около 20 мкл) ацетатного буферного раствора с pH от 4,50 до 4,57. Затем перемешивают и помещают в термостат при температуре 37° С и через 18 часов прибавляют 0,2 мл 6М раствора гуанидина гидрохлорида, перемешивают и прибавляют 0,007 мл 2М раствора дитиотрентола; далее полученную реакционную смесь помещают в термостат при температуре 100 °С на одну минуту, а потом выдерживают при комнатной температуре в течение около 10 минут и далее охлаждают смесь при температуре не более 8 °С в течение от 30 минут до 4-х часов (не более 4-х часов, но не менее 30 минут) не допуская образования льда и замораживания (от 0,1 °С до 8 °С).

Перемешивание и прибавление реакционных ингредиентов при проведении ферментативного гидролиза осуществляют с помощью автоматического дозатора или другого (их) предназначенного (ых) для этих манипуляций известных специалисту (ам) из данной области техники средств или устройств или способов.

Перемешивание реакционной смеси осуществляют около 30 секунд не допуская образования пены.

Специалисту из данной области техники известно, что в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XIV к комнатной температуре относятся параметры не менее 15°С и не более 25 °С.

Одновременно в тех же условиях, что описаны выше, проводят ферментативный гидролиз стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb, не содержащий стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот), с эффективной концентрацией не менее 0,6 мг/мл, с молекулярной массой около 18,5 кДа, не содержащий N-концевой метионин и состоящий из 165 аминокислотных остатков и подтвержденной аминокислотной последовательностью:

SYNLLGFLQR SSNFQSQKLL W QLNGRLEY С LKDRMNFDIP

EEIKQLQQFQ KEDAALTIYE MLQNIFAIFR QDSSSTGWNE

TIVENLLANV YHQINHLKT V LEEKLEKEDF TRGKLMSSLH

LKRYYGRILH YLKAKEYSHC AWTIVRVEIL RNFYFINRLT

GYLRN (далее - стандартный образец рекомбинантного интерферона бета-lb).

Рекомбинантный интерферон бета-lb и его стандартный образец, используемые в ферментативном гидролизе для получения пептидных фрагментов не содержат стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот).

Неожиданным образом, в ходе проведения исследования, определили, что хроматографические условия для интерферона альфа-2Ь могут быть применимы и для рекомбинантного интерферона бета-lb, так как в данных условиях можно получить разрешение пиков, приемлемое для визуальной и инструментальной оценки пептидной карты.

Пептидные фрагменты рекомбинантного интерферона бета-lb и пептидные фрагменты стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb, являющиеся продуктом ферментативного гидролиза, подвергают хроматографическому разделению в режиме обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в следующих условиях:

Хроматографическая колонка размером 100 х 4зб мм, заполненная октадецилсилил (С 18) силикагелем, диаметр частиц 5 мкм, размер пор 300А.

Подвижная фаза А: доводят 1 мл трифторуксусной кислоты до 1000 мл водой очищенной.

Подвижная фаза В : к 1 мл трифторуксусной кислоты прибавляют воду до 100 мл и доводят объем до 1000 мл ацетонитрилом.

Программа градиента:

Интервал, мин Подвижная фаза А, % об./об. Подвижная фаза В, % об./об. 0→8 100 0 8→68 100→40 0→60 68→72 40 60 72→75 40→100 60→0 75→80 100 0

Скорость потока 1 мл/мин

Температура колонки (30 ± 1)°С

Объем пробы 100 мкл

УФ-детектирование (ультрафиолетовое детектирование) проводят при длине волны 214 нм.

В результате высокоэффективного жидкостного хроматографического разделения пептидных фрагментов рекомбинантного интерферона бета-lb и пептидных фрагментов стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb, получают пептидные карты, характеризующие первичную структуру рекомбинантного интерферона бета-1b.

Пептидная карта представляет собой хроматографический профиль распределения пептидных фрагментов индивидуальных для каждого белка (продуктов ферментативного гидролиза молекулы белка), поскольку характер гидролиза и, следовательно, состав пептидных фрагментов, зависит от исходной структуры и аминокислотной последовательности белка.

Хроматографический профиль распределения пептидов имеет вид пиков, каждый из которых соответствует исследуемому пептиду - фрагменту исходной молекулы белка, полученному в результате его (белка) специфического ферментативного гидролиза.

Профиль пептидной карты испытуемого образца должен совпадать с профилем пептидной карты стандартного образца.

Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложения 1 -7)

Фиг.1. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-1b содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 1) при pH 4,50;

Фиг.2. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 2) при pH 4,50.

Фиг 3. Типичная пептидная карта стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) при pH 4,50.

Фиг. 4. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-lb содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 1) при pH 4,54.

Фиг 5. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-1b содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 2) при pH 4,54.

Фиг 6. Типичная пептидная карта стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) при pH 4,54.

Фиг 7. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-1b содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 1) при pH 4,57

Фиг 8. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-1b содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 2) при pH 4,57

Фиг 9. Типичная пептидная карта стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) при pH 4,57.

Фиг. 10 Контрольная пептидная карта без рекомбинантного интерферона бета-1b при эффективном pH от 4,50 до 4,57

Возможность осуществления заявляемого изобретения раскрыта в следующих примерах.

Пример 1.

Способ подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета- lb в субстанции 1 и в субстанции 2 не содержащих стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот) в сравнении со стандартным образцом рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащим стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот) при pH 4,50.

Для образования пептидных фрагментов рекомбинантного интерферона бета-lb и его стандартного образца: берут по отдельности эффективное количество (около 50 мкл) рекомбинантного интерферона бета-lb с концентрацией 0,6 мг/мл без стабилизаторов белкового происхождения в виде белков, пептидов или аминокислот (субстанция 1), эффективное количество (около 50 мкл) рекомбинантного интерферона бета-lb с концентрацией 0,6 мг/мл без стабилизаторов белкового происхождения в виде белков, пептидов или аминокислот (субстанции 2), эффективное количество (около 50 мкл) стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белкового происхождения в виде белков, пептидов или аминокислот (стандартный образец), где субстанция 1 и субстанция 2 и стандартный образец, представляют собой водные растворы; затем к каждой субстанции и стандартному образцу прибавляют последовательно эффективное количество (около 3 мкл) водного раствора Эндопротеиназы Glu-C с концентрацией 1 мг/мл, а затем эффективное количество (около 20 мкл) ацетатного буферного раствора с pH 4,50, затем перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18 часов, а затем в каждую пробирку прибавляют по 0,2 мл 6М раствора гуанидина гидрохлорида, перемешивают и прибавляют в каждую пробирку по 0,007 мл 2М раствора дитиотрентола; далее полученную реакционную смесь перемешивают и помещают в термостат при температуре 100 °С на одну минуту и затем выдерживают при комнатной температуре около 10 минут и далее охлаждают в течение не более 4-х часов, но не менее 30 минут, при температуре не более 8°С, не допуская образования льда и замораживания.

Перемешивание и прибавление реакционных ингредиентов при проведении ферментативного гидролиза осуществляют с помощью автоматического дозатора или другого (их) предназначенного (ых) для этих манипуляций известных специалисту из данной области техники средств или устройств или способов.

Перемешивание реакционной смеси при проведении ферментативного гидролиза осуществляют около 30 секунд не допуская образования пены.

Специалисту из данной области техники известно, что в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XIV к комнатной температуре относятся параметры не менее 15°С, но не более 25 °С.

Далее продукты ферментативного гидролиза (образовавшиеся пептидные фрагменты) подвергают хроматографическому разделению и дальнейшему сравнению полученных пептидных карт.

Типичная пептидная карта субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца, полученные в описанных выше условиях при pH 4,50, представлены на фиг.1, фиг.2, фиг.З. Времена удерживания пиков субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца представлены в таблице 1.

Данным примером подтверждено, что заявленный технический результат достигается в заявленном способе: раствор рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) взятый в эффективной концентрации, подвергнутый ферментативному гидролизу при pH 4,50 и последующему хроматографическому разделению позволяет получить специфичную пептидную карту совпадающую при визуальной оценке с пептидной картой стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) полученной в тех же условиях.

Пример 2.

Способ подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb в субстанции 1 и в субстанции 2 не содержащих стабилизаторов (белков или пептидов или аминокислот) в сравнении со стандартным образцом рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащим стабилизаторов (белков или пептидов или аминокислот) при pH 4,54. Способ осуществляют как описано в примере 1 при охлаждении смеси 30 мин.

Типичная пептидная карта субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца, полученные в данных условиях, представлены на фиг.4, фиг.5, фиг.6. Времена удерживания пиков субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца представлены в таблице 1.

Данным примером подтверждено, что заявленный технический результат достигается в заявленном способе: раствор рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) взятый в эффективной концентрации, подвергнутый ферментативному гидролизу при pH 4,54 и последующему хроматографическому разделению позволяет получить специфичную пептидную карту совпадающую при визуальной оценке с пептидной картой стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) полученной в тех же условиях.

Пример 3.

Способ подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb в субстанции 1 и в субстанции 2 не содержащих стабилизаторов (белков или аминокислот) в сравнении со стандартным образцом рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащим стабилизаторов (белков или пептидов или аминокислот) при pH 4,57. Способ осуществляют как описано в примере 1 при охлаждении смеси 4 часа.

Типичная пептидная карта субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца, полученные в данных условиях, представлены на фиг.7, фиг.8, фиг.9. Времена удерживания пиков субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца представлены в таблице 1.

Данным примером подтверждено, что заявленный технический результат достигается в заявленном способе: раствор рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) взятый в эффективной концентрации, подвергнутый ферментативному гидролизу при pH 4,57 и последующему хроматографическому разделению позволяет получить специфичную пептидную карту совпадающую при визуальной оценке с пептидной картой стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) полученной в тех же условиях.

Пример 4.

Эффективность конечной концентрации Эндопротеиназы Glu-C подтверждается отсутствием аутогидролиза используемого фермента: высокоэффективное хроматографическое разделение продуктов ферментативного гидролиза холостой пробы, где вместо эффективного количества (около 50 мкл) рекомбинантного интерферона бета-lb брали 50 мкл ацетатного буферного раствора с эффективным pH 4,5-4,57. Далее проводили анализ в соответствии с описываемым способом в примере 1 или примере 2 или примере 3.

Таким образом, данный пример подтверждает отсутствие пептидных фрагментов, что демонстрирует контрольная пептидная карта (фиг. 10).

Пример 5

Взяли раствор рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащий стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) с известной исходной концентрацией. Если концентрация интерферона бета-lb менее 0,6 мг/мл, то далее его концентрируют с помощью центрифугирования при 3800g с применением центрифужных фильтров с диаметром пор 10 кДа до концентрации интерферона бета-lb не менее 0,6 мг/мл. Конечную концентрацию интерферона бета-lb определяют исходя из значения исходной концентрации и пропорционального уменьшения объема взятого раствора.

Далее заявленный способ осуществляют, как описано в примере 1 или примере 2 или примере 3.

Пример 6.

С целью подтверждения специфичности и стабильности результатов (прецизионности) заявленного способа были проведены шесть независимых испытаний субстанции 1 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот), субстанции 2 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) и стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащего стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот). В результате анализа пептидных карт были выбраны семь характеристических пиков, как наиболее интенсивных, хорошо разрешенных, симметричных пиков со стабильным временем удерживания (см. таб. 1)

Пример 7.

Специфичность заявленного способа оценивали путем визуального сравнительного анализа пептидных карт субстанции 1 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) и субстанции 2 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) с пептидными картами стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот). Было установлено, что общий профиль пептидных карт субстанции 1 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) и субстанции 2 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов (белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) и времена удерживания семи характеристических пиков совпадают с общим профилем пептидных карт и временами удерживания семи характеристических пиков стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащего стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) (фиг. 1-9).

Пример 8.

Прецизионность оценивали путем вычисления коэффициента вариации времени удерживания каждого из семи характеристических пиков (таблица 1).

Таблица 1. Оценка прецизионности заявленного способа. Испытуемый образец рН Время удерживания, мин пик 1 пик 2 пик 3 пик 4 пик 5 пик 6 пик 7 Субстанция
№1 4,50 27,23 30,35 42,76 45,14 49,11 52,88 55,56 27,05 30,17 42,51 44,88 48,84 52,60 55,26 4,54 27,06 30,22 42,62 44,99 48,93 52,73 55,40 27,03 30,08 42,45 44,75 48,68 52,45 55,14 4,57 27,01 30,17 42,60 44,96 48,92 52,71 55,39 27,05 30,11 42,58 44,87 48,80 52,59 55,30 Субстанция №2 4,50 27,03 30,17 42,58 44,95 48,92 52,72 55,40 27,06 30,17 42,53 44,89 48,84 52,61 55,26 4,54 27,07 30,22 42,61 44,98 48,93 52,70 55,38 26,93 30,03 42,41 44,74 48,69 52,47 55,13 4,57 26,99 30,07 42,49 44,79 48,77 52,57 55,24 27,08 30,21 42,59 44,96 48,91 52,73 55,40 Стандартный образец 4,50 26,97 30,07 42,44 44,75 48,71 52,48 55,16 27,02 30,10 42,51 44,81 48,79 52,55 55,26 4,54 27,40 30,44 42,41 44,71 48,56 52,25 54,87 27,11 30,24 42,63 44,99 48,94 52,72 55,40 4,57 27,06 30,20 42,61 44,97 48,92 52,70 55,39 27,39 30,44 42,46 44,76 48,62 52,33 54,95 Среднее арифметическое (n=18) -- 27,09 30,19 42,54 44,88 48,83 52,60 55,27 Стандартное отклонение -- 0,13 0,12 0,09 0,12 0,14 0,16 0,17 Коэффициент вариации, % -- 0,48 0,39 0,22 0,27 0,28 0,30 0,31

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что прецизионность метода, оцениваемая по коэффициенту вариации, составило не более 0,5%.

Выше изложенное изобретение описано довольно подробно, с целью ясности понимания, и не должно рассматриваться, как ограничивающее объем притязаний.

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации и раскрытия заявленного способа.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры, подтверждают эффективность и специфичность заявленного способа.

Таким образом, поставленная техническая задача, а именно, разработка эффективного и специфичного способа подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb без содержания стабилизаторов (белков или пептидов или аминокислот), достигнута, что подтверждается приведенными примерами.

Применение в фармации, биотехнологии, биологии, химии, медицине, заявленного способа является эффективным и специфичным.

Список литературы

1. EMA/CHMP/BMWP/652000/2010 «Guidline on similar biological medicinal products containing interferon beta».

2. Zettl U.K., Hecker М., Aktas O., et al. Interferon P-la and P-lb for patients with multiple sclerosis: updates to current knowledge. Expert Rev Clin Immunol. 2018; 14(2): 137-153.

3. Патент на изобретение № 2473696 (заявка № 2011129033 от 14.07.2011).

4. Европейская Фармакопея 01/2009:1639 «Interferon beta-la concentrated solution».

5. Европейская Фармакопея, Монография 07/2015:1110 «Interferon Alfa-2 Concentrated Solution»

6. О.Б. Устинникова, JI.А. Гайдерова, М.Л. Байкова, Т.Н. Лобанова, И.М. Щербаченко, Е.О.Голощапова, В.П. Бондарев. Обзор методических подходов к оценке качества лекарстенных средств на основе рекомбинантных интерферонов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017. Т.17. №3. с.152-155.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b пептидным картированием. Способ подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b пептидным картированием характеризуется тем, что берут отдельно интерферон бета-1b и его стандартный образец, не содержащие белковых стабилизаторов, и одновременно проводят их гидролиз путем последовательного приливания растворов фермента эндопротеиназы Glu-C и ацетатного буфера, перемешивания и помещения в термостат, далее приливают раствор гуанидина гидрохлорида, перемешивают и добавляют раствор дитиотреитола, перемешивают и помещают в термостат, охлаждают смесь, проводят обращенно-фазовое высокоэффективное жидкостное хроматографическое разделение при УФ-детектировании, получают и сравнивают пептидные карты первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b и его стандартного образца. Вышеописанный способ используется для эффективного подтверждения подлинности первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b. 5 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 8 пр.

1. Способ подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b пептидным картированием, характеризующийся тем, что берут отдельно интерферон бета-1b 50 мкл в концентрации 0,6 мг/мл и его стандартный образец, не содержащие белковых стабилизаторов, и одновременно проводят их гидролиз путем последовательного прибавления 3 мкл раствора фермента эндопротеиназы Glu-C с концентрацией 1 мг/мл, 20 мкл ацетатного буферного раствора рН 4,50-4,57, перемешивают и помещают в термостат при температуре 37°C на 18 часов, прибавляют 0,2 мл 6М раствора гуанидина гидрохлорида, перемешивают и добавляют 0,007 мл 2М раствора дитиотреитола, перемешивают и помещают в термостат при температуре 100°C на 1 мин, где перемешивание проводят без образования пены в течение 30 секунд, выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут, охлаждают смесь не более 4 часов, но не менее 30 минут при температуре не более 8°C, не допуская образования льда и замораживания, далее проводят обращенно-фазовое высокоэффективное жидкостное хроматографическое разделение при УФ-детектировании, где подвижная фаза А представляет собой 1 мл трифторуксусной кислоты, разведенной 1000 мл водой, и где подвижная фаза В представляет собой 1 мл трифторуксусной кислоты, разведенной водой до 100 мл и доведенной до объема 1000 мл ацетонитрилом, далее получают и сравнивают пептидные карты первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b и его стандартного образца.

2. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что молекулярная масса рекомбинантного интерферона бета-1b составляет 18,5 кДа.

3. Способ по п. 2, дополнительно характеризующийся тем, что рекомбинантный интерферон бета-1b не содержит N-концевой метионин.

4. Способ по п. 2 или 3, дополнительно характеризующийся тем, что рекомбинантный интерферон бета-1b состоит из 165 аминокислотных остатков.

5. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что ацетатный буферный раствор представляет собой композицию, состоящую из 0,2М раствора уксусной кислоты и 4,3 мл 0,2М раствора натрия ацетата.

6. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что УФ-детектирование проводят при длине волны 214 нм.