Рекомбинантная плазмидная ДНК pSMT3_HCRG21, кодирующая гибридный белок SMT3-HCRG21, штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21 - продуцент анальгетического пептида HCRG21 и способ получения рекомбинантного анальгетического пептида HCRG21 Российский патент 2023 года по МПК C12N1/21 C12N15/12 C12N15/63 C12N15/70 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения пептидов в прокариотах. Оно может быть использовано для получения анальгетического пептида HCRG21 биотехнологическим путем.

HCRG21 - это пептид актинии Heteractis crispa. Ранее было показано, что рекомбинантный аналог HCRG21 обладает пролонгированным анальгетическим действием и может найти применение в качестве активной фармакологической субстанции для изготовления анальгетического лекарственного средства, предназначенного для облегчения острых болевых состояний и боли при хронических патологических процессах, где нарушена нормальная функциональная активность и задействована повышенная активность ионного канала TRPV1. Препарат снимает воспаление, эффективно понижает температуру тела животных и человека [RU 2755206, С1, 14.09.2021]. Для пептида определена основная биологическая мишень - ионный канал TRPV1, который характеризуется своей способностью селективно активироваться капсаицином (жгучий компонент перца), реагировать на изменение значения pH внеклеточной среды, активироваться при превышении критического уровня нагревания (более 43°С) и распознавать множество различных химических молекул. Ингибирование активности TRPV1 в животных тестах приводит к анальгетическому эффекту [Гладких И.Н. и др. Успехи биологической химии, 2021, Т. 61, С. 107-154]. Активность этого пептида как ингибитора ионного канала TRPV1 была определена путем электрофизиологических экспериментов, где было получено значение половинного эффекта ингибирования (IC₅₀) 6,9 мкМ для индуцированного капсаицином тока на ооцитах Xenopus laevis [Monastyrnaya M. et al. Marine Drugs 2016, 14, 229-234].

HCRG21 представляет собой 56-членный полипептид (SEQ ID NO: 1):

RGICSEPKVVGPCTAYFRRFYFDSETGKCTPFIYGGCEGNGNNFETLRACRAICRА

Известен гомологичный анальгетический пептид АРНС3, который можно получить из природного источника [S.A. Kozlov et al. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2009, vol. 35, No. 6, pp. 711-719], экспрессией в бактериальной системе в составе гибридного белка с тиоредоксином [Yaroslav A. Andreev et al. Marine Drugs. 2013 Dec; 11(12): 5100-5115] или в составе гибридного белка DnaBAPHC3 в виде телец включения, содержащего, наряду с АРНС3, последовательность мини-интеина Ssp DnaB [RU 2619170 C2, 12.05.2017]. Недостатки этих методов заключаются в том, что перенос способов получения одного пептида на другой гомологичный пептид не могут дать гарантировано подобный результат из-за индивидуальных особенностей выделения (из природного сырья) или биосинтеза молекулы внутри клеток продуцентов (биотехнологический синтез).

Другой способ, представленный в патенте RU 2571942 С2, 27.12.2015, позволяет получить рекомбинантный пептидный анальгетик РТ1 с высоким выходом, который обладает модулирующим действием на участвующие в генерации болевого сигнала клеточные рецепторы и может найти применение в медицине и научных исследованиях. Однако этот пептид имеет отличную структуру и биологическую клеточную мишень, а значит, он сам и способ его получения не могут быть использованы для синтеза пептида HCRG21.

Прототип, наиболее близкий к заявляемому для патентования способу получения HCRG21, описан в работе [Monastyrnaya M. et al. Marine Drugs 2016, 14, 229-234], где пептид получали в Escherichia coli (штамм BL21(DE3)) в составе гибридного белка, содержащего целевой пептид HCRG21, фрагмент тиоредоксина и интегрированную аффинную метку - последовательность из шести остатков гистидина.

Недостаток данного метода заключается в необходимости использовать для отделения активного пептида от белка-партнера процедуру гидролиза с применением бромциана, расщепляющего гибридный белок по остатку метионина, дополнительно введенного перед первым N-концевым остатком целевого пептида. Использование в схеме синтеза ядовитых веществ, таких как бромциан, резко снижает круг задач, где можно применять полученную таким способом субстанцию. К тому же выход целевого пептида данным способом производства оказался пониженным - 5,5 мг/л клеточной культуры.

Изобретение решает задачу получения высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный анальгетический пептид HCRG21 с высоким выходом и по упрощенной технологии.

Настоящее изобретение относится к гибридному белку SMT3-HCRG21 для получения полипептида HCRG21, имеющему последовательность, состоящую из 176 аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 2):

MVKYHHHHHHGSGLVPRGSASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGRGICSEPKVVGPCTAYFRRFYFDSETGKCTPFIYGGCEGNGNNFETLRACRAICRA,

и содержащий гексагистидиновую метку (HS), последовательность SMT3, сайт распознавания Ulp1-протеазы и полипептид HCRG21, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантной плазмидной ДНК pSMT3_HCRG21 для экспрессии указанного гибридного белка SMT3-HCRG21, имеющей длину 4355 п.о., состоящей из следующих ключевых генетических элементов:

- промотора и терминатора траснкрипции Т7-РНК-полимеразы;

- синтетической нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 3):

CATATGGTGAAGTATCACCACCATCATCACCATGGCTCAGGCTTAGTTCCTCGTGGCAGTGCCTCCATGAGCGATAGTGAAGTCAACCAAGAAGCGAAACCGGAAGTGAAACCTGAAGTGAAACCGGAGACCCACATCAACCTGAAAGTGAGTGATGGCAGTTCTGAGATCTTCTTCAAGATCAAGAAGACCACTCCGTTACGTCGTCTGATGGAGGCGTTTGCGAAACGCCAAGGCAAAGAAATGGATAGTCTTCGCTTTCTGTATGATGGCATTCGCATTCAAGCTGATCAGACTCCAGAAGATCTGGACATGGAAGACAACGACATCATTGAAGCACATCGTGAACAGATTGGTGGTCGTGGCATCTGCAGCGAACCGAAAGTGGTTGGTCCGTGCACTGCGTACTTTCGTCGCTTCTACTTTGACTCTGAGACTGGCAAGTGCACACCGTTCATCTATGGTGGCTGTGAAGGGAATGGCAACAACTTTGAGACCTTACGTGCGTGTCGTGCGATCTGTCGTGCCTAACTCGAG,

кодирующую гибридный белок согласно настоящему изобретению SMT3-HCRG21, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

-гена устойчивости к антибиотику канамицину (KanR) для проведения отбора рекомбинантных клеток;

-участка инициации репликации бактериофага f1 (Оri f1).

Настоящее изобретение также относится к штамму Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21, продуцирующему гибридный белок SMT3-HCRG21 (SEQ ID NO: 2), содержащему указанную рекомбинантую плазмиду ДНК pSMT3_HCRG21. Согласно настоящему изобретению штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21 получают путём трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидой согласно настоящему изобретению.

Предлагаемое изобретение также относится к способу получения полипептида HCRG21, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, включающему стадии:

a) культивирования штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21 согласно настоящему изобретению с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок SMT3-HCRG21 согласно настоящему изобретению;

б) выделения гибридного белка SMT3-HCRG21 согласно настоящему изобретению из биомассы клеток штамма-продуцента, полученных на стадии а);

c) ферментативного расщепления гибридного белка SMT3-HCRG21, полученного на стадии б), с образованием полипептида HCRG21 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1;

д) очистки полипептида HCRG21, полученного на стадии c).

Техническим результатом является образование HCRG21 с последовательностью SEQ ID NO: 1, выход которого в 2 раза превышает выход по способу-прототипу, и достигает 10,2 мг/литр культуры при чистоте препарата 97%, который имеет замкнутые дисульфидные связи по данным масс-спектрометрии и способен ингибировать капсаицин-вызванные токи через ионный канал TRPV1 на модельных клетках. Кроме того, использование в качестве белка партнера фрагмента N-концевой последовательности SMT3, которая распознается и выщепляется специфической протеазой дрожжей Ulp1, позволяет избежать использование в схеме синтеза ядовитого бромциана, что расширяет круг задач, где можно применять полученную таким способом субстанцию.

В составе гибридного белка был использован фрагмент N-концевой последовательности SMT3 для того, чтобы избежать трудностей, связанных с расщеплением рекомбинантного гибридного белка с помощью различных протеаз, таких как TEV, энтерокиназа, фактор X и др., а также с целью удешевления этой стадии. Эта последовательность распознается и выщепляется специфической протеазой дрожжей Ulp1, которая специфична к белкам SMT3 и SUMO-1 [J. Li and M. Hochstrasser, Nature, 1999, 398(6724), 246-251]. Этот подход для синтеза пептидов был уже опробован ранее. Разработчики из НИИ биохимии ФИЦ ФТМ предложили способ получения зрелого аполипопротеина Α-I человека, который является основным белком плазмы крови, участвующим в образовании липопротеинов высокой плотности [RU 2605326 С1, 20.12.2016]. Для получения зрелого белка апоА-I человека был использован рекомбинантный химерный белок SUMO3-apoA-I, включающий с N-конца аминокислотную последовательность убиквитин-подобного белка SUMO3 человека, слитую с С-конца с аминокислотной последовательностью зрелого белка апоА-I человека. В заявке CN110305887A описан слитый белок SUMO-дросомицин и способ его получения. Противогрибковый пептид имеет широкие перспективы применения при приготовлении антибактериальных препаратов, безопасных пищевых продуктов и косметики, а также имеет высокую рыночную стоимость.

Для заявляемого способа синтезируют ген SMT3-HCRG21 (SEQ ID NO: 2) с учетом оптимизации кодонов для прокариот, далее используют в качестве матрицы плазмиду на основе векторов pET 23a(+) и pET 28a(+), в которую встраивают ген интереса. Полученной экспрессионной плазмидой pSMT3_HCRG21, строение которой приведено на фиг. 1, трансформируют клетки Е.coli BL21 (DE3).

Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/pSMT3_HCRG21 выращивают в богатой среде LB, содержащей 50 мг/л канамицина и 0,5-5 г/л глюкозы до достижения максимальной плотности культуры. Индукцию биосинтеза гибридного белка осуществляют лактозой, после чего через час ферментации собирают осадок, отделяют нерастворимый клеточный осадок, ренатурируют гибридный белок и выделяют целевой пептид HCRG21 хроматографически после гидролиза протеазой.

Изобретение иллюстрируют фигуры.

Фиг. 1. Физическая карта плазмиды pSMT3_HCRG21.

Фиг. 2. Электрофореграмма лизата клеток штамма-продуцента после разрушения биомассы E.coli Bl21(DE3)/pSMT3_HCRG21 в 15% ПААГ. Дорожка 1 - тотальный клеточный лизат; дорожка 2 - клеточный осадок; дорожка 3 - осветленный клеточный лизат; дорожка 4 - маркеры молекулярных масс. Стрелкой указано положение полосы, соответствующее по ожидаемой молекулярной массе гибридному белку SMT3-HCRG21.

Фиг. 3 Электрофореграмма белков в 12,5% ПААГ. Дорожка 5 - SMT3-HCRG21 до ренатурации, дорожка 6 - SMT3-HCRG21 после ренатурации, дорожка 7 - гидролиз гибридного белка протеазой Ulp-1 (3 часа при комнатной температуре), дорожка 8 - целевой продукт после очистки аффинной хроматографией, дорожка 9 - маркеры молекулярных масс, дорожка 10 - фракция, удерживаемая на второй аффинной хроматографии. Стрелками указаны положения полос, соответствующие по ожидаемой молекулярной массе гибридному белку SMT3-HCRG21, N-концевому фрагменту SMT3 и целевому пептиду HCRG21.

Фиг. 4. Профиль аналитической ВЭЖХ рекомбинантного HCRG21, полученного после очистки методом ОФ-ВЭЖХ. Разделение на колонке VDSpher PUR 100 C18-E (VDS, Германия), 250 x 4,6 мм на скорости 1 мл/мин проводят в градиенте концентрации ацетонитрила от 5 до 90% в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты. Расчет площади пиков проводят при длине волны 214 нм.

Фиг. 5. Масс-спектрометрический анализ целевого пептида.

Фиг. 6. Анализ ингибирующей способности целевого пептида методом флуоресцентного имиджинга. Оценивают изменение видимой флуоресценции клеток, экспрессирующих ионный канал TRPV1, после их активации селективным агонистом капсаицином в концентрации 1 мкМ, как разницу между светимостью до добавления агониста (слева) и через 20 секунд после добавления агониста (справа). За 5 минут до начала измерения в клетки добавляют 20 мкл воды (контрольный образец сверху) или 20 мкл раствора HCRG21 до финальной концентрации 5 мкМ (образцы снизу). Расчет относительной флуоресценции по трем независимым лункам проводят по формуле F/F0-1.

Изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1

Получение штамма-продуцента E. coli Bl21(DE3)/pSMT3_HCRG21

Штамм-продуцент Е. coli BL21 (DE3)/pSMT3_HCRG21 получают трансформацией компетентных клеток Е. coli BL21 (DE3) плазмидным вектором pSMT3_HCRG21. К 100 мкл химически компетентных клеток E. coli BL21 (DE3) добавляют 1,5 мкл плазмиды и помещают в лед на 30 минут. Далее клетки помещают в термостат на 45 сек при температуре 42°С. После этого снова помещают клетки в лед на 5 минут. Затем к клеткам добавляют 300 мкл среды SOC и культивируют в течение 1 часа на шейкере (перемешивание 225 об/мин) при 37°С. Содержимое пробирок высеивают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим селективный антибиотик канамицин (50 мг/л) и инкубируют в течение 14-16 ч при 37°С. Полученные колонии отбирают для получения маточной культуры и далее нарабатывают культуру в 15 мл пробирках с питательной средой LB, содержащей 50 мг/л канамицина и 0,5% глюкозы (качалка 190 об/мин, температура 37°С, 15-16 часов). Полученные культуры пересевают 2,5%об. в пробирки со свежей питательной средой LB, содержащей 50 мг/л канамицина и 0,5% глюкозы и культивируют до оптической плотности 0,6-0,7 единиц (качалка 190 об/мин, температура 37°С). Далее добавляют глицерин до 15%об и полученный исследовательский банк (музейные культуры) хранят при -70°С.

Пример 2

Получение гибридного белка SMT3-HCRG21

Для приготовления инокулята используют музейную культуру. Инокулируют 0,1% музейной культуры в среде LB, содержащей 50 мг/л канамицина и 5 г/л глюкозы. Через 16 часов инкубации (при 32°С, качалка 180 об/мин) отсутствие посторонней микрофлоры в инокуляте подтверждают микроскопией. Выращивание клеток-продуцентов проводят в 30 литровом ферментере в 20 литрах среды LB при 37°С. Каждый час контролируют культуральную жидкость на значение pH, количество кислорода, оптическую плотность при 600 нм, и концентрацию глюкозы. По достижению OD₆₀₀ равного 12 понижают расход воздуха c 25 до 15%, вводят в ферментер 0,3 г лактозы и продолжают ферментацию 60 минут при 37°С. Далее собирают влажную биомассу (1 кг) после центрифугирования культуральной среды при 10000 g в течение 20 минут при 10°С.

Полученную биомассу ресуспендируют в 50 мМ Трис-HCl, 20 мМ ЭДТА, pH 8,0 буфере из расчета 10 мл буфера на 1 г биомассы, после чего разрушают на гомогенизаторе. Полученный клеточный лизат центрифугируют при 10000 g в течение 20 минут при 10°С. Полученный клеточный осадок (70 г) повторно ресуспендируют в буфере 50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, перемешивают в течение 20 минут и переосаждают при 10000 g в течение 20 минут при 10°С.

Из полученной биомассы, нерастворимого клеточного осадка и осветленного клеточного лизата отбирают пробу в количестве 30 мкл и с красителем бромфеноловым синим нагревают 3 мин при 100°С. Пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% ДСН-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930 (фиг. 2).

Нерастворимый клеточный осадок промывают 10-20 объемами буфера (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0) и растворяют в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0 с 8 М мочевиной из расчета 10 мл буфера на 1 г осадка. Экстракцию проводят в течение 30 минут при перемешивании на магнитной мешалке, далее собирают супернатант после центрифугирования при 10000 g в течение 20 минут при 10°С.

Для проведения металл-хелатной хроматографии используют сорбент Ni IMAC SepFast (BioToolomics, England), который предварительно активируют двумя колоночными объемами 0,15 М раствора NiSO₄. Рабочую скорость процесса задают 17 мл/мин. После нанесения супернатанта колонку промывают буферным раствором, содержащим 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0 и 8 М мочевину, до выхода на плато показателей УФ-поглощения при длине волны 280 нм и проводимости. Элюцию гибридного белка осуществляют линейным градиентом 0-100% буферного раствора, содержащего 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 8 М мочевину и 500 мМ имидазол, за 120 минут.

Далее проводят очистку SMT3-HCRG21 при помощи анионообменной хроматографии на колонке XK 50 с 200 мл сорбента DEAE Sepharose (GE Healthcare), используя хроматографическую систему Akta Pure. Рабочую скорость процесса задают 17 мл/мин. После нанесения разделяемой фракции колонку промывают буферным раствором, содержащим 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0 и 2 М мочевину, до выхода на плато показателей УФ-поглощения при длине волны 280 нм и проводимости. Элюцию осуществляют линейным градиентом 0-100% буферного раствора, содержащего 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 2 М мочевину и 1 М NaCl, за 80 минут. Детекцию осуществляют по поглощению при длине волны 280 нм. Сбор фракций начинают при достижении показателя УФ-поглощения уровня выше 50 mAU. Фракции анализируют методом белкового электрофореза в ПААГ и те из них, которые содержат более 90% целевого гибридного белка, объединяют для дальнейшей работы.

Пример 3

Получение пептида HCRG21

Очищенный гибридный белок разводят в два раза добавлением равного объёма буферного раствора (50 мМ Трис-HCl, рН 8,5) и оставляют для ренатурации в течение ночи при 4°C и перемешивании (скорость 100 об/мин). После этого к ренатуранту SMT3-HCRG21 добавляют суспензию лиофилизированной протеазы Ulp-1 (1 мг фермента на 100 мг белка) и 1 М раствор дитиотриетола до конечной концентрации 1 мМ. Гидролиз проводят не менее 3 часов при перемешивании при комнатной температуре, после чего реакционную смесь наносят на колонку для проведения металл-хелатной хроматографии.

Для проведения металл-хелатной хроматографии используют сорбент Ni IMAC SepFast (BioToolomics, England), который предварительно активируют двумя колоночными объемами 0,15 М раствора NiSO₄. Рабочую скорость процесса задают 17 мл/мин. После нанесения гидролизата, колонку промывают буферным раствором, содержащим 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, и 8 М мочевину, и собирают несвязавшуюся с носителем фракцию до выхода на плато показателей УФ-поглощения при длине волны 280 нм. Элюцию остальных продуктов гидролиза осуществляют линейным градиентом 0-100% буферного раствора, содержащего 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 8 М мочевину и 500 мМ имидазол, за 20 минут.

На каждой стадии получения отбирают аликвоты растворов в количестве 30 мкл, которые в конце процесса выделения нагревают 3 мин при 100°С с красителем бромфеноловым синим. Пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 12,5% ДНС-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930 (фиг. 3).

Для окончательной очистки используют носитель с обращенной фазой ODS-A (YMC, Япония), упакованный в колонку диаметром 1 см, и хроматографическую систему Akta Pure. В качестве мобильной фазы используют раствор А: 0,1% уксусной кислоты, 2% этанола и раствор Б: 0,1% уксусной кислоты, 75% этанола. Колонку уравновешивают раствором А и наносят несвязавшуюся фракцию после второй аффинной хроматографии, после чего колонку промывают раствором А до тех пор, пока УФ-поглощение при длине волны 280 нм и проводимость не достигнут плато. Элюирование проводят в линейном градиенте 0-100% раствора Б в течение 50 минут при скорости потока 2 мл/мин. Собранные фракции анализируют с помощью аналитической ВЭЖХ для определения количественного состава примесей относительно целевого продукта (фиг. 4). Выход целевого продукта составляет 10,2 мг/л клеточной культуры. Фракции с чистотой не менее 97% объединяют и лиофилизируют. Молекулярную массу чистого пептида определяют методом МАЛДИ масс-спектрометрии (фиг. 5).

Пример 4

Тестирование активности HCRG21

Клетки CHO (яичник китайского хомячка), стабильно экспрессирующие ионный канал TRPV1 крысы, высевают в 96-луночный планшет с черными стенками и прозрачным дном и растят при 37°C и 5% CO₂ до плотности 40000 клеток на лунку, используя полную среду без антибиотиков. Для индукции экспрессии каналов TRPV1 в лунки вносят тетрациклин до конечной концентрации 1 мкг/мл за 14 часов до начала измерения. Затем клетки загружают флуоресцентным красителем, добавляя по 20 мкл Voltage Sensitive Dye (Molecular Devices, San Jose, USA) (Cat # R8126) на лунку в соответствии с протоколом, разработанным производителем. Через 30 минут инкубации (темнота, 37°C и 5% CO₂) в лунки добавляют по 20 мкл испытуемого раствора, для контрольных клеток добавляют 20 мкл воды. Через 5 минут инкубации проводят измерение флуоресценции в видимом поле инвертированного микроскопа Leica DM IL, оснащенного G/R фильтром cube: EX: 225/-450 | DC: 495 595 | EM: 250/-500, производя запись изображения видеокамерой в течение 60 секунд через 40-кратный объектив. Через 5 секунд после начала записи в лунку вносят раствор капсаицина до конечной концентрации 1 мкМ. Относительную флуоресценцию рассчитывают для всего изображения после вычитания фрагмента фона, сравнивая интенсивность сигнала на изображении через 20 секунд после добавления капсаицина (F) с интенсивностью сигнала на изображении до добавления капсаицина (F0) по формуле F/F0-1. Используют три повтора для пептида и три повтора для воды, после чего рассчитывают среднее значение и стандартное отклонение. Определяют, что HCRG21 в концентрации 5 мкМ ингибирует относительную флуоресценцию клеток на 50%, что аналогично ранее опубликованной активности для этого пептида, измеренной для капсаицин активированных токов на ооцитах лягушки.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению анальгетических пептидов в прокариотах, и может быть использовано в медицине. Пептид HCRG21 получают путем трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pSMT3_HCRG21, обеспечивающей синтез гибридного белка SMT3_HCRG21, содержащего целевой пептид, в клетках Escherichia coli. Настоящее изобретение раскрывает штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21, продуцирующий указанный гибридный белок, а также способ получения указанного рекомбинантного пептида HCRG21, предусматривающий культивирование указанного штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21. Технический результат - образование HCRG21, который имеет замкнутые дисульфидные связи по данным масс-спектрометрии и способен ингибировать капсаицин-вызванные токи через ионный канал TRPV1 на модельных клетках. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSMT3_HCRG21, 4355 п. о., для экспрессии гибридного белка SMT3-HCRG21 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, содержащего пептид HCRG21, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, состоящая из фрагментов ДНК плазмид рЕТ 23а(+) и рЕТ 28а(+), содержащих промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, кодирующую гибридный белок SMT3-HCRG21, ген устойчивости к антибиотику канамицину для проведения отбора рекомбинантных клеток и участок инициации репликации бактериофага f1.

2. Штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21 - продуцент анальгетического пептида HCRG21, полученный путем трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pSMT3_HCRG21 по п. 1.

3. Способ получения рекомбинантного пептида HCRG21, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, включающий трансформацию штамма Escherichia coli BL21(DE3) полученной плазмидной ДHK pSMT3_HCRG21 по п. 1, культивирование полученного штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21 по п. 2, выделение гибридного белка из нерастворимого клеточного осадка после разрушения клеток на гомогенизаторе путем экстракции гибридного белка в буферном растворе, содержащем 8 М мочевину, с последующей металл-хелатной и анионообменной хроматографией, дальнейший гидролиз ренатурированного гибридного белка протеазой Ulp-1 и выделение целевого пептида HCRG21 с помощью металл-хелатной и обращеннофазной хроматографии.