СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ CLOSTRIDIUM DIFFICILE Российский патент 2022 года по МПК C07K14/33 A61K39/08 A61K39/116 A61P31/04 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительных заявок США №№ 62/471636, поданной 15 марта 2017 г., и 62/474434, поданной 21 марта 2017 г., содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылок.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[0002] Содержание текстового файла, поданного в электронном виде с настоящим документом, полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Копия перечня последовательностей в машиночитаемом формате (имя файла: NOVV_058_02WO_SeqList_ST25, дата записи: 13 марта 2018 г., размер файла 187 килобайт).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Вакцинация против заболеваний с использованием субъединичной вакцины зависит от получения достаточного количества белка-антигена и поддержания стабильности антигена для сохранения активности указанного белка при применении у целевой популяции.

[0004] Осложнения при получении субъединичных вакцин возникают на различных этапах производства. Целевой белок может продуцироваться в малых количествах или может быть нерастворимым, что делает производство экономически невыгодным даже при особенно благоприятном профиле иммуногенности указанного белка.

[0005] Бактериальные инфекции остаются проблемой, угрожающей здоровью. Бактериальные вакцины становятся все более востребованными, поскольку у бактерий развивается устойчивость к часто используемым антибиотикам. Бактериальные субъединичные вакцины основаны на рекомбинантной продукции белка. В то же время бактериальные белки часто сложно продуцировать в больших количествах из-за низкого уровня экспрессии и нерастворимости; кроме того, они могут характеризоваться пониженной стабильностью. Таким образом, улучшенные подходы к производству вакцин, особенно сложных антигенов-мишеней, могут быть полезны с точки зрения здравоохранения во всем мире. В частности, инфекция с участием бактерий-клостридий, в особенности C. Difficile, остается важной проблемой. Инфекция Clostridium difficile (CDI) является основной причиной внутрибольничной диареи, ассоциированной с антибиотиками в развитых странах. Сформировались гипервирулентные штаммы, вызывающие тяжелое заболевание, характеризующиеся повышенной смертностью. Гомологичные гликозилирующие токсины TcdA и TcdB, а также бинарный АДФ-рибозилирующий токсин (CDT) являются основными факторами вирулентности, обуславливающими патогенез. Существует неудовлетворенная потребность в вакцинах, мишенью которых являются эти токсины.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В настоящем документе описаны способы и композиции для индукции иммунного ответа против C. difficile. Композиция содержит полипептиды, содержащие множественные токсины C. difficile, которые при введении субъекту индуцируют желательные иммунные реакции. Кроме того, описаны способы получения полипептидов, содержащих множество токсинов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0007] Фигура 1. Вакцинные конструкции, содержащие три токсина C. difficile. На фигуре показана иллюстрация вакцины на основе трех токсинов C.diff, содержащей связывающие домены CDTb, Tcd B и Tcd A с сайтом расщепления фурином после домена активации CDTb (конструкция 1420) и без него (конструкция 1470).

[0008] Фигура 2. Экспрессия и растворимость трехтоксинных вакцин BV1470 и BV1420. Клетки насекомого Spodoptera frugiperda Sf9 инфицировали при MOI, равной 0,1, рекомбинантными бакуловирусами BV1420 и BV1470, собирали через 48 и 72 часа после инфицирования и анализировали на предмет экспрессии белка посредством электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивания кумасси. Равные объемы общего белка (Т, клетки и среда) и осветленной среды (М) смешивали с 2X буфером для образца для электрофореза в ДСН-ПААГ и анализировали в 4-12% полиакриламидном геле NuPage. Осажденные инфицированные клетки солюбилизировали в буфере, содержащем 1% NP9, 25 мМ трис, 50 мМ NaCl, pH 8,0. Лизированные клетки центрифугировали при 9000 x g в течение 40 мин. Надосадочную жидкость (S, растворимый белок) удаляли, осадок (I, нерастворимый белок) суспендировали в буфере до исходного объема и анализировали посредством электрофореза в ДСН-ПААГ, как описано выше. Местоположение трехтоксинного белка указано стрелкой.

[0009] Фигура 3. Динамика экспрессии трехтоксинных вакцин BV1470 и BV1420. Клетки насекомого Spodoptera frugiperda Sf9 инфицировали рекомбинантными бакуловирусами BV1420 и BV1470, как описано на фигуре 6. Общий белок, среду, растворимый и нерастворимый белок анализировали посредством электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивания кумасси в различные моменты времени после инфицирования. Местоположение трехтоксинного белка указано стрелкой.

[0010] Фигура 4. Очистка трехтоксинной вакцины. Трехтоксинную вакцину очищали от общей клеточной культуры инфицированных клеток Sf9 после добавления NP9 до конечной концентрации 0,2%. Экстракт NP9 дважды осветляли и очищали на последовательных колонках Fractogel EMD TMAE, Phenyl HP и Source 30Q. Тройной токсин элюировали с каждой колонки и загружали на следующую колонку, как показано. Элюируемые фракции с колонки Source 30Q, положительные по трем токсинам, объединяли и стерилизовали фильтрацией через 0,2 мкM фильтр.

[0011] Фигура 5. Очистка трехтоксинной вакцины BV1470 от клеток Sf9. Трехтоксинную вакцину BV1470 очищали от инфицированных клеток, как описано на фигуре 8. Чистоту конечного продукта фильтрации с колонки Source 30Q анализировали посредством электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивания кумасси. Трехтоксинный белок выявляли вестерн-блоттингом с использованием антител против CDTb, TcdB и TcdA.

[0012] Фигура 6. Очистка трехтоксинной вакцины BV1420 от клеток Sf9. Трехтоксинную вакцину BV1420 очищали от инфицированных клеток, как описано на фигуре 8. Чистоту конечного продукта фильтрации с колонки Source 30Q анализировали посредством электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивания кумасси. Трехтоксинный белок выявляли вестерн-блоттингом с использованием антител против TcdB.

[0013] Фигура 7. График гранулометрического состава тройного токсина BV1420 по объему. Размер частиц тройного токсина BV1420 определяли с помощью динамического светорассеяния с использованием Zeta Sizer Nano. Показан график распределения размеров по объему.

[0014] Фигура 8. График гранулометрического состава тройного токсина BV1470 по интенсивности. Размер частиц тройного токсина BV1420 определяли с помощью динамического светорассеяния с использованием Zeta Sizer Nano. Показан график распределения размеров по интенсивности.

[0015] Фигуры 9A-9D Электронные микрофотографии отрицательно окрашенного тройного токсина BV1420. Электронная микрофотография очищенного тройного токсина BV1420, разбавленного до концентрации приблизительно 10 мкг/мл и отрицательно окрашенного уранилацетатом.

[0016] Фигура 10. Исследование 1 по контрольной стимуляции летальной дозой токсина мышей, вакцинированных трехтоксинной вакциной BV1420. Мышей иммунизировали в нулевой день и в 14 день трехтоксинной вакциной BV1420, выполняли контрольную стимуляцию на 35 день летальной дозой Tcd A или CDT и мониторировали в течение 10 дней после контрольной стимуляции. У мышей брали кровь, как показано, и выполняли анализ IgG против токсина и антител, нейтрализующих токсин, в сыворотке. Животных мониторировали на предмет смертности и заболеваемости в течение 10 дней после контрольной стимуляции токсином.

[0017] Фигура 11. Исследование 1 по контрольной стимуляции летальной дозой токсина мышей, вакцинированных трехтоксинной вакциной BV1420 - ответ за счет IgG против токсина в сыворотке. На 42 день выполняли анализ титров IgG против Tcd A, Tcd B и CDT в образцах сыворотки посредством твердофазного ИФА с использованием нативных токсинов, иммобилизованных на планшетах.

[0018] Фигура 12. Исследование 1 по контрольной стимуляции летальной дозой токсина мышей, вакцинированных трехтоксинной вакциной BV1420 - титры антител, нейтрализующих токсин (TNA). Титры антител, нейтрализующих токсин, определяли с использованием колориметрического анализа на основе клеток Vero. Указанный титр представляет собой величину, обратную максимальному разбавлению сыворотки, при котором клетки не погибали.

[0019] Фигура 13. Исследование 1 по контрольной стимуляции летальной дозой токсина мышей, вакцинированных трехтоксинной вакциной BV1420- выживаемость животных. Выживаемость животных определяли через 10 дней после контрольной стимуляции. Животных, демонстрировавших более чем 20% потерю веса, умерщвляли и регистрировали как мертвых.

[0020] Фигура 14. Исследование 2 по контрольной стимуляции летальной дозой токсина мышей, вакцинированных трехтоксинной вакциной BV1420- выживаемость после введения токсина В. Мышей иммунизировали в нулевой день и в 14 день трехтоксинной вакциной BV1420, выполняли контрольную стимуляцию на 35 день летальной дозой Tcd B и мониторировали в течение 10 дней после контрольной стимуляции. У мышей брали кровь, как показано, и выполняли анализ IgG против токсина и антител, нейтрализующих токсин (TNA), в сыворотке. Животных мониторировали на предмет смертности и заболеваемости в течение 10 дней после контрольной стимуляции токсином.

[0021] Фигура 15. Исследование 2 по контрольной стимуляции летальной дозой токсина мышей, вакцинированных трехтоксинной вакциной BV1420 - уровни IgG против токсина. На 42 день выполняли анализ титров IgG против Tcd A, Tcd B и CDT в образцах сыворотки посредством твердофазного ИФА с использованием нативных токсинов, иммобилизованных на планшетах.

[0022] Фигура 16. Исследование 2 по контрольной стимуляции летальной дозой токсина мышей, вакцинированных трехтоксинной вакциной BV1420- титры TNA против токсина В. Титры антител, нейтрализующих токсин, определяли с использованием колориметрического анализа на основе клеток Vero. Указанный титр представляет собой величину, обратную максимальному разбавлению сыворотки, при котором клетки не погибали.

[0023] Фигура 17. Исследование 2 по контрольной стимуляции летальной дозой токсина мышей, вакцинированных трехтоксинной вакциной BV1420- выживаемость после введения токсина В. Выживаемость животных определяли через 10 дней после контрольной стимуляции. Животных, демонстрировавших более чем 20% потерю веса, умерщвляли и регистрировали как мертвых.

[0024] Фигура 18. Показаны дополнительные вакцинные белки с доменом транслокации гена TcdB. BV1512 показан на нижней диаграмме.

[0025] Фигура 19. Экспрессия мультимерного белка: Анализ экспрессии и верстерн-блоттинг мультимерного белка BV1512.

[0026] Фигура 20. Экспрессия четырехвалентного мультимерного белка: На фигуре 25 приведены два четырехвалентных мультимерных белка. В обоих случаях внедрен пептид из второго штамма TcdB для расширения иммунитета против нескольких штаммов. На верхней диаграмме пептид TcdB штамма 027 добавлен к С-концу. На нижней диаграмме пептид внедрен между белком TcdB и белком TcdA(R19) первого штамма (штамма 630).

[0027] Фигура 21. Экспрессия четырехвалентного мультимерного белка: Анализ экспрессии и вестерн-блоттинг четырехвалентного белка показаны на верхней диаграмме фигуры 20.

[0028] Фигура 22. Экспрессия четырехвалентного мультимерного белка: Анализ экспрессии и вестерн-блоттинг четырехвалентного белка показаны на нижней диаграмме фигуры 20.

[0029] Фигура 23. Токсины C. difficile и конструкция химерного трехвалентного (T) и четырехвалентного (Q) гибридных белков токсинов. На фигуре 23A показано изображение функциональных доменов токсина A (TcdA), токсина B (TcdB) и бинарного токсина (CDT) C. difficile, использованных для конструирования химерных трехвалентного и четырехвалентного гибридных белков токсинов. TcdA и TcdB используют общие функциональные домены, включая ферментативный гликозилтрансферазный (GT) домен, автокаталитический домен цистеиновой протеазы (CP), порообразующий транслоцирующий домен (PT) (оранжевый) и рецептор-связывающий домен (RBD). Бинарный токсин (CDT) состоит из ферментативного АДФ-рибозилтрансферазного компонента (CDTa) и рецептор-связывающего компонента (CDTb). CDTb содержит сигнальную последовательность длиной 42 аминокислоты (АК) с двумя сайтами протеолитического расщепления серинового типа (стрелка), которые при расщеплении дают 20-кДа и 75-кДа фрагменты. На фигуре 24B показана иллюстрация химерного трехвалентного гибридного белка токсина (T-токсин) и химерного четырехвалентного гибридного белка токсина (Q-токсин). Гибридный белок T-токсина состоит из полноразмерной кодирующей последовательности CDTb, RBD TcdB₍₀₀₃₎, содержащий 24 повтора, и укороченный RBD TcdA, содержащий 19 повторов. Экспрессированный гибридный белок T-токсина состоит из 1813 АК, его молекулярная масса (MW) составляет 205 кДа. Гибридный белок Q токсина состоит из полноразмерной кодирующей последовательности CDTb, RBD TcdB₍₀₀₃₎, содержащий 24 повтора, RBD TcdA, укороченный до 19 повторов, и RBD TcdB₍₀₂₇₎, содержащий 24 повтора. Экспрессируемый гибридный белок Q-токсина состоит из 2359 АК, его молекулярная масса составляет 268 кДа.

[0030] Фигуры 24A-24C. Экспрессия и очистка гибридных белков Т-токсина и Q-токсина. При электрофорезе в ДСН-ПААГ очищенный T-токсин (дорожки 2 и 3) мигрирует как белок с молекулярной массой 205 кДа, а Q-токсин (дорожки 4 и 5) мигрирует как белок с молекулярной массой 268 кДа. Маркер молекулярной массы (дорожка 1). На фигуре 24A показано, что чистота T-токсина и Q-токсина составляла >90% согласно сканирующей денситометрии при электрофорезе в ДСН-ПААГ. На фигуре 24B показан вестерн-блоттинг с использованием специфических антител кролика против CDTb в качестве зондов. На фигуре 24C показан вестерн-блоттинг с использованием специфических антител курицы против TcdB в качестве зондов. На фигуре 24D показан вестерн-блоттинг с использованием специфических антител курицы против TcdA в качестве зондов.

[0031] Фигуры 25A-25C. Иммуногенность гибридных белков Т-токсина и Q-токсина у мышей. Группы самок мышей C57BL/6 (N = 10/группу) в/м иммунизировали в 0 и 14 дни T-токсином (100 мкг) или Q-токсином (100 мкг) с использованием квасцов в качестве адъюванта (50 мкг) или фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (контрольная группа). Сыворотку собирали через 18 дней после второй вакцинации. На фигуре 25А показаны титры IgG против TcdA, TcdB₍₀₀₃₎ и CDTb в сыворотке при определении посредством твердофазного ИФА. На фигуре 25B показаны титры антител, нейтрализующих токсин, для каждого токсина, при определении посредством анализа на основе клеток Vero. На фигуре 25C мыши получали летальную дозу (MLD_100% = 2,0 мкг) TcdB₍₀₀₃₎, вводимую в/б через 21 день после второй иммунизации. *Значимость определяли с использованием лог-рангового критерия Мантеля-Кокса при сравнении групп T-токсина или Q-токсина с контрольной группой ФСБ.

[0032] Фигуры 26A-26D. Иммуногенность гибридных белков Т-токсина и Q-токсина у хомяков. Самцов хомяков (N = 8/группу) в/м иммунизировали 3 раза с 21-дневным интервалом 30 мкг Q-токсина с использованием 120 мкг квасцов в качестве адъюванта или ФСБ (контрольная группа). Через две недели после третьей дозы собирали и анализировали образцы. На фигуре 26А показаны титры IgG против TcdA, TcdB₍₀₀₃₎ и CDTb в сыворотке при определении посредством твердофазного ИФА. На фигуре 26B показаны титры антител, нейтрализующих токсин, для каждого токсина, при определении в анализе на основе клеток Vero. На фигурах 26C и 26D через две недели после третьей иммунизации всех животных в/б обрабатывали клиндамицином (10 мг/кг) за один день после контрольного заражения спорами и выполняли контрольное заражение через желудочный зонд 200 КОЕ штамма 630 C. difficile (C) или 500 КОЕ штамма B1/NAP1/027 C. difficile (D). За животными наблюдали в течение 8 дней после контрольного заражения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[0033] В настоящем документе термин «адъювант» относится к соединению, которое при использовании в комбинации с иммуногеном усиливает или иным образом изменяет или модифицирует иммунный ответ, индуцированный против иммуногена. Модификация иммунного ответа может включать интенсификацию или расширение специфичности гуморального или клеточного иммунного ответа.

[0034] В настоящем документе термины «иммуноген», «антиген» и «эпитоп» используются взаимозаменяемо и относятся к таким веществам, как белки и пептиды, способным вызывать иммунный ответ.

[0035] В настоящем документе термин «гибридный белок» означает белок, состоящий из двух или более белков или фрагментов белка, непосредственно или опосредованно (посредством связывающего пептида) соединенных или объединенных по N-концу одного белка и С-концу другого белка с образованием единого непрерывного полипептида. В некоторых аспектах гибридный белок может называться «мультивалентным белком». Мультивалентный белок содержит белки или фрагменты двух или более трех отдельных белковых антигенов, объединенные друг с другом.

[0036] В настоящем документе термины «лечить» и «лечение» относятся к подходу для получения благоприятных или желательных результатов, например, клинических результатов. Для целей настоящего изобретения благоприятные или желательные результаты могут включать ингибирование или подавление инициации или прогрессирования инфекции или заболевания; ослабление или уменьшение развития симптомов инфекции или заболевания; или их комбинацию.

[0037] Термин «предотвращение» в настоящем документе используется взаимозаменяемо с термином «профилактика» и может означать полную профилактику инфекции или заболевания или предотвращение развития симптомов этой инфекции или заболевания; задержку начала инфекции или заболевания или его симптомов; или снижение тяжести впоследствии развившейся инфекции или заболевания или его симптомов.

[0038] В настоящем документе термин «эффективная доза» или «эффективное количество» относится к количеству иммуногена, достаточному для индукции иммунного ответа, который ослабляет по меньшей мере один симптом малярии. Эффективную дозу или эффективное количество можно определить, например, путем измерения количества нейтрализующих секреторных и/или сывороточных антител, например, путем нейтрализации бляшек, фиксации комплемента, твердофазного иммуноферментного анализа (твердофазного ИФА) или анализа микронейтрализации.

[0039] В настоящем документе термин «вакцина» относится к препарату, содержащему иммуноген (например, гибридный белок, описанный в настоящем документе), полученный из патогена, который используется для индукции иммунного ответа против этого патогена, что обеспечивает защитный иммунитет (например, иммунитет, защищающий субъекта против инфицирования патогенным организмом и/или снижающий тяжесть заболевания или состояния, вызванного инфицированием патогенным организмом). Защитный иммунный ответ может включать образование антител и/или клеточный ответ. В зависимости от контекста термин «вакцина» может также относиться к суспензии или раствору иммуногена, который вводят позвоночному для получения защитного иммунитета.

[0040] В настоящем документе термин «субъект» включает людей и других животных. В одном варианте реализации субъект является человеком.

[0041] В настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый» означает, что он одобрен регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или включен в фармакопею США, Европейскую фармакопею или другую общепризнанную фармакопею для применения у млекопитающих и, в частности, у людей. Эти композиции можно применять в качестве вакцинных и/или антигенных композиций для индукции защитного иммунного ответа у позвоночных.

[0042] В настоящем документе термин «приблизительно» означает плюс-минус 10% от указанного численного значения.

Краткий обзор

В настоящем изобретении предложены способы и композиции для достижения высокого уровня экспрессии крупных белков, в частности, мультивалентных белков, содержащих множественные антигены, в клетках насекомых. Продукция большого количества белков, описанная в настоящем документе, особенно неожиданна с учетом предшествующего опыта в данной области техники.

Мультивалентные белки

[0043] Мультивалентные (мультивалентный белок в настоящем документе также может называться мультимером) белки, описанные в настоящем документе, могут защищать от множества патогенных микроорганизмов и/или эффектов, вызванных множеством патогенных белков, полученных из одного и того же организма. Например, некоторые патогены могут продуцировать множество молекул, каждая из которых негативно влияет на субъекта. Более эффективный ответ получают путем индукции реакций против множества отдельных антигенов.

[0044] Мультивалентный белок содержит белковые фрагменты (части) множества бактериальных токсинов. В некоторых аспектах мультивалентный белок содержит или состоит из фрагментов белка из одного и того же организма, например, токсинов. В других аспектах мультивалентный белок содержит или состоит из белков более чем одного организма. В конкретных аспектах любые два белка мультивалентного белка получены не из одного и того же организма. В некоторых аспектах для получения фрагментов можно применять одни и те же белки из разных штаммов (т.е. изологи). Использование одного и того же белка из разных штаммов обеспечивает защиту от нескольких штаммов и особенно полезно в ситуациях, когда возникают новые вирулентные штаммы. Другие примеры включают C. botulinum у которой есть 8 серологических типов A-H. Способы и композиции, описанные в настоящем документе, можно применять для создания единой вакцины против всех 8 серотипов. Другие конкретные примеры включают комбинированные токсинные вакцины для защиты от холеры, дифтерии и шигелл или столбняка, коклюша и дифтерии. Таким образом, в некоторых аспектах мультимерный белок может содержать фрагменты 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных белков. Эти фрагменты можно применять в качестве компонентов для получения мультимерных иммуногенных полипептидов.

[0045] Типичные мультимеры и компоненты, используемые для получения вакцин, описаны ниже в таблице. Нуклеотидные последовательности, кодирующие Q-токсин и BV1512, а также альтернативные нуклеотидные последовательности BV1420 и BV1470, представляют собой последовательности, использующие стандартное преобразование кодонов в соответствующие вырожденные кодоны, кодирующие указанную аминокислоту.

[0046] Дополнительные вакцинные конструкции могут использовать различные вышеприведенные компоненты в различных ориентациях. Кроме того, в качестве компонентов для получения мультимерного белка можно применять белки, характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичностью по отношению к каждой из этих описанных последовательностей.

Линкеры

[0047] В некоторых аспектах между одним или более белками в мультивалентных белках можно использовать линкеры. В некоторых аспектах линкер представляет собой поли-(Gly)n линкер, где n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. В других аспектах линкер представляет собой GG, GGG или GGGG (SEQ ID NO: 26). В других аспектах линкер выбран из группы, состоящей из дипептидов, трипептидов и тетрапептидов. Предпочтительными дипептидами являются аланин-серин (AS), лейцин-глутаминовая кислота (LE), серин-аргинин (SR).

[0048] Мультивалентные антигены особенно подходят для защиты от организмов, которые выделяют множество токсинов в организм субъекта. Например, известно, что бактерии продуцируют токсины, которые вызывают заболевания у людей. Таким образом, хотя основной целью настоящего изобретения является C. difficile; можно получить мультимерные полипептиды согласно настоящему изобретению с использованием фрагментов белковых токсинов других видов.

[0049] Токсин-продуцирующие виды включают C. perfringes, C. botulinum, C. difficile и C. tetani), Bacillus (например, B. anthracis), Vibrio (например, Vibrio cholerae), Shigella и Corynebacterium. C. difficile выделяет два кишечных токсина, A и B, которые продуцируют токсигенные штаммы. Токсин A представляет собой энтеротоксин с минимальной цитотоксической активностью, в то время как токсин B представляет собой мощный цитотоксин, но обладает ограниченной энтеротоксической активностью. Третий токсин, бинарный токсин, также известный как CDT, также продуцируют бактерии. Известны последовательности, кодирующие токсин A и B (Moncrief et al., Infect. Immun. 65:1105-1108 (1997); Barroso et al., Nucl. Acids Res. 18:4004 (1990); Dove et al. Infect. Immun. 58:480-488 (1990)). Кроме того, известны последовательности, кодирующие бинарный токсин (учетные номера ABS57477, AAB67305, AAF81761).

[0050] Возможность применения настоящего изобретения для защиты от патогенной инфекции показана на примере трехвалентной белковой вакцины против C. difficile. На фигуре 1 показана структура двух типичных мультимерных белков (BV1420 и BV1470). Каждый мультимер содержит фрагменты трех белков-токсинов - токсина A (TcdA), токсина B (TcdB) и бинарного токсина (CDTb) C. difficile. Тройной токсин 1420 также содержит сайт расщепления фурином. Эти белки являются крупными (содержат более 1800 аминокислот), и ранее не ожидалось, что их можно получать в больших количествах при экспрессии в клетках насекомых. Однако, неожиданно, оба белка экспрессируются в больших количествах. См. фигуру 3. Фактически, как продемонстрировано на фигуре 5, выход BV1470 составлял 269 мг/л. Аналогичным образом, выход BV1420 составлял 166 мг/л.

[0051] Анализ очищенных мультимерных белков подтвердил, что они находились в составе структур-наночастиц с максимальным диаметром приблизительно 16 нм для BV1420 и приблизительно 18 нм для BV1470. Примечательно, что распределение диаметров, показанное на фигурах 7 и 8, демонстрирует, что высокий процент мультимерных белков сохранял структуру наночастиц после очистки.

[0052] Введение трехвалентных наночастиц BV1420 мышам демонстрирует получение иммунных реакций на все три белка. Кроме того, как показано на фигуре 3, полученный иммунный ответ защищал 100% мышей от летальной контрольной стимуляции токсином А и бинарным токсином, а также от 67% до 83% мышей от летальной контрольной стимуляции токсином B. В противоположность этому, все мыши в контрольной группе ФСБ погибли, за исключением двух мышей в контрольной группе бинарного токсина.

[0053] Четырехвалентные токсины также являются предпочтительным видом мультимерного иммуногенного пептида. На фигуре 20 показаны два типичных примера с четырьмя последовательно расположенными фрагментами или компонентами. Несмотря на значительную длину мультимера, данный белок продуцировался в больших количествах. Фиг. 22.

[0054] На фигуре 23 показано преобразование трехтоксинного гибридного белка в четырехвалентный токсин путем добавления фрагмента токсина TcdB второго типа. Сравнение этих двух белков показывает, что экспрессия в клетках насекомых способна обеспечить высокий уровень продукции. См. фиг. 24A-D.

[0055] Таким образом, типичные мультимеры включают фрагменты, упорядоченные в различной ориентации. Например, начиная с N-конца, первый фрагмент может представлять собой фрагмент TcdA, фрагмент TcdB или фрагмент CDTb. Второй фрагмент может представлять собой фрагмент TcdA, фрагмент TcdB или фрагмент CDTb. Третий фрагмент может представлять собой фрагмент TcdA, фрагмент TcdB или фрагмент CDTb. Четвертый фрагмент (при его наличии) может представлять собой фрагмент TcdA, фрагмент TcdB или фрагмент CDTb. Таким образом, каждый фрагмент может находиться в каждом положении. Обычно, хотя и не всегда, два соседних фрагмента не являются фрагментами токсина одного и того же типа. В предпочтительных вариантах реализации N-концевой фрагмент является фрагментом CDTb.

Молекулярно-биологические методики

[0056] Мультивалентные белки, описанные в настоящем документе, получают с помощью молекулярно-биологических подходов. Основные тексты, в которых описаны молекулярно-биологические методики, которые можно применять в настоящем изобретении, например, клонирование, мутирование, культивирование клеток и т.п., включают Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 («Sambrook») и Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., («Ausubel»). В этих текстах описан мутагенез, использование векторов, промоторов и многие другие соответствующие темы, связанные, например, с клонированием и мутированием PfCSP и т.д. Таким образом, настоящее изобретение также охватывает применение известных методик белковой инженерии и технологии рекомбинантных ДНК для улучшения или изменения характеристик белков, экспрессируемых на или в составе гибридных белков согласно настоящему изобретению. Для получения и/или выделения вариантных нуклеиновых кислот, кодирующих молекулы белка, и/или для дополнительной модификации/мутации белков на или в составе гибридных белков согласно настоящему изобретению можно использовать различные типы мутагенеза. Они включают сайт-специфический, случайный точечный мутагенез, гомологичную рекомбинацию (перетасовку ДНК), мутагенез с использованием урацилсодержащих матриц, олигонуклеотид-специфический мутагенез, мутагенез ДНК, модифицированной тиофосфатами, мутагенез с использованием двуцепочечной ДНК с разрывом и т.п., но не ограничиваются ими Дополнительные подходящие способы включают репарацию точечных несоответствий, мутагенез с использованием штаммов-хозяев, дефектных по репарации, рестрикционный отбор и рестрикционную очистку, делеционный мутагенез, мутагенез посредством синтеза всего гена, репарацию двуцепочечных разрывов и т.п. Мутагенез, например, включающий химерные конструкции, также включен в настоящее изобретение. В одном варианте реализации при мутагенезе можно использовать известную информацию о природной молекуле или модифицированной или мутированной природной молекуле, например, о последовательности, сравнении последовательностей, физических свойствах, кристаллической структуре и т.п.

[0057] Способы клонирования белков известны в данной области техники. Ген можно клонировать в виде ДНК, вставленной в вектор. Термин «вектор» относится к средствам, с помощью которых можно размножать и/или переносить нуклеиновую кислоту между организмами, клетками или клеточными компонентами. Векторы включают плазмиды, вирусы, бактериофаги, провирусы, фагмиды, транспозоны, искусственные хромосомы и т.п., которые реплицируются автономно или могут встраиваться в хромосому клетки-хозяина. Вектор также может представлять собой депротеинизированный РНК-полинуклеотид, депротеинизированный ДНК-полинуклеотид, полинуклеотид, содержащий как ДНК, так и РНК в одной и той же цепи, ДНК или РНК, конъюгированную с полилизином, ДНК или РНК, конъюгированную с пептидом, ДНК, конъюгированную с липосомами и т.п., не реплицирующиеся автономно. Во многих, но не во всех распространенных вариантах реализации векторы согласно настоящему изобретению являются плазмидами или бакмидами.

[0058] Таким образом, настоящее изобретение включает нуклеотиды, кодирующие белки, в том числе химерные молекулы, клонированные в экспрессирующий вектор, способный экспрессироваться в клетке, индуцирующий образование гибридных белков согласно настоящему изобретению. «Экспрессирующий вектор» представляет собой вектор, например, плазмиду, способную стимулировать экспрессию, а также репликацию нуклеиновой кислоты, внедренной в нее. Обычно экспрессируемая нуклеиновая кислота «функционально связана» с промотором и/или энхансером и подвергается регуляции транскрипции за счет промотора и/или энхансера. В одном варианте реализации нуклеотиды кодируют белок Plasmodium (как обсуждалось выше). В еще одном варианте реализации экспрессирующий вектор представляет собой бакуловирусный вектор.

[0059] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения белки могут содержать мутации, содержащие модификации, приводящие к молчащим заменам, добавлениям или делециям, например, для оптимизации кодонов под экспрессию в конкретном хозяине (замену кодонов в мРНК человека на кодоны, предпочтительные для клеток насекомого, например, клеток Sf9). См., например, публикацию патента США 2005/0118191, полностью включенную в настоящий документ посредством ссылки для всех целей.

[0060] Кроме того, нуклеотиды можно секвенировать для обеспечения клонирования нужных кодирующих областей, не содержащих каких-либо нежелательных мутаций. Нуклеотиды можно субклонировать в экспрессирующий вектор (например, бакуловирус) для экспрессии в любой клетке. Выше приведен лишь один пример способа клонирования белков. Специалист в данной области техники должен понимать, что можно применять дополнительные способы.

Клетки-хозяева

[0061] В системах экспрессии на основе клеток насекомых получали высокий уровень экспрессии. Неограничивающие примеры клеток насекомых представляют собой клетки Spodoptera frugiperda (Sf), например, Sf9, Sf21, клетки Trichoplusia ni, например, клетки High Five, и клетки Drosophila S2.

[0062] Векторы, например, векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие гибридные белки, можно трансфицировать в клетки-хозяева в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Например, нуклеиновые кислоты можно внедрять в эукариотические клетки путем совместного осаждения с фосфатом кальция, электропорации, микроинъекции, липофекции и трансфекции с использованием реагентов для трансфекции с полиаминами. В одном варианте реализации вектор представляет собой рекомбинантный бакуловирус.

Получение наночастиц

[0063] Наночастицы можно получать путем выращивания клеток-хозяев, трансформированных экспрессирующим вектором, в условиях, в которых экспрессируются рекомбинантные белки. В одном аспекте способ получения мультивалентного белка включает трансфекцию векторов, кодирующих белок, в подходящую клетку-хозяина, и экспрессию белка в условиях, обеспечивающих образование наночастиц. В еще одном варианте реализации эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из клеток дрожжей, насекомого, земноводного, птицы или млекопитающего. Выбор подходящих ростовых условий находится в компетенции специалиста в данной области техники.

[0064] Способы выращивания клеток-хозяев включают способы периодического, полупериодического, непрерывного и перфузионного культивирования клеток, но не ограничиваются ими. Культивирование клеток означает рост и размножение клеток в биореакторе (ферментационной камере), где клетки размножаются и экспрессируют белок (например, рекомбинантные белки) для очистки и выделения. Как правило, культивирование клеток выполняют в стерильных условиях с контролируемой температурой и составом атмосферы в биореакторе. Биореактор представляет собой камеру, используемую для культивирования клеток, в которой можно отслеживать условия среды, например, температуру, состав атмосферы, перемешивание и/или pH. В одном варианте реализации биореактор представляет собой камеру из нержавеющей стали. В еще одном варианте реализации биореактор представляет собой заранее стерилизованный пластмассовый пакет (например, Cellbag®, Wave Biotech, Бриджуотер, штат Нью-Джерси, США). В другом варианте реализации объем заранее стерилизованных пластмассовых пакетов составляет от приблизительно 50 л до 1000 л.

Экстракция (выделение) детергентом и очистка наночастиц

[0065] Наночастицы можно выделить из клеток-хозяев с использованием детергентов. Подходящие детергенты включают неионогенные поверхностно-активные вещества. Например, неионогенное поверхностно-активное вещество может представлять собой бис(полиэтиленгликоль-бис[имидазоилкарбонил]), ноноксинол-9-бис(полиэтиленгликоль-бис[имидазоилкарбонил]), Brij® 35, Brij®56, Brij® 72, Brij® 76 , Brij® 92V, Brij® 97, Brij® 58P, Cremophor® EL, монододециловый эфир декаэтиленгликоля, N-деканоил-N-метилглюкамин, н-децил-альфа-D-глюкопиранозид, децил-бета-D-мальтопиранозид, н-додеканоил-N-метилглюкамид, н-додецил-альфа-D-мальтозид, н-додецил-бета-D-мальтозид, монодециловый эфир гептаэтиленгликоля, монододециловый эфир гептаэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир гептаэтиленгликоля, н-гексадецил-бета-D-мальтозид, монододециловый эфир гексаэтиленгликоля, моногексадециловый эфир гексаэтиленгликоля, монооктадециловый эфир гексаэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир гексаэтиленгликоля, Igepal СА-630, Igepal СА -630, метил-6-О-(N-гептилкарбамоил)-альфа-D-глюкопиранозид, монододециловый эфир нонаэтиленгликоля, N-нонаноил-N-метилглюкамин, монодециловый эфир октаэтиленгликоля, монододециловый эфир октаэтиленгликоля, моногексадециловый эфир октаэтиленгликоля, монооктадециловый эфир октаэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир октаэтиленгликоля, октил-бета-D-гликопиранозид, монодециловый эфир пентаэтиленгликоля, монододециловый эфир пентаэтиленгликоля, моногексадециловый эфир пентаэтиленгликоля, моногексиловый эфир пентэтиленгликоля, монооктадециловый эфир пентаэтиленгликоля, монооктиловый эфир пентаэтиленгликоля, диглицидиловый эфир полиэтиленгликоля, простой эфир полиэтиленгликоля W-1, тридециловый эфир полиоксиэтилена 10, стеарат полиоксиэтилена 100, изогексадециловый эфир полиоксиэтилена 20, олеиловый эфир полиоксиэтилена 20, стеарат полиоксиэтилена 40, стеарат полиоксиэтилена 50 стеарат полиоксиэтилена 8, полиоксиэтилен-бис(имидазолилкарбонил), стеарат полиоксиэтилен-25-пропиленгликоля, сапонин из коры квиллайи, Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 65, Span® 80, Span® 85, Tergitol 15-S-12, Tergitol 15-S-30, тип Tergitol 15-S-5, Tergitol 15-S-7, Tergitol 15-S-9, Tergitol NP-10, Tergitol NP-4, Tergitol NP-40, Tergitol NP-7, Tergitol NP-9, Tergitol TMN- 10, Tergitol TMN-6, тетрадецил-бета-D-мальтозид, монодециловый эфир тетраэтиленгликоля, монододециловый эфир тетраэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир тетраэтиленгликоля, монодециловый эфир триэтиленгликоля, монододециловый эфир триэтиленгликоля, моногексадециловый эфир триэтиленгликоля, монооктиловый эфир триэтиленгликоля, монотетрадециловый эфир триэтиленгликоля, Triton CF-21, Triton CF-32, Triton DF-12, Triton DF-16, Triton GR-5M, Triton QS-15, Triton QS-44, Triton X-100, Triton X-102, Triton Х-15, Triton Х-151, Triton Х-200, Triton Х-207, Triton® Х-100, Triton® Х-114, Triton® Х-165, Triton® Х-305, Triton® Х-405 , Triton® X-45, Triton® X-705-70, TWEEN® 20, TWEEN® 21, TWEEN® 40, TWEEN® 60, TWEEN® 61, TWEEN® 65, TWEEN® 80, TWEEN® 81, TWEEN® 85, тилоксапол, н-ундецил-бета-D-глюкопиранозид, их полусинтетические производные или комбинации. Tergitol NP-9 является предпочтительным детергентом.

[0066] После выращивания клеток-хозяев в течение 48-72 часов клетки выделяют из среды и добавляют раствор, содержащий детергент, для растворения клеточной мембраны и высвобождения наночастиц в экстракт детергента. Детергент можно добавлять до конечной концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 1,0%. Например, концентрация может составлять приблизительно 0,1%, приблизительно 0,2%, приблизительно 0,3%, приблизительно 0,5%, приблизительно 0,7%, приблизительно 0,8% или приблизительно 1,0 %. В некоторых аспектах этот диапазон может составлять от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,3%. Предпочтительная концентрация составляет приблизительно 0,2%.

[0067] Затем можно выделить наночастицы с использованием способов, сохраняющих их целостность, например, центрифугирования. В некоторых аспектах можно применять градиентное центрифугирование, например, с использованием хлорида цезия, сахарозы и йодиксанола. В качестве альтернативы или дополнения можно применять другие методики, например стандартные методики очистки, включая, например, ионообменную и гель-фильтрационную хроматографию.

[0068] В одном аспекте экстракт детергента последовательно добавляют на несколько колонок. Например, первая колонка может представлять собой колонку для ионообменной хроматографии, например, TMAE, вторая колонка может представлять собой колонку для хроматографии гидрофобного взаимодействия, например, Phenyl HP, а третья колонка может представлять собой колонку для сильной анионообменной хроматографии, например, колонку Source 30Q. Повышенной чистоты можно достичь путем повторения этой трехэтапной процедуры.

[0069] Ниже приведена общая процедура получения и очистки белков. Специалист в данной области техники должен понимать, что существуют ее варианты, которые можно использовать

[0070] Продукцию начинают путем посева клеток Sf9 (неинфицированных) в качалочные колбы, обеспечивая размножение клеток и масштабирование процесса по мере роста и размножения клеток (например, из 125-мл колбы в пакет Wave объемом 50 л). Среду, используемую для роста клеток, составляют для соответствующей линии клеток (предпочтительной является бессывороточная среда, например, среда для клеток насекомых ExCell-420, JRH). Затем клетки инфицируют рекомбинантным бакуловирусом при наиболее эффективной множественности заражения (например, от приблизительно 1 до приблизительно 3 бляшкообразующих единиц на клетку). После инфицирования геном вируса экспрессирует гибридные белки (и, необязательно, другие иммуногены). Обычно инфекция максимально эффективна при использовании клеток в середине логарифмической фазы роста (4-8×10⁶ клеток/мл), жизнеспособных по меньшей мере приблизительно на 90%.

[0071] Белки согласно настоящему изобретению можно собирать приблизительно через 48-96 часов после инфицирования. В некоторых аспектах сбор выполняют приблизительно через 48 часов, приблизительно через 72 часа или между приблизительно 48 и приблизительно 72 часами. Как правило, сбор выполняют при уровне вирусоподобных частиц в культуральной среде, близком к максимальному, но до интенсивного лизиса клеток. Плотность и жизнеспособность клеток Sf9 на момент сбора может составлять от приблизительно 0,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 1,5×10⁶ клеток/мл при по меньшей мере 20% жизнеспособности, согласно анализу с исключением красителя.

[0072] Для солюбилизации частиц непосредственно добавляют Tergitol NP9 к культуре клеток до конечной концентрации 0,2% NP9/25 мМ трис/50 мМ NaCl/pH 8,0. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа, затем дважды центрифугируют лизат при 9000 g в течение 30 мин. Собирают надосадочную жидкость, содержащую наночастицы. Затем надосадочную жидкость добавляют в буфер А и элюируют в буфер В (буфер А: 25 мМ трис pH 8,0 /50 мМ NaCl, буфер B: 25 мМ трис pH 8,0/1 M NaCl). Элюат наносят на колонку Phenyl HP (буфер A: 350 мМ цитрата Na/25 мМ трис pH 7,5, буфер B: 5 мМ трис pH 8,0), а затем на колонку Source 30Q (буфер A: 25 мМ трис pH 8,0/250 мМ NaCl, буфер B: 25 мМ трис pH 8,0/1 M NaCl). Объединенные фракции, содержащие продукт, пропускают через 2-микронный фильтр. См. фигуры 8-10.

[0073] Вышеописанные процедуры обеспечивают по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или приблизительно 98% чистоту с выходом от 150 мг/л до приблизительно 300 мг/л. Чистоту можно измерить с помощью подходов с использованием гелей, которые оценивают общий белок.

[0074] При желании интактный бакуловирус можно инактивировать. Инактивацию можно выполнить с помощью химических способов, например, с использованием формалина или β-пропиолактона (BPL). Удаление и/или инактивацию интактного бакуловируса также можно в значительной степени выполнить с использованием способов селективного осаждения и хроматографии, известных в данной области техники, как показано выше. Способы инактивации включают инкубирование образца, содержащего вирусоподобные частицы, в 0,2% BPL в течение 3 часов при температуре от приблизительно 25°C до приблизительно 27°C. Бакуловирус также можно инактивировать инкубированием образца, содержащего вирусоподобные частицы, в 0,05% BPL при 4°C в течение 3 дней, а затем при 37°C в течение часа.

[0075] Вышеприведенные методики можно осуществлять в различном масштабе. Например, от Т-образных колб, качалочных колб, вращающихся колб до биореакторов промышленного размера. Биореакторы могут включать резервуар из нержавеющей стали или заранее стерилизованный пластмассовый пакет (например, система, продаваемая Wave Biotech, Бриджуотер, штат Нью-Джерси, США). Специалист в данной области техники должен знать наиболее предпочтительные варианты для конкретных обстоятельств.

Размер и выход белка

[0076] Выход мультимерных белков с использованием способов, описанных в настоящем документе, является значительным. В некоторых случаях выход составляет от приблизительно 150 мг/л до приблизительно 300 мг/л. В некоторых вариантах реализации выход составляет приблизительно 40 мг/л, приблизительно 60 мг/л, приблизительно 80 мг/л, приблизительно 100 мг/л, приблизительно 150 мг/л, приблизительно 200 мг/л, приблизительно 250 мг/л или приблизительно 300 мг/л. В конкретных аспектах выход составляет от приблизительно 40 мг/л до приблизительно 300 мг/л, от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 250 мг/л или от приблизительно 100 мг/л до приблизительно 300 мг/л.

[0077] Размер крупных мультимерных белков, описанных в настоящем документе, обычно составляет от 1500 до 2500 аминокислот. В некоторых аспектах он составляет от приблизительно 1500 до приблизительно 2000 аминокислот. В других аспектах он составляет от приблизительно 1800 до приблизительно 2000 аминокислот.

[0078] Мультимерные белки образуют наночастицы с типичным диаметром от приблизительно 11 нм до приблизительно 35 нм. Диапазон диаметра может составлять от приблизительно 15 нм до приблизительно 25 нм. Типичные примеры наночастиц мультимерного белка в этих диапазонах показаны на Фигуре 9.

[0079] Важно отметить, что несмотря на большой размер белков, они остаются растворимыми. Например, очищенный мультимерный белок может быть приблизительно на 80% растворимым, приблизительно на 85% растворимым, приблизительно на 90% растворимым, приблизительно на 95% растворимым, приблизительно на 97% растворимым или приблизительно на 99% растворимым. В некоторых аспектах растворимость составляет от приблизительно 90% до приблизительно 99% или от приблизительно 90% до приблизительно 95%.

Модифицированные антигены и полипептиды

[0100] Антигены, описанные в настоящем документе, включают варианты и мутанты этих антигенов. В некоторых аспектах антиген может быть частично идентичен описанному антигену. Как правило, если это специально не задано в контексте конкретных указанных антигенов, процентная идентичность может составлять по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 98%. Процент идентичности можно рассчитать с помощью программы выравнивания Clustal Omega, доступной по адресу www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo, с использованием параметров по умолчанию.

[0101] В определенных аспектах белок, содержащийся в наночастицах, состоит из указанного белка. В других аспектах белок, содержащийся в наночастицах, содержит указанный белок. Увеличение размеров самого белка можно выполнять для различных целей.

[0102] В некоторых аспектах антиген можно увеличить с N-конца и/или С-конца. В некоторых аспектах присоединенный фрагмент представляет собой метку, которую можно применять в определенных целях, например, для очистки или обнаружения. В некоторых аспектах метка содержит эпитоп. Например, метка может представлять собой полиглутаматную метку, метку FLAG, HA-метку, полигистидиновую метку (содержащую приблизительно 5-10 остатков гистидина), Myc-метку, глутатион-S-трансферазную метку, метку зеленого флуоресцентного белка, мальтозосвязывающую белковую метку, тиоредоксиновую метку или Fc-метку. В других аспектах присоединенный фрагмент может представлять собой N-концевой сигнальный пептид, объединенный с белком для усиления экспрессии. Хотя такие сигнальные пептиды часто отщепляются в ходе экспрессии в клетке, некоторые наночастицы могут содержать антиген с интактным сигнальным пептидом. Таким образом, если наночастица содержит антиген, указанный антиген может содержать присоединенный фрагмент и, следовательно, может представлять собой гибридный белок при включении в наночастицы. Для целей расчета идентичности последовательности присоединенные фрагменты не включают. В некоторых аспектах антиген можно укоротить. Например, N-конец можно укоротить на приблизительно 10 аминокислот, приблизительно 30 аминокислот, приблизительно 50 аминокислот, приблизительно 75 аминокислот, приблизительно 100 аминокислот или приблизительно 200 аминокислот. Например, C-конец можно укоротить на приблизительно 10 аминокислот, приблизительно 30 аминокислот, приблизительно 50 аминокислот, приблизительно 75 аминокислот, приблизительно 100 аминокислот или приблизительно 200 аминокислот.

Фармацевтические композиции

[0103] Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, содержат мультимерный белок и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители включают любой фармацевтический агент, который при введении субъекту не вызывает чрезмерной токсичности, раздражения или аллергической реакции. Фармацевтически приемлемые носители могут также включать одно или более из фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой любое вспомогательное вещество, которое можно применять при получении фармацевтической композиции, и которое является в целом безопасным, нетоксичным и приемлемым как для ветеринарного, так и для фармацевтического применения для лечения людей.

[0080] Фармацевтические композиции, используемые в настоящем документе, содержат фармацевтически приемлемый носитель, включая любой подходящий разбавитель или вспомогательное вещество, включающее любой фармацевтический агент, сам по себе не вызывающий иммунный ответ, вредный для позвоночного, получающего указанную композицию, и при введении не вызывающий чрезмерной токсичности, и иммуноген, например, мультимерный гибридный белок.

[0104] В некоторых аспектах составы могут содержать фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. Фармацевтически приемлемые носители включают физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, стерильный изотонический водный буфер и их комбинации, но не ограничиваются ими. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и других вспомогательных веществ представлено в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J., текущее издание). Состав можно адаптировать под способ введения. В типичном варианте реализации композиция подходит для введения людям, является стерильной, не содержит частиц и/или является апирогенной.

[0105] Композиция также может содержать увлажнители или эмульгаторы или pH-буферные агенты или их смеси. Композиция может представлять собой твердое вещество, например, лиофилизированный порошок, подходящий для растворения (например, водой или физиологическим раствором), жидкий раствор, суспензию, эмульсию, таблетку, пилюлю, капсулу, состав с замедленным высвобождением или порошок. Составы для перорального применения могут содержать стандартные носители, например, маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин-натрий, целлюлозу, карбонат магния и т.д. фармацевтической степени чистоты.

Адьюванты

[0106] Иммуногенность конкретной композиции можно усилить путем использования неспецифических стимуляторов иммунного ответа, известных как адъюванты. Адъюванты используют в экспериментах для стимуляции общего иммунитета против антигенов (например, в патенте США № 4877611). Адъюванты используют в протоколах иммунизации для стимуляции ответа в течение многих лет, и сами по себе адъюванты хорошо известны специалисту в данной области техники. Некоторые адъюванты влияют на механизм презентации антигенов. Например, иммунный ответ усиливается при осаждении белковых антигенов квасцами. Эмульгирование антигенов также увеличивает продолжительность презентации антигена. Включение любых адьювантов описано в монографии Vogel et al., «A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2е изд.)», полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки для всех целей, и предусмотрено сущностью настоящего изобретения.

[0107] Типичные адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (неспецифический стимулятор иммунного ответа, содержащий убитые Mycobacterium tuberculosis), неполные адъюванты Фрейнда и адъювант на основе гидроксида алюминия. Другие адъюванты содержат GMCSP, BCG, соединения MDP, например, thr-MDP и nor-MDP, CGP (MTP-PE), липид A и монофосфориллипид A (MPL), MF-59, RIBI, содержащий три компонента, выделенных из бактерий, MPL, димиколат трегалозы (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS) в 2% эмульсии сквалена/Tween® 80. В других предпочтительных аспектах применяют квасцы, например, 2% Alhydrogel (Al(OH)₃). В некоторых аспектах адьювант может представлять собой олиголамеллярные липидные везикулы, например, Novasomes®. Novasomes® представляют собой олиголамеллярные нефосфолипидные везикулы размером от приблизительно 100 нм до приблизительно 500 нм. Они содержат Brij 72, холестерин, олеиновую кислоту и сквален. Показано, что Novasomes являются эффективным адьювантом (см. патенты США № 5629021, 6387373 и 4911928.

Сапониновые адьюванты

[0108] Сапонинсодержащие адъюванты также можно объединять с иммуногенами, описанными в настоящем документе. Сапонины представляют собой гликозиды, получаемые из коры дерева Quillaja saponaria Molina. Как правило, сапонины получают с использованием многостадийного процесса очистки, в результате которого получают несколько фракций. В настоящем документе термин «фракция сапонинов Quillaja saponaria Molina» используется в общем смысле для описания полуочищенной или установленной фракции сапонинов Quillaja saponaria или ее по существу чистой фракции.

Фракции сапонинов

[0109] Для получения фракций сапонинов можно использовать несколько подходов. Фракции A, B и C описаны в патенте США № 6352697, и их можно получить следующим образом. Липофильную фракцию Quil A, необработанного водного экстракта Quillaja saponaria Molina, хроматографически разделяют и элюируют 70% ацетонитрилом в воде, восстанавливая липофильную фракцию. Затем липофильную фракцию разделяют полупрепаративной ВЭЖХ с элюированием градиентом от 25% до 60% ацетонитрила в подкисленной воде. Фракция, называемая в настоящем документе «фракцией A» или «QH-A», представляет собой или соответствует фракции, элюируемой при концентрации ацетонитрила приблизительно 39%. Фракция, называемая в настоящем документе «фракцией B» или «QH-B», представляет собой или соответствует фракции, элюируемой при концентрации ацетонитрила приблизительно 47%. Фракция, называемая в настоящем документе «фракцией C» или «QH-C», представляет собой или соответствует фракции, элюируемой при концентрации ацетонитрила приблизительно 49%. Дополнительная информация об очистке фракций находится в патенте США № 5057540. При получении фракций A, B и C Quillaja saponaria Molina согласно описанию в настоящем документе каждая из них представляет собой группы или семейства химически близкородственных молекул с определенными свойствами. Хроматографические условия их получения таковы, что воспроизводимость между партиями с точки зрения профиля элюирования и биологической активности воспроизводится в высокой степени.

[0110] Описаны другие фракции сапонинов. Фракции B3, B4 и B4b описаны в EP 0436620. Фракции QA1-QA22 описаны в EP03632279 B2, Q-VAC (Nor-Feed AS, Дания), Quillaja saponaria Molina Spikoside (lsconova AB, 2B, 756 51 Уппсала, Швеция). Можно использовать фракции QA-1, QA-2, QA-3, QA-4, QA-5, QA-6, QA-7, QA-8, QA-9, QA-10, QA-11, QA-12, QA-13, QA-14, QA-15, QA-16, QA-17, QA-18, QA-19, QA-20, QA-21 и QA-22 EP 0 3632 279 B2, особенно QA-7, QA-17, QA-18 и QA-21. Их получают согласно описанию в EP 0 3632 279 B2, особенно на странице 6 и в примере 1 на странице 8 и 9.

[0111] Фракции сапонинов, описанные в настоящем документе и используемые для образования адъювантов, часто являются по существу чистыми фракциями; т.е. эти фракции по существу не загрязнены другими материалами. В определенных аспектах фракция по существу чистого сапонина может содержать до 40 мас.%, до 30 мас.%, до 25 мас.%, до 20 мас.%, до 15 мас.%, до 10 мас.%, до 7 мас.%, до 5 мас.%, до 2 мас.%, до 1 мас.%, до 0,5 мас.% или до 0,1 мас.% других соединений, например, других сапонинов или других адъювантов.

Структуры ISCOM

[0112] Фракции сапонинов можно вводить в виде клеткоподобной частицы, называемой ISCOM (иммуностимулирующий комплекс). ISCOM можно получать, как описано в EP0109942B1, EP0242380B1 и EP0180546 B1. В конкретных вариантах реализации можно использовать транспортный антиген и/или антиген-пассажир, как описано в EP 9600647-3 (PCT/SE97/00289).

Матриксные адьюванты

[0113] В некоторых аспектах ISCOM представляет собой матриксный комплекс ISCOM. Матриксный комплекс ISCOM содержит по меньшей мере одну фракцию сапонинов и липид. Липид представляет собой по меньшей мере стерин, например, холестерин. В конкретных аспектах матриксный комплекс ISCOM также содержит фосфолипид. Матриксные комплексы ISCOM могут также содержать одно или более из других иммуномодулирующих (адъювант-активных) веществ, необязательно гликозид, и их можно получить согласно описанию в EP0436620B1.

[0114] В других аспектах ISCOM представляет собой комплекс ISCOM. Комплекс ISCOM содержит по меньшей мере один сапонин, по меньшей мере один липид и антиген или эпитоп по меньшей мере одного вида. Комплекс ISCOM содержит антиген, ассоциированный путем обработки детергентом, так что фрагмент антигена встраивается в частицу. В отличие от этого, матрикс ISCOM составлен в виде смеси с антигеном, а ассоциация между частицами матрикса ISCOM и антигеном опосредована электростатическими и/или гидрофобными взаимодействиями.

[0115] В соответствии с одним вариантом реализации фракцию сапонинов, встроенную в матриксный комплекс ISCOM или комплекс ISCOM, или по меньшей мере один дополнительный адъювант, который также встроен в ISCOM или матриксный комплекс ISCOM или смешан с ним, выбирают из фракции A, фракции B или фракции С Quillaja saponaria, полуочищенного препарата Quillaja saponaria, очищенного препарата Quillaja saponaria или любой очищенной субфракции, например, QA 1-21.

[0116] В конкретных аспектах каждая частица ISCOM может содержать по меньшей мере две фракции сапонинов. Можно использовать любые комбинации массово-процентных концентраций различных фракций сапонинов. Можно использовать любую комбинацию массово-процентных концентраций любых двух фракций. Например, частица может содержать любую массово-процентную концентрацию фракции А и любую массово-процентную концентрацию другой фракции сапонинов, например, неочищенной фракции сапонинов или фракции С, соответственно. Соответственно, в конкретных аспектах каждая частица матрикса ISCOM или каждая частица комплекса ISCOM может содержать от 0,1 до 99,9 мас.%, от 5 до 95 мас.%, от 10 до 90 мас.%, от 15 до 85 мас.%, от 20 до 80 мас.%, от 25 до 75 мас.%, от 30 до 70 мас.%, от 35 до 65 мас.%, от 40 до 60 мас.%, от 45 до 55 мас.%, от 40 до 60 мас.%, или 50 мас.% одной фракции сапонинов, например, фракции A, и недостающее в каждом случае до 100% количество другого сапонина, например, любой неочищенной фракции или любой другой фракции, например, фракции C. Массу рассчитывают как общую массу фракций сапонинов. Примеры адъювантов на основе матриксного комплекса ISCOM и комплекса ISCOM описаны в опубликованной заявке на патент США № 2013/0129770.

[0117] В конкретных вариантах реализации матрикс ISCOM или комплекс ISCOM содержат от 5 до 99 мас.% одной фракции, например, фракции А, и недостающее до 100 мас.% количество другой фракции, например, неочищенной фракции сапонинов или фракции С. Массу рассчитывают как общую массу фракций сапонинов.

[0118] В еще одном варианте реализации матрикс ISCOM или комплекс ISCOM содержат от 40 мас.% до 99 мас.% одной фракции, например, фракции А, и от 1 мас.% до 60 мас. % другой фракции, например, неочищенной фракции сапонинов или фракции С. Массу рассчитывают как общую массу фракций сапонинов.

[0119] В еще одном варианте реализации матрикс ISCOM или комплекс ISCOM содержат от 70 мас.% до 99 мас.% одной фракции, например, фракции А, и от 30 мас.% до 5 мас.% другой фракции, например, неочищенной фракции сапонинов или фракции С. Массу рассчитывают как общую массу фракций сапонинов. В других в других вариантах реализации фракцию сапонинов Quillaja saponaria Molina выбирают из любой из QA 1-21.

[0120] В дополнение к частицам, содержащим смеси фракций сапонинов, частицы матрикса ISCOM и частицы комплекса ISCOM можно получать с использованием только одной фракции сапонинов. Композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать множество частиц, причем каждая частица содержит только одну фракцию сапонинов. Т.е. некоторые композиции могут содержать одну или более из частиц матриксных комплексов ISCOM различного типа и/или одну или более из частиц комплексов ISCOM различного типа, причем каждая отдельная частица содержит одну фракцию сапонинов Quillaja saponaria Molina, причем фракция сапонинов в одном комплексе отличается от фракции сапонинов в других частицах комплекса.

[0121] В конкретных аспектах фракцию сапонинов одного типа или фракцию неочищенных сапонинов можно встроить в один матриксный комплекс или частицу ISCOM, а другую фракцию по существу чистого сапонина или фракцию неочищенных сапонинов можно встроить в другой матриксный комплекс или частицу ISCOM. Композиция или вакцина может содержать по меньшей мере два типа комплексов или частиц, причем каждый из них содержит сапонины одного типа, встроенные в физически разные частицы.

[0122] В композициях можно применять смеси частиц матриксного комплекса ISCOM и/или частиц комплекса ISCOM, причем одна фракция сапонинов Quillaja saponaria Molina и другая фракция сапонинов Quillaja saponaria Molina отдельно встроены в различные частицы матриксного комплекса ISCOM и/или частицы комплекса ISCOM.

[0123] Частицы матрикса ISCOM или частицы комплекса ISCOM, каждая из которых содержит одну фракцию сапонинов, могут присутствовать в композиции в любой комбинации мас.%. В конкретных аспектах композиция может содержать от 0,1 мас.% до 99,9 мас.%, от 5% до 95 мас.%, от 10% до 90 мас.%, от 15% до 85 мас.%, от 20% до 80 мас.%, от 25% до 75 мас.%, от 30% до 70 мас.%, от 35% до 65 мас.%, от 40% до 60 мас.%, от 45% до 55 мас.%, от 40 до 60 мас.% или 50 мас.%, матрикса или комплекса ISCOM, содержащего первую фракцию сапонинов, в то время как оставшаяся часть состоит из матрикса или комплекса ISCOM, содержащего другую фракцию сапонинов. В некоторых аспектах оставшаяся часть представляет собой один или несколько из матриксов или комплексов ISCOM, причем каждая частица матрикса или комплекса содержит только одну фракцию сапонинов. В других аспектах каждая частица матрикса или комплекса ISCOM может содержать более одной фракции сапонинов.

[0124] В предпочтительных композициях фракция сапонинов в первом матриксе ISCOM представляет собой фракцию A («матрикс фракции A»), а фракция сапонинов во второй частице матрикса ISCOM или комплекса ISCOM представляет собой фракцию C («Матрица фракции C»). Таким образом, предпочтительная композиция содержит в качестве адьюванта матриксный адъювант фракции А и матриксный адъювант фракции С. Количество каждого матрикса, присутствующего в композиции, может меняться. Например, количество матрикса фракции A может составлять приблизительно 80% (мас./мас.), приблизительно 85% (мас./мас.), приблизительно 90 (мас./мас.), приблизительно 92% (мас./мас.) или приблизительно 95% (мас./мас.), а остальная часть представляет собой матрикс фракции C. Подходящим примером подходящей комбинации 85:15 матрикса фракции А и матрикса фракции С является Matrix-М™ (Novavax AB, Уппсала, Швеция), смесь матрикса фракции А и матрикса фракции С в соотношении от приблизительно 85 до приблизительно 15,

[0125] Другие фракции сапонинов, например, фракции QS-7 и QS-21, их получение и применение описаны в патентах США № 5057540; 6231859; 6352697; 6524584; 6846489; 7776343 и 8173141. Эти фракции можно применять в способах и композициях, описанных в настоящем документе

Иммуностимуляторы

[0126] Кроме того, композиции согласно настоящему изобретению можно составить с использованием «иммуностимуляторов». Это - собственные химические мессенджеры организма (цитокины), усиливающие ответ иммунной системы. Иммуностимуляторы включают различные цитокины, лимфокины и хемокины с обладающие иммуностимулирующей, усиливающей иммунный ответ и провоспалительной активностями, например, интерлейкины (например, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-12, ИЛ-13); факторы роста (например, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМКСФ) и другие молекулы-иммуностимуляторы, например, воспалительный фактор макрофагов, лиганд Flt3, B7.1; B7.2 и т. д., но не ограничиваются ими. Иммуностимулирующие молекулы можно вводить в тот же состав, что и композиции согласно настоящему изобретению, или отдельно. Белок или экспрессирующий вектор, кодирующий белок, можно вводить для получения иммуностимулирующего эффекта. Таким образом, в одном варианте реализации настоящее изобретение включает антигенные и вакцинные составы, содержащие адъювант и/или иммуностимулятор.

Способы индукции иммунного ответа

[0081] Кроме того, в настоящем изобретении предложены способы. позволяющие вызывать иммунный ответ против патогенных организмов. Этот способ включает введение субъекту иммунологически эффективного количества композиции, содержащей мультимерный белок. Введение иммунологически эффективного количества композиции согласно настоящему изобретению вызывает иммунный ответ, специфичный по отношению к эпитопам, присутствующим в гибридном белке. Такой иммунный ответ может включать В-клеточный ответ и/или Т-клеточный ответ. При введении субъекту мультимерные белки предпочтительно индуцируют продукцию нейтрализующих антител. Иммунный ответ предпочтительно включает элементы, специфичные по меньшей мере по отношению к одному конформационному эпитопу, представляющему каждый белок, содержащийся в мультимерном белке.

Введение

[0127] Введение можно осуществлять любым удобным путем. Подходящие пути включают парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутривенное и подкожное введение), эпидуральное введение и введение через слизистые (например, интраназальный, пероральный или легочный пути, или посредством суппозиториев), трансдермальное или внутрикожное введение. Введение можно осуществлять посредством вливания или болюсной инъекции, всасывания через эпителий или слизистую (например, слизистую полости рта, толстой кишки, конъюнктиву, слизистую носоглотки, ротоглотки, влагалища, мочеиспускательного канала, мочевого пузыря и кишечника и т.д.); можно осуществлять введение вместе с другими биологически активными агентами. В некоторых аспектах интраназальный или другие пути введения через слизистые могут приводить к гуморальному или другому иммунному ответу, значительно превышающему ответ при использовании других путей введения. Введение может быть системным или местным.

[0128] В некоторых аспектах введение можно осуществлять посредством инъекции с использованием иглы и шприца или безыгольного инъекционного устройства. В других аспектах введение осуществляют с использованием капель, аэрозоля с крупными частицами (размером более приблизительно 10 микрон) или спрея в верхние дыхательные пути.

[0129] В некоторых аспектах предложена фармацевтическая упаковка или набор, содержащий один или более из контейнеров, заполненных одним или более компонентами составов. В конкретном аспекте набор может включать два контейнера, причем первый контейнер содержит мультимерный белок, а второй контейнер - адъювант. С таким контейнером(ами) может быть связано уведомление в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, причем в указанном уведомлении отражено утверждение указанным агентством производства, применения или продажи для введения людям. Кроме того, составы можно упаковать в герметически закрытый контейнер, например, ампулу или саше, с указанием количества композиции.

[0130] В некоторых аспектах введение может быть нацеленным (таргетным). Например, композиции можно вводить таким образом, чтобы их мишенью являлись ткани слизистой, с целью индукции иммунного ответа в области иммунизации. Можно оказывать нацеленное воздействие на ткани слизистых, например, кишечно-ассоциированную лимфоидную ткань (GALT), с целью иммунизации посредством перорального введения композиций, содержащих адъюванты, обладающие свойством специфического адресного воздействия на слизистые. Кроме того, мишенью воздействия могут являться дополнительные ткани слизистых, например, лимфоидная ткань носоглотки (NALT) и лимфоидная ткань, ассоциированная с бронхами (BALT).

[0131] В некоторых аспектах можно вводить множество композиций, каждая из которых содержит свой набор антигенов. При введении более одного мультимерного белка можно вводить указанные белки одновременно в одну и ту же область тела субъекта; например, путем инъекции материала из одного или более контейнеров, содержащих мультимерные белки. В других аспектах их можно последовательно вводить в разные области в течение короткого промежутка времени; например, одно введение можно выполнить в бедро, а второе - в руку, причем оба введения выполняют в течение небольшого времени (например, до 30 минут).

[0132] Специалист в данной области техники может выполнить клинические исследования на людях для определения предпочтительной эффективной дозы для людей. Такие клинические исследования выполняют в рабочем порядке; они хорошо известны в данной области техники. Точная применяемая доза также зависит от пути введения. Эффективную дозу можно экстраполировать на основе кривых доза-ответ, полученных in vitro или в тест-системах на основе in vivo. Дозу можно корректировать на основании, например, возраста, физического состояния, массы тела, пола, диеты, времени введения и других клинических факторов.

[0133] Хотя возможна стимуляция иммунитета посредством разовой дозы, для достижения желательного эффекта можно вводить дополнительные дозы тем же или другим путем. Например, для стимуляции достаточного уровня иммунитета у новорожденных и младенцев может потребоваться многократное введение. При необходимости поддержания достаточного уровня защиты от инфекций введение можно продолжать с интервалами в течение всего детского возраста. Аналогичным образом, взрослым, в особенности подверженным повторяющимся или тяжелым инфекциям, например, медицинским работникам, работникам дневного ухода, родственникам маленьких детей, пожилым людям и людям с нарушениями функции сердца и легких для установления и/или поддержания защитного иммунного ответа может потребоваться многократная иммунизация. Уровень индуцированного иммунитета можно отслеживать, например, измеряя количество нейтрализующих секреторных и сывороточных антител, а также коррекции дозировок или повторения вакцинации при необходимости стимуляции и поддержания желательного уровня защиты.

[0134] Кроме того, вакцинные композиции можно применять для получения антител против токсинов, используемых для пассивной терапии. См. Casadevall. «Passive Antibody Administration (Immediate Immunity) as a Specific Defense Against Biological Weapons», Emerging Infectious Diseases. 2002;8(8):833-841.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Вакцинные конструкции, содержащие три токсина C. difficile

[0082] Сконструировали две трехтоксинных конструкции. Диаграмма структуры белка показана на фигуре 1. Тройной токсин 1420 (также называемый BV1420) содержал от N-конца к C-концу пептид домена активации, зрелый пептид CDTb, пептид RBD TcdB и пептид RBD TcdA, содержащий 19 повторов (R19). Сайту расщепления фурином (RARRRKKR; SEQ ID NO:27) располагался между доменом активации и зрелым пептидом CDTb. На фигурах 2 и 3 показаны белковая и генетическая последовательность BV1470, соответственно. Линкер находился на каждом конце пептида TcdB.

ПРИМЕР 2

Экспрессия трехтоксинной вакцины

[0083] Клетки Sf9 трансформировали бакуловирусным вектором, экспрессирующим тройную вакцину в виде единого транскрипта. Данные экспрессии в клетках Sf9 показаны на фигуре 2. На фигуре 2 показана экспрессия каждого белка, собранного через 48 и 72 часа. Примечательно, что, хотя масса каждого белка превышала 200 кДа, достигался высокий уровень продукции. На фигуре 7 показан ход экспрессии каждого белка с 48 до 96 часов. Данные показывают, что оба белка были хорошо растворимы.

ПРИМЕР 3

Очистка трехтоксинной вакцины

[0084] Для солюбилизации и очистки частиц к культуре клеток непосредственно добавляли Tergitol NP9 до конечной концентрации 0,2% NP9/25 мМ трис/50 мМ NaCl/pH 8,0. Инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем дважды центрифугировали лизат при 9000 g в течение 30 мин. Собирали надосадочную жидкость, содержащую наночастицы. Затем надосадочную жидкость добавляли в буфер А и элюировали в буфер В (буфер А: 25 мМ трис pH 8,0 /50 мМ NaCl, буфер B: 25 мМ трис pH 8,0/1 M NaCl). Элюат наносили на колонку Phenyl HP (буфер A: 350 мМ цитрата Na/25 мМ трис pH 7,5, буфер B: 5 мМ трис pH 8,0), а затем на колонку Source 30Q (буфер A: 25 мМ трис pH 8,0/250 мМ NaCl, буфер B: 25 мМ трис pH 8,0/1 M NaCl). Объединенные фракции, содержащие продукт, пропускали через 2-микронный фильтр. См. фигуры 4-6. Выход очистки 1470 из Sf9 составлял 269 мг/титр белка. Выход очистки 1420 из клеток Sf9 составлял 166 мг/титр.

ПРИМЕР 4

Анализ частиц трехтоксинной вакцины

[0085] Распределение размеров частиц тройного токсина BV1420 по объему анализировали с помощью динамического светорассеяния с использованием Zeta Sizer Nano. График распределения размеров по объему показано на фигуре 7. Средний диаметр составлял ~30 нм. На фигуре 8 показан график распределения размеров частиц тройного токсина BV1470 по интенсивности. Средний диаметр составлял ~18 нм.

[0086] На фигуре 9 показаны электронные микрофотографии отрицательно окрашенного тройного токсина BV1420. Электронная микрофотография очищенного тройного токсина BV1420, разбавленного до концентрации приблизительно 10 мкг/мл и отрицательно окрашенного уранилацетатом.

ПРИМЕР 5

Вакцина, содержащая три токсина C. difficile: контрольная стимуляция летальной дозой токсина и выживаемость животных

[0087] На фигуре 10 приведены результаты испытания трехтоксинной вакцины на мышах против токсина A и бинарного токсина. Группам 1-6 вводили антиген BV1420 (30 мкг) или ФСБ, как показано. Группам 1 и 4 вводили 50 мкг квасцов Alum OH; группам 2 и 5 вводили 50 мкг квасцов Alum OH и 50 мкг адьюванта ISCOM Matrix M. Мышей иммунизировали в 0 и 14 день, отбор крови выполняли в 0, 14 и 32 день. Контрольную стимуляцию мышей токсином А и бинарным токсином выполняли на 35 день.

[0088] На фигуре 11 показан ответ IgG в сыворотке. ФСБ не индуцировал образования антител, как и ожидалось. Трехтоксинная вакцина с квасцами Alum OH или как с квасцами Alum OJ, так и с Matrix M, индуцировала титры антител против токсина A, токсина B и CDTb в диапазоне от приблизительно 10⁴ до приблизительно 10⁶. На фигуре 12 установлено, что антитела нейтрализовали как токсин А, так и CTDb. На Фигуре 13 показана выживаемость животных в 6 группах. Группы 1, 2, 4 и 5 демонстрировали 100% выживаемость. За исключением двух мышей при контрольной стимуляции бинарным токсином, все животные в контрольных группах ФСБ погибли. Эти данные позволяют установить, что трехтоксинная вакцина защищает от воздействия токсинов.

[0089] Во втором исследовании контрольной стимуляции токсином B было разработано и протестировано несколько конструкций по отдельности или в комбинации. Мышам 1 группы вводили BV1420 (30 мкг) с квасцами Alum OH. Мышам 2 группы вводили BV1470 (30 мкг) с квасцами Alum OH, 3 группе вводили тандемный белок, содержащий VP6 ротавируса и RBD TcdB (10 мкг) с квасцами Alum OH. Мышам 4 группы вводили BV1470 и VP6/RBD TcdB. 5 группе вводили анатоксин Toxoid B (10 мкг). 6 группа была контрольной и получала ФСБ. IgG-ответ показан на фигуре 15. В каждом случае получили высокие титры антител. В каждой из групп, получившей пептид токсина A, произошла индукция ответа с высоким титром антител против токсина A в диапазоне между 10⁴ и приблизительно 10⁵. Всем группам вводили пептид токсина В, и в каждой из них продемонстрирован высокий титр антител в диапазоне между 10⁴ и приблизительно 10⁶. В каждой из групп, получившей пептид бинарного токсина, произошла индукция ответа с высоким титром антител в диапазоне между 10⁵ и приблизительно 10⁶. На фигуре 16 установлено получение антитела, нейтрализовавших токсин B, при этом для анатоксина B продемонстрированы более высокие уровни.

[0090] Выживаемость мышей в 1-6 группах показана на фигуре 17. Все мыши в контрольной группе ФСБ погибли к 3 дню, причем 5 из 6 погибли в течение суток. Выживаемость после токсина В составила 100%. Для 1-4 групп выживаемость варьировала от 67% до 83%.

ПРИМЕР 6

Дополнительные трехтоксинные вакцины

[0091] Можно получить дополнительные вакцины с высоким уровнем экспрессии. На фигурах 18 и 19 показаны дополнительные трехвалентные вакцинные белки с геном транслокации TcdB. BV1512 показан на нижней диаграмме. На фигуре 18 показана структура дополнительных вакцин: Последовательность мультимерного белка: В последовательности мультимерного вакцинного белка BV1512 показан белок CDTb, отделенный от домена транслокации (TD) A-S-линкером, и TD, отделенный от фрагмента TcdAR19 S-R-линкером. На фигуре 19 показана экспрессия мультимерного белка BV1512 в клетках Sf9.

ПРИМЕР 7

Четырехвалентные вакцины

[0092] Получили мультимерные белки, содержащие четыре пептида. Фиг. 20. В этом примере внедряли пептид TcdB из второго штамма для расширения иммунитета против дополнительного штамма C. difficile. Первый четырехвалентный мультимерный белок (CBAB, или pCDTb/TcdB₆₃₀/TcdAR19/TcdB₀₂₇) содержал пептид TcdB штамма 027, добавленный на C-конце (см. фиг. 20, верхняя диаграмма). Во втором четырехвалентном мультимерном пептиде пептид TcdB штамма 027 внедрили между белком TcdB и белком TcdA(R19) первого штамма (штамма 630) (см. фиг. 20, нижнюю диаграмму). На фигуре 21 показана экспрессия четырехвалентного мультимера CBBA в клетках Sf9, как описано выше. Данные показывают, что полученный выход составил 42 мг/л. Второй белок (CBBA, или pCDTb/TcdB₆₃₀/TcdAR19/TcdB₀₂₇, показанный на фигуре 26) также продуцировали в системе Sf9 с выходом 40 мг/л. См. Фиг. 22.

ПРИМЕР 8

Конструирование, экспрессия и очистка гибридных белков Т-токсина и Q-токсина

[0093] Сконструировали химерные гибридные белки, содержавшие RBD TcdA C. difficile, TcdB₍₀₀₃₎, TcdB₍₀₂₇₎ и CDTb. Аминокислотную последовательность RBD TcdA получили из штамма C. difficile VPI 10463 (ATCC 43255), NCBI P16154 (токсинотип 0, риботип 003); TcdB₍₀₀₃₎ из штамма VPI 10463 (ATCC 43255), NCBI P18177 (токсинотип 0, риботип 003); TcdB₍₀₂₇₎ из штамма CD196, NCBI WP_009888442.1 (токсинотип III, риботип 027); а CDTb из штамма CD196, GenBank ABS57477.1 (токсинотип III, риботип 027).

[0094] Кодирующие последовательности RBD TcdA (укороченного до 19 из 38 повторов), RBD TcdB₍₀₀₃₎ и TcdB₍₀₂₇₎ (по 24 повтора) и CDTb подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в клетках насекомых (GenScript).

[0095] Нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагмент гена CDTb (аминокислоты 1-835), RBD TcdA (1314 пар оснований [п.о.], 6816-8130 п.о.) и RBD TcdB₍₀₀₃₎ (1608 п.о., 5493-7098 п.о.) получали ПЦР-амплификацией из синтезированного гена. ПЦР-амплифицированные фрагменты генов гидролизовали ферментом рестрикции: CDTb с использованием BamHI/NheI; RBD TcdB₍₀₀₃₎ - NheI/XbaI; а RBD TcdA - XbaI/HindIII. После гидролиза эти три гена лигировали в сайты BamH1 и HindIII pFastBac1 (Invitrogen). Плазмиду, кодировавшую указанные три RBD, использовали для конструирования рекомбинантного бакуловируса множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV) с использованием системы экспрессии Bac-to-Bac (Invitrogen) в клетках насекомого Spodoptera frugiperda (Sf9) с целью экспрессии трехвалентного гибридного белка, далее называемого T-токсином (фигура 23B).

[0096] RBD TcdB₍₀₂₇₎ (1608 п.о, 5493-7098), гидролизованный Spel/HinIII, присоединяли к C-концу трехвалентного гибридного гена с образованием плазмиды и бакуловирусной конструкции, кодирующей RBD всех четырех токсинов, который аналогичным образом экспрессировали в клетках Sf9 для продуцирования четырехвалентного гибридного белка, далее называемого Q-токсином (фигура 23B; SEQ ID NO: 21).

[0097] Таким образом, конструкция содержала pCDTb: 835 аминокислот 1-835; штамм: CD196; токсинотип: III, риботип: 027; GenBank: ABS57477.1;TcdB₀₀₃: 536 аминокислот 838-1373; NCBI: P18177, ШТАММ=ATCC 4325 / VPI 10463, токсинотип 0, риботип: 087; TcdA: 438 аминокислот 1376-1813; NCBI: P16154, ШТАММ=ATCC 4325 / VPI 10463, токсинотип 0, риботип: 087, и TcdB₀₂₇: 536 аминокислот 1815-2351; NCBI: 013315, штамм CD196; токсинотип: III, риботип: 027. Каждый из этих фрагментов разделяли двухаминокислотными линкерами: AS между фрагментом pCDTb и фрагментом TcdB003, SR между фрагментом TcdB003 и фрагментом TcdA, TS между фрагментом TcdA и фрагментом TcdB027.

[0098] Гибридные белки экстрагировали путем лизиса с использованием детергентов в буфер, содержащий 0,2% Tergitol NP-9 в 25 мМ трис-буфере (pH 8,0), 250 мМ NaCl и 2 мкг/мл лейпептина. Лизаты очищали центрифугированием, гибридные белки очищали хроматографией на колонках Fractogel EMD TMAE, phenyl HP и 30Q. Очищенные T-токсин и Q-токсин добавляли в буфер, содержащий 25 мМ трис и 250 мМ NaCl (pH 8,0), в концентрации приблизительно 4,0 мг/мл, и хранили при < -60°C. Выход очищенного T-токсина и Q-токсина составил 267 и 154 мг/л, соответственно. T-токсин и Q-токсин мигрировали при электрофорезе в ДСН-ПААГ как белки с молекулярной массой 205 кДа и 268 кДа, соответственно, их чистота составляла > 90% (фигура 23A). Вестерн-блоттинг с токсин-специфичными антителами подтвердил экспрессию CDTb, TcdB и TcdA в каждом гибридном белке (фигура 23B-D).

ПРИМЕР 9

Иммуногенность гибридных белков Т-токсина и Q-токсина у мышей

[0099] Для оценки иммуногенности гибридных белков Т-токсина и Q-токсина выполнили исследования на мышах в соответствии с утвержденными протоколами комитета учреждения по уходу за животными и их использованию (IACUC) Noble Life Sciences. Самок мышей C57BL/6 (в возрасте 6-8 недель) иммунизировали в/м в 0 и 14 дни T-токсином (30 или 100 мкг) или Q-токсином (100 мкг) в составе с 50 мкг гидроксида алюминия (квасцов) или ФСБ (контроль). Сыворотку собирали через 18 дней после второй дозы. У мышей через 3 недели после второй иммунизации выполняли контрольную стимуляцию посредством внутрибрюшинной (в/б) инъекции 100% минимальной летальной дозы (MLD_100%) TcdA, TcdB₍₀₀₃₎ или CDTa и CDTb.

[00100] Оценку содержания антител против токсинов в сыворотке мышей выполняли посредством твердофазного ИФА. На 96-луночных титрационных микропланшетах MaxiSorp (Thermo Scientific) иммобилизовали каждый токсин (2 мкг/мл) в течение ночи при 2-8°C. В планшеты добавляли пятикратные последовательные разведения сыворотки в двух повторностях. Связанные антитела обнаруживали с помощью антител козы против IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (Southern Biotech). В качестве субстрата добавляли 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (TMB) (Sigma) и останавливали реакцию стоп-буфером для TMB (Scytek Laboratories). Планшеты считывали при длине волны 450 нм на планшет-ридере SpectraMax Plus (Molecular Devices), результаты анализировали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro. Титры регистрировали в виде величины, обратной разведению, которое позволяло получить показания, составлявшие 50% от максимальной ОП_{450 нм}. Значениям титра, зарегистрированным как «менее нижнего уровня обнаружения» (LLOD), присваивали значение титра 50 для расчета GMT. После иммунизации сыворотка мышей содержала высокие титры IgG против TcdA, TcdB и CDT, которые были сопоставимы для T-токсина и Q-токсина (фигура 25A).

[00101] Клетки Vero (CCL-81, ATCC) поддерживали на DMEM с добавлением 20% термически инактивированной фетальной телячьей сыворотки (FBS) и антибиотиков (Gibco). В 96-луночных плоскодонных планшетах для тканевых культур (Thermo Scientific) получали двукратные последовательные разведения сыворотки мыши. Равный объем (50 мкл) среды для анализа (1x DMEM с 5% термически инактивированной FBS, 1x NEAA, 0,3% декстрозой, 1x пенициллин/стрептомицин/глутамина, 0,006% фенолового красного), содержащей 2x минимальную цитотоксическую дозу TcdA, TcdB или CDT, добавляли к разбавленной сыворотке и инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Добавляли клетки Vero (7,5×10⁴ клеток/мл), суспендированные в 50 мкл среды, и 150 мкл стерильного минерального масла (Sigma) и инкубировали планшеты в течение 6-7 дней при 37°C. После инкубирования планшеты просматривали на предмет окрашивания в лунках. Контрольные лунки с добавлением среды и токсина были красными/красно-розовыми; контрольные лунки с клетками были желтыми/желто-оранжевыми. Для каждого разведения образца последнюю лунку, которая была желтой/желто-оранжевой, регистрировали как конечный титр нейтрализующего антитела. Значениям титра, зарегистрированным как < LLOD, присваивали значение титра 5 для расчета GMT. Титры нейтрализующих антител (TNA) против каждого из трех токсинов были сопоставимы для гибридных белков T-токсина и Q-токсина (фигура 25B).

[00102] Через три недели после второй иммунизации у мышей выполняли контрольную стимуляцию TcdB₍₀₀₃₎. В группах, вакцинированных Q-токсином, выживаемость составляла 80% (p = 0,0043), в то время как в группе Т-токсина после контрольной стимуляции выжили 65% особей (p = 0,018). В противоположность этому, в контрольной группе после контрольной стимуляции токсином выжили лишь 20% особей (фигура 25C).

ПРИМЕР 10

Иммуногенность гибридных белков Т-токсина и Q-токсина у хомяков

[00103] Самцы золотистых сирийских хомяков (HsdHan:Aura; Harlan Laboratories) в возрасте 5-7 недель и массой от 70 до 100 граммов получали 3 иммунизации с 3-недельным интервалом посредством в/м введения 30 кг Q-токсина и 120 мкг квасцов или ФСБ (контроль) в правое и левое бедро попеременно. Через две недели после третьей иммунизации собирали сыворотку и обрабатывали животных 10 мг/кг клиндамицина в/б. Через день у животных выполняли контрольное заражение через желудочный зонд штаммом 630 или NAP1 с последующим наблюдением в течение 8 дней.

[00104] Оценку содержания антител против токсинов в сыворотке хомяков выполняли посредством твердофазного ИФА. На 96-луночных титрационных микропланшетах MaxiSorp (Thermo Scientific) иммобилизовали каждый токсин (2 мкг/мл) в течение ночи при 2-8°C. В планшеты добавляли пятикратные последовательные разведения сыворотки в двух повторностях. Связанные антитела обнаруживали с помощью антител кролика против IgG хомяка, конъюгированных с пероксидазой хрена (Southern Biotech). В качестве субстрата добавляли 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (TMB) (Sigma) и останавливали реакцию стоп-буфером для TMB (Scytek Laboratories). Планшеты считывали при длине волны 450 нм на планшет-ридере SpectraMax Plus (Molecular Devices), результаты анализировали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro. Титры регистрировали в виде величины, обратной разведению, которое позволяло получить показания, составлявшие 50% от максимальной ОП_{450 нм}. Значениям титра, зарегистрированным как «менее нижнего уровня обнаружения» (LLOD), присваивали значение титра 50 для расчета GMT. Хомяки, трижды иммунизированные Q-токсином с 3-недельным интервалом, продуцировали высокие титры IgG против токсинов TcdA, TcdB и CDTb (фигура 26A).

[00105] Клетки Vero (CCL-81, ATCC) поддерживали на DMEM с добавлением 20% термически инактивированной фетальной телячьей сыворотки (FBS) и антибиотиков (Gibco). В 96-луночных плоскодонных планшетах для тканевых культур (Thermo Scientific) получали двукратные последовательные разведения сыворотки хомяка. Равный объем (50 мкл) среды для анализа (1x DMEM с 5% термически инактивированной FBS, 1x NEAA, 0,3% декстрозой, 1x пенициллин/стрептомицин/глутамина, 0,006% фенолового красного), содержащей 2x минимальную цитотоксическую дозу TcdA, TcdB или CDT, добавляли к разбавленной сыворотке и инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Добавляли клетки Vero (7,5×10⁴ клеток/мл), суспендированные в 50 мкл среды, и 150 мкл стерильного минерального масла (Sigma) и инкубировали планшеты в течение 6-7 дней при 37°C. После инкубирования планшеты просматривали на предмет окрашивания в лунках. Контрольные лунки с добавлением среды и токсина были красными/красно-розовыми; контрольные лунки с клетками были желтыми/желто-оранжевыми. Для каждого разведения образца последнюю лунку, которая была желтой/желто-оранжевой, регистрировали как конечный титр нейтрализующего антитела. Значениям титра, зарегистрированным как < LLOD, присваивали значение титра 5 для расчета GMT. Титры TNA против каждого из трех токсинов были сопоставимы для гибридных белков T-токсина и Q-токсина (фигура 31B).

[00106] После обработки клиндамицином у животных, инфицированных штаммом C. difficile 630, наблюдали 90% выживаемость (фигура 26C), в то время как у животных, инфицированных NAP1, выживаемость составляла 75% (фигура 31D). Все животные в группе плацебо погибли в течение 48-72 часов после инфицирования каждым штаммом.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[00107] Каждый патент или опубликованная заявка, указанные в настоящем документе, включены в настоящий документ для всех целей.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> НОВАВАКС, ИНК.

ТЯНЬ, Цзин-Хуэй

ЛЮ, Е

СМИТ, Гейл

ГЛЕНН, Грегори

ФЛАЙЕР, Дэвид

<120> СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ

CLOSTRIDIUM DIFFICILE

<130> NOVV-058/02WO

<150> US 62/474 434

<151> 21.03.2017

<150> US 62/471 636

<151> 16.03.2017

<160> 28

<170> Версия PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 1813

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трехтоксинная вакцина BV1470

<220>

<221> прочее

<222> (588)..(588)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 1

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp Ala Ser Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser

835 840 845

Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val

850 855 860

Thr Val Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala

865 870 875 880

Ala Ser Ile Gly Glu Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn

885 890 895

Gln Ser Gly Val Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe

900 905 910

Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu

915 920 925

Ala Ile Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr

930 935 940

Phe Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly

945 950 955 960

Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu

965 970 975

Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met

980 985 990

Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp

995 1000 1005

Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His

1010 1015 1020

Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn

1025 1030 1035

Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu

1040 1045 1050

Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn

1055 1060 1065

Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Ala Val

1070 1075 1080

Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Tyr Phe Asp

1085 1090 1095

Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu Ile Asn Asp

1100 1105 1110

Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln Val Gly Phe

1115 1120 1125

Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser Gly Ile

1130 1135 1140

Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr Ile

1145 1150 1155

Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

1160 1165 1170

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile

1175 1180 1185

Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu

1190 1195 1200

Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp

1205 1210 1215

Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro

1220 1225 1230

Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile

1235 1240 1245

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile

1250 1255 1260

Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met

1265 1270 1275

Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly

1280 1285 1290

Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly

1295 1300 1305

Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu

1310 1315 1320

Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu Asp Glu Lys

1325 1330 1335

Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val

1340 1345 1350

Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gln

1355 1360 1365

Leu Val Ile Ser Glu Ser Arg Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly

1370 1375 1380

Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn

1385 1390 1395

Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr

1400 1405 1410

Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val

1415 1420 1425

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu

1430 1435 1440

Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys

1445 1450 1455

Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp

1460 1465 1470

Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe

1475 1480 1485

Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

1490 1495 1500

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

1505 1510 1515

Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn

1520 1525 1530

Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu

1535 1540 1545

Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr

1550 1555 1560

Gly Leu Arg Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

1565 1570 1575

Thr Ala Val Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys

1580 1585 1590

Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr

1595 1600 1605

Ile Ile Ser Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met

1610 1615 1620

Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1625 1630 1635

Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg

1640 1645 1650

Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe

1655 1660 1665

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly

1670 1675 1680

Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly

1685 1690 1695

Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu

1700 1705 1710

Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe

1715 1720 1725

Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

1730 1735 1740

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr

1745 1750 1755

Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn

1760 1765 1770

Gly Lys Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala

1775 1780 1785

Gly Gly Leu Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val

1790 1795 1800

Asp Gly Val Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly Met Glu Ile Val Asn Glu

1805 1810 1 5

Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu

10 15 20

His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro Ile Lys Asp Gly Asn Leu

25 30 35

Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu Leu Asp Lys Asp Lys Ser

40 45 50

Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg Ile Ile Pro Ser Lys Asp

55 60 65 70

Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp Asp Val Leu Met Gln Val

75 80 85

Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu Lys Val Asn Met Lys Lys

90 95 100

Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu Gln Asp Lys Asn Leu Gly

105 110 115

Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu Tyr Trp Glu Leu Asp Gly

120 125 130

Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu Phe Leu Arg Asp Tyr Ser

135 140 145 150

Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro Asn Asn Asn Phe Phe Asp

155 160 165

Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu Asp Leu Asp Thr Asp Asn

170 175 180

Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn Gly Tyr Thr Ile Lys Asp

185 190 195

Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe Ala Glu Gln Gly Tyr Lys

200 205 210

Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn Thr Ala Gly Asp Pro Tyr

215 220 225 230

Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe Asp Lys Ala Ile Lys Thr

235 240 245

Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val Gly Val Gly

250 255 260

Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu His Ala Ser Thr Asp Gln

265 270 275

Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn Ser Lys Thr Glu Ser Asn

280 285 290

Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr Gln Asn Gly Phe Thr Ala

295 300 305 310

Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr Asp Asn Ser Thr Ala Val

315 320 325

Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr Gly Leu Ser Ile Asn Lys

330 335 340

Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly

345 350 355

Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr Thr Asn Leu Val Leu Asp

360 365 370

Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln Glu Asn Gln Ile Gly Asn

375 380 385 390

Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys Lys Gly Leu Ser Pro Leu

395 400 405

Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser Arg Leu Ile Pro Ile Asn

410 415 420

Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly Lys Gln Ile Lys Leu Glu

425 430 435

Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr Lys Asn Ser Ser Gly Gln

440 445 450

Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp Tyr Ile Ser Gln Ile Asp

455 460 465 470

Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr Glu Asn Glu Ser Tyr Glu

475 480 485

Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp Pro Glu Asp Lys Thr Pro

490 495 500

Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys Ala Phe Gly Ala Thr Lys

505 510 515

Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile Pro Ile Asp Glu Ser Cys

520 525 530

Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala Asn Lys Ile Lys Asp Ser

535 540 545 550

Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr Asn Val Lys Leu Glu Arg

555 560 565

Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr Tyr Phe Thr Asn Phe Asp

570 575 580

Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser Asn Val Asn Thr Thr Asn

585 590 595

Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys Leu Asn Gly Glu Thr Lys

600 605 610

Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Lys Arg Tyr Val Phe

615 620 625 630

Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser Asn Ser Ile Ile Val Lys

635 640 645

Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr Leu Val Pro Glu Gln Gly

650 655 660

Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr Thr Glu Lys Asp Ser Ser

665 670 675

Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Leu Asp Asn

680 685 690

Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro Glu Ile Leu Asp Glu Pro

695 700 705 710

Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile Met Asp Ala His Lys Ile

715 720 725

Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Ile

730 735 740

Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr Asn Lys Glu Ala Leu Asp

745 750 755

Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr Leu Gln Tyr Ser Gly Phe

760 765 770

Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met Arg Asn Tyr Leu Gly Asp

775 780 785 790

Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn Leu Arg Ser Tyr Phe Thr

795 800 805

Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys Leu Arg Ile Tyr Ala Ile

810 815 820

Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu Ser Val Asp Ala Ser Met

825 830 835

Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro

840 845 850

Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp Lys

855 860 865 870

Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu Thr

875 880 885

Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val Leu Gln

890 895 900

Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro Ala

905 910 915

Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr Gly

920 925 930

Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr Arg

935 940 945 950

Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met His Tyr Phe Ser

955 960 965

Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr

970 975 980

Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met Gln Lys Gly Phe Val Ser

985 990 995

Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys

1000 1005 1010

Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu

1015 1020 1025

Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe

1030 1035 1040

Lys Tyr Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly

1045 1050 1055

Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile

1060 1065 1070

Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp

1075 1080 1085

Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu

1090 1095 1100

Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe

1105 1110 1115

Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp

1120 1125 1130

Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val

1135 1140 1145

Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Ile

1150 1155 1160

Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe

1165 1170 1175

Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val

1180 1185 1190

Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe

1195 1200 1205

Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu

1210 1215 1220

Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala

1225 1230 1235

Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp

1240 1245 1250

Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn

1255 1260 1265

Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile

1270 1275 1280

Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met

1285 1290 1295

Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala

1300 1305 1310

His Gln Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn

1315 1320 1325

Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr

1330 1335 1340

Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu

1345 1350 1355

Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

1360 1365 1370

Ser Arg Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu

1375 1380 1385

Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln

1390 1395 1400

Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys

1405 1410 1415

Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr

1420 1425 1430

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala

1435 1440 1445

Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn

1450 1455 1460

Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly

1465 1470 1475

Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe Ile Ala Ser Thr Gly

1480 1485 1490

Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly

1495 1500 1505

Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr

1510 1515 1520

Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala

1525 1530 1535

Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr

1540 1545 1550

Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr Ile

1555 1560 1565

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val

1570 1575 1580

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr

1585 1590 1595

Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys

1600 1605 1610

His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe

1615 1620 1625

Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp

1630 1635 1640

Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe

1645 1650 1655

Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys

1660 1665 1670

Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe

1675 1680 1685

Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp

1690 1695 1700

Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val

1705 1710 1715

Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr

1720 1725 1730

Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg

1735 1740 1745

Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser

1750 1755 1760

Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Val Tyr Tyr

1765 1770 1775

Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu Phe Glu

1780 1785 1790

Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys Ala

1795 1800 1805

Pro Gly Ile Tyr Gly

1810

<210> 2

<211> 835

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<220>

<221> прочее

<222> (588)..(588)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 2

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp

835

<210> 3

<211> 536

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 3

Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys

1 5 10 15

Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp

20 25 30

Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

35 40 45

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val Leu

50 55 60

Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro

65 70 75 80

Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr

85 90 95

Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr

100 105 110

Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met His Tyr Phe

115 120 125

Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp

130 135 140

Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met Gln Lys Gly Phe Val

145 150 155 160

Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys

165 170 175

Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn

180 185 190

Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr

195 200 205

Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile

210 215 220

Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp

225 230 235 240

Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser

245 250 255

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser

260 265 270

Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

275 280 285

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser

290 295 300

Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr

305 310 315 320

Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

325 330 335

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr

340 345 350

Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val

355 360 365

Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp

370 375 380

Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys

385 390 395 400

Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp

405 410 415

Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn

420 425 430

Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile

435 440 445

Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly

450 455 460

Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr

465 470 475 480

Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu

485 490 495

Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala

500 505 510

Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

515 520 525

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

530 535

<210> 4

<211> 438

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 4

Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr

20 25 30

Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

35 40 45

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

50 55 60

Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

65 70 75 80

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr

85 90 95

Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr

100 105 110

Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

115 120 125

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn

130 135 140

Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu

145 150 155 160

Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

165 170 175

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr

180 185 190

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val

195 200 205

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

210 215 220

Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe

225 230 235 240

Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

245 250 255

Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile

260 265 270

Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp

275 280 285

Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val

290 295 300

Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly

305 310 315 320

Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn

325 330 335

Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr

340 345 350

Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

355 360 365

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe

370 375 380

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys

385 390 395 400

Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

405 410 415

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys

420 425 430

Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

435

<210> 5

<211> 5442

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трехтоксинная вакцина BV1470

<220>

<221> прочее

<222> (1763)..(1763)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 5

atggaaatcg tcaacgaaga catcctgccg aacaacggtt tgatgggcta ctacttcacc 60

gatgagcact tcaaggacct gaagctcatg gctcctatca aggacggaaa cctgaagttc 120

gaggaaaaga aggtcgataa gctgctcgac aaggataaga gcgacgttaa gtcaatcagg 180

tggaccggca gaatcatccc atccaaggat ggagagtaca ctctctctac agaccgtgac 240

gatgtcttga tgcaggtgaa caccgaatcg actatctcca acactctgaa ggtgaacatg 300

aagaagggaa aggagtacaa ggtgcgcatc gaactgcaag ataagaacct cggttctatc 360

gacaacctct cctctccaaa cctctactgg gagttggatg gcatgaagaa gatcatcccg 420

gaggaaaact tgttcctgcg tgactacagc aacatcgaaa aggacgatcc cttcatccct 480

aacaacaact tcttcgatcc caagctgatg tctgactggg aggacgaaga tctcgacacc 540

gataacgaca acatccctga cagctacgag cgcaacggat acactatcaa ggatctcatc 600

gctgtgaagt gggaggactc cttcgccgaa cagggttaca agaagtacgt ctcaaactac 660

ttggagtcga acacagctgg tgacccctac accgactacg aaaaggcctc cggctctttc 720

gataaggcta tcaagaccga ggctagggac ccactcgtcg ctgcttaccc catcgtggga 780

gtcggtatgg agaagttgat catcagcact aacgaacacg cttcaactga ccagggcaag 840

acagtttcaa gagccaccac taactcgaag accgagtcca acactgctgg cgtttccgtg 900

aacgtcggct accagaacgg attcaccgcc aacgttacaa ccaactactc gcacactaca 960

gataactcca ccgctgtgca agactctaac ggagagagct ggaacactgg tctgtctatc 1020

aacaagggcg aaagcgctta catcaacgcc aacgtccgct actacaacac tggcacagcc 1080

cccatgtaca aggtgacccc taccactaac ctcgtcttgg atggagacac actgtctacc 1140

atcaaggctc aggagaacca aatcggaaac aacctcagcc ccggtgacac ataccctaag 1200

aagggattgt caccactggc cctcaacact atggaccagt tcagctcaag gttgatcccg 1260

atcaactacg atcaactcaa gaagttggac gctggcaagc agatcaagct ggagacaacc 1320

caagtctccg gtaacttcgg caccaagaac tcgtccggcc agatcgttac tgaaggaaac 1380

agctggtcag attacatctc acaaatcgac tcgatctccg cctctatcat cctggacaca 1440

gagaacgaat cctacgagcg tcgcgtgacc gctaagaact tgcaggaccc cgaggacaag 1500

acaccggaac tgaccatcgg cgaggccatc gaaaaggctt tcggtgccac caagaaggac 1560

ggcttgctgt acttcaacga tatccctatc gacgagtcct gcgttgaact gatcttcgac 1620

gataacactg ctaacaagat caaggattcc ctgaagacac tctctgacaa gaagatctac 1680

aacgtgaagc tcgagagggg tatgaacatc ttgatcaaga cccccactta cttcacaaac 1740

ttcgacgatt acaacaacta ccnttctacc tggagcaacg tcaacactac aaaccaggac 1800

ggactgcaag gttcggccaa caagctcaac ggcgagacca agatcaagat cccaatgagc 1860

gaactgaagc cgtacaagag atacgtgttc tcaggctact cgaaggaccc actcactagc 1920

aactcaatca tcgtgaagat caaggctaag gaggaaaaga ccgactacct ggtccccgag 1980

cagggctaca ctaagttctc ttacgagttc gaaaccactg agaaggactc tagcaacatc 2040

gaaatcaccc tcatcggcag cggaacaacc tacttggaca acctgtcaat caccgagttg 2100

aactcgactc ccgaaatcct ggacgagccc gaagtcaaga tccctaccga tcaggagatc 2160

atggacgctc acaagatcta cttcgccgac ctgaacttca acccctctac tggaaacaca 2220

tacatcaacg gcatgtactt cgctcctaca caaaccaaca aggaggccct ggactacatc 2280

cagaagtacc gtgtcgaagc cactctccaa tactccggtt tcaaggatat cggcacaaag 2340

gacaaggaga tgaggaacta cttgggtgac ccaaaccagc cgaagaccaa ctacgtgaac 2400

ctgagatcat acttcactgg tggcgagaac atcatgacat acaagaagct gcgtatctac 2460

gctatcaccc ctgacgaccg tgaactcttg gttttgtccg tggacgctag catggtcagc 2520

ggtctcatct acatcaacga ctcgttgtac tacttcaagc cccctgtgaa caacctgatc 2580

acaggtttcg ttaccgtggg cgacgataag tactacttca acccaatcaa cggtggcgct 2640

gcctccatcg gcgagaccat catcgacgat aagaactact acttcaacca gagcggagtt 2700

ctccaaactg gtgtgttctc aacagaggac ggtttcaagt acttcgctcc ggccaacacc 2760

ttggacgaaa acctggaggg tgaagccatc gacttcactg gcaagttgat catcgatgag 2820

aacatctact acttcgacga taactaccgc ggtgctgtgg agtggaagga actcgacggc 2880

gagatgcact acttctctcc agaaaccggc aaggccttca agggattgaa ccagatcggt 2940

gactacaagt actacttcaa ctcggatggc gtgatgcaaa agggattcgt ctccatcaac 3000

gacaacaagc actacttcga cgattccggt gttatgaaag tgggctacac agagatcgac 3060

ggcaagcact tctacttcgc tgagaacgga gaaatgcaga tcggtgtctt caacactgaa 3120

gatggtttca agtacttcgc ccaccacaac gaagatttgg gcaacgagga aggagaggaa 3180

atcagctact caggcatcct gaacttcaac aacaagatct actacttcga tgactctttc 3240

accgctgtgg tcggatggaa ggacctggag gatggtagca agtactactt cgacgaggat 3300

actgctgaag cctacatcgg cctgtcgctc atcaacgacg gacagtacta cttcaacgac 3360

gatggcatca tgcaagtcgg attcgttacc atcaacgaca aggtgttcta cttctcggat 3420

tccggtatca tcgagtctgg cgtccagaac atcgacgata actacttcta catcgacgat 3480

aacggaatcg tgcaaatcgg tgtcttcgac acaagcgatg gctacaagta cttcgctccc 3540

gccaacaccg tgaacgacaa catctacgga caggctgtgg agtactcagg cctggtccgt 3600

gttggagaag acgtgtacta cttcggcgag acctacacta tcgaaactgg atggatctac 3660

gacatggaga acgaatctga caagtactac ttcaaccctg agacaaagaa ggcctgcaag 3720

ggtatcaacc tgatcgacga tatcaagtac tacttcgatg aaaagggtat catgcgcacc 3780

ggcctcatct cattcgaaaa caacaactac tacttcaacg agaacggaga aatgcaattc 3840

ggttacatca acatcgagga caagatgttc tacttcggag aagatggtgt catgcagatc 3900

ggtgttttca acactccaga cggcttcaag tacttcgctc accaaaacac actcgacgag 3960

aacttcgagg gagaatccat caactacact ggttggttgg acctggatga gaagaggtac 4020

tacttcaccg acgaatacat cgctgccact ggctccgtca tcatcgacgg agaggaatac 4080

tacttcgacc cggatacagc ccagctggtc atctctgaat ctagaatggt gaccggtgtc 4140

ttcaagggtc ccaacggctt cgagtacttc gctcccgcca acactcacaa caacaacatc 4200

gaaggtcaag ctatcgtcta ccaaaacaag ttcttgaccc tgaacggcaa gaagtattat 4260

tttgacaacg attctaaggc cgttactggc tggcaaacaa tcgacggaaa gaagtattat 4320

ttcaatctga acactgccga ggctgccacc ggttggcaga ctatcgatgg caagaagtac 4380

tactttaacc tcaacactgc cgaagctgcc acaggatggc aaaccatcga cggcaagaag 4440

tactatttta acacaaacac cttcatcgct tctactggct acacaagcat caacggaaag 4500

catttttatt tcaacaccga tggaatcatg cagatcggtg tgttcaaggg accaaacggt 4560

ttcgaatact tcgctccggc taacacagac gctaacaaca tcgagggcca ggctatcttg 4620

taccaaaaca agttcctcac tttgaacggc aagaagtact attttggctc tgacagcaag 4680

gccgtcactg gactgaggac aatcgatggc aagaagtact actttaatac taacacagcc 4740

gttgctgtga ccggctggca gactatcaac ggaaagaagt attatttcaa taccaacact 4800

tcaatcgctt cgaccggtta cactatcatc tctggcaagc atttttattt taacaccgac 4860

ggcatcatgc aaatcggtgt cttcaagggc cccgatggct tcgaatactt cgcccccgct 4920

aacactgatg ctaacaacat cgagggacag gctatccgtt accaaaaccg cttcctgtac 4980

ctccacgaca acatctacta cttcggcaac aactcaaagg ctgccacagg atgggtgacc 5040

atcgatggta accgttacta cttcgagccc aacactgcca tgggtgctaa cggctacaag 5100

acaatcgaca acaagaactt ctacttccgc aacggtctcc cacagatcgg cgtcttcaag 5160

ggatcaaacg gtttcgagta cttcgctcct gccaacaccg acgccaacaa catcgagggc 5220

caagctatca ggtaccaaaa cagattcctg cacctgctcg gcaagatcta ctacttcgga 5280

aacaactcga aggccgttac tggttggcag acaatcaacg gcaaggtgta ctacttcatg 5340

ccagacaccg ctatggctgc cgctggtggc ctcttcgaaa tcgacggcgt gatctacttc 5400

ttcggcgttg atggagtgaa ggctccgggt atctacggct aa 5442

<210> 6

<211> 2505

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<220>

<221> прочее

<222> (1763)..(1763)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 6

atggaaatcg tcaacgaaga catcctgccg aacaacggtt tgatgggcta ctacttcacc 60

gatgagcact tcaaggacct gaagctcatg gctcctatca aggacggaaa cctgaagttc 120

gaggaaaaga aggtcgataa gctgctcgac aaggataaga gcgacgttaa gtcaatcagg 180

tggaccggca gaatcatccc atccaaggat ggagagtaca ctctctctac agaccgtgac 240

gatgtcttga tgcaggtgaa caccgaatcg actatctcca acactctgaa ggtgaacatg 300

aagaagggaa aggagtacaa ggtgcgcatc gaactgcaag ataagaacct cggttctatc 360

gacaacctct cctctccaaa cctctactgg gagttggatg gcatgaagaa gatcatcccg 420

gaggaaaact tgttcctgcg tgactacagc aacatcgaaa aggacgatcc cttcatccct 480

aacaacaact tcttcgatcc caagctgatg tctgactggg aggacgaaga tctcgacacc 540

gataacgaca acatccctga cagctacgag cgcaacggat acactatcaa ggatctcatc 600

gctgtgaagt gggaggactc cttcgccgaa cagggttaca agaagtacgt ctcaaactac 660

ttggagtcga acacagctgg tgacccctac accgactacg aaaaggcctc cggctctttc 720

gataaggcta tcaagaccga ggctagggac ccactcgtcg ctgcttaccc catcgtggga 780

gtcggtatgg agaagttgat catcagcact aacgaacacg cttcaactga ccagggcaag 840

acagtttcaa gagccaccac taactcgaag accgagtcca acactgctgg cgtttccgtg 900

aacgtcggct accagaacgg attcaccgcc aacgttacaa ccaactactc gcacactaca 960

gataactcca ccgctgtgca agactctaac ggagagagct ggaacactgg tctgtctatc 1020

aacaagggcg aaagcgctta catcaacgcc aacgtccgct actacaacac tggcacagcc 1080

cccatgtaca aggtgacccc taccactaac ctcgtcttgg atggagacac actgtctacc 1140

atcaaggctc aggagaacca aatcggaaac aacctcagcc ccggtgacac ataccctaag 1200

aagggattgt caccactggc cctcaacact atggaccagt tcagctcaag gttgatcccg 1260

atcaactacg atcaactcaa gaagttggac gctggcaagc agatcaagct ggagacaacc 1320

caagtctccg gtaacttcgg caccaagaac tcgtccggcc agatcgttac tgaaggaaac 1380

agctggtcag attacatctc acaaatcgac tcgatctccg cctctatcat cctggacaca 1440

gagaacgaat cctacgagcg tcgcgtgacc gctaagaact tgcaggaccc cgaggacaag 1500

acaccggaac tgaccatcgg cgaggccatc gaaaaggctt tcggtgccac caagaaggac 1560

ggcttgctgt acttcaacga tatccctatc gacgagtcct gcgttgaact gatcttcgac 1620

gataacactg ctaacaagat caaggattcc ctgaagacac tctctgacaa gaagatctac 1680

aacgtgaagc tcgagagggg tatgaacatc ttgatcaaga cccccactta cttcacaaac 1740

ttcgacgatt acaacaacta ccnttctacc tggagcaacg tcaacactac aaaccaggac 1800

ggactgcaag gttcggccaa caagctcaac ggcgagacca agatcaagat cccaatgagc 1860

gaactgaagc cgtacaagag atacgtgttc tcaggctact cgaaggaccc actcactagc 1920

aactcaatca tcgtgaagat caaggctaag gaggaaaaga ccgactacct ggtccccgag 1980

cagggctaca ctaagttctc ttacgagttc gaaaccactg agaaggactc tagcaacatc 2040

gaaatcaccc tcatcggcag cggaacaacc tacttggaca acctgtcaat caccgagttg 2100

aactcgactc ccgaaatcct ggacgagccc gaagtcaaga tccctaccga tcaggagatc 2160

atggacgctc acaagatcta cttcgccgac ctgaacttca acccctctac tggaaacaca 2220

tacatcaacg gcatgtactt cgctcctaca caaaccaaca aggaggccct ggactacatc 2280

cagaagtacc gtgtcgaagc cactctccaa tactccggtt tcaaggatat cggcacaaag 2340

gacaaggaga tgaggaacta cttgggtgac ccaaaccagc cgaagaccaa ctacgtgaac 2400

ctgagatcat acttcactgg tggcgagaac atcatgacat acaagaagct gcgtatctac 2460

gctatcaccc ctgacgaccg tgaactcttg gttttgtccg tggac 2505

<210> 7

<211> 1608

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<400> 7

atggtcagcg gtctcatcta catcaacgac tcgttgtact acttcaagcc ccctgtgaac 60

aacctgatca caggtttcgt taccgtgggc gacgataagt actacttcaa cccaatcaac 120

ggtggcgctg cctccatcgg cgagaccatc atcgacgata agaactacta cttcaaccag 180

agcggagttc tccaaactgg tgtgttctca acagaggacg gtttcaagta cttcgctccg 240

gccaacacct tggacgaaaa cctggagggt gaagccatcg acttcactgg caagttgatc 300

atcgatgaga acatctacta cttcgacgat aactaccgcg gtgctgtgga gtggaaggaa 360

ctcgacggcg agatgcacta cttctctcca gaaaccggca aggccttcaa gggattgaac 420

cagatcggtg actacaagta ctacttcaac tcggatggcg tgatgcaaaa gggattcgtc 480

tccatcaacg acaacaagca ctacttcgac gattccggtg ttatgaaagt gggctacaca 540

gagatcgacg gcaagcactt ctacttcgct gagaacggag aaatgcagat cggtgtcttc 600

aacactgaag atggtttcaa gtacttcgcc caccacaacg aagatttggg caacgaggaa 660

ggagaggaaa tcagctactc aggcatcctg aacttcaaca acaagatcta ctacttcgat 720

gactctttca ccgctgtggt cggatggaag gacctggagg atggtagcaa gtactacttc 780

gacgaggata ctgctgaagc ctacatcggc ctgtcgctca tcaacgacgg acagtactac 840

ttcaacgacg atggcatcat gcaagtcgga ttcgttacca tcaacgacaa ggtgttctac 900

ttctcggatt ccggtatcat cgagtctggc gtccagaaca tcgacgataa ctacttctac 960

atcgacgata acggaatcgt gcaaatcggt gtcttcgaca caagcgatgg ctacaagtac 1020

ttcgctcccg ccaacaccgt gaacgacaac atctacggac aggctgtgga gtactcaggc 1080

ctggtccgtg ttggagaaga cgtgtactac ttcggcgaga cctacactat cgaaactgga 1140

tggatctacg acatggagaa cgaatctgac aagtactact tcaaccctga gacaaagaag 1200

gcctgcaagg gtatcaacct gatcgacgat atcaagtact acttcgatga aaagggtatc 1260

atgcgcaccg gcctcatctc attcgaaaac aacaactact acttcaacga gaacggagaa 1320

atgcaattcg gttacatcaa catcgaggac aagatgttct acttcggaga agatggtgtc 1380

atgcagatcg gtgttttcaa cactccagac ggcttcaagt acttcgctca ccaaaacaca 1440

ctcgacgaga acttcgaggg agaatccatc aactacactg gttggttgga cctggatgag 1500

aagaggtact acttcaccga cgaatacatc gctgccactg gctccgtcat catcgacgga 1560

gaggaatact acttcgaccc ggatacagcc cagctggtca tctctgaa 1608

<210> 8

<211> 1317

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<400> 8

atggtgaccg gtgtcttcaa gggtcccaac ggcttcgagt acttcgctcc cgccaacact 60

cacaacaaca acatcgaagg tcaagctatc gtctaccaaa acaagttctt gaccctgaac 120

ggcaagaagt attattttga caacgattct aaggccgtta ctggctggca aacaatcgac 180

ggaaagaagt attatttcaa tctgaacact gccgaggctg ccaccggttg gcagactatc 240

gatggcaaga agtactactt taacctcaac actgccgaag ctgccacagg atggcaaacc 300

atcgacggca agaagtacta ttttaacaca aacaccttca tcgcttctac tggctacaca 360

agcatcaacg gaaagcattt ttatttcaac accgatggaa tcatgcagat cggtgtgttc 420

aagggaccaa acggtttcga atacttcgct ccggctaaca cagacgctaa caacatcgag 480

ggccaggcta tcttgtacca aaacaagttc ctcactttga acggcaagaa gtactatttt 540

ggctctgaca gcaaggccgt cactggactg aggacaatcg atggcaagaa gtactacttt 600

aatactaaca cagccgttgc tgtgaccggc tggcagacta tcaacggaaa gaagtattat 660

ttcaatacca acacttcaat cgcttcgacc ggttacacta tcatctctgg caagcatttt 720

tattttaaca ccgacggcat catgcaaatc ggtgtcttca agggccccga tggcttcgaa 780

tacttcgccc ccgctaacac tgatgctaac aacatcgagg gacaggctat ccgttaccaa 840

aaccgcttcc tgtacctcca cgacaacatc tactacttcg gcaacaactc aaaggctgcc 900

acaggatggg tgaccatcga tggtaaccgt tactacttcg agcccaacac tgccatgggt 960

gctaacggct acaagacaat cgacaacaag aacttctact tccgcaacgg tctcccacag 1020

atcggcgtct tcaagggatc aaacggtttc gagtacttcg ctcctgccaa caccgacgcc 1080

aacaacatcg agggccaagc tatcaggtac caaaacagat tcctgcacct gctcggcaag 1140

atctactact tcggaaacaa ctcgaaggcc gttactggtt ggcagacaat caacggcaag 1200

gtgtactact tcatgccaga caccgctatg gctgccgctg gtggcctctt cgaaatcgac 1260

ggcgtgatct acttcttcgg cgttgatgga gtgaaggctc cgggtatcta cggctaa 1317

<210> 9

<211> 1820

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трехтоксинная вакцина BV1420

<220>

<221> прочее

<222> (595)..(595)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 9

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Arg Ala Arg Arg Arg Lys Lys

165 170 175

Arg Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn

180 185 190

Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile

195 200 205

Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr

210 215 220

Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Asp Tyr

225 230 235 240

Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg

245 250 255

Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys

260 265 270

Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr

275 280 285

Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly

290 295 300

Val Ser Val Asn Val Gly Tyr Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr

305 310 315 320

Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser

325 330 335

Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser

340 345 350

Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro

355 360 365

Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr

370 375 380

Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser

385 390 395 400

Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn

405 410 415

Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln

420 425 430

Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln

435 440 445

Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr

450 455 460

Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser

465 470 475 480

Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val

485 490 495

Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr

500 505 510

Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly

515 520 525

Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu

530 535 540

Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr

545 550 555 560

Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn

565 570 575

Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn

580 585 590

Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly

595 600 605

Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile

610 615 620

Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr

625 630 635 640

Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala

645 650 655

Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys

660 665 670

Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu

675 680 685

Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile

690 695 700

Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys

705 710 715 720

Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala

725 730 735

Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met

740 745 750

Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln

755 760 765

Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile

770 775 780

Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln

785 790 795 800

Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu

805 810 815

Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp

820 825 830

Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu Ser Val Asp Ala Ser Met Val Ser Gly

835 840 845

Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro Val Asn

850 855 860

Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe

865 870 875 880

Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu Thr Ile Ile Asp

885 890 895

Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val Leu Gln Thr Gly Val

900 905 910

Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Leu

915 920 925

Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile

930 935 940

Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val

945 950 955 960

Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr

965 970 975

Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr

980 985 990

Phe Asn Ser Asp Gly Val Met Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp

995 1000 1005

Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr

1010 1015 1020

Thr Glu Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu

1025 1030 1035

Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe

1040 1045 1050

Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile

1055 1060 1065

Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe

1070 1075 1080

Asp Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp

1085 1090 1095

Gly Ser Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile

1100 1105 1110

Gly Leu Ser Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp

1115 1120 1125

Gly Ile Met Gln Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe

1130 1135 1140

Tyr Phe Ser Asp Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile

1145 1150 1155

Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile

1160 1165 1170

Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala

1175 1180 1185

Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser

1190 1195 1200

Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr

1205 1210 1215

Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser

1220 1225 1230

Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly

1235 1240 1245

Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly

1250 1255 1260

Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr

1265 1270 1275

Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu

1280 1285 1290

Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly

1295 1300 1305

Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn

1310 1315 1320

Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly

1325 1330 1335

Trp Leu Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr

1340 1345 1350

Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr

1355 1360 1365

Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu Ser Arg Met

1370 1375 1380

Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1385 1390 1395

Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val

1400 1405 1410

Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe

1415 1420 1425

Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly

1430 1435 1440

Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly

1445 1450 1455

Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr

1460 1465 1470

Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

1475 1480 1485

Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser

1490 1495 1500

Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln

1505 1510 1515

Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro

1520 1525 1530

Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr

1535 1540 1545

Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly

1550 1555 1560

Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr Ile Asp Gly Lys

1565 1570 1575

Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val Thr Gly Trp

1580 1585 1590

Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ser

1595 1600 1605

Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe Tyr

1610 1615 1620

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

1625 1630 1635

Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn

1640 1645 1650

Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu

1655 1660 1665

His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr

1670 1675 1680

Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn

1685 1690 1695

Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn

1700 1705 1710

Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly

1715 1720 1725

Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn

1730 1735 1740

Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His

1745 1750 1755

Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val

1760 1765 1770

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Val Tyr Tyr Phe Met Pro

1775 1780 1785

Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu Phe Glu Ile Asp Gly

1790 1795 1800

Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys Ala Pro Gly Ile

1805 1810 1815

Tyr Gly

1820

<210> 10

<211> 842

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<220>

<221> прочее

<222> (595)..(595)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 10

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Arg Ala Arg Arg Arg Lys Lys

165 170 175

Arg Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn

180 185 190

Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile

195 200 205

Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr

210 215 220

Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Asp Tyr

225 230 235 240

Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg

245 250 255

Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys

260 265 270

Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr

275 280 285

Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly

290 295 300

Val Ser Val Asn Val Gly Tyr Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr

305 310 315 320

Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser

325 330 335

Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser

340 345 350

Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro

355 360 365

Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr

370 375 380

Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser

385 390 395 400

Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn

405 410 415

Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln

420 425 430

Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln

435 440 445

Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr

450 455 460

Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser

465 470 475 480

Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val

485 490 495

Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr

500 505 510

Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly

515 520 525

Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu

530 535 540

Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr

545 550 555 560

Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn

565 570 575

Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn

580 585 590

Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly

595 600 605

Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile

610 615 620

Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr

625 630 635 640

Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala

645 650 655

Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys

660 665 670

Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu

675 680 685

Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile

690 695 700

Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys

705 710 715 720

Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala

725 730 735

Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met

740 745 750

Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln

755 760 765

Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile

770 775 780

Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln

785 790 795 800

Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu

805 810 815

Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp

820 825 830

Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu Ser Val Asp

835 840

<210> 11

<211> 536

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 11

Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys

1 5 10 15

Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp

20 25 30

Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

35 40 45

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val Leu

50 55 60

Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro

65 70 75 80

Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr

85 90 95

Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr

100 105 110

Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met His Tyr Phe

115 120 125

Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp

130 135 140

Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met Gln Lys Gly Phe Val

145 150 155 160

Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys

165 170 175

Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn

180 185 190

Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr

195 200 205

Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile

210 215 220

Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp

225 230 235 240

Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser

245 250 255

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser

260 265 270

Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

275 280 285

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser

290 295 300

Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr

305 310 315 320

Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

325 330 335

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr

340 345 350

Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val

355 360 365

Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp

370 375 380

Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys

385 390 395 400

Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp

405 410 415

Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn

420 425 430

Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile

435 440 445

Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly

450 455 460

Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr

465 470 475 480

Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu

485 490 495

Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala

500 505 510

Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

515 520 525

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

530 535

<210> 12

<211> 438

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 12

Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr

20 25 30

Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

35 40 45

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

50 55 60

Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

65 70 75 80

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr

85 90 95

Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr

100 105 110

Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

115 120 125

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn

130 135 140

Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu

145 150 155 160

Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

165 170 175

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr

180 185 190

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val

195 200 205

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

210 215 220

Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe

225 230 235 240

Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

245 250 255

Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile

260 265 270

Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp

275 280 285

Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val

290 295 300

Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly

305 310 315 320

Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn

325 330 335

Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr

340 345 350

Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

355 360 365

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe

370 375 380

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys

385 390 395 400

Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

405 410 415

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys

420 425 430

Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

435

<210> 13

<211> 5466

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трехтоксинная вакцина BV1470

<220>

<221> прочее

<222> (1787)..(1787)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 13

atggaaatcg tcaacgaaga catcctgccg aacaacggtt tgatgggcta ctacttcacc 60

gatgagcact tcaaggacct gaagctcatg gctcctatca aggacggaaa cctgaagttc 120

gaggaaaaga aggtcgataa gctgctcgac aaggataaga gcgacgttaa gtcaatcagg 180

tggaccggca gaatcatccc atccaaggat ggagagtaca ctctctctac agaccgtgac 240

gatgtcttga tgcaggtgaa caccgaatcg actatctcca acactctgaa ggtgaacatg 300

aagaagggaa aggagtacaa ggtgcgcatc gaactgcaag ataagaacct cggttctatc 360

gacaacctct cctctccaaa cctctactgg gagttggatg gcatgaagaa gatcatcccg 420

gaggaaaact tgttcctgcg tgactacagc aacatcgaaa aggacgatcc cttcatccct 480

aacaacaact tcttcgatcc caagctgcgc gctcgccgcc gcaagaagcg catgtctgac 540

tgggaggacg aagatctcga caccgataac gacaacatcc ctgacagcta cgagcgcaac 600

ggatacacta tcaaggatct catcgctgtg aagtgggagg actccttcgc cgaacagggt 660

tacaagaagt acgtctcaaa ctacttggag tcgaacacag ctggtgaccc ctacaccgac 720

tacgaaaagg cctccggctc tttcgataag gctatcaaga ccgaggctag ggacccactc 780

gtcgctgctt accccatcgt gggagtcggt atggagaagt tgatcatcag cactaacgaa 840

cacgcttcaa ctgaccaggg caagacagtt tcaagagcca ccactaactc gaagaccgag 900

tccaacactg ctggcgtttc cgtgaacgtc ggctaccaga acggattcac cgccaacgtt 960

acaaccaact actcgcacac tacagataac tccaccgctg tgcaagactc taacggagag 1020

agctggaaca ctggtctgtc tatcaacaag ggcgaaagcg cttacatcaa cgccaacgtc 1080

cgctactaca acactggcac agcccccatg tacaaggtga cccctaccac taacctcgtc 1140

ttggatggag acacactgtc taccatcaag gctcaggaga accaaatcgg aaacaacctc 1200

agccccggtg acacataccc taagaaggga ttgtcaccac tggccctcaa cactatggac 1260

cagttcagct caaggttgat cccgatcaac tacgatcaac tcaagaagtt ggacgctggc 1320

aagcagatca agctggagac aacccaagtc tccggtaact tcggcaccaa gaactcgtcc 1380

ggccagatcg ttactgaagg aaacagctgg tcagattaca tctcacaaat cgactcgatc 1440

tccgcctcta tcatcctgga cacagagaac gaatcctacg agcgtcgcgt gaccgctaag 1500

aacttgcagg accccgagga caagacaccg gaactgacca tcggcgaggc catcgaaaag 1560

gctttcggtg ccaccaagaa ggacggcttg ctgtacttca acgatatccc tatcgacgag 1620

tcctgcgttg aactgatctt cgacgataac actgctaaca agatcaagga ttccctgaag 1680

acactctctg acaagaagat ctacaacgtg aagctcgaga ggggtatgaa catcttgatc 1740

aagaccccca cttacttcac aaacttcgac gattacaaca actaccnttc tacctggagc 1800

aacgtcaaca ctacaaacca ggacggactg caaggttcgg ccaacaagct caacggcgag 1860

accaagatca agatcccaat gagcgaactg aagccgtaca agagatacgt gttctcaggc 1920

tactcgaagg acccactcac tagcaactca atcatcgtga agatcaaggc taaggaggaa 1980

aagaccgact acctggtccc cgagcagggc tacactaagt tctcttacga gttcgaaacc 2040

actgagaagg actctagcaa catcgaaatc accctcatcg gcagcggaac aacctacttg 2100

gacaacctgt caatcaccga gttgaactcg actcccgaaa tcctggacga gcccgaagtc 2160

aagatcccta ccgatcagga gatcatggac gctcacaaga tctacttcgc cgacctgaac 2220

ttcaacccct ctactggaaa cacatacatc aacggcatgt acttcgctcc tacacaaacc 2280

aacaaggagg ccctggacta catccagaag taccgtgtcg aagccactct ccaatactcc 2340

ggtttcaagg atatcggcac aaaggacaag gagatgagga actacttggg tgacccaaac 2400

cagccgaaga ccaactacgt gaacctgaga tcatacttca ctggtggcga gaacatcatg 2460

acatacaaga agctgcgtat ctacgctatc acccctgacg accgtgaact cttggttttg 2520

tccgtggacg ctagcatggt cagcggtctc atctacatca acgactcgtt gtactacttc 2580

aagccccctg tgaacaacct gatcacaggt ttcgttaccg tgggcgacga taagtactac 2640

ttcaacccaa tcaacggtgg cgctgcctcc atcggcgaga ccatcatcga cgataagaac 2700

tactacttca accagagcgg agttctccaa actggtgtgt tctcaacaga ggacggtttc 2760

aagtacttcg ctccggccaa caccttggac gaaaacctgg agggtgaagc catcgacttc 2820

actggcaagt tgatcatcga tgagaacatc tactacttcg acgataacta ccgcggtgct 2880

gtggagtgga aggaactcga cggcgagatg cactacttct ctccagaaac cggcaaggcc 2940

ttcaagggat tgaaccagat cggtgactac aagtactact tcaactcgga tggcgtgatg 3000

caaaagggat tcgtctccat caacgacaac aagcactact tcgacgattc cggtgttatg 3060

aaagtgggct acacagagat cgacggcaag cacttctact tcgctgagaa cggagaaatg 3120

cagatcggtg tcttcaacac tgaagatggt ttcaagtact tcgcccacca caacgaagat 3180

ttgggcaacg aggaaggaga ggaaatcagc tactcaggca tcctgaactt caacaacaag 3240

atctactact tcgatgactc tttcaccgct gtggtcggat ggaaggacct ggaggatggt 3300

agcaagtact acttcgacga ggatactgct gaagcctaca tcggcctgtc gctcatcaac 3360

gacggacagt actacttcaa cgacgatggc atcatgcaag tcggattcgt taccatcaac 3420

gacaaggtgt tctacttctc ggattccggt atcatcgagt ctggcgtcca gaacatcgac 3480

gataactact tctacatcga cgataacgga atcgtgcaaa tcggtgtctt cgacacaagc 3540

gatggctaca agtacttcgc tcccgccaac accgtgaacg acaacatcta cggacaggct 3600

gtggagtact caggcctggt ccgtgttgga gaagacgtgt actacttcgg cgagacctac 3660

actatcgaaa ctggatggat ctacgacatg gagaacgaat ctgacaagta ctacttcaac 3720

cctgagacaa agaaggcctg caagggtatc aacctgatcg acgatatcaa gtactacttc 3780

gatgaaaagg gtatcatgcg caccggcctc atctcattcg aaaacaacaa ctactacttc 3840

aacgagaacg gagaaatgca attcggttac atcaacatcg aggacaagat gttctacttc 3900

ggagaagatg gtgtcatgca gatcggtgtt ttcaacactc cagacggctt caagtacttc 3960

gctcaccaaa acacactcga cgagaacttc gagggagaat ccatcaacta cactggttgg 4020

ttggacctgg atgagaagag gtactacttc accgacgaat acatcgctgc cactggctcc 4080

gtcatcatcg acggagagga atactacttc gacccggata cagcccagct ggtcatctct 4140

gaatctagaa tggtgaccgg tgtcttcaag ggtcccaacg gcttcgagta cttcgctccc 4200

gccaacactc acaacaacaa catcgaaggt caagctatcg tctaccaaaa caagttcttg 4260

accctgaacg gcaagaagta ttattttgac aacgattcta aggccgttac tggctggcaa 4320

acaatcgacg gaaagaagta ttatttcaat ctgaacactg ccgaggctgc caccggttgg 4380

cagactatcg atggcaagaa gtactacttt aacctcaaca ctgccgaagc tgccacagga 4440

tggcaaacca tcgacggcaa gaagtactat tttaacacaa acaccttcat cgcttctact 4500

ggctacacaa gcatcaacgg aaagcatttt tatttcaaca ccgatggaat catgcagatc 4560

ggtgtgttca agggaccaaa cggtttcgaa tacttcgctc cggctaacac agacgctaac 4620

aacatcgagg gccaggctat cttgtaccaa aacaagttcc tcactttgaa cggcaagaag 4680

tactattttg gctctgacag caaggccgtc actggactga ggacaatcga tggcaagaag 4740

tactacttta atactaacac agccgttgct gtgaccggct ggcagactat caacggaaag 4800

aagtattatt tcaataccaa cacttcaatc gcttcgaccg gttacactat catctctggc 4860

aagcattttt attttaacac cgacggcatc atgcaaatcg gtgtcttcaa gggccccgat 4920

ggcttcgaat acttcgcccc cgctaacact gatgctaaca acatcgaggg acaggctatc 4980

cgttaccaaa accgcttcct gtacctccac gacaacatct actacttcgg caacaactca 5040

aaggctgcca caggatgggt gaccatcgat ggtaaccgtt actacttcga gcccaacact 5100

gccatgggtg ctaacggcta caagacaatc gacaacaaga acttctactt ccgcaacggt 5160

ctcccacaga tcggcgtctt caagggatca aacggtttcg agtacttcgc tcctgccaac 5220

accgacgcca acaacatcga gggccaagct atcaggtacc aaaacagatt cctgcacctg 5280

ctcggcaaga tctactactt cggaaacaac tcgaaggccg ttactggttg gcagacaatc 5340

aacggcaagg tgtactactt catgccagac accgctatgg ctgccgctgg tggcctcttc 5400

gaaatcgacg gcgtgatcta cttcttcggc gttgatggag tgaaggctcc gggtatctac 5460

ggctaa 5466

<210> 14

<211> 2529

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<220>

<221> прочее

<222> (1787)..(1787)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 14

atggaaatcg tcaacgaaga catcctgccg aacaacggtt tgatgggcta ctacttcacc 60

gatgagcact tcaaggacct gaagctcatg gctcctatca aggacggaaa cctgaagttc 120

gaggaaaaga aggtcgataa gctgctcgac aaggataaga gcgacgttaa gtcaatcagg 180

tggaccggca gaatcatccc atccaaggat ggagagtaca ctctctctac agaccgtgac 240

gatgtcttga tgcaggtgaa caccgaatcg actatctcca acactctgaa ggtgaacatg 300

aagaagggaa aggagtacaa ggtgcgcatc gaactgcaag ataagaacct cggttctatc 360

gacaacctct cctctccaaa cctctactgg gagttggatg gcatgaagaa gatcatcccg 420

gaggaaaact tgttcctgcg tgactacagc aacatcgaaa aggacgatcc cttcatccct 480

aacaacaact tcttcgatcc caagctgcgc gctcgccgcc gcaagaagcg catgtctgac 540

tgggaggacg aagatctcga caccgataac gacaacatcc ctgacagcta cgagcgcaac 600

ggatacacta tcaaggatct catcgctgtg aagtgggagg actccttcgc cgaacagggt 660

tacaagaagt acgtctcaaa ctacttggag tcgaacacag ctggtgaccc ctacaccgac 720

tacgaaaagg cctccggctc tttcgataag gctatcaaga ccgaggctag ggacccactc 780

gtcgctgctt accccatcgt gggagtcggt atggagaagt tgatcatcag cactaacgaa 840

cacgcttcaa ctgaccaggg caagacagtt tcaagagcca ccactaactc gaagaccgag 900

tccaacactg ctggcgtttc cgtgaacgtc ggctaccaga acggattcac cgccaacgtt 960

acaaccaact actcgcacac tacagataac tccaccgctg tgcaagactc taacggagag 1020

agctggaaca ctggtctgtc tatcaacaag ggcgaaagcg cttacatcaa cgccaacgtc 1080

cgctactaca acactggcac agcccccatg tacaaggtga cccctaccac taacctcgtc 1140

ttggatggag acacactgtc taccatcaag gctcaggaga accaaatcgg aaacaacctc 1200

agccccggtg acacataccc taagaaggga ttgtcaccac tggccctcaa cactatggac 1260

cagttcagct caaggttgat cccgatcaac tacgatcaac tcaagaagtt ggacgctggc 1320

aagcagatca agctggagac aacccaagtc tccggtaact tcggcaccaa gaactcgtcc 1380

ggccagatcg ttactgaagg aaacagctgg tcagattaca tctcacaaat cgactcgatc 1440

tccgcctcta tcatcctgga cacagagaac gaatcctacg agcgtcgcgt gaccgctaag 1500

aacttgcagg accccgagga caagacaccg gaactgacca tcggcgaggc catcgaaaag 1560

gctttcggtg ccaccaagaa ggacggcttg ctgtacttca acgatatccc tatcgacgag 1620

tcctgcgttg aactgatctt cgacgataac actgctaaca agatcaagga ttccctgaag 1680

acactctctg acaagaagat ctacaacgtg aagctcgaga ggggtatgaa catcttgatc 1740

aagaccccca cttacttcac aaacttcgac gattacaaca actaccnttc tacctggagc 1800

aacgtcaaca ctacaaacca ggacggactg caaggttcgg ccaacaagct caacggcgag 1860

accaagatca agatcccaat gagcgaactg aagccgtaca agagatacgt gttctcaggc 1920

tactcgaagg acccactcac tagcaactca atcatcgtga agatcaaggc taaggaggaa 1980

aagaccgact acctggtccc cgagcagggc tacactaagt tctcttacga gttcgaaacc 2040

actgagaagg actctagcaa catcgaaatc accctcatcg gcagcggaac aacctacttg 2100

gacaacctgt caatcaccga gttgaactcg actcccgaaa tcctggacga gcccgaagtc 2160

aagatcccta ccgatcagga gatcatggac gctcacaaga tctacttcgc cgacctgaac 2220

ttcaacccct ctactggaaa cacatacatc aacggcatgt acttcgctcc tacacaaacc 2280

aacaaggagg ccctggacta catccagaag taccgtgtcg aagccactct ccaatactcc 2340

ggtttcaagg atatcggcac aaaggacaag gagatgagga actacttggg tgacccaaac 2400

cagccgaaga ccaactacgt gaacctgaga tcatacttca ctggtggcga gaacatcatg 2460

acatacaaga agctgcgtat ctacgctatc acccctgacg accgtgaact cttggttttg 2520

tccgtggac 2529

<210> 15

<211> 1608

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<400> 15

atggtcagcg gtctcatcta catcaacgac tcgttgtact acttcaagcc ccctgtgaac 60

aacctgatca caggtttcgt taccgtgggc gacgataagt actacttcaa cccaatcaac 120

ggtggcgctg cctccatcgg cgagaccatc atcgacgata agaactacta cttcaaccag 180

agcggagttc tccaaactgg tgtgttctca acagaggacg gtttcaagta cttcgctccg 240

gccaacacct tggacgaaaa cctggagggt gaagccatcg acttcactgg caagttgatc 300

atcgatgaga acatctacta cttcgacgat aactaccgcg gtgctgtgga gtggaaggaa 360

ctcgacggcg agatgcacta cttctctcca gaaaccggca aggccttcaa gggattgaac 420

cagatcggtg actacaagta ctacttcaac tcggatggcg tgatgcaaaa gggattcgtc 480

tccatcaacg acaacaagca ctacttcgac gattccggtg ttatgaaagt gggctacaca 540

gagatcgacg gcaagcactt ctacttcgct gagaacggag aaatgcagat cggtgtcttc 600

aacactgaag atggtttcaa gtacttcgcc caccacaacg aagatttggg caacgaggaa 660

ggagaggaaa tcagctactc aggcatcctg aacttcaaca acaagatcta ctacttcgat 720

gactctttca ccgctgtggt cggatggaag gacctggagg atggtagcaa gtactacttc 780

gacgaggata ctgctgaagc ctacatcggc ctgtcgctca tcaacgacgg acagtactac 840

ttcaacgacg atggcatcat gcaagtcgga ttcgttacca tcaacgacaa ggtgttctac 900

ttctcggatt ccggtatcat cgagtctggc gtccagaaca tcgacgataa ctacttctac 960

atcgacgata acggaatcgt gcaaatcggt gtcttcgaca caagcgatgg ctacaagtac 1020

ttcgctcccg ccaacaccgt gaacgacaac atctacggac aggctgtgga gtactcaggc 1080

ctggtccgtg ttggagaaga cgtgtactac ttcggcgaga cctacactat cgaaactgga 1140

tggatctacg acatggagaa cgaatctgac aagtactact tcaaccctga gacaaagaag 1200

gcctgcaagg gtatcaacct gatcgacgat atcaagtact acttcgatga aaagggtatc 1260

atgcgcaccg gcctcatctc attcgaaaac aacaactact acttcaacga gaacggagaa 1320

atgcaattcg gttacatcaa catcgaggac aagatgttct acttcggaga agatggtgtc 1380

atgcagatcg gtgttttcaa cactccagac ggcttcaagt acttcgctca ccaaaacaca 1440

ctcgacgaga acttcgaggg agaatccatc aactacactg gttggttgga cctggatgag 1500

aagaggtact acttcaccga cgaatacatc gctgccactg gctccgtcat catcgacgga 1560

gaggaatact acttcgaccc ggatacagcc cagctggtca tctctgaa 1608

<210> 16

<211> 1317

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<400> 16

atggtgaccg gtgtcttcaa gggtcccaac ggcttcgagt acttcgctcc cgccaacact 60

cacaacaaca acatcgaagg tcaagctatc gtctaccaaa acaagttctt gaccctgaac 120

ggcaagaagt attattttga caacgattct aaggccgtta ctggctggca aacaatcgac 180

ggaaagaagt attatttcaa tctgaacact gccgaggctg ccaccggttg gcagactatc 240

gatggcaaga agtactactt taacctcaac actgccgaag ctgccacagg atggcaaacc 300

atcgacggca agaagtacta ttttaacaca aacaccttca tcgcttctac tggctacaca 360

agcatcaacg gaaagcattt ttatttcaac accgatggaa tcatgcagat cggtgtgttc 420

aagggaccaa acggtttcga atacttcgct ccggctaaca cagacgctaa caacatcgag 480

ggccaggcta tcttgtacca aaacaagttc ctcactttga acggcaagaa gtactatttt 540

ggctctgaca gcaaggccgt cactggactg aggacaatcg atggcaagaa gtactacttt 600

aatactaaca cagccgttgc tgtgaccggc tggcagacta tcaacggaaa gaagtattat 660

ttcaatacca acacttcaat cgcttcgacc ggttacacta tcatctctgg caagcatttt 720

tattttaaca ccgacggcat catgcaaatc ggtgtcttca agggccccga tggcttcgaa 780

tacttcgccc ccgctaacac tgatgctaac aacatcgagg gacaggctat ccgttaccaa 840

aaccgcttcc tgtacctcca cgacaacatc tactacttcg gcaacaactc aaaggctgcc 900

acaggatggg tgaccatcga tggtaaccgt tactacttcg agcccaacac tgccatgggt 960

gctaacggct acaagacaat cgacaacaag aacttctact tccgcaacgg tctcccacag 1020

atcggcgtct tcaagggatc aaacggtttc gagtacttcg ctcctgccaa caccgacgcc 1080

aacaacatcg agggccaagc tatcaggtac caaaacagat tcctgcacct gctcggcaag 1140

atctactact tcggaaacaa ctcgaaggcc gttactggtt ggcagacaat caacggcaag 1200

gtgtactact tcatgccaga caccgctatg gctgccgctg gtggcctctt cgaaatcgac 1260

ggcgtgatct acttcttcgg cgttgatgga gtgaaggctc cgggtatcta cggctaa 1317

<210> 17

<211> 2307

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трехтоксинная вакцина BV1512

<220>

<221> прочее

<222> (588)..(588)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 17

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp Ala Ser Met Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser

835 840 845

Asp Ile Glu Leu Glu Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Cys Glu Ile Asn

850 855 860

Val Ile Ser Asn Ile Asp Thr Gln Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Glu

865 870 875 880

Ala Lys Asn Leu Thr Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asp Glu Phe

885 890 895

Lys Leu Ile Glu Ser Ile Ser Asp Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gln Gln

900 905 910

Asn Glu Leu Glu Asp Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Glu

915 920 925

Thr Asp Glu Gly Phe Ser Ile Arg Phe Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu

930 935 940

Ser Ile Phe Val Glu Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn

945 950 955 960

His Ile Thr Glu Glu Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr

965 970 975

Val Asn Gly Lys Leu Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu

980 985 990

Val Asn Thr Leu Asn Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr

995 1000 1005

Asn Ser Ser Lys Glu Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys

1010 1015 1020

Val Gln Val Tyr Ala Gln Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile

1025 1030 1035

Thr Asp Ala Ala Lys Val Val Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp

1040 1045 1050

Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro Thr Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile

1055 1060 1065

Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly Val Ser Leu Gly Ala Ala Ile Lys

1070 1075 1080

Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp Pro Leu Leu Arg Gln Glu Ile Glu

1085 1090 1095

Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala Val Asn Leu Thr Thr Ala Thr Thr

1100 1105 1110

Ala Ile Ile Thr Ser Ser Leu Gly Ile Ala Ser Gly Phe Ser Ile

1115 1120 1125

Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu

1130 1135 1140

Val Asn Asn Glu Leu Val Leu Arg Asp Lys Ala Thr Lys Val Val

1145 1150 1155

Asp Tyr Phe Lys His Val Ser Leu Val Glu Thr Glu Gly Val Phe

1160 1165 1170

Thr Leu Leu Asp Asp Lys Ile Met Met Pro Gln Asp Asp Leu Val

1175 1180 1185

Ile Ser Glu Ile Asp Phe Asn Asn Asn Ser Ile Val Leu Gly Lys

1190 1195 1200

Cys Glu Ile Trp Arg Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr

1205 1210 1215

Asp Asp Ile Asp His Phe Phe Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg

1220 1225 1230

Glu Pro His Leu Ser Ile Tyr Asp Val Leu Glu Val Gln Lys Glu

1235 1240 1245

Glu Leu Asp Leu Ser Lys Asp Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro

1250 1255 1260

Asn Arg Val Phe Ala Trp Glu Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg

1265 1270 1275

Ser Leu Glu Asn Asp Gly Thr Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp

1280 1285 1290

Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr Trp Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala

1295 1300 1305

Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu Lys Pro Arg Tyr Glu Asp Thr Asn

1310 1315 1320

Ile Arg Ile Asn Leu Asp Ser Asn Thr Arg Ser Phe Ile Val Pro

1325 1330 1335

Ile Ile Thr Thr Glu Tyr Ile Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Ser Phe

1340 1345 1350

Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ser Gln Tyr Asn

1355 1360 1365

Met Gly Ile Asn Ile Glu Leu Ser Glu Ser Asp Val Trp Ile Ile

1370 1375 1380

Asp Val Asp Asn Val Val Arg Asp Val Thr Ile Glu Ser Asp Lys

1385 1390 1395

Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ile Glu Gly Ile Leu Ser Thr Leu Ser

1400 1405 1410

Ile Glu Glu Asn Lys Ile Ile Leu Asn Ser His Glu Ile Asn Phe

1415 1420 1425

Ser Gly Glu Val Asn Gly Ser Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe

1430 1435 1440

Ser Ile Leu Glu Gly Ile Asn Ala Ile Ile Glu Val Asp Leu Leu

1445 1450 1455

Ser Lys Ser Tyr Lys Leu Leu Ile Ser Gly Glu Leu Lys Ile Leu

1460 1465 1470

Met Leu Asn Ser Asn His Ile Gln Gln Lys Ile Asp Tyr Ile Gly

1475 1480 1485

Phe Asn Ser Glu Leu Gln Lys Asn Ile Pro Tyr Ser Phe Val Asp

1490 1495 1500

Ser Glu Gly Lys Glu Asn Gly Phe Ile Asn Gly Ser Thr Lys Glu

1505 1510 1515

Gly Leu Phe Val Ser Glu Leu Pro Asp Val Val Leu Ile Ser Lys

1520 1525 1530

Val Tyr Met Asp Asp Ser Lys Pro Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn

1535 1540 1545

Asn Leu Lys Asp Val Lys Val Ile Thr Lys Asp Asn Val Asn Ile

1550 1555 1560

Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys Asp Asp Ile Lys Ile Ser Leu Ser

1565 1570 1575

Leu Thr Leu Gln Asp Glu Lys Thr Ile Lys Leu Asn Ser Val His

1580 1585 1590

Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala Glu Ile Leu Lys Phe Met Asn Arg

1595 1600 1605

Lys Gly Asn Thr Asn Thr Ser Asp Ser Leu Met Ser Phe Leu Glu

1610 1615 1620

Ser Met Asn Ile Lys Ser Ile Phe Val Asn Phe Leu Gln Ser Asn

1625 1630 1635

Ile Lys Phe Ile Leu Asp Ala Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr

1640 1645 1650

Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe Ile Cys Asp Glu Asn Asp Asn Ile

1655 1660 1665

Gln Pro Tyr Phe Ile Lys Phe Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr

1670 1675 1680

Leu Tyr Val Gly Asn Arg Gln Asn Met Ile Val Glu Pro Asn Tyr

1685 1690 1695

Asp Leu Asp Asp Ser Gly Asp Ile Ser Ser Thr Val Ile Asn Phe

1700 1705 1710

Ser Gln Lys Tyr Leu Tyr Gly Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val

1715 1720 1725

Val Ile Ser Pro Asn Ile Tyr Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro

1730 1735 1740

Val Tyr Glu Thr Asn Asn Thr Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp

1745 1750 1755

Ala Asn Tyr Ile Asn Glu Lys Ile Asn Val Asn Ile Asn Asp Leu

1760 1765 1770

Ser Ile Arg Tyr Val Trp Ser Asn Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu

1775 1780 1785

Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn Lys Val Ser Gln Val Lys Ile Arg

1790 1795 1800

Phe Val Asn Val Phe Lys Asp Lys Thr Leu Ala Asn Lys Leu Ser

1805 1810 1815

Phe Asn Phe Ser Asp Lys Gln Asp Val Pro Val Ser Glu Ile Ile

1820 1825 1830

Leu Ser Phe Thr Pro Ser Tyr Tyr Glu Asp Gly Leu Ile Gly Tyr

1835 1840 1845

Asp Leu Gly Leu Val Ser Leu Tyr Asn Glu Lys Phe Tyr Ile Asn

1850 1855 1860

Asn Phe Gly Met Ser Arg Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro

1865 1870 1875

Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn

1880 1885 1890

Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu

1895 1900 1905

Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr

1910 1915 1920

Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn

1925 1930 1935

Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys

1940 1945 1950

Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln

1955 1960 1965

Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe Ile

1970 1975 1980

Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe

1985 1990 1995

Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn

2000 2005 2010

Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile

2015 2020 2025

Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn

2030 2035 2040

Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly

2045 2050 2055

Leu Arg Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr

2060 2065 2070

Ala Val Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile

2090 2095 2100

Ile Ser Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln

2105 2110 2115

Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro

2120 2125 2130

Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr

2135 2140 2145

Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly

2150 2155 2160

Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly Asn

2165 2170 2175

Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr

2180 2185 2190

Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro

2195 2200 2205

Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

2210 2215 2220

Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg

2225 2230 2235

Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe

2240 2245 2250

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly

2255 2260 2265

Lys Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly

2270 2275 2280

Gly Leu Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp

2285 2290 2295

Gly Val Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

2300 2305

<210> 18

<211> 835

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<220>

<221> прочее

<222> (588)..(588)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 18

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp

835

<210> 19

<211> 1030

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 19

Met Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asp Ile Glu Leu Glu

1 5 10 15

Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Cys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn Ile

20 25 30

Asp Thr Gln Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Glu Ala Lys Asn Leu Thr

35 40 45

Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asp Glu Phe Lys Leu Ile Glu Ser

50 55 60

Ile Ser Asp Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gln Gln Asn Glu Leu Glu Asp

65 70 75 80

Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Glu Thr Asp Glu Gly Phe

85 90 95

Ser Ile Arg Phe Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu Ser Ile Phe Val Glu

100 105 110

Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn His Ile Thr Glu Glu

115 120 125

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr Val Asn Gly Lys Leu

130 135 140

Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu Val Asn Thr Leu Asn

145 150 155 160

Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr Asn Ser Ser Lys Glu

165 170 175

Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys Val Gln Val Tyr Ala Gln

180 185 190

Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Thr Asp Ala Ala Lys Val Val

195 200 205

Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro Thr

210 215 220

Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly Val Ser

225 230 235 240

Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp Pro Leu Leu

245 250 255

Arg Gln Glu Ile Glu Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala Val Asn Leu Thr

260 265 270

Thr Ala Thr Thr Ala Ile Ile Thr Ser Ser Leu Gly Ile Ala Ser Gly

275 280 285

Phe Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro

290 295 300

Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Val Leu Arg Asp Lys Ala Thr Lys Val

305 310 315 320

Val Asp Tyr Phe Lys His Val Ser Leu Val Glu Thr Glu Gly Val Phe

325 330 335

Thr Leu Leu Asp Asp Lys Ile Met Met Pro Gln Asp Asp Leu Val Ile

340 345 350

Ser Glu Ile Asp Phe Asn Asn Asn Ser Ile Val Leu Gly Lys Cys Glu

355 360 365

Ile Trp Arg Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Asp Asp Ile

370 375 380

Asp His Phe Phe Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Glu Pro His Leu

385 390 395 400

Ser Ile Tyr Asp Val Leu Glu Val Gln Lys Glu Glu Leu Asp Leu Ser

405 410 415

Lys Asp Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro Asn Arg Val Phe Ala Trp

420 425 430

Glu Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp Gly Thr

435 440 445

Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr Trp

450 455 460

Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu Lys Pro

465 470 475 480

Arg Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Arg Ile Asn Leu Asp Ser Asn Thr Arg

485 490 495

Ser Phe Ile Val Pro Ile Ile Thr Thr Glu Tyr Ile Arg Glu Lys Leu

500 505 510

Ser Tyr Ser Phe Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ser

515 520 525

Gln Tyr Asn Met Gly Ile Asn Ile Glu Leu Ser Glu Ser Asp Val Trp

530 535 540

Ile Ile Asp Val Asp Asn Val Val Arg Asp Val Thr Ile Glu Ser Asp

545 550 555 560

Lys Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ile Glu Gly Ile Leu Ser Thr Leu Ser

565 570 575

Ile Glu Glu Asn Lys Ile Ile Leu Asn Ser His Glu Ile Asn Phe Ser

580 585 590

Gly Glu Val Asn Gly Ser Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe Ser Ile

595 600 605

Leu Glu Gly Ile Asn Ala Ile Ile Glu Val Asp Leu Leu Ser Lys Ser

610 615 620

Tyr Lys Leu Leu Ile Ser Gly Glu Leu Lys Ile Leu Met Leu Asn Ser

625 630 635 640

Asn His Ile Gln Gln Lys Ile Asp Tyr Ile Gly Phe Asn Ser Glu Leu

645 650 655

Gln Lys Asn Ile Pro Tyr Ser Phe Val Asp Ser Glu Gly Lys Glu Asn

660 665 670

Gly Phe Ile Asn Gly Ser Thr Lys Glu Gly Leu Phe Val Ser Glu Leu

675 680 685

Pro Asp Val Val Leu Ile Ser Lys Val Tyr Met Asp Asp Ser Lys Pro

690 695 700

Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn Asn Leu Lys Asp Val Lys Val Ile Thr

705 710 715 720

Lys Asp Asn Val Asn Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys Asp Asp Ile

725 730 735

Lys Ile Ser Leu Ser Leu Thr Leu Gln Asp Glu Lys Thr Ile Lys Leu

740 745 750

Asn Ser Val His Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala Glu Ile Leu Lys Phe

755 760 765

Met Asn Arg Lys Gly Asn Thr Asn Thr Ser Asp Ser Leu Met Ser Phe

770 775 780

Leu Glu Ser Met Asn Ile Lys Ser Ile Phe Val Asn Phe Leu Gln Ser

785 790 795 800

Asn Ile Lys Phe Ile Leu Asp Ala Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr

805 810 815

Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe Ile Cys Asp Glu Asn Asp Asn Ile Gln

820 825 830

Pro Tyr Phe Ile Lys Phe Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr

835 840 845

Val Gly Asn Arg Gln Asn Met Ile Val Glu Pro Asn Tyr Asp Leu Asp

850 855 860

Asp Ser Gly Asp Ile Ser Ser Thr Val Ile Asn Phe Ser Gln Lys Tyr

865 870 875 880

Leu Tyr Gly Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val Val Ile Ser Pro Asn

885 890 895

Ile Tyr Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro Val Tyr Glu Thr Asn Asn

900 905 910

Thr Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp Ala Asn Tyr Ile Asn Glu Lys

915 920 925

Ile Asn Val Asn Ile Asn Asp Leu Ser Ile Arg Tyr Val Trp Ser Asn

930 935 940

Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn Lys Val

945 950 955 960

Ser Gln Val Lys Ile Arg Phe Val Asn Val Phe Lys Asp Lys Thr Leu

965 970 975

Ala Asn Lys Leu Ser Phe Asn Phe Ser Asp Lys Gln Asp Val Pro Val

980 985 990

Ser Glu Ile Ile Leu Ser Phe Thr Pro Ser Tyr Tyr Glu Asp Gly Leu

995 1000 1005

Ile Gly Tyr Asp Leu Gly Leu Val Ser Leu Tyr Asn Glu Lys Phe

1010 1015 1020

Tyr Ile Asn Asn Phe Gly Met

1025 1030

<210> 20

<211> 438

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 20

Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr

20 25 30

Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

35 40 45

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

50 55 60

Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

65 70 75 80

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr

85 90 95

Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr

100 105 110

Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

115 120 125

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn

130 135 140

Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu

145 150 155 160

Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

165 170 175

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr

180 185 190

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val

195 200 205

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

210 215 220

Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe

225 230 235 240

Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

245 250 255

Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile

260 265 270

Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp

275 280 285

Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val

290 295 300

Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly

305 310 315 320

Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn

325 330 335

Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr

340 345 350

Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

355 360 365

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe

370 375 380

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys

385 390 395 400

Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

405 410 415

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys

420 425 430

Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

435

<210> 21

<211> 2351

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибридный белок Q-токсина

<220>

<221> прочее

<222> (588)..(588)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 21

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp Ala Ser Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser

835 840 845

Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val

850 855 860

Thr Val Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala

865 870 875 880

Ala Ser Ile Gly Glu Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn

885 890 895

Gln Ser Gly Val Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe

900 905 910

Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu

915 920 925

Ala Ile Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr

930 935 940

Phe Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly

945 950 955 960

Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu

965 970 975

Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met

980 985 990

Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp

995 1000 1005

Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His

1010 1015 1020

Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn

1025 1030 1035

Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu

1040 1045 1050

Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn

1055 1060 1065

Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Ala Val

1070 1075 1080

Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Tyr Phe Asp

1085 1090 1095

Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu Ile Asn Asp

1100 1105 1110

Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln Val Gly Phe

1115 1120 1125

Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser Gly Ile

1130 1135 1140

Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr Ile

1145 1150 1155

Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

1160 1165 1170

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile

1175 1180 1185

Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu

1190 1195 1200

Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp

1205 1210 1215

Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro

1220 1225 1230

Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile

1235 1240 1245

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile

1250 1255 1260

Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met

1265 1270 1275

Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly

1280 1285 1290

Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly

1295 1300 1305

Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu

1310 1315 1320

Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu Asp Glu Lys

1325 1330 1335

Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val

1340 1345 1350

Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gln

1355 1360 1365

Leu Val Ile Ser Glu Ser Arg Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly

1370 1375 1380

Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn

1385 1390 1395

Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr

1400 1405 1410

Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val

1415 1420 1425

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu

1430 1435 1440

Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys

1445 1450 1455

Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp

1460 1465 1470

Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe

1475 1480 1485

Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

1490 1495 1500

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

1505 1510 1515

Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn

1520 1525 1530

Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu

1535 1540 1545

Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr

1550 1555 1560

Gly Leu Arg Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

1565 1570 1575

Thr Ala Val Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys

1580 1585 1590

Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr

1595 1600 1605

Ile Ile Ser Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met

1610 1615 1620

Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1625 1630 1635

Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg

1640 1645 1650

Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe

1655 1660 1665

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly

1670 1675 1680

Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly

1685 1690 1695

Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu

1700 1705 1710

Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe

1715 1720 1725

Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

1730 1735 1740

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr

1745 1750 1755

Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn

1760 1765 1770

Gly Lys Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala

1775 1780 1785

Gly Gly Leu Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val

1790 1795 1800

Asp Gly Val Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly Thr Ser Met Val Ser

1805 1810 1815

Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro

1820 1825 1830

Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp Lys

1835 1840 1845

Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

1850 1855 1860

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val

1865 1870 1875

Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe

1880 1885 1890

Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile

1895 1900 1905

Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe

1910 1915 1920

Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly

1925 1930 1935

Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly

1940 1945 1950

Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly

1955 1960 1965

Val Met Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr

1970 1975 1980

Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp

1985 1990 1995

Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly

2000 2005 2010

Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn

2015 2020 2025

Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly

2030 2035 2040

Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe

2045 2050 2055

Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr

2060 2065 2070

Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu

2075 2080 2085

Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

2090 2095 2100

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp

2105 2110 2115

Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr

2120 2125 2130

Phe Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp

2135 2140 2145

Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn

2150 2155 2160

Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg

2165 2170 2175

Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu

2180 2185 2190

Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr

2195 2200 2205

Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile

2210 2215 2220

Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr

2225 2230 2235

Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn

2240 2245 2250

Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe

2255 2260 2265

Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr

2270 2275 2280

Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu

2285 2290 2295

Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu

2300 2305 2310

Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr

2315 2320 2325

Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

2330 2335 2340

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

2345 2350

<210> 22

<211> 835

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<220>

<221> прочее

<222> (588)..(588)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 22

Met Glu Ile Val Asn Glu Asp Ile Leu Pro Asn Asn Gly Leu Met Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu His Phe Lys Asp Leu Lys Leu Met Ala Pro

20 25 30

Ile Lys Asp Gly Asn Leu Lys Phe Glu Glu Lys Lys Val Asp Lys Leu

35 40 45

Leu Asp Lys Asp Lys Ser Asp Val Lys Ser Ile Arg Trp Thr Gly Arg

50 55 60

Ile Ile Pro Ser Lys Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Arg Asp

65 70 75 80

Asp Val Leu Met Gln Val Asn Thr Glu Ser Thr Ile Ser Asn Thr Leu

85 90 95

Lys Val Asn Met Lys Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Val Arg Ile Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asp Asn Leu Ser Ser Pro Asn Leu

115 120 125

Tyr Trp Glu Leu Asp Gly Met Lys Lys Ile Ile Pro Glu Glu Asn Leu

130 135 140

Phe Leu Arg Asp Tyr Ser Asn Ile Glu Lys Asp Asp Pro Phe Ile Pro

145 150 155 160

Asn Asn Asn Phe Phe Asp Pro Lys Leu Met Ser Asp Trp Glu Asp Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Thr Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ser Tyr Glu Arg Asn

180 185 190

Gly Tyr Thr Ile Lys Asp Leu Ile Ala Val Lys Trp Glu Asp Ser Phe

195 200 205

Ala Glu Gln Gly Tyr Lys Lys Tyr Val Ser Asn Tyr Leu Glu Ser Asn

210 215 220

Thr Ala Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Gly Ser Phe

225 230 235 240

Asp Lys Ala Ile Lys Thr Glu Ala Arg Asp Pro Leu Val Ala Ala Tyr

245 250 255

Pro Ile Val Gly Val Gly Met Glu Lys Leu Ile Ile Ser Thr Asn Glu

260 265 270

His Ala Ser Thr Asp Gln Gly Lys Thr Val Ser Arg Ala Thr Thr Asn

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Asn Thr Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr

290 295 300

Gln Asn Gly Phe Thr Ala Asn Val Thr Thr Asn Tyr Ser His Thr Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Thr Ala Val Gln Asp Ser Asn Gly Glu Ser Trp Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Val

340 345 350

Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Met Tyr Lys Val Thr Pro Thr

355 360 365

Thr Asn Leu Val Leu Asp Gly Asp Thr Leu Ser Thr Ile Lys Ala Gln

370 375 380

Glu Asn Gln Ile Gly Asn Asn Leu Ser Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Lys Gly Leu Ser Pro Leu Ala Leu Asn Thr Met Asp Gln Phe Ser Ser

405 410 415

Arg Leu Ile Pro Ile Asn Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Lys Gln Ile Lys Leu Glu Thr Thr Gln Val Ser Gly Asn Phe Gly Thr

435 440 445

Lys Asn Ser Ser Gly Gln Ile Val Thr Glu Gly Asn Ser Trp Ser Asp

450 455 460

Tyr Ile Ser Gln Ile Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ile Ile Leu Asp Thr

465 470 475 480

Glu Asn Glu Ser Tyr Glu Arg Arg Val Thr Ala Lys Asn Leu Gln Asp

485 490 495

Pro Glu Asp Lys Thr Pro Glu Leu Thr Ile Gly Glu Ala Ile Glu Lys

500 505 510

Ala Phe Gly Ala Thr Lys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Ile

515 520 525

Pro Ile Asp Glu Ser Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala

530 535 540

Asn Lys Ile Lys Asp Ser Leu Lys Thr Leu Ser Asp Lys Lys Ile Tyr

545 550 555 560

Asn Val Lys Leu Glu Arg Gly Met Asn Ile Leu Ile Lys Thr Pro Thr

565 570 575

Tyr Phe Thr Asn Phe Asp Asp Tyr Asn Asn Tyr Xaa Ser Thr Trp Ser

580 585 590

Asn Val Asn Thr Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ala Asn Lys

595 600 605

Leu Asn Gly Glu Thr Lys Ile Lys Ile Pro Met Ser Glu Leu Lys Pro

610 615 620

Tyr Lys Arg Tyr Val Phe Ser Gly Tyr Ser Lys Asp Pro Leu Thr Ser

625 630 635 640

Asn Ser Ile Ile Val Lys Ile Lys Ala Lys Glu Glu Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Leu Val Pro Glu Gln Gly Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr

660 665 670

Thr Glu Lys Asp Ser Ser Asn Ile Glu Ile Thr Leu Ile Gly Ser Gly

675 680 685

Thr Thr Tyr Leu Asp Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Asn Ser Thr Pro

690 695 700

Glu Ile Leu Asp Glu Pro Glu Val Lys Ile Pro Thr Asp Gln Glu Ile

705 710 715 720

Met Asp Ala His Lys Ile Tyr Phe Ala Asp Leu Asn Phe Asn Pro Ser

725 730 735

Thr Gly Asn Thr Tyr Ile Asn Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gln Thr

740 745 750

Asn Lys Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Gln Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr

755 760 765

Leu Gln Tyr Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met

770 775 780

Arg Asn Tyr Leu Gly Asp Pro Asn Gln Pro Lys Thr Asn Tyr Val Asn

785 790 795 800

Leu Arg Ser Tyr Phe Thr Gly Gly Glu Asn Ile Met Thr Tyr Lys Lys

805 810 815

Leu Arg Ile Tyr Ala Ile Thr Pro Asp Asp Arg Glu Leu Leu Val Leu

820 825 830

Ser Val Asp

835

<210> 23

<211> 536

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 23

Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys

1 5 10 15

Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp

20 25 30

Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

35 40 45

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val Leu

50 55 60

Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro

65 70 75 80

Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr

85 90 95

Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr

100 105 110

Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met His Tyr Phe

115 120 125

Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp

130 135 140

Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met Gln Lys Gly Phe Val

145 150 155 160

Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys

165 170 175

Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn

180 185 190

Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr

195 200 205

Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile

210 215 220

Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp

225 230 235 240

Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser

245 250 255

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser

260 265 270

Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

275 280 285

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser

290 295 300

Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr

305 310 315 320

Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

325 330 335

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr

340 345 350

Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val

355 360 365

Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp

370 375 380

Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys

385 390 395 400

Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp

405 410 415

Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn

420 425 430

Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile

435 440 445

Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly

450 455 460

Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr

465 470 475 480

Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu

485 490 495

Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala

500 505 510

Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

515 520 525

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

530 535

<210> 24

<211> 438

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 24

Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr

20 25 30

Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

35 40 45

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

50 55 60

Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

65 70 75 80

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr

85 90 95

Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr

100 105 110

Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr

115 120 125

Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn

130 135 140

Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu

145 150 155 160

Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

165 170 175

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr

180 185 190

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val

195 200 205

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn

210 215 220

Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe

225 230 235 240

Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro

245 250 255

Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile

260 265 270

Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp

275 280 285

Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val

290 295 300

Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly

305 310 315 320

Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn

325 330 335

Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr

340 345 350

Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile

355 360 365

Arg Tyr Gln Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe

370 375 380

Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys

385 390 395 400

Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

405 410 415

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys

420 425 430

Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

435

<210> 25

<211> 536

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 25

Met Val Ser Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys

1 5 10 15

Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp

20 25 30

Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

35 40 45

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val Leu

50 55 60

Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro

65 70 75 80

Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile Asp Phe Thr

85 90 95

Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr

100 105 110

Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly Glu Met His Tyr Phe

115 120 125

Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Asn Gln Ile Gly Asp

130 135 140

Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val Met Gln Lys Gly Phe Val

145 150 155 160

Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys

165 170 175

Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn

180 185 190

Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr

195 200 205

Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile

210 215 220

Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp

225 230 235 240

Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser

245 250 255

Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser

260 265 270

Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

275 280 285

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser

290 295 300

Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr

305 310 315 320

Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp

325 330 335

Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn Asp Asn Ile Tyr

340 345 350

Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg Val Gly Glu Asp Val

355 360 365

Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu Thr Gly Trp Ile Tyr Asp

370 375 380

Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys

385 390 395 400

Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp

405 410 415

Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn

420 425 430

Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile

435 440 445

Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly

450 455 460

Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr

465 470 475 480

Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu

485 490 495

Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala

500 505 510

Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

515 520 525

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

530 535

<210> 26

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетически синтезированный пептидный линкер

<400> 26

Gly Gly Gly Gly

1

<210> 27

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> последовательность сайта расщепления фурином

<400> 27

Arg Ala Arg Arg Arg Lys Lys Arg

1 5

<210> 28

<211> 24

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> последовательность сайта расщепления фурином

<400> 28

cgcgctcgcc gccgcaagaa gcgc 24

<---

Изобретение относится к способам и композициям для индукции иммунного ответа против C. difficile. В конкретных аспектах композиции представляют собой вакцины, содержащие мультимерные полипептиды, содержащие фрагменты нескольких токсинов бактерии. Эти полипептиды индуцируют эффективный иммунный ответ, тем самым обеспечивая лечение или профилактику инфекции.7 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 табл., 26 ил., 10 пр.

1. Мультивалентный иммуногенный полипептид для индукции иммунного ответа против Clostridium difficile (C. difficile), содержащий фрагменты по меньшей мере четырех белков-токсинов C. difficile, при этом фрагменты по меньшей мере четырех белков-токсинов C. difficile представляют собой:

(i) фрагмент бинарного токсина (CDT), содержащий рецептор-связывающий компонент бинарного токсина (CDTb), при этом последовательность фрагмента CDT по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:22;

(ii) фрагмент токсина A, содержащий укороченный рецептор-связывающий домен белка токсина A (TcdA), содержащий 19 повторов, при этом последовательность фрагмента токсина A по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:24;

(iii) первый фрагмент токсина B, содержащий рецептор-связывающий домен первого белка токсина B, при этом последовательность первого фрагмента токсина B по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID 15 NO:23; и

(iv) второй фрагмент токсина B, содержащий рецептор-связывающий домен второго белка токсина B, при этом последовательность второго фрагмента токсина B по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:25;

причем первый белок токсина B и второй белок токсина B получены из разных штаммов C. difficile.

2. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 1, характеризующийся тем, что по меньшей мере один белок токсина B получен из эпидемического штамма.

3. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 2, характеризующийся тем, что эпидемический штамм представляет собой штамм NAP1 (TcdB₍₀₂₇₎).

4. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 1, характеризующийся тем, что один из белков токсина B получен из штамма 630 (TcdB₍₀₀₃₎).

5. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 1, характеризующийся тем, что указанные фрагменты ориентированы так, что фрагмент токсина А располагается между двумя фрагментами токсина B.

6. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 1, характеризующийся тем, что указанный фрагмент CDT располагается со стороны N-конца одного или обоих фрагментов токсина B.

7. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 1, характеризующийся тем, что фрагмент CDT содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:22.

8. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 1, характеризующийся тем, что один из фрагментов токсина В содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:23.

9. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 1, характеризующийся тем, что второй фрагмент токсина В содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:25.

10. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 1, характеризующийся тем, что фрагмент токсина А содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:24.

11. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 1, характеризующийся тем, что каждый из фрагментов разделен линкером из двух аминокислот, линкером из трех аминокислот или линкером из четырех аминокислот.

12. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 11, характеризующийся тем, что указанные фрагменты разделены линкером из двух аминокислот, и указанный линкер выбран из группы, состоящей из аланина-серина (AS), лейцина-глутаминовой кислоты (LE) и серина-аргинина (SR).

13. Мультивалентный иммуногенный полипептид по п. 1, характеризующийся тем, что указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21.

14. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 1-13.

15. Способ получения полипептида по п. 1, включающий

(а) экспрессию полипептида в клетке-хозяине насекомого;

(b) очистку полипептида в присутствии неионогенного детергента в форме наночастиц и

(c) суспендирование наночастиц в фармацевтически приемлемом носителе, вспомогательном веществе или разбавителе.

16. Способ по п. 15, характеризующийся тем, что хозяин-насекомое представляет собой клетку Sf9.

17. Способ по п. 15 или 16, характеризующийся тем, что клетку-хозяина насекомого трансфицируют рекомбинантной бакуловирусной конструкцией в 15 подходящих для экспрессии полипептида условиях.

18. Вакцинная композиция для индукции иммунного ответа против Clostridium difficile, содержащая иммуногенный полипептид по любому из пп. 1-13 и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель.

19. Вакцинная композиция по п. 18, характеризующаяся тем, что указанная композиция содержит адьювант.

20. Вакцинная композиция по п. 18 или 19, характеризующаяся тем, что указанный адьювант представляет собой адьювант на основе сапонина.

21. Вакцинная композиция по любому из пп. 18-20, характеризующаяся тем, что адьювант на основе сапонина содержит матрикс фракции A и матрикс фракции C.

22. Вакцинная композиция по любому из пп. 18-21, характеризующаяся тем, что количество матрикса фракции A составляет от приблизительно 85% до приблизительно 92%, а остальная часть представляет собой матрикс фракции C.

23. Применение полипептида по любому из пп. 1-13 для производства медикамента для профилактики или лечения инфекции Clostridium Difficile.

24. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п. 14 для производства медикамента для профилактики или лечения инфекции Clostridium Difficile.

25. Наночастица, содержащая мультивалентный иммуногенный полипептид по любому из пп. 1-13 и неионогенный детергент.