КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ВЫЗЫВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ CLOSTRIDIUM DIFFICILE Российский патент 2022 года по МПК A61K39/08 A61K39/00 C07K14/33 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной патентной заявки США № 62/577661, поданной 28 сентября 2017 г., предварительной патентной заявки США № 62/576603, поданной 24 октября 2017 г., предварительной патентной заявки США № 62/577661, поданной 26 октября 2017 г., и предварительной патентной заявки США № 62/720617, поданной 21 августа 2018 г. Каждая из этих патентных заявок включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам, связанным с токсоидами Clostridium difficile, и вариантам их применения.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Clostridium difficile (C. difficile) является грамположительной анаэробной бактерией, связанной с желудочно-кишечным заболеванием у человека. Колонизация C. difficile, как правило, происходит в толстой кишке, если количество естественной кишечной микрофлоры уменьшается вследствие лечения антибиотиками. Инфекция может приводить к связанной с применением антибиотиков диарее и иногда псевдомембранозному колиту вследствие секреции гликозилирующих токсинов, токсина A и токсина B (308 и 270 кДа, соответственно), которые являются основными вирулентными факторами C. difficile.

В последнее десятилетие число и серьезность вспышек инфекции, вызываемой C. difficile (CDI), в больницах, домах престарелых и других учреждениях длительного ухода резко возросли. Ключевые факторы в этой эскалации включают появление гипервирулентных патогенных штаммов, более широкое использование антибиотиков, усовершенствованные методы обнаружения и повышенное содержание спор в воздухе в медицинских учреждениях.

Применение метронидазола и ванкомицина является общепринятым стандартом лечения антибиотиками при заболевании, вызываемом C. difficile (CDAD). Однако примерно 20% пациентов, получающих такое лечение, испытывают рецидив инфекции после первого эпизода CDI, и вплоть до 50% этих пациентов страдают от последующих рецидивов. Лечение рецидивов представляет собой очень серьезную проблему, и большинство рецидивов обычно происходят в течение одного месяца после предыдущего эпизода.

Гуморальные иммунные ответы на токсины C. difficile играют важную роль в предотвращении более тяжелого исхода или рецидива заболевания у людей. Результаты клинических испытаний указывают на наличие корреляции между высокими сывороточными концентрациями иммуноглобулина G против токсина A (при измерении в иммуноферментном анализе) и защитой от CDI или от рецидива после первичной CDI. Показано, что активная иммунизация инактивированными токсинами и пассивная иммунизация антителами против токсинов защищают животных от летального исхода при заражении. Кроме того, у хомяков, получавших лечение только ванкомицином, наблюдались более высокие показатели смертности, чем у тех, которые получали ванкомицин плюс антитела против токсина, это указывало на то, что вакцинация может иметь преимущества перед лечением антибиотиками.

В настоящее время отсутствует одобренный высокоэффективный неинвазивный метод лечения осложненной инфекции, вызываемой C. difficile (CDI). Соответственно, существует потребность в иммуногенных и/или терапевтических композициях, и способах их применения, направленных против C. difficile.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к токсоидам C. difficile и способам их применения для решения указанных и других проблем. Используемые в настоящем документе термины «токсоид», «мутантный токсин» и «полипептид» являются синонимами и используются взаимозаменяемо, если нет иных указаний. В одном аспекте изобретение относится к вакцине от C. difficile, в настоящее время оцениваемой в отношении эффективности и безопасности у субъектов, подверженных риску CDI. Выбор оптимальной дозы и режима вакцинации основан на результатах исследований, с учетом иммуногенности, безопасности, а также потенциала для краткосрочной и долгосрочной защиты.

В одном аспекте изобретение относится к способу вызывания иммунного ответа у человека против инфекции Clostridium difficile. Способ включает введение человеку эффективной дозы композиции, содержащей токсоид, то есть, полипептид, C. difficile, при этом композицию вводят по меньшей мере два раза. В одном варианте осуществления второе введение производят по меньшей мере через 7 дней после первого введения, и третье введение производят примерно через 30 дней после первого введения. В одном варианте осуществления третье введение производят примерно через 180 дней после первого введения. В одном варианте осуществления композицию вводят по меньшей мере три раза. В одном варианте осуществления второе введение производят примерно через 30 дней после первого введения, и третье введение производят примерно через 180 дней после первого или второго введения. В одном варианте осуществления третье введение производят по меньшей мере через 180 дней после первого введения.

В одном варианте осуществления вызываемый иммунный ответ включает нейтрализующее моноклональное антитело против токсина A. В одном варианте осуществления вызываемый иммунный ответ включает нейтрализующее моноклональное антитело против токсина B. В одном варианте осуществления вызываемый иммунный ответ включает нейтрализующее моноклональное антитело против токсина A и нейтрализующее моноклональное антитело против токсина B, при этом концентрация нейтрализующего моноклонального антитела составляет по меньшей мере 10 мкг/мл.

В одном варианте осуществления композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile, каждый из которых имеет чистоту по меньшей мере 90% или более. В одном варианте осуществления композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile в соотношении от примерно 3:1 до примерно 1:1. В способе по п. 1 композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile в соотношении 1:1. В одном варианте осуществления композиция содержит адъювант. В одном варианте осуществления композиция содержит адъювант на основе алюминия.

В одном варианте осуществления иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 60 дней. В одном варианте осуществления иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 180 дней после первой дозы. В одном варианте осуществления иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 180 дней после второй дозы. В одном варианте осуществления иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 365 дней после первой дозы. В одном варианте осуществления иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 365 дней после второй дозы. В одном варианте осуществления иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 540 дней после первой дозы. В одном варианте осуществления иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 540 дней после второй дозы.

В одном варианте осуществления второе введение производят по меньшей мере через 7 дней после первого введения, и третье введение производят по меньшей мере через 30 дней после первого введения. В одном варианте осуществления третье введение производят по меньшей мере через 30 дней после первого введения. В одном варианте осуществления второе введение производят по меньшей мере через 7 дней после первого введения, и третье введение производят по меньшей мере через 180 дней после первого или второго введения. В одном варианте осуществления третье введение производят по меньшей мере через 180 дней после первого введения. В одном варианте осуществления композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile, каждый из которых имеет чистоту по меньшей мере 90% или более.

В одном варианте осуществления композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile в соотношении от примерно 3:1 до примерно 1:1. В одном варианте осуществления композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile в соотношении 1:1. В одном варианте осуществления композиция содержит адъювант. В одном варианте осуществления композиция содержит адъювант на основе алюминия. В одном варианте осуществления иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 60 дней. В одном варианте осуществления иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 180 дней. В одном варианте осуществления иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 365 дней.

В одном варианте осуществления токсоид A C. difficile связан с адъювантом на основе алюминия. В одном варианте осуществления токсоид B C. difficile связан с адъювантом на основе алюминия. В одном варианте осуществления токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile являются лиофилизированными.

В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения первой дозы, при измерении примерно через 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения второй дозы, при измерении примерно через 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения третьей дозы, при измерении примерно через 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения первой дозы, при измерении примерно через 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения второй дозы, при измерении примерно через 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения третьей дозы, при измерении примерно в любой день из 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

В одном варианте осуществления композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека после получения третьей дозы, которая выше, при измерении примерно в любой день из 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

В одном варианте осуществления человек является сероотрицательным в отношении токсина B. В одном варианте осуществления человек является сероотрицательным в отношении токсина A. В одном варианте осуществления человек является сероотрицательным в отношении токсина A и токсина B. В одном варианте осуществления человек является сероположительным в отношении токсина B. В одном варианте осуществления человек является сероположительным в отношении токсина A. В одном варианте осуществления человек является сероположительным в отношении токсина A и токсина B.

В одном варианте осуществления токсоид представляет собой полипептид, содержащий SEQ ID NO: 4, в которой остаток метионина отсутствует. В одном варианте осуществления токсоид представляет собой полипептид, содержащий SEQ ID NO: 6, в которой остаток метионина отсутствует. В одном варианте осуществления токсоид включает обработанный формальдегидом токсин A C. difficile. В одном варианте осуществления токсоид включает обработанный формальдегидом токсин B C. difficile. В другом варианте осуществления токсоид представляет собой не обработанный формальдегидом полипептид.

В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 002. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 003. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 004. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 012. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 015. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 017. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 020. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 023. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 027. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 029. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 046. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 053. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 059. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 070. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 075. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 078. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 081. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 087. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 106. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 117. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 126. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 131. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile риботипа 154. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile токсинотипа 0. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile токсинотипа I. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile токсинотипа VIII. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile токсинотипа IV. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile токсинотипа III. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile токсинотипа XIII. В одном варианте осуществления причиной инфекции является C. difficile токсинотипа V.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1A-D: ФИГ. 1A-B - Относительное количество субъектов с показателями выше порогового значения* - Режим введения в месяцы 0, 1, 6 (популяция для оценки иммуногенности). Звездочка (*) соответствует ≥219 единицам нейтрализации/мл для токсина A (ФИГ. 1A) и ≥2586 единицам нейтрализации/мл для токсина B (ФИГ. 1B). Сыворотки не собирали в дни 8 и 15, и в месяце 4 в режиме введения по месяцам. ФИГ. 1C и ФИГ. 1D - Относительное количество субъектов с показателями выше порогового значения* - Режим введения в дни 1, 8, 30 (популяция для оценки иммуногенности). Звездочка (*) соответствует≥219 единицам нейтрализации/мл для токсина A (ФИГ. 1C) и ≥2586 единицам нейтрализации/мл для токсина B (ФИГ. 1D). Сыворотки не собирали в дни 8 и 15, и в месяце 4 в режиме введения по месяцам.

ФИГ. 2A-2D - ФИГ. 2A-B Средние геометрические значения концентраций - Режим введения в месяцы 0, 1, 6 (популяция для оценки иммуногенности). Пунктирная линия (--) соответствует 219 единицам нейтрализации/мл для токсина A (ФИГ. 2A) и 2586 единицам нейтрализации/мл для токсина B (ФИГ. 2B). Сыворотки не собирали в дни 8 и 15, и в месяце 4 в режиме введения по месяцам. ФИГ. 2C-D Средние геометрические значения концентраций - Режим введения в дни 1, 8, 30 (популяция для оценки иммуногенности). Пунктирная линия (--) соответствует 219 единицам нейтрализации/мл для токсина A (ФИГ. 2C) и 2586 единицам нейтрализации/мл для токсина B (ФИГ. 2D). Сыворотки не собирали в дни 8 и 15, и в месяце 4 в режиме введения по месяцам.

ФИГ. 3A-B - Обзор нежелательных явлений (популяция для оценки безопасности). Верхняя панель представляет режим введения в месяцы 0, 1, 6 (ФИГ. 3A). Нижняя панель представляет режим введения в дни 1, 8, 30 (ФИГ. 3B). Обратите внимание на периоды времени для регистрации предусмотренных протоколом нежелательных явлений: несерьезные вплоть до 1 месяца после дозы 3, серьезные вплоть до 6 месяцев после дозы 3 (то есть, периоды времени для регистрации были на 5 месяцев больше для режима введения по месяцам).

ФИГ. 4A-B - Средние геометрические значения концентраций - Токсин A (популяция для оценки иммуногенности). Верхняя панель представляет режим введения в месяцы 0, 1, 6 (ФИГ. 4A). Нижняя панель представляет режим введения в дни 1, 8, 30 (ФИГ. 4B). Пунктирная линия соответствует 219 единицам нейтрализации/мл для токсина A; Сыворотки не собирали в дни 8 и 15, и в месяце 4 в режиме введения по месяцам; Сыворотки не собирали в месяце 6 и в день 187 в режиме введения по дням.

ФИГ. 5A-B - Средние геометрические значения концентраций - Токсин B (популяция для оценки иммуногенности). Верхняя панель представляет режим введения в месяцы 0, 1, 6 (ФИГ. 5A). Нижняя панель представляет режим введения в дни 1, 8, 30. Пунктирная линия соответствует 2586 единицам нейтрализации/мл для токсина B (ФИГ. 5B). Сыворотки не собирали в дни 8 и 15, и в месяце 4 в режиме введения по месяцам; Сыворотки не собирали в месяце 6 и в день 187 в режиме введения по дням.

ФИГ. 6A-B - Средние геометрические значения концентраций в зависимости от исходного серостатуса - Токсин A (популяция для оценки иммуногенности). Верхняя панель представляет режим введения в месяцы 0, 1, 6 (ФИГ. 6A). Нижняя панель представляет режим введения в дни 1, 8, 30 (ФИГ. 6B). Пунктирная линия соответствует 219 единицам нейтрализации/мл для токсина A; Сыворотки не собирали в дни 8 и 15, и в месяце 4 в режиме введения по месяцам; Сыворотки не собирали в месяце 6 и день 187 в режиме введения по дням.

ФИГ. 7A-B - Средние геометрические значения концентраций в зависимости от исходного серостатуса - Токсин B (популяция для оценки иммуногенности). Верхняя панель представляет режим введения в месяцы 0, 1, 6 (ФИГ. 7A). Нижняя панель представляет режим введения в дни 1, 8, 30 (ФИГ. 7B). Пунктирная линия соответствует 2586 единицам нейтрализации/мл для токсина B. Сыворотки не собирали в дни 8 и 15, и в месяце 4 в режиме введения по месяцам; Сыворотки не собирали в месяце 6 и в день 187 в режиме введения по дням.

ФИГ. 8A-B - Средние геометрические значения концентраций в зависимости от исходного серостатуса - (режим введения по месяцам) - токсин A и токсин B (популяция для оценки иммуногенности). Верхняя панель представляет токсин A (ФИГ. 8A). Пунктирная линия соответствует 219 единицам нейтрализации/мл для токсина A. Нижняя панель представляет токсин B (ФИГ. 8B). Пунктирная линия соответствует 2586 единицам нейтрализации/мл для токсина B. Сыворотки не собирали в дни 8 и 15, и в месяце 4 в режиме введения по месяцам; Сыворотки не собирали в месяце 6 и в день 187 в режиме введения по дням.

ФИГ. 9A-B - Средние геометрические значения концентраций в зависимости от исходного серостатуса - (режим введения по дням) - токсин A и токсин B (популяция для оценки иммуногенности). Верхняя панель представляет токсин A (ФИГ. 9A). Пунктирная линия соответствует 219 единицам нейтрализации/мл для токсина A. Нижняя панель представляет токсин B (ФИГ. 9B). Пунктирная линия соответствует 2586 единицам нейтрализации/мл для токсина B. Сыворотки не собирали в дни 8 и 15, и в месяце 4 в режиме введения по месяцам; Сыворотки не собирали в месяце 6 и в день 187 в режиме введения по дням.

ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 соответствует аминокислотной последовательности токсина A дикого типа (TcdA) C. difficile 630.

SEQ ID NO: 2 соответствует аминокислотной последовательности токсина B дикого типа (TcdB) C. difficile 630.

SEQ ID NO: 3 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdA с мутацией в положениях 285 и 287 в сравнении с SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 4 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdA с мутацией в положениях 285, 287 и 700 в сравнении с SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 5 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdB с мутацией в положениях 286 и 288 в сравнении с SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 6 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdB с мутацией в положениях 286, 288 и 698 в сравнении с SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 7 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdA с мутацией в положениях 269, 272, 285, 287, 460, 462 и 700 в сравнении с SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 8 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdB с мутацией в положениях 270, 273, 286, 288, 461, 463 и 698 в сравнении с SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 9 соответствует последовательности ДНК, кодирующей токсин A дикого типа (TcdA) C. difficile 630.

SEQ ID NO: 10 соответствует последовательности ДНК, кодирующей токсин B дикого типа (TcdB) C. difficile 630.

SEQ ID NO: 11 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 12 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 13 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 14 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 15 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile R20291.

SEQ ID NO: 16 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 15.

SEQ ID NO: 17 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile CD196.

SEQ ID NO: 18 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 17.

SEQ ID NO: 19 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile VPI10463.

SEQ ID NO: 20 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 19.

SEQ ID NO: 21 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile R20291.

SEQ ID NO: 22 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 21.

SEQ ID NO: 23 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile CD196.

SEQ ID NO: 24 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 23.

SEQ ID NO: 25 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile VPI10463.

SEQ ID NO: 26 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 25.

SEQ ID NO: 27 соответствует последовательности ДНК локуса патогенности дикого типа C. difficile VPI10463.

SEQ ID NO: 28 соответствует аминокислотной последовательности остатков 101-293 в SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 29 соответствует аминокислотной последовательности остатков 1-542 в SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 30 соответствует аминокислотной последовательности остатков 101-293 в SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 31 соответствует аминокислотной последовательности остатков 1-543 в SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 32 соответствует аминокислотной последовательности остатков 543-809 в SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 33 соответствует аминокислотной последовательности остатков 544-767 в SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 34 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdA, при этом остатки 101, 269, 272, 285, 287, 460, 462, 541, 542, 543, 589, 655 и 700 могут представлять собой любую аминокислоту.

SEQ ID NO: 35 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdB, при этом остатки 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461, 463, 520, 543, 544, 587, 600, 653, 698 и 751 могут представлять собой любую аминокислоту.

SEQ ID NO: 36 соответствует аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdA C. difficile (A3-25 мАт).

SEQ ID NO: 37 соответствует аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdA C. difficile (A3-25 мАт).

SEQ ID NO: 38 соответствует аминокислотной последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdA C. difficile (A3-25 мАт).

SEQ ID NO: 39 соответствует аминокислотной последовательности CDR2 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdA C. difficile (A3-25 мАт).

SEQ ID NO: 40 соответствует аминокислотной последовательности CDR3 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdA C. difficile (A3-25 мАт).

SEQ ID NO: 41 соответствует аминокислотной последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdA C. difficile (A3-25 мАт).

SEQ ID NO: 42 соответствует аминокислотной последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdA C. difficile (A3-25 мАт).

SEQ ID NO: 43 соответствует аминокислотной последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdA C. difficile (A3-25 мАт).

SEQ ID NO: 44 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 45 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 46 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 47 соответствует последовательности ДНК, кодирующей SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 48 соответствует нуклеотидной последовательности иммуностимулирующего олигонуклеотида ODN CpG 24555.

SEQ ID NO: 49 соответствует аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B8-26 мАт).

SEQ ID NO: 50 соответствует аминокислотной последовательности сигнального пептида вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B8-26 мАт).

SEQ ID NO: 51 соответствует аминокислотной последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B8-26 мАт).

SEQ ID NO: 52 соответствует аминокислотной последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B8-26 мАт).

SEQ ID NO: 53 соответствует аминокислотной последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B8-26 мАт).

SEQ ID NO: 54 соответствует аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B8-26 мАт).

SEQ ID NO: 55 соответствует аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B8-26 мАт).

SEQ ID NO: 56 соответствует аминокислотной последовательности сигнального пептида вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B8-26 мАт).

SEQ ID NO: 57 соответствует аминокислотной последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B8-26 мАт).

SEQ ID NO: 58 соответствует аминокислотной последовательности CDR2 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B8-26 мАт).

SEQ ID NO: 59 соответствует аминокислотной последовательности CDR3 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B8-26 мАт).

SEQ ID NO: 60 соответствует аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B59-3 мАт).

SEQ ID NO: 61 соответствует аминокислотной последовательности сигнального пептида вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B59-3 мАт).

SEQ ID NO: 62 соответствует аминокислотной последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B59-3 мАт).

SEQ ID NO: 63 соответствует аминокислотной последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B59-3 мАт).

SEQ ID NO: 64 соответствует аминокислотной последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B59-3 мАт).

SEQ ID NO: 65 соответствует аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B59-3 мАт).

SEQ ID NO: 66 соответствует аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B59-3 мАт).

SEQ ID NO: 67 соответствует аминокислотной последовательности сигнального пептида вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B59-3 мАт).

SEQ ID NO: 68 соответствует аминокислотной последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B59-3 мАт).

SEQ ID NO: 69 соответствует аминокислотной последовательности CDR2 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B59-3 мАт).

SEQ ID NO: 70 соответствует аминокислотной последовательности CDR3 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B59-3 мАт).

SEQ ID NO: 71 соответствует аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B9-30 мАт).

SEQ ID NO: 72 соответствует аминокислотной последовательности сигнального пептида вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B9-30 мАт).

SEQ ID NO: 73 соответствует аминокислотной последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B9-30 мАт).

SEQ ID NO: 74 соответствует аминокислотной последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B9-30 мАт).

SEQ ID NO: 75 соответствует аминокислотной последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B9-30 мАт).

SEQ ID NO: 76 соответствует аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B9-30 мАт).

SEQ ID NO: 77 соответствует аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B9-30 мАт).

SEQ ID NO: 78 соответствует аминокислотной последовательности сигнального пептида вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B9-30 мАт).

SEQ ID NO: 79 соответствует аминокислотной последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B9-30 мАт).

SEQ ID NO: 80 соответствует аминокислотной последовательности CDR2 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B9-30 мАт).

SEQ ID NO: 81 соответствует аминокислотной последовательности CDR3 вариабельной области легкой цепи нейтрализующего антитела против TcdB C. difficile (B9-30 мАт).

SEQ ID NO: 82 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdB, при этом остатки в положениях 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461, 463, 520, 543, 544, 587, 600, 653, 698 и 751 могут представлять собой любую аминокислоту.

SEQ ID NO: 83 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdA с мутацией в положениях 269, 272, 285, 287, 460, 462 и 700 в сравнении с SEQ ID NO: 1, в которой остаток метионина в положении 1 отсутствует.

SEQ ID NO: 84 соответствует аминокислотной последовательности мутантного токсина A C. difficile с мутацией в положениях 285, 287 и 700 в сравнении с SEQ ID NO: 1, в которой остаток метионина в положении 1 отсутствует.

SEQ ID NO: 85 соответствует аминокислотной последовательности мутантного токсина B C. difficile с мутацией в положениях 270, 273, 286, 288, 461, 463 и 698 в сравнении с SEQ ID NO: 2, в которой остаток метионина в положении 1 отсутствует.

SEQ ID NO: 86 соответствует аминокислотной последовательности мутантного токсина B C. difficile с мутацией в положениях 286, 288 и 698 в сравнении с SEQ ID NO: 2, в которой остаток метионина в положении 1 отсутствует.

SEQ ID NO: 87 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2004013.

SEQ ID NO: 88 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2004111.

SEQ ID NO: 89 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2004118.

SEQ ID NO: 90 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2004205.

SEQ ID NO: 91 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2004206.

SEQ ID NO: 92 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2005022.

SEQ ID NO: 93 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2005088.

SEQ ID NO: 94 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2005283.

SEQ ID NO: 95 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2005325.

SEQ ID NO: 96 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2005359.

SEQ ID NO: 97 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2006017.

SEQ ID NO: 98 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2007070.

SEQ ID NO: 99 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2007217.

SEQ ID NO: 100 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2007302.

SEQ ID NO: 101 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2007816.

SEQ ID NO: 102 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2007838.

SEQ ID NO: 103 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2007858.

SEQ ID NO: 104 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2007886.

SEQ ID NO: 105 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2008222.

SEQ ID NO: 106 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2009078.

SEQ ID NO: 107 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2009087.

SEQ ID NO: 108 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2009141.

SEQ ID NO: 109 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 2009292.

SEQ ID NO: 110 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2004013.

SEQ ID NO: 111 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2004111.

SEQ ID NO: 112 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2004118.

SEQ ID NO: 113 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2004205.

SEQ ID NO: 114 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2004206.

SEQ ID NO: 115 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2005022.

SEQ ID NO: 116 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2005088.

SEQ ID NO: 117 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2005283.

SEQ ID NO: 118 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2005325.

SEQ ID NO: 119 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2005359.

SEQ ID NO: 120 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2006017.

SEQ ID NO: 121 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2006376.

SEQ ID NO: 122 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2007070.

SEQ ID NO: 123 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2007217.

SEQ ID NO: 124 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2007302.

SEQ ID NO: 125 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2007816.

SEQ ID NO: 126 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2007838.

SEQ ID NO: 127 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2007858.

SEQ ID NO: 128 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2007886.

SEQ ID NO: 129 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2008222.

SEQ ID NO: 130 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2009078.

SEQ ID NO: 131 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2009087.

SEQ ID NO: 132 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2009141.

SEQ ID NO: 133 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 2009292.

SEQ ID NO: 134 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 014.

SEQ ID NO: 135 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 015.

SEQ ID NO: 136 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 020.

SEQ ID NO: 137 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 023.

SEQ ID NO: 138 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 027.

SEQ ID NO: 139 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 029.

SEQ ID NO: 140 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 046.

SEQ ID NO: 141 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 014.

SEQ ID NO: 142 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 015.

SEQ ID NO: 143 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 020.

SEQ ID NO: 144 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 023.

SEQ ID NO: 145 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 027.

SEQ ID NO: 146 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 029.

SEQ ID NO: 147 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 046.

SEQ ID NO: 148 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 001.

SEQ ID NO: 149 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 002.

SEQ ID NO: 150 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 003.

SEQ ID NO: 151 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 004.

SEQ ID NO: 152 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 070.

SEQ ID NO: 153 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 075.

SEQ ID NO: 154 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 077.

SEQ ID NO: 155 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 081.

SEQ ID NO: 156 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 117.

SEQ ID NO: 157 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 131.

SEQ ID NO: 158 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 001.

SEQ ID NO: 159 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 002.

SEQ ID NO: 160 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 003.

SEQ ID NO: 161 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 004.

SEQ ID NO: 162 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 070.

SEQ ID NO: 163 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 075.

SEQ ID NO: 164 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 077.

SEQ ID NO: 165 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 081.

SEQ ID NO: 166 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 117.

SEQ ID NO: 167 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 131.

SEQ ID NO: 168 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 053.

SEQ ID NO: 169 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 078.

SEQ ID NO: 170 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 087.

SEQ ID NO: 171 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 095.

SEQ ID NO: 172 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 126.

SEQ ID NO: 173 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 053.

SEQ ID NO: 174 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 078.

SEQ ID NO: 175 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 087.

SEQ ID NO: 176 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 095.

SEQ ID NO: 177 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 126.

SEQ ID NO: 178 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 059.

SEQ ID NO: 179 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 059.

SEQ ID NO: 180 соответствует аминокислотной последовательности TcdA дикого типа C. difficile 106.

SEQ ID NO: 181 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 106.

SEQ ID NO: 182 соответствует аминокислотной последовательности TcdB дикого типа C. difficile 017.

SEQ ID NO: 183 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdA с мутацией в положениях 285, 287, 700, 972 и 978 в сравнении с SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 184 соответствует аминокислотной последовательности мутантного TcdB с мутацией в положениях 286, 288, 698, 970 и 976 в сравнении с SEQ ID NO: 2.

Каждая из SEQ ID NO: 185 - SEQ ID NO: 195 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина.

Каждая из SEQ ID NO: 196 - SEQ ID NO: 212 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина A.

Каждая из SEQ ID NO: 213 - SEQ ID NO: 222 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина B.

Каждая из SEQ ID NO: 223 - SEQ ID NO: 236 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина A.

Каждая из SEQ ID NO: 237 - SEQ ID NO: 243 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина B.

Каждая из SEQ ID NO: 244 - SEQ ID NO: 245 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина A.

Каждая из SEQ ID NO: 246 - SEQ ID NO: 249 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина B.

Каждая из SEQ ID NO: 250 - SEQ ID NO: 253 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина A.

SEQ ID NO: 254 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина.

Каждая из SEQ ID NO: 255 - SEQ ID NO: 263 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина A.

Каждая из SEQ ID NO: 264 - SEQ ID NO: 269 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина B.

Каждая из SEQ ID NO: 270 - SEQ ID NO: 275 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина.

Каждая из SEQ ID NO: 276 - SEQ ID NO: 323 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина A.

Каждая из SEQ ID NO: 324 - SEQ ID NO: 373 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина B.

Каждая из SEQ ID NO: 374 - SEQ ID NO: 421 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина A.

Каждая из SEQ ID NO: 422 - SEQ ID NO: 471 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина B.

Каждая из SEQ ID NO: 472 - SEQ ID NO: 519 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина A.

Каждая из SEQ ID NO: 568 - SEQ ID NO: 615 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина B.

Каждая из SEQ ID NO: 520 - SEQ ID NO: 567 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина A.

Каждая из SEQ ID NO: 616 - SEQ ID NO: 663 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина B.

Каждая из SEQ ID NO: 664 - SEQ ID NO: 711 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина A.

Каждая из SEQ ID NO: 712 - SEQ ID NO: 761 соответствует аминокислотной последовательности иллюстративного мутантного токсина B.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения разработали высоко иммуногенные и хорошо переносимые композиции и способы, которые могут быть использованы для лечения, облегчения, уменьшения риска развития и/или предотвращения инфекции, вызываемой C. difficile. Более конкретно, например, авторы изобретения определили, в числе прочего, иммуногенность вакцины от C. difficile при двух уровнях доз антигенов (суммарные дозы токсоидов 100 мкг и 200 мкг) в режиме введения 3 доз (в дни 1, 8 и 30) здоровым взрослым людям в возрасте 65-85 лет, на основании измерения уровней специфических для токсина A и токсина B C. difficile нейтрализующих антител в день 37 (через 7 дней после дозы 3). Авторы изобретения также определили, в числе прочего, иммуногенность вакцины от C. difficile при 2 уровнях доз антигенов (суммарные дозы токсоидов 100 мкг и 200 мкг) в режиме введения 3 доз (в месяцы 0, 1 и 6) здоровым взрослым людям в возрасте 65-85 лет, на основании измерения уровней специфических для токсина A и токсина B C. difficile нейтрализующих антител в месяце 7 (через 1 месяц после дозы 3). Авторы изобретения также определили, в числе прочего, иммуногенность вакцины от C. difficile при 2 уровнях доз антигенов (суммарные дозы токсоидов 100 мкг и 200 мкг) в режиме введения 3 доз (либо в дни 1, 8 и 30, либо в месяцы 0, 1 и 6) здоровым взрослым людям в возрасте 65-85 лет, на основании измерения уровней специфических для токсина A и токсина B C. difficile нейтрализующих антител в различные моменты времени после вакцинации; кинетику иммунного ответа у здоровых взрослых людей в возрасте 65-85 лет в течение по меньшей мере 12 месяцев после введения 3 доз вакцины от C. difficile; иммуногенность четвертой дозы вакцины от C. difficile на основании измерения уровней специфических для токсина A и токсина B C. difficile нейтрализующих антител в различные моменты времени после вакцинации; и кинетику иммунного ответа у здоровых взрослых людей в возрасте 65-85 лет в течение по меньшей мере 36 месяцев после введения четвертой дозы вакцины от C. difficile.

Предложены иллюстративные композиции. Например, предложены композиции, содержащие эффективное количество токсоида A и токсоида B C. difficile (например, от примерно 40 до примерно 500 мкг/дозу, например, примерно 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 1 50, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 или 500 мкг/дозу, например, от примерно 50 до примерно 100 мкг/дозу (масс/масс, общее количество токсоидов A и B в композиции)), при эффективном соотношении токсоидов A:B (например, примерно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 3:1, 3:2, или 1:1 токсоида A к токсоиду B по массе) и с достаточной чистотой (например, по меньшей мере от примерно 80 до примерно 100%, например, примерно 80, 85, 90, 95 или 90-100% (масс/масс)), с использованием одного или более введений (например, по меньшей мере двух, трех введений или доз) любым подходящим путем введения (например, внутримышечно), при этом все дозы в режиме введения нескольких доз соответствующим образом разделены во времени (например, с интервалом по меньшей мере от примерно одного до примерно десяти дней, например, примерно один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять, например, примерно семь дней). Промежуток времени (временной интервал) между дозами, как понятно специалистам в данной области, может варьироваться в зависимости от индивидуума, и такой интервал должен быть достаточно длинным (например, при измерении в днях), чтобы иммунный ответ от предыдущей дозы мог развиться (например, быть примирован) и никоим образом не был ингибирован последующей дозой (например, бустерной дозой или дозами).

В одном варианте осуществления композиция, используемая в режиме вакцинации по настоящему изобретению, содержит от примерно 40 до примерно 500 мкг/дозу токсоида A C. difficile. В одном из вариантов осуществления композиция содержит от примерно 50 до примерно 400 мкг/дозу токсоида A C. difficile. В одном варианте осуществления композиция содержит от примерно 50 до примерно 200 мкг/дозу токсоида A C. difficile. В одном варианте осуществления композиция содержит от примерно 50 до примерно 150 мкг/дозу. В одном варианте осуществления композиция содержит примерно 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 или 500 мкг/дозу токсоида A C. difficile. В одном варианте осуществления композиция содержит примерно 50 мкг/дозу токсоида A C. difficile. В другом варианте осуществления композиция содержит примерно 100 мкг/дозу токсоида A C. difficile.

В одном варианте осуществления композиция, используемая в режиме вакцинации по настоящему изобретению, содержит от примерно 40 до примерно 500 мкг/дозу токсоида B C. difficile. В одном варианте осуществления композиция содержит от примерно 50 до примерно 400 мкг/дозу токсоида B C. difficile. В одном варианте осуществления композиция содержит от примерно 50 до примерно 200 мкг/дозу токсоида B C. difficile. В одном варианте осуществления композиция содержит от примерно 50 до примерно 150 мкг/дозу. В одном варианте осуществления композиция содержит примерно 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 или 500 мкг/дозу токсоида B C. difficile. В одном варианте осуществления композиция содержит примерно 50 мкг/дозу токсоида B C. difficile. В другом варианте осуществления композиция содержит примерно 100 мкг/дозу токсоида B C. difficile.

В одном варианте осуществления композиция, используемая в режиме вакцинации по настоящему изобретению, содержит токсоид A и B C. difficile в дозах, раскрытых в настоящем документе. В одном варианте осуществления соотношение токсоидов A и B составляет 3:1, 3:2 или 1:1 токсоида A к токсоиду B по массе. В одном варианте осуществления соотношение токсоидов A и B составляет 1:3, 2:3 или 1:1 токсоида A к токсоиду B по массе. В одном варианте осуществления соотношение токсоидов A и B составляет 1:1 токсоида A к токсоиду B по массе.

В одном варианте осуществления композиция, используемая в режиме вакцинации по настоящему изобретению, содержит токсоиды A и B C. difficile с чистотой по меньшей мере от примерно 80 до примерно 100%. В одном варианте осуществления композиция, используемая в режиме вакцинации по настоящему изобретению, содержит токсоиды A и B C. difficile с чистотой по меньшей мере от примерно 90 до примерно 100%. В одном варианте осуществления композиция, используемая в режиме вакцинации по настоящему изобретению, содержит токсоиды A и B C. difficile с чистотой примерно 80, 85, 90, 95 или 100% (масс/масс).

В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят один раз. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят три раза. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят четыре раза.

В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза в одной и той же дозе. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят три раза в одной и той же дозе. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят четыре раза в одной и той же дозе.

В одном варианте осуществления композицию по настоящему изобретению вводят любым подходящим путем введения. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным или подкожным путями введения. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят подкожно или внутримышечно. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят внутримышечно.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения все дозы в режиме введения нескольких доз соответствующим образом разделены во времени. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза, при этом все дозы разделены интервалом, составляющим от примерно одного до примерно десяти дней. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза, при этом все дозы разделены интервалом, составляющим от примерно двух до девяти дней. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза, при этом все дозы разделены интервалом, составляющим примерно один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять дней. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза, при этом все дозы разделены интервалом, составляющим примерно шесть дней. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза, при этом все дозы разделены интервалом, составляющим примерно семь дней. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза, при этом все дозы разделены интервалом, составляющим примерно восемь дней. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза, при этом все дозы разделены интервалом, составляющим от примерно одного до примерно четырех месяцев. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза, при этом все дозы разделены интервалом, составляющим примерно один, два, три или четыре месяца. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза, при этом все дозы разделены интервалом, составляющим примерно один месяц. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят два раза, при этом все дозы разделены интервалом, составляющим примерно два месяца.

В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят три раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим от примерно одного до примерно десяти дней, и третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 15-45 дней. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят три раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим от примерно 5 до примерно 8 дней, и третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 20-35 дней. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят три раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим от примерно 6 до примерно 7 дней, и третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 25-35 дней. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят три раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим примерно семь дней, и третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 30 дней.

В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят три раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим от примерно одного до примерно четырех месяцев, и третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 5-10 месяцев. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят три раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим от примерно одного до двух месяцев, и третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 5-8 месяцев. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят три раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим примерно один месяц, и третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 6 месяцев. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят три раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим примерно один месяц, и третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 5 месяцев. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят три раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим примерно один месяц, и третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 7 месяцев.

В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят четыре раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим от примерно одного до примерно десяти дней, третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 15-45 дней, и четвертая доза с третьей дозой разделены интервалом, составляющим от примерно 6 месяцев до примерно 2 лет. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят четыре раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим от примерно 5 до примерно 8 дней, третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 20-35 дней, и четвертая доза с третьей дозой разделены интервалом, составляющим от примерно 10 месяцев до примерно 1,5 лет. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят четыре раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим от примерно 6 до примерно 7 дней, третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 25-35 дней, и четвертая доза с третьей дозой разделены интервалом, составляющим от примерно 11 месяцев до примерно 13 месяцев. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят четыре раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим примерно семь дней, третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 30 дней, и четвертая доза с третьей дозой разделены интервалом, составляющим 1 год.

В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят четыре раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим от примерно одного до примерно четырех месяцев, третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 5-10 месяцев, и четвертая доза с третьей дозой разделены интервалом, составляющим от примерно 6 месяцев до 2 лет. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят четыре раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим от примерно одного до двух месяцев, третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 5-8 месяцев, и четвертая доза с третьей дозой разделены интервалом, составляющим от примерно 10 месяцев до 1,5 лет. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят четыре раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим примерно один месяц, третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 6 месяцев, и четвертая доза с третьей дозой разделены интервалом, составляющим от примерно 11 месяцев до 13 месяцев. В одном варианте осуществления композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят четыре раза, при этом первая и вторая дозы разделены интервалом, составляющим примерно один месяц, третья доза с первой дозой разделены интервалом, составляющим примерно 6 месяцев, и четвертая доза с третьей дозой разделены интервалом, составляющим примерно 12 месяцев.

В одном варианте осуществления композиции, вводимые в любом из режимов введения нескольких доз, раскрытых в настоящем документе, вводят в одной и той же дозе (то есть, одно и то же количество токсоида A и/или B C. difficile). В одном варианте осуществления композиции, вводимые в любом из режимов введения нескольких доз, раскрытых в настоящем документе, являются одинаковыми (то есть, одна и та же доза и одни и те же ингредиенты).

В одном варианте осуществления композиции, вводимые в любом из режимов введения нескольких доз, раскрытых в настоящем документе, вводят в разных дозах. В одном варианте осуществления композиции, вводимые в любом из режимов введения нескольких доз, раскрытых в настоящем документе, вводят в одной и той же дозе антигенов (то есть, одно и то же количество токсоида A и/или B C. difficile), но они могут содержать разные ингредиенты (например, разные адъюванты).

В некоторых вариантах осуществления второе введение производят по меньшей мере через один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять дней после первого введения (например, в день 0), и третье введение производят по меньшей мере через примерно 20-200 (например, примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200, например, примерно 30 или примерно 180 дней) дней после первого введения. Например, способ может включать первое, второе и/или третье введения, при этом второе введение производят по меньшей мере через 7 дней после первого введения, и третье введение производят по меньшей мере через примерно 30 дней и/или по меньшей мере примерно 180 дней после первого или второго введения. В некоторых вариантах осуществления второе введение производят примерно через семь дней после первого введения, и третье введение производят примерно через 30 дней после первого введения.

После введения таких композиций с использованием таких способов хозяину/субъекту, как правило, наблюдается иммунный ответ, который, как правило, включает гуморальный иммунный ответ и может включать клеточный иммунный ответ.

В конкретных вариантах осуществления способ может включать введение иммуногенной композиции человеку, субъекту, имеющему риск развития инфекции. В некоторых вариантах осуществления субъект-человек может быть в возрасте по меньшей мере примерно 40, 50, 65 лет, или старше. В некоторых вариантах осуществления субъект-человек может быть в возрасте от примерно 40 до примерно 65 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект-человек может быть в возрасте 65-75 лет. Таким образом, также предложены способы введения композиций. Способы получения композиций описаны в настоящем документе и известны специалистам в данной области.

В одном аспекте изобретение относится к способам иммунизации субъекта (например, человека) против C. difficile путем введения ему композиции, содержащей один или более антигенов C. difficile. В одном аспекте изобретение относится к композиции, раскрытой в настоящем документе, для использования в способе иммунизации субъекта против C. difficile. В одном аспекте изобретение относится к композиции, раскрытой в настоящем документе, для использования в способе иммунизации субъекта против C. difficile. В одном варианте осуществления субъект-человек имеет возраст 40-90 лет. В одном варианте осуществления субъект-человек имеет возраст 50-85 лет. В одном варианте осуществления субъект-человек имеет возраст 60-85 лет. В одном из вариантов осуществления субъект-человек имеет возраст 65-85 лет. В одном варианте осуществления субъект-человек имеет возраст 65-69 лет. В одном из вариантов осуществления субъект-человек имеет возраст 70-79 лет. В одном варианте осуществления субъект-человек имеет возраст 75-79 лет. В одном варианте осуществления субъект-человек имеет возраст по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 или 90 лет. В одном варианте осуществления субъект-человек имеет возраст по меньшей мере 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 или 85 лет.

Например, соответствующая композиция может содержать всего примерно 50 или примерно 100 мкг (или примерно 50-100 мкг) токсоидов (токсоида A и токсоида B) C. difficile с примерным соотношением токсоида A и токсоида B, составляющим примерно 3:2, с добавлением или без добавления адъюванта (например, гидроксида алюминия). Для целей сравнения, антиген-содержащую композицию можно вводить одной группе субъектов, и плацебо композицию (например, 0,9% нормальный солевой раствор) вводить (например, по той же схеме) другой группе. Иммунологические данные и данные по безопасности можно получать от субъектов в конкретные дни (например, дни 0, 14, 30, 60, 180 и/или 210, и/или вплоть до 1000 дней после первого введения). Введение композиции можно производить, например, в день 0 (первое введение), примерно в день 7 (второе введение), примерно в день 30 (третье введение) и/или примерно в день 180 (альтернативное третье введение или четвертое введение).

Композиция может содержать токсоид A и токсоид B C. difficile с эффективным соотношением токсоидов A:B (например, примерно 3:1, 3:2 или 1:1 токсоида A к токсоиду B по массе) с достаточной чистотой (например, чистотой примерно 90% или выше (масс/масс)). Например, композиция может содержать высокоочищенный (например, >90% (масс/масс/)) препарат токсоидов A и B C. difficile с примерным соотношением токсоида A и токсоида B, составляющим примерно 3:2. Такие композиции могут быть получены с использованием любого из подходящих способов получения, например, описанных в WIPO патентной заявке WO/2012/143902, патенте США № 9187536 и WIPO патентной заявке WO/2014/060898, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

Используемый в настоящем документе термин «токсоид C. difficile» означает токсин C. difficile (токсин A или токсин B), который был частично или полностью инактивирован. Токсин является инактивированным, если он обладает меньшей токсичностью (например, 100%, 99%, 98%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% или меньшей токсичностью, включая любое промежуточное значение), чем необработанный токсин, при измерении, например, в in vitro анализе цитотоксичности или в анализе токсичности на животных. Токсоиды C. difficile могут быть получены путем очистки токсинов из культур C. difficile и инактивации токсинов химическим методом (например, путем обработки формальдегидом, глутаральдегидом, пероксидом или кислородом). Альтернативно, дикого типа или мутантные токсины C. difficile, которые не имеют, или имеют сниженную, токсичность, могут быть получены с использованием рекомбинантных методов и/или, альтернативно, химических сшивающих агентов. Например, можно вносить генетические мутации, приводящие к сниженной токсичности. Также могут быть получены дикого типа или мутантные токсины C. difficile, лишенные определенных областей для снижения токсичности.

Токсоид C. difficile, или мутантный токсин C. difficile, представляет собой молекулу, имеющую структуру, или последовательность, отличающуюся от соответствующей структуры, или последовательности, дикого типа, например, наличием сшивок в сравнении с соответствующей структурой дикого типа, и/или наличием по меньшей мере одной мутации в сравнении с соответствующей последовательностью дикого типа при оптимальном выравнивании, например, при помощи программы GAP или BESTFIT с использованием штрафа за делецию по умолчанию. Описанный в настоящем документе токсоид, или мутантный токсин, также обладает функциональным свойством (например, отсутствующей активностью глюкозилтрансферазы и/или отсутствующей активностью цистеиновой протеазы), которое отличается от соответствующего свойства молекулы дикого типа.

Описанный в настоящем документе токсоид может представлять собой любой из токсоидов, или мутантных токсинов, C. difficile, описанных в WIPO патентной заявке WO/2012/143902, патенте США № 9187536 и WIPO патентной заявке WO/2014/060898, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. То есть, токсоид, описанный в настоящем документе, может представлять собой любой из полипептидов, описанных в WIPO патентной заявке WO/2012/143902, патенте США № 9187536 и WIPO патентной заявке WO/2014/060898, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Токсин C. difficile из любого из штаммов дикого типа, описанных выше, может быть использован в качестве источника для получения токсоида, или мутантного токсина, C. difficile. Предпочтительно, C. difficile 630 является источником, из которого получают токсоид C. difficile.

В одном варианте осуществления токсоид представляет собой полипептид, имеющий любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 761, при этом с отсутствующим начальным остатком метионина, и при этом полипептид был обработан химическим сшивающим реагентом, таким как, например, формальдегид или EDC, как описано в настоящем документе, и/или был генетически мутирован. Более конкретно, в одном варианте осуществления токсоид представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-8, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28-35, 82-761.

Мутация может включать замену, делецию, укорочение или модификацию аминокислотного остатка дикого типа, обычно находящегося в данном положении. Предпочтительно, мутация представляет собой неконсервативную аминокислотную замену. Мутантные токсины по изобретению могут быть получены методами, известными в данной области для создания мутаций, такими как, например, сайт-направленный мутагенез, мутагенез с использованием мутагена (например, УФ света) и так далее. Предпочтительно, используют сайт-направленный мутагенез. Альтернативно, можно непосредственно синтезировать молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую соответствующую последовательность. Такие методы химического синтеза известны в данной области.

Мутантный токсин C. difficile по настоящему изобретению имеет по меньшей мере одну мутацию в домене глюкозилтрансферазы, в сравнении с соответствующим токсином дикого типа C. difficile. В одном варианте осуществления домен глюкозилтрансферазы имеет по меньшей мере две мутации. Предпочтительно, мутация приводит к уменьшению или устранению ферментной глюкозилтрансферазной активности токсина в сравнении с ферментной глюкозилтрансферазной активностью соответствующего токсина дикого типа C. difficile.

Иллюстративный токсоид A C. difficile имеет домен глюкозилтрансферазы, содержащий SEQ ID NO: 29, имеющую аминокислотную замену в положениях 285 и 287, и домен цистеиновой протеазы, содержащий SEQ ID NO: 32, имеющую аминокислотную замену в положении 158, относительно соответствующего токсина A дикого типа C. difficile. Например, такой мутантный TcdA C. difficile имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, в которой начальный остаток метионина отсутствует. В другом варианте осуществления мутантный токсин A C. difficile имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 84. Дополнительные примеры токсоида A C. difficile включают аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, которая имеет мутации D269A, R272A, D285A, D287A, E460A, R462A и C700A в сравнении с SEQ ID NO: 1, в которой начальный остаток метионина, необязательно, отсутствует. В другом варианте осуществления мутантный токсин A C. difficile имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 83.

Иллюстративный токсоид B C. difficile имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, в которой начальный остаток метионина отсутствует. В другом варианте осуществления мутантный токсин B C. difficile имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 86. Дополнительные примеры мутантного TcdB C. difficile включают аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8, которая имеет мутации D270A, R273A, D286A, D288A, D461A, K463A и C698A в сравнении с SEQ ID NO: 2, и при этом начальный остаток метионина в SEQ ID NO: 8, необязательно, отсутствует. В другом варианте осуществления мутантный токсин B C. difficile имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 85.

В дополнение к вызыванию иммунного ответа у млекопитающего токсоиды, описанные в настоящем документе, также имеют сниженную цитотоксичность в сравнении с соответствующим токсином дикого типа C. difficile. Предпочтительно, иммуногенные композиции являются безопасными и имеют минимальную (например, примерно уменьшение составляет 6-8 log₁₀), или не имеют, цитотоксичность в сравнении с цитотоксичностью соответствующего токсина дикого типа при введении млекопитающим.

Используемый в настоящем документе термин «цитотоксичность» является термином, принятым в данной области, и относится к апоптозной клеточной гибели и/или состоянию, в котором одна или более обычных биохимических или биологических функций клетки аберрантно нарушены в сравнении с функциями идентичной клетки в идентичных условиях, но в отсутствие цитотоксического средства. Токсичность можно количественно определять, например, в клетках или у млекопитающих, как количество средства, необходимое для вызывания гибели 50% клеток (то есть, EC₅₀ или ED₅₀, соответственно) или другими методами, известными в данной области.

Анализы для определения цитотоксичности известны в данной области, например, анализы округления клеток. Дополнительные иллюстративные анализы цитотоксичности, известные в данной области, включают анализы глюкозилирования, связанные с формированием изображения на люминесцентном фосфорном покрытии Ras, меченого [¹⁴C]глюкозой, и, предпочтительно, in vitro анализ цитотоксичности, описанный в WIPO патентной заявке WO/2012/143902, патенте США № 9187536 и WIPO патентной заявке WO/2014/060898, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, при этом EC₅₀ может означать концентрацию иммуногенной композиции, которая приводит к цитопатогенному эффекту для по меньшей мере примерно 50% клеток (CPE), предпочтительно, диплоидных фибробластов человека (например, клеток IMR90 (ATCC CCL-186™), в сравнении с идентичными клетками в идентичных условиях в отсутствие токсина. In vitro анализ цитотоксичности также можно использовать для оценки концентрации композиции, приводящей к ингибированию индуцируемого токсином дикого типа C. difficile цитопатогенного эффекта (CPE) для по меньшей мере примерно 50% клеток, предпочтительно, диплоидных фибробластов человека (например, клеток IMR90 (ATCC CCL-186™), в сравнении с идентичными клетками в идентичных условиях в отсутствие токсина.

В одном варианте осуществления цитотоксичность иммуногенной композиции снижена по меньшей мере примерно в 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000 раз, 14000 раз, 15000 раз, или более, в сравнении с соответствующим токисном дикого типа C. difficile.

В другом варианте осуществления цитотоксичность иммуногенной композиции снижена на величину по меньшей мере примерно 2-log₁₀, более предпочтительно, примерно 3-log₁₀, и наиболее предпочтительно, примерно 4-log₁₀, или более, в сравнении с соответствующим токсином дикого типа в идентичных условиях. Например, мутантный TcdB C. difficile может иметь величину EC₅₀ примерно 10^-9 г/мл при измерении в стандартном анализе цитопатогенного эффекта (CPE), в сравнении с иллюстративным TcdB дикого типа C. difficile, который может иметь величину EC₅₀ по меньшей мере примерно 10^-12 г/мл.

В другом варианте осуществления цитотоксичность мутантного токсина C. difficile характеризуется EC₅₀ по меньшей мере примерно 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл, 300 мкг/мл, 400 мкг/мл, 500 мкг/мл, 600 мкг/мл, 700 мкг/мл, 800 мкг/мл, 900 мкг/мл, 1000 мкг/мл, или более, при измерении, например, в in vitro анализе цитотоксичности. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления иммуногенные композиции и мутантные токсины биологически безопасны для введения млекопитающим.

В одном варианте осуществления токсоид представляет собой полипептид, имеющий любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 761, более конкретно, токсоид представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-8, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28-35, 82-761, в которой начальный остаток метионина отсутствует, и при этом полипептид был обработан химическим сшивающим реагентом, таким как, например, формальдегид или EDC, как описано в настоящем документе. Сшивание (также называемое в настоящем документе «химическая инактивация» или «инактивация») представляет собой процесс химического соединения двух или более молекул ковалентной связью. Термины «сшивающие реагенты», «перекрестно сшивающие реагенты» и «сшивающие средства» означают молекулы, способные вступать в реакцию и/или химически связываться с конкретными функциональными группами (первичными аминами, сульфгидрилами, карбоксилами, карбонилами и так далее) на пептидах, полипептидах, и/или белках. В одном варианте осуществления молекула может содержать два или более реакционноспособных концов, которые могут вступать в реакцию и/или химически связываться с конкретными функциональными группами (первичными аминами, сульфгидрилами, карбоксилами, карбонилами и так далее) на пептидах, полипептидах, и/или белках. Предпочтительно, химический сшивающий реагент является водорастворимым. В другом предпочтительном варианте осуществления химический сшивающий реагент представляет собой гетеробифункциональный сшивающий реагент. В другом варианте осуществления химический сшивающий реагент не является гетеробифункциональным сшивающим реагентом. Химические сшивающие реагенты известны в данной области.

Иллюстративные подходящие химические сшивающие реагенты включают формальдегид; формалин; ацетальдегид; пропиональдегид; водорастворимые карбодиимиды (RN=C=NR'), которые включают 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид, 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид мето-п-толуолсульфонат (CMC), N, N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC) и N, N'-диизопропилкарбодиимид (DIC), а также их производные; и N-гидроксисукцинимид (NHS); фенилглиоксаль; и/или UDP-диальдегид.

Предпочтительно, сшивающий реагент представляет собой EDC. Если полипептид мутантного токсина C. difficile химически модифицируют при помощи EDC (например, путем обработки полипептида EDC), в одном варианте осуществления полипептид имеет (a) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида. В одном варианте осуществления полипептид имеет (b) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида. В одном варианте осуществления полипептид имеет (c) по меньшей мере одну сшивку между карбоксильной группой на C-конце полипептида и аминогруппой на N-конце полипептида. В одном варианте осуществления полипептид имеет (d) по меньшей мере одну сшивку между карбоксильной группой на C-конце полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида. В одном варианте осуществления полипептид имеет (e) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина второго выделенного полипептида. В одном варианте осуществления полипептид имеет (f) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина второго выделенного полипептида. В одном варианте осуществления полипептид имеет (g) по меньшей мере одну сшивку между карбоксильной группой на C-конце полипептида и аминогруппой на N-конце второго выделенного полипептида. В одном варианте осуществления полипептид имеет (h) по меньшей мере одну сшивку между карбоксильной группой на C-конце полипептида и боковой цепью остатка лизина второго выделенного полипептида.

«Второй выделенный полипептид» означает любой выделенный полипептид, присутствующий во время реакции с EDC. В одном варианте осуществления второй выделенный полипептид представляет собой полипептид мутантного токсина C. difficile, имеющий последовательность, идентичную последовательности первого выделенного полипептида. В другом варианте осуществления второй выделенный полипептид представляет собой полипептид мутантного токсина C. difficile, имеющий последовательность, отличную от последовательности первого выделенного полипептида.

В одном варианте осуществления полипептид имеет по меньшей мере две модификации, выбранные из модификаций (a)-(d). В иллюстративном варианте осуществления полипептид имеет (a) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида, и (b) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида. В следующем варианте осуществления полипептид имеет по меньшей мере три модификации, выбранные из модификаций (a)-(d). В следующем варианте осуществления полипептид имеет модификации (a), (b), (c) и (d).

Если в процессе химической модификации при помощи EDC присутствует более, чем один мутантный полипептид, в одном варианте осуществления полученная композиция имеет по меньшей мере одну из модификаций (a)-(h). В одном варианте осуществления композиция имеет по меньшей мере две модификации, выбранные из модификаций (a)-(h). В следующем варианте осуществления композиция имеет по меньшей мере три модификации, выбранные из модификаций (a)-(h). В следующем варианте осуществления композиция имеет по меньшей мере четыре модификации, выбранные из модификаций (a)-(h). В другом варианте осуществления композиция имеет по меньшей мере по одной из всех модификаций (a)-(h).

В иллюстративном варианте осуществления полученная композиция имеет (a) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида; и (b) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида. В одном варианте осуществления композиция также имеет (c) по меньшей мере одну сшивку между карбоксильной группой на C-конце полипептида и аминогруппой на N-конце полипептида; и (d) по меньшей мере одну сшивку между карбоксильной группой на C-конце полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида.

В другом иллюстративном варианте осуществления полученная композиция имеет (e) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина второго выделенного полипептида; (f) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина второго выделенного полипептида; (g) по меньшей мере одну сшивку между карбоксильной группой на C-конце полипептида и аминогруппой на N-конце второго выделенного полипептида; и (h) по меньшей мере одну сшивку между карбоксильной группой на C-конце полипептида и боковой цепью остатка лизина второго выделенного полипептида.

В следующем иллюстративном варианте осуществления полученная композиция имеет (a) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида; (b) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида; (e) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина второго выделенного полипептида; и (f) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина второго выделенного полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления химический сшивающий реагент включает формальдегид, более предпочтительно, реагент включает формальдегид в отсутствие лизина. Глицин или другое подходящее соединение с первичным амином можно использовать в качестве гасителя в реакциях сшивания. Соответственно, в другом предпочтительном варианте осуществления химический реагент включает формальдегид, с использованием глицина.

В другом предпочтительном варианте осуществления химический сшивающий реагент включает EDC и NHS. Как известно в данной области, NHS может быть включен в протоколы сшивания при помощи EDC. Однако авторы изобретения неожиданно установили, что NHS может способствовать дополнительному снижению цитотоксичности мутантного токсина C. difficile в сравнении с соответствующим токсином дикого типа, в сравнении с генетически модифицированным токсином и в сравнении с генетически модифицированным токсином, который был химически сшит при помощи EDC. Смотри, например, пример 22, описанный в WIPO патентной заявке WO/2012/143902, патенте США № 9187536 и WIPO патентной заявке WO/2014/060898, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Соответственно, без связи с механизмом или теорией, полипептид мутантного токсина, имеющий фрагмент бета-аланина, связанный с боковой цепью по меньшей мере одного остатка лизина полипептида (например, в результате реакции полипептида мутантного токсина, EDC и NHS), может отличаться дополнительно сниженной цитотоксичностью мутантного токсина в сравнении с, например, токсином (дикого типа или мутантным) C. difficile, в котором отсутствует фрагмент бета-аланина.

Использование EDC и/или NHS также может включать использование глицина, или другого подходящего соединения с первичным амином, в качестве гасителя. В качестве гасителя можно использовать любое соединение, имеющее первичный амин, такое как, например, сложный метиловый эфир глицина и аланина. В предпочтительном варианте осуществления соединение-гаситель представляет собой не полимерный гидрофильный первичный амин. Примеры не полимерного гидрофильного первичного амина включают, например, аминосахара, аминоспирты и аминополиолы. Конкретные примеры не полимерного гидрофильного первичного амина включают глицин, этаноламин, глюкамин, функционализированный амином полиэтиленгликоль и функционализированные амином олигомеры этиленгликоля. В одном варианте осуществления химический сшивающий реагент не включает формальдегид. В одном варианте осуществления химический сшивающий реагент не включает формалин.

В одном аспекте изобретение относится к мутантному токсину, то есть, полипептиду, C. difficile, имеющему по меньшей мере одну боковую цепь аминокислоты, химически модифицированную EDC и не полимерным гидрофильным первичным амином, предпочтительно глицином. Полученные глициновые аддукты (например, в результате получения трижды мутантных токсинов вследствие обработки EDC, NHS и гашения глицином) могут способствовать снижению цитотоксичности мутантного токсина в сравнении с соответствующим токсином дикого типа.

В одном варианте осуществления, когда мутантный токсин, то есть, полипептид, C. difficile химически модифицируют при помощи EDC и глицина, полипептид имеет по меньшей мере одну модификацию за счет модификации полипептида при помощи EDC (например, по меньшей мере одну из любых модификаций (a)-(h), описанных выше), и по меньшей мере одну из следующих иллюстративных модификаций: (i) фрагмент глицина, связанный с карбоксильной группой на C-конце полипептида; (j) фрагмент глицина, связанный с боковой цепью по меньшей мере одного остатка аспарагиновой кислоты полипептида; и (k) фрагмент глицина, связанный с боковой цепью по меньшей мере одного остатка глутаминовой кислоты полипептида.

В одном варианте осуществления по меньшей мере одна аминокислота мутантного TcdA, то есть, полипептида, C. difficile химически сшита, и/или по меньшей мере одна аминокислота мутантного TcdB, то есть, полипептида, C. difficile химически сшита. Любой из мутантных токсинов, то есть, полипептидов, описанных в настоящем документе, может быть химически сшит. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна аминокислота полипептида, имеющего SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, и/или SEQ ID NO: 8, химически сшита. В одном варианте осуществления по меньшей мере один аминокислотный остаток полипептида, имеющего любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 761, является сшитым. Например, в одном варианте осуществления по меньшей мере один аминокислотный остаток полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-8, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28-35, 82-761, является сшитым. В другом варианте осуществления по меньшей мере один аминокислотный остаток полипептида, имеющего любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 183 - SEQ ID NO: 761, имеет модификацию, описанную выше, например, любую из модификаций (a)-(k), например, (a) по меньшей мере одну сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты полипептида и боковой цепью остатка лизина полипептида.

Например, по меньшей мере одна аминокислота может быть химически сшита средством, которое включает карбодиимид, например, EDC. Карбодиимиды могут вызывать образование ковалентной связи между свободным карбоксилом (например, из боковых цепей аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты) и аминогруппами (например, в боковой цепи остатков лизина), с созданием стабильных амидных связей.

В качестве другого примера, по меньшей мере одна аминокислота может быть химически сшита при помощи реагента, который включает NHS. Активированные сшивающие реагенты на основе NHS сложного эфира могут вступать в реакцию с первичными аминами (например, на N-конце каждой полипептидной цепи и/или на боковой цепи остатков лизина), с образованием амидной связи.

В другом варианте осуществления по меньшей мере одна аминокислота может быть химически сшита при помощи реагента, который включает EDC и NHS. Например, в одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, в которой остаток метионина в положении 1, необязательно, отсутствует, при этом полипептид имеет по меньшей мере одну боковую цепь аминокислоты, химически модифицированную при помощи EDC и NHS. В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, в которой остаток метионина в положении 1, необязательно, отсутствует, при этом полипептид имеет по меньшей мере одну боковую цепь аминокислоты, химически модифицированную при помощи EDC и NHS. В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 7, или SEQ ID NO: 8. Полипептид модифицирован путем обработки полипептида при помощи EDC и NHS.

Если мутантный токсин, то есть, полипептид, C. difficile химически модифицирован (например, путем обработки) EDC и NHS, в одном варианте осуществления полипептид имеет по меньшей мере одну модификацию за счет модификации полипептида при помощи EDC (например, по меньшей мере одну из модификаций (a)-(h), описанных выше) и (l) фрагмент бета-аланина, связанный с боковой цепью по меньшей мере одного остатка лизина полипептида.

В другом аспекте изобретение относится к мутантному токсину, то есть, полипептиду, C. difficile, при этом полипептид имеет по меньшей мере одну боковую цепь аминокислоты, химически модифицированную при помощи EDC, NHS и не полимерного гидрофильного первичного амина, предпочтительно глицина. В одном варианте осуществления полипептид имеет по меньшей мере одну модификацию, когда полипептид модифицирован при помощи EDC (например, по меньшей мере одну из модификаций (a)-(h), описанных выше), по меньшей мере одну модификацию, когда полипептид модифицирован при помощи глицина (например, по меньшей мере одну из модификаций (i)-(k), описанных выше) и (l) фрагмент бета-аланина, связанный с боковой цепью по меньшей мере одного остатка лизина полипептида.

В одном аспекте изобретение относится к мутантному токсину, то есть, полипептиду, C. difficile, в котором боковая цепь по меньшей мере одного остатка лизина полипептида связана с фрагментом бета-аланина. В одном варианте осуществления боковая цепь второго остатка лизина полипептида связана с боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты и/или с боковой цепью остатка глутаминовой кислоты. «Второй» остаток лизина полипептида включает остаток лизина полипептида, который не связан с фрагментом бета-аланина. Боковая цепь аспарагиновой кислоты и/или боковая цепь глутаминовой кислоты, с которой связан второй остаток лизина, может представлять собой боковую цепь полипептида, образующую внутримолекулярную сшивку, или боковую цепь второго полипептида, образующую межмолекулярную сшивку. В другом варианте осуществления боковая цепь по меньшей мере одного остатка аспарагиновой кислоты и/или боковая цепь по меньшей мере одного остатка глутаминовой кислоты полипептида связана с фрагментом глицина. Остаток аспарагиновой кислоты и/или остаток глутаминовой кислоты, который связан с фрагментом глицина, не связан также с остатком лизина.

В другом аспекте изобретение относится к мутантному токсину, то есть, полипептиду, C. difficile, в котором по меньшей мере одна боковая цепь аминокислоты токсина дикого типа C. difficile является химически модифицированной. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна боковая цепь аминокислоты токсина A дикого типа C. difficile и/или по меньшей мере одна боковая цепь аминокислоты токсина B дикого типа C. difficile является химически модифицированной при помощи EDC. Например, в одном варианте осуществления TcdA (SEQ ID NO: 1) и/или Tcdb (SEQ ID NO: 2) является химически модифицированным при помощи EDC. В другом варианте осуществления токсин дикого типа является химически модифицированным при помощи EDC и NHS. В одном варианте осуществления мутантный токсин, то есть, полипептид, включает химически модифицированный токсин A дикого типа, при этом токсин A дикого типа является любым из приведенных в Таблице 1. В другом варианте осуществления мутантный токсин, то есть, полипептид, включает химически модифицированный токсин B дикого типа, при этом токсин B дикого типа является любым из приведенных в Таблице 2.

Таблица 1: Штаммы C. difficile дикого типа Штамм C. difficile Токсин A, SEQ ID NO: 2004013 SEQ ID NO: 87 2004111 SEQ ID NO: 88 2004118 SEQ ID NO: 89 2004205 SEQ ID NO: 90 2004206 SEQ ID NO: 91 2005022 SEQ ID NO: 92 2005088 SEQ ID NO: 93 2005283 SEQ ID NO: 94 2005325 SEQ ID NO: 95 2005359 SEQ ID NO: 96 2006017 SEQ ID NO: 97 2006376 Н/П 2007070 SEQ ID NO: 98 2007217 SEQ ID NO: 99 2007302 SEQ ID NO: 100 2007816 SEQ ID NO: 101 2007838 SEQ ID NO: 102 2007858 SEQ ID NO: 103 2007886 SEQ ID NO: 104 2008222 SEQ ID NO: 105 2009078 SEQ ID NO: 106 2009087 SEQ ID NO: 107 2009141 SEQ ID NO: 108 2009292 SEQ ID NO: 109 001 SEQ ID NO: 148 002 SEQ ID NO: 149 003 SEQ ID NO: 150 012 (004) SEQ ID NO: 151 014 SEQ ID NO: 134 015 SEQ ID NO: 135 017 020 SEQ ID NO: 136 023 SEQ ID NO: 137 027 SEQ ID NO: 138 029 SEQ ID NO: 139 046 SEQ ID NO: 140 053 SEQ ID NO: 168 059 SEQ ID NO: 178 070 SEQ ID NO: 152 075 SEQ ID NO: 153 077 SEQ ID NO: 154 078 SEQ ID NO: 169 081 SEQ ID NO: 155 087 SEQ ID NO: 170 095 SEQ ID NO: 171 106 SEQ ID NO: 180 117 SEQ ID NO: 156 126 SEQ ID NO: 172 131 SEQ ID NO: 157 SE844 SEQ ID NO: 196 12087 SEQ ID NO: 197 K14 SEQ ID NO: 198 BI6 SEQ ID NO: 199 BI17 SEQ ID NO: 200 CH6230 SEQ ID NO: 201 SE881 SEQ ID NO: 202

Таблица 2 Штаммы C. difficile дикого типа Штамм C. difficile Токсин B, SEQ ID NO: 2004013 SEQ ID NO: 110 2004111 SEQ ID NO: 111 2004118 SEQ ID NO: 112 2004205 SEQ ID NO: 113 2004206 SEQ ID NO: 114 2005022 SEQ ID NO: 115 2005088 SEQ ID NO: 116 2005283 SEQ ID NO: 117 2005325 SEQ ID NO: 118 2005359 SEQ ID NO: 119 2006017 SEQ ID NO: 120 2006376 SEQ ID NO: 121 2007070 SEQ ID NO: 122 2007217 SEQ ID NO: 123 2007302 SEQ ID NO: 124 2007816 SEQ ID NO: 125 2007838 SEQ ID NO: 126 2007858 SEQ ID NO: 127 2007886 SEQ ID NO: 128 2008222 SEQ ID NO: 129 2009078 SEQ ID NO: 130 2009087 SEQ ID NO: 131 2009141 SEQ ID NO: 132 2009292 SEQ ID NO: 133 001 SEQ ID NO: 158 002 SEQ ID NO: 159 003 SEQ ID NO: 160 012 (004) SEQ ID NO: 161 014 SEQ ID NO: 141 015 SEQ ID NO: 142 017 SEQ ID NO: 182 020 SEQ ID NO: 143 023 SEQ ID NO: 144 027 SEQ ID NO: 145 029 SEQ ID NO: 146 046 SEQ ID NO: 147 053 SEQ ID NO: 173 059 SEQ ID NO: 179 070 SEQ ID NO: 162 075 SEQ ID NO: 163 077 SEQ ID NO: 164 078 SEQ ID NO: 174 081 SEQ ID NO: 165 087 SEQ ID NO: 175 095 SEQ ID NO: 176 106 SEQ ID NO: 181 117 SEQ ID NO: 166 126 SEQ ID NO: 177 131 SEQ ID NO: 167

В другом примере химически сшитого мутантного токсина, то есть, полипептида, C. difficile по меньшей мере одна аминокислота может быть химически сшита при помощи реагента, который включает формальдегид. Формальдегид может вступать в реакцию с аминогруппой N-концевого аминокислотного остатка и боковыми цепями аргинина, цистеина, гистидина и лизина. Формальдегид и глицин могут образовывать аддукт основания Шиффа, который может присоединяться к первичным N-концевым аминогруппам, остаткам аргинина и тирозина, и в меньшей степени к остаткам аспарагина, глутамина, гистидина и триптофана.

Говорят, что химический сшивающий реагент снижает цитотоксичность токсина, если обработанный токсин имеет меньшую токсичность (например, примерно на 100%, 99%, 95%, 90%, 80%, 75%, 60%, 50%, 25% или 10% меньшую токсичность), чем необработанный токсин в идентичных условиях, при измерении, например, в in vitro анализе цитотоксичности, или в анализе токсичности на животных.

Предпочтительно, химический сшивающий реагент снижает цитотоксичность мутантного токсина C. difficile на величину, соответствующую по меньшей мере примерно 2-log₁₀ снижению, более предпочтительно, примерно 3-log₁₀ снижению, и наиболее предпочтительно, примерно 4-log₁₀ снижению, или более, в сравнении с мутантным токсином в идентичных условиях, но в отсутствие химического сшивающего реагента. Химический сшивающий реагент предпочтительно снижает цитотоксичность мутантного токсина, в сравнении с токсином дикого типа, на величину, соответствующую по меньшей мере примерно 5-log₁₀ снижению, примерно 6-log₁₀ снижению, примерно 7-log₁₀ снижению, примерно 8-log₁₀ снижению, или более.

В другом предпочтительном варианте осуществления химически инактивированный мутантный токсин, то есть, полипептид, C. difficile имеет величину EC₅₀ более чем, или по меньшей мере, примерно 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл, 300 мкг/мл, 400 мкг/мл, 500 мкг/мл, 600 мкг/мл, 700 мкг/мл, 800 мкг/мл, 900 мкг/мл, 1000 мкг/мл или более, при измерении, например, в in vitro анализе цитотоксичности, таком как анализ, описанный в настоящем документе.

Условия реакции для взаимодействия мутантного токсина с химическим сшивающим реагентом находятся в пределах квалификации специалистов в данной области, и условия могут варьироваться в зависимости от используемого реагента. Однако авторы изобретения определили оптимальные условия реакции для обработки мутантного токсина, то есть, полипептида, C. difficile химическим сшивающим реагентом, с сохранением функциональных эпитопов и снижением цитотоксичности мутантного токсина в сравнении с соответствующим токсином дикого типа.

Предпочтительно, для обработки мутантного токсина сшивающим реагентом выбирают условия реакции так, что мутантный токсин имеет минимальную концентрацию от примерно 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, 2,0 мг/мл до максимума примерно 3,0, 2,5, 2,0, 1,5 или 1,25 мг/мл. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением для определения диапазона подходящих для реакции концентраций мутантного токсина. Наиболее предпочтительно, мутантный токсин имеет концентрацию для реакции, составляющую примерно 1,0-1,25 мг/мл.

В одном варианте осуществления реагент, используемый в реакции, имеет минимальную концентрацию примерно 1 мМ, 2 мМ, 3 мМ, 4 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 30 мМ, 40 мМ или 50 мМ, и максимальную концентрацию примерно 100 мМ, 90 мМ, 80 мМ, 70 мМ, 60 мМ или 50 мМ. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением для определения диапазона подходящих для реакции концентраций химического реагента.

В предпочтительном варианте осуществления, когда реагент включает формальдегид, используемая концентрация предпочтительно представляет собой любую концентрацию от примерно 2 мМ до 80 мМ, наиболее предпочтительно, примерно 40 мМ. В другом предпочтительном варианте осуществления, в котором реагент включает EDC, используемая концентрация предпочтительно представляет собой любую концентрацию от примерно 1,3 мМ до примерно 13 мМ, более предпочтительно, от примерно 2 мМ до 3 мМ, наиболее предпочтительно, примерно 2,6 мМ. В одном варианте осуществления концентрация EDC составляет не более 5 г/л, 4 г/л, 3 г/л, 2,5 г/л, 2 г/л, 1,5 г/л, 1,0 г/л, 0,5 г/л в расчете на общий объем реакционной смеси, предпочтительно, не более 1 г/л, более предпочтительно, не более 0,5 г/л.

Иллюстративное время реакции, в которой мутантный токсин обрабатывают химическим сшивающим реагентом, включает минимум примерно 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24, 36, 48 или 60 часов, и максимум примерно 14 дней, 12 дней, 10 дней, 7 дней, 5 дней, 3 дней, 2 дней, 1 день, или 12 часов, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 час. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением для определения диапазона подходящего времени реакции.

В предпочтительном варианте осуществления этап обработки мутантного токсина химическим сшивающим реагентом происходит в течение периода времени, достаточного для снижения цитотоксичности мутантного токсина C. difficile до величины EC₅₀, составляющей по меньшей мере примерно 1000 мкг/мл, в подходящих клетках человека, например, клетках IMR-90, в стандартном in vitro анализе цитотоксичности, в сравнении с идентичным мутантным токсином в отсутствие сшивающего реагента. Более предпочтительно, этап реакции проводят в течение периода времени, который по меньшей мере в два раза превышает, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере в три раза, или более, превышает, период времени, достаточный для снижения цитотоксичности мутантного токсина до величины EC₅₀, составляющей по меньшей мере примерно 1000 мкг/мл в подходящих клетках человека. В одном варианте осуществления время реакции не превышает примерно 168 часов (или 7 дней).

Например, в одном варианте осуществления, в котором реагент включает формальдегид, мутантный токсин предпочтительно обрабатывают реагентом в течение примерно 12 часов, что, как показано, является иллюстративным периодом времени, достаточным для снижения цитотоксичности мутантного токсина C. difficile до величины EC₅₀, составляющей по меньшей мере примерно 1000 мкг/мл в подходящих клетках человека, например, клетках IMR-90, в стандартном in vitro анализе цитотоксичности, в сравнении с идентичным мутантным токсином в отсутствие сшивающего реагента. В более предпочтительном варианте осуществления реакцию проводят в течение примерно 48 часов, что по меньшей мере примерно в три раза превышает период времени, достаточный для реакции. В таком варианте осуществления время реакции предпочтительно не превышает примерно 72 часа.

В другом варианте осуществления, когда реагент включает EDC, мутантный токсин предпочтительно обрабатывают реагентом в течение примерно 0,5 часа, более предпочтительно, по меньшей мере примерно 1 часа, или наиболее предпочтительно, примерно 2 часов. В одном варианте осуществления мутантный токсин обрабатывают EDC в течение не более примерно 5 часов, предпочтительно, не более примерно 3 часов, более предпочтительно, не более примерно 2 часов. В таком варианте осуществления время реакции предпочтительно не превышает примерно 6 часов.

Иллюстративное значение pH, при котором мутантный токсин обрабатывают химическим сшивающим реагентом, включает минимум примерно pH 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 или 7,5, и максимум примерно pH 8,5, 8,0, 7,5, 7,0 или 6,5. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением для определения диапазона подходящих значений pH. Предпочтительно, реакцию проводят при pH 6,5-7,5, предпочтительно при pH 7,0.

Иллюстративная температура, при которой мутантный токсин обрабатывают химическим сшивающим реагентом, включает минимальную температуру примерно 2°C, 4°C, 10°C, 20°C, 25°C или 37°C, и максимальную температуру примерно 40°C, 37°C, 30°C, 27°C, 25°C или 20°C. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением для определения диапазона подходящей для реакции температуры. Предпочтительно, реакцию проводят при примерно 20°C - 30°C, наиболее предпочтительно при примерно 25°C.

Иммуногенные композиции, описанные выше, могут содержать один мутантный токсин, то есть, полипептид, C. difficile (A или B). Соответственно, иммуногенные композиции могут находиться в отдельных флаконах (например, отдельном флаконе для композиции, содержащей мутантный токсин A C. difficile, и отдельном флаконе для композиции, содержащей мутантный токсин B C. difficile) в препарате или наборе. Иммуногенные композиции могут быть предназначены для одновременного, последовательного или раздельного использования.

В другом варианте осуществления иммуногенные композиции, описанные выше, могут содержать оба мутантных токсина, то есть, полипептида, C. difficile (A и B). Для иммуногенной композиции можно использовать любое сочетание описанных мутантного токсина A C. difficile и мутантного токсина B C. difficile. Соответственно, иммуногенные композиции можно объединять в одном флаконе (например, одном флаконе, содержащем как композицию, содержащую мутантный TcdA C. difficile, так и композицию, содержащую мутантный TcdB C. difficile). Предпочтительно, иммуногенные композиции содержат мутантный TcdA C. difficile и мутантный TcdB, то есть, полипептиды, C. difficile.

Например, в одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6, при этом по меньшей мере одна аминокислота в каждой из SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6 является химически сшитой. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция содержит мутантный токсин A C. difficile, который содержит SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 7, и мутантный токсин B C. difficile, который содержит SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, при этом по меньшей мере одна аминокислота каждого мутантного токсина C. difficile является химически сшитой.

В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 84 и SEQ ID NO: 83, и любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 85. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает SEQ ID NO: 84 и иммуногенную композицию, включающую SEQ ID NO: 86. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает SEQ ID NO: 83 и иммуногенную композицию, включающую SEQ ID NO: 85. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 85.

В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает полипептид, имеющий любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 761, и второй полипептид, имеющий любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 761, при этом полипептид был обработан химическим сшивающим реагентом, таким как, например, формальдегид или EDC, как описано в настоящем документе. Например, в одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает первый полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-8, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28-35, 82-761, и второй полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-8, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28-35, 82-761, при этом первый полипептид и второй полипептид были обработаны химическим сшивающим реагентом, таким как, например, формальдегид или EDC, как описано в настоящем документе.

В конкретных вариантах осуществления предпочтительно, если композиции, описанные в настоящем документе, проявляют иммуногенные свойства (например, индуцируют поддающийся обнаружению и/или нейтрализующий и/или защитный иммунный ответ) после соответствующего введения субъекту. Наличие нейтрализующего и/или защитного иммунного ответа может быть продемонстрировано, как описано выше, и/или путем демонстрации того, что инфекция, вызываемая патогеном (например, C. difficile), подвергается воздействию (например, уменьшается) у индивидуумов (например, людей или других животных), которым были введены материалы, описанные в настоящем документе, в сравнении с индивидуумами, которым не были введены данные материалы. Например, одному или более испытуемым субъектам (например, людям или не являющимся людьми субъектам) можно вводить любым подходящим путем введения и в любом режиме композицию, описанную в настоящем документе, а затем после соответствующего периода времени (например, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель) проводить контрольное заражение патогенным микроорганизмом. Можно проводить мониторинг животного(ых) в отношении иммунной функции (например, продуцирования антител, T-клеточной активности) после введения и/или заражения. Сыворотки можно анализировать на общий ответ в виде продуцирования антител или на экспрессию конкретных подтипов, с использованием, например, метода ELISA и/или анализа нейтрализации патогена. T-клеточную активность можно определять, например, путем измерения продуцирования IFN-γ после повторной стимуляции антигеном. Затем можно использовать статистический анализ (например, точный критерий Фишера, критерий Вилкоксона, критерий Манна-Уитни) данных для определения эффективности влияния материала на иммунный ответ.

Токсоиды A и/или B C. difficile, описанные в настоящем документе, можно объединять с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями для создания композиции перед введением хозяину. Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой материал, который не является нежелательным в биологическом, или ином, отношении, например, материал может быть введен субъекту без вызывания каких-либо нежелательных биологических эффектов или разрушительного взаимодействия с каким-либо из других компонентов фармацевтической композиции, в которой он содержится. Носитель, естественно, будет выбран для минимизации любой деградации активного ингредиента и минимизации любых нежелательных побочных эффектов у субъекта, как известно специалисту в данной области. Подходящие фармацевтические носители и их препараты описаны, например, в Remington's: The Science and Practice of Pharmacy, 27⁴' Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005) и могут быть соответствующим образом выбраны. Как правило, в препарате используют соответствующее количество фармацевтически приемлемой соли для придания препарату изотоничности. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают, но без ограничения, стерильную воду, солевой раствор, буферные растворы, такие как раствор Рингера и раствор декстрозы. Значение pH раствора, как правило, составляет от примерно 5 до примерно 8 или от примерно 7 до примерно 7,5. Другие носители включают носители для препаратов с замедленным высвобождением, такие как полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие полипептиды или их фрагменты. Матрицы могут иметь форму профилированных изделий, например, пленок, липосом или микрочастиц. Для специалистов в данной области будет очевидно, что некоторые носители могут быть более предпочтительными, в зависимости от, например, пути введения и концентрации вводимой композиции. Носители представляют собой носители, подходящие для введения людям или другим субъектам.

Как указано выше, иммунологическая композиция, как правило, представляет собой композицию, содержащую антиген(ы) C. difficile, и, после введения хозяину (например, животному), индуцирует или усиливает иммунный ответ, направленный против антигена (например, C. difficile). Такие ответы могут включать выработку антител (например, за счет стимуляции B-клеток) или T-клеточный ответ (например, цитолитический ответ), описанный выше, который может быть защитным и/или нейтрализующим. Защитный или нейтрализующий иммунный ответ может представлять собой ответ, который является разрушительным для инфекционного микроорганизма с соответствующим антигеном (например, из которого антиген был получен) и полезным для хозяина (например, за счет уменьшения или предотвращения инфекции). Описанные в настоящем документе защитные или нейтрализующие антитела и/или клеточные ответы могут быть направлены против антиген(ов) C. difficile, описанных в настоящем документе, особенно введенных в эффективном количестве и/или режиме. Такие антитела и/или клеточные ответы могут приводить к ослаблению или уменьшению степени тяжести, продолжительности и/или летальности инфекции, вызываемой C. difficile, при тестировании на животных. Как показано в примерах, композиции, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для индукции иммунного ответа против C. difficile. Иммунологическую композицию, которая при введении хозяину вызывает терапевтический (например, как правило, при введении во время активной инфекции) и/или защитный (например, как правило, при введении до или после активной инфекции), и/или нейтрализующий иммунный ответ, можно считать вакциной.

В одном варианте осуществления композиция индуцирует иммунный ответ. В предпочтительном варианте осуществления применение композиции приводит к уменьшению частоты первого начального эпизода инфекции, вызываемой C. difficile. Частота может быть уменьшена после первого введения композиции, после второго введения композиции и/или после третьего введения композиции в сравнении с частотой до первого введения композиции. В другом варианте осуществления применение композиции приводит к уменьшению частоты рецидивов инфекции, вызываемой C. difficile. Частота рецидивов инфекции может быть уменьшена после первого введения композиции, после второго введения композиции и/или после третьего введения композиции.

В другом варианте осуществления применение композиции приводит к уменьшению степени тяжести инфекции, вызываемой C. difficile. Например, продолжительность эпизода инфекции, вызываемой C. difficile, может быть уменьшена после первого введения композиции, после второго введения композиции и/или после третьего введения композиции в сравнении с частотой до первого введения композиции. Эпизод инфекции, вызываемой C. difficile, может включать, например, по меньшей мере два дня с по меньшей мере тремя случаями жидкого стула и/или необходимостью в приеме антибиотика для борьбы с инфекцией, вызываемой C. difficile. Продолжительность эпизода инфекции, вызываемой C. difficile, можно считать уменьшенной, если у пациента в течение по меньшей мере двух дней не наблюдается по меньшей мере три или более случаев жидкого стула и/или больше не требуется прием антибиотика для борьбы с инфекцией, вызываемой C. difficile.

В некоторых вариантах осуществления также предложены способы предотвращения, облегчения, уменьшения риска развития и/или лечения (например, устранения) инфекции, вызываемой C. difficile. Способы лечения одного или более болезненных состояний, вызываемых, или включающих участие, C. difficile, у субъекта включают введение субъекту по меньшей мере одной или более эффективных доз композиций, описанных в настоящем документе (например, содержащих антигены, например, токсоид A, токсоид B, C. difficile). Антигены можно вводить в количестве дозы, составляющем от примерно 1 до примерно 300 мкг (например, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 5, 20,· 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 и/или 300 мкг). Антигены можно вводить более одного раза в одинаковых или в разных количествах дозы. В конкретных вариантах осуществления антигены C. difficile можно вводить субъекту одним и тем же, или разными подходящими путями введения один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более раз. При введении нескольких доз дозы могут содержать примерно одинаковые или разные типы и/или количества антигенов C. difficile в каждой дозе. Дозы также могут быть разделены во времени одинаковыми или разными интервалами. Например, дозы могут быть разделены интервалами, составляющими примерно 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 или 96 часов, семь дней, 14 дней, 21 день, 30 дней, 40 дней, 50 дней, 60 дней, 70 дней, 80 дней, 90 дней, 100 дней, 110 дней, 120 дней, 130 дней, 140 дней, 150 дней, 160 дней, 170 дней, 180 дней, 190 дней, 200 дней, одну неделю, две недели, три недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, семь месяцев, восемь месяцев, девять месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 1,5 года, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, или любой промежуток времени до, после и/или в промежутке между этими периодами времени. В некоторых вариантах осуществления антигены C. difficile можно вводить отдельно или в сочетании с другими реагентами (например, антибиотиками). Такие другие реагенты можно вводить одновременно (или примерно одновременно) с такими же, или иными, антигенами C. difficile, или в иное время и/или с иной частотой. Другие варианты осуществления таких способов также могут быть подходящими, как может с легкостью определять специалист в данной области.

Также предложены способы иммунизации субъекта (такого как человек) путем введения ему любых таких композиций. В некоторых вариантах осуществления способы могут включать введение субъекту иммуногенной композиции (например, вакцины), содержащей эффективное количество (например, по меньшей мере от примерно 40 до примерно 500, например, от примерно 50 до примерно 100 мкг) токсоида A и токсоида B C. difficile (в совокупности, масс/масс) при эффективном соотношении токсоидов A:B (например, 3:1, 3:2, 1:1 по массе (масс/масс)) и с достаточной чистотой (например, по меньшей мере 90% (масс/масс)), с использованием одного или более введений (например, по меньшей мере три раза, с соответствующим разделением всех доз во времени (например, по меньшей мере примерно 7 дней)). Эффективное соотношение токсоидов A:B представляет собой любое соотношение, в котором они могут быть включены в композицию и индуцировать эффективный иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile.

В одном варианте осуществления способ может включать первое, второе и третье введения, при этом второе введение производят по меньшей мере через 7 дней после первого введения, и третье введение производят по меньшей мере через примерно 30 дней и/или по меньшей мере примерно 180 дней после первого и/или второго введения.

В некоторых вариантах осуществления способы могут приводить к индукции и/или усилению существующего иммунного ответа у человека, ранее подвергавшегося воздействию C. difficile (например, сероположительного человека, вторичный иммунный ответ).

В одном варианте осуществления у человека была незапланированная госпитализация в пределах 12 месяцев до первого введения композиции. В другом варианте осуществления человек находился в учреждении с квалифицированным медицинским уходом (учреждении по уходу за больными, которое предоставляет услуги по профессиональному уходу и реабилитации, как правило, после выписки из больницы) в пределах 12 месяцев до первого введения композиции. В другом варианте осуществления человек находился в доме для престарелых (например, учреждении интернатного типа, которое предоставляет профессиональные услуги по уходу и реабилитации, как правило, после выписки из больницы) в пределах 12 месяцев до первого введения композиции. В другом варианте осуществления человек два или более раз посещал отделение неотложной помощи в пределах 12 месяцев до первого введения композиции. В другом варианте осуществления человек имел 10 или более амбулаторных посещений (посещений для получения первичной и/или вторичной помощи, за исключением посещения аптек и психиатрических служб) в пределах 12 месяцев до первого введения композиции.

В другом варианте осуществления человеку вводили системный антибиотик в пределах 12 недель до первого введения композиции. В другом варианте осуществления человек имел значительное сопутствующее заболевание или контакт с учреждениями здравоохранения в пределах 12 месяцев до первого введения композиции. В другом варианте осуществления человек проходил 1 госпитализацию в стационаре на протяжении ≥2 ночей в пределах 12 месяцев до первого введения композиции. В другом варианте осуществления человек посещал отделение неотложной помощи ≥2 раз в пределах 12 месяцев до первого введения композиции. В другом варианте осуществления человек имел ≥10 амбулаторных посещений в пределах 12 месяцев до первого введения композиции. В другом варианте осуществления человек находится в учреждении с квалифицированным медицинским уходом в пределах 12 месяцев до первого введения композиции. В другом варианте осуществления человек находится в доме для престарелых в пределах 12 месяцев до первого введения композиции. В другом варианте осуществления для человека запланирована госпитализация в стационаре на протяжении ≥2 ночей через ≥37 дней после рандомизации в пределах 12 месяцев до первого введения композиции. В другом варианте осуществления человек получал системные антибиотики в любое время в пределах 12 недель, предшествующих первому введению композиции.

В конкретных вариантах осуществления человек работает, или имеет контакты, в любом из следующих учреждений в пределах 12 месяцев до первого введения композиции: больница, учреждение с квалифицированным медицинским уходом (учреждение по уходу за больными, которое предоставляет услуги по профессиональному уходу и реабилитации, как правило, после выписки из больницы), дом для престарелых (например, учреждение интернатного типа, которое предоставляет профессиональные услуги по уходу и реабилитации, как правило, после выписки из больницы), отделение неотложной помощи и амбулаторное учреждение (посещение для получения первичной и/или вторичной помощи, за исключением посещения аптек и психиатрических служб).

В конкретных вариантах осуществления человек(люди) мог, в течение 12-месячного периода времени до первого введения, по меньшей мере один или два раза пребывать в больнице, каждый раз в течение по меньшей мере примерно 24, 48 или 72 часов, или более, и/или получал системные (не топические) антибиотики; и/или, ему предстоит госпитализация для запланированной хирургической операции в пределах примерно 60 дней после первого введения. В некоторых вариантах осуществления ожидаемое/предстоящее пребывание в больнице/госпитализация может планироваться на срок примерно 24, 48-72 часа, или более, и причиной может являться операция с вовлечением по меньшей мере одной из: мочеполовой системы, скелетно-мышечной системы, дыхательной системы, системы кровообращения и центральной нервной системы.

Предпочтительно, если иммунный ответ, вызываемый в результате использования данных способов, является достаточным для предотвращения и/или облегчения, и/или уменьшения риска развития симптоматической инфекции, вызываемой C. difficile. В конкретных вариантах осуществления способ может включать введение иммуногенной композиции субъекту-человеку, имеющему риск развития симптоматической инфекции, который имеет возраст по меньшей мере примерно 40, 50 или 65, 70, 75, 80 или 85 лет. В некоторых вариантах осуществления способ может включать введение композиции каждому индивидууму в группе людей, имеющих возраст от примерно 40 до примерно 65 лет, и/или от примерно 65 до примерно 75 лет. В некоторых вариантах осуществления способ может приводить к примерно двух-четырех-кратному усилению иммунного ответа в виде выработки антител против токсина A и/или токсина B C. difficile у примерно 80, 85, 90, 95 или 100% группы индивидуумов, считающихся сероположительными до первого введения, при измерении, например, в анализе ELISA и/или TNA. В некоторых вариантах осуществления способ может приводить к примерно двух-четырех-кратному усилению иммунного ответа в виде выработки антител против токсина A и/или токсина B C. difficile у примерно 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% группы индивидуумов, считающихся сероотрицательными до введения композиции, при измерении, например, в анализе ELISA и/или TNA через 14 дней после первого введения (например, после введения в дни 0, семь и 30). В некоторых вариантах осуществления способ может приводить к примерно двух-четырех-кратному усилению иммунного ответа в виде выработки антител против токсина A и/или токсина B C. difficile у примерно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80% группы индивидуумов, считающихся сероотрицательными до введения композиции, при измерении, например, в анализе ELISA и/или TNA через 60 дней после первого введения (например, после введения в дни 0, семь и 30). В некоторых вариантах осуществления индивидуумы в таких группах имеют возраст от примерно 40 до примерно 65 лет. В некоторых вариантах осуществления индивидуумы в таких группах имеют возраст от примерно 50 до 75 лет, или от примерно 50 лет до примерно 65 лет. В некоторых вариантах осуществления такое усиление наблюдают примерно через 30 дней после первого введения (в день 0), как правило, с последующим вторым введением примерно в день 7, и, как правило, наблюдают до третьего введения (например, примерно в день 30 или день 180). В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ против токсина A и/или токсина B может быть обнаружен в течение вплоть до примерно 30 месяцев (например, примерно 1000 дней) после первого, второго и/или третьего введения в режиме многократного введения. В некоторых вариантах осуществления введение композиции, описанной в настоящем документе, субъекту-человеку в день 0 (первое введение), примерно день 7 (второе введение) и примерно день 30 (третье введение) приводит к усилению или индукции иммунного ответа против токсина A и/или токсина B C. difficile в течение вплоть до примерно 30 месяцев, или примерно 1000 дней, при измерении, например, в анализе ELISA и/или TNA, предпочтительно, в анализе цитотоксичности. В некоторых вариантах осуществления уровень иммунного ответа может быть примерно по меньшей мере таким же высоким примерно в день 1000 после первого введения, как примерно в день 14 после первого введения в режиме введения трех доз, при измерении, например, в анализе ELISA и/или TNA, предпочтительно, в анализе цитотоксичности. В некоторых вариантах осуществления уровень иммунного ответа может быть примерно по меньшей мере таким же высоким примерно в любой из дней 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 и 1000 после первого введения, как примерно в день 14 после первого введения, при измерении, например, в анализе ELISA и/или TNA, предпочтительно, в анализе цитотоксичности. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ может превышать примерно в два-восемь раз исходный уровень (например, уровни антител против токсина A и/или токсина B в день 0, до первого введения, при измерении, например, в анализе ELISA и/или TNA. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ может превышать от примерно 2,5 до примерно 6,8 раз исходный уровень, при измерении, например, в анализе ELISA и/или TNA, предпочтительно, в анализе цитотоксичности. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ у сероположительных индивидуумов (например, подвергавшихся ранее воздействию) превышает исходный уровень примерно в три раза примерно в день 7; от примерно 10 до примерно 70 раз примерно в день 14; от примерно 30 до примерно 200 раз примерно в день 30; и от примерно 100 до примерно 200 раз примерно в день 60, при измерении в анализе ELISA для токсинов A и/или B (например, после введения в дни 0, 7 и 30). В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ у сероположительных индивидуумов (например, подвергавшихся ранее воздействию) превышает исходный уровень примерно в три раза примерно в день 7; от примерно 10 до примерно 100 раз примерно в день 14; от примерно 15 до примерно 130 раз примерно в день 30; и от примерно 100 до примерно 130 раз примерно в день 60, при измерении в анализе TNA для токсинов A и/или B (например, после введения в дни 0, семь и 30). В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ у сероотрицательных индивидуумов (например, не подвергавшихся ранее воздействию) превышает исходный уровень примерно в два раза примерно в день 14; от примерно пяти до примерно 10 раз примерно в день 30; и от примерно 25 до примерно 60 раз примерно день в 60, при измерении в анализе ELISA для токсинов A и/или B (например, после введения в дни 0, семь и 30). В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ у сероотрицательных индивидуумов (например, не подвергавшихся ранее воздействию) превышает исходный уровень от примерно двух до примерно трех раз примерно в день 14; от примерно двух до примерно пяти раз примерно в день 30; и от примерно пяти до примерно 40 раз примерно в день 60, при измерении в анализе TNA для токсинов A и/или B (например, после введения в дни 0, 7 и 30). В некоторых вариантах осуществления иммунные ответы, описанные в настоящем документе, обнаруживают у индивидуумов, считавшихся либо сероположительными, либо сероотрицательными, в день 0 (например, до первого введения). В некоторых вариантах осуществления такой иммунный ответ обнаруживают как против токсина A, так и против токсина B, C. difficile при измерении, например, в анализе ELISA и/или TNA, предпочтительно, в анализе цитотоксичности. Также предложены способы (например, in vitro или in vivo) получения таких антигенов C. difficile (например, токсоидов A и/или B) и содержащих их композиций. Такие способы могут включать, например, любой из способов, доступных и/или известных специалистам в данной области, и/или способов, описанных в WIPO патентной заявке WO/2012/143902, патенте США № 9187536 и WIPO патентной заявке WO/2014/060898, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

В настоящем документе, «субъект» или «хозяин» означает «индивидуум». Термин «субъект» может охватывать домашних животных, таких как кошки и собаки, домашний скот (например, крупный рогатый скот, лошадей, свиней, овец и коз), лабораторных животных (например, мышей, кроликов, крыс, морских свинок) и птиц. В одном аспекте субъект является млекопитающим, таким как примат или человек.

Композиция и вакцина

В одном варианте осуществления композиция представляет собой иммуногенную композицию. В одном варианте осуществления композиция представляет собой иммуногенную композицию для человека. В другом варианте осуществления композиция представляет собой вакцину. Термин «вакцина» означает композицию, содержащую антиген, который содержит по меньшей мере один эпитоп, индуцирующий иммунный ответ, специфический для данного антигена. Вакцину можно вводить непосредственно субъекту подкожным, пероральным, ороназальным или интраназальным путями введения. Предпочтительно, вакцину вводят внутримышечно. В одном варианте осуществления композиция представляет собой вакцину для человека. В одном варианте осуществления композиция представляет собой иммуногенную композицию против C. difficile.

В конкретных вариантах осуществления композиции могут дополнительно содержать один или более антигенов C. difficile, один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или один или более адъювантов (например, соль алюминия, эмульсию, катионные липосомы, анионный полимер, агонист Toll-подобного рецептора, а также их сочетание).

В одном варианте осуществления композиция, которая может представлять собой вакцину, может быть предоставлена в виде лиофилизированного препарата, который может быть восстановлен в клиническом центре разбавителем и смешан с любым адъювантом (например, адъювантом на основе алюминия, таким как фосфат алюминия или гидроксид алюминия) или водой для инъекций (WFI), в соответствии с указаниями.

В одном варианте осуществления композиция содержит фармацевтически приемлемые носители, которые представляют собой любые растворители, дисперсионные среды, стабилизаторы, разбавители и/или буферы, которые являются физиологически приемлемыми. Иллюстративные стабилизаторы включают углеводы, такие как сорбит, маннит, крахмал, декстран, сахароза, трегалоза, лактоза и/или глюкоза; инертные белки, такие как альбумин и/или казеин; и/или другие крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, например, полисахариды, такие как хитозан, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты и сополимеры (например, латекс, функционализированная SEPHAROSE™, агароза, целлюлоза и так далее), аминокислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и липидные агрегаты (такие как масляные капли или липосомы). Кроме того, эти носители могут действовать в качестве иммуностимулирующих средств (то есть, адъювантов).

Предпочтительно, композиция содержит трегалозу. Предпочтительные количества трегалозы (% по массе) включают количества от минимума примерно 1%, 2%, 3% или 4% до максимума примерно 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5%. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением для определения подходящего диапазона. В одном варианте осуществления композиция содержит примерно 3% - 6% трегалозы, наиболее предпочтительно, 4,5% трегалозы, например, на дозу объемом 0,5 мл.

Примеры подходящих разбавителей включают дистиллированную воду, солевой раствор, физиологический фосфатно-солевой буфер, глицерин, спирт (такой как этанол), растворы Рингера, раствор декстрозы, сбалансированные солевые растворы Хэнка и/или эксципиент для лиофилизации. Разбавитель может представлять собой, например, любой фармацевтически приемлемый разбавитель (например, 20 мМ цитрат натрия с 5% сахарозы и 0,016% формальдегида; 10 мМ цитрат с 4% сахарозы, 0,008% формальдегида, 0,57% хлорида натрия). В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит 10 мМ трис, 4,5% трегалозы, 0,01% полисорбата 80 (PS80), pH 7,4.

Иллюстративные буферы включают фосфатный (такой как фосфат калия, фосфат натрия); ацетатный (такой как ацетат натрия); сукцинатный (такой как сукцинат натрия); глициновый; гистидиновый; карбонатный, трис (трис(гидроксиметил)аминометан) и/или бикарбонатный (такой как бикарбонат аммония) буферы. Предпочтительно, композиция содержит трис-буфер. Предпочтительные количества трис-буфера включают количества от минимума примерно 1 мМ, 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ до максимума примерно 100 мМ, 50 мМ, 20 мМ,19 мМ, 18 мМ, 17 мМ, 16 мМ, 15 мМ, 14 мМ, 13 мМ, 12 мМ или 11 мМ. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением для определения подходящего диапазона. В одном варианте осуществления композиция содержит примерно 8 мМ - 12 мМ трис-буфер, наиболее предпочтительно, 10 мМ трис-буфер, например, на дозу объемом 0,5 мл.

В другом предпочтительном варианте осуществления композиция содержит гистидиновый буфер. Предпочтительные количества гистидинового буфера включают количества от минимума примерно 1 мМ, 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ до максимума примерно 100 мМ, 50 мМ, 20 мМ,19 мМ, 18 мМ, 17 мМ, 16 мМ, 15 мМ, 14 мМ, 13 мМ, 12 мМ или 11 мМ. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением для определения подходящего диапазона. В одном варианте осуществления композиция содержит примерно 8 мМ - 12 мМ гистидиновый буфер, наиболее предпочтительно, 10 мМ гистидиновый буфер, например, на дозу объемом 0,5 мл.

В другом предпочтительном варианте осуществления композиция содержит фосфатный буфер. Предпочтительные количества фосфатного буфера включают количества от минимума примерно 1 мМ, 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ до максимума примерно 100 мМ, 50 мМ, 20 мМ,19 мМ, 18 мМ, 17 мМ, 16 мМ, 15 мМ, 14 мМ, 13 мМ, 12 мМ или 11 мМ. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением для определения подходящего диапазона. В одном варианте осуществления композиция содержит примерно 8 мМ - 12 мМ фосфатный буфер, наиболее предпочтительно, 10 мМ фосфатный буфер, например, на дозу объемом 0,5 мл.

Значение pH буфера, как правило, выбирают для стабилизации выбранного активного материала, и оно может быть определено специалистами в данной области известными методами. Предпочтительно, значение pH буфера будет находиться в диапазоне физиологических значений pH. Таким образом, предпочтительные диапазоны значений pH составляют от примерно 3 до примерно 8; более предпочтительно, от примерно 6,0 до примерно 8,0; даже более предпочтительно, от примерно 6,5 до примерно 7,5; и наиболее предпочтительно, от примерно 7,0 до примерно 7,2.

В другом варианте осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать адъювант, описанный ниже. Предпочтительные адъюванты способствуют повышению характерного иммунного ответа на иммуноген, не вызывая конформационные изменения в иммуногене, которые могут влиять на качество иммунного ответа. Иллюстративные адъюванты включают 3-де-O-ацилированный монофосфориллипид A (MPL™) (смотри GB 2220211 (GSK)); гель гидроксида алюминия, такой как ALHYDROGEL™ (Brenntag Biosector, Denmark); соли алюминия (такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия), которые могут быть использованы с добавлением, или без добавления, иммуностимулирующего средства, такого как MPL или 3-DMP, QS-21, полимерные или мономерные аминокислоты, такие как полиглутаминовая кислота или полилизин. Другим иллюстративным адъювантом является иммуностимулирующий олигонуклеотид, такой как олигонуклеотид CpG (смотри, например, WO 1998/040100, WO2010/067262), или сапонин и иммуностимулирующий олигонуклеотид, такой как олигонуклеотид CpG (смотри, например, WO 00/062800). В предпочтительном варианте осуществления адъювант представляет собой олигонуклеотид CpG, наиболее предпочтительно, олигодезоксинуклеотиды CpG (ОДН CpG). Предпочтительные ОДН CpG относятся к классу B, они предпочтительно активируют B-клетки. В аспектах изобретения ОДН CpG имеет нуклеотидную последовательность 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’ (SEQ ID NO: 48), где * обозначает фосфоротиоатную связь. ОДН CpG с такой последовательностью известен как CpG 24555, описанный в WO2010/067262. В предпочтительном варианте осуществления CpG 24555 используют совместно с солью гидроксида алюминия, такой как ALHYDROGEL. Следующий класс иллюстративных адъювантов включает сапониновые адъюванты, такие как STIMULON™ (QS-21, который представляет собой тритерпеновый гликозид, или сапонин, Aquila, Framingham, Mass.), или полученные из него частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы), и адъювант ISCOMATRIX^®. Соответственно, композиции по настоящему изобретению могут быть доставлены в форме ISCOM, ISCOM, содержащих CTB, липосом или инкапсулированных соединений, таких как акрилаты или поли(DL-лактид-ко-гликозид), с образованием микросфер такого размера, который подходит для абсорбции. Как правило, термин «ISCOM» означает иммуногенные комплексы, образовавшиеся между гликозидами, такими как тритерпеноидные сапонины (в частности, Quil A), и антигенами, которые содержат гидрофобную область. В предпочтительном варианте осуществления адъювант представляет собой адъювант ISCOMATRIX. Другие иллюстративные адъюванты включают RC-529, GM-CSF, полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA). Другим классом иллюстративных адъювантов являются аналоги гликолипидов, включая N-гликозиламиды, N-гликозилмочевины и N-гликозилкарбаматы, каждый из которых замещен в сахарном остатке аминокислотой. Необязательно, фармацевтическая композиция содержит два или более разных адъювантов. Предпочтительные сочетания адъювантов включают любое сочетание адъювантов, в том числе, например, по меньшей мере двух из следующих адъювантов: квасцы, MPL, QS-21, ISCOMATRIX, CpG и ALHYDROGEL. Иллюстративное сочетание адъювантов включает сочетание CpG и ALHYDROGEL.

Адъювант может иметь, например, соответствующую концентрацию (например, примерно 800-1600 мкг/мл) адъюванта, например, адъювант, содержащий соединение алюминия (например, гидроксид алюминия или фосфат алюминия) в WFI. Например, адъювант (например, 800-1600 г/мл гидроксида алюминия в 0,57% растворе хлорида натрия) может быть использован в качестве разбавителя для восстановления лиофилизированного препарата. WFI можно использовать для разбавления лиофилизированной вакцины для не содержащих адъювант препаратов. Конечный раствор для дозирования может содержать, например, композицию/вакцину, разбавитель и адъювант.

Альтернативно, в одном варианте осуществления композицию вводят млекопитающему без адъюванта. То есть, композиция не содержит адъювант.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит сурфактант. Любой сурфактант является подходящим, амфотерный, неионный, катионный или анионный. Иллюстративные сурфактанты включают сурфактанты на основе сложных эфиров сорбитана и жирных кислот (например, TWEEN^®), такие как полисорбат 20 и/или полисорбат 80; полиоксиэтиленовые эфиры жирных спиртов из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как сурфактанты BRIJ), такие как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (BRIJ 30); TRITON X100, или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол; и сложные эфиры сорбитана (обычно известные как SPAN), такие как сорбитан триолеат (SPAN 85) и сорбитан монолаурат, а также их сочетания. Предпочтительные сурфактанты включают полисорбат 80 (полиоксиэтиленсорбитан моноолеат).

Полисорбат 80 (PS-80) представляет собой неионный сурфактант. В одном варианте осуществления композиция содержит PS-80 в диапазоне концентраций от 0,0005% до 1%. Например, концентрация PS-80 в композиции может составлять по меньшей мере 0,0005%, 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,10%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1% или 1,1% PS-80. В одном варианте осуществления концентрация PS-80 в композиции может составлять не более 2,0%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8% или 0,7% PS-80. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением, описанным в настоящем документе, для определения диапазона. Предпочтительно, композиция содержит 0,01% PS-80.

В иллюстративном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит трегалозу и полисорбат 80. В другом иллюстративном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит трис-буфер и полисорбат 80. В другом иллюстративном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит гистидиновый буфер и полисорбат 80. В другом иллюстративном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит фосфатный буфер и полисорбат 80.

В одном иллюстративном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит трегалозу, трис-буфер и полисорбат 80. В другом иллюстративном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит трегалозу, гистидиновый буфер и полисорбат 80. В другом иллюстративном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит трегалозу, фосфатный буфер и полисорбат 80.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит формальдегид. Например, в предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция, которая дополнительно содержит формальдегид, включает иммуногенную композицию, при этом мутантный токсин C. difficile в иммуногенной композиции был обработан химическим сшивающим реагентом, который включает формальдегид. Количество формальдегида, присутствующего в фармацевтической композиции, может варьироваться от минимума примерно 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,010%, 0,013% или 0,015%, до максимума примерно 0,020%, 0,019%, 0,018%, 0,017% 0,016%, 0,015%, 0,014%, 0,013%, 0,012% 0,011% или 0,010%. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением для определения подходящего диапазона. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит примерно 0,010% формальдегида.

В некоторых альтернативных вариантах осуществления фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, не содержат формальдегид. Например, в предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция, которая не содержит формальдегид, включает иммуногенную композицию, при этом по меньшей мере одна аминокислота мутантного токсина C. difficile является химически сшитой при помощи реагента, который включает EDC. Более предпочтительно, в таком варианте осуществления мутантный токсин C. difficile не был обработан химическим сшивающим реагентом, который включает формальдегид. В другом иллюстративном варианте осуществления фармацевтическая композиция, которая находится в лиофилизированной форме, не содержит формальдегид.

В настоящем документе также предложены наборы для введения антигенов C. difficile. В одном варианте осуществления один или более антигенов C. difficile могут являться частью, и/или быть предоставлены в виде, набора для введения субъекту. В наборе также могут быть предоставлены инструкции по введению антигенов C. difficile. Композиции, содержащие антигены C. difficile, описанные в настоящем документе, могут быть включены в набор (например, вакцинный набор). Например, набор может включать первый контейнер, содержащий композицию, описанную в настоящем документе, в сухой или лиофилизированной форме, и второй контейнер, содержащий водный раствор для восстановления композиции. Набор может, необязательно, включать устройство для введения восстановленной композиции в жидкой форме (например, шприц для подкожных инъекций, набор микроигл) и/или инструкции по применению. Устройство для введения может быть предоставлено предварительно заполненным водным раствором для восстановления композиции.

Объем каждой доставляемой дозы исследуемого лекарственного средства (вакцины или плацебо) может составлять примерно 0,5 мл. Объем каждой доставляемой дозы композиции, раскрытой в настоящем документе, может составлять примерно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7; 0,8, 0,9 или 1 мл. Объем каждой доставляемой дозы композиции, раскрытой в настоящем документе, может составлять примерно 0,4, 0,5, 0,6 мл. Объем каждой доставляемой дозы композиции, раскрытой в настоящем документе, может составлять примерно 0,5 мл. Объем каждой доставляемой дозы композиции, раскрытой в настоящем документе, может составлять примерно 1 мл. Препараты можно вводить любым подходящим путем введения (например, подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, в лимфатические узлы, интраназально, перорально).

Нейтрализующая токсины активность

Иммунный ответ, индуцированный введением композиции человеку, можно определять с использованием анализа нейтрализации токсина (TNA), ELISA или, более предпочтительно, анализа цитотоксичности, например, как описано в WIPO патентной заявке WO/2012/143902, патенте США № 9187536 и WIPO патентной заявке WO/2014/060898, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

In vitro анализ цитотоксичности является ключевым анализом для оценки безопасности, разработанным для тестирования любой потенциальной остаточной цитотоксичности материала лекарственной субстанции. Определение какой-либо потенциальной остаточной цитотоксичности токсоида A выполняют с использованием анализа на основе клеток IMR-90. Токсин A дикого типа C. difficile проявляет сильную in vitro цитотоксичность, при этом небольших количеств токсина бывает достаточно для вызывания различных эффектов в клетках млекопитающих, таких как округление клеток (цитопатический эффект или CPE) и отсутствие метаболической активности (при определении на основании уровней АТФ). Анализ CPE проводят путем инкубации с клетками IMR90 в культуре материала токсоида в концентрации 500 мкг/мл при 37°C и оценки округления клеток через 24 часа. Для анализа CPE необходима субъективная визуальная оценка CPE специально обученными аналитиками и, таким образом, этот анализ не может быть с легкостью валидирован. Был разработан анализ цитотоксичности, основанный на измерении интенсивности люминесцентного сигнала, генерируемого из АТФ, который пропорционален количеству метаболически активных клеток после обработки либо токсоидом A, либо токсином дикого типа. Результаты выражают в виде EC₅₀, что определяют как количество токсина или токсоида, вызывающее 50% уменьшение уровней АТФ, измеренное в виде относительных световых единиц. Токсоид тестируют в концентрации 100 мкг/мл. Данный способ был выбран для тестирования высвобождения и стабильности (ограниченное количество временных точек), поскольку он является более надежным, объективным и подходящим для тестирования в соответствии с требованиями GMP, чем альтернативный анализ цитопатогенного эффекта (CPE). Анализ цитотоксичности выполняют только для токсоида, поскольку он может быть тестирован в более высокой концентрации в сравнении с материалом лекарственного продукта без помех со стороны матрицы. Это гарантирует, что измерение производят в стадии с наибольшей концентрацией в производственном цикле изготовления вакцины от C. difficile. Кроме того, анализ цитотоксичности будет проводиться стабильно для контролирования любого потенциального восстановления токсичности.

In vitro анализ цитотоксичности является ключевым анализом для оценки безопасности, разработанным для тестирования любой потенциальной остаточной цитотоксичности материала лекарственной субстанции. Определение какой-либо потенциальной остаточной цитотоксичности токсоида B выполняют с использованием анализа на основе клеток IMR-90. Токсин B дикого типа C. difficile проявляет сильную in vitro цитотоксичность, при этом небольших количеств токсина бывает достаточно для вызывания различных эффектов в клетках млекопитающих, таких как округление клеток (цитопатический эффект или CPE) и отсутствие метаболической активности (при определении на основании уровней АТФ). Анализ CPE проводят путем инкубации с клетками IMR90 в культуре материала токсоида в концентрации 500 мкг/мл при 37°C и оценки округления клеток через 24 часа. Для анализа CPE необходима субъективная визуальная оценка CPE специально обученными аналитиками и, таким образом, этот анализ не может быть с легкостью валидирован. Был разработан анализ цитотоксичности, основанный на измерении интенсивности люминесцентного сигнала, генерируемого из АТФ, который пропорционален количеству метаболически активных клеток после обработки либо токсоидом B, либо токсином B дикого типа. Результаты выражают в виде EC₅₀, что определяют как количество токсина или токсоида, вызывающее 50% уменьшение уровней АТФ, измеренное в виде относительных световых единиц. Максимальная концентрация токсоида, которая была исходно протестирована в данном анализе, составляла 200 мкг/мл. Однако результаты использования способа с течением времени указывали на то, что максимальная концентрация лишь 100 мкг/мл может приводить к достоверным показателям. Данный способ был выбран для тестирования высвобождения и стабильности (ограниченное количество временных точек), поскольку он является более надежным, объективным и подходящим для тестирования в соответствии с требованиями GMP, чем альтернативный анализ CPE. Анализ цитотоксичности выполняют только для материала лекарственной субстанции токсоида B, поскольку он может быть тестирован в более высокой концентрации в сравнении с материалом лекарственного продукта без помех со стороны матрицы. Это гарантирует, что измерение производят в стадии с наибольшей концентрацией в производственном цикле изготовления вакцины от C. difficile. Кроме того, анализ цитотоксичности будет проводиться стабильно для контролирования любого потенциального восстановления токсичности.

Для подтверждения пригодности анализа титра 50% нейтрализации для клинического применения, обеспечения дополнительной надежности анализа и гарантии унифицированных долгосрочных функциональных параметров в клинических условиях в анализ добавляли эталонный стандарт и соответствующие контроли, что позволяло получать результаты определения титра нейтрализации в виде единиц нейтрализации/мл относительно эталонного стандарта. Перед проведением анализа в текущем исследовании использовали образцы сыворотки вакцинированных людей для демонстрации линейной взаимосвязи между титрами 50% нейтрализации и единицами нейтрализации/мл при проведении анализа нейтрализации. На основании этих исследований корреляции были рассчитаны пороговые значения «защитной» нейтрализации и использованы для анализа клинических данных в этом исследовании.

В одном варианте осуществления TNA является автоматизированным и чувствительным анализом, основанным на показателях люминесценции. Титры нейтрализации тестируемых образцов рассчитывают на основании эталонного стандарта. В одном варианте осуществления НПКО анализа для Txd A составляет 158,0 Ед/мл; для Txd B=249,5 Ед/мл. Предпочтительно, TNA

В анализах иммуногенности пороговые значения для «защитных» ответов в виде продуцирования нейтрализующих антител против токсина A и токсина B составляли 219 и 2586 единиц нейтрализации/мл, соответственно. Несколько конечных точек определения иммуногенности для исследования B5091009 были оценены на основании этих пороговых значений «защитных» ответов.

При использовании в настоящем документе, если специально не указано иначе, «установленное пороговое» значение определено как 219 единиц нейтрализации/мл для токсина A и 2586 единиц нейтрализации/мл для токсина B.

В одном варианте осуществления иммунный ответ, индуцированный у человека, является нейтрализующим в отношении штамма C. difficile, который экспрессирует токсин A, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с последовательностью токсоида A композиции.

В другом варианте осуществления иммунный ответ, индуцированный у человека, является нейтрализующим в отношении штамма C. difficile, который экспрессирует токсин B, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с последовательностью токсоида B композиции.

Полезность (например, иммуногенность) любого из материалов (например, композиций) и/или способов, описанных в настоящем документе, можно оценивать любым из множества способов, известных специалистам в данной области. Любой один или более из анализов, описанных в настоящем документе, или любые другие один или более подходящих анализов, могут быть использованы для определения пригодности любого из материалов, описанных в настоящем документе, для намеченной цели. Следует понимать, что эти способы являются иллюстративными и не ограничивающими; другие анализы также могут быть подходящими. Например, композиции, описанные в настоящем документе, как правило, индуцируют и/или усиливают продуцирование антител против C. difficile при введении субъекту. Такие антитела можно обнаруживать у субъекта с использованием любых способов, доступных специалистам в данной области. Например, как описано в разделе «Примеры», можно получать сыворотку от субъекта и тестировать ее методом ELISA для определения антител - иммуноглобулинов типа G (IgG) к токсину A и/или токсину B C. difficile (например, «первичные данные по иммуногенности»). Антитела, присутствующие в тестируемой сыворотке, могут вступать в реакцию с антигенами токсинами A или B, адсорбированными в отдельных лунках планшета для микротитрования. Количество антител, связанных с антигеном, нанесенным на лунки, можно определять с использованием колориметрической реакции с субстратом после связывания вторичного антитела против IgG (например, против IgG человека), конъюгированного с ферментом. Затем, как правило, добавляют субстрат для фермента, вызывающий изменение цвета реакционной смеси, прямо пропорциональное количеству антител, связанных с антигеном. Концентрацию антител в сыворотке можно определять путем экстраполяции из стандартной кривой, которая была построена с использованием нескольких разведений эталонной стандартной сыворотки с известным количеством единиц IgG (единиц ELISA (EU)/мл)). Также можно использовать анализ нейтрализации токсина (TNA) для количественного определения нейтрализующих антител к токсину C. difficile. В данном анализе серийно разведенную сыворотку можно инкубировать с фиксированным количеством токсина A или B C. difficile. Затем можно добавлять тестируемые клетки (например, клетки Vero), и смесь сыворотки-токсина-клеток инкубировать в соответствующих условиях (например, при 37°C в течение 6 дней). Способность сыворотки нейтрализовать цитотоксический эффект токсина C. difficile может быть определена на основании жизнеспособности клеток, и коррелирует с ней. В анализе используют накопление кислых метаболитов в закрытых лунках для культивирования в качестве показателя нормального клеточного дыхания. В клетках, подвергнутых воздействию токсина, метаболизм и продуцирование CO₂ снижены; следовательно, значение pH возрастает (например, до 7,4 или выше), на что указывает индикатор pH феноловый красный в среде для культивирования клеток. При этом значении pH среда выглядит красной. Однако контрольные клетки, или клетки, подвергнутые воздействию токсина, который был нейтрализован антителом, имеют метаболизм и продуцирование CO₂ в нормальных количествах; в результате, значение pH поддерживается на нормальном уровне (например, 7,0 или ниже), и при этом значении pH среда выглядит желтой. Таким образом, количество антител, нейтрализующих токсин C. difficile, коррелирует со способностью сыворотки нейтрализовать метаболические эффекты токсина C. difficile на клетки, на что указывает их способность поддерживать определенное значение pH (например, 7,0 или ниже). Изменение цвета среды можно измерять (например, при длине волны от 562 нм до 630 нм) с использованием планшетного ридера для последующего расчета титра нейтрализующего токсин антитела при 50% ингибировании опосредованной токсином C. difficile цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция индуцирует выработку нейтрализующего токсин антитела с титром, который выше по меньшей мере в 1 раз, например, по меньшей мере в 1,01 раза, 1,1 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 11 раз, 12 раз, 13 раз, 14 раз, 15 раз, 16 раз, 32 раза, или более, у человека после получения дозы композиции, чем титр нейтрализующего токсин антитела у человека до получения указанной дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе нейтрализации токсина.

Титры

В одном варианте осуществления композиция индуцирует увеличение титра нейтрализующего токсин антитела у человека в сравнении с титром нейтрализующего токсин антитела у человека до введения дозы композиции, при измерении в идентичных условиях, например, в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления увеличенный титр нейтрализующего токсин антитела сравнивают с титром нейтрализующего токсин антитела у человека до введения первой дозы композиции, то есть, сравнивают с титром нейтрализующего токсин антитела у человека перед введением первой дозы композиции, при измерении в идентичных условиях, например, в анализе цитотоксичности. В другом варианте осуществления увеличение титра наблюдают после второй дозы композиции в сравнении с титром нейтрализующего токсин антитела у человека до введения первой дозы композиции, при измерении в идентичных условиях, например, в анализе цитотоксичности. В другом варианте осуществления увеличение титра нейтрализующего токсин антитела наблюдают после третьей дозы композиции в сравнении с титром нейтрализующего токсин антитела у человека до введения первой дозы композиции, при измерении в идентичных условиях, например, в анализе цитотоксичности. В другом варианте осуществления увеличение титра наблюдают после второй дозы композиции в сравнении с титром нейтрализующего токсин антитела у человека до введения второй дозы композиции, при измерении в идентичных условиях, например, в анализе цитотоксичности. В другом варианте осуществления увеличение титра нейтрализующего токсин антитела наблюдают после третьей дозы композиции в сравнении с титром нейтрализующего токсин антитела у человека до введения третьей дозы композиции, при измерении в идентичных условиях, например, в анализе цитотоксичности.

В одном варианте осуществления композиция индуцирует титр нейтрализующего токсин антитела у человека после введения дозы, при этом титр нейтрализующего токсин антитела по меньшей мере более чем в 1 раз выше, чем титр нейтрализующего токсин антитела у человека до введения дозы, при измерении в идентичных условиях, например, в анализе цитотоксичности. Например, титр нейтрализующего токсин антитела может быть по меньшей мере в 1,01 раза, 1,1 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 11 раз, 12 раз, 13 раз, 14 раз, 15 раз, 16 раз, 32 раза или 64 раза выше у человека после получения дозы композиции в сравнении с титром нейтрализующего токсин антитела у человека до введения дозы, при измерении в идентичных условиях, например, в анализе цитотоксичности.

В одном варианте осуществления термин «отвечающий на воздействие» относится к человеку, у которого композиция индуцирует титр нейтрализующего токсин антитела после введения дозы, при этом титр нейтрализующего токсин антитела по меньшей мере более чем в 1 раз выше, чем титр нейтрализующего токсин антитела у человека до введения дозы. В предпочтительном варианте осуществления у отвечающего на воздействие человека наблюдается увеличение по меньшей мере в ≥4 раза титра нейтрализующего токсин антитела в сравнении с титром нейтрализующего токсин антитела у человека до введения дозы. Можно сказать, что у такого отвечающего на воздействие человека имеется защитный титр антител.

В одном варианте осуществления композиция индуцирует титр нейтрализующего токсин антитела у человека после получения первой дозы, который по меньшей мере в 2 раза выше, чем титр нейтрализующего токсин антитела у человека до получения первой дозы (например, выше, чем титр нейтрализующего токсин антитела у человека в отсутствие первой дозы), при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция индуцирует титр нейтрализующего токсин антитела у человека, который по меньшей мере в 4 раза выше, чем титр нейтрализующего токсин антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности. В одном варианте осуществления композиция индуцирует титр нейтрализующего токсин антитела у человека, который по меньшей мере в 8 раз выше, чем титр нейтрализующего токсин антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

В одном варианте осуществления человек имеет, например, титр нейтрализующего токсин антитела, равный или превышающий нижний предел количественного определения (НПКО) в анализе цитотоксичности, после введения первой дозы композиции. В другом варианте осуществления человек имеет, например, в анализе цитотоксичности, титр, равный или превышающий НПКО в анализе цитотоксичности, после введения второй дозы композиции. В другом варианте осуществления человек имеет, например, титр нейтрализующего токсин антитела, равный или превышающий НПКО в анализе цитотоксичности, после введения третьей дозы композиции.

Способы и введение

В одном аспекте изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против C. difficile у человека. В другом аспекте изобретение относится к способу вакцинации человека. В одном варианте осуществления способ включает введение человеку по меньшей мере одной дозы композиции, описанной выше. В предпочтительном варианте осуществления способ включает введение человеку не более одной дозы композиции, описанной выше. В другом варианте осуществления способ включает введение человеку по меньшей мере первой дозы и второй дозы композиции, описанной выше.

В одном варианте осуществления вторую дозу вводят по меньшей мере через 20, 30, 50, 60, 100, 120, 160, 170 или 180 дней после первой дозы, и не более чем через 250, 210, 200 или 190 дней после первой дозы. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением, описанным в настоящем документе, для определения диапазона.

В другом варианте осуществления вторую дозу вводят через примерно 30 дней после первой дозы. В другом варианте осуществления вторую дозу вводят через примерно 60 дней после первой дозы, например, по схеме иммунизации в 0, 2 месяцы. В другом варианте осуществления вторую дозу вводят через примерно 180 дней после первой дозы, например, по схеме иммунизации в 0, 6 месяцы. В другом варианте осуществления вторую дозу вводят через примерно 120 дней после первой дозы, например, по схеме иммунизации в 2, 6 месяцы.

В одном варианте осуществления способ включает введение человеку двух доз композиции, и не более двух доз. В одном варианте осуществления две дозы вводят в пределах периода времени примерно 6 месяцев после первой дозы. В одном варианте осуществления способ не включает дополнительное бустерное введение дозы человеку. Используемый в настоящем документе термин «бустерное» означает дополнительное введение композиции человеку. Введение человеку не более двух доз композиции может иметь преимущества. Такие преимущества включают, например, облегчение соблюдения человеком полной схемы введения и уменьшение затратности применения схемы.

В одном варианте осуществления первую дозу и вторую дозу вводят человеку на протяжении периода времени примерно 5 дней, 7 дней, 14 дней, 21, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 дней, и не более 400, 390, 380, 370, 365, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210 или 200 дней после первой дозы. В одном варианте осуществления вторую дозу вводят человеку по меньшей мере через 8, 14, 21, 25 или 30 дней, и не более чем через 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 или 30 дней после введения первой дозы. Например, в одном варианте осуществления вторую дозу вводят человеку по меньшей мере через 21 день, и не более чем через 40 дней после введения первой дозы. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением, описанным в настоящем документе, для определения диапазона. Предпочтительно, первую дозу и вторую дозу вводят человеку на протяжении периода времени примерно 8 дней. Более предпочтительно, первую дозу и вторую дозу вводят человеку на протяжении периода времени примерно 30 дней. Наиболее предпочтительно, первую дозу и вторую дозу вводят человеку на протяжении периода времени по меньшей мере примерно 30 дней.

В одном варианте осуществления первую дозу и вторую дозу вводят человеку на протяжении периода времени примерно 30 дней. В другом варианте осуществления первую дозу и вторую дозу вводят человеку на протяжении периода времени примерно 60 дней. В другом варианте осуществления первую дозу и вторую дозу вводят человеку на протяжении периода времени примерно 180 дней.

В одном варианте осуществления первую дозу и вторую дозу вводят человеку на протяжении периода времени не более 30 дней. В другом варианте осуществления первую дозу и вторую дозу вводят человеку на протяжении периода времени не более 60 дней. В другом варианте осуществления первую дозу и вторую дозу вводят человеку на протяжении периода времени не более 180 дней.

Дозы

В одном варианте осуществления способ включает введение человеку трех доз композиции. В другом варианте осуществления способ включает введение не более трех доз композиции. В одном варианте осуществления три дозы вводят на протяжении периода времени примерно 6 месяцев после первой дозы. В одном варианте осуществления способ включает введение бустерной дозы человеку после третьей дозы. В другом варианте осуществления способ не включает введение бустерной дозы человеку после третьей дозы. В другом варианте осуществления способ не включает дополнительное введение четвертой или бустерной дозы композиции человеку. В следующем варианте осуществления человеку вводят не более трех доз в пределах периода времени примерно 6 месяцев.

В иллюстративном варианте осуществления вторую дозу вводят примерно через 30 дней после первой дозы, и третью дозу вводят примерно через 150-180 дней после второй дозы, например, по схеме иммунизации в 0, 1, 6 месяцы. В другом иллюстративном варианте осуществления вторую дозу вводят примерно через 60 дней после первой дозы, и третью дозу вводят примерно через 120 дней после второй дозы, например, по схеме иммунизации в 0, 2, 6 месяцы.

В одном варианте осуществления первую дозу, вторую дозу и третью дозу вводят человеку на протяжении периода времени примерно 150, 160, 170 или 180 дней, и не более чем 240, 210 200 или 190 дней. Любое минимальное значение можно комбинировать с любым максимальным значением, описанным в настоящем документе, для определения диапазона. Предпочтительно, первую дозу, вторую дозу и третью дозу вводят человеку на протяжении периода времени примерно 180 дней или 6 месяцев. Например, вторую дозу можно вводить человеку примерно через 60 дней после первой дозы, и третью дозу можно вводить человеку примерно через 120 дней после второй дозы. Соответственно, иллюстративная схема введения включает введение дозы человеку примерно в месяцы 0, 2 и 6.

Как описано выше, человеку можно вводить несколько доз иммуногенной композиции, и число дней между всеми дозами может варьироваться. Преимущество способа включает, например, гибкость, способствующую соблюдению человеком схем введения.

В одном варианте осуществления способ включает введение человеку не более трех доз одной и той же иммуногенной композиции. Например, в предпочтительном варианте осуществления способ не включает введение человеку первой дозы первой композиции, введение человеку второй дозы второй композиции и введение человеку третьей дозы третьей композиции, при этом первая, вторая и третья композиции не являются идентичными. В другом варианте осуществления способ включает введение человеку не более четырех доз одной и той же иммуногенной композиции.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры иллюстрируют варианты осуществления изобретения. Если в настоящем документе нет иных указаний, в следующих далее примерах речь идет о вакцине-кандидате или иммуногенной композиции, содержащей смесь генетически модифицированного токсоида A, то есть, полипептида, C. difficile (содержащего SEQ ID NO: 4, в которой начальный остаток метионина отсутствует) и генетически модифицированного токсоида B, то есть, полипептида, C. difficile (содержащего SEQ ID NO: 6, в которой начальный остаток метионина отсутствует), которые были дополнительно химически инактивированы при помощи 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида) (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) для устранения остаточной цитотоксичности, но с сохранением естественной антигенной структуры, и о вызывании ответа в виде выработки нейтрализующих антител, как описано в примере 21 в WIPO патентной заявке WO/2012/143902, патенте США № 9187536 и WIPO патентной заявке WO/2014/060898, WIPO патентной заявке WO/2012/143902, патенте США № 9187536 и WIPO патентной заявке WO/2014/060898, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Вкратце, после очистки генетически модифицированные токсины (SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6) инактивируют в течение 2 часов при 25°C с использованием 0,5 мг EDC и 0,5 мг NHS на мг очищенных генетически модифицированных токсинов A и B (примерно 2,6 мМ и 4,4 мМ, соответственно). Реакцию гасят добавлением глицина до конечной концентрации 100 мМ, и реакционную смесь инкубируют дополнительно в течение 2 часов при 25°C. Инактивацию проводят при pH 7,0 ± 0,5 в 10 мМ фосфатном буфере, 150 мМ хлорид натрия. Период инактивиции должен превышать в три раза период, необходимый для уменьшения величины EC₅₀ в клетках IMR90 на более, чем 1000 мкг/мл. Через 2 часа биологическая активность уменьшается на величину 7-8 log₁₀ относительно природного токсина. После 4 час инкубации инактивированный мутантный токсин переводят в конечный буфер для лекарственной субстанции методом диафильтрации. Например, используя кассету для ультрафильтрации из регенерированного ацетата целлюлозы с порогом отсечения 100 кДа, инактивированный токсин концентрируют до концентрации 1-2 мг/мл и проводят замену буфера. Более конкретно, вакцинная композиция содержит: (a) первый полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, при этом остаток метионина в положении 1 в SEQ ID NO: 4 отсутствует, при этом боковая цепь остатка лизина первого полипептида сшита с фрагментом бета-аланина, и при этом первый полипептид дополнительно имеет сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты первого полипептида и фрагментом глицина, и сшивку между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты первого полипептида и фрагментом глицина; и (b) второй полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, при этом остаток метионина в положении 1 в SEQ ID NO: 6 отсутствует, при этом боковая цепь остатка лизина второго полипептида сшита с фрагментом бета-аланина, и при этом второй полипептид дополнительно имеет сшивку между боковой цепью остатка аспарагиновой кислоты второго полипептида и фрагментом глицина, и сшивку между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты второго полипептида и фрагментом глицина.

Исследуемая вакцина от C. difficile состоит из 2 токсоидов (A и B) в равных количествах. Вакцина была предоставлена в виде стерильного лиофилизированного порошка с дозировкой 100 мкг и 200 мкг совокупных токсоидов A и B на дозу. Вакцина была подготовлена для инъекции путем ресуспендирования лиофилизированной вакцины в разбавителе - гидроксиде алюминия непосредственно перед использованием. Разбавитель, гидроксид алюминия, был предоставлен в виде жидкой суспензии с содержанием 1 мг алюминия/мл (в форме гидроксида алюминия).

В доклинических экспериментах вакцина-кандидат была изучена либо отдельно, либо в сочетании с адъювантом. В модели на хомяках все вакцинные препараты продемонстрировали полезность для выживания, обеспечивая по меньшей мере на 90% защиту от летального заражения спорами C. difficile иммунизированных хомяков. В модели на приматах все протестированные вакцинные препараты с токсоидами индуцировали надежные ответы в виде выработки нейтрализующих антител против токсинов, как против токсина A C. difficile, так и против токсина B C. difficile.

Пример 1 - Первое исследование фазы 1 на людях, режим введения 3 доз в месяцы 0, 1 и 6 (B5091001)

Иллюстративная вакцина-кандидат против C. difficile была оценена в первом исследовании фазы 1 с участием людей (FIH) B5091001, проводимом в США, в которое были включены 192 здоровых взрослых человека в возрасте от 50 до 85 лет. Это было исследование с повышением дозы, плацебо-контролируемое, рандомизированное исследование с маскированием данных для наблюдателя с целью оценки безопасности, переносимости и иммуногенности вакцины от C. difficile в режиме введения 3 доз в месяцы 0, 1 и 6. Оценивали три (3) уровня доз антигенов (50, 100 и 200 мкг) вакцины-кандидата, либо отдельно, либо в сочетании с гидроксидом алюминия.

Анализ безопасности показал, что оба препарата и все 3 уровня доз были, как правило, хорошо переносимы. Местные реакции были преимущественно слабыми или умеренными, и в основном представляли собой болевые ощущения в месте инъекции. Не было отмечено никаких по-настоящему тяжелых, или 4 степени, местных реакций. В возрастной группе 65-85 лет при уровне дозы 200 мкг местные реакции, как правило, чаще возникали в группе введения только токсоида, в сравнении с группами введения доз, включающих гидроксид алюминия. После всех 3 доз частота и степень тяжести местных реакций не увеличивались с увеличением уровня дозы или количества доз в группах всех доз. Системные явления были преимущественно слабыми или умеренными, и в основном представляли собой головную боль и усталость. Отсутствовало свидетельство увеличения частоты системных явлений с увеличением уровня дозы или числа доз в группах всех доз.

Анализ иммуногенности показал ограниченный ответ в виде выработки антител после дозы 1, однако после дозы 2 наблюдалось значительное увеличение титров антител как против токсина A, так и против токсина B, которые, в целом были максимальными через 7 дней после дозы 2, и стабильными через 1 месяц после дозы 2. Через семь (7) дней после дозы 3 был очевиден значительный бустерный ответ, который был слегка более выраженным вновь через 1 месяц после дозы 3. В целом, сильные ответы в виде нейтрализующих антител против токсинов были вызваны обоими препаратами, хотя наблюдалась тенденция в виде более сильных ответов у реципиентов препарата только с токсоидами. Например, через 1 месяц после дозы 3 в возрастной группе 65-85 лет среднее геометрическое кратности увеличения (СГКУ) от исходных значений (до дозы 1) титров специфических для токсина A нейтрализующих антител находилось в диапазоне от 131 до 254 в группах приема дозы только с токсоидами и от 42 до 80 в группах приема дозы, включающей гидроксид алюминия. Соответствующие диапазоны для титров специфических для токсина B нейтрализующих антител составляли от 2953 до 4922 и от 136 до 484, соответственно.

Доклинические данные, полученные на макаках-резусах, свидетельствовали в пользу использования режима введения 3 доз вакцины от C. difficile, вводимой с добавлением, или без добавления, гидроксида алюминия в недели 0, 2 и 4. Кроме того, в токсикологическом исследовании на кроликах режим введения 4 доз вакцины от C. difficile (уровни доз вплоть до 400 мкг), вводимой в дни 1, 8, 22 и 36, не приводил к нежелательным токсикологическим результатам и вызывал увеличение титров нейтрализующих антител против токсина A и против токсина B, что подтверждало ожидаемый иммунологический ответ у животных на вводимый иммуноген.

Эти доклинические и токсикологические данные, как и обнадеживающий иммунный ответ, наблюдаемый после 3 доз в исследовании фазы 1 B5091001, свидетельствовали в поддержку исследования фазы 2 B5091003.

Пример 2 - Исследование фазы 2, режим введения 3 доз в дни 1, 8 и 30 (B5091003)

Исследование фазы 2 B5091003 было предназначено для оценки безопасности, переносимости и иммуногенности вакцины, содержащей только токсоиды C. difficile, при уровнях доз 100 и 200 мкг антигена (суммарно для токсоидов A и B) в режиме введения 3 доз, вводимых в дни 1, 8 и 30 здоровым взрослым людям в возрасте от 50 до 85 лет.

Вакцинации в исследовании B5091003 были остановлены после появления покраснения в месте инъекции. У субъектов отсутствовали сопутствующие тяжелые системные симптомы, не было отмечено, что покраснение влияло на их ежедневную активность, и все местные реакции полностью разрешились. Местные реакции, наблюдаемые в случае препарата, содержащего только токсоиды, могли быть следствием взаимодействия свободных токсоидов и вызываемого иммунного ответа.

Пример 3 - Исследование фазы 2, режим введения 3 доз в дни 1, 8 и 30 (режим введения по дням) или месяцы 0, 1 и 6 (режим введения по месяцам) (B5091009)

Показано, что адсорбция на алюминии приводит к связыванию и медленному высвобождению компонентов вакцины из зоны инъекции. Кроме того, существует потенциальная необходимость в быстрой индукции иммунного ответа и пролонгированной защите от CDI. Соответственно, в исследовании B5091009 оценивали безопасность, переносимость и иммуногенность содержащей гидроксид алюминия вакцины при 2 уровнях доз антигенов (то есть, суммарно 100 мкг и 200 мкг токсоидов), выбранных из исследования FIH B5091001, с использованием 2 разных режимов дозирования: в дни 1, 8 и 30 или в месяцы 0, 1 и 6.

Первичную конечную точку иммуногенности оценивали на основании способности вакцины индуцировать уровни специфических для токсина A и специфических для токсина B нейтрализующих антител, превышающие или равные установленным пороговым значениям для каждого токсоида C. difficile в вакцине. Эти установленные пороговые значения были взяты из исследования фазы 2 для оценки эффективности, показавшего, что пассивное введение 2 мАт против токсина A и токсина B приводит к защите от CDI. Помимо продемонстрированной эффективности мАт против токсина в отношении рецидивирующей инфекции CDI, результаты исследования фазы 2 для оценки эффективности также свидетельствовали о том, что уровни нейтрализующих мАт против токсина A и против токсина B, превышающие пороговое значение 10 мкг/мл («защитный» пороговый уровень) связаны с защитой от рецидива инфекции CDI.

Для перевода «защитных» от токсина A и токсина B пороговых уровней из исследования фазы 2 для оценки эффективности в обеспечивающие 50% нейтрализацию титры антител, индуцируемые вакциной-кандидатом, было использовано то наблюдение, что (1) один и тот же анализ цитотоксичности был использован для измерения нейтрализации токсинов и (2) ингибирующая концентрация мАт, которая приводит к нейтрализации 50% токсинов (IC₅₀ [50% ингибирующая концентрация]) была опубликована (значения IC₅₀ для мАт против токсина A и токсина B составляют 100 нг/мл и 15 нг/мл, соответственно). «Защитный» титр 50% нейтрализации для каждого антитела против токсина, таким образом, рассчитывали, как концентрацию антитела при защитном пороговом уровне 10 мкг/мл, деленную на величину IC₅₀ соответствующего мАт.

Для подтверждения пригодности анализа титра 50% нейтрализации для клинического применения, обеспечения дополнительной надежности анализа и гарантии унифицированных долгосрочных функциональных параметров в клинических условиях в анализ добавляли эталонный стандарт и соответствующие контроли, что позволяло получать результаты определения титра нейтрализации в виде единиц нейтрализации/мл относительно эталонного стандарта. Перед проведением анализа в текущем исследовании использовали образцы сыворотки вакцинированных людей для демонстрации линейной взаимосвязи между титрами 50% нейтрализации и единицами нейтрализации/мл при проведении анализа нейтрализации. На основании этих исследований корреляции были рассчитаны пороговые значения «защитной» нейтрализации и использованы для анализа клинических данных в этом исследовании.

В анализах иммуногенности «защитные» пороговые значения для ответов в виде выработки нейтрализующих антител против токсина A и токсина B составляли 219 и 2586 единиц нейтрализации/мл, соответственно. Несколько конечных точек определения иммуногенности для исследования B5091009 были оценены на основании этих пороговых значений «защитных» ответов.

При использовании в настоящем документе, если специально не указано иначе, «установленное пороговое» значение определено как 219 единиц нейтрализации/мл для токсина A и 2586 единиц нейтрализации/мл для токсина B.

Поскольку будет важно обеспечивать вакцинированных субъектов пролонгированной защитой от CDI, и поскольку индивидуумы, которым необходима вакцинация, могут иметь пониженную способность генерировать и поддерживать иммунный ответ, субъектов в настоящем исследовании контролировали после их третьей вакцинации для оценки персистенции антител и ответа на четвертую вакцинацию. Таким образом, субъектам при обоих режимах дозирования, получавшим первые 3 дозы вакцины от C. difficile (100 мкг или 200 мкг), было предложено участие в продленной стадии исследования, и они были рандомизированы в отношении 1:1 для получения вакцины против C. difficile или плацебо. Эти субъекты будут получать либо четвертую дозу вакцины от C. difficile с тем же уровнем дозы антигена (100 мкг или 200 мкг), который они получали ранее, либо плацебо, примерно через 1 год после их третьей дозы. Этих субъектов будут наблюдать для оценки персистенции антител. Субъекты, исходно рандомизированные в группу плацебо при любом режиме дозирования, не будут принимать участие в продленной стадии исследования.

Анализы в данном клиническом исследовании были выполнены, когда все субъекты завершали посещение 9 (месяц 13 для субъектов с режимом введения в дни 1, 8 и 30 [режим введения по дням] и месяц 18 для субъектов с режимом введения в месяцы 0, 1 и 6 [режим введения по месяцам]), и все данные по иммуногенности и безопасности вплоть до, и включительно, посещения 9 были доступны.

Методы анализа. Любому уровню специфического для токсина A или токсина B C. difficile нейтрализующего антитела, который был ниже нижнего предела количественного определения (НПКО), ПО, присваивали значение, определенное как 0,5 × НПКО. Значения НПКО в анализах нейтрализации для токсина A и токсина B составляли 158,0 единиц нейтрализации/мл и 249,5 единиц нейтрализации/мл, соответственно. Никакие другие отсутствующие данные анализа не были включены в анализы. Все анализы иммуногенности выполняли после соответствующей подстановки уровней антител, которые были ниже НПКО. Если уровень специфических для токсина A нейтрализующих антител был ≥ НПКО для токсина A, субъекта считали сероположительным в отношении токсина A. Если уровень специфических для токсина B нейтрализующих антител был ≥ НПКО для токсина B, субъекта считали сероположительным в отношении токсина B. И наоборот, если уровень антител был < НПКО, субъекта считали сероотрицательным. Данные по иммуногенности были подытожены в соответствии с дозой вакцины, определенной при рандомизации. Для исходной запланированной стадии все данные по иммуногенности были подытожены отдельно для каждого предписанного режима дозирования (дни 1, 8 и 30, и месяцы 0, 1 и 6). Для каждого предписанного режима дозирования были использованы 3 группы вакцинации (100 мкг C difficile, 200 мкг C difficile и плацебо).

Пример 4: Исследование фазы 2, режим введения 3 доз в дни 1, 8 и 30 (режим введения по дням) или месяцы 0, 1 и 6 (режим введения по месяцам) (B5091009) - Общий дизайн исследования и план

Примерно 854 здоровых взрослых человека в возрасте 65-85 лет, согласно плану, были включены в исследование примерно в 15 центрах в США. Субъекты были приписаны к 1 из 2 режимов дозирования, а затем рандомизированы параллельно в соотношении 3:3:1 в группы для получения вакцины от C. difficile (100 мкг или 200 мкг) или плацебо (солевой раствор) (Таблица 3).

Таблица 3. Группы вакцинации и запланированное число субъектов на группу и на режим дозирования Группа вакцины Описание вакцинного препарата Режим дозирования Число субъектов 1^a Содержащая гидроксид алюминия вакцина от C. difficile (доза 100 мкг антигенов) Дни 1, 8 и 30 183 2^a Содержащая гидроксид алюминия вакцина от C. difficile (доза 200 мкг антигенов) Дни 1, 8 и 30 183 3 Плацебо (солевой раствор) Дни 1, 8 и 30 61 4^a Содержащая гидроксид алюминия вакцина от C. difficile (доза 100 мкг антигенов) Месяцы 0, 1 и 6 183 5^a Содержащая гидроксид алюминия вакцина от C. difficile (доза 200 мкг антигенов) Месяцы 0, 1 и 6 183 6 Плацебо (солевой раствор) Месяцы 0, 1 и 6 61 Всего 854 a. Субъектам в этих группах было предложено участие в продленной стадии исследования.
Источник: План статистического анализа (версия 2.0), Таблица 4.

Проводили исследование фазы 2, плацебо-контролируемое, рандомизированное исследование с маскированием данных для наблюдателя с целью оценки безопасности, переносимости и иммуногенности содержащей гидроксид алюминия вакцины от C. difficile при 2 уровнях доз антигенов (суммарные дозы токсоидов 100 мкг и 200 мкг), в режиме введения 3 доз либо в дни 1, 8 и 30, либо в месяцы 0, 1 и 6, здоровым взрослым людям в возрасте 65-85 лет. Уровень дозы антигенов 100 мкг (суммарная доза токсоидов A и B) и уровень дозы антигенов 200 мкг (суммарная доза токсоидов A и B) были выбраны для данного исследования, поскольку результаты определения иммуногенности и безопасности, полученные в исследовании FIH (B5091001), показали, что уровни доз антигенов 100 и 200 мкг индуцировали аналогичные иммунные ответы. Для контрольной группы в качестве плацебо использовали стерильный нормальный солевой раствор для инъекций (0,9% хлорид натрия) в объеме 0,5 мл. Гидроксид алюминия был выбран в качестве разбавителя, поскольку было показано, что адсорбция на алюминии приводит к связыванию и медленному высвобождению компонентов вакцины из зоны инъекции.

Исследование было плацебо-контролируемым (хотя рандомизация в исходной запланированной стадии создавала преимущества для групп с активным препаратом) для проведения сравнительной оценки безопасности и переносимости исследуемого вакцинного препарата, а также для мониторинга любого потенциального изменения с течением времени естественных фоновых антител к токсинам A и B C. difficile.

При использовании режима введения по дням субъекты получали 1 дозу вакцины от C. difficile/плацебо во время посещения 1 (день 1), 2 (день 8) и 4 (день 30). При использовании режима введения по месяцам субъекты получали 1 дозу вакцины от C. difficile/плацебо во время посещения 1 (день 1), 2 (день 30) и 5 (месяц 6).

Первичные конечные точки определения иммуногенности - в день 37 (через 7 дней после дозы 3 для субъектов с режимом введения по дням) и в месяце 7 (через 1 месяц после дозы 3 для субъектов с режимом введения по месяцам) относительное количество субъектов в каждой группе вакцинации с: уровнем специфических для токсина A нейтрализующих антител (единиц нейтрализации/мл) ≥ установленного порогового значения для токсина A; уровнем специфических для токсина B нейтрализующих антител (единиц нейтрализации/мл) ≥ установленного порогового значения для токсина B; и уровнями специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител (единиц нейтрализации/мл) ≥ установленного порогового значения для токсина A и установленного порогового значения для токсина B, соответственно. Пороговые значения были установлены на уровне 219 единиц нейтрализации/мл для токсина A и 2586 единиц нейтрализации/мл для токсина B.

Вторичные конечные точки определения иммуногенности - в день 37 (через 7 дней после дозы 3 для субъектов с режимом введения по дням) и в месяце 7 (через 1 месяц после дозы 3 для субъектов с режимом введения по месяцам): уровни специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител, выраженные в виде среднего геометрического значения концентраций (СГК) (единиц нейтрализации/мл). Значения СГКУ в начале исследования (до введения дозы 1) для: уровней специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител (единиц нейтрализации/мл). Относительные количества субъектов в каждой группе вакцинации с ≥4-кратным, ≥8-кратным, ≥16-кратным и ≥32-кратным увеличением от исходного значения: уровней специфических для токсина A; специфических для токсина B; и специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител (единиц нейтрализации/мл). Для субъектов, при использовании режима введения по дням, в день 1 (непосредственно перед дозой 1), в день 8 (непосредственно перед дозой 2), в день 15 (через 7 дней после дозы 2), в день 30 (непосредственно перед дозой 3), в месяце 2 (через 1 месяц после дозы 3), в месяце 4 (через 3 месяца после дозы 3), в месяце 7 (через 6 месяцев после дозы 3) и в месяце 13 (через 12 месяцев после дозы 3); или для субъектов, при использовании режима введения по месяцам, в день 1 (непосредственно перед дозой 1), в день 30 (непосредственно перед дозой 2), в день 37 (через 7 дней после дозы 2), в месяце 2 (через 1 месяц после дозы 2), в месяце 6 (непосредственно перед дозой 3), в день 187 (через 7 дней после дозы 3), в месяце 12 (через 6 месяцев после дозы 3) и в месяце 18 (через 12 месяцев после дозы 3): относительные количества субъектов в каждой группе вакцинации с: уровнем специфических для токсина A нейтрализующих антител (единиц нейтрализации/мл) ≥ установленного порогового значения для токсина A; уровнем специфических для токсина B нейтрализующих антител (единиц нейтрализации/мл) ≥ установленного порогового значения для токсина B; и уровнями специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител (единиц нейтрализации/мл) ≥ установленного порогового значения для токсина A и установленного порогового значения для токсина B, соответственно (эти параметры также будут оценены в начале исследования). Пороговые значения были установлены на уровне 219 единиц нейтрализации/мл для токсина A и 2586 единиц нейтрализации/мл для токсина B. Уровни специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител, выраженные в виде СГК (единиц нейтрализации/мл). Значения СГКУ в начале исследования для: уровней специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител (единиц нейтрализации/мл). Относительные количества субъектов в каждой группе вакцинации с ≥4-кратным, ≥8-кратным, ≥16-кратным и ≥32-кратным увеличением от исходного значения: уровней специфических для токсина A; специфических для токсина B; и специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител (единиц нейтрализации/мл). Исходные значения для вышеуказанных конечных точек представляли собой значения при последнем измерении перед первой вакцинацией в день 1.

Анализы иммуногенности. Анализы в настоящем исследовании были выполнены, когда все субъекты завершали посещение 9 (месяц 13 для субъектов с режимом введения по дням и месяц 18 для субъектов с режимом введения по месяцам), и все данные по иммуногенности и безопасности вплоть до, и включительно, посещения 9 были доступны. В данном разделе результаты определения иммуногенности представлены отдельно для режима введения по месяцам и режима введения по дням.

Первичными конечными точками определения иммуногенности являлись: относительное количество субъектов в каждой группе вакцинации с титрами специфических для токсина A, токсина B и как токсина A, так и токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений (219 единиц нейтрализации/мл для специфических для токсина A антител и 2586 единиц нейтрализации/мл для специфических для токсина антител) в день 37 (через 7 дней после дозы 3 для субъектов с режимом введения по дням) и в месяце 7 (через 1 месяц после дозы 3 для субъектов с режимом введения по месяцам). Вторичными конечными точками определения иммуногенности были следующие: уровни специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител во всех временных точках сбора образцов, выраженные в виде СГК. Уровни специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител во всех временных точках сбора образцов, выраженные в виде СГКУ. Относительные количества субъектов в каждой группе вакцинации, у которых была достигнута установленная кратность увеличения от исходных значений уровней специфических для токсина A, токсина B, и как токсина A, так и токсина B, нейтрализующих антител во всех временных точках сбора образцов.

Выводы относительно иммуногенности. В сравнении с режимом введения по дням, при режиме введения по месяцам был достигнут более высокий иммунный ответ в день 187 и месяце 7 как против токсина A, так и против токсина B. В сравнении с режимом введения по месяцам, при режиме введения по дням был достигнут более высокий ранний иммунный ответ в день 37 и месяце 2 против токсина A, но ответы против токсина B были сходными в данных временных точках. Уровень дозы 200 мкг был более иммуногенным, чем уровень дозы 100 мкг, при обоих режимах. В случае токсина A исходная сероположительность могла увеличивать интенсивность иммунного ответа вскоре после дозы 1 (в частности, при уровне дозы 100 мкг), однако при обоих режимах имело место небольшое отличие иммунного ответа после дозы 3 в сравнении с ответом у субъектов, которые исходно были сероотрицательными в отношении токсина A. В случае токсина B исходная сероположительность увеличивала интенсивность иммунного ответа при обоих режимах. Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты уровни специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ пороговых значений, в месяце 7 при использовании режима введения по месяцам или в день 37 при использовании режима введения по дням, были аналогичными при стратификации по квинтилю возраста 65-85 лет (хотя число субъектов в возрасте 80-85 лет было небольшим).

Это было исследование фазы 2, плацебо-контролируемое, рандомизированное исследование с маскированием данных для наблюдателя с целью оценки безопасности, переносимости и иммуногенности содержащей гидроксид алюминия вакцины от C. difficile при 2 уровнях доз антигенов (суммарные дозы токсоидов 100 мкг и 200 мкг) в режиме введения 3 доз: либо в дни 1, 8 и 30 (режим введения по дням), либо в месяцы 0, 1 и 6 (режим введения по месяцам). В целом, вакцина от C. difficile была в высокой степени иммуногенной, хорошо переносимой и имеющей приемлемый профиль безопасности.

Обсуждение результатов определения иммуногенности. Основная цель изучения иммуногенности в данном исследовании заключалась в определении иммуногенности вакцины от C. difficile при 2 уровнях доз антигенов (суммарные дозы токсоидов 100 мкг и 200 мкг) в режиме введения 3 доз (либо в дни 1, 8 и 30, либо в месяцы 0, 1 и 6) здоровым взрослым людям в возрасте 65-85 лет на основании измерения уровней специфических для токсина A и токсина B C. difficile нейтрализующих антител в день 37 (через 7 дней после дозы 3) в режиме введения по дням, а также на основании измерения уровней специфических для токсина A и токсина B C. difficile нейтрализующих антител в месяце 7 (через 1 месяц после дозы 3) в режиме введения по месяцам. Иммуногенность оценивали путем измерения титров специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител на протяжении всего исследования. Результаты были выражены в виде СГК, относительных количеств субъектов, у которых были достигнуты различные показатели кратности увеличения титра, и относительных количеств субъектов, у которых были достигнуты титры выше установленного порогового уровня для каждого токсина.

Как в режиме введения по месяцам, так и в режиме введения по дням, дозы 100 мкг и 200 мкг антигенов C. difficile были иммуногенными в сравнении с плацебо. Уровень дозы 200 мкг был более иммуногенным, чем уровень дозы 100 мкг, при оценке на основании интенсивности и продолжительности ответа.

Относительные количества субъектов в режиме введения по месяцам, у которых были достигнуты титры, превышающие установленный пороговый уровень для каждого токсина, были максимальными в день 187 (через 1 неделю после дозы 3) и месяце 7 (через 1 месяц после дозы 3) как в случае токсина A, так и токсина B.

Относительные количества субъектов в режиме введения по дням, у которых были достигнуты титры, превышающие установленный пороговый уровень для токсина A, были выше в день 37 и месяце 2 в случае токсина A, однако относительные количества субъектов были сходными в этих временных точках в случае токсина B.

До вакцинации большинство субъектов в обоих режимах дозирования были сероотрицательными в отношении токсина A и в отношении токсина B. В режиме дозирования по месяцам 69,8% субъектов были сероотрицательными, 8,7% субъектов были сероположительными только в отношении токсина A, 19,0% субъектов были сероположительными только в отношении токсина B и 2,6% субъектов были сероположительными в отношении как токсина A, так и токсина B. В режиме дозирования по дням 75,4% субъектов были сероотрицательными, 4,9% субъектов были сероположительными только в отношении токсина A, 16,4% субъектов были сероположительными только в отношении токсина B и 3,0% субъектов были сероположительными в отношении как токсина A, так и токсина B.

В случае токсина A исходная сероположительность могла увеличивать интенсивность иммунного ответа вскоре после дозы 1 (в частности, при уровне дозы 100 мкг), однако в обоих режимах имело место небольшое отличие иммунного ответа после дозы 3 в сравнении с ответом у субъектов, которые исходно были сероотрицательными в отношении токсина A.

В случае токсина B исходная сероположительность увеличивала интенсивность иммунного ответа в обоих режимах. У субъектов, которые были исходно сероотрицательными в отношении токсина B, только третья доза, введенная в месяце 6, приводила к появлению значительного относительного количества субъектов, у которых было достигнуто установленное пороговое значение.

Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты уровни специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ пороговых значений, в месяце 7, при использовании режима введения по месяцам, или в день 37 при использовании режима введения по дням, были аналогичными при стратификации по квинтилю возраста 65-85 лет (хотя число субъектов в возрасте 80-85 лет было небольшим).

Уровень дозы 200 мкг в количественном выражении был более иммуногенным, чем уровень дозы 100 мкг, в обоих режимах дозирования.

Режим дозирования по месяцам приводил к более высокому ответу после дозы 3 при обоих уровнях доз, 100 мкг и 200 мкг, особенно для токсина B у субъектов, которые исходно были сероотрицательными.

Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты уровни специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ пороговых значений, были аналогичными при стратификации по квинтилю возраста 65-85 лет (хотя число субъектов в возрасте 80-85 лет было небольшим).

Пример 5: Исследование фазы 2, режим введения 3 доз в дни 1, 8 и 30 (режим введения по дням) или месяцы 0, 1 и 6 (режим введения по месяцам) (B5091009) - Оценка иммуногенности, режим введения по месяцам

Режим введения по месяцам. Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты титры специфических для токсина A, для токсина B, и как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, в зависимости от исходного серостатуса субъектов оценивали для режима введения по месяцам. Все (100,0%) рандомизированные субъекты были оценены в отношении исходного серостатуса. Большинство были исходно сероотрицательными в отношении как токсина A, так и токсина B. Среди исходно сероотрицательных субъектов относительное количество субъектов, у которых были достигнуты титры специфических для токсина A нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения, достигало 98,0% в месяце 7 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 95,0% в месяце 7 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. Относительное количество субъектов, у которых были достигнуты титры специфических для токсина B нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения, достигало 69,4% в месяце 7 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 85,0% в месяце 7 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. Среди исходно сероположительных субъектов относительное количество субъектов, у которых были достигнуты титры специфических для токсина A нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения, достигало 100,0% в месяце 7 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 100,0% в месяце 7 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. Относительное количество субъектов, у которых были достигнуты титры специфических для токсина B нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения, достигало 100,0% в день 187 и месяце 7 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 96,8% в день 37, месяце 2 и месяце 7 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile.

В случае токсина A, в месяце 7 в режиме введения по месяцам у 160 субъектов (95% ДИ: 94,7%; 99,6%) в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и у 151 субъекта (95% ДИ: 91,1%; 98,2%) в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile было достигнуто установленное пороговое значение, в сравнении с 1 субъектом (95% ДИ: 0,0%; 10,1%) в группе плацебо.

В случае токсина B, в месяце 7 в режиме введения по месяцам у 122 (74,8%) субъектов (95% ДИ: 67,5%; 81,3%) в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и у 138 (87,3%) субъектов (95% ДИ: 81,1%; 92,1%) в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile было достигнуто установленное пороговое значение, в сравнении с 4 (7,5%) субъектами (95% ДИ: 2,1%; 18,2%) в группе плацебо.

В случае как токсина A, так и токсина B, в месяце 7 в режиме введения по месяцам у 121 (74,2%) субъекта (95% ДИ: 66,8%; 80,8%) в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и у 136 (86,1%) субъектов (95% ДИ: 79,7%; 91,1%) в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile было достигнуто установленное пороговое значение, в сравнении с отсутствием таких субъектов (95% ДИ: 0,0%; 6,7%) в группе плацебо.

В режиме введения по месяцам 1 субъект в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, 2 (1,3%) субъекта в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile и 1 субъект в группе плацебо исходно имели уровни специфических для токсина A нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения. После доз 1 и 2, но до дозы 3, относительные количества субъектов, у которых было достигнуто пороговое значение для специфических для токсина A антител, были ограниченными, с 71 (43,6%) субъектом (95% ДИ: 35,8%; 51,5%) в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 89 (56,7%) субъектами (95% ДИ: 48,6%; 64,6%) в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в день 37. После дозы 3 относительные количества субъектов, у которых было достигнуто это пороговое значение, возрастали в день 187. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile в месяце 7 у 160 (98,2%) субъектов было достигнуто пороговое значение для специфических для токсина A антител, и относительное количество субъектов, у которых было достигнуто пороговое значение, уменьшалось до 75 (48,7%) субъектов в месяце 18. В группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 7 у 151 (95,6%) субъекта было достигнуто пороговое значение для специфических для токсина A антител, и относительное количество субъектов, у которых было достигнуто пороговое значение, уменьшалось до 81 (53,3%) субъекта в месяце 18.

В режиме введения по месяцам 4 (2,5%) субъекта в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, 7 (4,4%) субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile и 2 (3,8%) субъекта в группе плацебо исходно имели уровни специфических для токсина B нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения. После доз 1 и 2, но до дозы 3, у 47 (28,8%) субъектов (95% ДИ: 22,0%; 36,4%) в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile было достигнуто пороговое значение в день 37 и в месяце 2, и у 60 (38,2%) субъектов (95% ДИ: 30,6%; 46,3%) в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile было достигнуто пороговое значение в день 37. После дозы 3 относительное количество субъектов, у которых было достигнуто это пороговое значение, возрастало в день 187. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile в месяце 7 у 122 (74,8%) субъектов было достигнуто пороговое значение для специфических для токсина B антител, и относительное количество субъектов, у которых было достигнуто пороговое значение, уменьшалось до 53 (34,4%) субъектов в месяце 18. В группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 7 у 138 (87,3%) субъектов было достигнуто пороговое значение для специфических для токсина B антител, и относительное количество субъектов, у которых было достигнуто это пороговое значение, уменьшалось до 72 (47,4%) субъектов в месяце 18.

В целом, результаты для относительного количества субъектов, у которых были достигнуты уровни специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, были аналогичны таковым в случае токсина B.

Были оценены средние геометрические значения концентраций (СГК) специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител в каждой временной точке. В режиме введения по месяцам значение СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител исходно было ниже НПКО (158,0 единиц нейтрализации/мл) у субъектов в группах введения 100 мкг антигенов C. difficile, 200 мкг антигенов C. difficile и плацебо. В сравнении с исходными значениями, у субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile увеличение СГК наблюдалось в день 30 (137 единиц нейтрализации/мл), было максимальным в месяце 7 (1245 единиц нейтрализации/мл) и уменьшалось до 214 единиц нейтрализации/мл в месяце 18. В сравнении с исходными значениями у субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile увеличение СГК наблюдалось в день 30 (149 единиц нейтрализации/мл), было максимальным в месяце 7 (1380 единиц нейтрализации/мл) и уменьшалось до 257 единиц нейтрализации/мл в месяце 18. Значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител в группе плацебо были ≥93 единиц нейтрализации/мл во всех временных точках.

В режиме введения по месяцам значение СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител исходно было ниже НПКО (249,5 единиц нейтрализации/мл) у субъектов в группах введения 100 мкг антигенов C. difficile, 200 мкг антигенов C. difficile и плацебо. В сравнении с исходными значениями, у субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile увеличение СГК наблюдалось в день 30 (570 единиц нейтрализации/мл), было максимальным в месяце 7 (6255 единиц нейтрализации/мл) и уменьшалось до 1248 единиц нейтрализации/мл в месяце 18. В сравнении с исходными значениями, у субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile увеличение СГК наблюдалось в день 30 (909 единиц нейтрализации/мл), было максимальным в месяце 7 (9549 единиц нейтрализации/мл) и уменьшалось до 2178 единиц нейтрализации/мл в месяце 18. Значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител в группе плацебо были ≥263 единиц нейтрализации/мл во всех временных точках.

В режиме введения по месяцам во время всех посещений после начала исследования значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител были выше в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile. В обеих группах введения 100 мкг и 200 мкг антигенов C. difficile значения СГК после начала исследования были выше, чем в группе плацебо; однако отсутствовала четкая зависимость ответа от дозы в группах введения 100 мкг и 200 мкг антигенов C. difficile. В режиме введения по месяцам во время всех посещений после начала исследования значения СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител были выше в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile. В обеих группах введения 100 мкг и 200 мкг антигенов C. difficile значения СГК после начала исследования были выше, чем в группе плацебо. Наблюдалась четкая зависимость ответа от дозы в группах введения 100 мкг и 200 мкг антигенов C. difficile после дозы 3 (в месяце 12 и месяце 18). Значения СГК специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител в зависимости от исходного серостатуса субъектов были подытожены для режима введения по месяцам. Значения СГК специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител в зависимости от возраста и исходного серостатуса субъектов были подытожены для режима введения по дням.

Для режима введения по месяцам значения среднего геометрического кратности увеличения (СГКУ) титров специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител от исходных значений рассчитывали в день 30, в день 37, в месяце 2, в месяце 6, в день 187, в месяце 7, в месяце 12 и в месяце 18.

После дозы 2 увеличение значений СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител наблюдалось в день 37 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 2,70; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 3,78). После дозы 3 бустерный ответ наблюдался в день 187 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 5,85; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 8,54). Этот бустерный ответ был максимальным в месяце 7 (через 1 месяц после дозы 3), с показателями СГКУ, составляющими 14,58 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 15,85 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. Значения СГКУ уменьшались до 2,51 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 2,95 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 18.

После дозы 2 увеличение значений СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител наблюдалось в день 37 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 3,75; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 5,59). После дозы 3 значительный бустерный ответ наблюдался в день 187 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 15,85; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 24,44). Этот бустерный ответ был максимальным в месяце 7 (через 1 месяц после дозы 3), с показателями СГКУ, составляющими 35,43 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 49,98 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. Значения СГКУ уменьшались до 7,07 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 11,21 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 18.

Со дня 30 до месяца 18 значения СГКУ для специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител были выше в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile.

Значения СГКУ для специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител в каждой временной точке в зависимости от исходного серостатуса субъектов оценивали для режима введения по месяцам. У исходно сероотрицательных субъектов увеличение значений СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител наблюдалось в день 37 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 2,74; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 4,07). После дозы 3 бустерный ответ наблюдался в день 187 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 6,29; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 9,37). Этот бустерный ответ был максимальным в месяце 7, с показателями СГКУ, составляющими 15,88 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 17,32 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. Значения СГКУ уменьшались до 2,59 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 3,12 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 18. После дозы 2 значения СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител сравнялись в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile (в день 30: 2,45; в день 37: 2,67; в месяце 2: 2,79) и группе введения 200 мкг антигенов C. difficile (в день 30: 3,40; в день 37: 3,95; в месяце 2: 3,94). После дозы 3 значительный бустерный ответ наблюдался в день 187 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 16,00; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 26,67). Этот бустерный ответ был максимальным в месяце 7, с показателями СГКУ, составляющими 39,29 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 61,04 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. Значения СГКУ уменьшались до 6,95 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 11,57 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 18.

У исходно сероположительных субъектов увеличение значений СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител наблюдалось в день 37 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 2,37; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 2,13). После дозы 3 бустерный ответ наблюдался в день 187 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 3,03; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 4,18). Этот бустерный ответ был максимальным в месяце 7, с показателями СГКУ, составляющими 6,65 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 7,96 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. Значения СГКУ уменьшались до 1,87 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 1,91 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 18. После дозы 2 увеличение значений СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител наблюдалось в день 37 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 17,97; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 23,01). После дозы 3 значительный бустерный ответ наблюдался в месяце 7 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 21,96; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 21,99). Этот бустерный ответ был максимальным в месяце 7. Значения СГКУ уменьшались до 7,68 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 9,91 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 18.

Со дня 30 до месяца 18 значения СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител были выше в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, за исключением показателей в день 30 и день 37 у исходно сероположительных субъектов. После дня 187 значения СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител были выше у исходно сероотрицательных субъектов в группах обеих доз в сравнении с исходно сероположительными субъектами. Со дня 30 до месяца 18 значения СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител у исходно сероотрицательных и сероположительных субъектов были выше в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile. Со дня 30 до месяца 6 значения СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител были выше у исходно сероположительных субъектов в сравнении с исходно сероотрицательными субъектами, однако со дня 187 до месяца 18 значения СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител были выше у исходно сероотрицательных субъектов в сравнении с исходно сероположительными субъектами.

Были подытожены относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A, токсина B, и как токсина A, так и токсина B, нейтрализующих антител в день 37 и в других временных точках сбора образцов.

В целом, большие относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител, наблюдались в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile увеличение относительных количеств субъектов, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение, наблюдалось со дня 37, при этом у 125 (76,7%) субъектов было достигнуто ≥8-кратное увеличение в месяце 7. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile у 77 (47,2%) субъектов было достигнуто ≥16-кратное увеличение, и у 33 (20,2%) субъектов было достигнуто ≥32-кратное увеличение уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител в месяце 7. В группе введения 200 мкг антигенов C. difficile увеличение относительных количеств субъектов, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение, наблюдалось со дня 37, со значительным увеличением относительного количества субъектов, у которых было достигнуто ≥8-кратное увеличение в день 187. В группе введения 200 мкг антигенов C. difficile у 89 (56,3%) субъектов было достигнуто ≥16-кратное увеличение, и у 34 (21,5%) субъектов было достигнуто ≥32-кратное увеличение уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител в месяце 7.

В целом, большие относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител, наблюдались в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile увеличение относительных количеств субъектов, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение, наблюдалось со дня 37, при этом у 138 (84,7%) субъектов было достигнуто ≥8-кратное увеличение в месяце 7. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile у 85 (52,5%) субъектов было достигнуто ≥16-кратное, и у 52 (32,1%) субъектов было достигнуто ≥32-кратное, увеличение уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител в день 187. В группе введения 200 мкг антигенов C. difficile увеличение относительных количеств субъектов, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение, наблюдалось со дня 187, со значительным увеличением относительного количества субъектов, у которых было достигнуто ≥8-кратное увеличение в день 187. Что касается группы введения 200 мкг антигенов C. difficile, у 105 (66,5%) субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile было достигнуто ≥32-кратное увеличение уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител в месяце 7.

В целом, результаты для относительного количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных показателей уровней специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител, были аналогичны таковым в случае токсина A.

Кривые обратного интегрального распределения (КОИР), представляющие данные для уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител, измеренных в день 1, в день 30, в день 37, в месяце 2, в месяце 6, в день 187, в месяце 7, в месяце 12 и в месяце 18, в зависимости от групп вакцинации были оценены для режима введения по месяцам. КОИР, представляющие данные для уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител, измеренных в день 1, в день 30, в день 37, в месяце 2, в месяце 6, в день 187, в месяце 7, в месяце 12 и в месяце 18, в зависимости от групп вакцинации были оценены для режима введения по месяцам. В целом, наблюдали смещение кривой вправо для вакцинированных групп, это указывало на то, что иммунизация токсоидной вакциной приводила к увеличению уровней титров относительно уровней, наблюдаемых в случае плацебо. Эти данные находились в соответствии с данными по СГК и относительному количеству субъектов, у которых были достигнуты уровни ≥ установленных пороговых значений.

Пример 6: Исследование фазы 2, режим введения 3 доз в дни 1, 8 и 30 (режим введения по дням) или месяцы 0, 1 и 6 (режим введения по месяцам) (B5091009) - Оценка иммуногенности, режим введения по дням

Режим введения по дням. Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты титры специфических для токсина A, токсина B и как токсина A, так и токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, в зависимости от исходного серостатуса субъектов были оценены для режима введения по дням. Большинство субъектов были исходно сероотрицательными в отношении как токсина A, так и токсина B. Среди исходно сероотрицательных субъектов относительное количество субъектов, у которых были достигнуты титры специфических для токсина A нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения, достигало 67,7% в день 37 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 85,2% в день 37 и месяце 2 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. Относительное количество субъектов, у которых были достигнуты титры специфических для токсина B нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения, достигало 14,0% в день 15 и день 37 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 25,2% в день 37 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. У исходно сероположительных субъектов относительные количества субъектов, у которых были достигнуты титры специфических для токсина A нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения, достигали 80,0% в день 37 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 86,7% в день 37 и месяце 2 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты титры специфических для токсина B нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения, достигали 97,1% в день 30 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 93,9% в день 37 и месяце 2 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile.

В случае токсина A, в день 37 в режиме введения по дням у 117 (68,4%) субъектов (95% ДИ: 60,9%; 75,3%) в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и у 141 (85,5%) субъекта (95% ДИ: 79,1%; 90,5%) в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile было достигнуто установленное пороговое значение, в сравнении с 7 (12,5%) субъектами (95% ДИ: 5,2%; 24,1%) в группе плацебо.

В случае токсина B, в день 37 в режиме введения по дням у 51 (29,8%) субъекта (95% ДИ: 23,1%; 37,3%) в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и у 64 (38,8%) субъектов (95% ДИ: 31,3%; 46,7%) в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile было достигнуто установленное пороговое значение, в сравнении с 1 субъектом (95% ДИ: 0,0%; 9,6%) в группе плацебо.

В случае как токсина A, так и токсина B, в день 37 в режиме введения по дням у 45 (26,3%) субъектов (95% ДИ: 19,9%; 33,6%) в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и у 64 (38,8%) субъектов (95% ДИ: 31,3%; 46,7%) в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile было достигнуто установленное пороговое значение, в сравнении с отсутствием таких субъектов (95% ДИ: 0,0%; 6,4%) в группе плацебо.

В режиме введения по дням 2 (1,2%) субъекта в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 1 субъект в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile имели уровни специфических для токсина A нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения в начале исследования. После доз 1 и 2, но до дозы 3, относительные количества субъектов, у которых было достигнуто пороговое значение для специфических для токсина A антител, были ограниченными, с 29 (17,0%) субъектами (95% ДИ: 11,7%; 23,4%) в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 41 (25,0%) субъектом (95% ДИ: 18,6%; 32,3%) в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в день 15. После дозы 3 относительное количество субъектов, у которых было достигнуто это пороговое значение, возрастало в день 37. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile в день 37 у 117 (68,4%) субъектов было достигнуто пороговое значение для специфических для токсина A антител, и относительное количество субъектов, у которых было достигнуто пороговое значение, уменьшалось до 16 (10,1%) субъектов в месяце 13. В группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в день 37 и в месяце 2 у 141 (85,5%) субъекта было достигнуто пороговое значение для специфических для токсина A антител, и относительное количество субъектов, у которых было достигнуто это пороговое значение, уменьшалось до 40 (25,8%) субъектов в месяце 13.

В режиме введения по дням 8 (4,7%) субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, 6 (3,7%) субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile и 3 (5,4%) субъекта в группе плацебо имели уровни специфических для токсина B нейтрализующих антител ≥ установленного порогового значения в начале исследования. После доз 1 и 2, но до дозы 3, у 52 (30,4%) субъектов (95% ДИ: 23,6%; 37,9%) в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и у 61 (37,2%) субъекта (95% ДИ: 29,8%; 45,1%) в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile было достигнуто пороговое значение в день 15. После дозы 3 относительное количество субъектов, у которых было достигнуто это пороговое значение, оставалось стабильным до дня 37. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile в день 30 и день 37 у 51 (29,8%) субъекта было достигнуто пороговое значение для специфических для токсина B антител, и относительное количество субъектов, у которых было достигнуто пороговое значение, уменьшалось до 31 (19,6%) субъекта в месяце 13. В группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в день 37 у 64 (38,8%) субъектов было достигнуто пороговое значение для специфических для токсина B антител, и относительное количество субъектов, у которых было достигнуто это пороговое значение, уменьшалось до 48 (31,0%) субъектов в месяце 13.

В целом, результаты для относительного количества субъектов, у которых были достигнуты уровни специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, были аналогичны таковым в случае токсина B.

Были оценены значения СГК специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител в каждой временной точке. В режиме введения по дням в начале исследования значение СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител было ниже НПКО (158,0 единиц нейтрализации/мл) у субъектов в группах введения 100 мкг антигенов C. difficile, 200 мкг антигенов C. difficile и плацебо. В сравнении с исходными значениями у субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile увеличение СГК наблюдалось в день 15 (143 единиц нейтрализации/мл), было максимальным в день 37 (368 единиц нейтрализации/мл) и уменьшалось до 105 единиц нейтрализации/мл в месяце 13. В сравнении с исходными значениями у субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile увеличение СГК наблюдалось в день 15 (192 единиц нейтрализации/мл), было максимальным в день 37 (556 единиц нейтрализации/мл) и уменьшалось до 138 единиц нейтрализации/мл в месяце 13. Значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител в группе плацебо составляли ≤102 единиц нейтрализации/мл во всех временных точках.

В режиме введения по дням в начале исследования значение СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител было ниже НПКО (249,5 единиц нейтрализации/мл) у субъектов в группах введения 100 мкг антигенов C. difficile, 200 мкг антигенов C. difficile и плацебо. В сравнении с исходными значениями у субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile увеличение СГК наблюдалось в день 8 (273 единиц нейтрализации/мл), было максимальным в день 15 (807 единиц нейтрализации/мл) и уменьшалось до 447 единиц нейтрализации/мл в месяце 13. В сравнении с исходными значениями у субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile увеличение СГК наблюдалось в день 8 (290 единиц нейтрализации/мл), было максимальным в день 37 (1219 единиц нейтрализации/мл) и уменьшалось до 828 единиц нейтрализации/мл в месяце 13. Значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител в группе плацебо были ≥211 единиц нейтрализации/мл во всех временных точках.

В режиме введения по дням во время всех посещений после начала исследования значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител были выше в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile. В обеих группах введения 100 мкг и 200 мкг антигенов C. difficile значения СГК после начала исследования были выше, чем в группе плацебо; и четкая зависимость ответа от дозы наблюдалась в группах введения 100 мкг и 200 мкг антигенов C. difficile.

В режиме введения по дням во время всех посещений после начала исследования значения СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител были выше в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile. В обеих группах введения 100 мкг и 200 мкг антигенов C. difficile значения СГК после начала исследования были выше, чем в группе плацебо; однако отсутствовала четкая зависимость ответа от дозы в группах введения 100 мкг и 200 мкг антигенов C. difficile.

Значения СГК специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител в зависимости от исходного серостатуса субъектов были подытожены для режима введения по дням. Значения СГК специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител в зависимости от возраста и исходного серостатуса субъектов были подытожены для режима введения по дням.

Для режима введения по дням среднее геометрическое кратности увеличения (СГКУ) от исходных показателей концентраций специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител было рассчитано в день 8, в день 15, в день 30, в день 37, в месяце 2, в месяце 4, в месяце 7 и в месяце 13. После дозы 2 увеличение значений СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител наблюдалось в день 15 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 1,73; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 2,27). После дозы 3 бустерный ответ наблюдался в день 37 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 4,45; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 6,56). Этот бустерный ответ был максимальным в день 37 (через 7 дней после дозы 3), и значение составляло 3,56 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и 5,71 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 2. Значения СГКУ уменьшались до 1,26 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 1,64 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 13.

После дозы 2 заметное увеличение значений СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител наблюдалось в день 15 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 4,31; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 5,86). После дозы 3 бустерный ответ наблюдался в день 37 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile (СГКУ 6,57), однако значения СГКУ сравнялись в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile (в день 30: 3,76; в день 37: 3,89; в месяце 2: 3,61). Этот бустерный ответ был максимальным в день 37 (через 7 дней после дозы 3) в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile. Значения СГКУ уменьшались до 2,40 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 4,44 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 13.

Со дня 8 до месяца 13 значения СГКУ для специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител были выше в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile.

Значения СГКУ для специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител в зависимости от исходного серостатуса субъектов в каждой временной точке были оценены для режима введения по дням. Среди исходно сероотрицательных субъектов увеличение значений СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител наблюдалось в день 30 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 2,01; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 2,95). После дозы 3 бустерный ответ наблюдался в день 37 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 4,48; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 6,95). Этот бустерный ответ был максимальным в день 37. Значения СГКУ уменьшались до 1,28 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 1,75 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 13. После дозы 2 увеличение значений СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител наблюдалось в день 15 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 2,57; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 3,81). После дозы 3 значения СГКУ сравнялись в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile (в день 30: 2,37; в день 37: 2,56; в месяце 2: 2,42) и в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile (в день 30: 3,68; день 37: 4,55; в месяце 2: 4,22). Значения СГКУ уменьшались до 2,01 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 4,00 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 13.

Среди исходно сероположительных субъектов увеличение значений СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител наблюдалось в день 30 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 2,47; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 1,20). После дозы 3 бустерный ответ наблюдался в день 37 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 3,97; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 3,68). Этот бустерный ответ был максимальным в день 37. Значения СГКУ уменьшались до 0,99 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 0,81 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 13. После дозы 2 заметное увеличение значений СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител наблюдалось в день 15 (группа введения 100 мкг антигенов C. difficile, 32,18; группа введения 200 мкг антигенов C. difficile, 32,14). Бустерный ответ не был очевидным после дозы 3, поскольку значения СГКУ сравнялись в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile (в день 30: 22,86; в день 37: 19,74; в месяце 2: 17,23) и в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile (в день 30: 27,50; в день 37: 28,23; в месяце 2: 25,54). Значения СГКУ уменьшались до 4,72 в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и до 6,70 в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile в месяце 13.

Со дня 8 до месяца 13 значения СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител у исходно сероотрицательных субъектов были выше в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile. Со дня 8 до месяца 13 значения СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител у исходно сероположительных субъектов были ниже в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, за исключением месяца 4. Значения СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител были выше у исходно сероотрицательных субъектов в группах обеих доз в сравнении с исходно сероположительными субъектами. Со дня 8 до месяца 13 значения СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител у исходно сероотрицательных и сероположительных субъектов были выше в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, за исключением дня 15 у исходно сероположительных субъектов. Со дня 8 до месяца 13 значения СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител были выше у исходно сероположительных субъектов, чем у исходно сероотрицательных субъектов.

Были подытожены относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A, токсина B, и как токсина A, так и токсина B, нейтрализующих антител в день 37 и в других временных точках сбора образцов крови.

В целом, большие относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител, наблюдались в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile увеличение относительных количеств субъектов, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение, наблюдалось со дня 15, при этом у 43 (25,1%) субъектов было достигнуто ≥8-кратное увеличение в день 37. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile у 15 (8,8%) субъектов было достигнуто ≥16-кратное увеличение, и у 6 (3,5%) субъектов было достигнуто ≥32-кратное увеличение уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител в день 37. В группе введения 200 мкг антигенов C. difficile увеличение относительных количеств субъектов, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение, наблюдалось со дня 15, с заметным увеличением относительного количества субъектов (67 [40,0%]), у которых было достигнуто ≥8-кратное увеличение в день 37. В группе введения 200 мкг антигенов C. difficile у 23 (14,1%) субъектов было достигнуто ≥16-кратное увеличение, и у 15 (9,2%) субъектов было достигнуто ≥32-кратное увеличение уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител в день 15.

В целом, сходные относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител, наблюдались в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile и группе введения 200 мкг антигенов C. difficile вплоть до месяца 4. В месяцы 7 и 13 большие относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител, наблюдались в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile, чем в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile увеличение относительных количеств субъектов, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение, наблюдалось со дня 15, при этом у 57 (33,3%) субъектов было достигнуто ≥8-кратное увеличение в день 15 и день 30. В группе введения 100 мкг антигенов C. difficile у 45 (26,3%) субъектов было достигнуто ≥16-кратное увеличение, и у 35 (20,5%) субъектов было достигнуто ≥32-кратное увеличение уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител в день 15. В группе введения 200 мкг антигенов C. difficile увеличение относительных количеств субъектов, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение, наблюдалось со дня 15, с заметным увеличением относительного количества субъектов (66 [40,2%]), у которых было достигнуто ≥8-кратное увеличение в день 37. В группе введения 200 мкг антигенов C. difficile у 61 (37,4%) субъекта было достигнуто ≥16-кратное увеличение, и у 45 (27,4%) субъектов было достигнуто ≥32-кратное увеличение уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител в день 30 и день 37.

В целом, результаты для относительного количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных показателей уровней специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител, были аналогичны таковым в случае токсина A.

Кривые обратного интегрального распределения (КОИР), представляющие данные для уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител, измеренных в день 1, в день 8, в день 15, в день 30, в день 37, в месяце 2, в месяце 4, в месяце 7 и в месяце 13, в зависимости от группы вакцинации были оценены для режима введения по дням. КОИР, представляющие данные для уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител, измеренных в день 1, в день 8, в день 15, в день 30, в день 37, в месяце 2, в месяце 4, в месяце 7 и в месяце 13, в зависимости от групп вакцинации были оценены для режима введения по дням. В целом, наблюдали смещение кривой вправо для вакцинированных групп, это указывало на то, что иммунизация токсоидной вакциной приводила к увеличению уровней титров относительно уровней, наблюдаемых в случае плацебо. Эти данные находились в соответствии с данными по СГК и относительному количеству субъектов, у которых были достигнуты уровни ≥ установленных пороговых значений.

Пример 7: Исследование фазы 2, режим введения 3 доз в дни 1, 8 и 30 (режим введения по дням) или месяцы 0, 1 и 6 (режим введения по месяцам) (B5091009) - Оценка иммуногенности, результаты по возрастным группам

Также был оценен иммунный ответ в зависимости от возрастной группы (65-69 лет, 70-74 лет, 75-79 лет и 80-85 лет).

В режиме введения по месяцам в месяце 7 относительные количества субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых были достигнуты титры специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 80,0% из 70 субъектов в возрасте 65-69 лет, 68,8% из 48 субъектов в возрасте 70-74 лет, 73,5% из 34 субъектов в возрасте 75-79 лет и 63,6% из 11 субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 90,6% из 64 субъектов в возрасте 65-69 лет, 83,9% из 56 субъектов в возрасте 70-74 лет, 89,7% из 29 субъектов в возрасте 75-79 лет и 55,6% из 9 субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по месяцам в месяце 7 значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител у субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile составляли 1304 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 65-69 лет, 1182 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 70-74 лет, 1254 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 75-79 лет и 1132 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие значения СГК у субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 1690 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 65-69 лет, 1073 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 70-74 лет, 1627 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 75-79 лет и 925 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по месяцам в месяце 7 значения СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител у субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile составляли 7608 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 65-69 лет, 5688 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 70-74 лет, 5446 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 75-79 лет и 4178 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие значения СГК у субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 11835 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 65-69 лет, 8750 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 70-74 лет, 10533 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 75-79 лет и 2608 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по месяцам в месяце 7 относительные количества исходно сероотрицательных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых были достигнуты титры специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 73,9% из 46 субъектов в возрасте 65-69 лет, 64,1% из 39 субъектов в возрасте 70-74 лет, 67,9% из 28 субъектов в возрасте 75-79 лет и 62,5% из 8 субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 91,3% из 46 субъектов в возрасте 65-69 лет, 81,1% из 37 субъектов в возрасте 70-74 лет, 86,4% из 22 субъектов в возрасте 75-79 лет и 55,6% из 9 субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по месяцам в месяце 7 относительные количества исходно сероположительных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых были достигнуты титры специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 100,0% из 2 субъектов в возрасте 65-69 лет, 100,0% из 1 субъекта в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 66,7% из 3 субъектов в возрасте 65-69 лет, 100,0% из 2 субъектов в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по месяцам в месяце 7 относительные количества исходно сероотрицательных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых были достигнуты титры специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 73,9% из 46 субъектов в возрасте 65-69 лет, 64,1% из 39 субъектов в возрасте 70-74 лет, 67,9% из 28 субъектов в возрасте 75-79 лет и 62,5% из 8 субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 91,3% из 46 субъектов в возрасте 65-69 лет, 81,1% из 37 субъектов в возрасте 70-74 лет, 86,4% из 22 субъектов в возрасте 75-79 лет и 55,6% из 9 субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по месяцам в месяце 7 относительные количества исходно сероположительных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых были достигнуты титры специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 100,0% из 2 субъектов в возрасте 65-69 лет, 100,0% из 1 субъекта в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 66,7% из 3 субъектов в возрасте 65-69 лет, 100,0% из 2 субъектов в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по месяцам в месяце 7 относительные количества исходно сероотрицательных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение от исходных значений титров специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 84,8% из 46 субъектов в возрасте 65-69 лет, 87,2% из 39 субъектов в возрасте 70-74 лет, 78,6% из 28 субъектов в возрасте 75-79 лет и 100,0% из 8 субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 91,3% из 46 субъектов в возрасте 65-69 лет, 81,1% из 37 субъектов в возрасте 70-74 лет, 100,0% из 22 субъектов в возрасте 75-79 лет и 77,8% из 9 субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по месяцам в месяце 7 относительные количества исходно сероположительных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение от исходных значений титров специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 100,0% из 2 субъектов в возрасте 65-69 лет, 100% из 1 субъекта в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 66,7% из 3 субъектов в возрасте 65-69 лет, 50,0% из 2 субъектов в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по дням в день 37 относительные количества субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых были достигнуты титры специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 23,0% из 74 субъектов в возрасте 65-69 лет, 30,2% из 53 субъектов в возрасте 70-74 лет, 28,6% из 28 субъектов в возрасте 75-79 лет и 25,0% из 16 субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 38,0% из 71 субъекта в возрасте 65-69 лет, 30,0% из 50 субъектов в возрасте 70-74 лет, 48,3% из 29 субъектов в возрасте 75-79 лет и 53,3% из 15 субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по дням в день 37 значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител у субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile составляли 422 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 65-69 лет, 389 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 70-74 лет, 282 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 75-79 лет и 262 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие значения СГК у субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 569 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 65-69 лет, 558 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 70-74 лет, 496 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 75-79 лет и 616 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по дням в день 37 значения СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител у субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile составляли 653 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 65-69 лет, 809 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 70-74 лет, 566 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 75-79 лет и 1309 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие значения СГК у субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 1192 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 65-69 лет, 805 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 70-74 лет, 2404 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 75-79 лет и 1449 единиц нейтрализации/мл у субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по дням в день 37 относительные количества исходно сероотрицательных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых были достигнуты титры специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 11,9% из 59 субъектов в возрасте 65-69 лет, 13,2% из 38 субъектов в возрасте 70-74 лет, 9,1% из 22 субъектов в возрасте 75-79 лет и 9,1% из 11 субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 22,4% из 49 субъектов в возрасте 65-69 лет, 21,1% из 38 субъектов в возрасте 70-74 лет, 36,4% из 22 субъектов в возрасте 75-79 лет и 46,2% из 13 субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по дням в день 37 относительные количества исходно сероположительных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых были достигнуты титры специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 100,0% из 2 субъектов в возрасте 65-69 лет, 50,0% из 2 субъектов в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 100,0% из 3 субъектов в возрасте 65-69 лет, 100,0% из 3 субъектов в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по дням в день 37 относительные количества исходно сероотрицательных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых были достигнуты титры специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 11,9% из 59 субъектов в возрасте 65-69 лет, 13,2% из 38 субъектов в возрасте 70-74 лет, 9,1% из 22 субъектов в возрасте 75-79 лет и 9,1% из 11 субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 22,4% из 49 субъектов в возрасте 65-69 лет, 21,1% из 38 субъектов в возрасте 70-74 лет, 36,4% из 22 субъектов в возрасте 75-79 лет и 46,2% из 13 субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по дням в день 37 относительные количества исходно сероположительных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых были достигнуты титры специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 100,0% из 2 субъектов в возрасте 65-69 лет, 50,0% из 2 субъектов в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 100,0% из 3 субъектов в возрасте 65-69 лет, 100,0% из 3 субъектов в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по дням в день 37 относительные количества исходно сероотрицательных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение от исходных значений титров специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 15,3% из 59 субъектов в возрасте 65-69 лет, 18,4% из 38 субъектов в возрасте 70-74 лет, 18,2% из 22 субъектов в возрасте 75-79 лет и 18,2% из 11 субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 24,5% из 49 субъектов в возрасте 65-69 лет, 26,3% из 38 субъектов в возрасте 70-74 лет, 36,4% из 22 субъектов в возрасте 75-79 лет и 46,2% из 13 субъектов в возрасте 80-85 лет.

В режиме введения по дням в день 37 относительные количества исходно сероположительных субъектов в группе введения 100 мкг антигенов C. difficile, у которых было достигнуто ≥4-кратное увеличение от исходных значений титров специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител ≥ установленных пороговых значений, составляли 100,0% из 2 субъектов в возрасте 65-69 лет, 50,0% из 2 субъектов в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет. Соответствующие относительные количества субъектов в группе введения 200 мкг антигенов C. difficile составляли 33,3% из 3 субъектов в возрасте 65-69 лет, 0,0% из 3 субъектов в возрасте 70-74 лет, оценка была невозможна у субъектов в возрасте 75-79 лет и оценка была невозможна у субъектов в возрасте 80-85 лет.

Пример 8: Плацебо-контролируемое, рандомизированное исследование фазы 2 с маскированием данных для наблюдателя с целью оценки безопасности, переносимости и иммуногенности вакцины от Clostridium difficile с двумя режимами введения 3 доз здоровым взрослым людям в возрасте 65-85 лет, продолжающееся до 12 месяцев после дозы 3.

Clostridium difficile (C. difficile) является основной причиной внутрибольничной диареи, связанной с приемом антибиотиков. До настоящего времени не существует вакцины для предотвращения инфекции, вызываемой C. difficile (CDI). В данном исследовании фазы 2 авторы изобретения изучали безопасность, переносимость и иммуногенность вакцины от C. difficile на основе токсоидов на 855 здоровых иммунокомпетентных взрослых людях в возрасте 65-85 лет в США.

Методы. Исходная запланированная стадия данного испытания была проведена с 16 июля 2015 г. до 7 марта 2017 г. Субъекты были включены в исследование и рандомизированы для получения антигенов с одним из двух уровней доз (100 мкг или 200 мкг) или плацебо, и с применением одного из двух режимов введения 3 доз: в дни 1, 8 и 30 (режим введения по дням) или в месяцы 0, 1 и 6 (режим введения по месяцам). Тестирование иммуногенности проводили на образцах крови, собираемых во время каждого из девяти посещений во время исследования. Локальную и системную реактогенность определяли после каждой вакцинации. Несерьезные нежелательные явления (НЯ) регистрировали в течение срока вплоть до 1 месяца после дозы 3. Серьезные нежелательные явления (СНЯ) регистрировали в течение срока вплоть до 6 месяцев после дозы 3. 855 здоровых иммунокомпетентных субъектов были включены в исследование и рандомизированы параллельно в соотношении 3:3:1 для получения 3 доз вакцины от C. difficile (общее количество токсоидов 100 мкг или 200 мкг) или плацебо (солевой раствор) в 1 из 2 режимов дозирования: в дни 1, 8 и 30 (режим дозирования по дням) или в месяцы 0, 1 и 6 (режим дозирования по месяцам). Тестирование иммуногенности проводили на образцах крови, собираемых во время каждого из 9 посещений во время исследования: в дни 1, 8, 15, 30, 37, месяцы 2, 4, 7 и 13 в режиме введения по дням; и в дни 1, 30, 37, 187, месяцы 2, 6, 7, 12 и 18 в режиме введения по месяцам. Концентрации специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих иммуноглобулинов G (IgG) (единицы нейтрализации/мл) измеряли во время каждого запланированного посещения во время исследования. Для антител к токсину A и токсину B рассчитывали средние геометрические значений концентраций (СГК) и устанавливали пороговые значения для нейтрализации (ФИГ. 2A, ФИГ. 2B, ФИГ. 2C и ФИГ. 2D). Локальные реакции и системные явления регистрировали с использованием электронного дневника в течение 14 дней после каждой вакцинации (через 7 дней после дозы 1 в режиме введения по дням). Регистрацию нежелательных явлений начинали с момента подписания информированного согласия и вплоть до 1 месяца после дозы 3. Серьезные нежелательные явления (СНЯ) регистрировали в течение срока вплоть до 6 месяцев после дозы 3. Проводили описательный анализ безопасности, реактогенности и иммуногенности при каждом режиме вакцинации для доз антигенов (100 мкг и 200 мкг) и плацебо.

Результаты. В целом, иммуногенность была выше в группе введения 200 мкг в режиме дозирования по месяцам после 3 доз. Наблюдали возрастание локальной реактогенности после дозы № 2 в режиме дозирования по дням. Степень наличия нежелательных явлений в режиме введения по месяцам в численном выражении была выше, чем в режиме введения по дням, из-за дополнительного 5-месячного периода последующего наблюдения.

Пик иммунного ответа на вакцинацию в виде выработки антител наблюдали в месяце 7 и в день 37 после дозы 3 для режимов введения по месяцам и по дням, соответственно - (ФИГ. 2A, ФИГ. 2B, ФИГ. 2C и ФИГ. 2D).

Через 12 месяцев после дозы 3 в режиме введения по месяцам наблюдали более высокое относительное количество субъектов с титрами, превышающими заранее установленные пороговые значения для нейтрализации, в сравнении с режимом введения по дням, независимо от группы дозы - (ФИГ. 1A, ФИГ. 1B, ФИГ. 1C и ФИГ. 1D).

Через 12 месяцев после дозы 3 средние геометрические значения концентраций (СГК) антител в режиме введения по месяцам были выше в сравнении со значениями СГК в режиме введения по дням для токсина B (4-кратное превышение) и токсина A (2-кратное превышение) - ( ФИГ. 2A, ФИГ. 2B, ФИГ. 2C и ФИГ. 2D).

Через 12 месяцев после дозы 3 значения СГК антител к токсину A оставались выше порога нейтрализации в группе 200 мкг с режимом введения по месяцам - (ФИГ. 2A и ФИГ. 2B).

Значения СГК антител к токсину B были выше порога нейтрализации в группе 200 мкг с режимом введения по месяцам в течение примерно 9 месяцев после дозы 3 - (ФИГ. 2A и ФИГ. 2B).

Боль была наиболее часто отмечаемой локальной реакцией; частота появления покраснения и отека была <10% после каждой дозы в обоих режимах введения.

Не было отмечено ни одного события локальной или системной реактогенности 4 степени в течение исследования.

В режиме введения по месяцам не было отмечено какой-либо существенной разницы в совокупном количестве нежелательных явлений между группами введения доз и плацебо - (ФИГ. 3A и ФИГ. 3B).

Серьезные нежелательные явления (СНЯ), связанные с вакцинацией от C difficile, отсутствовали на протяжении испытания при всех режимах введения и во всех группах дозирования - (ФИГ. 3A и ФИГ. 3B).

Выводы. Режим введения по месяцам характеризуется большей иммуногенностью, чем режим введения по дням, после 3 доз вакцины от C difficile. Повышенную локальную реактогенность наблюдали после дозы 2, введенной в день 8, в частности, при уровне дозы 200 мкг. Связанные с препаратом нежелательные явления, серьезные нежелательные явления и случаи прекращения участия в исследовании вследствие нежелательных явлений были больше в числовом выражении в группах введения активной вакцины, но явные закономерности, которые могли бы свидетельствовать о проблемах с безопасностью, отсутствовали. В целом, частота и природа нежелательных явлений были характерными для этой возрастной группы во всех слоях населения. Вакцина от C. difficile была иммуногенной и хорошо переносимой. Вакцина-кандидат от Clostridium difficile является высоко иммуногенной, хорошо переносится и имеет приемлемый профиль безопасности. Режим введения по месяцам дозы 200 мкг, в целом, отличался большей иммуногенностью был выбран для разработки исследования фазы 3.

Уровень дозы 200 мкг неизменно был более иммуногенным, чем уровень дозы 100 мкг. Режим введения по дням приводит к лучшему раннему иммунному ответу в день 37/месяце 2 для токсина A, но не для токсина B. Смотри, например, ФИГ. 4A, ФИГ. 4B, ФИГ. 5A и ФИГ. 5B. В случае токсина A исходная сероположительность вносит вклад в интенсивность раннего иммунного ответа (в частности, при уровне дозы 100 мкг), однако в обоих режимах введения после дозы 3 разница была очень небольшой. В случае токсина B у исходно сероотрицательных субъектов (~80% от общего количества) лишь 3-я доза, введенная в месяце 6, приводила к значительному относительному количеству субъектов, у которых были достигнуты пороговые значения. Смотри, например, ФИГ. 6A, ФИГ. 6B, ФИГ. 7A и ФИГ. 7B. Для всех системных явлений отсутствовали существенные различия между группами введения плацебо и вакцины от C. difficile, или между группами с уровнями доз 100 мкг и 200 мкг. Связанные с препаратом нежелательные явления, серьезные нежелательные явления и случаи прекращения участия в исследовании вследствие нежелательных явлений были больше в числовом выражении в группах введения активной вакцины, но явные закономерности, которые могли бы свидетельствовать о проблемах с безопасностью, отсутствовали. Уровень дозы 200 мкг с введением в месяцы 0, 1 и 6 был выбран для исследования фазы 3.

Что касается результатов в месяце 12 после дозы 3, через 12 месяцев после дозы № 3 у примерно 50% субъектов были показатели, превышающие заранее установленные пороговые значения, в группах обеих доз для нейтрализации токсина A. В режиме введения по месяцам в группе дозы 200 мкг средние геометрические значения концентрации (СГК) превышали пороговые значения для нейтрализации токсина A через 12 месяцев после дозы № 3. Через 12 месяцев после дозы № 3 у 47% субъектов показатели превышали заранее установленные пороговые значения для нейтрализации токсина B в группе дозы 200 мкг в режиме введения по месяцам. Значения СГК у сероположительных субъектов превышали пороговые значения для нейтрализации токсина B в обоих режимах введения. Что касается режима введения по месяцам, в случае токсина B значения СГК превышали пороговые значения для нейтрализации через 6 месяцев после дозы № 3 (2993 единиц нейтрализации/мл) и оставались аналогичными (2178 единиц нейтрализации/мл) через 12 месяцев после дозы № 3. Смотри, например, ФИГ. 1A-D, ФИГ. 2A-D, ФИГ. 8A, ФИГ. 8B и ФИГ. 9A и ФИГ. 9B.

Пример 9: Плацебо-контролируемое, рандомизированное исследование фазы 1 с маскированием данных для наблюдателя с целью оценки безопасности, переносимости и иммуногенности вакцины от Clostridium difficile с двумя режимами введения 3 доз здоровым взрослым японцам в возрасте 65-85 лет (B5091010)

Было проведено плацебо-контролируемое, рандомизированное исследование фазы 1 с маскированием данных для наблюдателя с целью оценки безопасности, переносимости и иммуногенности содержащей гидроксид алюминия вакцины при 2 уровнях доз антигенов (то есть, 100-мкг и 200-мкг) в 2 разных режимах введения доз (месяцы 0, 1 и 6 [режим введения по месяцам] или дни 1, 8 и 30 [режим введения по дням]) здоровым взрослым японцам в возрасте 65-85 лет.

В исследование были включены всего 128 здоровых японцев в возрасте 65-85 лет. Субъекты были рандомизированы в соотношении 3:3:2 для получения вакцины от C difficile (суммарные дозы токсоидов 100 мкг или 200 мкг) или плацебо (солевой раствор) в каждом режиме дозирования.

Субъектов наблюдали в течение 6 месяцев после подтверждения их последней вакцинации. Таким образом, субъекты, распределенные для режима введения по месяцам, участвовали в течение примерно 12 месяцев, и субъекты, распределенные для режима введения по дням, и завершившие его, участвовали в течение примерно 7 месяцев. Данное исследование было запланировано для завершения примерно через 14 месяцев. Завершением исследования являлось последнее посещение последнего субъекта.

Вакцина от C difficile ранее не была изучена на субъектах-японцах. Таким образом, дизайн настоящего первого в Японии исследования B5091010 был аналогичен дизайну исследования B5091009 для оценки безопасности, переносимости и иммуногенности содержащей гидроксид алюминия вакцины от C difficile при 2 уровнях доз антигенов (суммарные дозы токсоидов 100 мкг и 200 мкг) в двух режимах введения 3 доз (либо в дни 1, 8 и 30, либо в месяцы 0, 1 и 6) здоровым японцам в возрасте 65-85 лет.

В период разработки исследования B5091010 результаты исследования фазы 2 B5091009 были проанализированы и показали, что оба режима введения и оба уровня вводимых доз, в целом, хорошо переносились. Локальные реакции были преимущественно слабыми или умеренными, с наиболее частыми проявлениями в виде боли в месте инъекции. После дозы 2 локальная реактогенность была выше, когда вакцину вводили в день 8, чем при введении в месяце 1, особенно при уровне дозы 200 мкг. Системные явления также были преимущественно слабыми или умеренными, и частота отдельных явлений была сходной в группе плацебо, группе дозы 100 мкг и группе дозы 200 мкг. В каждом режиме, в целом, частота случаев нежелательных явлений (НЯ) также была сходной в группах плацебо, дозы 100 мкг и дозы 200 мкг. В обоих режимах серьезных нежелательных явлений (СНЯ) в численном выражении было больше в группах доз 100 мкг и 200 мкг, чем в группе плацебо. Однако закономерность для этих явлений отсутствовала, и не было выявлено проблем с безопасностью. Оба изученных уровня доз приводили к значительным титрам нейтрализующих антител против токсинов A и B, с предпочтительным профилем иммуногенности после 3 доз, введенных в месяцы 0, 1 и 6. Кроме того, уровень дозы 200 мкг был более иммуногенным, чем уровень дозы 100 мкг. Исходя из этого, было решено переходить к разработке исследования фазы 3 с использованием уровня дозы 200 мкг, вводимой в месяцы 0, 1 и 6.

Для каждого режима дозирования субъекты были рандомизированы в 1 из 3 групп исследования, приведенных в Таблице 4. Примерно 24 субъекта, в соответствии с планом, должны были получать вакцину от C difficile с уровнем дозы токсоидов или 100, или 200 мкг, и примерно 16 субъектов должны были получать плацебо (солевой раствор).

Таблица 4. Группы вакцинации и запланированное число субъектов на группу и на режим дозирования Группа вакцины Описание вакцинного препарата Режим дозирования Число субъектов 1 Содержащая гидроксид алюминия вакцина от C. difficile (доза 100 мкг антигенов) Месяцы 0, 1, 6 24 2 Содержащая гидроксид алюминия вакцина от C. difficile (доза 200 мкг антигенов) Месяцы 0, 1, 6 24 3 Плацебо (солевой раствор) Месяцы 0, 1, 6 16 4 Содержащая гидроксид алюминия вакцина от C. difficile (доза 100 мкг антигенов) Дни 1, 8, 30 24 5 Содержащая гидроксид алюминия вакцина от C. difficile (доза 200 мкг антигенов) Дни 1, 8, 30 24 6 Плацебо (солевой раствор) Дни 1, 8, 30 16 Всего 128

Образцы сыворотки собирали для тестирования иммуногенности. Для режима введения по месяцам в день 1 (до введения вакцины), в день 15 (через 14 дней после дозы 1), в день 30 (непосредственно перед дозой 2), в день 37 (через 7 дней после дозы 2), в месяце 2 (через 1 месяц после дозы 2), в месяце 6 (непосредственно перед дозой 3), в день 187 (через 7 дней после дозы 3), в месяце 7 (через 1 месяц после дозы 3) и в месяце 12 (через 6 месяцев после дозы 3).

Для режима введения по дням в день 1 (до введения вакцины), в день 8 (непосредственно перед дозой 2), в день 15 (через 7 дней после дозы 2), в день 30 (непосредственно перед дозой 3), в день 37 (через 7 дней после дозы 3), в месяце 2 (через 1 месяц после дозы 3), в месяце 4 (через 3 месяца после дозы 3) и в месяце 7 (через 6 месяцев после дозы 3).

Были измерены уровни специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител.

Средние геометрические значения концентраций специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител - Для режима введения по месяцам, месяц 7 (через 1 месяц после дозы 3) был определен в качестве основной временной точки, поскольку эти показатели отражали иммунный ответ после третьей дозы вакцины. В целом, значения СГК специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител возрастали после дозы 2, но были максимальными после дозы 3 (в месяце 7) в группах обеих доз 100 и 200 мкг. Значения СГК специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител были выше в группе дозы 200 мкг, чем в группе дозы 100 мкг, в месяце 7. Значения СГК специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител уменьшались от месяца 7 вплоть до месяца 12 при обоих уровнях доз. В месяце 12 значения СГК оставались выше пороговых значений для специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител в группе дозы 200 мкг, а также для специфических для токсина A нейтрализующих антител в группе дозы 100 мкг. Значения СГК специфических для токсина A антител в группе дозы 200 мкг возрастали после дозы 2 (в день 37) до 347,17 единиц нейтрализации/мл и до 125,46 единиц нейтрализации/мл в группе дозы 100 мкг в день 37. Значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител в группах обеих доз 100 и 200 мкг уменьшались к месяцу 6 (перед дозой 3) до 88,89 единиц нейтрализации/мл и 148,44 единиц нейтрализации/мл, соответственно. После дозы 3 значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител вновь возрастали в группах обеих доз 100 и 200 мкг, и в месяце 7 были в численном выражении выше в группе дозы 200 мкг (1692,38 единиц нейтрализации/мл), чем в группе дозы 100 мкг (1137,50 единиц нейтрализации/мл). Значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител затем уменьшались вплоть до месяца 12 (через 6 месяцев после дозы 3), хотя в группах обеих доз 100 и 200 мкг оставались, в целом, высокими (248,97 единиц нейтрализации/мл и 587,46 единиц нейтрализации/мл, соответственно) в сравнении со значениями СГК в месяце 6. Значения СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител в группах обеих доз 100 и 200 мкг возрастали после дозы 2 (в день 37) до 337,54 единиц нейтрализации/мл и 901,16 единиц нейтрализации/мл, соответственно. Значения СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител уменьшались к месяцу 6 (перед дозой 3) до 274,13 единиц нейтрализации/мл и 689,74 единиц нейтрализации/мл, соответственно. После дозы 3 (в день 187) значения СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител вновь возрастали в группах обеих доз 100 и 200 мкг, и в месяце 7 значения СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител были в численном выражении выше в группе дозы 200 мкг (13756,54 единиц нейтрализации/мл), чем в группе дозы 100 мкг (7903,68 единиц нейтрализации/мл). В месяце 12 значения СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител уменьшались, но оставались, в целом, высокими в группе дозы 200 мкг (6298,18 единиц нейтрализации/мл), но не в группе дозы 100 мкг (1887,24 единиц нейтрализации/мл), в сравнении со значениями СГК в месяце 6. Значения СГК специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител оставались неизменными с начала исследования до месяца 12 в группе плацебо. В режиме введения по месяцам значения СГК специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител были в основном сходными у субъектов в возрасте 65-69 лет и 70-74 лет в популяции для оценки иммуногенности.

В режиме введения по месяцам значения среднего геометрического кратности увеличения (СГКУ) титров специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител от исходных показателей рассчитывали в каждой доступной временной точке после начала исследования: в день 15 (через 14 дней после дозы 1), в день 30 (непосредственно перед дозой 2), в день 37 (через 7 дней после дозы 2), в месяце 2 (через 1 месяц после дозы 2), в месяце 6 (непосредственно перед дозой 3), в день 187 (через 7 дней после дозы 3), в месяце 7 (через 1 месяц после дозы 3, основная временная точка) и в месяце 12 (через 6 месяцев после дозы 3).

Увеличение значений СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител наблюдалось в группе дозы 200 мкг после дозы 2 (в день 37; 4,26), но уменьшалось до 1,82 к месяцу 6. После дозы 3 имело место дополнительное увеличение значений СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител в группах обеих доз 100 и 200 мкг в день 187 (7,42 и 16,07, соответственно) и дальнейшее увеличение в месяце 7 (12,58 и 20,77, соответственно). К месяцу 12 значения СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител уменьшались до 2,70 и 7,20 в группах доз 100 и 200 мкг, соответственно. Значения СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител в группе дозы 200 мкг были неизменно выше, чем значения в группе дозы 100 мкг в каждой временной точке сбора образцов крови. Значения СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител оставались неизменными в группе плацебо в течение всего исследования.

Увеличение значений СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител наблюдалось в группах доз 100 и 200 мкг после дозы 1 (в день 15; 2,81 и 5,21, соответственно) и дозы 2 (в день 37; 2,53 и 5,35, соответственно), с небольшим уменьшением, наблюдаемым в месяце 6 (2,06 и 4,10, соответственно). Дополнительное увеличение значений СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител наблюдалось после дозы 3 в группах обеих доз 100 и 200 мкг в день 187 (32,00 и 54,81, соответственно) и дальнейшее увеличение в месяце 7 (59,28 и 81,71, соответственно). К месяцу 12 значения СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител уменьшались до 14,01 и 36,90 в группах доз 100 и 200 мкг, соответственно. Значения СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител в группе дозы 200 мкг были неизменно выше, чем значения в группе дозы 100 мкг, в каждой временной точке сбора образцов крови. Значения СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител оставались неизменными в группе плацебо в течение всего исследования.

Относительные количества субъектов в режиме введения по месяцам, у которых были достигнуты уровни специфических для токсина A, токсина B и как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител, превышающие установленные пороговые значения (219 единиц нейтрализации/мл [токсин A] и 2586 единиц нейтрализации/мл [токсин B]), были оценены в популяции для оценки иммуногенности.

В целом, относительные количества субъектов, у которых были достигнуты уровни специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител, превышающие пороговые значения, были выше в группе дозы 200 мкг, чем в группе дозы 100 мкг, во всех временных точках сбора образцов крови. В группах обеих доз относительные количества субъектов с уровнями специфических для токсина A, токсина B и как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител, превышающими пороговые значения, возрастали после дозы 2 и были максимальными после дозы 3 (в месяце 7).

В случае специфических для токсина A нейтрализующих антител, после дозы 3 (в день 187), у 78,3% (18/23, 95% ДИ: 56,3, 92,5) субъектов в группе дозы 100 мкг и у 95,7% (22/23, 95% ДИ: 78,1, 99,9) субъектов в группе дозы 200 мкг были достигнуты уровни специфических для токсина A нейтрализующих антител, превышающие пороговое значение, в сравнении с отсутствием таких субъектов в группе плацебо. В месяце 7 у 91,3% (21/23, 95% ДИ: 72,0, 98,9) субъектов в группе дозы 100 мкг и у 100,0% (23/23, 95% ДИ: 85,2, 100,0) субъектов в группе дозы 200 мкг были достигнуты уровни специфических для токсина A нейтрализующих антител, превышающие пороговое значение, в сравнении с отсутствием таких субъектов в группе плацебо. Относительные количества субъектов с уровнями специфических для токсина A нейтрализующих антител, превышающими пороговое значение, оставались высокими в месяце 12 в группе дозы 200 мкг (95,5% [21/22] субъектов, 95% ДИ: 77,2, 99,9), но снижались в группе дозы 100 мкг (55,0% [9/20] субъектов, 95% ДИ: 31,5, 76,9). Ни у одного из субъектов в группе плацебо не было уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител, превышающих пороговое значение, в месяце 12.

В случае специфических для токсина B нейтрализующих антител, после дозы 3 (в день 187), у 52,2% (12/23, 95% ДИ: 30,6, 73,2) субъектов в группе дозы 100 мкг и у 91,3% (21/23, 95% ДИ: 72,0, 98,9) субъектов в группе дозы 200 мкг были достигнуты уровни специфических для токсина B нейтрализующих антител, превышающие пороговое значение, в сравнении с отсутствием таких субъектов в группе плацебо. В месяце 7 у 91,3% (21/23, 95% ДИ: 72,0, 98,9) субъектов в группе дозы 100 мкг и у 100,0% (23/23, 95% ДИ: 85,2, 100,0) субъектов в группе дозы 200 мкг были достигнуты уровни специфических для токсина B нейтрализующих антител, превышающие пороговое значение, в сравнении с отсутствием таких субъектов в группе плацебо. Относительные количества субъектов с уровнями специфических для токсина B нейтрализующих антител, превышающими пороговое значение, оставались высокими в месяце 12 в группе дозы 200 мкг (81,8% [18/22] субъектов, 95% ДИ: 59,7, 94,8), но снижались в группе дозы 100 мкг (45,0% [11/20] субъектов, 95% ДИ: 23,1, 68,5). Ни у одного из субъектов в группе плацебо не было уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител, превышающих пороговое значение, в месяце 12.

В режиме введения по месяцам относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения (≥4 раза, ≥8 раз, ≥16 раз и ≥32 раза) от исходных уровней специфических для токсина A, токсина B и как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител, были оценены в популяции для оценки иммуногенности. В целом, большее относительное количество субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител, наблюдалось в группе дозы 200 мкг в сравнении с группой дозы 100 мкг. Увеличение относительного количества субъектов, у которых было достигнуто ≥32-кратное увеличение от исходных уровней, в группах обеих доз 100 и 200 мкг наблюдалось после дозы 3 (в день 187). К месяцу 7 у 69,6% (16/23) субъектов в группе дозы 100 мкг и у 91,3% (21/23) субъектов в группе дозы 200 мкг было достигнуто ≥8-кратное увеличение от исходных уровней. Кроме того, в месяце 7 у 69,6% (16/23) субъектов в группе дозы 200 мкг также было достигнуто ≥16-кратное увеличение от исходных уровней. Показатели кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител в группе плацебо оставались неизменными во всех временных точках. Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител, уменьшались в месяце 12 в сравнении с месяцем 7, с 5,0% (1/20) субъектов в группе дозы 100 мкг и 13,6% (3/22) субъектов в группе дозы 200 мкг, у которых было достигнуто ≥16-кратное увеличение от исходных уровней.

В целом, большее относительное количество субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител, наблюдалось в группе дозы 200 мкг в сравнении с группой дозы 100 мкг. Увеличение относительного количества субъектов, у которых было достигнуто ≥32-кратное увеличение от исходных уровней в группах обеих доз 100 и 200 мкг, наблюдалось после дозы 3 (в день 187). К месяцу 7 у 73,9% (17/23) субъектов в группе дозы 100 мкг и у 82,6% (19/23) субъектов в группе дозы 200 мкг было достигнуто ≥32-кратное увеличение от исходных уровней. Показатели кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител в группе плацебо оставались неизменными во всех временных точках. Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител, уменьшались в месяце 12 в сравнении с месяцем 7, с 25,0% (5/20) субъектов в группе дозы 100 мкг и 45,5% (10/22) субъектов в группе дозы 200 мкг, у которых было достигнуто ≥32-кратное увеличение от исходных уровней.

Увеличение относительных количеств субъектов, у которых было достигнуто ≥8-кратное увеличение от исходных уровней специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител, в группах обеих доз 100 и 200 мкг наблюдалось после дозы 3 (в день 187). К месяцу 7 у 69,6% (16/23) субъектов в группе дозы 100 мкг и у 87,0% (20/23) субъектов в группе дозы 200 мкг было достигнуто ≥8-кратное увеличение от исходных уровней. Кроме того, в месяце 7 у 65,2% (15/23) субъектов в группе дозы 200 мкг было достигнуто ≥16-кратное увеличение от исходных уровней. Показатели кратности увеличения от исходных уровней специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител в группе плацебо оставались неизменными во всех временных точках.

Были оценены относительные количества субъектов с уровнями специфических для токсинов A и B нейтрализующих антител≤НПКО в режиме введения по месяцам. В целом, низкое относительное количество субъектов в группах обеих доз 100 и 200 мкг имели уровни специфических для токсина A, или для токсина B, нейтрализующих антител < НПКО в месяце 7 и в месяце 12. Большинство субъектов в группе плацебо имели уровни специфических для токсина A, токсина B, а также и токсина A, и токсина B, нейтрализующих антител < НПКО во всех временных точках.

В режиме введения по месяцам день 37 (через 7 дней после дозы 3) был определен в качестве основной временной точки, поскольку эти показатели отражали иммунный ответ после третьей дозы вакцины; однако вследствие ограниченного количества включенных в исследование субъектов в результате решения о прекращении последующего дозирования в соответствии с правилом прекращения участия в исследовании, выводы не могли быть сделаны в день 30 и в последующие дни. Значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител в группах доз 100 и 200 мкг возрастали после дозы 1 и дозы 2, но в большей степени в группе дозы 200 мкг в день 15 (515,67 единиц нейтрализации/мл) и в день 30 (673,00 единиц нейтрализации/мл), чем в группе дозы 100 мкг (79,00 единиц нейтрализации/мл в день 15 и 116,21 единиц нейтрализации/мл в день 30). Значения СГК специфических для токсина A нейтрализующих антител оставались неизменными в течение всего исследования в группе плацебо. Аналогично ситуации с токсином A, значения СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител в группах доз 100 и 200 мкг возрастали после дозы 1 и дозы 2, но в большей степени в группе дозы 200 мкг в день 15 (3531,69 единиц нейтрализации/мл) и в день 30 (4666,51 единиц нейтрализации/мл), чем в группе дозы 100 мкг (692,98 единиц нейтрализации/мл и 682,09 единиц нейтрализации/мл). Значения СГК специфических для токсина B нейтрализующих антител оставались неизменными в течение всего исследования в группе плацебо.

В режиме введения по дням значения СГКУ для специфических для токсина A и для токсина B нейтрализующих антител от исходных уровней рассчитывали в каждой доступной временной точке после начала исследования: в день 8 (непосредственно перед дозой 2), в день 15 (через 7 дней после дозы 2), в день 30 (непосредственно перед дозой 3), в день 37 (через 7 дней после дозы 3, основная временная точка), в месяце 2 (через 1 месяц после дозы 3), в месяце 4 (через 3 месяца после дозы 3) и в месяце 7 (через 6 месяцев после дозы 3). Вследствие ограниченного числа субъектов, вызванного решением о прекращении последующего дозирования в соответствии с правилом прекращения участия в исследовании, выводы не могли быть сделаны в день 30 и в последующие дни. Увеличение значений СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител наблюдалось в группе дозы 200 мкг после дозы 2 в день 15 (6,11) и дополнительное увеличение в день 30 (7,79). Увеличение значений СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител наблюдалось после дозы 2 в группе дозы 100 мкг в день 30 (1,47), но в целом было ниже, чем для значений СГКУ, наблюдаемых в группе дозы 200 мкг, во всех временных точках. Значения СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител оставались неизменными в группе плацебо во всех временных точках.

Увеличение значений СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител наблюдалось в группах обеих доз 100 и 200 мкг после дозы 1 (в день 8: 1,41 и 1,78, соответственно), с дальнейшим увеличением, наблюдаемым в группах обеих доз в день 15 (4,37 и 9,01, соответственно) и в день 30 (4,59 и 10,63, соответственно). Значения СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител были неизменно выше в группе дозы 200 мкг, чем значения в группе дозы 100 мкг. Значения СГКУ для специфических для токсина B нейтрализующих антител оставались неизменными в группе плацебо во всех временных точках.

В режиме введения по дням были оценены относительные количества субъектов в модифицированной ITT (mITT) популяции, у которых были достигнуты уровни специфических для токсина A, токсина B и как для токсина A, так и токсина B, нейтрализующих антител выше установленных пороговых значений (219 единиц нейтрализации/мл [токсин A] и 2586 единиц нейтрализации/мл [токсин B]). Ко дню 30 в режиме введения по дням у более высокой процентной доли субъектов в группе дозы 200 мкг (62,5% [5/8] субъектов, 95% ДИ: 24,5, 91,5), в сравнении с группой дозы 100 мкг (20,0% [1/5] субъектов, 95% ДИ: 0,5, 71,6), были достигнуты уровни специфических для токсина A нейтрализующих антител выше пороговых значений.

Аналогично, в случае специфических для токсина B нейтрализующих антител, в день 30 у более высокой процентной доли субъектов в группе дозы 200 мкг (62,5% [5/8] субъектов, 95% ДИ: 24,5, 91,5), в сравнении с группой дозы 100 мкг (20,0% [1/5] субъектов, 95% ДИ: 0,5, 71,6), были достигнуты уровни специфических для токсина B нейтрализующих антител выше пороговых значений.

В случае специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител, у половины субъектов были достигнуты уровни, превышающие пороговые значения, ко дню 30 в группе дозы 200 мкг (50,0% [4/8] субъектов, 95% ДИ: 15,7, 84,3), при этом ни у одного из субъектов не были достигнуты уровни, превышающие пороговые значения, специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител в группе дозы 100 мкг (0,0% [0/5] субъектов).

В режиме введения по дням были оценены относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения (≥4 раза, ≥8 раз, ≥16 раз и ≥32 раза) от исходных уровней специфических для токсина A, токсина B и как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител. В целом, большее относительное количество субъектов в режиме введения по дням, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител, наблюдалось в группе дозы 200 мкг в сравнении с группой дозы 100 мкг. Ни у одного из субъектов в группе дозы 100 мкг не было достигнуто ≥4-кратное, или выше, увеличение уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител вплоть до дня 30. Имело место увеличение относительного количества субъектов в группе дозы 200 мкг, у которых было достигнуто ≥32-кратное увеличение от исходных уровней после дозы 2 (день 15), которое продолжалось вплоть до дня 30 (у 25,0% [2/8] субъектов в группе дозы 200 мкг было достигнуто ≥32-кратное увеличение от исходных уровней). Значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител в группе плацебо оставались неизменными во всех временных точках.

Аналогично ситуации со специфическими для токсина A нейтрализующими антителами, большее относительное количество субъектов в режиме введения по дням, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител, наблюдалось в группе дозы 200 мкг в сравнении с группой дозы 100 мкг. Имело место увеличение относительного количества субъектов, у которых было достигнуто ≥32-кратное увеличение от исходных уровней в группах обеих доз 100 и 200 мкг после дозы 2 (в день 15), которое продолжалось вплоть до дня 30. В день 30 лишь у 1 из 5 субъектов в группе дозы 100 мкг было достигнуто какое-либо из установленных значений кратности увеличения. И наоборот, у 62,5% [5/8] субъектов в группе дозы 200 мкг было достигнуто ≥16-кратное увеличение в день 30. Значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител в группе плацебо оставались неизменными во всех временных точках.

Ни у одного из субъектов в группе дозы 100 мкг не было достигнуто ≥4-кратное, или выше, увеличение уровней специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител вплоть до, и включительно, дня 30. Имело место увеличение относительного количества субъектов, у которых было достигнуто ≥32-кратное увеличение от исходных уровней специфических для токсинов A и B антител, в группе дозы 200 мкг после дозы 2 (в день 15), которое продолжалось вплоть до дня 30 (у 12,5% [1/8] субъектов в группе дозы 200 мкг было достигнуто ≥32-кратное увеличение от исходных уровней). Значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A и для токсина B нейтрализующих антител в группе плацебо оставались неизменными во всех временных точках.

Были оценены относительные количества субъектов с уровнями специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител < НПКО в режиме введения по дням. Субъекты в группах обеих доз 100 и 200 мкг имели уровни специфических для токсина A нейтрализующих антител < НПКО после дозы 2 в день 15 (100,0% [11/11] субъектов и 54,5% [6/11] субъектов, соответственно), и это количество было уменьшено в день 30 (60,0% [3/5] субъектов и 25,0% [2/8] субъектов, соответственно). Ко дню 30 субъекты в группах обеих доз 100 и 200 мкг имели уровни специфических для токсина B нейтрализующих антител < НПКО (40,0% [2/5] субъектов и 37,5% [3/8] субъектов, соответственно) и уровни специфических как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител < НПКО (20,0% [1/5] субъектов и 12,5% [1/8] субъектов, соответственно).

Выводы. Конечные точки определения иммуногенности считались вторичными конечными точками в данном исследовании. Конечные точки определения иммуногенности включали значения СГК и значения СГКУ от исходных уровней специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител, а также относительное количество субъектов с уровнями специфических для токсина A, токсина B, или как для токсина A, так и для токсина B, нейтрализующих антител выше пороговых значений и относительные количества субъектов, имеющих ≥4-кратное, ≥8-кратное, ≥16-кратное и ≥32-кратное увеличение от исходных значений уровней антител. В результате прекращения исследования в режиме введения по дням лишь ограниченное количество данных по иммуногенности было доступно для этой группы после 30 дней. Таким образом, следующие выводы были сделаны на основании данных, полученных в режиме введения по месяцам. В целом, значения СГК специфических для токсина A и для токсина B нейтрализующих антител возрастали после дозы 1, были максимальными в месяце 7 и снижались вплоть до месяца 12 в группах обеих доз 100 и 200 мкг. В месяце 7 значения СГК специфических как для токсина A, так и токсина B, нейтрализующих антител в численном выражении были выше в группе дозы 200 мкг (1692,38 и 13756,54 единиц нейтрализации/мл, соответственно), чем в группе дозы 100 мкг (1137,50 и 7903,68 единиц нейтрализации/мл, соответственно). К месяцу 12 значения СГК специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител снижались, однако оставались высокими в группе дозы 200 мкг (587,46 и 6298,18 единиц нейтрализации/мл, соответственно) в сравнении со значениями СГК в месяце 6. Значения СГКУ для специфических для токсина A нейтрализующих антител в группе дозы 200 мкг были неизменно выше значений в группе дозы 100 мкг в каждой временной точке сбора образцов крови. После дозы 3 увеличение значений СГКУ от исходных уровней наблюдалось в группах обеих доз 100 и 200 мкг. Значения СГКУ специфических для токсина A и для токсина B нейтрализующих антител были максимальными в месяце 7 и в числовом выражении были выше в группе дозы 200 мкг (20,77 и 81,71, соответственно), чем в группе дозы 100 мкг (12,58 и 59,28, соответственно). Затем значения СГКУ для специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител уменьшались к месяцу 12 в обеих группах вакцинации. Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты уровни специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител, превышающие пороговые значения, как правило, были выше в группе дозы 200 мкг, чем в группе дозы 100 мкг, во всех временных точках сбора образцов крови. К месяцу 7 у 100,0% субъектов в группе дозы 200 мкг были достигнуты уровни специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител, превышающие пороговые значения, при этом более чем у 90% субъектов в группе дозы 100 мкг были достигнуты уровни, превышающие пороговые значения. Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты уровни специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител, превышающие пороговые значения, оставались высокими в месяце 12 в группе дозы 200 мкг (95,5% и 81,8%, соответственно), но уменьшались в группе дозы 100 мкг (55,0% и 45,0%, соответственно). Ни один из субъектов в группе плацебо не имел уровни специфических для токсина A или токсина B нейтрализующих антител, превышающие пороговые значения, в месяце 12. В случае специфических для токсина A нейтрализующих антител, у 69,6% (16/23) субъектов в группе дозы 100 мкг и у 91,3% (21/23) субъектов в группе дозы 200 мкг было достигнуто ≥8-кратное увеличение от исходных уровней к месяцу 7, при этом у большинства субъектов (69,6%; 16/23) в группе дозы 200 мкг также было достигнуто ≥16-кратное увеличение от исходных уровней к месяцу 7. Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина A нейтрализующих антител, уменьшались в месяце 12 в сравнении с месяцем 7, при этом у 5,0% (1/20) субъектов в группе дозы 100 мкг и у 13,6% (3/22) субъектов в группе дозы 200 мкг было достигнуто ≥16-кратное увеличение от исходных уровней. В случае специфических для токсина B нейтрализующих антител, у большинства субъектов в группах обеих доз 100 и 200 мкг было достигнуто ≥32-кратное увеличение от исходных уровней (у 73,9% [17/23] субъектов и у 82,6% [19/23] субъектов, соответственно) к месяцу 7. Относительные количества субъектов, у которых были достигнуты установленные значения кратности увеличения от исходных уровней специфических для токсина B нейтрализующих антител, уменьшались в месяце 12 в сравнении с месяцем 7, при этом у 25,0% (5/20) субъектов в группе дозы 100 мкг и у 45,5% (10/22) субъектов в группе дозы 200 мкг было достигнуто ≥32-кратное увеличение от исходных уровней. Вследствие очень низкого числа исходно сероположительных субъектов в режимах введения по дням и по месяцам в начале исследования в группах введения доз 100 мкг, 200 мкг и плацебо невозможно было оценивать эффекты исходного серостатуса на СГК. Как видно на КОИР для режима введения по месяцам, в группе дозы 200 мкг имели место более высокие концентрации специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител, чем в группе дозы 100 мкг, в месяце 7 и, как правило, во всех временных точках. В совокупности, данные результаты показывают, что в режиме введения по месяцам пик иммуногенности приходится примерно на 1 месяц после дозы 3 (в месяце 7) вакцины от C difficile. Кроме того, доза 200 мкг индуцирует более сильный и более продолжительный ответ в виде выработки антител, чем доза 100 мкг, при оценке на основании значений СГК и СГКУ для специфических для токсина A и токсина B нейтрализующих антител.

Пример 10: Антитела, индуцированные иммуногенными композициями, способны нейтрализовать токсины разных штаммов C. difficile

Культуральные супернатанты, содержащие секретируемые разными штаммами токсины, тестировали в in vitro анализе нейтрализации с использованием сыворотки от приматов, иммунизированных иммуногенной композицией, для определения охвата иммуногенной композиции и для определения способности иммуногенной композиции защищать от разных токсинов из циркулирующих клинических штаммов.

Клетки IMR-90 использовали для тестирования нейтрализации токсинов, экспрессируемых разными штаммами C. difficile. Титры нейтрализации тестируемых образцов рассчитывали на основании эталонного стандарта. НПКО анализа: Txd A=158,0 Ед/мл; Txd B=249,5 Ед/мл. Результаты в Таблице 5 показывают, что сыворотки от иммунизированных приматов были способны нейтрализовать токсины C. difficile из каждого из соответствующих культуральных супернатантов в анализе нейтрализации.

Таблица 5.

Описание штаммов Clostridium difficile: Эпидемиологические маркеры, генотип токсинов, идентичность последовательности с антигеном вакцины и способность антител приматов против токсинов нейтрализовать токсины Штамм C. difficile Источник штамма Тип PFGE Риботип Токсинoтип Вариант токсина
(% идентичности с антигеном вакцины^a) Способность антител приматов против токсинов нейтрализовать токсины C difficile TcdB TcdA PFECD0003 Европа NAP6 002 0 TcdB_016 (99,7) TcdA_017 (99,7) + PFECD0005 Европа NAP10 003 I TcdB_010 (99,8) TcdA_018 (99,7) + PFECD0046 Европа NAPCR1 004 0 TcdB_001 (99,9) TcdA_006 (99,8) + PFECD0078 Европа NA 012 0 TcdB_001 (99,9) TcdA_001 (99,9) + PFECD0008 Канада NAP12 015 0 TcdB_005 (99,8) TcdA_014 (99,6) + PFECD0010 США NAP9 017 VIII TcdB_003 (93,7) Укороченный^c + PFECD0011 Европа NAP4 020 0 TcdB_007 (99,8) TcdA_003 (99,7) + PFECD0012 Европа NA 023 IV TcdB_006 (98,1) TcdA_019 (98,3) + PFECD0013 Европа NAP1 027 III TcdB_012 (99,8) TcdA_010 (99,8) + PFECD0015 США NAP1 027 III TcdB_002 (92,1) TcdA_007 (98,1) + PFECD0016 Европа NA 029 0 TcdB_006 (98,1) TcdA_019 (98,3) + PFECD0017 Европа NA 046 0 TcdB_008 (99,8) TcdA_004 (99,7) + PFECD0019 США NAP3 053 0 TcdB_008 (99,8) TcdA_012 (99,7) + PFECD0021 Европа NA 059 IV TcdB_015 (99,7) TcdA_011 (99,7) + PFECD0022 Европа NA 070 XIII TcdB_016 (99,7) TcdA_017 (99,7) + PFECD0023 США NAP10 070 0 TcdB_012 (99,8) TcdA_015 (99,8) + PFECD0024 Европа NA 075 III TcdB_012 (99,8) TcdA_010 (99,8) + PFECD0027 Европа NA 078 0 TcdB_004 (95,9) TcdA_013 (97,9) + PFECD0030 США NAP7 078 V TcdB_004 (95,9) TcdA_013 (97,9) + PFECD0031 Европа NA 081 0 TcdB_013 (99,8) TcdA_009 (99,7) + PFECD0032 Европа NA 087 0 TcdB_001 (99,9) TcdA_009 (99,7) + PFECD0035 США NAP11 106 0 TcdB_009 (99,8) TcdA_002 (99,7) + PFECD0036 Европа NA 117 0 TcdB_001 (99,9) TcdA_005 (99,9) + PFECD0037 Европа NA 126 NA TcdB_016 (99,7) TcdA_017 (99,7) + PFECD0039 Канада NAP7 126 V TcdB_011 (86,9) TcdA_016 (98,3) + PFECD0040 Европа NA 131 NA TcdB_016 (99,7) TcdA_017 (99,7) + PFECD0041 США NAP4 154 0 TcdB_014 (99,8) TcdA_010 (99,8) + PFECD0043 США NAP11 NA^b 0 TcdB_008 (99,8) TcdA_008 (99,7) + PFECD0049 США NAP2 NA^b 0 TcdB_012 (99,8) TcdA_010 (99,8) +

Пример 11: Диагностические анализы в поддержку исследования фазы 3 для изучения эффективности вакцины от C. difficile

«Клевер» (B5091007) является межгосударственным опорным исследованием фазы 3 для оценки эффективности, безопасности и переносимости вакцины от Clostridium (C) difficile на основе токсоидов у субъектов в возрасте 50 лет или старше, имеющих повышенный риск развития CDI. С вовлечением примерно 400 исследовательских центров в 23 странах, в данное исследование будут включены примерно 16000 субъектов. Основной целью данного исследования фазы 3 будет демонстрация эффективности вакцины для уменьшения частоты первых основных эпизодов CDI на основании как клинических, так и лабораторных, диагностических критериев. Для оценки эффективности вакцины необходимо отслеживать случаи диареи у субъектов, собирать образцы стула, когда это происходит, отправлять эти образцы в центральную лабораторию в условиях с контролируемой температурой и тестировать их на присутствие C difficile и токсина(ов), которые вызывают заболевание. С целью обеспечения точности лабораторного диагноза CDI для тестирования образцов стула используют двухэтапный алгоритм. Этот алгоритм основан на обнаружении штаммов/спор C. difficile, несущих ген токсина B, методом ПЦР, с последующим обнаружением свободных токсинов (A и B) при помощи патентованного теста для обнаружения токсинов (CCNA). Этот подход был выбран, поскольку эпидемиологические исследования четко продемонстрировали, что обнаружение свободных токсинов является лучшим предиктором заболевания CDI, чем только ПЦР. i, ii Кроме того, двухэтапный алгоритм тестирования уже был рекомендован в ЕС Европейским обществом клинической микробиологии и инфекционных болезней, и в США Американским обществом инфекционных болезней и Американским обществом эпидемиологии здравоохранения. Описаны основные операционные/исполнительские сложности проведения данного исследования, а также квалификационная оценка ПЦР и валидация/клиническая валидация CCNA. Оба анализа соответствуют всем заданным критериям приемлемости и подходят для использования по назначению в качестве диагностических анализов при определении эффективности вакцины от C. difficile и при проведении эпидемиологических исследований.

Квалификационная оценка: валидация CEPHEID XPERT ^® C. difficile/эпи-ПЦР теста и клиническая валидация CCNA

Тесты XPERT^® C. difficile/эпи-ПЦР и CCNA являются чувствительными, надежными и воспроизводимыми. Результаты квалификационной оценки анализов и валидации воспроизводимости, линейности, точности и/или специфичности подтвердили, что XPERT^® C. difficile/эпи-ПЦР тест и CCNA подходят для их запланированного использования. Каждый анализ был проверен с использованием истинно положительных и отрицательных по CDI образцов стула, и оценен в отношении клинической точности. Как XPERT^® C. difficile/эпи-ПЦР тест, так и CCNA, были клинически точными, позволяя правильно классифицировать положительные и отрицательные образцы.

Специфичность: 50 не токсикогенных и не C. difficile штаммов были оценены методом XPERT^® C. difficile/эпи-ПЦР. Перекрестная реактивность отсутствовала, что соответствует аналитической специфичности 100%.

Чувствительность: был определен предел обнаружения (ПО) 10 штаммов C. difficile, добавленных в образцы стула. ПО для 10 штаммов находился в диапазоне от 344 до 2175 колониеобразующих единиц (КОЕ).

Воспроизводимость: 9 полученных образцов были протестированы 2 аналитиками, с использованием 3 лотов реагентов для тестирования в течение 10 дней тестирования. Вариабельность образцов в данных условиях составляла <2% относительного среднеквадратического отклонения.

Точность: согласованность между измеренным значением и эталонным значением при 10-кратном увеличении концентрации обозначается наклоном = -3,3 Ct.

С использованием CEPHEID XPERT^® C. difficile/эпи-ПЦР теста были правильно идентифицированы образцы в 93 случаях CDI при клинической валидации; превосходная воспроизводимость CCNA наблюдалось в процессе валидации анализа; CCNA продемонстрировал 100% клиническую специфичность в сравнении с эталонным способом; и CCNA продемонстрировал 95,7% клиническую чувствительность в сравнении с другим эталонным способом.

Вывод: используют 2-этапный алгоритм для подтверждения лабораторными методами CDI на основании обнаружения микроорганизма C. difficile, с последующим обнаружением токсинов. До использования в исследовании «КЛЕВЕР», как XPERT^® C. difficile/эпи-ПЦР тест, так и CCNA, были признаны пригодными и/или валидированы, и они продемонстрировали превосходную аналитическую специфичность, чувствительность и воспроизводимость. В процессе клинической валидации оба диагностических анализа были клинически специфичными и чувствительными при определении предполагаемых случаев CDI. Каждый из анализов, в сочетании с надежной стратегией сбора клинических образцов, в настоящее время используется в клиническом испытании фазы 3 вакцины от C. difficile.

Следующие пункты описывают дополнительные варианты осуществления изобретения:

C1. Способ вызывания иммунного ответа у человека против инфекции Clostridium difficile, включающий введение человеку эффективной дозы композиции, содержащей токсоид C. difficile, при этом композицию вводят по меньшей мере два раза.

C2. Способ по п. C1, отличающийся тем, что второе введение производят по меньшей мере через 7 дней после первого введения, и третье введение производят примерно через 30 дней после первого введения.

C3. Способ по п. C1, отличающийся тем, что третье введение производят примерно через 180 дней после первого введения.

C4. Способ по п. C1, отличающийся тем, что композицию вводят по меньшей мере три раза.

C5. Способ по п. C2, отличающийся тем, что второе введение производят примерно через 30 дней после первого введения, и третье введение производят примерно через 180 дней после первого или второго введения.

C6. Способ по п. C2, отличающийся тем, что третье введение производят по меньшей мере через 180 дней после первого введения.

C7. Способ по п. C1, отличающийся тем, что вызываемый иммунный ответ включает нейтрализующее моноклональное антитело против токсина A.

C8. Способ по п. C1, отличающийся тем, что вызываемый иммунный ответ включает нейтрализующее моноклональное антитело против токсина B.

C9. Способ по п. C1, отличающийся тем, что вызываемый иммунный ответ включает нейтрализующее моноклональное антитело против токсина A и нейтрализующее моноклональное антитело против токсина B, при этом концентрация нейтрализующего моноклонального антитела составляет по меньшей мере 10 мкг/мл.

C10. Способ по п. C1, отличающийся тем, что композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile, каждый из которых имеет чистоту по меньшей мере 90% или более.

C11. Способ по п. C1, отличающийся тем, что композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile в соотношении от примерно 3:1 до примерно 1:1.

C12. Способ по п. C1, отличающийся тем, что композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile в соотношении 1:1.

C13. Способ по п. C1, отличающийся тем, что композиция содержит адъювант.

C14. Способ по п. C1, отличающийся тем, что композиция содержит адъювант на основе алюминия.

C15. Способ по п. C1, при этом иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 60 дней.

C16. Способ по п. C1, при этом иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 180 дней.

C17. Способ по п. C1, при этом иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 365 дней.

C18. Способ по п. C1, при этом иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 540 дней.

C19. Способ по п. C1, отличающийся тем, что второе введение производят по меньшей мере через 7 дней после первого введения, и третье введение производят по меньшей мере через 30 дней после первого введения.

C20. Способ по п. C1, отличающийся тем, что третье введение производят по меньшей мере через 30 дней после первого введения.

C21. Способ по п. C1, отличающийся тем, что второе введение производят по меньшей мере через 7 дней после первого введения, и третье введение производят по меньшей мере через 180 дней после первого или второго введения.

C22. Способ по п. C1, отличающийся тем, что третье введение производят по меньшей мере через 180 дней после первого введения.

C23. Способ по п. C1, отличающийся тем, что композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile, каждый из которых имеет чистоту по меньшей мере 90% или более.

C24. Способ по п. C1, отличающийся тем, что композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile в соотношении от примерно 3:1 до примерно 1:1.

C25. Способ по п. C1, отличающийся тем, что композиция содержит токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile в соотношении 1:1.

C26. Способ по п. C1, отличающийся тем, что композиция содержит адъювант.

C27. Способ по п. C1, отличающийся тем, что композиция содержит адъювант на основе алюминия.

C28. Способ по п. C1, при этом иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 60 дней.

C29. Способ по п. C1, при этом иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 180 дней.

C30. Способ по п. C1, при этом иммунный ответ против токсина A и/или токсина B C. difficile сохраняется в течение по меньшей мере примерно 365 дней.

C31. Способ по п. C1, отличающийся тем, что токсоид A C. difficile связан с адъювантом на основе алюминия.

C32. Способ по п. C1, отличающийся тем, что токсоид B C. difficile связан с адъювантом на основе алюминия.

C33. Способ по п. C1, отличающийся тем, что токсоид A C. difficile и/или токсоид B C. difficile являются лиофилизированными.

C34. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C35. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C36. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C37. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C38. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C39. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C40. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C41. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C42. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C43. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C44. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C45. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C46. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C47. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C48. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C49. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C50. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C51. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C52. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C53. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C54. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C55. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C56. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C57. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C58. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C59. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C60. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 4 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C61. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 8 раз выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C62. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 16 раз выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C63. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 32 раза выше у человека после получения третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C64. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения первой дозы, при измерении примерно через 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после первой дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C65. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения второй дозы, при измерении примерно через 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после второй дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C66. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина A нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения третьей дозы, при измерении примерно через 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина A нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C67. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения первой дозы, при измерении примерно через 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после первой дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C68. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения второй дозы, при измерении примерно через 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после второй дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C69. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела, которая по меньшей мере в 2 раза выше у человека после получения третьей дозы, при измерении примерно в любой день из 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C70. Способ по п. C1, при этом композиция приводит к концентрации специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека после получения третьей дозы, при измерении примерно в любой день из 7, 30, 60, 90, 120, 365 или 540 дней после третьей дозы, чем концентрация специфического для токсина B нейтрализующего антитела у человека до получения первой дозы, при измерении в идентичных условиях в анализе цитотоксичности.

C71. Способ по п. C1, при этом человек является сероотрицательным в отношении токсина B.

C72. Способ по п. C1, при этом человек является сероотрицательным в отношении токсина A.

C73. Способ по п. C1, при этом человек является сероотрицательным в отношении токсина A и токсина B.

C74. Способ по п. C1, при этом человек является сероположительным в отношении токсина B.

C75. Способ по п. C1, при этом человек является сероположительным в отношении токсина A.

C76. Способ по п. C1, при этом человек является сероположительным в отношении токсина A и токсина B.

C77. Способ по п. C1, при этом токсоид содержит SEQ ID NO: 4, в которой остаток метионина отсутствует.

C78. Способ по п. C1, при этом токсоид содержит SEQ ID NO: 6, в которой остаток метионина отсутствует.

C79. Способ по п. C1, при этом токсоид содержит любую из SEQ ID NO: 1-8, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28-35, 82-761, в которой остаток метионина отсутствует.

C80. Способ по п. C1, при этом токсоид включает обработанный формальдегидом токсин A C. difficile.

C81. Способ по п. C1, при этом токсоид включает обработанный формальдегидом токсин B C. difficile.

C82. Способ по п. C1, при этом токсоид не обрабатывают формальдегидом.

C83. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 002.

C84. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 003.

C85. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 004.

C86. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 012.

C87. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 015.

C88. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 017.

C89. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 020.

C90. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 023.

C91. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 027.

C92. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 029.

C93. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 046.

C94. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 053.

C95. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 059.

C96. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 070.

C97. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 075.

C98. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 078.

C99. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 081.

C100. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 087.

C101. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 106.

C102. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 117.

C103. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 126.

C104. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 131.

C105. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile риботипа 154.

C106. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile токсинотипа 0.

C107. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile токсинотипа I.

C108. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile токсинотипа VIII.

C109. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile токсинотипа IV.

C110. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile токсинотипа III.

C111. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile токсинотипа XIII.

C112. Способ по п. C1, при этом причиной инфекции является C. difficile токсинотипа V.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PFIZER INC.

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ВЫЗЫВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА

ПРОТИВ CLOSTRIDIUM DIFFICILE

<130> PC72392

<150> 62/565096

<151> 2017-09-28

<160> 761

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2709

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 1

Ser Leu Ile Ser Lys Glu Glu Leu Ile Lys Leu Ala Tyr Ser Ile Arg

1 5 10 15

Pro Arg Glu Asn Glu Tyr Lys Thr Ile Leu Thr Asn Leu Asp Glu Tyr

20 25 30

Asn Lys Leu Thr Thr Asn Asn Asn Glu Asn Lys Tyr Leu Gln Leu Lys

35 40 45

Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asp Val Phe Met Asn Lys Tyr Lys Thr Ser

50 55 60

Ser Arg Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu Lys Lys Asp Ile Leu Lys Glu

65 70 75 80

Val Ile Leu Ile Lys Asn Ser Asn Thr Ser Pro Val Glu Lys Asn Leu

85 90 95

His Phe Val Trp Ile Gly Gly Glu Val Ser Asp Ile Ala Leu Glu Tyr

100 105 110

Ile Lys Gln Trp Ala Asp Ile Asn Ala Glu Tyr Asn Ile Lys Leu Trp

115 120 125

Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Leu Val Asn Thr Leu Lys Lys Ala Ile Val

130 135 140

Glu Ser Ser Thr Thr Glu Ala Leu Gln Leu Leu Glu Glu Glu Ile Gln

145 150 155 160

Asn Pro Gln Phe Asp Asn Met Lys Phe Tyr Lys Lys Arg Met Glu Phe

165 170 175

Ile Tyr Asp Arg Gln Lys Arg Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ser Gln Ile

180 185 190

Asn Lys Pro Thr Val Pro Thr Ile Asp Asp Ile Ile Lys Ser His Leu

195 200 205

Val Ser Glu Tyr Asn Arg Asp Glu Thr Val Leu Glu Ser Tyr Arg Thr

210 215 220

Asn Ser Leu Arg Lys Ile Asn Ser Asn His Gly Ile Asp Ile Arg Ala

225 230 235 240

Asn Ser Leu Phe Thr Glu Gln Glu Leu Leu Asn Ile Tyr Ser Gln Glu

245 250 255

Leu Leu Asn Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Val Arg Leu

260 265 270

Leu Ala Leu Lys Asn Phe Gly Gly Val Tyr Leu Asp Val Asp Met Leu

275 280 285

Pro Gly Ile His Ser Asp Leu Phe Lys Thr Ile Ser Arg Pro Ser Ser

290 295 300

Ile Gly Leu Asp Arg Trp Glu Met Ile Lys Leu Glu Ala Ile Met Lys

305 310 315 320

Tyr Lys Lys Tyr Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Asp Lys Leu

325 330 335

Asp Gln Gln Leu Lys Asp Asn Phe Lys Leu Ile Ile Glu Ser Lys Ser

340 345 350

Glu Lys Ser Glu Ile Phe Ser Lys Leu Glu Asn Leu Asn Val Ser Asp

355 360 365

Leu Glu Ile Lys Ile Ala Phe Ala Leu Gly Ser Val Ile Asn Gln Ala

370 375 380

Leu Ile Ser Lys Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Asn Leu Val Ile Glu Gln

385 390 395 400

Val Lys Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Asn Gln His Leu Asn Pro Ala Ile

405 410 415

Glu Ser Asp Asn Asn Phe Thr Asp Thr Thr Lys Ile Phe His Asp Ser

420 425 430

Leu Phe Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asn Ser Met Phe Leu Thr Lys Ile

435 440 445

Ala Pro Tyr Leu Gln Val Gly Phe Met Pro Glu Ala Arg Ser Thr Ile

450 455 460

Ser Leu Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Ala Ser Ala Tyr Tyr Asp Phe Ile

465 470 475 480

Asn Leu Gln Glu Asn Thr Ile Glu Lys Thr Leu Lys Ala Ser Asp Leu

485 490 495

Ile Glu Phe Lys Phe Pro Glu Asn Asn Leu Ser Gln Leu Thr Glu Gln

500 505 510

Glu Ile Asn Ser Leu Trp Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ala Lys Tyr Gln

515 520 525

Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Tyr Thr Gly Gly Ser Leu Ser Glu Asp

530 535 540

Asn Gly Val Asp Phe Asn Lys Asn Thr Ala Leu Asp Lys Asn Tyr Leu

545 550 555 560

Leu Asn Asn Lys Ile Pro Ser Asn Asn Val Glu Glu Ala Gly Ser Lys

565 570 575

Asn Tyr Val His Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Gly Asp Asp Ile Ser Tyr

580 585 590

Glu Ala Thr Cys Asn Leu Phe Ser Lys Asn Pro Lys Asn Ser Ile Ile

595 600 605

Ile Gln Arg Asn Met Asn Glu Ser Ala Lys Ser Tyr Phe Leu Ser Asp

610 615 620

Asp Gly Glu Ser Ile Leu Glu Leu Asn Lys Tyr Arg Ile Pro Glu Arg

625 630 635 640

Leu Lys Asn Lys Glu Lys Val Lys Val Thr Phe Ile Gly His Gly Lys

645 650 655

Asp Glu Phe Asn Thr Ser Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Asp Ser Leu

660 665 670

Ser Asn Glu Ile Ser Ser Phe Leu Asp Thr Ile Lys Leu Asp Ile Ser

675 680 685

Pro Lys Asn Val Glu Val Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser Tyr

690 695 700

Asp Phe Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Ser Ile

705 710 715 720

Met Asp Lys Ile Thr Ser Thr Leu Pro Asp Val Asn Lys Asn Ser Ile

725 730 735

Thr Ile Gly Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly Arg

740 745 750

Lys Glu Leu Leu Ala His Ser Gly Lys Trp Ile Asn Lys Glu Glu Ala

755 760 765

Ile Met Ser Asp Leu Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Phe Phe Asp Ser Ile

770 775 780

Asp Asn Lys Leu Lys Ala Lys Ser Lys Asn Ile Pro Gly Leu Ala Ser

785 790 795 800

Ile Ser Glu Asp Ile Lys Thr Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val Ser Pro

805 810 815

Asp Thr Lys Phe Ile Leu Asn Asn Leu Lys Leu Asn Ile Glu Ser Ser

820 825 830

Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Glu Lys Leu Glu Pro Val Lys Asn Ile

835 840 845

Ile His Asn Ser Ile Asp Asp Leu Ile Asp Glu Phe Asn Leu Leu Glu

850 855 860

Asn Val Ser Asp Glu Leu Tyr Glu Leu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Asp

865 870 875 880

Glu Lys Tyr Leu Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Lys Asn Asn Ser Thr

885 890 895

Tyr Ser Val Arg Phe Ile Asn Lys Ser Asn Gly Glu Ser Val Tyr Val

900 905 910

Glu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Ser Lys Tyr Ser Glu His Ile Thr Lys

915 920 925

Glu Ile Ser Thr Ile Lys Asn Ser Ile Ile Thr Asp Val Asn Gly Asn

930 935 940

Leu Leu Asp Asn Ile Gln Leu Asp His Thr Ser Gln Val Asn Thr Leu

945 950 955 960

Asn Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Asp Tyr Ser Ser Asn Lys

965 970 975

Asp Val Leu Asn Asp Leu Ser Thr Ser Val Lys Val Gln Leu Tyr Ala

980 985 990

Gln Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Tyr Asp Ser Ile Gln Leu

995 1000 1005

Val Asn Leu Ile Ser Asn Ala Val Asn Asp Thr Ile Asn Val Leu

1010 1015 1020

Pro Thr Ile Thr Glu Gly Ile Pro Ile Val Ser Thr Ile Leu Asp

1025 1030 1035

Gly Ile Asn Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Leu Asp Glu His

1040 1045 1050

Asp Pro Leu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ala Lys Val Gly Val Leu

1055 1060 1065

Ala Ile Asn Met Ser Leu Ser Ile Ala Ala Thr Val Ala Ser Ile

1070 1075 1080

Val Gly Ile Gly Ala Glu Val Thr Ile Phe Leu Leu Pro Ile Ala

1085 1090 1095

Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Ile

1100 1105 1110

Leu His Asp Lys Ala Thr Ser Val Val Asn Tyr Phe Asn His Leu

1115 1120 1125

Ser Glu Ser Lys Lys Tyr Gly Pro Leu Lys Thr Glu Asp Asp Lys

1130 1135 1140

Ile Leu Val Pro Ile Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp Phe

1145 1150 1155

Asn Asn Asn Ser Ile Lys Leu Gly Thr Cys Asn Ile Leu Ala Met

1160 1165 1170

Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Gly Asn Ile Asp His Phe

1175 1180 1185

Phe Ser Ser Pro Ser Ile Ser Ser His Ile Pro Ser Leu Ser Ile

1190 1195 1200

Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Glu Thr Glu Asn Leu Asp Phe Ser Lys

1205 1210 1215

Lys Ile Met Met Leu Pro Asn Ala Pro Ser Arg Val Phe Trp Trp

1220 1225 1230

Glu Thr Gly Ala Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp Gly

1235 1240 1245

Thr Arg Leu Leu Asp Ser Ile Arg Asp Leu Tyr Pro Gly Lys Phe

1250 1255 1260

Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala Phe Phe Asp Tyr Ala Ile Thr Thr Leu

1265 1270 1275

Lys Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Lys Ile Lys Leu Asp Lys

1280 1285 1290

Asp Thr Arg Asn Phe Ile Met Pro Thr Ile Thr Thr Asn Glu Ile

1295 1300 1305

Arg Asn Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Asp Gly Ala Gly Gly Thr Tyr

1310 1315 1320

Ser Leu Leu Leu Ser Ser Tyr Pro Ile Ser Thr Asn Ile Asn Leu

1325 1330 1335

Ser Lys Asp Asp Leu Trp Ile Phe Asn Ile Asp Asn Glu Val Arg

1340 1345 1350

Glu Ile Ser Ile Glu Asn Gly Thr Ile Lys Lys Gly Lys Leu Ile

1355 1360 1365

Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile Asp Ile Asn Lys Asn Lys Leu Ile

1370 1375 1380

Ile Gly Asn Gln Thr Ile Asp Phe Ser Gly Asp Ile Asp Asn Lys

1385 1390 1395

Asp Arg Tyr Ile Phe Leu Thr Cys Glu Leu Asp Asp Lys Ile Ser

1400 1405 1410

Leu Ile Ile Glu Ile Asn Leu Val Ala Lys Ser Tyr Ser Leu Leu

1415 1420 1425

Leu Ser Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Ile Ser Asn Leu Ser Asn Ile

1430 1435 1440

Ile Glu Lys Ile Asn Thr Leu Gly Leu Asp Ser Lys Asn Ile Ala

1445 1450 1455

Tyr Asn Tyr Thr Asp Glu Ser Asn Asn Lys Tyr Phe Gly Ala Ile

1460 1465 1470

Ser Lys Thr Ser Gln Lys Ser Ile Ile His Tyr Lys Lys Asp Ser

1475 1480 1485

Lys Asn Ile Leu Glu Phe Tyr Asn Asp Ser Thr Leu Glu Phe Asn

1490 1495 1500

Ser Lys Asp Phe Ile Ala Glu Asp Ile Asn Val Phe Met Lys Asp

1505 1510 1515

Asp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Lys Tyr Tyr Val Asp Asn Asn Thr

1520 1525 1530

Asp Lys Ser Ile Asp Phe Ser Ile Ser Leu Val Ser Lys Asn Gln

1535 1540 1545

Val Lys Val Asn Gly Leu Tyr Leu Asn Glu Ser Val Tyr Ser Ser

1550 1555 1560

Tyr Leu Asp Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly His His Asn Thr Ser

1565 1570 1575

Asn Phe Met Asn Leu Phe Leu Asp Asn Ile Ser Phe Trp Lys Leu

1580 1585 1590

Phe Gly Phe Glu Asn Ile Asn Phe Val Ile Asp Lys Tyr Phe Thr

1595 1600 1605

Leu Val Gly Lys Thr Asn Leu Gly Tyr Val Glu Phe Ile Cys Asp

1610 1615 1620

Asn Asn Lys Asn Ile Asp Ile Tyr Phe Gly Glu Trp Lys Thr Ser

1625 1630 1635

Ser Ser Lys Ser Thr Ile Phe Ser Gly Asn Gly Arg Asn Val Val

1640 1645 1650

Val Glu Pro Ile Tyr Asn Pro Asp Thr Gly Glu Asp Ile Ser Thr

1655 1660 1665

Ser Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Pro Leu Tyr Gly Ile Asp Arg Tyr

1670 1675 1680

Ile Asn Lys Val Leu Ile Ala Pro Asp Leu Tyr Thr Ser Leu Ile

1685 1690 1695

Asn Ile Asn Thr Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Tyr Tyr Pro Glu Ile

1700 1705 1710

Ile Val Leu Asn Pro Asn Thr Phe His Lys Lys Val Asn Ile Asn

1715 1720 1725

Leu Asp Ser Ser Ser Phe Glu Tyr Lys Trp Ser Thr Glu Gly Ser

1730 1735 1740

Asp Phe Ile Leu Val Arg Tyr Leu Glu Glu Ser Asn Lys Lys Ile

1745 1750 1755

Leu Gln Lys Ile Arg Ile Lys Gly Ile Leu Ser Asn Thr Gln Ser

1760 1765 1770

Phe Asn Lys Met Ser Ile Asp Phe Lys Asp Ile Lys Lys Leu Ser

1775 1780 1785

Leu Gly Tyr Ile Met Ser Asn Phe Lys Ser Phe Asn Ser Glu Asn

1790 1795 1800

Glu Leu Asp Arg Asp His Leu Gly Phe Lys Ile Ile Asp Asn Lys

1805 1810 1815

Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu Ile

1820 1825 1830

Asn Ile Asn Asn Ser Leu Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Phe Asn

1835 1840 1845

Leu Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe

1850 1855 1860

Asp Ile Asn Thr Gly Ala Ala Leu Ile Ser Tyr Lys Ile Ile Asn

1865 1870 1875

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asp Gly Val Met Gln Leu Gly

1880 1885 1890

Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

1895 1900 1905

Thr Gln Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Ser

1910 1915 1920

Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp

1925 1930 1935

Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Glu Lys Tyr

1940 1945 1950

Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Val Gly Leu Gln Val

1955 1960 1965

Ile Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala Ile Ile

1970 1975 1980

Ser Lys Gly Trp Gln Thr Val Asn Gly Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp

1985 1990 1995

Thr Asp Thr Ala Ile Ala Phe Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Gly

2000 2005 2010

Lys His Phe Tyr Phe Asp Ser Asp Cys Val Val Lys Ile Gly Val

2015 2020 2025

Phe Ser Thr Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr

2030 2035 2040

Tyr Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Ser Lys

2045 2050 2055

Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn Ser

2060 2065 2070

Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Tyr

2075 2080 2085

Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

2090 2095 2100

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala

2105 2110 2115

Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr

2120 2125 2130

Asn Thr Ala Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Asn Gly Lys

2135 2140 2145

His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe

2150 2155 2160

Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp

2165 2170 2175

Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Glu Phe

2180 2185 2190

Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys

2195 2200 2205

Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Lys Lys Tyr Tyr Phe

2210 2215 2220

Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Ile His Leu Cys Thr Ile Asn

2225 2230 2235

Asn Asp Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Asp Gly Ile Leu Gln Asn Gly

2240 2245 2250

Tyr Ile Thr Ile Glu Arg Asn Asn Phe Tyr Phe Asp Ala Asn Asn

2255 2260 2265

Glu Ser Lys Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe

2270 2275 2280

Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly

2285 2290 2295

Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

2300 2305 2310

Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln

2315 2320 2325

Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu

2330 2335 2340

Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe

2345 2350 2355

Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp

2360 2365 2370

Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe Ile Ala Ser Thr

2375 2380 2385

Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp

2390 2395 2400

Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu

2405 2410 2415

Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln

2420 2425 2430

Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys

2435 2440 2445

Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr

2450 2455 2460

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala

2465 2470 2475

Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn

2480 2485 2490

Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly

2495 2500 2505

Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val

2510 2515 2520

Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr

2525 2530 2535

Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn Arg

2540 2545 2550

Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser

2555 2560 2565

Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr

2570 2575 2580

Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile

2585 2590 2595

Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile Gly

2600 2605 2610

Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2615 2620 2625

Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn

2630 2635 2640

Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn

2645 2650 2655

Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Val Tyr

2660 2665 2670

Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu Phe

2675 2680 2685

Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys

2690 2695 2700

Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

2705

<210> 2

<211> 2366

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 2

Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gln Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg

1 5 10 15

Phe Arg Thr Gln Glu Asp Glu Tyr Val Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu

20 25 30

Glu Tyr His Asn Met Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Lys Tyr Leu Lys

35 40 45

Leu Lys Asp Ile Asn Ser Leu Thr Asp Ile Tyr Ile Asp Thr Tyr Lys

50 55 60

Lys Ser Gly Arg Asn Lys Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Val

65 70 75 80

Thr Glu Val Leu Glu Leu Lys Asn Asn Asn Leu Thr Pro Val Glu Lys

85 90 95

Asn Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Gln Ile Asn Asp Thr Ala Ile

100 105 110

Asn Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Val Asn Ser Asp Tyr Asn Val Asn

115 120 125

Val Phe Tyr Asp Ser Asn Ala Phe Leu Ile Asn Thr Leu Lys Lys Thr

130 135 140

Val Val Glu Ser Ala Ile Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn

145 150 155 160

Leu Asn Asp Pro Arg Phe Asp Tyr Asn Lys Phe Phe Arg Lys Arg Met

165 170 175

Glu Ile Ile Tyr Asp Lys Gln Lys Asn Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ala

180 185 190

Gln Arg Glu Glu Asn Pro Glu Leu Ile Ile Asp Asp Ile Val Lys Thr

195 200 205

Tyr Leu Ser Asn Glu Tyr Ser Lys Glu Ile Asp Glu Leu Asn Thr Tyr

210 215 220

Ile Glu Glu Ser Leu Asn Lys Ile Thr Gln Asn Ser Gly Asn Asp Val

225 230 235 240

Arg Asn Phe Glu Glu Phe Lys Asn Gly Glu Ser Phe Asn Leu Tyr Glu

245 250 255

Gln Glu Leu Val Glu Arg Trp Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Leu

260 265 270

Arg Ile Ser Ala Leu Lys Glu Ile Gly Gly Met Tyr Leu Asp Val Asp

275 280 285

Met Leu Pro Gly Ile Gln Pro Asp Leu Phe Glu Ser Ile Glu Lys Pro

290 295 300

Ser Ser Val Thr Val Asp Phe Trp Glu Met Thr Lys Leu Glu Ala Ile

305 310 315 320

Met Lys Tyr Lys Glu Tyr Ile Pro Glu Tyr Thr Ser Glu His Phe Asp

325 330 335

Met Leu Asp Glu Glu Val Gln Ser Ser Phe Glu Ser Val Leu Ala Ser

340 345 350

Lys Ser Asp Lys Ser Glu Ile Phe Ser Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala

355 360 365

Ser Pro Leu Glu Val Lys Ile Ala Phe Asn Ser Lys Gly Ile Ile Asn

370 375 380

Gln Gly Leu Ile Ser Val Lys Asp Ser Tyr Cys Ser Asn Leu Ile Val

385 390 395 400

Lys Gln Ile Glu Asn Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Asn Ser Leu Asn Pro

405 410 415

Ala Ile Ser Glu Asp Asn Asp Phe Asn Thr Thr Thr Asn Thr Phe Ile

420 425 430

Asp Ser Ile Met Ala Glu Ala Asn Ala Asp Asn Gly Arg Phe Met Met

435 440 445

Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Arg Val Gly Phe Phe Pro Asp Val Lys Thr

450 455 460

Thr Ile Asn Leu Ser Gly Pro Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Tyr Gln Asp

465 470 475 480

Leu Leu Met Phe Lys Glu Gly Ser Met Asn Ile His Leu Ile Glu Ala

485 490 495

Asp Leu Arg Asn Phe Glu Ile Ser Lys Thr Asn Ile Ser Gln Ser Thr

500 505 510

Glu Gln Glu Met Ala Ser Leu Trp Ser Phe Asp Asp Ala Arg Ala Lys

515 520 525

Ala Gln Phe Glu Glu Tyr Lys Arg Asn Tyr Phe Glu Gly Ser Leu Gly

530 535 540

Glu Asp Asp Asn Leu Asp Phe Ser Gln Asn Ile Val Val Asp Lys Glu

545 550 555 560

Tyr Leu Leu Glu Lys Ile Ser Ser Leu Ala Arg Ser Ser Glu Arg Gly

565 570 575

Tyr Ile His Tyr Ile Val Gln Leu Gln Gly Asp Lys Ile Ser Tyr Glu

580 585 590

Ala Ala Cys Asn Leu Phe Ala Lys Thr Pro Tyr Asp Ser Val Leu Phe

595 600 605

Gln Lys Asn Ile Glu Asp Ser Glu Ile Ala Tyr Tyr Tyr Asn Pro Gly

610 615 620

Asp Gly Glu Ile Gln Glu Ile Asp Lys Tyr Lys Ile Pro Ser Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asp Arg Pro Lys Ile Lys Leu Thr Phe Ile Gly His Gly Lys Asp

645 650 655

Glu Phe Asn Thr Asp Ile Phe Ala Gly Phe Asp Val Asp Ser Leu Ser

660 665 670

Thr Glu Ile Glu Ala Ala Ile Asp Leu Ala Lys Glu Asp Ile Ser Pro

675 680 685

Lys Ser Ile Glu Ile Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser Tyr Ser

690 695 700

Ile Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Lys Val Lys

705 710 715 720

Asp Lys Ile Ser Glu Leu Met Pro Ser Ile Ser Gln Asp Ser Ile Ile

725 730 735

Val Ser Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly Arg Arg

740 745 750

Glu Leu Leu Asp His Ser Gly Glu Trp Ile Asn Lys Glu Glu Ser Ile

755 760 765

Ile Lys Asp Ile Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Ser Phe Asn Pro Lys Glu

770 775 780

Asn Lys Ile Thr Val Lys Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Ser Thr Leu

785 790 795 800

Leu Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asp Ile Glu Leu Glu

805 810 815

Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Cys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn Ile

820 825 830

Asp Thr Gln Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Glu Ala Lys Asn Leu Thr

835 840 845

Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asp Glu Phe Lys Leu Ile Glu Ser

850 855 860

Ile Ser Asp Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gln Gln Asn Glu Leu Glu Asp

865 870 875 880

Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Glu Thr Asp Glu Gly Phe

885 890 895

Ser Ile Arg Phe Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu Ser Ile Phe Val Glu

900 905 910

Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn His Ile Thr Glu Glu

915 920 925

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr Val Asn Gly Lys Leu

930 935 940

Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu Val Asn Thr Leu Asn

945 950 955 960

Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr Asn Ser Ser Lys Glu

965 970 975

Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys Val Gln Val Tyr Ala Gln

980 985 990

Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Thr Asp Ala Ala Lys Val Val

995 1000 1005

Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro

1010 1015 1020

Thr Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly

1025 1030 1035

Val Ser Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp

1040 1045 1050

Pro Leu Leu Arg Gln Glu Ile Glu Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala

1055 1060 1065

Val Asn Leu Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ile Ile Thr Ser Ser Leu

1070 1075 1080

Gly Ile Ala Ser Gly Phe Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly

1085 1090 1095

Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Val Leu

1100 1105 1110

Arg Asp Lys Ala Thr Lys Val Val Asp Tyr Phe Lys His Val Ser

1115 1120 1125

Leu Val Glu Thr Glu Gly Val Phe Thr Leu Leu Asp Asp Lys Ile

1130 1135 1140

Met Met Pro Gln Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp Phe Asn

1145 1150 1155

Asn Asn Ser Ile Val Leu Gly Lys Cys Glu Ile Trp Arg Met Glu

1160 1165 1170

Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Asp Asp Ile Asp His Phe Phe

1175 1180 1185

Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Glu Pro His Leu Ser Ile Tyr

1190 1195 1200

Asp Val Leu Glu Val Gln Lys Glu Glu Leu Asp Leu Ser Lys Asp

1205 1210 1215

Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro Asn Arg Val Phe Ala Trp Glu

1220 1225 1230

Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp Gly Thr

1235 1240 1245

Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr

1250 1255 1260

Trp Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu

1265 1270 1275

Lys Pro Arg Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Arg Ile Asn Leu Asp Ser

1280 1285 1290

Asn Thr Arg Ser Phe Ile Val Pro Ile Ile Thr Thr Glu Tyr Ile

1295 1300 1305

Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr

1310 1315 1320

Ala Leu Ser Leu Ser Gln Tyr Asn Met Gly Ile Asn Ile Glu Leu

1325 1330 1335

Ser Glu Ser Asp Val Trp Ile Ile Asp Val Asp Asn Val Val Arg

1340 1345 1350

Asp Val Thr Ile Glu Ser Asp Lys Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ile

1355 1360 1365

Glu Gly Ile Leu Ser Thr Leu Ser Ile Glu Glu Asn Lys Ile Ile

1370 1375 1380

Leu Asn Ser His Glu Ile Asn Phe Ser Gly Glu Val Asn Gly Ser

1385 1390 1395

Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe Ser Ile Leu Glu Gly Ile Asn

1400 1405 1410

Ala Ile Ile Glu Val Asp Leu Leu Ser Lys Ser Tyr Lys Leu Leu

1415 1420 1425

Ile Ser Gly Glu Leu Lys Ile Leu Met Leu Asn Ser Asn His Ile

1430 1435 1440

Gln Gln Lys Ile Asp Tyr Ile Gly Phe Asn Ser Glu Leu Gln Lys

1445 1450 1455

Asn Ile Pro Tyr Ser Phe Val Asp Ser Glu Gly Lys Glu Asn Gly

1460 1465 1470

Phe Ile Asn Gly Ser Thr Lys Glu Gly Leu Phe Val Ser Glu Leu

1475 1480 1485

Pro Asp Val Val Leu Ile Ser Lys Val Tyr Met Asp Asp Ser Lys

1490 1495 1500

Pro Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn Asn Leu Lys Asp Val Lys Val

1505 1510 1515

Ile Thr Lys Asp Asn Val Asn Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys

1520 1525 1530

Asp Asp Ile Lys Ile Ser Leu Ser Leu Thr Leu Gln Asp Glu Lys

1535 1540 1545

Thr Ile Lys Leu Asn Ser Val His Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala

1550 1555 1560

Glu Ile Leu Lys Phe Met Asn Arg Lys Gly Asn Thr Asn Thr Ser

1565 1570 1575

Asp Ser Leu Met Ser Phe Leu Glu Ser Met Asn Ile Lys Ser Ile

1580 1585 1590

Phe Val Asn Phe Leu Gln Ser Asn Ile Lys Phe Ile Leu Asp Ala

1595 1600 1605

Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe

1610 1615 1620

Ile Cys Asp Glu Asn Asp Asn Ile Gln Pro Tyr Phe Ile Lys Phe

1625 1630 1635

Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Val Gly Asn Arg Gln

1640 1645 1650

Asn Met Ile Val Glu Pro Asn Tyr Asp Leu Asp Asp Ser Gly Asp

1655 1660 1665

Ile Ser Ser Thr Val Ile Asn Phe Ser Gln Lys Tyr Leu Tyr Gly

1670 1675 1680

Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val Val Ile Ser Pro Asn Ile Tyr

1685 1690 1695

Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro Val Tyr Glu Thr Asn Asn Thr

1700 1705 1710

Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp Ala Asn Tyr Ile Asn Glu Lys

1715 1720 1725

Ile Asn Val Asn Ile Asn Asp Leu Ser Ile Arg Tyr Val Trp Ser

1730 1735 1740

Asn Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn

1745 1750 1755

Lys Val Ser Gln Val Lys Ile Arg Phe Val Asn Val Phe Lys Asp

1760 1765 1770

Lys Thr Leu Ala Asn Lys Leu Ser Phe Asn Phe Ser Asp Lys Gln

1775 1780 1785

Asp Val Pro Val Ser Glu Ile Ile Leu Ser Phe Thr Pro Ser Tyr

1790 1795 1800

Tyr Glu Asp Gly Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Gly Leu Val Ser Leu

1805 1810 1815

Tyr Asn Glu Lys Phe Tyr Ile Asn Asn Phe Gly Met Met Val Ser

1820 1825 1830

Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro

1835 1840 1845

Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp Lys

1850 1855 1860

Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

1865 1870 1875

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val

1880 1885 1890

Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe

1895 1900 1905

Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile

1910 1915 1920

Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe

1925 1930 1935

Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly

1940 1945 1950

Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly

1955 1960 1965

Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly

1970 1975 1980

Val Met Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr

1985 1990 1995

Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp

2000 2005 2010

Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly

2015 2020 2025

Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn

2030 2035 2040

Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly

2045 2050 2055

Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe

2060 2065 2070

Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu

2090 2095 2100

Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

2105 2110 2115

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp

2120 2125 2130

Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr

2135 2140 2145

Phe Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp

2150 2155 2160

Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn

2165 2170 2175

Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg

2180 2185 2190

Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu

2195 2200 2205

Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr

2210 2215 2220

Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile

2225 2230 2235

Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr

2240 2245 2250

Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn

2255 2260 2265

Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe

2270 2275 2280

Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr

2285 2290 2295

Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu

2300 2305 2310

Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu

2315 2320 2325

Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr

2330 2335 2340

Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

2345 2350 2355

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

2360 2365

<210> 3

<211> 2710

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность: TcdA (мутации

D285A D287A)

<400> 3

Met Ser Leu Ile Ser Lys Glu Glu Leu Ile Lys Leu Ala Tyr Ser Ile

1 5 10 15

Arg Pro Arg Glu Asn Glu Tyr Lys Thr Ile Leu Thr Asn Leu Asp Glu

20 25 30

Tyr Asn Lys Leu Thr Thr Asn Asn Asn Glu Asn Lys Tyr Leu Gln Leu

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asp Val Phe Met Asn Lys Tyr Lys Thr

50 55 60

Ser Ser Arg Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu Lys Lys Asp Ile Leu Lys

65 70 75 80

Glu Val Ile Leu Ile Lys Asn Ser Asn Thr Ser Pro Val Glu Lys Asn

85 90 95

Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Glu Val Ser Asp Ile Ala Leu Glu

100 105 110

Tyr Ile Lys Gln Trp Ala Asp Ile Asn Ala Glu Tyr Asn Ile Lys Leu

115 120 125

Trp Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Leu Val Asn Thr Leu Lys Lys Ala Ile

130 135 140

Val Glu Ser Ser Thr Thr Glu Ala Leu Gln Leu Leu Glu Glu Glu Ile

145 150 155 160

Gln Asn Pro Gln Phe Asp Asn Met Lys Phe Tyr Lys Lys Arg Met Glu

165 170 175

Phe Ile Tyr Asp Arg Gln Lys Arg Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ser Gln

180 185 190

Ile Asn Lys Pro Thr Val Pro Thr Ile Asp Asp Ile Ile Lys Ser His

195 200 205

Leu Val Ser Glu Tyr Asn Arg Asp Glu Thr Val Leu Glu Ser Tyr Arg

210 215 220

Thr Asn Ser Leu Arg Lys Ile Asn Ser Asn His Gly Ile Asp Ile Arg

225 230 235 240

Ala Asn Ser Leu Phe Thr Glu Gln Glu Leu Leu Asn Ile Tyr Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Leu Asn Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Val Arg

260 265 270

Leu Leu Ala Leu Lys Asn Phe Gly Gly Val Tyr Leu Ala Val Ala Met

275 280 285

Leu Pro Gly Ile His Ser Asp Leu Phe Lys Thr Ile Ser Arg Pro Ser

290 295 300

Ser Ile Gly Leu Asp Arg Trp Glu Met Ile Lys Leu Glu Ala Ile Met

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Tyr Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Asp Lys

325 330 335

Leu Asp Gln Gln Leu Lys Asp Asn Phe Lys Leu Ile Ile Glu Ser Lys

340 345 350

Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe Ser Lys Leu Glu Asn Leu Asn Val Ser

355 360 365

Asp Leu Glu Ile Lys Ile Ala Phe Ala Leu Gly Ser Val Ile Asn Gln

370 375 380

Ala Leu Ile Ser Lys Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Asn Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

Gln Val Lys Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Asn Gln His Leu Asn Pro Ala

405 410 415

Ile Glu Ser Asp Asn Asn Phe Thr Asp Thr Thr Lys Ile Phe His Asp

420 425 430

Ser Leu Phe Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asn Ser Met Phe Leu Thr Lys

435 440 445

Ile Ala Pro Tyr Leu Gln Val Gly Phe Met Pro Glu Ala Arg Ser Thr

450 455 460

Ile Ser Leu Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Ala Ser Ala Tyr Tyr Asp Phe

465 470 475 480

Ile Asn Leu Gln Glu Asn Thr Ile Glu Lys Thr Leu Lys Ala Ser Asp

485 490 495

Leu Ile Glu Phe Lys Phe Pro Glu Asn Asn Leu Ser Gln Leu Thr Glu

500 505 510

Gln Glu Ile Asn Ser Leu Trp Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ala Lys Tyr

515 520 525

Gln Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Tyr Thr Gly Gly Ser Leu Ser Glu

530 535 540

Asp Asn Gly Val Asp Phe Asn Lys Asn Thr Ala Leu Asp Lys Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Asn Asn Lys Ile Pro Ser Asn Asn Val Glu Glu Ala Gly Ser

565 570 575

Lys Asn Tyr Val His Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Gly Asp Asp Ile Ser

580 585 590

Tyr Glu Ala Thr Cys Asn Leu Phe Ser Lys Asn Pro Lys Asn Ser Ile

595 600 605

Ile Ile Gln Arg Asn Met Asn Glu Ser Ala Lys Ser Tyr Phe Leu Ser

610 615 620

Asp Asp Gly Glu Ser Ile Leu Glu Leu Asn Lys Tyr Arg Ile Pro Glu

625 630 635 640

Arg Leu Lys Asn Lys Glu Lys Val Lys Val Thr Phe Ile Gly His Gly

645 650 655

Lys Asp Glu Phe Asn Thr Ser Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Asp Ser

660 665 670

Leu Ser Asn Glu Ile Ser Ser Phe Leu Asp Thr Ile Lys Leu Asp Ile

675 680 685

Ser Pro Lys Asn Val Glu Val Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser

690 695 700

Tyr Asp Phe Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Ser

705 710 715 720

Ile Met Asp Lys Ile Thr Ser Thr Leu Pro Asp Val Asn Lys Asn Ser

725 730 735

Ile Thr Ile Gly Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly

740 745 750

Arg Lys Glu Leu Leu Ala His Ser Gly Lys Trp Ile Asn Lys Glu Glu

755 760 765

Ala Ile Met Ser Asp Leu Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Phe Phe Asp Ser

770 775 780

Ile Asp Asn Lys Leu Lys Ala Lys Ser Lys Asn Ile Pro Gly Leu Ala

785 790 795 800

Ser Ile Ser Glu Asp Ile Lys Thr Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val Ser

805 810 815

Pro Asp Thr Lys Phe Ile Leu Asn Asn Leu Lys Leu Asn Ile Glu Ser

820 825 830

Ser Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Glu Lys Leu Glu Pro Val Lys Asn

835 840 845

Ile Ile His Asn Ser Ile Asp Asp Leu Ile Asp Glu Phe Asn Leu Leu

850 855 860

Glu Asn Val Ser Asp Glu Leu Tyr Glu Leu Lys Lys Leu Asn Asn Leu

865 870 875 880

Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Lys Asn Asn Ser

885 890 895

Thr Tyr Ser Val Arg Phe Ile Asn Lys Ser Asn Gly Glu Ser Val Tyr

900 905 910

Val Glu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Ser Lys Tyr Ser Glu His Ile Thr

915 920 925

Lys Glu Ile Ser Thr Ile Lys Asn Ser Ile Ile Thr Asp Val Asn Gly

930 935 940

Asn Leu Leu Asp Asn Ile Gln Leu Asp His Thr Ser Gln Val Asn Thr

945 950 955 960

Leu Asn Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Asp Tyr Ser Ser Asn

965 970 975

Lys Asp Val Leu Asn Asp Leu Ser Thr Ser Val Lys Val Gln Leu Tyr

980 985 990

Ala Gln Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Tyr Asp Ser Ile Gln

995 1000 1005

Leu Val Asn Leu Ile Ser Asn Ala Val Asn Asp Thr Ile Asn Val

1010 1015 1020

Leu Pro Thr Ile Thr Glu Gly Ile Pro Ile Val Ser Thr Ile Leu

1025 1030 1035

Asp Gly Ile Asn Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Leu Asp Glu

1040 1045 1050

His Asp Pro Leu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ala Lys Val Gly Val

1055 1060 1065

Leu Ala Ile Asn Met Ser Leu Ser Ile Ala Ala Thr Val Ala Ser

1070 1075 1080

Ile Val Gly Ile Gly Ala Glu Val Thr Ile Phe Leu Leu Pro Ile

1085 1090 1095

Ala Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu

1100 1105 1110

Ile Leu His Asp Lys Ala Thr Ser Val Val Asn Tyr Phe Asn His

1115 1120 1125

Leu Ser Glu Ser Lys Lys Tyr Gly Pro Leu Lys Thr Glu Asp Asp

1130 1135 1140

Lys Ile Leu Val Pro Ile Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp

1145 1150 1155

Phe Asn Asn Asn Ser Ile Lys Leu Gly Thr Cys Asn Ile Leu Ala

1160 1165 1170

Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Gly Asn Ile Asp His

1175 1180 1185

Phe Phe Ser Ser Pro Ser Ile Ser Ser His Ile Pro Ser Leu Ser

1190 1195 1200

Ile Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Glu Thr Glu Asn Leu Asp Phe Ser

1205 1210 1215

Lys Lys Ile Met Met Leu Pro Asn Ala Pro Ser Arg Val Phe Trp

1220 1225 1230

Trp Glu Thr Gly Ala Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp

1235 1240 1245

Gly Thr Arg Leu Leu Asp Ser Ile Arg Asp Leu Tyr Pro Gly Lys

1250 1255 1260

Phe Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala Phe Phe Asp Tyr Ala Ile Thr Thr

1265 1270 1275

Leu Lys Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Lys Ile Lys Leu Asp

1280 1285 1290

Lys Asp Thr Arg Asn Phe Ile Met Pro Thr Ile Thr Thr Asn Glu

1295 1300 1305

Ile Arg Asn Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Asp Gly Ala Gly Gly Thr

1310 1315 1320

Tyr Ser Leu Leu Leu Ser Ser Tyr Pro Ile Ser Thr Asn Ile Asn

1325 1330 1335

Leu Ser Lys Asp Asp Leu Trp Ile Phe Asn Ile Asp Asn Glu Val

1340 1345 1350

Arg Glu Ile Ser Ile Glu Asn Gly Thr Ile Lys Lys Gly Lys Leu

1355 1360 1365

Ile Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile Asp Ile Asn Lys Asn Lys Leu

1370 1375 1380

Ile Ile Gly Asn Gln Thr Ile Asp Phe Ser Gly Asp Ile Asp Asn

1385 1390 1395

Lys Asp Arg Tyr Ile Phe Leu Thr Cys Glu Leu Asp Asp Lys Ile

1400 1405 1410

Ser Leu Ile Ile Glu Ile Asn Leu Val Ala Lys Ser Tyr Ser Leu

1415 1420 1425

Leu Leu Ser Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Ile Ser Asn Leu Ser Asn

1430 1435 1440

Ile Ile Glu Lys Ile Asn Thr Leu Gly Leu Asp Ser Lys Asn Ile

1445 1450 1455

Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Glu Ser Asn Asn Lys Tyr Phe Gly Ala

1460 1465 1470

Ile Ser Lys Thr Ser Gln Lys Ser Ile Ile His Tyr Lys Lys Asp

1475 1480 1485

Ser Lys Asn Ile Leu Glu Phe Tyr Asn Asp Ser Thr Leu Glu Phe

1490 1495 1500

Asn Ser Lys Asp Phe Ile Ala Glu Asp Ile Asn Val Phe Met Lys

1505 1510 1515

Asp Asp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Lys Tyr Tyr Val Asp Asn Asn

1520 1525 1530

Thr Asp Lys Ser Ile Asp Phe Ser Ile Ser Leu Val Ser Lys Asn

1535 1540 1545

Gln Val Lys Val Asn Gly Leu Tyr Leu Asn Glu Ser Val Tyr Ser

1550 1555 1560

Ser Tyr Leu Asp Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly His His Asn Thr

1565 1570 1575

Ser Asn Phe Met Asn Leu Phe Leu Asp Asn Ile Ser Phe Trp Lys

1580 1585 1590

Leu Phe Gly Phe Glu Asn Ile Asn Phe Val Ile Asp Lys Tyr Phe

1595 1600 1605

Thr Leu Val Gly Lys Thr Asn Leu Gly Tyr Val Glu Phe Ile Cys

1610 1615 1620

Asp Asn Asn Lys Asn Ile Asp Ile Tyr Phe Gly Glu Trp Lys Thr

1625 1630 1635

Ser Ser Ser Lys Ser Thr Ile Phe Ser Gly Asn Gly Arg Asn Val

1640 1645 1650

Val Val Glu Pro Ile Tyr Asn Pro Asp Thr Gly Glu Asp Ile Ser

1655 1660 1665

Thr Ser Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Pro Leu Tyr Gly Ile Asp Arg

1670 1675 1680

Tyr Ile Asn Lys Val Leu Ile Ala Pro Asp Leu Tyr Thr Ser Leu

1685 1690 1695

Ile Asn Ile Asn Thr Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Tyr Tyr Pro Glu

1700 1705 1710

Ile Ile Val Leu Asn Pro Asn Thr Phe His Lys Lys Val Asn Ile

1715 1720 1725

Asn Leu Asp Ser Ser Ser Phe Glu Tyr Lys Trp Ser Thr Glu Gly

1730 1735 1740

Ser Asp Phe Ile Leu Val Arg Tyr Leu Glu Glu Ser Asn Lys Lys

1745 1750 1755

Ile Leu Gln Lys Ile Arg Ile Lys Gly Ile Leu Ser Asn Thr Gln

1760 1765 1770

Ser Phe Asn Lys Met Ser Ile Asp Phe Lys Asp Ile Lys Lys Leu

1775 1780 1785

Ser Leu Gly Tyr Ile Met Ser Asn Phe Lys Ser Phe Asn Ser Glu

1790 1795 1800

Asn Glu Leu Asp Arg Asp His Leu Gly Phe Lys Ile Ile Asp Asn

1805 1810 1815

Lys Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu

1820 1825 1830

Ile Asn Ile Asn Asn Ser Leu Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Phe

1835 1840 1845

Asn Leu Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr

1850 1855 1860

Phe Asp Ile Asn Thr Gly Ala Ala Leu Ile Ser Tyr Lys Ile Ile

1865 1870 1875

Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asp Gly Val Met Gln Leu

1880 1885 1890

Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

1895 1900 1905

Asn Thr Gln Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln

1910 1915 1920

Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

1925 1930 1935

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Glu Lys

1940 1945 1950

Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Val Gly Leu Gln

1955 1960 1965

Val Ile Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala Ile

1970 1975 1980

Ile Ser Lys Gly Trp Gln Thr Val Asn Gly Ser Arg Tyr Tyr Phe

1985 1990 1995

Asp Thr Asp Thr Ala Ile Ala Phe Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp

2000 2005 2010

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asp Ser Asp Cys Val Val Lys Ile Gly

2015 2020 2025

Val Phe Ser Thr Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2030 2035 2040

Thr Tyr Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Ser

2045 2050 2055

Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn

2060 2065 2070

Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr

2090 2095 2100

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala

2105 2110 2115

Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn

2120 2125 2130

Thr Asn Thr Ala Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Asn Gly

2135 2140 2145

Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val

2150 2155 2160

Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr

2165 2170 2175

Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Glu

2180 2185 2190

Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser

2195 2200 2205

Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Lys Lys Tyr Tyr

2210 2215 2220

Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Ile His Leu Cys Thr Ile

2225 2230 2235

Asn Asn Asp Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Asp Gly Ile Leu Gln Asn

2240 2245 2250

Gly Tyr Ile Thr Ile Glu Arg Asn Asn Phe Tyr Phe Asp Ala Asn

2255 2260 2265

Asn Glu Ser Lys Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly

2270 2275 2280

Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu

2285 2290 2295

Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly

2300 2305 2310

Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp

2315 2320 2325

Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala

2330 2335 2340

Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr

2345 2350 2355

Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

2360 2365 2370

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe Ile Ala Ser

2375 2380 2385

Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr

2390 2395 2400

Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe

2405 2410 2415

Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly

2420 2425 2430

Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

2435 2440 2445

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg

2450 2455 2460

Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val

2465 2470 2475

Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe

2480 2485 2490

Asn Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser

2495 2500 2505

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly

2510 2515 2520

Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2525 2530 2535

Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn

2540 2545 2550

Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn

2555 2560 2565

Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr

2570 2575 2580

Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr

2585 2590 2595

Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile

2600 2605 2610

Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

2615 2620 2625

Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln

2630 2635 2640

Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn

2645 2650 2655

Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Val

2660 2665 2670

Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

2675 2680 2685

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val

2690 2695 2700

Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

2705 2710

<210> 4

<211> 2710

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность: TcdA (мутации

D285A D287A C700A)

<400> 4

Met Ser Leu Ile Ser Lys Glu Glu Leu Ile Lys Leu Ala Tyr Ser Ile

1 5 10 15

Arg Pro Arg Glu Asn Glu Tyr Lys Thr Ile Leu Thr Asn Leu Asp Glu

20 25 30

Tyr Asn Lys Leu Thr Thr Asn Asn Asn Glu Asn Lys Tyr Leu Gln Leu

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asp Val Phe Met Asn Lys Tyr Lys Thr

50 55 60

Ser Ser Arg Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu Lys Lys Asp Ile Leu Lys

65 70 75 80

Glu Val Ile Leu Ile Lys Asn Ser Asn Thr Ser Pro Val Glu Lys Asn

85 90 95

Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Glu Val Ser Asp Ile Ala Leu Glu

100 105 110

Tyr Ile Lys Gln Trp Ala Asp Ile Asn Ala Glu Tyr Asn Ile Lys Leu

115 120 125

Trp Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Leu Val Asn Thr Leu Lys Lys Ala Ile

130 135 140

Val Glu Ser Ser Thr Thr Glu Ala Leu Gln Leu Leu Glu Glu Glu Ile

145 150 155 160

Gln Asn Pro Gln Phe Asp Asn Met Lys Phe Tyr Lys Lys Arg Met Glu

165 170 175

Phe Ile Tyr Asp Arg Gln Lys Arg Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ser Gln

180 185 190

Ile Asn Lys Pro Thr Val Pro Thr Ile Asp Asp Ile Ile Lys Ser His

195 200 205

Leu Val Ser Glu Tyr Asn Arg Asp Glu Thr Val Leu Glu Ser Tyr Arg

210 215 220

Thr Asn Ser Leu Arg Lys Ile Asn Ser Asn His Gly Ile Asp Ile Arg

225 230 235 240

Ala Asn Ser Leu Phe Thr Glu Gln Glu Leu Leu Asn Ile Tyr Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Leu Asn Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Val Arg

260 265 270

Leu Leu Ala Leu Lys Asn Phe Gly Gly Val Tyr Leu Ala Val Ala Met

275 280 285

Leu Pro Gly Ile His Ser Asp Leu Phe Lys Thr Ile Ser Arg Pro Ser

290 295 300

Ser Ile Gly Leu Asp Arg Trp Glu Met Ile Lys Leu Glu Ala Ile Met

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Tyr Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Asp Lys

325 330 335

Leu Asp Gln Gln Leu Lys Asp Asn Phe Lys Leu Ile Ile Glu Ser Lys

340 345 350

Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe Ser Lys Leu Glu Asn Leu Asn Val Ser

355 360 365

Asp Leu Glu Ile Lys Ile Ala Phe Ala Leu Gly Ser Val Ile Asn Gln

370 375 380

Ala Leu Ile Ser Lys Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Asn Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

Gln Val Lys Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Asn Gln His Leu Asn Pro Ala

405 410 415

Ile Glu Ser Asp Asn Asn Phe Thr Asp Thr Thr Lys Ile Phe His Asp

420 425 430

Ser Leu Phe Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asn Ser Met Phe Leu Thr Lys

435 440 445

Ile Ala Pro Tyr Leu Gln Val Gly Phe Met Pro Glu Ala Arg Ser Thr

450 455 460

Ile Ser Leu Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Ala Ser Ala Tyr Tyr Asp Phe

465 470 475 480

Ile Asn Leu Gln Glu Asn Thr Ile Glu Lys Thr Leu Lys Ala Ser Asp

485 490 495

Leu Ile Glu Phe Lys Phe Pro Glu Asn Asn Leu Ser Gln Leu Thr Glu

500 505 510

Gln Glu Ile Asn Ser Leu Trp Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ala Lys Tyr

515 520 525

Gln Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Tyr Thr Gly Gly Ser Leu Ser Glu

530 535 540

Asp Asn Gly Val Asp Phe Asn Lys Asn Thr Ala Leu Asp Lys Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Asn Asn Lys Ile Pro Ser Asn Asn Val Glu Glu Ala Gly Ser

565 570 575

Lys Asn Tyr Val His Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Gly Asp Asp Ile Ser

580 585 590

Tyr Glu Ala Thr Cys Asn Leu Phe Ser Lys Asn Pro Lys Asn Ser Ile

595 600 605

Ile Ile Gln Arg Asn Met Asn Glu Ser Ala Lys Ser Tyr Phe Leu Ser

610 615 620

Asp Asp Gly Glu Ser Ile Leu Glu Leu Asn Lys Tyr Arg Ile Pro Glu

625 630 635 640

Arg Leu Lys Asn Lys Glu Lys Val Lys Val Thr Phe Ile Gly His Gly

645 650 655

Lys Asp Glu Phe Asn Thr Ser Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Asp Ser

660 665 670

Leu Ser Asn Glu Ile Ser Ser Phe Leu Asp Thr Ile Lys Leu Asp Ile

675 680 685

Ser Pro Lys Asn Val Glu Val Asn Leu Leu Gly Ala Asn Met Phe Ser

690 695 700

Tyr Asp Phe Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Ser

705 710 715 720

Ile Met Asp Lys Ile Thr Ser Thr Leu Pro Asp Val Asn Lys Asn Ser

725 730 735

Ile Thr Ile Gly Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly

740 745 750

Arg Lys Glu Leu Leu Ala His Ser Gly Lys Trp Ile Asn Lys Glu Glu

755 760 765

Ala Ile Met Ser Asp Leu Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Phe Phe Asp Ser

770 775 780

Ile Asp Asn Lys Leu Lys Ala Lys Ser Lys Asn Ile Pro Gly Leu Ala

785 790 795 800

Ser Ile Ser Glu Asp Ile Lys Thr Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val Ser

805 810 815

Pro Asp Thr Lys Phe Ile Leu Asn Asn Leu Lys Leu Asn Ile Glu Ser

820 825 830

Ser Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Glu Lys Leu Glu Pro Val Lys Asn

835 840 845

Ile Ile His Asn Ser Ile Asp Asp Leu Ile Asp Glu Phe Asn Leu Leu

850 855 860

Glu Asn Val Ser Asp Glu Leu Tyr Glu Leu Lys Lys Leu Asn Asn Leu

865 870 875 880

Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Lys Asn Asn Ser

885 890 895

Thr Tyr Ser Val Arg Phe Ile Asn Lys Ser Asn Gly Glu Ser Val Tyr

900 905 910

Val Glu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Ser Lys Tyr Ser Glu His Ile Thr

915 920 925

Lys Glu Ile Ser Thr Ile Lys Asn Ser Ile Ile Thr Asp Val Asn Gly

930 935 940

Asn Leu Leu Asp Asn Ile Gln Leu Asp His Thr Ser Gln Val Asn Thr

945 950 955 960

Leu Asn Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Asp Tyr Ser Ser Asn

965 970 975

Lys Asp Val Leu Asn Asp Leu Ser Thr Ser Val Lys Val Gln Leu Tyr

980 985 990

Ala Gln Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Tyr Asp Ser Ile Gln

995 1000 1005

Leu Val Asn Leu Ile Ser Asn Ala Val Asn Asp Thr Ile Asn Val

1010 1015 1020

Leu Pro Thr Ile Thr Glu Gly Ile Pro Ile Val Ser Thr Ile Leu

1025 1030 1035

Asp Gly Ile Asn Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Leu Asp Glu

1040 1045 1050

His Asp Pro Leu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ala Lys Val Gly Val

1055 1060 1065

Leu Ala Ile Asn Met Ser Leu Ser Ile Ala Ala Thr Val Ala Ser

1070 1075 1080

Ile Val Gly Ile Gly Ala Glu Val Thr Ile Phe Leu Leu Pro Ile

1085 1090 1095

Ala Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu

1100 1105 1110

Ile Leu His Asp Lys Ala Thr Ser Val Val Asn Tyr Phe Asn His

1115 1120 1125

Leu Ser Glu Ser Lys Lys Tyr Gly Pro Leu Lys Thr Glu Asp Asp

1130 1135 1140

Lys Ile Leu Val Pro Ile Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp

1145 1150 1155

Phe Asn Asn Asn Ser Ile Lys Leu Gly Thr Cys Asn Ile Leu Ala

1160 1165 1170

Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Gly Asn Ile Asp His

1175 1180 1185

Phe Phe Ser Ser Pro Ser Ile Ser Ser His Ile Pro Ser Leu Ser

1190 1195 1200

Ile Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Glu Thr Glu Asn Leu Asp Phe Ser

1205 1210 1215

Lys Lys Ile Met Met Leu Pro Asn Ala Pro Ser Arg Val Phe Trp

1220 1225 1230

Trp Glu Thr Gly Ala Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp

1235 1240 1245

Gly Thr Arg Leu Leu Asp Ser Ile Arg Asp Leu Tyr Pro Gly Lys

1250 1255 1260

Phe Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala Phe Phe Asp Tyr Ala Ile Thr Thr

1265 1270 1275

Leu Lys Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Lys Ile Lys Leu Asp

1280 1285 1290

Lys Asp Thr Arg Asn Phe Ile Met Pro Thr Ile Thr Thr Asn Glu

1295 1300 1305

Ile Arg Asn Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Asp Gly Ala Gly Gly Thr

1310 1315 1320

Tyr Ser Leu Leu Leu Ser Ser Tyr Pro Ile Ser Thr Asn Ile Asn

1325 1330 1335

Leu Ser Lys Asp Asp Leu Trp Ile Phe Asn Ile Asp Asn Glu Val

1340 1345 1350

Arg Glu Ile Ser Ile Glu Asn Gly Thr Ile Lys Lys Gly Lys Leu

1355 1360 1365

Ile Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile Asp Ile Asn Lys Asn Lys Leu

1370 1375 1380

Ile Ile Gly Asn Gln Thr Ile Asp Phe Ser Gly Asp Ile Asp Asn

1385 1390 1395

Lys Asp Arg Tyr Ile Phe Leu Thr Cys Glu Leu Asp Asp Lys Ile

1400 1405 1410

Ser Leu Ile Ile Glu Ile Asn Leu Val Ala Lys Ser Tyr Ser Leu

1415 1420 1425

Leu Leu Ser Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Ile Ser Asn Leu Ser Asn

1430 1435 1440

Ile Ile Glu Lys Ile Asn Thr Leu Gly Leu Asp Ser Lys Asn Ile

1445 1450 1455

Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Glu Ser Asn Asn Lys Tyr Phe Gly Ala

1460 1465 1470

Ile Ser Lys Thr Ser Gln Lys Ser Ile Ile His Tyr Lys Lys Asp

1475 1480 1485

Ser Lys Asn Ile Leu Glu Phe Tyr Asn Asp Ser Thr Leu Glu Phe

1490 1495 1500

Asn Ser Lys Asp Phe Ile Ala Glu Asp Ile Asn Val Phe Met Lys

1505 1510 1515

Asp Asp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Lys Tyr Tyr Val Asp Asn Asn

1520 1525 1530

Thr Asp Lys Ser Ile Asp Phe Ser Ile Ser Leu Val Ser Lys Asn

1535 1540 1545

Gln Val Lys Val Asn Gly Leu Tyr Leu Asn Glu Ser Val Tyr Ser

1550 1555 1560

Ser Tyr Leu Asp Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly His His Asn Thr

1565 1570 1575

Ser Asn Phe Met Asn Leu Phe Leu Asp Asn Ile Ser Phe Trp Lys

1580 1585 1590

Leu Phe Gly Phe Glu Asn Ile Asn Phe Val Ile Asp Lys Tyr Phe

1595 1600 1605

Thr Leu Val Gly Lys Thr Asn Leu Gly Tyr Val Glu Phe Ile Cys

1610 1615 1620

Asp Asn Asn Lys Asn Ile Asp Ile Tyr Phe Gly Glu Trp Lys Thr

1625 1630 1635

Ser Ser Ser Lys Ser Thr Ile Phe Ser Gly Asn Gly Arg Asn Val

1640 1645 1650

Val Val Glu Pro Ile Tyr Asn Pro Asp Thr Gly Glu Asp Ile Ser

1655 1660 1665

Thr Ser Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Pro Leu Tyr Gly Ile Asp Arg

1670 1675 1680

Tyr Ile Asn Lys Val Leu Ile Ala Pro Asp Leu Tyr Thr Ser Leu

1685 1690 1695

Ile Asn Ile Asn Thr Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Tyr Tyr Pro Glu

1700 1705 1710

Ile Ile Val Leu Asn Pro Asn Thr Phe His Lys Lys Val Asn Ile

1715 1720 1725

Asn Leu Asp Ser Ser Ser Phe Glu Tyr Lys Trp Ser Thr Glu Gly

1730 1735 1740

Ser Asp Phe Ile Leu Val Arg Tyr Leu Glu Glu Ser Asn Lys Lys

1745 1750 1755

Ile Leu Gln Lys Ile Arg Ile Lys Gly Ile Leu Ser Asn Thr Gln

1760 1765 1770

Ser Phe Asn Lys Met Ser Ile Asp Phe Lys Asp Ile Lys Lys Leu

1775 1780 1785

Ser Leu Gly Tyr Ile Met Ser Asn Phe Lys Ser Phe Asn Ser Glu

1790 1795 1800

Asn Glu Leu Asp Arg Asp His Leu Gly Phe Lys Ile Ile Asp Asn

1805 1810 1815

Lys Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu

1820 1825 1830

Ile Asn Ile Asn Asn Ser Leu Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Phe

1835 1840 1845

Asn Leu Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr

1850 1855 1860

Phe Asp Ile Asn Thr Gly Ala Ala Leu Ile Ser Tyr Lys Ile Ile

1865 1870 1875

Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asp Gly Val Met Gln Leu

1880 1885 1890

Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

1895 1900 1905

Asn Thr Gln Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln

1910 1915 1920

Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

1925 1930 1935

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Glu Lys

1940 1945 1950

Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Val Gly Leu Gln

1955 1960 1965

Val Ile Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala Ile

1970 1975 1980

Ile Ser Lys Gly Trp Gln Thr Val Asn Gly Ser Arg Tyr Tyr Phe

1985 1990 1995

Asp Thr Asp Thr Ala Ile Ala Phe Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp

2000 2005 2010

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asp Ser Asp Cys Val Val Lys Ile Gly

2015 2020 2025

Val Phe Ser Thr Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2030 2035 2040

Thr Tyr Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Ser

2045 2050 2055

Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn

2060 2065 2070

Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr

2090 2095 2100

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala

2105 2110 2115

Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn

2120 2125 2130

Thr Asn Thr Ala Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Asn Gly

2135 2140 2145

Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val

2150 2155 2160

Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr

2165 2170 2175

Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Glu

2180 2185 2190

Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser

2195 2200 2205

Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Lys Lys Tyr Tyr

2210 2215 2220

Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Ile His Leu Cys Thr Ile

2225 2230 2235

Asn Asn Asp Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Asp Gly Ile Leu Gln Asn

2240 2245 2250

Gly Tyr Ile Thr Ile Glu Arg Asn Asn Phe Tyr Phe Asp Ala Asn

2255 2260 2265

Asn Glu Ser Lys Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly

2270 2275 2280

Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu

2285 2290 2295

Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly

2300 2305 2310

Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp

2315 2320 2325

Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala

2330 2335 2340

Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr

2345 2350 2355

Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

2360 2365 2370

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe Ile Ala Ser

2375 2380 2385

Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr

2390 2395 2400

Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe

2405 2410 2415

Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly

2420 2425 2430

Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

2435 2440 2445

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg

2450 2455 2460

Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val

2465 2470 2475

Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe

2480 2485 2490

Asn Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser

2495 2500 2505

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly

2510 2515 2520

Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2525 2530 2535

Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn

2540 2545 2550

Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn

2555 2560 2565

Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr

2570 2575 2580

Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr

2585 2590 2595

Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile

2600 2605 2610

Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

2615 2620 2625

Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln

2630 2635 2640

Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn

2645 2650 2655

Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Val

2660 2665 2670

Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

2675 2680 2685

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val

2690 2695 2700

Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

2705 2710

<210> 5

<211> 2366

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность: TcdB (мутации

D286A D288A)

<400> 5

Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gln Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg

1 5 10 15

Phe Arg Thr Gln Glu Asp Glu Tyr Val Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu

20 25 30

Glu Tyr His Asn Met Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Lys Tyr Leu Lys

35 40 45

Leu Lys Asp Ile Asn Ser Leu Thr Asp Ile Tyr Ile Asp Thr Tyr Lys

50 55 60

Lys Ser Gly Arg Asn Lys Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Val

65 70 75 80

Thr Glu Val Leu Glu Leu Lys Asn Asn Asn Leu Thr Pro Val Glu Lys

85 90 95

Asn Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Gln Ile Asn Asp Thr Ala Ile

100 105 110

Asn Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Val Asn Ser Asp Tyr Asn Val Asn

115 120 125

Val Phe Tyr Asp Ser Asn Ala Phe Leu Ile Asn Thr Leu Lys Lys Thr

130 135 140

Val Val Glu Ser Ala Ile Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn

145 150 155 160

Leu Asn Asp Pro Arg Phe Asp Tyr Asn Lys Phe Phe Arg Lys Arg Met

165 170 175

Glu Ile Ile Tyr Asp Lys Gln Lys Asn Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ala

180 185 190

Gln Arg Glu Glu Asn Pro Glu Leu Ile Ile Asp Asp Ile Val Lys Thr

195 200 205

Tyr Leu Ser Asn Glu Tyr Ser Lys Glu Ile Asp Glu Leu Asn Thr Tyr

210 215 220

Ile Glu Glu Ser Leu Asn Lys Ile Thr Gln Asn Ser Gly Asn Asp Val

225 230 235 240

Arg Asn Phe Glu Glu Phe Lys Asn Gly Glu Ser Phe Asn Leu Tyr Glu

245 250 255

Gln Glu Leu Val Glu Arg Trp Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Leu

260 265 270

Arg Ile Ser Ala Leu Lys Glu Ile Gly Gly Met Tyr Leu Ala Val Ala

275 280 285

Met Leu Pro Gly Ile Gln Pro Asp Leu Phe Glu Ser Ile Glu Lys Pro

290 295 300

Ser Ser Val Thr Val Asp Phe Trp Glu Met Thr Lys Leu Glu Ala Ile

305 310 315 320

Met Lys Tyr Lys Glu Tyr Ile Pro Glu Tyr Thr Ser Glu His Phe Asp

325 330 335

Met Leu Asp Glu Glu Val Gln Ser Ser Phe Glu Ser Val Leu Ala Ser

340 345 350

Lys Ser Asp Lys Ser Glu Ile Phe Ser Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala

355 360 365

Ser Pro Leu Glu Val Lys Ile Ala Phe Asn Ser Lys Gly Ile Ile Asn

370 375 380

Gln Gly Leu Ile Ser Val Lys Asp Ser Tyr Cys Ser Asn Leu Ile Val

385 390 395 400

Lys Gln Ile Glu Asn Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Asn Ser Leu Asn Pro

405 410 415

Ala Ile Ser Glu Asp Asn Asp Phe Asn Thr Thr Thr Asn Thr Phe Ile

420 425 430

Asp Ser Ile Met Ala Glu Ala Asn Ala Asp Asn Gly Arg Phe Met Met

435 440 445

Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Arg Val Gly Phe Phe Pro Asp Val Lys Thr

450 455 460

Thr Ile Asn Leu Ser Gly Pro Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Tyr Gln Asp

465 470 475 480

Leu Leu Met Phe Lys Glu Gly Ser Met Asn Ile His Leu Ile Glu Ala

485 490 495

Asp Leu Arg Asn Phe Glu Ile Ser Lys Thr Asn Ile Ser Gln Ser Thr

500 505 510

Glu Gln Glu Met Ala Ser Leu Trp Ser Phe Asp Asp Ala Arg Ala Lys

515 520 525

Ala Gln Phe Glu Glu Tyr Lys Arg Asn Tyr Phe Glu Gly Ser Leu Gly

530 535 540

Glu Asp Asp Asn Leu Asp Phe Ser Gln Asn Ile Val Val Asp Lys Glu

545 550 555 560

Tyr Leu Leu Glu Lys Ile Ser Ser Leu Ala Arg Ser Ser Glu Arg Gly

565 570 575

Tyr Ile His Tyr Ile Val Gln Leu Gln Gly Asp Lys Ile Ser Tyr Glu

580 585 590

Ala Ala Cys Asn Leu Phe Ala Lys Thr Pro Tyr Asp Ser Val Leu Phe

595 600 605

Gln Lys Asn Ile Glu Asp Ser Glu Ile Ala Tyr Tyr Tyr Asn Pro Gly

610 615 620

Asp Gly Glu Ile Gln Glu Ile Asp Lys Tyr Lys Ile Pro Ser Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asp Arg Pro Lys Ile Lys Leu Thr Phe Ile Gly His Gly Lys Asp

645 650 655

Glu Phe Asn Thr Asp Ile Phe Ala Gly Phe Asp Val Asp Ser Leu Ser

660 665 670

Thr Glu Ile Glu Ala Ala Ile Asp Leu Ala Lys Glu Asp Ile Ser Pro

675 680 685

Lys Ser Ile Glu Ile Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser Tyr Ser

690 695 700

Ile Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Lys Val Lys

705 710 715 720

Asp Lys Ile Ser Glu Leu Met Pro Ser Ile Ser Gln Asp Ser Ile Ile

725 730 735

Val Ser Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly Arg Arg

740 745 750

Glu Leu Leu Asp His Ser Gly Glu Trp Ile Asn Lys Glu Glu Ser Ile

755 760 765

Ile Lys Asp Ile Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Ser Phe Asn Pro Lys Glu

770 775 780

Asn Lys Ile Thr Val Lys Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Ser Thr Leu

785 790 795 800

Leu Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asp Ile Glu Leu Glu

805 810 815

Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Cys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn Ile

820 825 830

Asp Thr Gln Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Glu Ala Lys Asn Leu Thr

835 840 845

Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asp Glu Phe Lys Leu Ile Glu Ser

850 855 860

Ile Ser Asp Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gln Gln Asn Glu Leu Glu Asp

865 870 875 880

Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Glu Thr Asp Glu Gly Phe

885 890 895

Ser Ile Arg Phe Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu Ser Ile Phe Val Glu

900 905 910

Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn His Ile Thr Glu Glu

915 920 925

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr Val Asn Gly Lys Leu

930 935 940

Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu Val Asn Thr Leu Asn

945 950 955 960

Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr Asn Ser Ser Lys Glu

965 970 975

Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys Val Gln Val Tyr Ala Gln

980 985 990

Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Thr Asp Ala Ala Lys Val Val

995 1000 1005

Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro

1010 1015 1020

Thr Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly

1025 1030 1035

Val Ser Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp

1040 1045 1050

Pro Leu Leu Arg Gln Glu Ile Glu Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala

1055 1060 1065

Val Asn Leu Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ile Ile Thr Ser Ser Leu

1070 1075 1080

Gly Ile Ala Ser Gly Phe Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly

1085 1090 1095

Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Val Leu

1100 1105 1110

Arg Asp Lys Ala Thr Lys Val Val Asp Tyr Phe Lys His Val Ser

1115 1120 1125

Leu Val Glu Thr Glu Gly Val Phe Thr Leu Leu Asp Asp Lys Ile

1130 1135 1140

Met Met Pro Gln Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp Phe Asn

1145 1150 1155

Asn Asn Ser Ile Val Leu Gly Lys Cys Glu Ile Trp Arg Met Glu

1160 1165 1170

Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Asp Asp Ile Asp His Phe Phe

1175 1180 1185

Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Glu Pro His Leu Ser Ile Tyr

1190 1195 1200

Asp Val Leu Glu Val Gln Lys Glu Glu Leu Asp Leu Ser Lys Asp

1205 1210 1215

Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro Asn Arg Val Phe Ala Trp Glu

1220 1225 1230

Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp Gly Thr

1235 1240 1245

Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr

1250 1255 1260

Trp Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu

1265 1270 1275

Lys Pro Arg Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Arg Ile Asn Leu Asp Ser

1280 1285 1290

Asn Thr Arg Ser Phe Ile Val Pro Ile Ile Thr Thr Glu Tyr Ile

1295 1300 1305

Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr

1310 1315 1320

Ala Leu Ser Leu Ser Gln Tyr Asn Met Gly Ile Asn Ile Glu Leu

1325 1330 1335

Ser Glu Ser Asp Val Trp Ile Ile Asp Val Asp Asn Val Val Arg

1340 1345 1350

Asp Val Thr Ile Glu Ser Asp Lys Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ile

1355 1360 1365

Glu Gly Ile Leu Ser Thr Leu Ser Ile Glu Glu Asn Lys Ile Ile

1370 1375 1380

Leu Asn Ser His Glu Ile Asn Phe Ser Gly Glu Val Asn Gly Ser

1385 1390 1395

Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe Ser Ile Leu Glu Gly Ile Asn

1400 1405 1410

Ala Ile Ile Glu Val Asp Leu Leu Ser Lys Ser Tyr Lys Leu Leu

1415 1420 1425

Ile Ser Gly Glu Leu Lys Ile Leu Met Leu Asn Ser Asn His Ile

1430 1435 1440

Gln Gln Lys Ile Asp Tyr Ile Gly Phe Asn Ser Glu Leu Gln Lys

1445 1450 1455

Asn Ile Pro Tyr Ser Phe Val Asp Ser Glu Gly Lys Glu Asn Gly

1460 1465 1470

Phe Ile Asn Gly Ser Thr Lys Glu Gly Leu Phe Val Ser Glu Leu

1475 1480 1485

Pro Asp Val Val Leu Ile Ser Lys Val Tyr Met Asp Asp Ser Lys

1490 1495 1500

Pro Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn Asn Leu Lys Asp Val Lys Val

1505 1510 1515

Ile Thr Lys Asp Asn Val Asn Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys

1520 1525 1530

Asp Asp Ile Lys Ile Ser Leu Ser Leu Thr Leu Gln Asp Glu Lys

1535 1540 1545

Thr Ile Lys Leu Asn Ser Val His Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala

1550 1555 1560

Glu Ile Leu Lys Phe Met Asn Arg Lys Gly Asn Thr Asn Thr Ser

1565 1570 1575

Asp Ser Leu Met Ser Phe Leu Glu Ser Met Asn Ile Lys Ser Ile

1580 1585 1590

Phe Val Asn Phe Leu Gln Ser Asn Ile Lys Phe Ile Leu Asp Ala

1595 1600 1605

Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe

1610 1615 1620

Ile Cys Asp Glu Asn Asp Asn Ile Gln Pro Tyr Phe Ile Lys Phe

1625 1630 1635

Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Val Gly Asn Arg Gln

1640 1645 1650

Asn Met Ile Val Glu Pro Asn Tyr Asp Leu Asp Asp Ser Gly Asp

1655 1660 1665

Ile Ser Ser Thr Val Ile Asn Phe Ser Gln Lys Tyr Leu Tyr Gly

1670 1675 1680

Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val Val Ile Ser Pro Asn Ile Tyr

1685 1690 1695

Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro Val Tyr Glu Thr Asn Asn Thr

1700 1705 1710

Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp Ala Asn Tyr Ile Asn Glu Lys

1715 1720 1725

Ile Asn Val Asn Ile Asn Asp Leu Ser Ile Arg Tyr Val Trp Ser

1730 1735 1740

Asn Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn

1745 1750 1755

Lys Val Ser Gln Val Lys Ile Arg Phe Val Asn Val Phe Lys Asp

1760 1765 1770

Lys Thr Leu Ala Asn Lys Leu Ser Phe Asn Phe Ser Asp Lys Gln

1775 1780 1785

Asp Val Pro Val Ser Glu Ile Ile Leu Ser Phe Thr Pro Ser Tyr

1790 1795 1800

Tyr Glu Asp Gly Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Gly Leu Val Ser Leu

1805 1810 1815

Tyr Asn Glu Lys Phe Tyr Ile Asn Asn Phe Gly Met Met Val Ser

1820 1825 1830

Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro

1835 1840 1845

Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp Lys

1850 1855 1860

Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

1865 1870 1875

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val

1880 1885 1890

Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe

1895 1900 1905

Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile

1910 1915 1920

Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe

1925 1930 1935

Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly

1940 1945 1950

Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly

1955 1960 1965

Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly

1970 1975 1980

Val Met Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr

1985 1990 1995

Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp

2000 2005 2010

Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly

2015 2020 2025

Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn

2030 2035 2040

Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly

2045 2050 2055

Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe

2060 2065 2070

Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu

2090 2095 2100

Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

2105 2110 2115

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp

2120 2125 2130

Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr

2135 2140 2145

Phe Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp

2150 2155 2160

Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn

2165 2170 2175

Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg

2180 2185 2190

Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu

2195 2200 2205

Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr

2210 2215 2220

Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile

2225 2230 2235

Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr

2240 2245 2250

Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn

2255 2260 2265

Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe

2270 2275 2280

Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr

2285 2290 2295

Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu

2300 2305 2310

Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu

2315 2320 2325

Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr

2330 2335 2340

Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

2345 2350 2355

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

2360 2365

<210> 6

<211> 2366

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность: TcdB (мутации

D286A D288A C698A)

<400> 6

Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gln Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg

1 5 10 15

Phe Arg Thr Gln Glu Asp Glu Tyr Val Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu

20 25 30

Glu Tyr His Asn Met Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Lys Tyr Leu Lys

35 40 45

Leu Lys Asp Ile Asn Ser Leu Thr Asp Ile Tyr Ile Asp Thr Tyr Lys

50 55 60

Lys Ser Gly Arg Asn Lys Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Val

65 70 75 80

Thr Glu Val Leu Glu Leu Lys Asn Asn Asn Leu Thr Pro Val Glu Lys

85 90 95

Asn Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Gln Ile Asn Asp Thr Ala Ile

100 105 110

Asn Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Val Asn Ser Asp Tyr Asn Val Asn

115 120 125

Val Phe Tyr Asp Ser Asn Ala Phe Leu Ile Asn Thr Leu Lys Lys Thr

130 135 140

Val Val Glu Ser Ala Ile Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn

145 150 155 160

Leu Asn Asp Pro Arg Phe Asp Tyr Asn Lys Phe Phe Arg Lys Arg Met

165 170 175

Glu Ile Ile Tyr Asp Lys Gln Lys Asn Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ala

180 185 190

Gln Arg Glu Glu Asn Pro Glu Leu Ile Ile Asp Asp Ile Val Lys Thr

195 200 205

Tyr Leu Ser Asn Glu Tyr Ser Lys Glu Ile Asp Glu Leu Asn Thr Tyr

210 215 220

Ile Glu Glu Ser Leu Asn Lys Ile Thr Gln Asn Ser Gly Asn Asp Val

225 230 235 240

Arg Asn Phe Glu Glu Phe Lys Asn Gly Glu Ser Phe Asn Leu Tyr Glu

245 250 255

Gln Glu Leu Val Glu Arg Trp Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Leu

260 265 270

Arg Ile Ser Ala Leu Lys Glu Ile Gly Gly Met Tyr Leu Ala Val Ala

275 280 285

Met Leu Pro Gly Ile Gln Pro Asp Leu Phe Glu Ser Ile Glu Lys Pro

290 295 300

Ser Ser Val Thr Val Asp Phe Trp Glu Met Thr Lys Leu Glu Ala Ile

305 310 315 320

Met Lys Tyr Lys Glu Tyr Ile Pro Glu Tyr Thr Ser Glu His Phe Asp

325 330 335

Met Leu Asp Glu Glu Val Gln Ser Ser Phe Glu Ser Val Leu Ala Ser

340 345 350

Lys Ser Asp Lys Ser Glu Ile Phe Ser Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala

355 360 365

Ser Pro Leu Glu Val Lys Ile Ala Phe Asn Ser Lys Gly Ile Ile Asn

370 375 380

Gln Gly Leu Ile Ser Val Lys Asp Ser Tyr Cys Ser Asn Leu Ile Val

385 390 395 400

Lys Gln Ile Glu Asn Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Asn Ser Leu Asn Pro

405 410 415

Ala Ile Ser Glu Asp Asn Asp Phe Asn Thr Thr Thr Asn Thr Phe Ile

420 425 430

Asp Ser Ile Met Ala Glu Ala Asn Ala Asp Asn Gly Arg Phe Met Met

435 440 445

Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Arg Val Gly Phe Phe Pro Asp Val Lys Thr

450 455 460

Thr Ile Asn Leu Ser Gly Pro Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Tyr Gln Asp

465 470 475 480

Leu Leu Met Phe Lys Glu Gly Ser Met Asn Ile His Leu Ile Glu Ala

485 490 495

Asp Leu Arg Asn Phe Glu Ile Ser Lys Thr Asn Ile Ser Gln Ser Thr

500 505 510

Glu Gln Glu Met Ala Ser Leu Trp Ser Phe Asp Asp Ala Arg Ala Lys

515 520 525

Ala Gln Phe Glu Glu Tyr Lys Arg Asn Tyr Phe Glu Gly Ser Leu Gly

530 535 540

Glu Asp Asp Asn Leu Asp Phe Ser Gln Asn Ile Val Val Asp Lys Glu

545 550 555 560

Tyr Leu Leu Glu Lys Ile Ser Ser Leu Ala Arg Ser Ser Glu Arg Gly

565 570 575

Tyr Ile His Tyr Ile Val Gln Leu Gln Gly Asp Lys Ile Ser Tyr Glu

580 585 590

Ala Ala Cys Asn Leu Phe Ala Lys Thr Pro Tyr Asp Ser Val Leu Phe

595 600 605

Gln Lys Asn Ile Glu Asp Ser Glu Ile Ala Tyr Tyr Tyr Asn Pro Gly

610 615 620

Asp Gly Glu Ile Gln Glu Ile Asp Lys Tyr Lys Ile Pro Ser Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asp Arg Pro Lys Ile Lys Leu Thr Phe Ile Gly His Gly Lys Asp

645 650 655

Glu Phe Asn Thr Asp Ile Phe Ala Gly Phe Asp Val Asp Ser Leu Ser

660 665 670

Thr Glu Ile Glu Ala Ala Ile Asp Leu Ala Lys Glu Asp Ile Ser Pro

675 680 685

Lys Ser Ile Glu Ile Asn Leu Leu Gly Ala Asn Met Phe Ser Tyr Ser

690 695 700

Ile Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Lys Val Lys

705 710 715 720

Asp Lys Ile Ser Glu Leu Met Pro Ser Ile Ser Gln Asp Ser Ile Ile

725 730 735

Val Ser Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly Arg Arg

740 745 750

Glu Leu Leu Asp His Ser Gly Glu Trp Ile Asn Lys Glu Glu Ser Ile

755 760 765

Ile Lys Asp Ile Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Ser Phe Asn Pro Lys Glu

770 775 780

Asn Lys Ile Thr Val Lys Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Ser Thr Leu

785 790 795 800

Leu Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asp Ile Glu Leu Glu

805 810 815

Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Cys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn Ile

820 825 830

Asp Thr Gln Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Glu Ala Lys Asn Leu Thr

835 840 845

Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asp Glu Phe Lys Leu Ile Glu Ser

850 855 860

Ile Ser Asp Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gln Gln Asn Glu Leu Glu Asp

865 870 875 880

Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Glu Thr Asp Glu Gly Phe

885 890 895

Ser Ile Arg Phe Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu Ser Ile Phe Val Glu

900 905 910

Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn His Ile Thr Glu Glu

915 920 925

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr Val Asn Gly Lys Leu

930 935 940

Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu Val Asn Thr Leu Asn

945 950 955 960

Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr Asn Ser Ser Lys Glu

965 970 975

Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys Val Gln Val Tyr Ala Gln

980 985 990

Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Thr Asp Ala Ala Lys Val Val

995 1000 1005

Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro

1010 1015 1020

Thr Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly

1025 1030 1035

Val Ser Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp

1040 1045 1050

Pro Leu Leu Arg Gln Glu Ile Glu Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala

1055 1060 1065

Val Asn Leu Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ile Ile Thr Ser Ser Leu

1070 1075 1080

Gly Ile Ala Ser Gly Phe Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly

1085 1090 1095

Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Val Leu

1100 1105 1110

Arg Asp Lys Ala Thr Lys Val Val Asp Tyr Phe Lys His Val Ser

1115 1120 1125

Leu Val Glu Thr Glu Gly Val Phe Thr Leu Leu Asp Asp Lys Ile

1130 1135 1140

Met Met Pro Gln Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp Phe Asn

1145 1150 1155

Asn Asn Ser Ile Val Leu Gly Lys Cys Glu Ile Trp Arg Met Glu

1160 1165 1170

Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Asp Asp Ile Asp His Phe Phe

1175 1180 1185

Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Glu Pro His Leu Ser Ile Tyr

1190 1195 1200

Asp Val Leu Glu Val Gln Lys Glu Glu Leu Asp Leu Ser Lys Asp

1205 1210 1215

Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro Asn Arg Val Phe Ala Trp Glu

1220 1225 1230

Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp Gly Thr

1235 1240 1245

Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr

1250 1255 1260

Trp Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu

1265 1270 1275

Lys Pro Arg Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Arg Ile Asn Leu Asp Ser

1280 1285 1290

Asn Thr Arg Ser Phe Ile Val Pro Ile Ile Thr Thr Glu Tyr Ile

1295 1300 1305

Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr

1310 1315 1320

Ala Leu Ser Leu Ser Gln Tyr Asn Met Gly Ile Asn Ile Glu Leu

1325 1330 1335

Ser Glu Ser Asp Val Trp Ile Ile Asp Val Asp Asn Val Val Arg

1340 1345 1350

Asp Val Thr Ile Glu Ser Asp Lys Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ile

1355 1360 1365

Glu Gly Ile Leu Ser Thr Leu Ser Ile Glu Glu Asn Lys Ile Ile

1370 1375 1380

Leu Asn Ser His Glu Ile Asn Phe Ser Gly Glu Val Asn Gly Ser

1385 1390 1395

Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe Ser Ile Leu Glu Gly Ile Asn

1400 1405 1410

Ala Ile Ile Glu Val Asp Leu Leu Ser Lys Ser Tyr Lys Leu Leu

1415 1420 1425

Ile Ser Gly Glu Leu Lys Ile Leu Met Leu Asn Ser Asn His Ile

1430 1435 1440

Gln Gln Lys Ile Asp Tyr Ile Gly Phe Asn Ser Glu Leu Gln Lys

1445 1450 1455

Asn Ile Pro Tyr Ser Phe Val Asp Ser Glu Gly Lys Glu Asn Gly

1460 1465 1470

Phe Ile Asn Gly Ser Thr Lys Glu Gly Leu Phe Val Ser Glu Leu

1475 1480 1485

Pro Asp Val Val Leu Ile Ser Lys Val Tyr Met Asp Asp Ser Lys

1490 1495 1500

Pro Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn Asn Leu Lys Asp Val Lys Val

1505 1510 1515

Ile Thr Lys Asp Asn Val Asn Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys

1520 1525 1530

Asp Asp Ile Lys Ile Ser Leu Ser Leu Thr Leu Gln Asp Glu Lys

1535 1540 1545

Thr Ile Lys Leu Asn Ser Val His Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala

1550 1555 1560

Glu Ile Leu Lys Phe Met Asn Arg Lys Gly Asn Thr Asn Thr Ser

1565 1570 1575

Asp Ser Leu Met Ser Phe Leu Glu Ser Met Asn Ile Lys Ser Ile

1580 1585 1590

Phe Val Asn Phe Leu Gln Ser Asn Ile Lys Phe Ile Leu Asp Ala

1595 1600 1605

Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe

1610 1615 1620

Ile Cys Asp Glu Asn Asp Asn Ile Gln Pro Tyr Phe Ile Lys Phe

1625 1630 1635

Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Val Gly Asn Arg Gln

1640 1645 1650

Asn Met Ile Val Glu Pro Asn Tyr Asp Leu Asp Asp Ser Gly Asp

1655 1660 1665

Ile Ser Ser Thr Val Ile Asn Phe Ser Gln Lys Tyr Leu Tyr Gly

1670 1675 1680

Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val Val Ile Ser Pro Asn Ile Tyr

1685 1690 1695

Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro Val Tyr Glu Thr Asn Asn Thr

1700 1705 1710

Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp Ala Asn Tyr Ile Asn Glu Lys

1715 1720 1725

Ile Asn Val Asn Ile Asn Asp Leu Ser Ile Arg Tyr Val Trp Ser

1730 1735 1740

Asn Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn

1745 1750 1755

Lys Val Ser Gln Val Lys Ile Arg Phe Val Asn Val Phe Lys Asp

1760 1765 1770

Lys Thr Leu Ala Asn Lys Leu Ser Phe Asn Phe Ser Asp Lys Gln

1775 1780 1785

Asp Val Pro Val Ser Glu Ile Ile Leu Ser Phe Thr Pro Ser Tyr

1790 1795 1800

Tyr Glu Asp Gly Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Gly Leu Val Ser Leu

1805 1810 1815

Tyr Asn Glu Lys Phe Tyr Ile Asn Asn Phe Gly Met Met Val Ser

1820 1825 1830

Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro

1835 1840 1845

Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp Lys

1850 1855 1860

Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

1865 1870 1875

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val

1880 1885 1890

Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe

1895 1900 1905

Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile

1910 1915 1920

Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe

1925 1930 1935

Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly

1940 1945 1950

Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly

1955 1960 1965

Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly

1970 1975 1980

Val Met Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr

1985 1990 1995

Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp

2000 2005 2010

Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly

2015 2020 2025

Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn

2030 2035 2040

Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly

2045 2050 2055

Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe

2060 2065 2070

Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu

2090 2095 2100

Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

2105 2110 2115

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp

2120 2125 2130

Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr

2135 2140 2145

Phe Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp

2150 2155 2160

Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn

2165 2170 2175

Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg

2180 2185 2190

Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu

2195 2200 2205

Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr

2210 2215 2220

Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile

2225 2230 2235

Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr

2240 2245 2250

Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn

2255 2260 2265

Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe

2270 2275 2280

Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr

2285 2290 2295

Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu

2300 2305 2310

Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu

2315 2320 2325

Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr

2330 2335 2340

Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

2345 2350 2355

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

2360 2365

<210> 7

<211> 2710

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность: TcdA (мутации

D269A, R272A, D285A, D287A, E460A, R462A и C700A)

<400> 7

Met Ser Leu Ile Ser Lys Glu Glu Leu Ile Lys Leu Ala Tyr Ser Ile

1 5 10 15

Arg Pro Arg Glu Asn Glu Tyr Lys Thr Ile Leu Thr Asn Leu Asp Glu

20 25 30

Tyr Asn Lys Leu Thr Thr Asn Asn Asn Glu Asn Lys Tyr Leu Gln Leu

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asp Val Phe Met Asn Lys Tyr Lys Thr

50 55 60

Ser Ser Arg Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu Lys Lys Asp Ile Leu Lys

65 70 75 80

Glu Val Ile Leu Ile Lys Asn Ser Asn Thr Ser Pro Val Glu Lys Asn

85 90 95

Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Glu Val Ser Asp Ile Ala Leu Glu

100 105 110

Tyr Ile Lys Gln Trp Ala Asp Ile Asn Ala Glu Tyr Asn Ile Lys Leu

115 120 125

Trp Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Leu Val Asn Thr Leu Lys Lys Ala Ile

130 135 140

Val Glu Ser Ser Thr Thr Glu Ala Leu Gln Leu Leu Glu Glu Glu Ile

145 150 155 160

Gln Asn Pro Gln Phe Asp Asn Met Lys Phe Tyr Lys Lys Arg Met Glu

165 170 175

Phe Ile Tyr Asp Arg Gln Lys Arg Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ser Gln

180 185 190

Ile Asn Lys Pro Thr Val Pro Thr Ile Asp Asp Ile Ile Lys Ser His

195 200 205

Leu Val Ser Glu Tyr Asn Arg Asp Glu Thr Val Leu Glu Ser Tyr Arg

210 215 220

Thr Asn Ser Leu Arg Lys Ile Asn Ser Asn His Gly Ile Asp Ile Arg

225 230 235 240

Ala Asn Ser Leu Phe Thr Glu Gln Glu Leu Leu Asn Ile Tyr Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Leu Asn Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Val Ala

260 265 270

Leu Leu Ala Leu Lys Asn Phe Gly Gly Val Tyr Leu Ala Val Ala Met

275 280 285

Leu Pro Gly Ile His Ser Asp Leu Phe Lys Thr Ile Ser Arg Pro Ser

290 295 300

Ser Ile Gly Leu Asp Arg Trp Glu Met Ile Lys Leu Glu Ala Ile Met

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Tyr Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Asp Lys

325 330 335

Leu Asp Gln Gln Leu Lys Asp Asn Phe Lys Leu Ile Ile Glu Ser Lys

340 345 350

Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe Ser Lys Leu Glu Asn Leu Asn Val Ser

355 360 365

Asp Leu Glu Ile Lys Ile Ala Phe Ala Leu Gly Ser Val Ile Asn Gln

370 375 380

Ala Leu Ile Ser Lys Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Asn Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

Gln Val Lys Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Asn Gln His Leu Asn Pro Ala

405 410 415

Ile Glu Ser Asp Asn Asn Phe Thr Asp Thr Thr Lys Ile Phe His Asp

420 425 430

Ser Leu Phe Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asn Ser Met Phe Leu Thr Lys

435 440 445

Ile Ala Pro Tyr Leu Gln Val Gly Phe Met Pro Ala Ala Ala Ser Thr

450 455 460

Ile Ser Leu Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Ala Ser Ala Tyr Tyr Asp Phe

465 470 475 480

Ile Asn Leu Gln Glu Asn Thr Ile Glu Lys Thr Leu Lys Ala Ser Asp

485 490 495

Leu Ile Glu Phe Lys Phe Pro Glu Asn Asn Leu Ser Gln Leu Thr Glu

500 505 510

Gln Glu Ile Asn Ser Leu Trp Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ala Lys Tyr

515 520 525

Gln Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Tyr Thr Gly Gly Ser Leu Ser Glu

530 535 540

Asp Asn Gly Val Asp Phe Asn Lys Asn Thr Ala Leu Asp Lys Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Asn Asn Lys Ile Pro Ser Asn Asn Val Glu Glu Ala Gly Ser

565 570 575

Lys Asn Tyr Val His Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Gly Asp Asp Ile Ser

580 585 590

Tyr Glu Ala Thr Cys Asn Leu Phe Ser Lys Asn Pro Lys Asn Ser Ile

595 600 605

Ile Ile Gln Arg Asn Met Asn Glu Ser Ala Lys Ser Tyr Phe Leu Ser

610 615 620

Asp Asp Gly Glu Ser Ile Leu Glu Leu Asn Lys Tyr Arg Ile Pro Glu

625 630 635 640

Arg Leu Lys Asn Lys Glu Lys Val Lys Val Thr Phe Ile Gly His Gly

645 650 655

Lys Asp Glu Phe Asn Thr Ser Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Asp Ser

660 665 670

Leu Ser Asn Glu Ile Ser Ser Phe Leu Asp Thr Ile Lys Leu Asp Ile

675 680 685

Ser Pro Lys Asn Val Glu Val Asn Leu Leu Gly Ala Asn Met Phe Ser

690 695 700

Tyr Asp Phe Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Ser

705 710 715 720

Ile Met Asp Lys Ile Thr Ser Thr Leu Pro Asp Val Asn Lys Asn Ser

725 730 735

Ile Thr Ile Gly Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly

740 745 750

Arg Lys Glu Leu Leu Ala His Ser Gly Lys Trp Ile Asn Lys Glu Glu

755 760 765

Ala Ile Met Ser Asp Leu Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Phe Phe Asp Ser

770 775 780

Ile Asp Asn Lys Leu Lys Ala Lys Ser Lys Asn Ile Pro Gly Leu Ala

785 790 795 800

Ser Ile Ser Glu Asp Ile Lys Thr Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val Ser

805 810 815

Pro Asp Thr Lys Phe Ile Leu Asn Asn Leu Lys Leu Asn Ile Glu Ser

820 825 830

Ser Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Glu Lys Leu Glu Pro Val Lys Asn

835 840 845

Ile Ile His Asn Ser Ile Asp Asp Leu Ile Asp Glu Phe Asn Leu Leu

850 855 860

Glu Asn Val Ser Asp Glu Leu Tyr Glu Leu Lys Lys Leu Asn Asn Leu

865 870 875 880

Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Lys Asn Asn Ser

885 890 895

Thr Tyr Ser Val Arg Phe Ile Asn Lys Ser Asn Gly Glu Ser Val Tyr

900 905 910

Val Glu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Ser Lys Tyr Ser Glu His Ile Thr

915 920 925

Lys Glu Ile Ser Thr Ile Lys Asn Ser Ile Ile Thr Asp Val Asn Gly

930 935 940

Asn Leu Leu Asp Asn Ile Gln Leu Asp His Thr Ser Gln Val Asn Thr

945 950 955 960

Leu Asn Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Asp Tyr Ser Ser Asn

965 970 975

Lys Asp Val Leu Asn Asp Leu Ser Thr Ser Val Lys Val Gln Leu Tyr

980 985 990

Ala Gln Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Tyr Asp Ser Ile Gln

995 1000 1005

Leu Val Asn Leu Ile Ser Asn Ala Val Asn Asp Thr Ile Asn Val

1010 1015 1020

Leu Pro Thr Ile Thr Glu Gly Ile Pro Ile Val Ser Thr Ile Leu

1025 1030 1035

Asp Gly Ile Asn Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Leu Asp Glu

1040 1045 1050

His Asp Pro Leu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ala Lys Val Gly Val

1055 1060 1065

Leu Ala Ile Asn Met Ser Leu Ser Ile Ala Ala Thr Val Ala Ser

1070 1075 1080

Ile Val Gly Ile Gly Ala Glu Val Thr Ile Phe Leu Leu Pro Ile

1085 1090 1095

Ala Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu

1100 1105 1110

Ile Leu His Asp Lys Ala Thr Ser Val Val Asn Tyr Phe Asn His

1115 1120 1125

Leu Ser Glu Ser Lys Lys Tyr Gly Pro Leu Lys Thr Glu Asp Asp

1130 1135 1140

Lys Ile Leu Val Pro Ile Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp

1145 1150 1155

Phe Asn Asn Asn Ser Ile Lys Leu Gly Thr Cys Asn Ile Leu Ala

1160 1165 1170

Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Gly Asn Ile Asp His

1175 1180 1185

Phe Phe Ser Ser Pro Ser Ile Ser Ser His Ile Pro Ser Leu Ser

1190 1195 1200

Ile Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Glu Thr Glu Asn Leu Asp Phe Ser

1205 1210 1215

Lys Lys Ile Met Met Leu Pro Asn Ala Pro Ser Arg Val Phe Trp

1220 1225 1230

Trp Glu Thr Gly Ala Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp

1235 1240 1245

Gly Thr Arg Leu Leu Asp Ser Ile Arg Asp Leu Tyr Pro Gly Lys

1250 1255 1260

Phe Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala Phe Phe Asp Tyr Ala Ile Thr Thr

1265 1270 1275

Leu Lys Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Lys Ile Lys Leu Asp

1280 1285 1290

Lys Asp Thr Arg Asn Phe Ile Met Pro Thr Ile Thr Thr Asn Glu

1295 1300 1305

Ile Arg Asn Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Asp Gly Ala Gly Gly Thr

1310 1315 1320

Tyr Ser Leu Leu Leu Ser Ser Tyr Pro Ile Ser Thr Asn Ile Asn

1325 1330 1335

Leu Ser Lys Asp Asp Leu Trp Ile Phe Asn Ile Asp Asn Glu Val

1340 1345 1350

Arg Glu Ile Ser Ile Glu Asn Gly Thr Ile Lys Lys Gly Lys Leu

1355 1360 1365

Ile Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile Asp Ile Asn Lys Asn Lys Leu

1370 1375 1380

Ile Ile Gly Asn Gln Thr Ile Asp Phe Ser Gly Asp Ile Asp Asn

1385 1390 1395

Lys Asp Arg Tyr Ile Phe Leu Thr Cys Glu Leu Asp Asp Lys Ile

1400 1405 1410

Ser Leu Ile Ile Glu Ile Asn Leu Val Ala Lys Ser Tyr Ser Leu

1415 1420 1425

Leu Leu Ser Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Ile Ser Asn Leu Ser Asn

1430 1435 1440

Ile Ile Glu Lys Ile Asn Thr Leu Gly Leu Asp Ser Lys Asn Ile

1445 1450 1455

Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Glu Ser Asn Asn Lys Tyr Phe Gly Ala

1460 1465 1470

Ile Ser Lys Thr Ser Gln Lys Ser Ile Ile His Tyr Lys Lys Asp

1475 1480 1485

Ser Lys Asn Ile Leu Glu Phe Tyr Asn Asp Ser Thr Leu Glu Phe

1490 1495 1500

Asn Ser Lys Asp Phe Ile Ala Glu Asp Ile Asn Val Phe Met Lys

1505 1510 1515

Asp Asp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Lys Tyr Tyr Val Asp Asn Asn

1520 1525 1530

Thr Asp Lys Ser Ile Asp Phe Ser Ile Ser Leu Val Ser Lys Asn

1535 1540 1545

Gln Val Lys Val Asn Gly Leu Tyr Leu Asn Glu Ser Val Tyr Ser

1550 1555 1560

Ser Tyr Leu Asp Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly His His Asn Thr

1565 1570 1575

Ser Asn Phe Met Asn Leu Phe Leu Asp Asn Ile Ser Phe Trp Lys

1580 1585 1590

Leu Phe Gly Phe Glu Asn Ile Asn Phe Val Ile Asp Lys Tyr Phe

1595 1600 1605

Thr Leu Val Gly Lys Thr Asn Leu Gly Tyr Val Glu Phe Ile Cys

1610 1615 1620

Asp Asn Asn Lys Asn Ile Asp Ile Tyr Phe Gly Glu Trp Lys Thr

1625 1630 1635

Ser Ser Ser Lys Ser Thr Ile Phe Ser Gly Asn Gly Arg Asn Val

1640 1645 1650

Val Val Glu Pro Ile Tyr Asn Pro Asp Thr Gly Glu Asp Ile Ser

1655 1660 1665

Thr Ser Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Pro Leu Tyr Gly Ile Asp Arg

1670 1675 1680

Tyr Ile Asn Lys Val Leu Ile Ala Pro Asp Leu Tyr Thr Ser Leu

1685 1690 1695

Ile Asn Ile Asn Thr Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Tyr Tyr Pro Glu

1700 1705 1710

Ile Ile Val Leu Asn Pro Asn Thr Phe His Lys Lys Val Asn Ile

1715 1720 1725

Asn Leu Asp Ser Ser Ser Phe Glu Tyr Lys Trp Ser Thr Glu Gly

1730 1735 1740

Ser Asp Phe Ile Leu Val Arg Tyr Leu Glu Glu Ser Asn Lys Lys

1745 1750 1755

Ile Leu Gln Lys Ile Arg Ile Lys Gly Ile Leu Ser Asn Thr Gln

1760 1765 1770

Ser Phe Asn Lys Met Ser Ile Asp Phe Lys Asp Ile Lys Lys Leu

1775 1780 1785

Ser Leu Gly Tyr Ile Met Ser Asn Phe Lys Ser Phe Asn Ser Glu

1790 1795 1800

Asn Glu Leu Asp Arg Asp His Leu Gly Phe Lys Ile Ile Asp Asn

1805 1810 1815

Lys Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu

1820 1825 1830

Ile Asn Ile Asn Asn Ser Leu Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Phe

1835 1840 1845

Asn Leu Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr

1850 1855 1860

Phe Asp Ile Asn Thr Gly Ala Ala Leu Ile Ser Tyr Lys Ile Ile

1865 1870 1875

Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asp Gly Val Met Gln Leu

1880 1885 1890

Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

1895 1900 1905

Asn Thr Gln Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln

1910 1915 1920

Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

1925 1930 1935

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Glu Lys

1940 1945 1950

Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Val Gly Leu Gln

1955 1960 1965

Val Ile Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala Ile

1970 1975 1980

Ile Ser Lys Gly Trp Gln Thr Val Asn Gly Ser Arg Tyr Tyr Phe

1985 1990 1995

Asp Thr Asp Thr Ala Ile Ala Phe Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp

2000 2005 2010

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asp Ser Asp Cys Val Val Lys Ile Gly

2015 2020 2025

Val Phe Ser Thr Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2030 2035 2040

Thr Tyr Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Ser

2045 2050 2055

Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn

2060 2065 2070

Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr

2090 2095 2100

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala

2105 2110 2115

Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn

2120 2125 2130

Thr Asn Thr Ala Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Asn Gly

2135 2140 2145

Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val

2150 2155 2160

Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr

2165 2170 2175

Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Glu

2180 2185 2190

Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser

2195 2200 2205

Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Lys Lys Tyr Tyr

2210 2215 2220

Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Ile His Leu Cys Thr Ile

2225 2230 2235

Asn Asn Asp Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Asp Gly Ile Leu Gln Asn

2240 2245 2250

Gly Tyr Ile Thr Ile Glu Arg Asn Asn Phe Tyr Phe Asp Ala Asn

2255 2260 2265

Asn Glu Ser Lys Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly

2270 2275 2280

Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu

2285 2290 2295

Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly

2300 2305 2310

Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp

2315 2320 2325

Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala

2330 2335 2340

Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr

2345 2350 2355

Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

2360 2365 2370

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe Ile Ala Ser

2375 2380 2385

Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr

2390 2395 2400

Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe

2405 2410 2415

Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly

2420 2425 2430

Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

2435 2440 2445

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg

2450 2455 2460

Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val

2465 2470 2475

Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe

2480 2485 2490

Asn Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser

2495 2500 2505

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly

2510 2515 2520

Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2525 2530 2535

Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn

2540 2545 2550

Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn

2555 2560 2565

Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr

2570 2575 2580

Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr

2585 2590 2595

Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile

2600 2605 2610

Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

2615 2620 2625

Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln

2630 2635 2640

Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn

2645 2650 2655

Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Val

2660 2665 2670

Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

2675 2680 2685

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val

2690 2695 2700

Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

2705 2710

<210> 8

<211> 2366

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая аминокислотная последовательность: TcdB (мутации

D270A, R273A, D286A, D288A, D461A, K463A и C698A)

<400> 8

Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gln Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg

1 5 10 15

Phe Arg Thr Gln Glu Asp Glu Tyr Val Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu

20 25 30

Glu Tyr His Asn Met Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Lys Tyr Leu Lys

35 40 45

Leu Lys Asp Ile Asn Ser Leu Thr Asp Ile Tyr Ile Asp Thr Tyr Lys

50 55 60

Lys Ser Gly Arg Asn Lys Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Val

65 70 75 80

Thr Glu Val Leu Glu Leu Lys Asn Asn Asn Leu Thr Pro Val Glu Lys

85 90 95

Asn Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Gln Ile Asn Asp Thr Ala Ile

100 105 110

Asn Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Val Asn Ser Asp Tyr Asn Val Asn

115 120 125

Val Phe Tyr Asp Ser Asn Ala Phe Leu Ile Asn Thr Leu Lys Lys Thr

130 135 140

Val Val Glu Ser Ala Ile Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn

145 150 155 160

Leu Asn Asp Pro Arg Phe Asp Tyr Asn Lys Phe Phe Arg Lys Arg Met

165 170 175

Glu Ile Ile Tyr Asp Lys Gln Lys Asn Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ala

180 185 190

Gln Arg Glu Glu Asn Pro Glu Leu Ile Ile Asp Asp Ile Val Lys Thr

195 200 205

Tyr Leu Ser Asn Glu Tyr Ser Lys Glu Ile Asp Glu Leu Asn Thr Tyr

210 215 220

Ile Glu Glu Ser Leu Asn Lys Ile Thr Gln Asn Ser Gly Asn Asp Val

225 230 235 240

Arg Asn Phe Glu Glu Phe Lys Asn Gly Glu Ser Phe Asn Leu Tyr Glu

245 250 255

Gln Glu Leu Val Glu Arg Trp Asn Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Leu

260 265 270

Ala Ile Ser Ala Leu Lys Glu Ile Gly Gly Met Tyr Leu Ala Val Ala

275 280 285

Met Leu Pro Gly Ile Gln Pro Asp Leu Phe Glu Ser Ile Glu Lys Pro

290 295 300

Ser Ser Val Thr Val Asp Phe Trp Glu Met Thr Lys Leu Glu Ala Ile

305 310 315 320

Met Lys Tyr Lys Glu Tyr Ile Pro Glu Tyr Thr Ser Glu His Phe Asp

325 330 335

Met Leu Asp Glu Glu Val Gln Ser Ser Phe Glu Ser Val Leu Ala Ser

340 345 350

Lys Ser Asp Lys Ser Glu Ile Phe Ser Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala

355 360 365

Ser Pro Leu Glu Val Lys Ile Ala Phe Asn Ser Lys Gly Ile Ile Asn

370 375 380

Gln Gly Leu Ile Ser Val Lys Asp Ser Tyr Cys Ser Asn Leu Ile Val

385 390 395 400

Lys Gln Ile Glu Asn Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Asn Ser Leu Asn Pro

405 410 415

Ala Ile Ser Glu Asp Asn Asp Phe Asn Thr Thr Thr Asn Thr Phe Ile

420 425 430

Asp Ser Ile Met Ala Glu Ala Asn Ala Asp Asn Gly Arg Phe Met Met

435 440 445

Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Arg Val Gly Phe Phe Pro Ala Val Ala Thr

450 455 460

Thr Ile Asn Leu Ser Gly Pro Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Tyr Gln Asp

465 470 475 480

Leu Leu Met Phe Lys Glu Gly Ser Met Asn Ile His Leu Ile Glu Ala

485 490 495

Asp Leu Arg Asn Phe Glu Ile Ser Lys Thr Asn Ile Ser Gln Ser Thr

500 505 510

Glu Gln Glu Met Ala Ser Leu Trp Ser Phe Asp Asp Ala Arg Ala Lys

515 520 525

Ala Gln Phe Glu Glu Tyr Lys Arg Asn Tyr Phe Glu Gly Ser Leu Gly

530 535 540

Glu Asp Asp Asn Leu Asp Phe Ser Gln Asn Ile Val Val Asp Lys Glu

545 550 555 560

Tyr Leu Leu Glu Lys Ile Ser Ser Leu Ala Arg Ser Ser Glu Arg Gly

565 570 575

Tyr Ile His Tyr Ile Val Gln Leu Gln Gly Asp Lys Ile Ser Tyr Glu

580 585 590

Ala Ala Cys Asn Leu Phe Ala Lys Thr Pro Tyr Asp Ser Val Leu Phe

595 600 605

Gln Lys Asn Ile Glu Asp Ser Glu Ile Ala Tyr Tyr Tyr Asn Pro Gly

610 615 620

Asp Gly Glu Ile Gln Glu Ile Asp Lys Tyr Lys Ile Pro Ser Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asp Arg Pro Lys Ile Lys Leu Thr Phe Ile Gly His Gly Lys Asp

645 650 655

Glu Phe Asn Thr Asp Ile Phe Ala Gly Phe Asp Val Asp Ser Leu Ser

660 665 670

Thr Glu Ile Glu Ala Ala Ile Asp Leu Ala Lys Glu Asp Ile Ser Pro

675 680 685

Lys Ser Ile Glu Ile Asn Leu Leu Gly Ala Asn Met Phe Ser Tyr Ser

690 695 700

Ile Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Lys Val Lys

705 710 715 720

Asp Lys Ile Ser Glu Leu Met Pro Ser Ile Ser Gln Asp Ser Ile Ile

725 730 735

Val Ser Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly Arg Arg

740 745 750

Glu Leu Leu Asp His Ser Gly Glu Trp Ile Asn Lys Glu Glu Ser Ile

755 760 765

Ile Lys Asp Ile Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Ser Phe Asn Pro Lys Glu

770 775 780

Asn Lys Ile Thr Val Lys Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Ser Thr Leu

785 790 795 800

Leu Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asp Ile Glu Leu Glu

805 810 815

Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Cys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn Ile

820 825 830

Asp Thr Gln Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Glu Ala Lys Asn Leu Thr

835 840 845

Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asp Glu Phe Lys Leu Ile Glu Ser

850 855 860

Ile Ser Asp Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gln Gln Asn Glu Leu Glu Asp

865 870 875 880

Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Glu Thr Asp Glu Gly Phe

885 890 895

Ser Ile Arg Phe Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu Ser Ile Phe Val Glu

900 905 910

Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn His Ile Thr Glu Glu

915 920 925

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr Val Asn Gly Lys Leu

930 935 940

Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu Val Asn Thr Leu Asn

945 950 955 960

Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr Asn Ser Ser Lys Glu

965 970 975

Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys Val Gln Val Tyr Ala Gln

980 985 990

Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Thr Asp Ala Ala Lys Val Val

995 1000 1005

Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro

1010 1015 1020

Thr Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly

1025 1030 1035

Val Ser Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp

1040 1045 1050

Pro Leu Leu Arg Gln Glu Ile Glu Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala

1055 1060 1065

Val Asn Leu Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ile Ile Thr Ser Ser Leu

1070 1075 1080

Gly Ile Ala Ser Gly Phe Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly

1085 1090 1095

Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Val Leu

1100 1105 1110

Arg Asp Lys Ala Thr Lys Val Val Asp Tyr Phe Lys His Val Ser

1115 1120 1125

Leu Val Glu Thr Glu Gly Val Phe Thr Leu Leu Asp Asp Lys Ile

1130 1135 1140

Met Met Pro Gln Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp Phe Asn

1145 1150 1155

Asn Asn Ser Ile Val Leu Gly Lys Cys Glu Ile Trp Arg Met Glu

1160 1165 1170

Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Asp Asp Ile Asp His Phe Phe

1175 1180 1185

Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Glu Pro His Leu Ser Ile Tyr

1190 1195 1200

Asp Val Leu Glu Val Gln Lys Glu Glu Leu Asp Leu Ser Lys Asp

1205 1210 1215

Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro Asn Arg Val Phe Ala Trp Glu

1220 1225 1230

Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp Gly Thr

1235 1240 1245

Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr

1250 1255 1260

Trp Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu

1265 1270 1275

Lys Pro Arg Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Arg Ile Asn Leu Asp Ser

1280 1285 1290

Asn Thr Arg Ser Phe Ile Val Pro Ile Ile Thr Thr Glu Tyr Ile

1295 1300 1305

Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr

1310 1315 1320

Ala Leu Ser Leu Ser Gln Tyr Asn Met Gly Ile Asn Ile Glu Leu

1325 1330 1335

Ser Glu Ser Asp Val Trp Ile Ile Asp Val Asp Asn Val Val Arg

1340 1345 1350

Asp Val Thr Ile Glu Ser Asp Lys Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ile

1355 1360 1365

Glu Gly Ile Leu Ser Thr Leu Ser Ile Glu Glu Asn Lys Ile Ile

1370 1375 1380

Leu Asn Ser His Glu Ile Asn Phe Ser Gly Glu Val Asn Gly Ser

1385 1390 1395

Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe Ser Ile Leu Glu Gly Ile Asn

1400 1405 1410

Ala Ile Ile Glu Val Asp Leu Leu Ser Lys Ser Tyr Lys Leu Leu

1415 1420 1425

Ile Ser Gly Glu Leu Lys Ile Leu Met Leu Asn Ser Asn His Ile

1430 1435 1440

Gln Gln Lys Ile Asp Tyr Ile Gly Phe Asn Ser Glu Leu Gln Lys

1445 1450 1455

Asn Ile Pro Tyr Ser Phe Val Asp Ser Glu Gly Lys Glu Asn Gly

1460 1465 1470

Phe Ile Asn Gly Ser Thr Lys Glu Gly Leu Phe Val Ser Glu Leu

1475 1480 1485

Pro Asp Val Val Leu Ile Ser Lys Val Tyr Met Asp Asp Ser Lys

1490 1495 1500

Pro Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn Asn Leu Lys Asp Val Lys Val

1505 1510 1515

Ile Thr Lys Asp Asn Val Asn Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys

1520 1525 1530

Asp Asp Ile Lys Ile Ser Leu Ser Leu Thr Leu Gln Asp Glu Lys

1535 1540 1545

Thr Ile Lys Leu Asn Ser Val His Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala

1550 1555 1560

Glu Ile Leu Lys Phe Met Asn Arg Lys Gly Asn Thr Asn Thr Ser

1565 1570 1575

Asp Ser Leu Met Ser Phe Leu Glu Ser Met Asn Ile Lys Ser Ile

1580 1585 1590

Phe Val Asn Phe Leu Gln Ser Asn Ile Lys Phe Ile Leu Asp Ala

1595 1600 1605

Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe

1610 1615 1620

Ile Cys Asp Glu Asn Asp Asn Ile Gln Pro Tyr Phe Ile Lys Phe

1625 1630 1635

Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Val Gly Asn Arg Gln

1640 1645 1650

Asn Met Ile Val Glu Pro Asn Tyr Asp Leu Asp Asp Ser Gly Asp

1655 1660 1665

Ile Ser Ser Thr Val Ile Asn Phe Ser Gln Lys Tyr Leu Tyr Gly

1670 1675 1680

Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val Val Ile Ser Pro Asn Ile Tyr

1685 1690 1695

Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro Val Tyr Glu Thr Asn Asn Thr

1700 1705 1710

Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp Ala Asn Tyr Ile Asn Glu Lys

1715 1720 1725

Ile Asn Val Asn Ile Asn Asp Leu Ser Ile Arg Tyr Val Trp Ser

1730 1735 1740

Asn Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn

1745 1750 1755

Lys Val Ser Gln Val Lys Ile Arg Phe Val Asn Val Phe Lys Asp

1760 1765 1770

Lys Thr Leu Ala Asn Lys Leu Ser Phe Asn Phe Ser Asp Lys Gln

1775 1780 1785

Asp Val Pro Val Ser Glu Ile Ile Leu Ser Phe Thr Pro Ser Tyr

1790 1795 1800

Tyr Glu Asp Gly Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Gly Leu Val Ser Leu

1805 1810 1815

Tyr Asn Glu Lys Phe Tyr Ile Asn Asn Phe Gly Met Met Val Ser

1820 1825 1830

Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro

1835 1840 1845

Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp Lys

1850 1855 1860

Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu

1865 1870 1875

Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val

1880 1885 1890

Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe

1895 1900 1905

Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile

1910 1915 1920

Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe

1925 1930 1935

Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly

1940 1945 1950

Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly

1955 1960 1965

Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly

1970 1975 1980

Val Met Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr

1985 1990 1995

Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp

2000 2005 2010

Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly

2015 2020 2025

Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn

2030 2035 2040

Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly

2045 2050 2055

Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe

2060 2065 2070

Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu

2090 2095 2100

Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln

2105 2110 2115

Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp

2120 2125 2130

Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr

2135 2140 2145

Phe Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp

2150 2155 2160

Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn

2165 2170 2175

Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg

2180 2185 2190

Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu

2195 2200 2205

Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr

2210 2215 2220

Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile

2225 2230 2235

Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr

2240 2245 2250

Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn

2255 2260 2265

Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe

2270 2275 2280

Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr

2285 2290 2295

Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu

2300 2305 2310

Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu

2315 2320 2325

Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr

2330 2335 2340

Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

2345 2350 2355

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

2360 2365

<210> 9

<211> 8133

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<400> 9

atgtctttaa tatctaaaga agagttaata aaactcgcat atagcattag accaagagaa 60

aatgagtata aaactatact aactaattta gacgaatata ataagttaac tacaaacaat 120

aatgaaaata aatatttaca attaaaaaaa ctaaatgaat caattgatgt ttttatgaat 180

aaatataaaa cttcaagcag aaatagagca ctctctaatc taaaaaaaga tatattaaaa 240

gaagtaattc ttattaaaaa ttccaataca agccctgtag aaaaaaattt acattttgta 300

tggataggtg gagaagtcag tgatattgct cttgaataca taaaacaatg ggctgatatt 360

aatgcagaat ataatattaa actgtggtat gatagtgaag cattcttagt aaatacacta 420

aaaaaggcta tagttgaatc ttctaccact gaagcattac agctactaga ggaagagatt 480

caaaatcctc aatttgataa tatgaaattt tacaaaaaaa ggatggaatt tatatatgat 540

agacaaaaaa ggtttataaa ttattataaa tctcaaatca ataaacctac agtacctaca 600

atagatgata ttataaagtc tcatctagta tctgaatata atagagatga aactgtatta 660

gaatcatata gaacaaattc tttgagaaaa ataaatagta atcatgggat agatatcagg 720

gctaatagtt tgtttacaga acaagagtta ttaaatattt atagtcagga gttgttaaat 780

cgtggaaatt tagctgcagc atctgacata gtaagattat tagccctaaa aaattttggc 840

ggagtatatt tagatgttga tatgcttcca ggtattcact ctgatttatt taaaacaata 900

tctagaccta gctctattgg actagaccgt tgggaaatga taaaattaga ggctattatg 960

aagtataaaa aatatataaa taattataca tcagaaaact ttgataaact tgatcaacaa 1020

ttaaaagata attttaaact cattatagaa agtaaaagtg aaaaatctga gatattttct 1080

aaattagaaa atttaaatgt atctgatctt gaaattaaaa tagctttcgc tttaggcagt 1140

gttataaatc aagccttgat atcaaaacaa ggttcatatc ttactaacct agtaatagaa 1200

caagtaaaaa atagatatca atttttaaac caacacctta acccagccat agagtctgat 1260

aataacttca cagatactac taaaattttt catgattcat tatttaattc agctaccgca 1320

gaaaactcta tgtttttaac aaaaatagca ccatacttac aagtaggttt tatgccagaa 1380

gctcgctcca caataagttt aagtggtcca ggagcttatg cgtcagctta ctatgatttc 1440

ataaatttac aagaaaatac tatagaaaaa actttaaaag catcagattt aatagaattt 1500

aaattcccag aaaataatct atctcaattg acagaacaag aaataaatag tctatggagc 1560

tttgatcaag caagtgcaaa atatcaattt gagaaatatg taagagatta tactggtgga 1620

tctctttctg aagacaatgg ggtagacttt aataaaaata ctgccctcga caaaaactat 1680

ttattaaata ataaaattcc atcaaacaat gtagaagaag ctggaagtaa aaattatgtt 1740

cattatatca tacagttaca aggagatgat ataagttatg aagcaacatg caatttattt 1800

tctaaaaatc ctaaaaatag tattattata caacgaaata tgaatgaaag tgcaaaaagc 1860

tactttttaa gtgatgatgg agaatctatt ttagaattaa ataaatatag gatacctgaa 1920

agattaaaaa ataaggaaaa agtaaaagta acctttattg gacatggtaa agatgaattc 1980

aacacaagcg aatttgctag attaagtgta gattcacttt ccaatgagat aagttcattt 2040

ttagatacca taaaattaga tatatcacct aaaaatgtag aagtaaactt acttggatgt 2100

aatatgttta gttatgattt taatgttgaa gaaacttatc ctgggaagtt gctattaagt 2160

attatggaca aaattacttc cactttacct gatgtaaata aaaattctat tactatagga 2220

gcaaatcaat atgaagtaag aattaatagt gagggaagaa aagaacttct ggctcactca 2280

ggtaaatgga taaataaaga agaagctatt atgagcgatt tatctagtaa agaatacatt 2340

ttttttgatt ctatagataa taagctaaaa gcaaagtcca agaatattcc aggattagca 2400

tcaatatcag aagatataaa aacattatta cttgatgcaa gtgttagtcc tgatacaaaa 2460

tttattttaa ataatcttaa gcttaatatt gaatcttcta ttggtgatta catttattat 2520

gaaaaattag agcctgttaa aaatataatt cacaattcta tagatgattt aatagatgag 2580

ttcaatctac ttgaaaatgt atctgatgaa ttatatgaat taaaaaaatt aaataatcta 2640

gatgagaagt atttaatatc ttttgaagat atctcaaaaa ataattcaac ttactctgta 2700

agatttatta acaaaagtaa tggtgagtca gtttatgtag aaacagaaaa agaaattttt 2760

tcaaaatata gcgaacatat tacaaaagaa ataagtacta taaagaatag tataattaca 2820

gatgttaatg gtaatttatt ggataatata cagttagatc atacttctca agttaataca 2880

ttaaacgcag cattctttat tcaatcatta atagattata gtagcaataa agatgtactg 2940

aatgatttaa gtacctcagt taaggttcaa ctttatgctc aactatttag tacaggttta 3000

aatactatat atgactctat ccaattagta aatttaatat caaatgcagt aaatgatact 3060

ataaatgtac tacctacaat aacagagggg atacctattg tatctactat attagacgga 3120

ataaacttag gtgcagcaat taaggaatta ctagacgaac atgacccatt actaaaaaaa 3180

gaattagaag ctaaggtggg tgttttagca ataaatatgt cattatctat agctgcaact 3240

gtagcttcaa ttgttggaat aggtgctgaa gttactattt tcttattacc tatagctggt 3300

atatctgcag gaataccttc attagttaat aatgaattaa tattgcatga taaggcaact 3360

tcagtggtaa actattttaa tcatttgtct gaatctaaaa aatatggccc tcttaaaaca 3420

gaagatgata aaattttagt tcctattgat gatttagtaa tatcagaaat agattttaat 3480

aataattcga taaaactagg aacatgtaat atattagcaa tggagggggg atcaggacac 3540

acagtgactg gtaatataga tcactttttc tcatctccat ctataagttc tcatattcct 3600

tcattatcaa tttattctgc aataggtata gaaacagaaa atctagattt ttcaaaaaaa 3660

ataatgatgt tacctaatgc tccttcaaga gtgttttggt gggaaactgg agcagttcca 3720

ggtttaagat cattggaaaa tgacggaact agattacttg attcaataag agatttatac 3780

ccaggtaaat tttactggag attctatgct tttttcgatt atgcaataac tacattaaaa 3840

ccagtttatg aagacactaa tattaaaatt aaactagata aagatactag aaacttcata 3900

atgccaacta taactactaa cgaaattaga aacaaattat cttattcatt tgatggagca 3960

ggaggaactt actctttatt attatcttca tatccaatat caacgaatat aaatttatct 4020

aaagatgatt tatggatatt taatattgat aatgaagtaa gagaaatatc tatagaaaat 4080

ggtactatta aaaaaggaaa gttaataaaa gatgttttaa gtaaaattga tataaataaa 4140

aataaactta ttataggcaa tcaaacaata gatttttcag gcgatataga taataaagat 4200

agatatatat tcttgacttg tgagttagat gataaaatta gtttaataat agaaataaat 4260

cttgttgcaa aatcttatag tttgttattg tctggggata aaaattattt gatatccaat 4320

ttatctaata ttattgagaa aatcaatact ttaggcctag atagtaaaaa tatagcgtac 4380

aattacactg atgaatctaa taataaatat tttggagcta tatctaaaac aagtcaaaaa 4440

agcataatac attataaaaa agacagtaaa aatatattag aattttataa tgacagtaca 4500

ttagaattta acagtaaaga ttttattgct gaagatataa atgtatttat gaaagatgat 4560

attaatacta taacaggaaa atactatgtt gataataata ctgataaaag tatagatttc 4620

tctatttctt tagttagtaa aaatcaagta aaagtaaatg gattatattt aaatgaatcc 4680

gtatactcat cttaccttga ttttgtgaaa aattcagatg gacaccataa tacttctaat 4740

tttatgaatt tatttttgga caatataagt ttctggaaat tgtttgggtt tgaaaatata 4800

aattttgtaa tcgataaata ctttaccctt gttggtaaaa ctaatcttgg atatgtagaa 4860

tttatttgtg acaataataa aaatatagat atatattttg gtgaatggaa aacatcgtca 4920

tctaaaagca ctatatttag cggaaatggt agaaatgttg tagtagagcc tatatataat 4980

cctgatacgg gtgaagatat atctacttca ctagattttt cctatgaacc tctctatgga 5040

atagatagat atatcaataa agtattgata gcacctgatt tatatacaag tttaataaat 5100

attaatacca attattattc aaatgagtac taccctgaga ttatagttct taacccaaat 5160

acattccaca aaaaagtaaa tataaattta gatagttctt cttttgagta taaatggtct 5220

acagaaggaa gtgactttat tttagttaga tacttagaag aaagtaataa aaaaatatta 5280

caaaaaataa gaatcaaagg tatcttatct aatactcaat catttaataa aatgagtata 5340

gattttaaag atattaaaaa actatcatta ggatatataa tgagtaattt taaatcattt 5400

aattctgaaa atgaattaga tagagatcat ttaggattta aaataataga taataaaact 5460

tattactatg atgaagatag taaattagtt aaaggattaa tcaatataaa taattcatta 5520

ttctattttg atcctataga atttaactta gtaactggat ggcaaactat caatggtaaa 5580

aaatattatt ttgatataaa tactggagca gctttaatta gttataaaat tattaatggt 5640

aaacactttt attttaataa tgatggtgtg atgcagttgg gagtatttaa aggacctgat 5700

ggatttgaat attttgcacc tgccaatact caaaataata acatagaagg tcaggctata 5760

gtttatcaaa gtaaattctt aactttgaat ggcaaaaaat attattttga taatgactca 5820

aaagcagtca ctggatggag aattattaac aatgagaaat attactttaa tcctaataat 5880

gctattgctg cagtcggatt gcaagtaatt gacaataata agtattattt caatcctgac 5940

actgctatca tctcaaaagg ttggcagact gttaatggta gtagatacta ctttgatact 6000

gataccgcta ttgcctttaa tggttataaa actattgatg gtaaacactt ttattttgat 6060

agtgattgtg tagtgaaaat aggtgtgttt agtacctcta atggatttga atattttgca 6120

cctgctaata cttataataa taacatagaa ggtcaggcta tagtttatca aagtaaattc 6180

ttaactttga atggtaaaaa atattacttt gataataact caaaagcagt taccggatgg 6240

caaactattg atagtaaaaa atattacttt aatactaaca ctgctgaagc agctactgga 6300

tggcaaacta ttgatggtaa aaaatattac tttaatacta acactgctga agcagctact 6360

ggatggcaaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tatagcttca 6420

actggttata caattattaa tggtaaacat ttttatttta atactgatgg tattatgcag 6480

ataggagtgt ttaaaggacc taatggattt gaatattttg cacctgctaa tacggatgct 6540

aacaacatag aaggtcaagc tatactttac caaaatgaat tcttaacttt gaatggtaaa 6600

aaatattact ttggtagtga ctcaaaagca gttactggat ggagaattat taacaataag 6660

aaatattact ttaatcctaa taatgctatt gctgcaattc atctatgcac tataaataat 6720

gacaagtatt actttagtta tgatggaatt cttcaaaatg gatatattac tattgaaaga 6780

aataatttct attttgatgc taataatgaa tctaaaatgg taacaggagt atttaaagga 6840

cctaatggat ttgagtattt tgcacctgct aatactcaca ataataacat agaaggtcag 6900

gctatagttt accagaacaa attcttaact ttgaatggca aaaaatatta ttttgataat 6960

gactcaaaag cagttactgg atggcaaacc attgatggta aaaaatatta ctttaatctt 7020

aacactgctg aagcagctac tggatggcaa actattgatg gtaaaaaata ttactttaat 7080

cttaacactg ctgaagcagc tactggatgg caaactattg atggtaaaaa atattacttt 7140

aatactaaca ctttcatagc ctcaactggt tatacaagta ttaatggtaa acatttttat 7200

tttaatactg atggtattat gcagatagga gtgtttaaag gacctaatgg atttgaatac 7260

tttgcacctg ctaatactca taataataac atagaaggtc aagctatact ttaccaaaat 7320

aaattcttaa ctttgaatgg taaaaaatat tactttggta gtgactcaaa agcagttacc 7380

ggattgcgaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tgttgcagtt 7440

actggatggc aaactattaa tggtaaaaaa tactacttta atactaacac ttctatagct 7500

tcaactggtt atacaattat tagtggtaaa catttttatt ttaatactga tggtattatg 7560

cagataggag tgtttaaagg acctgatgga tttgaatact ttgcacctgc taatacagat 7620

gctaacaata tagaaggtca agctatacgt tatcaaaata gattcctata tttacatgac 7680

aatatatatt attttggtaa taattcaaaa gcagctactg gttgggtaac tattgatggt 7740

aatagatatt acttcgagcc taatacagct atgggtgcga atggttataa aactattgat 7800

aataaaaatt tttactttag aaatggttta cctcagatag gagtgtttaa agggtctaat 7860

ggatttgaat actttgcacc tgctaatacg gatgctaaca atatagaagg tcaagctata 7920

cgttatcaaa atagattcct acatttactt ggaaaaatat attactttgg taataattca 7980

aaagcagtta ctggatggca aactattaat ggtaaagtat attactttat gcctgatact 8040

gctatggctg cagctggtgg acttttcgag attgatggtg ttatatattt ctttggtgtt 8100

gatggagtaa aagcccctgg gatatatggc taa 8133

<210> 10

<211> 7101

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<400> 10

atgagtttag ttaatagaaa acagttagaa aaaatggcaa atgtaagatt tcgtactcaa 60

gaagatgaat atgttgcaat attggatgct ttagaagaat atcataatat gtcagagaat 120

actgtagtcg aaaaatattt aaaattaaaa gatataaata gtttaacaga tatttatata 180

gatacatata aaaaatctgg tagaaataaa gccttaaaaa aatttaagga atatctagtt 240

acagaagtat tagagctaaa gaataataat ttaactccag ttgagaaaaa tttacatttt 300

gtttggattg gaggtcaaat aaatgacact gctattaatt atataaatca atggaaagat 360

gtaaatagtg attataatgt taatgttttt tatgatagta atgcattttt gataaacaca 420

ttgaaaaaaa ctgtagtaga atcagcaata aatgatacac ttgaatcatt tagagaaaac 480

ttaaatgacc ctagatttga ctataataaa ttcttcagaa aacgtatgga aataatttat 540

gataaacaga aaaatttcat aaactactat aaagctcaaa gagaagaaaa tcctgaactt 600

ataattgatg atattgtaaa gacatatctt tcaaatgagt attcaaagga gatagatgaa 660

cttaatacct atattgaaga atccttaaat aaaattacac agaatagtgg aaatgatgtt 720

agaaactttg aagaatttaa aaatggagag tcattcaact tatatgaaca agagttggta 780

gaaaggtgga atttagctgc tgcttctgac atattaagaa tatctgcatt aaaagaaatt 840

ggtggtatgt atttagatgt tgatatgtta ccaggaatac aaccagactt atttgagtct 900

atagagaaac ctagttcagt aacagtggat ttttgggaaa tgacaaagtt agaagctata 960

atgaaataca aagaatatat accagaatat acctcagaac attttgacat gttagacgaa 1020

gaagttcaaa gtagttttga atctgttcta gcttctaagt cagataaatc agaaatattc 1080

tcatcacttg gtgatatgga ggcatcacca ctagaagtta aaattgcatt taatagtaag 1140

ggtattataa atcaagggct aatttctgtg aaagactcat attgtagcaa tttaatagta 1200

aaacaaatcg agaatagata taaaatattg aataatagtt taaatccagc tattagcgag 1260

gataatgatt ttaatactac aacgaatacc tttattgata gtataatggc tgaagctaat 1320

gcagataatg gtagatttat gatggaacta ggaaagtatt taagagttgg tttcttccca 1380

gatgttaaaa ctactattaa cttaagtggc cctgaagcat atgcggcagc ttatcaagat 1440

ttattaatgt ttaaagaagg cagtatgaat atccatttga tagaagctga tttaagaaac 1500

tttgaaatct ctaaaactaa tatttctcaa tcaactgaac aagaaatggc tagcttatgg 1560

tcatttgacg atgcaagagc taaagctcaa tttgaagaat ataaaaggaa ttattttgaa 1620

ggttctcttg gtgaagatga taatcttgat ttttctcaaa atatagtagt tgacaaggag 1680

tatcttttag aaaaaatatc ttcattagca agaagttcag agagaggata tatacactat 1740

attgttcagt tacaaggaga taaaattagt tatgaagcag catgtaactt atttgcaaag 1800

actccttatg atagtgtact gtttcagaaa aatatagaag attcagaaat tgcatattat 1860

tataatcctg gagatggtga aatacaagaa atagacaagt ataaaattcc aagtataatt 1920

tctgatagac ctaagattaa attaacattt attggtcatg gtaaagatga atttaatact 1980

gatatatttg caggttttga tgtagattca ttatccacag aaatagaagc agcaatagat 2040

ttagctaaag aggatatttc tcctaagtca atagaaataa atttattagg atgtaatatg 2100

tttagctact ctatcaacgt agaggagact tatcctggaa aattattact taaagttaaa 2160

gataaaatat cagaattaat gccatctata agtcaagact ctattatagt aagtgcaaat 2220

caatatgaag ttagaataaa tagtgaagga agaagagaat tattggatca ttctggtgaa 2280

tggataaata aagaagaaag tattataaag gatatttcat caaaagaata tatatcattt 2340

aatcctaaag aaaataaaat tacagtaaaa tctaaaaatt tacctgagct atctacatta 2400

ttacaagaaa ttagaaataa ttctaattca agtgatattg aactagaaga aaaagtaatg 2460

ttaacagaat gtgagataaa tgttatttca aatatagata cgcaaattgt tgaggaaagg 2520

attgaagaag ctaagaattt aacttctgac tctattaatt atataaaaga tgaatttaaa 2580

ctaatagaat ctatttctga tgcactatgt gacttaaaac aacagaatga attagaagat 2640

tctcatttta tatcttttga ggacatatca gagactgatg agggatttag tataagattt 2700

attaataaag aaactggaga atctatattt gtagaaactg aaaaaacaat attctctgaa 2760

tatgctaatc atataactga agagatttct aagataaaag gtactatatt tgatactgta 2820

aatggtaagt tagtaaaaaa agtaaattta gatactacac acgaagtaaa tactttaaat 2880

gctgcatttt ttatacaatc attaatagaa tataatagtt ctaaagaatc tcttagtaat 2940

ttaagtgtag caatgaaagt ccaagtttac gctcaattat ttagtactgg tttaaatact 3000

attacagatg cagccaaagt tgttgaatta gtatcaactg cattagatga aactatagac 3060

ttacttccta cattatctga aggattacct ataattgcaa ctattataga tggtgtaagt 3120

ttaggtgcag caatcaaaga gctaagtgaa acgagtgacc cattattaag acaagaaata 3180

gaagctaaga taggtataat ggcagtaaat ttaacaacag ctacaactgc aatcattact 3240

tcatctttgg ggatagctag tggatttagt atacttttag ttcctttagc aggaatttca 3300

gcaggtatac caagcttagt aaacaatgaa cttgtacttc gagataaggc aacaaaggtt 3360

gtagattatt ttaaacatgt ttcattagtt gaaactgaag gagtatttac tttattagat 3420

gataaaataa tgatgccaca agatgattta gtgatatcag aaatagattt taataataat 3480

tcaatagttt taggtaaatg tgaaatctgg agaatggaag gtggttcagg tcatactgta 3540

actgatgata tagatcactt cttttcagca ccatcaataa catatagaga gccacactta 3600

tctatatatg acgtattgga agtacaaaaa gaagaacttg atttgtcaaa agatttaatg 3660

gtattaccta atgctccaaa tagagtattt gcttgggaaa caggatggac accaggttta 3720

agaagcttag aaaatgatgg cacaaaactg ttagaccgta taagagataa ctatgaaggt 3780

gagttttatt ggagatattt tgcttttata gctgatgctt taataacaac attaaaacca 3840

agatatgaag atactaatat aagaataaat ttagatagta atactagaag ttttatagtt 3900

ccaataataa ctacagaata tataagagaa aaattatcat attctttcta tggttcagga 3960

ggaacttatg cattgtctct ttctcaatat aatatgggta taaatataga attaagtgaa 4020

agtgatgttt ggattataga tgttgataat gttgtgagag atgtaactat agaatctgat 4080

aaaattaaaa aaggtgattt aatagaaggt attttatcta cactaagtat tgaagagaat 4140

aaaattatct taaatagcca tgagattaat ttttctggtg aggtaaatgg aagtaatgga 4200

tttgtttctt taacattttc aattttagaa ggaataaatg caattataga agttgattta 4260

ttatctaaat catataaatt acttatttct ggcgaattaa aaatattgat gttaaattca 4320

aatcatattc aacagaaaat agattatata ggattcaata gcgaattaca gaaaaatata 4380

ccatatagct ttgtagatag tgaaggaaaa gagaatggtt ttattaatgg ttcaacaaaa 4440

gaaggtttat ttgtatctga attacctgat gtagttctta taagtaaggt ttatatggat 4500

gatagtaagc cttcatttgg atattatagt aataatttga aagatgtcaa agttataact 4560

aaagataatg ttaatatatt aacaggttat tatcttaagg atgatataaa aatctctctt 4620

tctttgactc tacaagatga aaaaactata aagttaaata gtgtgcattt agatgaaagt 4680

ggagtagctg agattttgaa gttcatgaat agaaaaggta atacaaatac ttcagattct 4740

ttaatgagct ttttagaaag tatgaatata aaaagtattt tcgttaattt cttacaatct 4800

aatattaagt ttatattaga tgctaatttt ataataagtg gtactacttc tattggccaa 4860

tttgagttta tttgtgatga aaatgataat atacaaccat atttcattaa gtttaataca 4920

ctagaaacta attatacttt atatgtagga aatagacaaa atatgatagt ggaaccaaat 4980

tatgatttag atgattctgg agatatatct tcaactgtta tcaatttctc tcaaaagtat 5040

ctttatggaa tagacagttg tgttaataaa gttgtaattt caccaaatat ttatacagat 5100

gaaataaata taacgcctgt atatgaaaca aataatactt atccagaagt tattgtatta 5160

gatgcaaatt atataaatga aaaaataaat gttaatatca atgatctatc tatacgatat 5220

gtatggagta atgatggtaa tgattttatt cttatgtcaa ctagtgaaga aaataaggtg 5280

tcacaagtta aaataagatt cgttaatgtt tttaaagata agactttggc aaataagcta 5340

tcttttaact ttagtgataa acaagatgta cctgtaagtg aaataatctt atcatttaca 5400

ccttcatatt atgaggatgg attgattggc tatgatttgg gtctagtttc tttatataat 5460

gagaaatttt atattaataa ctttggaatg atggtatctg gattaatata tattaatgat 5520

tcattatatt attttaaacc accagtaaat aatttgataa ctggatttgt gactgtaggc 5580

gatgataaat actactttaa tccaattaat ggtggagctg cttcaattgg agagacaata 5640

attgatgaca aaaattatta tttcaaccaa agtggagtgt tacaaacagg tgtatttagt 5700

acagaagatg gatttaaata ttttgcccca gctaatacac ttgatgaaaa cctagaagga 5760

gaagcaattg attttactgg aaaattaatt attgacgaaa atatttatta ttttgatgat 5820

aattatagag gagctgtaga atggaaagaa ttagatggtg aaatgcacta ttttagccca 5880

gaaacaggta aagcttttaa aggtctaaat caaataggtg attataaata ctatttcaat 5940

tctgatggag ttatgcaaaa aggatttgtt agtataaatg ataataaaca ctattttgat 6000

gattctggtg ttatgaaagt aggttacact gaaatagatg gcaagcattt ctactttgct 6060

gaaaacggag aaatgcaaat aggagtattt aatacagaag atggatttaa atattttgct 6120

catcataatg aagatttagg aaatgaagaa ggtgaagaaa tctcatattc tggtatatta 6180

aatttcaata ataaaattta ctattttgat gattcattta cagctgtagt tggatggaaa 6240

gatttagagg atggttcaaa gtattatttt gatgaagata cagcagaagc atatataggt 6300

ttgtcattaa taaatgatgg tcaatattat tttaatgatg atggaattat gcaagttgga 6360

tttgtcacta taaatgataa agtcttctac ttctctgact ctggaattat agaatctgga 6420

gtacaaaaca tagatgacaa ttatttctat atagatgata atggtatagt tcaaattggt 6480

gtatttgata cttcagatgg atataaatat tttgcacctg ctaatactgt aaatgataat 6540

atttacggac aagcagttga atatagtggt ttagttagag ttggtgaaga tgtatattat 6600

tttggagaaa catatacaat tgagactgga tggatatatg atatggaaaa tgaaagtgat 6660

aaatattatt tcaatccaga aactaaaaaa gcatgcaaag gtattaattt aattgatgat 6720

ataaaatatt attttgatga gaagggcata atgagaacgg gtcttatatc atttgaaaat 6780

aataattatt actttaatga gaatggtgaa atgcaatttg gttatataaa tatagaagat 6840

aagatgttct attttggtga agatggtgtc atgcagattg gagtatttaa tacaccagat 6900

ggatttaaat actttgcaca tcaaaatact ttggatgaga attttgaggg agaatcaata 6960

aactatactg gttggttaga tttagatgaa aagagatatt attttacaga tgaatatatt 7020

gcagcaactg gttcagttat tattgatggt gaggagtatt attttgatcc tgatacagct 7080

caattagtga ttagtgaata g 7101

<210> 11

<211> 8133

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность: ген TcdA (мутации

D285A D287A)

<400> 11

atgtctttaa tatctaaaga agagttaata aaactcgcat atagcattag accaagagaa 60

aatgagtata aaactatact aactaattta gacgaatata ataagttaac tacaaacaat 120

aatgaaaata aatatttaca attaaaaaaa ctaaatgaat caattgatgt ttttatgaat 180

aaatataaaa cttcaagcag aaatagagca ctctctaatc taaaaaaaga tatattaaaa 240

gaagtaattc ttattaaaaa ttccaataca agccctgtag aaaaaaattt acattttgta 300

tggataggtg gagaagtcag tgatattgct cttgaataca taaaacaatg ggctgatatt 360

aatgcagaat ataatattaa actgtggtat gatagtgaag cattcttagt aaatacacta 420

aaaaaggcta tagttgaatc ttctaccact gaagcattac agctactaga ggaagagatt 480

caaaatcctc aatttgataa tatgaaattt tacaaaaaaa ggatggaatt tatatatgat 540

agacaaaaaa ggtttataaa ttattataaa tctcaaatca ataaacctac agtacctaca 600

atagatgata ttataaagtc tcatctagta tctgaatata atagagatga aactgtatta 660

gaatcatata gaacaaattc tttgagaaaa ataaatagta atcatgggat agatatcagg 720

gctaatagtt tgtttacaga acaagagtta ttaaatattt atagtcagga gttgttaaat 780

cgtggaaatt tagctgcagc atctgacata gtaagattat tagccctaaa aaattttggc 840

ggagtatatt tagcagttgc aatgcttcca ggtattcact ctgatttatt taaaacaata 900

tctagaccta gctctattgg actagaccgt tgggaaatga taaaattaga ggctattatg 960

aagtataaaa aatatataaa taattataca tcagaaaact ttgataaact tgatcaacaa 1020

ttaaaagata attttaaact cattatagaa agtaaaagtg aaaaatctga gatattttct 1080

aaattagaaa atttaaatgt atctgatctt gaaattaaaa tagctttcgc tttaggcagt 1140

gttataaatc aagccttgat atcaaaacaa ggttcatatc ttactaacct agtaatagaa 1200

caagtaaaaa atagatatca atttttaaac caacacctta acccagccat agagtctgat 1260

aataacttca cagatactac taaaattttt catgattcat tatttaattc agctaccgca 1320

gaaaactcta tgtttttaac aaaaatagca ccatacttac aagtaggttt tatgccagaa 1380

gctcgctcca caataagttt aagtggtcca ggagcttatg cgtcagctta ctatgatttc 1440

ataaatttac aagaaaatac tatagaaaaa actttaaaag catcagattt aatagaattt 1500

aaattcccag aaaataatct atctcaattg acagaacaag aaataaatag tctatggagc 1560

tttgatcaag caagtgcaaa atatcaattt gagaaatatg taagagatta tactggtgga 1620

tctctttctg aagacaatgg ggtagacttt aataaaaata ctgccctcga caaaaactat 1680

ttattaaata ataaaattcc atcaaacaat gtagaagaag ctggaagtaa aaattatgtt 1740

cattatatca tacagttaca aggagatgat ataagttatg aagcaacatg caatttattt 1800

tctaaaaatc ctaaaaatag tattattata caacgaaata tgaatgaaag tgcaaaaagc 1860

tactttttaa gtgatgatgg agaatctatt ttagaattaa ataaatatag gatacctgaa 1920

agattaaaaa ataaggaaaa agtaaaagta acctttattg gacatggtaa agatgaattc 1980

aacacaagcg aatttgctag attaagtgta gattcacttt ccaatgagat aagttcattt 2040

ttagatacca taaaattaga tatatcacct aaaaatgtag aagtaaactt acttggatgt 2100

aatatgttta gttatgattt taatgttgaa gaaacttatc ctgggaagtt gctattaagt 2160

attatggaca aaattacttc cactttacct gatgtaaata aaaattctat tactatagga 2220

gcaaatcaat atgaagtaag aattaatagt gagggaagaa aagaacttct ggctcactca 2280

ggtaaatgga taaataaaga agaagctatt atgagcgatt tatctagtaa agaatacatt 2340

ttttttgatt ctatagataa taagctaaaa gcaaagtcca agaatattcc aggattagca 2400

tcaatatcag aagatataaa aacattatta cttgatgcaa gtgttagtcc tgatacaaaa 2460

tttattttaa ataatcttaa gcttaatatt gaatcttcta ttggtgatta catttattat 2520

gaaaaattag agcctgttaa aaatataatt cacaattcta tagatgattt aatagatgag 2580

ttcaatctac ttgaaaatgt atctgatgaa ttatatgaat taaaaaaatt aaataatcta 2640

gatgagaagt atttaatatc ttttgaagat atctcaaaaa ataattcaac ttactctgta 2700

agatttatta acaaaagtaa tggtgagtca gtttatgtag aaacagaaaa agaaattttt 2760

tcaaaatata gcgaacatat tacaaaagaa ataagtacta taaagaatag tataattaca 2820

gatgttaatg gtaatttatt ggataatata cagttagatc atacttctca agttaataca 2880

ttaaacgcag cattctttat tcaatcatta atagattata gtagcaataa agatgtactg 2940

aatgatttaa gtacctcagt taaggttcaa ctttatgctc aactatttag tacaggttta 3000

aatactatat atgactctat ccaattagta aatttaatat caaatgcagt aaatgatact 3060

ataaatgtac tacctacaat aacagagggg atacctattg tatctactat attagacgga 3120

ataaacttag gtgcagcaat taaggaatta ctagacgaac atgacccatt actaaaaaaa 3180

gaattagaag ctaaggtggg tgttttagca ataaatatgt cattatctat agctgcaact 3240

gtagcttcaa ttgttggaat aggtgctgaa gttactattt tcttattacc tatagctggt 3300

atatctgcag gaataccttc attagttaat aatgaattaa tattgcatga taaggcaact 3360

tcagtggtaa actattttaa tcatttgtct gaatctaaaa aatatggccc tcttaaaaca 3420

gaagatgata aaattttagt tcctattgat gatttagtaa tatcagaaat agattttaat 3480

aataattcga taaaactagg aacatgtaat atattagcaa tggagggggg atcaggacac 3540

acagtgactg gtaatataga tcactttttc tcatctccat ctataagttc tcatattcct 3600

tcattatcaa tttattctgc aataggtata gaaacagaaa atctagattt ttcaaaaaaa 3660

ataatgatgt tacctaatgc tccttcaaga gtgttttggt gggaaactgg agcagttcca 3720

ggtttaagat cattggaaaa tgacggaact agattacttg attcaataag agatttatac 3780

ccaggtaaat tttactggag attctatgct tttttcgatt atgcaataac tacattaaaa 3840

ccagtttatg aagacactaa tattaaaatt aaactagata aagatactag aaacttcata 3900

atgccaacta taactactaa cgaaattaga aacaaattat cttattcatt tgatggagca 3960

ggaggaactt actctttatt attatcttca tatccaatat caacgaatat aaatttatct 4020

aaagatgatt tatggatatt taatattgat aatgaagtaa gagaaatatc tatagaaaat 4080

ggtactatta aaaaaggaaa gttaataaaa gatgttttaa gtaaaattga tataaataaa 4140

aataaactta ttataggcaa tcaaacaata gatttttcag gcgatataga taataaagat 4200

agatatatat tcttgacttg tgagttagat gataaaatta gtttaataat agaaataaat 4260

cttgttgcaa aatcttatag tttgttattg tctggggata aaaattattt gatatccaat 4320

ttatctaata ttattgagaa aatcaatact ttaggactag atagtaaaaa tatagcgtac 4380

aattacactg atgaatctaa taataaatat tttggagcta tatctaaaac aagtcaaaaa 4440

agcataatac attataaaaa agacagtaaa aatatattag aattttataa tgacagtaca 4500

ttagaattta acagtaaaga ttttattgct gaagatataa atgtatttat gaaagatgat 4560

attaatacta taacaggaaa atactatgtt gataataata ctgataaaag tatagatttc 4620

tctatttctt tagttagtaa aaatcaagta aaagtaaatg gattatattt aaatgaatcc 4680

gtatactcat cttaccttga ttttgtgaaa aattcagatg gacaccataa tacttctaat 4740

tttatgaatt tatttttgga caatataagt ttctggaaat tgtttgggtt tgaaaatata 4800

aattttgtaa tcgataaata ctttaccctt gttggtaaaa ctaatcttgg atatgtagaa 4860

tttatttgtg acaataataa aaatatagat atatattttg gtgaatggaa aacatcgtca 4920

tctaaaagca ctatatttag cggaaatggt agaaatgttg tagtagagcc tatatataat 4980

cctgatacgg gtgaagatat atctacttca ctagattttt cctatgaacc tctctatgga 5040

atagatagat atatcaataa agtattgata gcacctgatt tatatacaag tttaataaat 5100

attaatacca attattattc aaatgagtac taccctgaga ttatagttct taacccaaat 5160

acattccaca aaaaagtaaa tataaattta gatagttctt cttttgagta taaatggtct 5220

acagaaggaa gtgactttat tttagttaga tacttagaag aaagtaataa aaaaatatta 5280

caaaaaataa gaatcaaagg tatcttatct aatactcaat catttaataa aatgagtata 5340

gattttaaag atattaaaaa actatcatta ggatatataa tgagtaattt taaatcattt 5400

aattctgaaa atgaattaga tagagatcat ttaggattta aaataataga taataaaact 5460

tattactatg atgaagatag taaattagtt aaaggattaa tcaatataaa taattcatta 5520

ttctattttg atcctataga atttaactta gtaactggat ggcaaactat caatggtaaa 5580

aaatattatt ttgatataaa tactggagca gctttaatta gttataaaat tattaatggt 5640

aaacactttt attttaataa tgatggtgtg atgcagttgg gagtatttaa aggacctgat 5700

ggatttgaat attttgcacc tgccaatact caaaataata acatagaagg tcaggctata 5760

gtttatcaaa gtaaattctt aactttgaat ggcaaaaaat attattttga taatgactca 5820

aaagcagtca ctggatggag aattattaac aatgagaaat attactttaa tcctaataat 5880

gctattgctg cagtcggatt gcaagtaatt gacaataata agtattattt caatcctgac 5940

actgctatca tctcaaaagg ttggcagact gttaatggta gtagatacta ctttgatact 6000

gataccgcta ttgcctttaa tggttataaa actattgatg gtaaacactt ttattttgat 6060

agtgattgtg tagtgaaaat aggtgtgttt agtacctcta atggatttga atattttgca 6120

cctgctaata cttataataa taacatagaa ggtcaggcta tagtttatca aagtaaattc 6180

ttaactttga atggtaaaaa atattacttt gataataact caaaagcagt taccggatgg 6240

caaactattg atagtaaaaa atattacttt aatactaaca ctgctgaagc agctactgga 6300

tggcaaacta ttgatggtaa aaaatattac tttaatacta acactgctga agcagctact 6360

ggatggcaaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tatagcttca 6420

actggttata caattattaa tggtaaacat ttttatttta atactgatgg tattatgcag 6480

ataggagtgt ttaaaggacc taatggattt gaatattttg cacctgctaa tacggatgct 6540

aacaacatag aaggtcaagc tatactttac caaaatgaat tcttaacttt gaatggtaaa 6600

aaatattact ttggtagtga ctcaaaagca gttactggat ggagaattat taacaataag 6660

aaatattact ttaatcctaa taatgctatt gctgcaattc atctatgcac tataaataat 6720

gacaagtatt actttagtta tgatggaatt cttcaaaatg gatatattac tattgaaaga 6780

aataatttct attttgatgc taataatgaa tctaaaatgg taacaggagt atttaaagga 6840

cctaatggat ttgagtattt tgcacctgct aatactcaca ataataacat agaaggtcag 6900

gctatagttt accagaacaa attcttaact ttgaatggca aaaaatatta ttttgataat 6960

gactcaaaag cagttactgg atggcaaacc attgatggta aaaaatatta ctttaatctt 7020

aacactgctg aagcagctac tggatggcaa actattgatg gtaaaaaata ttactttaat 7080

cttaacactg ctgaagcagc tactggatgg caaactattg atggtaaaaa atattacttt 7140

aatactaaca ctttcatagc ctcaactggt tatacaagta ttaatggtaa acatttttat 7200

tttaatactg atggtattat gcagatagga gtgtttaaag gacctaatgg atttgaatac 7260

tttgcacctg ctaatactca taataataac atagaaggtc aagctatact ttaccaaaat 7320

aaattcttaa ctttgaatgg taaaaaatat tactttggta gtgactcaaa agcagttacc 7380

ggattgcgaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tgttgcagtt 7440

actggatggc aaactattaa tggtaaaaaa tactacttta atactaacac ttctatagct 7500

tcaactggtt atacaattat tagtggtaaa catttttatt ttaatactga tggtattatg 7560

cagataggag tgtttaaagg acctgatgga tttgaatact ttgcacctgc taatacagat 7620

gctaacaata tagaaggtca agctatacgt tatcaaaata gattcctata tttacatgac 7680

aatatatatt attttggtaa taattcaaaa gcagctactg gttgggtaac tattgatggt 7740

aatagatatt acttcgagcc taatacagct atgggtgcga atggttataa aactattgat 7800

aataaaaatt tttactttag aaatggttta cctcagatag gagtgtttaa agggtctaat 7860

ggatttgaat actttgcacc tgctaatacg gatgctaaca atatagaagg tcaagctata 7920

cgttatcaaa atagattcct acatttactt ggaaaaatat attactttgg taataattca 7980

aaagcagtta ctggatggca aactattaat ggtaaagtat attactttat gcctgatact 8040

gctatggctg cagcaggtgg acttttcgag attgatggtg ttatatattt ctttggtgtt 8100

gatggagtaa aagcccctgg gatatatggc taa 8133

<210> 12

<211> 8133

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность: ген TcdA (мутации

D285A D287A C700A)

<400> 12

atgtctttaa tatctaaaga agagttaata aaactcgcat atagcattag accaagagaa 60

aatgagtata aaactatact aactaattta gacgaatata ataagttaac tacaaacaat 120

aatgaaaata aatatttaca attaaaaaaa ctaaatgaat caattgatgt ttttatgaat 180

aaatataaaa cttcaagcag aaatagagca ctctctaatc taaaaaaaga tatattaaaa 240

gaagtaattc ttattaaaaa ttccaataca agccctgtag aaaaaaattt acattttgta 300

tggataggtg gagaagtcag tgatattgct cttgaataca taaaacaatg ggctgatatt 360

aatgcagaat ataatattaa actgtggtat gatagtgaag cattcttagt aaatacacta 420

aaaaaggcta tagttgaatc ttctaccact gaagcattac agctactaga ggaagagatt 480

caaaatcctc aatttgataa tatgaaattt tacaaaaaaa ggatggaatt tatatatgat 540

agacaaaaaa ggtttataaa ttattataaa tctcaaatca ataaacctac agtacctaca 600

atagatgata ttataaagtc tcatctagta tctgaatata atagagatga aactgtatta 660

gaatcatata gaacaaattc tttgagaaaa ataaatagta atcatgggat agatatcagg 720

gctaatagtt tgtttacaga acaagagtta ttaaatattt atagtcagga gttgttaaat 780

cgtggaaatt tagctgcagc atctgacata gtaagattat tagccctaaa aaattttggc 840

ggagtatatt tagcagttgc aatgcttcca ggtattcact ctgatttatt taaaacaata 900

tctagaccta gctctattgg actagaccgt tgggaaatga taaaattaga ggctattatg 960

aagtataaaa aatatataaa taattataca tcagaaaact ttgataaact tgatcaacaa 1020

ttaaaagata attttaaact cattatagaa agtaaaagtg aaaaatctga gatattttct 1080

aaattagaaa atttaaatgt atctgatctt gaaattaaaa tagctttcgc tttaggcagt 1140

gttataaatc aagccttgat atcaaaacaa ggttcatatc ttactaacct agtaatagaa 1200

caagtaaaaa atagatatca atttttaaac caacacctta acccagccat agagtctgat 1260

aataacttca cagatactac taaaattttt catgattcat tatttaattc agctaccgca 1320

gaaaactcta tgtttttaac aaaaatagca ccatacttac aagtaggttt tatgccagaa 1380

gctcgctcca caataagttt aagtggtcca ggagcttatg cgtcagctta ctatgatttc 1440

ataaatttac aagaaaatac tatagaaaaa actttaaaag catcagattt aatagaattt 1500

aaattcccag aaaataatct atctcaattg acagaacaag aaataaatag tctatggagc 1560

tttgatcaag caagtgcaaa atatcaattt gagaaatatg taagagatta tactggtgga 1620

tctctttctg aagacaatgg ggtagacttt aataaaaata ctgccctcga caaaaactat 1680

ttattaaata ataaaattcc atcaaacaat gtagaagaag ctggaagtaa aaattatgtt 1740

cattatatca tacagttaca aggagatgat ataagttatg aagcaacatg caatttattt 1800

tctaaaaatc ctaaaaatag tattattata caacgaaata tgaatgaaag tgcaaaaagc 1860

tactttttaa gtgatgatgg agaatctatt ttagaattaa ataaatatag gatacctgaa 1920

agattaaaaa ataaggaaaa agtaaaagta acctttattg gacatggtaa agatgaattc 1980

aacacaagcg aatttgctag attaagtgta gattcacttt ccaatgagat aagttcattt 2040

ttagatacca taaaattaga tatatcacct aaaaatgtag aagtaaactt acttggagct 2100

aatatgttta gttatgattt taatgttgaa gaaacttatc ctgggaagtt gctattaagt 2160

attatggaca aaattacttc cactttacct gatgtaaata aaaattctat tactatagga 2220

gcaaatcaat atgaagtaag aattaatagt gagggaagaa aagaacttct ggctcactca 2280

ggtaaatgga taaataaaga agaagctatt atgagcgatt tatctagtaa agaatacatt 2340

ttttttgatt ctatagataa taagctaaaa gcaaagtcca agaatattcc aggattagca 2400

tcaatatcag aagatataaa aacattatta cttgatgcaa gtgttagtcc tgatacaaaa 2460

tttattttaa ataatcttaa gcttaatatt gaatcttcta ttggtgatta catttattat 2520

gaaaaattag agcctgttaa aaatataatt cacaattcta tagatgattt aatagatgag 2580

ttcaatctac ttgaaaatgt atctgatgaa ttatatgaat taaaaaaatt aaataatcta 2640

gatgagaagt atttaatatc ttttgaagat atctcaaaaa ataattcaac ttactctgta 2700

agatttatta acaaaagtaa tggtgagtca gtttatgtag aaacagaaaa agaaattttt 2760

tcaaaatata gcgaacatat tacaaaagaa ataagtacta taaagaatag tataattaca 2820

gatgttaatg gtaatttatt ggataatata cagttagatc atacttctca agttaataca 2880

ttaaacgcag cattctttat tcaatcatta atagattata gtagcaataa agatgtactg 2940

aatgatttaa gtacctcagt taaggttcaa ctttatgctc aactatttag tacaggttta 3000

aatactatat atgactctat ccaattagta aatttaatat caaatgcagt aaatgatact 3060

ataaatgtac tacctacaat aacagagggg atacctattg tatctactat attagacgga 3120

ataaacttag gtgcagcaat taaggaatta ctagacgaac atgacccatt actaaaaaaa 3180

gaattagaag ctaaggtggg tgttttagca ataaatatgt cattatctat agctgcaact 3240

gtagcttcaa ttgttggaat aggtgctgaa gttactattt tcttattacc tatagctggt 3300

atatctgcag gaataccttc attagttaat aatgaattaa tattgcatga taaggcaact 3360

tcagtggtaa actattttaa tcatttgtct gaatctaaaa aatatggccc tcttaaaaca 3420

gaagatgata aaattttagt tcctattgat gatttagtaa tatcagaaat agattttaat 3480

aataattcga taaaactagg aacatgtaat atattagcaa tggagggggg atcaggacac 3540

acagtgactg gtaatataga tcactttttc tcatctccat ctataagttc tcatattcct 3600

tcattatcaa tttattctgc aataggtata gaaacagaaa atctagattt ttcaaaaaaa 3660

ataatgatgt tacctaatgc tccttcaaga gtgttttggt gggaaactgg agcagttcca 3720

ggtttaagat cattggaaaa tgacggaact agattacttg attcaataag agatttatac 3780

ccaggtaaat tttactggag attctatgct tttttcgatt atgcaataac tacattaaaa 3840

ccagtttatg aagacactaa tattaaaatt aaactagata aagatactag aaacttcata 3900

atgccaacta taactactaa cgaaattaga aacaaattat cttattcatt tgatggagca 3960

ggaggaactt actctttatt attatcttca tatccaatat caacgaatat aaatttatct 4020

aaagatgatt tatggatatt taatattgat aatgaagtaa gagaaatatc tatagaaaat 4080

ggtactatta aaaaaggaaa gttaataaaa gatgttttaa gtaaaattga tataaataaa 4140

aataaactta ttataggcaa tcaaacaata gatttttcag gcgatataga taataaagat 4200

agatatatat tcttgacttg tgagttagat gataaaatta gtttaataat agaaataaat 4260

cttgttgcaa aatcttatag tttgttattg tctggggata aaaattattt gatatccaat 4320

ttatctaata ttattgagaa aatcaatact ttaggactag atagtaaaaa tatagcgtac 4380

aattacactg atgaatctaa taataaatat tttggagcta tatctaaaac aagtcaaaaa 4440

agcataatac attataaaaa agacagtaaa aatatattag aattttataa tgacagtaca 4500

ttagaattta acagtaaaga ttttattgct gaagatataa atgtatttat gaaagatgat 4560

attaatacta taacaggaaa atactatgtt gataataata ctgataaaag tatagatttc 4620

tctatttctt tagttagtaa aaatcaagta aaagtaaatg gattatattt aaatgaatcc 4680

gtatactcat cttaccttga ttttgtgaaa aattcagatg gacaccataa tacttctaat 4740

tttatgaatt tatttttgga caatataagt ttctggaaat tgtttgggtt tgaaaatata 4800

aattttgtaa tcgataaata ctttaccctt gttggtaaaa ctaatcttgg atatgtagaa 4860

tttatttgtg acaataataa aaatatagat atatattttg gtgaatggaa aacatcgtca 4920

tctaaaagca ctatatttag cggaaatggt agaaatgttg tagtagagcc tatatataat 4980

cctgatacgg gtgaagatat atctacttca ctagattttt cctatgaacc tctctatgga 5040

atagatagat atatcaataa agtattgata gcacctgatt tatatacaag tttaataaat 5100

attaatacca attattattc aaatgagtac taccctgaga ttatagttct taacccaaat 5160

acattccaca aaaaagtaaa tataaattta gatagttctt cttttgagta taaatggtct 5220

acagaaggaa gtgactttat tttagttaga tacttagaag aaagtaataa aaaaatatta 5280

caaaaaataa gaatcaaagg tatcttatct aatactcaat catttaataa aatgagtata 5340

gattttaaag atattaaaaa actatcatta ggatatataa tgagtaattt taaatcattt 5400

aattctgaaa atgaattaga tagagatcat ttaggattta aaataataga taataaaact 5460

tattactatg atgaagatag taaattagtt aaaggattaa tcaatataaa taattcatta 5520

ttctattttg atcctataga atttaactta gtaactggat ggcaaactat caatggtaaa 5580

aaatattatt ttgatataaa tactggagca gctttaatta gttataaaat tattaatggt 5640

aaacactttt attttaataa tgatggtgtg atgcagttgg gagtatttaa aggacctgat 5700

ggatttgaat attttgcacc tgccaatact caaaataata acatagaagg tcaggctata 5760

gtttatcaaa gtaaattctt aactttgaat ggcaaaaaat attattttga taatgactca 5820

aaagcagtca ctggatggag aattattaac aatgagaaat attactttaa tcctaataat 5880

gctattgctg cagtcggatt gcaagtaatt gacaataata agtattattt caatcctgac 5940

actgctatca tctcaaaagg ttggcagact gttaatggta gtagatacta ctttgatact 6000

gataccgcta ttgcctttaa tggttataaa actattgatg gtaaacactt ttattttgat 6060

agtgattgtg tagtgaaaat aggtgtgttt agtacctcta atggatttga atattttgca 6120

cctgctaata cttataataa taacatagaa ggtcaggcta tagtttatca aagtaaattc 6180

ttaactttga atggtaaaaa atattacttt gataataact caaaagcagt taccggatgg 6240

caaactattg atagtaaaaa atattacttt aatactaaca ctgctgaagc agctactgga 6300

tggcaaacta ttgatggtaa aaaatattac tttaatacta acactgctga agcagctact 6360

ggatggcaaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tatagcttca 6420

actggttata caattattaa tggtaaacat ttttatttta atactgatgg tattatgcag 6480

ataggagtgt ttaaaggacc taatggattt gaatattttg cacctgctaa tacggatgct 6540

aacaacatag aaggtcaagc tatactttac caaaatgaat tcttaacttt gaatggtaaa 6600

aaatattact ttggtagtga ctcaaaagca gttactggat ggagaattat taacaataag 6660

aaatattact ttaatcctaa taatgctatt gctgcaattc atctatgcac tataaataat 6720

gacaagtatt actttagtta tgatggaatt cttcaaaatg gatatattac tattgaaaga 6780

aataatttct attttgatgc taataatgaa tctaaaatgg taacaggagt atttaaagga 6840

cctaatggat ttgagtattt tgcacctgct aatactcaca ataataacat agaaggtcag 6900

gctatagttt accagaacaa attcttaact ttgaatggca aaaaatatta ttttgataat 6960

gactcaaaag cagttactgg atggcaaacc attgatggta aaaaatatta ctttaatctt 7020

aacactgctg aagcagctac tggatggcaa actattgatg gtaaaaaata ttactttaat 7080

cttaacactg ctgaagcagc tactggatgg caaactattg atggtaaaaa atattacttt 7140

aatactaaca ctttcatagc ctcaactggt tatacaagta ttaatggtaa acatttttat 7200

tttaatactg atggtattat gcagatagga gtgtttaaag gacctaatgg atttgaatac 7260

tttgcacctg ctaatactca taataataac atagaaggtc aagctatact ttaccaaaat 7320

aaattcttaa ctttgaatgg taaaaaatat tactttggta gtgactcaaa agcagttacc 7380

ggattgcgaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tgttgcagtt 7440

actggatggc aaactattaa tggtaaaaaa tactacttta atactaacac ttctatagct 7500

tcaactggtt atacaattat tagtggtaaa catttttatt ttaatactga tggtattatg 7560

cagataggag tgtttaaagg acctgatgga tttgaatact ttgcacctgc taatacagat 7620

gctaacaata tagaaggtca agctatacgt tatcaaaata gattcctata tttacatgac 7680

aatatatatt attttggtaa taattcaaaa gcagctactg gttgggtaac tattgatggt 7740

aatagatatt acttcgagcc taatacagct atgggtgcga atggttataa aactattgat 7800

aataaaaatt tttactttag aaatggttta cctcagatag gagtgtttaa agggtctaat 7860

ggatttgaat actttgcacc tgctaatacg gatgctaaca atatagaagg tcaagctata 7920

cgttatcaaa atagattcct acatttactt ggaaaaatat attactttgg taataattca 7980

aaagcagtta ctggatggca aactattaat ggtaaagtat attactttat gcctgatact 8040

gctatggctg cagcaggtgg acttttcgag attgatggtg ttatatattt ctttggtgtt 8100

gatggagtaa aagcccctgg gatatatggc taa 8133

<210> 13

<211> 7101

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность: TcdB (мутации

D286A D288A)

<400> 13

atgagtttag ttaatagaaa acagttagaa aaaatggcaa atgtaagatt tcgtactcaa 60

gaagatgaat atgttgcaat attggatgct ttagaagaat atcataatat gtcagagaat 120

actgtagtcg aaaaatattt aaaattaaaa gatataaata gtttaacaga tatttatata 180

gatacatata aaaaatctgg tagaaataaa gccttaaaaa aatttaagga atatctagtt 240

acagaagtat tagagctaaa gaataataat ttaactccag ttgagaaaaa tttacatttt 300

gtttggattg gaggtcaaat aaatgacact gctattaatt atataaatca atggaaagat 360

gtaaatagtg attataatgt taatgttttt tatgatagta atgcattttt gataaacaca 420

ttgaaaaaaa ctgtagtaga atcagcaata aatgatacac ttgaatcatt tagagaaaac 480

ttaaatgacc ctagatttga ctataataaa ttcttcagaa aacgtatgga aataatttat 540

gataaacaga aaaatttcat aaactactat aaagctcaaa gagaagaaaa tcctgaactt 600

ataattgatg atattgtaaa gacatatctt tcaaatgagt attcaaagga gatagatgaa 660

cttaatacct atattgaaga atccttaaat aaaattacac agaatagtgg aaatgatgtt 720

agaaactttg aagaatttaa aaatggagag tcattcaact tatatgaaca agagttggta 780

gaaaggtgga atttagctgc tgcttctgac atattaagaa tatctgcatt aaaagaaatt 840

ggtggtatgt atttagcagt tgcaatgtta ccaggaatac aaccagactt atttgagtct 900

atagagaaac ctagttcagt aacagtggat ttttgggaaa tgacaaagtt agaagctata 960

atgaaataca aagaatatat accagaatat acctcagaac attttgacat gttagacgaa 1020

gaagttcaaa gtagttttga atctgttcta gcttctaagt cagataaatc agaaatattc 1080

tcatcacttg gtgatatgga ggcatcacca ctagaagtta aaattgcatt taatagtaag 1140

ggtattataa atcaagggct aatttctgtg aaagactcat attgtagcaa tttaatagta 1200

aaacaaatcg agaatagata taaaatattg aataatagtt taaatccagc tattagcgag 1260

gataatgatt ttaatactac aacgaatacc tttattgata gtataatggc tgaagctaat 1320

gcagataatg gtagatttat gatggaacta ggaaagtatt taagagttgg tttcttccca 1380

gatgttaaaa ctactattaa cttaagtggc cctgaagctt atgcggcagc ttatcaagat 1440

ttattaatgt ttaaagaagg cagtatgaat atccatttga tagaagctga tttaagaaac 1500

tttgaaatct ctaaaactaa tatttctcaa tcaactgaac aagaaatggc ttctttatgg 1560

tcatttgacg atgcaagagc taaagctcaa tttgaagaat ataaaaggaa ttattttgaa 1620

ggttctcttg gtgaagatga taatcttgat ttttctcaaa atatagtagt tgacaaggag 1680

tatcttttag aaaaaatatc ttcattagca agaagttcag agagaggata tatacactat 1740

attgttcagt tacaaggaga taaaattagt tatgaagcag catgtaactt atttgcaaag 1800

actccttatg atagtgtact gtttcagaaa aatatagaag attcagaaat tgcatattat 1860

tataatcctg gagatggtga aatacaagaa atagacaagt ataaaattcc aagtataatt 1920

tctgatagac ctaagattaa attaacattt attggtcatg gtaaagatga atttaatact 1980

gatatatttg caggttttga tgtagattca ttatccacag aaatagaagc agcaatagat 2040

ttagctaaag aggatatttc tcctaagtca atagaaataa atttattagg atgtaatatg 2100

tttagctact ctatcaacgt agaggagact tatcctggaa aattattact taaagttaaa 2160

gataaaatat cagaattaat gccatctata agtcaagact ctattatagt aagtgcaaat 2220

caatatgaag ttagaataaa tagtgaagga agaagagaat tattggatca ttctggtgaa 2280

tggataaata aagaagaaag tattataaag gatatttcat caaaagaata tatatcattt 2340

aatcctaaag aaaataaaat tacagtaaaa tctaaaaatt tacctgagct atctacatta 2400

ttacaagaaa ttagaaataa ttctaattca agtgatattg aactagaaga aaaagtaatg 2460

ttaacagaat gtgagataaa tgttatttca aatatagata cgcaaattgt tgaggaaagg 2520

attgaagaag ctaagaattt aacttctgac tctattaatt atataaaaga tgaatttaaa 2580

ctaatagaat ctatttctga tgcactatgt gacttaaaac aacagaatga attagaagat 2640

tctcatttta tatcttttga ggacatatca gagactgatg agggatttag tataagattt 2700

attaataaag aaactggaga atctatattt gtagaaactg aaaaaacaat attctctgaa 2760

tatgctaatc atataactga agagatttct aagataaaag gtactatatt tgatactgta 2820

aatggtaagt tagtaaaaaa agtaaattta gatactacac acgaagtaaa tactttaaat 2880

gctgcatttt ttatacaatc attaatagaa tataatagtt ctaaagaatc tcttagtaat 2940

ttaagtgtag caatgaaagt ccaagtttac gctcaattat ttagtactgg tttaaatact 3000

attacagatg cagccaaagt tgttgaatta gtatcaactg cattagatga aactatagac 3060

ttacttccta cattatctga aggattacct ataattgcaa ctattataga tggtgtaagt 3120

ttaggtgcag caatcaaaga gctaagtgaa acgagtgacc cattattaag acaagaaata 3180

gaagctaaga taggtataat ggcagtaaat ttaacaacag ctacaactgc aatcattact 3240

tcatctttgg ggatagctag tggatttagt atacttttag ttcctttagc aggaatttca 3300

gcaggtatac caagcttagt aaacaatgaa cttgtacttc gagataaggc aacaaaggtt 3360

gtagattatt ttaaacatgt ttcattagtt gaaactgaag gagtatttac tttattagat 3420

gataaaataa tgatgccaca agatgattta gtgatatcag aaatagattt taataataat 3480

tcaatagttt taggtaaatg tgaaatctgg agaatggaag gtggttcagg tcatactgta 3540

actgatgata tagatcactt cttttcagca ccatcaataa catatagaga gccacactta 3600

tctatatatg acgtattgga agtacaaaaa gaagaacttg atttgtcaaa agatttaatg 3660

gtattaccta atgctccaaa tagagtattt gcttgggaaa caggatggac accaggttta 3720

agaagcttag aaaatgatgg cacaaaactg ttagaccgta taagagataa ctatgaaggt 3780

gagttttatt ggagatattt tgcttttata gctgatgctt taataacaac attaaaacca 3840

agatatgaag atactaatat aagaataaat ttagatagta atactagaag ttttatagtt 3900

ccaataataa ctacagaata tataagagaa aaattatcat attctttcta tggttcagga 3960

ggaacttatg cattgtctct ttctcaatat aatatgggta taaatataga attaagtgaa 4020

agtgatgttt ggattataga tgttgataat gttgtgagag atgtaactat agaatctgat 4080

aaaattaaaa aaggtgattt aatagaaggt attttatcta cactaagtat tgaagagaat 4140

aaaattatct taaatagcca tgagattaat ttttctggtg aggtaaatgg aagtaatgga 4200

tttgtttctt taacattttc aattttagaa ggaataaatg caattataga agttgattta 4260

ttatctaaat catataaatt acttatttct ggcgaattaa aaatattgat gttaaattca 4320

aatcatattc aacagaaaat agattatata ggattcaata gcgaattaca gaaaaatata 4380

ccatatagct ttgtagatag tgaaggaaaa gagaatggtt ttattaatgg ttcaacaaaa 4440

gaaggtttat ttgtatctga attacctgat gtagttctta taagtaaggt ttatatggat 4500

gatagtaagc cttcatttgg atattatagt aataatttga aagatgtcaa agttataact 4560

aaagataatg ttaatatatt aacaggttat tatcttaagg atgatataaa aatctctctt 4620

tctttgactc tacaagatga aaaaactata aagttaaata gtgtgcattt agatgaaagt 4680

ggagtagctg agattttgaa gttcatgaat agaaaaggta atacaaatac ttcagattct 4740

ttaatgagct ttttagaaag tatgaatata aaaagtattt tcgttaattt cttacaatct 4800

aatattaagt ttatattaga tgctaatttt ataataagtg gtactacttc tattggccaa 4860

tttgagttta tttgtgatga aaatgataat atacaaccat atttcattaa gtttaataca 4920

ctagaaacta attatacttt atatgtagga aatagacaaa atatgatagt ggaaccaaat 4980

tatgatttag atgattctgg agatatatct tcaactgtta tcaatttctc tcaaaagtat 5040

ctttatggaa tagacagttg tgttaataaa gttgtaattt caccaaatat ttatacagat 5100

gaaataaata taacgcctgt atatgaaaca aataatactt atccagaagt tattgtatta 5160

gatgcaaatt atataaatga aaaaataaat gttaatatca atgatctatc tatacgatat 5220

gtatggagta atgatggtaa tgattttatt cttatgtcaa ctagtgaaga aaataaggtg 5280

tcacaagtta aaataagatt cgttaatgtt tttaaagata agactttggc aaataagcta 5340

tcttttaact ttagtgataa acaagatgta cctgtaagtg aaataatctt atcatttaca 5400

ccttcatatt atgaggatgg attgattggc tatgatttgg gtctagtttc tttatataat 5460

gagaaatttt atattaataa ctttggaatg atggtatctg gattaatata tattaatgat 5520

tcattatatt attttaaacc accagtaaat aatttgataa ctggatttgt gactgtaggc 5580

gatgataaat actactttaa tccaattaat ggtggagctg cttcaattgg agagacaata 5640

attgatgaca aaaattatta tttcaaccaa agtggagtgt tacaaacagg tgtatttagt 5700

acagaagatg gatttaaata ttttgcccca gctaatacac ttgatgaaaa cctagaagga 5760

gaagcaattg attttactgg aaaattaatt attgacgaaa atatttatta ttttgatgat 5820

aattatagag gagctgtaga atggaaagaa ttagatggtg aaatgcacta ttttagccca 5880

gaaacaggta aagcttttaa aggtctaaat caaataggtg attataaata ctatttcaat 5940

tctgatggag ttatgcaaaa aggatttgtt agtataaatg ataataaaca ctattttgat 6000

gattctggtg ttatgaaagt aggttacact gaaatagatg gcaagcattt ctactttgct 6060

gaaaacggag aaatgcaaat aggagtattt aatacagaag atggatttaa atattttgct 6120

catcataatg aagatttagg aaatgaagaa ggtgaagaaa tctcatattc tggtatatta 6180

aatttcaata ataaaattta ctattttgat gattcattta ctgctgtagt tggatggaaa 6240

gatttagagg atggttcaaa gtattatttt gatgaagata cagcagaagc atatataggt 6300

ttgtcattaa taaatgatgg tcaatattat tttaatgatg atggaattat gcaagttgga 6360

tttgtcacta taaatgataa agtcttctac ttctctgact ctggaattat agaatctgga 6420

gtacaaaaca tagatgacaa ttatttctat atagatgata atggtatagt tcaaattggt 6480

gtatttgata cttcagatgg atataaatat tttgcacctg ctaatactgt aaatgataat 6540

atttacggac aagcagttga atatagtggt ttagttagag ttggtgaaga tgtatattat 6600

tttggagaaa catatacaat tgagactgga tggatatatg atatggaaaa tgaaagtgat 6660

aaatattatt tcaatccaga aactaaaaaa gcatgcaaag gtattaattt aattgatgat 6720

ataaaatatt attttgatga gaagggcata atgagaacgg gtcttatatc atttgaaaat 6780

aataattatt actttaatga gaatggtgaa atgcaatttg gttatataaa tatagaagat 6840

aagatgttct attttggtga agatggtgtc atgcagattg gagtatttaa tacaccagat 6900

ggatttaaat actttgcaca tcaaaatact ttggatgaga attttgaggg agaatcaata 6960

aactatactg gttggttaga tttagatgaa aagagatatt attttacaga tgaatatatt 7020

gcagcaactg gttcagttat tattgatggt gaggagtatt attttgatcc tgatacagct 7080

caattagtga ttagtgaata g 7101

<210> 14

<211> 7101

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность: TcdB (мутации

D286A D288A C698A)

<400> 14

atgagtttag ttaatagaaa acagttagaa aaaatggcaa atgtaagatt tcgtactcaa 60

gaagatgaat atgttgcaat attggatgct ttagaagaat atcataatat gtcagagaat 120

actgtagtcg aaaaatattt aaaattaaaa gatataaata gtttaacaga tatttatata 180

gatacatata aaaaatctgg tagaaataaa gccttaaaaa aatttaagga atatctagtt 240

acagaagtat tagagctaaa gaataataat ttaactccag ttgagaaaaa tttacatttt 300

gtttggattg gaggtcaaat aaatgacact gctattaatt atataaatca atggaaagat 360

gtaaatagtg attataatgt taatgttttt tatgatagta atgcattttt gataaacaca 420

ttgaaaaaaa ctgtagtaga atcagcaata aatgatacac ttgaatcatt tagagaaaac 480

ttaaatgacc ctagatttga ctataataaa ttcttcagaa aacgtatgga aataatttat 540

gataaacaga aaaatttcat aaactactat aaagctcaaa gagaagaaaa tcctgaactt 600

ataattgatg atattgtaaa gacatatctt tcaaatgagt attcaaagga gatagatgaa 660

cttaatacct atattgaaga atccttaaat aaaattacac agaatagtgg aaatgatgtt 720

agaaactttg aagaatttaa aaatggagag tcattcaact tatatgaaca agagttggta 780

gaaaggtgga atttagctgc tgcttctgac atattaagaa tatctgcatt aaaagaaatt 840

ggtggtatgt atttagcagt tgcaatgtta ccaggaatac aaccagactt atttgagtct 900

atagagaaac ctagttcagt aacagtggat ttttgggaaa tgacaaagtt agaagctata 960

atgaaataca aagaatatat accagaatat acctcagaac attttgacat gttagacgaa 1020

gaagttcaaa gtagttttga atctgttcta gcttctaagt cagataaatc agaaatattc 1080

tcatcacttg gtgatatgga ggcatcacca ctagaagtta aaattgcatt taatagtaag 1140

ggtattataa atcaagggct aatttctgtg aaagactcat attgtagcaa tttaatagta 1200

aaacaaatcg agaatagata taaaatattg aataatagtt taaatccagc tattagcgag 1260

gataatgatt ttaatactac aacgaatacc tttattgata gtataatggc tgaagctaat 1320

gcagataatg gtagatttat gatggaacta ggaaagtatt taagagttgg tttcttccca 1380

gatgttaaaa ctactattaa cttaagtggc cctgaagctt atgcggcagc ttatcaagat 1440

ttattaatgt ttaaagaagg cagtatgaat atccatttga tagaagctga tttaagaaac 1500

tttgaaatct ctaaaactaa tatttctcaa tcaactgaac aagaaatggc ttctttatgg 1560

tcatttgacg atgcaagagc taaagctcaa tttgaagaat ataaaaggaa ttattttgaa 1620

ggttctcttg gtgaagatga taatcttgat ttttctcaaa atatagtagt tgacaaggag 1680

tatcttttag aaaaaatatc ttcattagca agaagttcag agagaggata tatacactat 1740

attgttcagt tacaaggaga taaaattagt tatgaagcag catgtaactt atttgcaaag 1800

actccttatg atagtgtact gtttcagaaa aatatagaag attcagaaat tgcatattat 1860

tataatcctg gagatggtga aatacaagaa atagacaagt ataaaattcc aagtataatt 1920

tctgatagac ctaagattaa attaacattt attggtcatg gtaaagatga atttaatact 1980

gatatatttg caggttttga tgtagattca ttatccacag aaatagaagc agcaatagat 2040

ttagctaaag aggatatttc tcctaagtca atagaaataa atttattagg agctaatatg 2100

tttagctact ctatcaacgt agaggagact tatcctggaa aattattact taaagttaaa 2160

gataaaatat cagaattaat gccatctata agtcaagact ctattatagt aagtgcaaat 2220

caatatgaag ttagaataaa tagtgaagga agaagagaat tattggatca ttctggtgaa 2280

tggataaata aagaagaaag tattataaag gatatttcat caaaagaata tatatcattt 2340

aatcctaaag aaaataaaat tacagtaaaa tctaaaaatt tacctgagct atctacatta 2400

ttacaagaaa ttagaaataa ttctaattca agtgatattg aactagaaga aaaagtaatg 2460

ttaacagaat gtgagataaa tgttatttca aatatagata cgcaaattgt tgaggaaagg 2520

attgaagaag ctaagaattt aacttctgac tctattaatt atataaaaga tgaatttaaa 2580

ctaatagaat ctatttctga tgcactatgt gacttaaaac aacagaatga attagaagat 2640

tctcatttta tatcttttga ggacatatca gagactgatg agggatttag tataagattt 2700

attaataaag aaactggaga atctatattt gtagaaactg aaaaaacaat attctctgaa 2760

tatgctaatc atataactga agagatttct aagataaaag gtactatatt tgatactgta 2820

aatggtaagt tagtaaaaaa agtaaattta gatactacac acgaagtaaa tactttaaat 2880

gctgcatttt ttatacaatc attaatagaa tataatagtt ctaaagaatc tcttagtaat 2940

ttaagtgtag caatgaaagt ccaagtttac gctcaattat ttagtactgg tttaaatact 3000

attacagatg cagccaaagt tgttgaatta gtatcaactg cattagatga aactatagac 3060

ttacttccta cattatctga aggattacct ataattgcaa ctattataga tggtgtaagt 3120

ttaggtgcag caatcaaaga gctaagtgaa acgagtgacc cattattaag acaagaaata 3180

gaagctaaga taggtataat ggcagtaaat ttaacaacag ctacaactgc aatcattact 3240

tcatctttgg ggatagctag tggatttagt atacttttag ttcctttagc aggaatttca 3300

gcaggtatac caagcttagt aaacaatgaa cttgtacttc gagataaggc aacaaaggtt 3360

gtagattatt ttaaacatgt ttcattagtt gaaactgaag gagtatttac tttattagat 3420

gataaaataa tgatgccaca agatgattta gtgatatcag aaatagattt taataataat 3480

tcaatagttt taggtaaatg tgaaatctgg agaatggaag gtggttcagg tcatactgta 3540

actgatgata tagatcactt cttttcagca ccatcaataa catatagaga gccacactta 3600

tctatatatg acgtattgga agtacaaaaa gaagaacttg atttgtcaaa agatttaatg 3660

gtattaccta atgctccaaa tagagtattt gcttgggaaa caggatggac accaggttta 3720

agaagcttag aaaatgatgg cacaaaactg ttagaccgta taagagataa ctatgaaggt 3780

gagttttatt ggagatattt tgcttttata gctgatgctt taataacaac attaaaacca 3840

agatatgaag atactaatat aagaataaat ttagatagta atactagaag ttttatagtt 3900

ccaataataa ctacagaata tataagagaa aaattatcat attctttcta tggttcagga 3960

ggaacttatg cattgtctct ttctcaatat aatatgggta taaatataga attaagtgaa 4020

agtgatgttt ggattataga tgttgataat gttgtgagag atgtaactat agaatctgat 4080

aaaattaaaa aaggtgattt aatagaaggt attttatcta cactaagtat tgaagagaat 4140

aaaattatct taaatagcca tgagattaat ttttctggtg aggtaaatgg aagtaatgga 4200

tttgtttctt taacattttc aattttagaa ggaataaatg caattataga agttgattta 4260

ttatctaaat catataaatt acttatttct ggcgaattaa aaatattgat gttaaattca 4320

aatcatattc aacagaaaat agattatata ggattcaata gcgaattaca gaaaaatata 4380

ccatatagct ttgtagatag tgaaggaaaa gagaatggtt ttattaatgg ttcaacaaaa 4440

gaaggtttat ttgtatctga attacctgat gtagttctta taagtaaggt ttatatggat 4500

gatagtaagc cttcatttgg atattatagt aataatttga aagatgtcaa agttataact 4560

aaagataatg ttaatatatt aacaggttat tatcttaagg atgatataaa aatctctctt 4620

tctttgactc tacaagatga aaaaactata aagttaaata gtgtgcattt agatgaaagt 4680

ggagtagctg agattttgaa gttcatgaat agaaaaggta atacaaatac ttcagattct 4740

ttaatgagct ttttagaaag tatgaatata aaaagtattt tcgttaattt cttacaatct 4800

aatattaagt ttatattaga tgctaatttt ataataagtg gtactacttc tattggccaa 4860

tttgagttta tttgtgatga aaatgataat atacaaccat atttcattaa gtttaataca 4920

ctagaaacta attatacttt atatgtagga aatagacaaa atatgatagt ggaaccaaat 4980

tatgatttag atgattctgg agatatatct tcaactgtta tcaatttctc tcaaaagtat 5040

ctttatggaa tagacagttg tgttaataaa gttgtaattt caccaaatat ttatacagat 5100

gaaataaata taacgcctgt atatgaaaca aataatactt atccagaagt tattgtatta 5160

gatgcaaatt atataaatga aaaaataaat gttaatatca atgatctatc tatacgatat 5220

gtatggagta atgatggtaa tgattttatt cttatgtcaa ctagtgaaga aaataaggtg 5280

tcacaagtta aaataagatt cgttaatgtt tttaaagata agactttggc aaataagcta 5340

tcttttaact ttagtgataa acaagatgta cctgtaagtg aaataatctt atcatttaca 5400

ccttcatatt atgaggatgg attgattggc tatgatttgg gtctagtttc tttatataat 5460

gagaaatttt atattaataa ctttggaatg atggtatctg gattaatata tattaatgat 5520

tcattatatt attttaaacc accagtaaat aatttgataa ctggatttgt gactgtaggc 5580

gatgataaat actactttaa tccaattaat ggtggagctg cttcaattgg agagacaata 5640

attgatgaca aaaattatta tttcaaccaa agtggagtgt tacaaacagg tgtatttagt 5700

acagaagatg gatttaaata ttttgcccca gctaatacac ttgatgaaaa cctagaagga 5760

gaagcaattg attttactgg aaaattaatt attgacgaaa atatttatta ttttgatgat 5820

aattatagag gagctgtaga atggaaagaa ttagatggtg aaatgcacta ttttagccca 5880

gaaacaggta aagcttttaa aggtctaaat caaataggtg attataaata ctatttcaat 5940

tctgatggag ttatgcaaaa aggatttgtt agtataaatg ataataaaca ctattttgat 6000

gattctggtg ttatgaaagt aggttacact gaaatagatg gcaagcattt ctactttgct 6060

gaaaacggag aaatgcaaat aggagtattt aatacagaag atggatttaa atattttgct 6120

catcataatg aagatttagg aaatgaagaa ggtgaagaaa tctcatattc tggtatatta 6180

aatttcaata ataaaattta ctattttgat gattcattta ctgctgtagt tggatggaaa 6240

gatttagagg atggttcaaa gtattatttt gatgaagata cagcagaagc atatataggt 6300

ttgtcattaa taaatgatgg tcaatattat tttaatgatg atggaattat gcaagttgga 6360

tttgtcacta taaatgataa agtcttctac ttctctgact ctggaattat agaatctgga 6420

gtacaaaaca tagatgacaa ttatttctat atagatgata atggtatagt tcaaattggt 6480

gtatttgata cttcagatgg atataaatat tttgcacctg ctaatactgt aaatgataat 6540

atttacggac aagcagttga atatagtggt ttagttagag ttggtgaaga tgtatattat 6600

tttggagaaa catatacaat tgagactgga tggatatatg atatggaaaa tgaaagtgat 6660

aaatattatt tcaatccaga aactaaaaaa gcatgcaaag gtattaattt aattgatgat 6720

ataaaatatt attttgatga gaagggcata atgagaacgg gtcttatatc atttgaaaat 6780

aataattatt actttaatga gaatggtgaa atgcaatttg gttatataaa tatagaagat 6840

aagatgttct attttggtga agatggtgtc atgcagattg gagtatttaa tacaccagat 6900

ggatttaaat actttgcaca tcaaaatact ttggatgaga attttgaggg agaatcaata 6960

aactatactg gttggttaga tttagatgaa aagagatatt attttacaga tgaatatatt 7020

gcagcaactg gttcagttat tattgatggt gaggagtatt attttgatcc tgatacagct 7080

caattagtga ttagtgaata g 7101

<210> 15

<211> 2710

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 15

Met Ser Leu Ile Ser Lys Glu Glu Leu Ile Lys Leu Ala Tyr Ser Ile

1 5 10 15

Arg Pro Arg Glu Asn Glu Tyr Lys Thr Ile Leu Thr Asn Leu Asp Glu

20 25 30

Tyr Asn Lys Leu Thr Thr Asn Asn Asn Glu Asn Lys Tyr Leu Gln Leu

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asp Val Phe Met Asn Lys Tyr Lys Asn

50 55 60

Ser Ser Arg Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu Lys Lys Asp Ile Leu Lys

65 70 75 80

Glu Val Ile Leu Ile Lys Asn Ser Asn Thr Ser Pro Val Glu Lys Asn

85 90 95

Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Glu Val Ser Asp Ile Ala Leu Glu

100 105 110

Tyr Ile Lys Gln Trp Ala Asp Ile Asn Ala Glu Tyr Asn Ile Lys Leu

115 120 125

Trp Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Leu Val Asn Thr Leu Lys Lys Ala Ile

130 135 140

Val Glu Ser Ser Thr Thr Glu Ala Leu Gln Leu Leu Glu Glu Glu Ile

145 150 155 160

Gln Asn Pro Gln Phe Asp Asn Met Lys Phe Tyr Lys Lys Arg Met Glu

165 170 175

Phe Ile Tyr Asp Arg Gln Lys Arg Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ser Gln

180 185 190

Ile Asn Lys Pro Thr Val Pro Thr Ile Asp Asp Ile Ile Lys Ser His

195 200 205

Leu Val Ser Glu Tyr Asn Arg Asp Glu Thr Leu Leu Glu Ser Tyr Arg

210 215 220

Thr Asn Ser Leu Arg Lys Ile Asn Ser Asn His Gly Ile Asp Ile Arg

225 230 235 240

Ala Asn Ser Leu Phe Thr Glu Gln Glu Leu Leu Asn Ile Tyr Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Leu Asn Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Val Arg

260 265 270

Leu Leu Ala Leu Lys Asn Phe Gly Gly Val Tyr Leu Asp Val Asp Met

275 280 285

Leu Pro Gly Ile His Ser Asp Leu Phe Lys Thr Ile Pro Arg Pro Ser

290 295 300

Ser Ile Gly Leu Asp Arg Trp Glu Met Ile Lys Leu Glu Ala Ile Met

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Tyr Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Asp Lys

325 330 335

Leu Asp Gln Gln Leu Lys Asp Asn Phe Lys Leu Ile Ile Glu Ser Lys

340 345 350

Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe Ser Lys Leu Glu Asn Leu Asn Val Ser

355 360 365

Asp Leu Glu Ile Lys Ile Ala Phe Ala Leu Gly Ser Val Ile Asn Gln

370 375 380

Ala Leu Ile Ser Lys Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Asn Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

Gln Val Lys Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Asn Gln His Leu Asn Pro Ala

405 410 415

Ile Glu Ser Asp Asn Asn Phe Thr Asp Thr Thr Lys Ile Phe His Asp

420 425 430

Ser Leu Phe Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asn Ser Met Phe Leu Thr Lys

435 440 445

Ile Ala Pro Tyr Leu Gln Val Gly Phe Met Pro Glu Ala Arg Ser Thr

450 455 460

Ile Ser Leu Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Ala Ser Ala Tyr Tyr Asp Phe

465 470 475 480

Ile Asn Leu Gln Glu Asn Thr Ile Glu Lys Thr Leu Lys Ala Ser Asp

485 490 495

Leu Ile Glu Phe Lys Phe Pro Glu Asn Asn Leu Ser Gln Leu Thr Glu

500 505 510

Gln Glu Ile Asn Ser Leu Trp Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ala Lys Tyr

515 520 525

Gln Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Tyr Thr Gly Gly Ser Leu Ser Glu

530 535 540

Asp Asn Gly Val Asp Phe Asn Lys Asn Thr Ala Leu Asp Lys Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Asn Asn Lys Ile Pro Ser Asn Asn Val Glu Glu Ala Gly Ser

565 570 575

Lys Asn Tyr Val His Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Gly Asp Asp Ile Ser

580 585 590

Tyr Glu Ala Thr Cys Asn Leu Phe Ser Lys Asn Pro Lys Asn Ser Ile

595 600 605

Ile Ile Gln Arg Asn Met Asn Glu Ser Ala Lys Ser Tyr Phe Leu Ser

610 615 620

Asp Asp Gly Glu Ser Ile Leu Glu Leu Asn Lys Tyr Arg Ile Pro Glu

625 630 635 640

Arg Leu Lys Asn Lys Glu Lys Val Lys Val Thr Phe Ile Gly His Gly

645 650 655

Lys Asp Glu Phe Asn Thr Ser Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Asp Ser

660 665 670

Leu Ser Asn Glu Ile Ser Ser Phe Leu Asp Thr Ile Lys Leu Asp Ile

675 680 685

Ser Pro Lys Asn Val Glu Val Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser

690 695 700

Tyr Asp Phe Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Ser

705 710 715 720

Ile Met Asp Lys Ile Thr Ser Thr Leu Pro Asp Val Asn Lys Asp Ser

725 730 735

Ile Thr Ile Gly Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly

740 745 750

Arg Lys Glu Leu Leu Ala His Ser Gly Lys Trp Ile Asn Lys Glu Glu

755 760 765

Ala Ile Met Ser Asp Leu Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Phe Phe Asp Ser

770 775 780

Ile Asp Asn Lys Leu Lys Ala Lys Ser Lys Asn Ile Pro Gly Leu Ala

785 790 795 800

Ser Ile Ser Glu Asp Ile Lys Thr Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val Ser

805 810 815

Pro Asp Thr Lys Phe Ile Leu Asn Asn Leu Lys Leu Asn Ile Glu Ser

820 825 830

Ser Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Glu Lys Leu Glu Pro Val Lys Asn

835 840 845

Ile Ile His Asn Ser Ile Asp Asp Leu Ile Asp Glu Phe Asn Leu Leu

850 855 860

Glu Asn Val Ser Asp Glu Leu Tyr Glu Leu Lys Lys Leu Asn Asn Leu

865 870 875 880

Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Lys Asn Asn Ser

885 890 895

Thr Tyr Ser Val Arg Phe Ile Asn Lys Ser Asn Gly Glu Ser Val Tyr

900 905 910

Val Glu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Ser Lys Tyr Ser Glu His Ile Thr

915 920 925

Lys Glu Ile Ser Thr Ile Lys Asn Ser Ile Ile Thr Asp Val Asn Gly

930 935 940

Asn Leu Leu Asp Asn Ile Gln Leu Asp His Thr Ser Gln Val Asn Thr

945 950 955 960

Leu Asn Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Asp Tyr Ser Ser Asn

965 970 975

Lys Asp Val Leu Asn Asp Leu Ser Thr Ser Val Lys Val Gln Leu Tyr

980 985 990

Ala Gln Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Tyr Asp Ser Ile Gln

995 1000 1005

Leu Val Asn Leu Ile Ser Asn Ala Val Asn Asp Thr Ile Asn Val

1010 1015 1020

Leu Pro Thr Ile Thr Glu Gly Ile Pro Ile Val Ser Thr Ile Leu

1025 1030 1035

Asp Gly Ile Asn Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Leu Asp Glu

1040 1045 1050

His Asp Pro Leu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ala Lys Val Gly Val

1055 1060 1065

Leu Ala Ile Asn Met Ser Leu Ser Ile Ala Ala Thr Val Ala Ser

1070 1075 1080

Ile Val Gly Ile Gly Ala Glu Val Thr Ile Phe Leu Leu Pro Ile

1085 1090 1095

Ala Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu

1100 1105 1110

Ile Leu His Asp Lys Ala Thr Ser Val Val Asn Tyr Phe Asn His

1115 1120 1125

Leu Ser Glu Ser Lys Glu Tyr Gly Pro Leu Lys Thr Glu Asp Asp

1130 1135 1140

Lys Ile Leu Val Pro Ile Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp

1145 1150 1155

Phe Asn Asn Asn Ser Ile Lys Leu Gly Thr Cys Asn Ile Leu Ala

1160 1165 1170

Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Gly Asn Ile Asp His

1175 1180 1185

Phe Phe Ser Ser Pro Tyr Ile Ser Ser His Ile Pro Ser Leu Ser

1190 1195 1200

Val Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Lys Thr Glu Asn Leu Asp Phe Ser

1205 1210 1215

Lys Lys Ile Met Met Leu Pro Asn Ala Pro Ser Arg Val Phe Trp

1220 1225 1230

Trp Glu Thr Gly Ala Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asn

1235 1240 1245

Gly Thr Lys Leu Leu Asp Ser Ile Arg Asp Leu Tyr Pro Gly Lys

1250 1255 1260

Phe Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala Phe Phe Asp Tyr Ala Ile Thr Thr

1265 1270 1275

Leu Lys Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn Thr Lys Ile Lys Leu Asp

1280 1285 1290

Lys Asp Thr Arg Asn Phe Ile Met Pro Thr Ile Thr Thr Asp Glu

1295 1300 1305

Ile Arg Asn Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Asp Gly Ala Gly Gly Thr

1310 1315 1320

Tyr Ser Leu Leu Leu Ser Ser Tyr Pro Ile Ser Met Asn Ile Asn

1325 1330 1335

Leu Ser Lys Asp Asp Leu Trp Ile Phe Asn Ile Asp Asn Glu Val

1340 1345 1350

Arg Glu Ile Ser Ile Glu Asn Gly Thr Ile Lys Lys Gly Asn Leu

1355 1360 1365

Ile Glu Asp Val Leu Ser Lys Ile Asp Ile Asn Lys Asn Lys Leu

1370 1375 1380

Ile Ile Gly Asn Gln Thr Ile Asp Phe Ser Gly Asp Ile Asp Asn

1385 1390 1395

Lys Asp Arg Tyr Ile Phe Leu Thr Cys Glu Leu Asp Asp Lys Ile

1400 1405 1410

Ser Leu Ile Ile Glu Ile Asn Leu Val Ala Lys Ser Tyr Ser Leu

1415 1420 1425

Leu Leu Ser Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Ile Ser Asn Leu Ser Asn

1430 1435 1440

Thr Ile Glu Lys Ile Asn Thr Leu Gly Leu Asp Ser Lys Asn Ile

1445 1450 1455

Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Glu Ser Asn Asn Lys Tyr Phe Gly Ala

1460 1465 1470

Ile Ser Lys Thr Ser Gln Lys Ser Ile Ile His Tyr Lys Lys Asp

1475 1480 1485

Ser Lys Asn Ile Leu Glu Phe Tyr Asn Gly Ser Thr Leu Glu Phe

1490 1495 1500

Asn Ser Lys Asp Phe Ile Ala Glu Asp Ile Asn Val Phe Met Lys

1505 1510 1515

Asp Asp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Lys Tyr Tyr Val Asp Asn Asn

1520 1525 1530

Thr Asp Lys Ser Ile Asp Phe Ser Ile Ser Leu Val Ser Lys Asn

1535 1540 1545

Gln Val Lys Val Asn Gly Leu Tyr Leu Asn Glu Ser Val Tyr Ser

1550 1555 1560

Ser Tyr Leu Asp Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly His His Asn Thr

1565 1570 1575

Ser Asn Phe Met Asn Leu Phe Leu Asn Asn Ile Ser Phe Trp Lys

1580 1585 1590

Leu Phe Gly Phe Glu Asn Ile Asn Phe Val Ile Asp Lys Tyr Phe

1595 1600 1605

Thr Leu Val Gly Lys Thr Asn Leu Gly Tyr Val Glu Phe Ile Cys

1610 1615 1620

Asp Asn Asn Lys Asn Ile Asp Ile Tyr Phe Gly Glu Trp Lys Thr

1625 1630 1635

Ser Ser Ser Lys Ser Thr Ile Phe Ser Gly Asn Gly Arg Asn Val

1640 1645 1650

Val Val Glu Pro Ile Tyr Asn Pro Asp Thr Gly Glu Asp Ile Ser

1655 1660 1665

Thr Ser Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Pro Leu Tyr Gly Ile Asp Arg

1670 1675 1680

Tyr Ile Asn Lys Val Leu Ile Ala Pro Asp Leu Tyr Thr Ser Leu

1685 1690 1695

Ile Asn Ile Asn Thr Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Tyr Tyr Pro Glu

1700 1705 1710

Ile Ile Val Leu Asn Pro Asn Thr Phe His Lys Lys Val Asn Ile

1715 1720 1725

Asn Leu Asp Ser Ser Ser Phe Glu Tyr Lys Trp Ser Thr Glu Gly

1730 1735 1740

Ser Asp Phe Ile Leu Val Arg Tyr Leu Glu Glu Ser Asn Lys Lys

1745 1750 1755

Ile Leu Gln Lys Ile Arg Ile Lys Gly Ile Leu Ser Asn Thr Gln

1760 1765 1770

Ser Phe Asn Lys Met Ser Ile Asp Phe Lys Asp Ile Lys Lys Leu

1775 1780 1785

Ser Leu Gly Tyr Ile Met Ser Asn Phe Lys Ser Phe Asn Ser Glu

1790 1795 1800

Asn Glu Leu Asp Arg Asp His Leu Gly Phe Lys Ile Ile Asp Asn

1805 1810 1815

Lys Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu

1820 1825 1830

Ile Asn Ile Asn Asn Ser Leu Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Ser

1835 1840 1845

Asn Leu Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr

1850 1855 1860

Phe Asp Ile Asn Thr Gly Ala Ala Ser Thr Ser Tyr Lys Ile Ile

1865 1870 1875

Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asn Gly Val Met Gln Leu

1880 1885 1890

Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

1895 1900 1905

Asn Thr Gln Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln

1910 1915 1920

Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

1925 1930 1935

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Glu Lys

1940 1945 1950

Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Val Gly Leu Gln

1955 1960 1965

Val Ile Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala Ile

1970 1975 1980

Ile Ser Lys Gly Trp Gln Thr Val Asn Gly Ser Arg Tyr Tyr Phe

1985 1990 1995

Asp Thr Asp Thr Ala Ile Ala Phe Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp

2000 2005 2010

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asp Ser Asp Cys Val Val Lys Ile Gly

2015 2020 2025

Val Phe Ser Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2030 2035 2040

Thr Tyr Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Ser

2045 2050 2055

Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn

2060 2065 2070

Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr

2090 2095 2100

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala

2105 2110 2115

Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn

2120 2125 2130

Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Asn Gly

2135 2140 2145

Lys Tyr Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val

2150 2155 2160

Phe Lys Val Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr

2165 2170 2175

His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys

2180 2185 2190

Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser

2195 2200 2205

Lys Ala Ile Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr

2210 2215 2220

Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Thr His Leu Cys Thr Ile

2225 2230 2235

Asn Asn Asp Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Asp Gly Ile Leu Gln Asn

2240 2245 2250

Gly Tyr Ile Thr Ile Glu Arg Asn Asn Phe Tyr Phe Asp Ala Asn

2255 2260 2265

Asn Glu Ser Lys Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly

2270 2275 2280

Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu

2285 2290 2295

Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly

2300 2305 2310

Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp

2315 2320 2325

Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala

2330 2335 2340

Val Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Glu Lys Tyr Tyr

2345 2350 2355

Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

2360 2365 2370

Asp Gly Lys Arg Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Tyr Ile Ala Ser

2375 2380 2385

Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr

2390 2395 2400

Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe

2405 2410 2415

Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly

2420 2425 2430

Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

2435 2440 2445

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg

2450 2455 2460

Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val

2465 2470 2475

Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe

2480 2485 2490

Asn Thr Asn Thr Tyr Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser

2495 2500 2505

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly

2510 2515 2520

Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2525 2530 2535

Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn

2540 2545 2550

Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asp

2555 2560 2565

Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Ala Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr

2570 2575 2580

Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr

2585 2590 2595

Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile

2600 2605 2610

Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

2615 2620 2625

Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Asp Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln

2630 2635 2640

Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn

2645 2650 2655

Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Ser Lys Val

2660 2665 2670

Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

2675 2680 2685

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val

2690 2695 2700

Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

2705 2710

<210> 16

<211> 8133

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<400> 16

atgtctttaa tatctaaaga agagttaata aaactcgcat atagcattag accaagagaa 60

aatgagtata aaactatact aactaattta gacgaatata ataagttaac tacaaacaat 120

aatgaaaata aatatttaca attaaaaaaa ctaaatgaat caattgatgt ttttatgaat 180

aaatataaaa attcaagcag aaatagagca ctctctaatc taaaaaaaga tatattaaaa 240

gaagtaattc ttattaaaaa ttccaataca agtcctgtag aaaaaaattt acattttgta 300

tggataggtg gagaagtcag tgatattgct cttgaataca taaaacaatg ggctgatatt 360

aatgcagaat ataatattaa actgtggtat gatagtgaag cattcttagt caatacacta 420

aaaaaggcta tagttgaatc ttctaccact gaagcattac agctactaga ggaagagatt 480

caaaatcctc aatttgataa tatgaaattt tacaaaaaaa ggatggaatt tatatatgat 540

agacaaaaaa ggtttataaa ttattataaa tctcaaatca ataaacctac agtacctaca 600

atagatgata ttataaagtc tcatctagta tctgaatata atagagatga aactttatta 660

gaatcatata gaacaaattc tttgagaaaa ataaatagta atcatgggat agatatcagg 720

gctaatagtt tgtttacaga acaagagtta ttaaatattt atagtcagga gttgttaaat 780

cgtgggaatt tagctgcagc atctgacata gtaagattat tagccctaaa aaattttggc 840

ggagtatatt tagatgttga tatgcttcca ggtattcact ctgatttatt taaaacaata 900

cctagaccta gctctattgg actagaccgt tgggaaatga taaaattaga ggctattatg 960

aagtataaaa aatatataaa taattataca tcagaaaact ttgataaact tgatcaacaa 1020

ttaaaagata attttaaact cattatagaa agtaaaagtg aaaaatctga gatattttct 1080

aaattagaaa atttaaatgt atctgatctt gaaattaaaa tagctttcgc tttaggcagt 1140

gttataaatc aagccttgat atcaaaacaa ggttcatatc ttactaacct agtaatagaa 1200

caagtaaaaa atagatatca atttttaaac caacacctta acccagccat agagtctgac 1260

aataacttca cagatactac taagattttt catgattcac tatttaattc agctaccgca 1320

gaaaactcta tgtttttaac aaaaatagca ccatacttac aagtaggttt tatgccagaa 1380

gctcgctcca caataagttt aagtggtcca ggagcttatg catcagctta ctatgatttc 1440

ataaatttac aagaaaatac tatagaaaaa actttaaaag catcagattt aatagaattt 1500

aaattcccag aaaataatct atctcaattg acagaacaag aaataaatag tctatggagc 1560

tttgatcaag caagtgcaaa atatcaattt gagaaatatg taagagatta tactggtgga 1620

tctctttctg aagacaatgg ggtagacttt aataaaaata ctgccctcga caaaaactat 1680

ttattaaata ataaaattcc atcaaacaat gtagaagaag ctggaagtaa aaattatgtt 1740

cattatatca tacagttaca aggagatgat ataagttatg aagcaacatg caatttattt 1800

tctaaaaatc ctaaaaatag tattattata caacgaaata tgaatgaaag tgcaaaaagt 1860

tactttttaa gtgatgatgg agaatctatt ttagaattaa ataaatatag gatacctgaa 1920

agattaaaaa ataaggaaaa agtaaaagta acctttattg gacatggtaa agatgaattc 1980

aacacaagcg aatttgctag attaagtgta gattcacttt ccaatgagat aagttcattt 2040

ttagatacca taaaattaga tatatcacct aaaaatgtag aagtaaactt gcttggatgt 2100

aatatgttta gttatgattt taatgttgaa gaaacttatc ctggtaagtt actattaagt 2160

attatggaca aaattacttc cactttacct gatgtaaata aagattctat tactatagga 2220

gcaaatcaat atgaagtaag aattaatagt gagggaagaa aagaacttct agctcactca 2280

ggtaaatgga taaataaaga ggaagctatt atgagcgatt tatctagtaa agaatacatt 2340

ttttttgatt ccatagataa taagctaaaa gcaaagtcca agaatattcc aggtttagcg 2400

tcaatatcag aagatataaa aacattatta cttgatgcaa gtgttagtcc tgatacaaaa 2460

tttattttaa ataatcttaa gcttaatatt gaatcttcta ttggtgatta catttattat 2520

gaaaaattag aacctgttaa aaatataatc cacaattcta tagatgattt aatagatgag 2580

ttcaatctac ttgaaaatgt atctgatgaa ttatatgaat taaaaaaatt aaataatcta 2640

gatgagaagt atttaatatc ttttgaagat atctcaaaaa ataattcaac ttattctgta 2700

agatttatta acaaaagtaa tggtgaatca gtttatgtag agacagaaaa agaaattttt 2760

tcaaaatata gcgaacatat tacaaaagaa ataagtacta taaagaatag tataattaca 2820

gatgttaatg gtaatttatt ggataatata cagttagatc atacttctca agttaataca 2880

ttaaacgcag cattctttat tcaatcatta atagattata gtagcaataa agatgtactg 2940

aatgatttaa gtacctcagt taaggttcaa ctttatgctc aactatttag tacaggttta 3000

aatactatat atgactctat ccaattagta aatttaatat caaatgcagt aaatgatact 3060

ataaatgtac tacctacaat aacagagggg atacctattg tatctactat attagacgga 3120

ataaacttag gtgcagcaat taaggaatta ctagacgaac atgacccatt actaaaaaaa 3180

gaactagaag ctaaggtggg tgttttagca ataaatatgt cattatctat agctgcaacg 3240

gtagcttcaa ttgttggaat aggtgctgaa gttactattt tcttattacc tatagctggt 3300

atatctgcgg gaataccttc attagttaat aatgaattaa tattgcatga taaggcaact 3360

tcagtggtaa actattttaa tcatttgtct gaatctaaag aatatggccc tcttaaaaca 3420

gaagatgata aaattttagt tcctattgat gatttagtaa tatcagaaat agattttaat 3480

aataattcga taaaactagg aacatgtaat atattagcaa tggagggggg atcaggacac 3540

acagtgactg gtaatataga tcactttttc tcatctccat atataagctc tcatattcct 3600

tcattatcag tttattctgc aataggtata aaaacagaaa atctagattt ttcaaaaaaa 3660

ataatgatgt taccaaatgc tccttcaaga gtgttttggt gggaaactgg agcagttcca 3720

ggtttaagat cattggaaaa taatgggact aaattgcttg attcaataag agatttatac 3780

ccaggcaaat tttactggag attctatgcc tttttcgatt atgcaataac tacattaaaa 3840

ccagtgtatg aagacactaa tactaaaatt aaactagata aagatactag aaactttata 3900

atgccaacta taactactga cgaaattaga aacaaattat cttattcatt tgatggagca 3960

ggaggaactt actctttatt attatcttca tatccaatat caatgaatat aaatttatct 4020

aaagatgatt tatggatatt taatattgat aatgaagtaa gagaaatatc tatagaaaat 4080

ggtactatta aaaaaggaaa tttaatagaa gatgttttaa gtaaaattga tataaataaa 4140

aataaactta ttataggcaa tcaaacaata gatttttcag gtgatataga taacaaagat 4200

agatatatat tcttgacttg tgagttagat gataaaatta gtttaataat agaaataaat 4260

cttgttgcaa aatcttatag tttgttattg tctggggata aaaattattt gatatccaat 4320

ttatctaata ctattgagaa aatcaatact ttaggcctag atagtaaaaa tatagcttac 4380

aattacactg atgaatctaa taataaatat tttggagcta tatctaaaac aagtcaaaaa 4440

agcataatac attataaaaa agacagtaaa aatatattag aattttataa tggcagtaca 4500

ttagaattta acagtaaaga ctttattgct gaagatataa atgtatttat gaaagatgat 4560

attaatacta taacaggaaa atactatgtt gataataata ctgataaaag tatagatttc 4620

tctatttctt tagttagtaa aaatcaagta aaagtaaatg gattatattt aaatgaatcc 4680

gtatactcat cttaccttga ttttgtgaaa aattcagatg gacaccataa tacttctaat 4740

tttatgaatt tatttttgaa caatataagt ttctggaaat tgtttgggtt tgaaaatata 4800

aattttgtaa tcgataaata ctttaccctt gttggtaaaa ctaatcttgg atatgtagaa 4860

tttatttgtg acaataataa aaatatagat atatattttg gtgaatggaa aacatcgtca 4920

tctaaaagca ctatatttag cggaaatggt agaaatgttg tagtagagcc tatatataat 4980

cctgatacgg gtgaagatat atctacttca ctagattttt cctatgaacc tctctatgga 5040

atagatagat atatcaataa agtattgata gcacctgatt tatatacaag tttaataaat 5100

attaatacca attattattc aaatgagtac taccctgaga ttatagttct taacccaaat 5160

acattccaca aaaaagtaaa tataaattta gatagttctt cttttgagta taaatggtct 5220

acagaaggaa gtgactttat tttagttaga tacttagaag aaagtaataa aaaaatatta 5280

caaaaaataa gaatcaaagg tatcttatct aatactcaat catttaataa aatgagtata 5340

gattttaaag atattaaaaa actatcatta ggatatataa tgagtaattt taaatcattt 5400

aattctgaaa atgaattaga tagagatcat ttaggattta aaataataga taataaaact 5460

tattactatg atgaagatag taaattagtt aaaggattaa tcaatataaa taattcatta 5520

ttctattttg atcctataga atctaactta gtaactggat ggcaaactat caatggtaaa 5580

aaatattatt ttgatataaa tactggagca gcttcaacta gttataaaat tattaatggt 5640

aaacactttt attttaataa taatggtgtg atgcagttag gagtatttaa aggacctgat 5700

ggatttgagt attttgcacc tgccaatact cagaataata acatagaagg tcaggctata 5760

gtttatcaaa gtaaattctt aactttgaat ggcaaaaaat attattttga taatgactca 5820

aaagcagtca ctggatggag gattattaac aatgagaaat attactttaa tcctaataat 5880

gctattgctg cagtcggatt gcaagtaatt gacaataata agtattattt caatcctgac 5940

actgctatca tctcaaaagg ttggcagact gttaatggta gtagatacta ctttgatact 6000

gataccgcta ttgcctttaa tggttataaa actattgatg gtaaacactt ttattttgat 6060

agtgattgtg tagtgaaaat aggtgtgttt agtggctcta atggatttga atatttcgca 6120

cctgctaata cttataataa taacatagaa ggtcaggcta tagtttatca aagtaaattc 6180

ttaactttga atggtaaaaa atattacttt gataataact caaaagcagt taccggatgg 6240

caaactattg atagtaaaaa atattacttt aatactaaca ctgctgaagc agctactgga 6300

tggcaaacta ttgatggtaa aaagtattac tttaatacta acactgctga agcagctact 6360

ggatggcaaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacacttc tatagcttca 6420

actggttata caattattaa tggtaaatat ttttatttta atactgatgg tattatgcag 6480

ataggagtgt ttaaagtacc taatggattt gaatactttg cacctgctaa tactcataat 6540

aataacatag aaggtcaagc tatactttac caaaataaat tcttaacttt gaatggtaaa 6600

aaatattact ttggtagtga ctcaaaagca attactggat ggcaaaccat tgatggtaaa 6660

aaatattact ttaatcctaa taatgctatt gctgcgactc atctatgcac tataaataac 6720

gacaagtatt actttagtta tgatggaatt cttcaaaatg gatatattac tattgaaaga 6780

aataatttct attttgatgc taataatgaa tctaaaatgg taacaggagt atttaaagga 6840

cctaatggat ttgagtattt tgcacctgct aatactcata ataataacat agaaggtcag 6900

gctatagttt accagaataa attcttaact ttgaatggca aaaaatatta ttttgataat 6960

gactcaaaag cagttactgg atggcaaact attgatagta aaaaatatta ctttaatctt 7020

aacactgctg ttgcagttac tggatggcaa actattgatg gtgaaaaata ttactttaat 7080

cttaacactg ctgaagcagc tactggatgg caaactattg atggtaaaag atactacttt 7140

aatactaaca cttatatagc ttcaactggt tatacgatta ttaatggtaa acatttttat 7200

tttaatactg atggtattat gcagatagga gtgtttaaag gacctgatgg atttgaatac 7260

tttgcacctg ctaatactca taataataac atagaaggtc aagctatact ttaccaaaat 7320

aaattcttaa ctttgaatgg taaaaaatat tactttggta gtgactcaaa agcagttacc 7380

ggattgcgaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tgttgcagtt 7440

actggatggc aaactattaa tggtaaaaaa tactacttta atactaacac ttatatagct 7500

tcaactggtt atacaattat tagtggtaaa catttttatt ttaatactga tggtattatg 7560

cagataggag tgtttaaagg acctgatgga tttgaatact ttgcacctgc taatacggat 7620

gctaacaaca tagaaggtca agctatacgt tatcaaaata gattcctata tttacatgac 7680

aatatatatt actttggcaa tgattcaaaa gcggctactg gttgggcaac tattgatggt 7740

aatagatatt acttcgagcc taatacagct atgggtgcga atggttataa aactattgat 7800

aataaaaatt tttactttag aaatggttta cctcagatag gagtgtttaa aggacctaat 7860

ggatttgaat actttgcacc tgctaatacg gatgctaaca atatagatgg tcaagctata 7920

cgttatcaaa atagattcct acatttactt ggaaaaatat attactttgg taataactca 7980

aaagcagtta ctggatggca aactattaat agtaaagtat attactttat gcctgatact 8040

gctatggctg cagctggtgg acttttcgag attgatggtg ttatatattt ctttggtgtt 8100

gatggagtaa aagcccctgg gatatatggc taa 8133

<210> 17

<211> 2710

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 17

Met Ser Leu Ile Ser Lys Glu Glu Leu Ile Lys Leu Ala Tyr Ser Ile

1 5 10 15

Arg Pro Arg Glu Asn Glu Tyr Lys Thr Ile Leu Thr Asn Leu Asp Glu

20 25 30

Tyr Asn Lys Leu Thr Thr Asn Asn Asn Glu Asn Lys Tyr Leu Gln Leu

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asp Val Phe Met Asn Lys Tyr Lys Asn

50 55 60

Ser Ser Arg Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu Lys Lys Asp Ile Leu Lys

65 70 75 80

Glu Val Ile Leu Ile Lys Asn Ser Asn Thr Ser Pro Val Glu Lys Asn

85 90 95

Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Glu Val Ser Asp Ile Ala Leu Glu

100 105 110

Tyr Ile Lys Gln Trp Ala Asp Ile Asn Ala Glu Tyr Asn Ile Lys Leu

115 120 125

Trp Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Leu Val Asn Thr Leu Lys Lys Ala Ile

130 135 140

Val Glu Ser Ser Thr Thr Glu Ala Leu Gln Leu Leu Glu Glu Glu Ile

145 150 155 160

Gln Asn Pro Gln Phe Asp Asn Met Lys Phe Tyr Lys Lys Arg Met Glu

165 170 175

Phe Ile Tyr Asp Arg Gln Lys Arg Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ser Gln

180 185 190

Ile Asn Lys Pro Thr Val Pro Thr Ile Asp Asp Ile Ile Lys Ser His

195 200 205

Leu Val Ser Glu Tyr Asn Arg Asp Glu Thr Leu Leu Glu Ser Tyr Arg

210 215 220

Thr Asn Ser Leu Arg Lys Ile Asn Ser Asn His Gly Ile Asp Ile Arg

225 230 235 240

Ala Asn Ser Leu Phe Thr Glu Gln Glu Leu Leu Asn Ile Tyr Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Leu Asn Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Val Arg

260 265 270

Leu Leu Ala Leu Lys Asn Phe Gly Gly Val Tyr Leu Asp Val Asp Met

275 280 285

Leu Pro Gly Ile His Ser Asp Leu Phe Lys Thr Ile Pro Arg Pro Ser

290 295 300

Ser Ile Gly Leu Asp Arg Trp Glu Met Ile Lys Leu Glu Ala Ile Met

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Tyr Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Asp Lys

325 330 335

Leu Asp Gln Gln Leu Lys Asp Asn Phe Lys Leu Ile Ile Glu Ser Lys

340 345 350

Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe Ser Lys Leu Glu Asn Leu Asn Val Ser

355 360 365

Asp Leu Glu Ile Lys Ile Ala Phe Ala Leu Gly Ser Val Ile Asn Gln

370 375 380

Ala Leu Ile Ser Lys Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Asn Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

Gln Val Lys Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Asn Gln His Leu Asn Pro Ala

405 410 415

Ile Glu Ser Asp Asn Asn Phe Thr Asp Thr Thr Lys Ile Phe His Asp

420 425 430

Ser Leu Phe Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asn Ser Met Phe Leu Thr Lys

435 440 445

Ile Ala Pro Tyr Leu Gln Val Gly Phe Met Pro Glu Ala Arg Ser Thr

450 455 460

Ile Ser Leu Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Ala Ser Ala Tyr Tyr Asp Phe

465 470 475 480

Ile Asn Leu Gln Glu Asn Thr Ile Glu Lys Thr Leu Lys Ala Ser Asp

485 490 495

Leu Ile Glu Phe Lys Phe Pro Glu Asn Asn Leu Ser Gln Leu Thr Glu

500 505 510

Gln Glu Ile Asn Ser Leu Trp Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ala Lys Tyr

515 520 525

Gln Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Tyr Thr Gly Gly Ser Leu Ser Glu

530 535 540

Asp Asn Gly Val Asp Phe Asn Lys Asn Thr Ala Leu Asp Lys Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Asn Asn Lys Ile Pro Ser Asn Asn Val Glu Glu Ala Gly Ser

565 570 575

Lys Asn Tyr Val His Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Gly Asp Asp Ile Ser

580 585 590

Tyr Glu Ala Thr Cys Asn Leu Phe Ser Lys Asn Pro Lys Asn Ser Ile

595 600 605

Ile Ile Gln Arg Asn Met Asn Glu Ser Ala Lys Ser Tyr Phe Leu Ser

610 615 620

Asp Asp Gly Glu Ser Ile Leu Glu Leu Asn Lys Tyr Arg Ile Pro Glu

625 630 635 640

Arg Leu Lys Asn Lys Glu Lys Val Lys Val Thr Phe Ile Gly His Gly

645 650 655

Lys Asp Glu Phe Asn Thr Ser Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Asp Ser

660 665 670

Leu Ser Asn Glu Ile Ser Ser Phe Leu Asp Thr Ile Lys Leu Asp Ile

675 680 685

Ser Pro Lys Asn Val Glu Val Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser

690 695 700

Tyr Asp Phe Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Ser

705 710 715 720

Ile Met Asp Lys Ile Thr Ser Thr Leu Pro Asp Val Asn Lys Asp Ser

725 730 735

Ile Thr Ile Gly Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly

740 745 750

Arg Lys Glu Leu Leu Ala His Ser Gly Lys Trp Ile Asn Lys Glu Glu

755 760 765

Ala Ile Met Ser Asp Leu Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Phe Phe Asp Ser

770 775 780

Ile Asp Asn Lys Leu Lys Ala Lys Ser Lys Asn Ile Pro Gly Leu Ala

785 790 795 800

Ser Ile Ser Glu Asp Ile Lys Thr Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val Ser

805 810 815

Pro Asp Thr Lys Phe Ile Leu Asn Asn Leu Lys Leu Asn Ile Glu Ser

820 825 830

Ser Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Glu Lys Leu Glu Pro Val Lys Asn

835 840 845

Ile Ile His Asn Ser Ile Asp Asp Leu Ile Asp Glu Phe Asn Leu Leu

850 855 860

Glu Asn Val Ser Asp Glu Leu Tyr Glu Leu Lys Lys Leu Asn Asn Leu

865 870 875 880

Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Lys Asn Asn Ser

885 890 895

Thr Tyr Ser Val Arg Phe Ile Asn Lys Ser Asn Gly Glu Ser Val Tyr

900 905 910

Val Glu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Ser Lys Tyr Ser Glu His Ile Thr

915 920 925

Lys Glu Ile Ser Thr Ile Lys Asn Ser Ile Ile Thr Asp Val Asn Gly

930 935 940

Asn Leu Leu Asp Asn Ile Gln Leu Asp His Thr Ser Gln Val Asn Thr

945 950 955 960

Leu Asn Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Asp Tyr Ser Ser Asn

965 970 975

Lys Asp Val Leu Asn Asp Leu Ser Thr Ser Val Lys Val Gln Leu Tyr

980 985 990

Ala Gln Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Tyr Asp Ser Ile Gln

995 1000 1005

Leu Val Asn Leu Ile Ser Asn Ala Val Asn Asp Thr Ile Asn Val

1010 1015 1020

Leu Pro Thr Ile Thr Glu Gly Ile Pro Ile Val Ser Thr Ile Leu

1025 1030 1035

Asp Gly Ile Asn Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Leu Asp Glu

1040 1045 1050

His Asp Pro Leu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ala Lys Val Gly Val

1055 1060 1065

Leu Ala Ile Asn Met Ser Leu Ser Ile Ala Ala Thr Val Ala Ser

1070 1075 1080

Ile Val Gly Ile Gly Ala Glu Val Thr Ile Phe Leu Leu Pro Ile

1085 1090 1095

Ala Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu

1100 1105 1110

Ile Leu His Asp Lys Ala Thr Ser Val Val Asn Tyr Phe Asn His

1115 1120 1125

Leu Ser Glu Ser Lys Glu Tyr Gly Pro Leu Lys Thr Glu Asp Asp

1130 1135 1140

Lys Ile Leu Val Pro Ile Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp

1145 1150 1155

Phe Asn Asn Asn Ser Ile Lys Leu Gly Thr Cys Asn Ile Leu Ala

1160 1165 1170

Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Gly Asn Ile Asp His

1175 1180 1185

Phe Phe Ser Ser Pro Tyr Ile Ser Ser His Ile Pro Ser Leu Ser

1190 1195 1200

Val Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Lys Thr Glu Asn Leu Asp Phe Ser

1205 1210 1215

Lys Lys Ile Met Met Leu Pro Asn Ala Pro Ser Arg Val Phe Trp

1220 1225 1230

Trp Glu Thr Gly Ala Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asn

1235 1240 1245

Gly Thr Lys Leu Leu Asp Ser Ile Arg Asp Leu Tyr Pro Gly Lys

1250 1255 1260

Phe Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala Phe Phe Asp Tyr Ala Ile Thr Thr

1265 1270 1275

Leu Lys Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn Thr Lys Ile Lys Leu Asp

1280 1285 1290

Lys Asp Thr Arg Asn Phe Ile Met Pro Thr Ile Thr Thr Asp Glu

1295 1300 1305

Ile Arg Asn Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Asp Gly Ala Gly Gly Thr

1310 1315 1320

Tyr Ser Leu Leu Leu Ser Ser Tyr Pro Ile Ser Met Asn Ile Asn

1325 1330 1335

Leu Ser Lys Asp Asp Leu Trp Ile Phe Asn Ile Asp Asn Glu Val

1340 1345 1350

Arg Glu Ile Ser Ile Glu Asn Gly Thr Ile Lys Lys Gly Asn Leu

1355 1360 1365

Ile Glu Asp Val Leu Ser Lys Ile Asp Ile Asn Lys Asn Lys Leu

1370 1375 1380

Ile Ile Gly Asn Gln Thr Ile Asp Phe Ser Gly Asp Ile Asp Asn

1385 1390 1395

Lys Asp Arg Tyr Ile Phe Leu Thr Cys Glu Leu Asp Asp Lys Ile

1400 1405 1410

Ser Leu Ile Ile Glu Ile Asn Leu Val Ala Lys Ser Tyr Ser Leu

1415 1420 1425

Leu Leu Ser Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Ile Ser Asn Leu Ser Asn

1430 1435 1440

Thr Ile Glu Lys Ile Asn Thr Leu Gly Leu Asp Ser Lys Asn Ile

1445 1450 1455

Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Glu Ser Asn Asn Lys Tyr Phe Gly Ala

1460 1465 1470

Ile Ser Lys Thr Ser Gln Lys Ser Ile Ile His Tyr Lys Lys Asp

1475 1480 1485

Ser Lys Asn Ile Leu Glu Phe Tyr Asn Gly Ser Thr Leu Glu Phe

1490 1495 1500

Asn Ser Lys Asp Phe Ile Ala Glu Asp Ile Asn Val Phe Met Lys

1505 1510 1515

Asp Asp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Lys Tyr Tyr Val Asp Asn Asn

1520 1525 1530

Thr Asp Lys Ser Ile Asp Phe Ser Ile Ser Leu Val Ser Lys Asn

1535 1540 1545

Gln Val Lys Val Asn Gly Leu Tyr Leu Asn Glu Ser Val Tyr Ser

1550 1555 1560

Ser Tyr Leu Asp Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly His His Asn Thr

1565 1570 1575

Ser Asn Phe Met Asn Leu Phe Leu Asn Asn Ile Ser Phe Trp Lys

1580 1585 1590

Leu Phe Gly Phe Glu Asn Ile Asn Phe Val Ile Asp Lys Tyr Phe

1595 1600 1605

Thr Leu Val Gly Lys Thr Asn Leu Gly Tyr Val Glu Phe Ile Cys

1610 1615 1620

Asp Asn Asn Lys Asn Ile Asp Ile Tyr Phe Gly Glu Trp Lys Thr

1625 1630 1635

Ser Ser Ser Lys Ser Thr Ile Phe Ser Gly Asn Gly Arg Asn Val

1640 1645 1650

Val Val Glu Pro Ile Tyr Asn Pro Asp Thr Gly Glu Asp Ile Ser

1655 1660 1665

Thr Ser Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Pro Leu Tyr Gly Ile Asp Arg

1670 1675 1680

Tyr Ile Asn Lys Val Leu Ile Ala Pro Asp Leu Tyr Thr Ser Leu

1685 1690 1695

Ile Asn Ile Asn Thr Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Tyr Tyr Pro Glu

1700 1705 1710

Ile Ile Val Leu Asn Pro Asn Thr Phe His Lys Lys Val Asn Ile

1715 1720 1725

Asn Leu Asp Ser Ser Ser Phe Glu Tyr Lys Trp Ser Thr Glu Gly

1730 1735 1740

Ser Asp Phe Ile Leu Val Arg Tyr Leu Glu Glu Ser Asn Lys Lys

1745 1750 1755

Ile Leu Gln Lys Ile Arg Ile Lys Gly Ile Leu Ser Asn Thr Gln

1760 1765 1770

Ser Phe Asn Lys Met Ser Ile Asp Phe Lys Asp Ile Lys Lys Leu

1775 1780 1785

Ser Leu Gly Tyr Ile Met Ser Asn Phe Lys Ser Phe Asn Ser Glu

1790 1795 1800

Asn Glu Leu Asp Arg Asp His Leu Gly Phe Lys Ile Ile Asp Asn

1805 1810 1815

Lys Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu

1820 1825 1830

Ile Asn Ile Asn Asn Ser Leu Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Ser

1835 1840 1845

Asn Leu Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr

1850 1855 1860

Phe Asp Ile Asn Thr Gly Ala Ala Ser Thr Ser Tyr Lys Ile Ile

1865 1870 1875

Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asn Gly Val Met Gln Leu

1880 1885 1890

Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

1895 1900 1905

Asn Thr Gln Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln

1910 1915 1920

Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

1925 1930 1935

Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Glu Lys

1940 1945 1950

Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Val Gly Leu Gln

1955 1960 1965

Val Ile Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala Ile

1970 1975 1980

Ile Ser Lys Gly Trp Gln Thr Val Asn Gly Ser Arg Tyr Tyr Phe

1985 1990 1995

Asp Thr Asp Thr Ala Ile Ala Phe Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp

2000 2005 2010

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asp Ser Asp Cys Val Val Lys Ile Gly

2015 2020 2025

Val Phe Ser Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2030 2035 2040

Thr Tyr Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Ser

2045 2050 2055

Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn

2060 2065 2070

Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr

2090 2095 2100

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala

2105 2110 2115

Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn

2120 2125 2130

Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Asn Gly

2135 2140 2145

Lys Tyr Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val

2150 2155 2160

Phe Lys Val Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr

2165 2170 2175

His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys

2180 2185 2190

Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser

2195 2200 2205

Lys Ala Ile Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr

2210 2215 2220

Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Thr His Leu Cys Thr Ile

2225 2230 2235

Asn Asn Asp Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Asp Gly Ile Leu Gln Asn

2240 2245 2250

Gly Tyr Ile Thr Ile Glu Arg Asn Asn Phe Tyr Phe Asp Ala Asn

2255 2260 2265

Asn Glu Ser Lys Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly

2270 2275 2280

Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu

2285 2290 2295

Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly

2300 2305 2310

Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp

2315 2320 2325

Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala

2330 2335 2340

Val Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Glu Lys Tyr Tyr

2345 2350 2355

Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

2360 2365 2370

Asp Gly Lys Arg Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Tyr Ile Ala Ser

2375 2380 2385

Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr

2390 2395 2400

Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe

2405 2410 2415

Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly

2420 2425 2430

Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

2435 2440 2445

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg

2450 2455 2460

Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val

2465 2470 2475

Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe

2480 2485 2490

Asn Thr Asn Thr Tyr Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser

2495 2500 2505

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly

2510 2515 2520

Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2525 2530 2535

Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn

2540 2545 2550

Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asp

2555 2560 2565

Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Ala Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr

2570 2575 2580

Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr

2585 2590 2595

Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile

2600 2605 2610

Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

2615 2620 2625

Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Asp Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln

2630 2635 2640

Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn

2645 2650 2655

Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Ser Lys Val

2660 2665 2670

Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

2675 2680 2685

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val

2690 2695 2700

Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

2705 2710

<210> 18

<211> 8133

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<400> 18

atgtctttaa tatctaaaga agagttaata aaactcgcat atagcattag accaagagaa 60

aatgagtata aaactatact aactaattta gacgaatata ataagttaac tacaaacaat 120

aatgaaaata aatatttaca attaaaaaaa ctaaatgaat caattgatgt ttttatgaat 180

aaatataaaa attcaagcag aaatagagca ctctctaatc taaaaaaaga tatattaaaa 240

gaagtaattc ttattaaaaa ttccaataca agtcctgtag aaaaaaattt acattttgta 300

tggataggtg gagaagtcag tgatattgct cttgaataca taaaacaatg ggctgatatt 360

aatgcagaat ataatattaa actgtggtat gatagtgaag cattcttagt caatacacta 420

aaaaaggcta tagttgaatc ttctaccact gaagcattac agctactaga ggaagagatt 480

caaaatcctc aatttgataa tatgaaattt tacaaaaaaa ggatggaatt tatatatgat 540

agacaaaaaa ggtttataaa ttattataaa tctcaaatca ataaacctac agtacctaca 600

atagatgata ttataaagtc tcatctagta tctgaatata atagagatga aactttatta 660

gaatcatata gaacaaattc tttgagaaaa ataaatagta atcatgggat agatatcagg 720

gctaatagtt tgtttacaga acaagagtta ttaaatattt atagtcagga gttgttaaat 780

cgtgggaatt tagctgcagc atctgacata gtaagattat tagccctaaa aaattttggc 840

ggagtatatt tagatgttga tatgcttcca ggtattcact ctgatttatt taaaacaata 900

cctagaccta gctctattgg actagaccgt tgggaaatga taaaattaga ggctattatg 960

aagtataaaa aatatataaa taattataca tcagaaaact ttgataaact tgatcaacaa 1020

ttaaaagata attttaaact cattatagaa agtaaaagtg aaaaatctga gatattttct 1080

aaattagaaa atttaaatgt atctgatctt gaaattaaaa tagctttcgc tttaggcagt 1140

gttataaatc aagccttgat atcaaaacaa ggttcatatc ttactaacct agtaatagaa 1200

caagtaaaaa atagatatca atttttaaac caacacctta acccagccat agagtctgac 1260

aataacttca cagatactac taagattttt catgattcac tatttaattc agctaccgca 1320

gaaaactcta tgtttttaac aaaaatagca ccatacttac aagtaggttt tatgccagaa 1380

gctcgctcca caataagttt aagtggtcca ggagcttatg catcagctta ctatgatttc 1440

ataaatttac aagaaaatac tatagaaaaa actttaaaag catcagattt aatagaattt 1500

aaattcccag aaaataatct atctcaattg acagaacaag aaataaatag tctatggagc 1560

tttgatcaag caagtgcaaa atatcaattt gagaaatatg taagagatta tactggtgga 1620

tctctttctg aagacaatgg ggtagacttt aataaaaata ctgccctcga caaaaactat 1680

ttattaaata ataaaattcc atcaaacaat gtagaagaag ctggaagtaa aaattatgtt 1740

cattatatca tacagttaca aggagatgat ataagttatg aagcaacatg caatttattt 1800

tctaaaaatc ctaaaaatag tattattata caacgaaata tgaatgaaag tgcaaaaagt 1860

tactttttaa gtgatgatgg agaatctatt ttagaattaa ataaatatag gatacctgaa 1920

agattaaaaa ataaggaaaa agtaaaagta acctttattg gacatggtaa agatgaattc 1980

aacacaagcg aatttgctag attaagtgta gattcacttt ccaatgagat aagttcattt 2040

ttagatacca taaaattaga tatatcacct aaaaatgtag aagtaaactt gcttggatgt 2100

aatatgttta gttatgattt taatgttgaa gaaacttatc ctggtaagtt actattaagt 2160

attatggaca aaattacttc cactttacct gatgtaaata aagattctat tactatagga 2220

gcaaatcaat atgaagtaag aattaatagt gagggaagaa aagaacttct agctcactca 2280

ggtaaatgga taaataaaga ggaagctatt atgagcgatt tatctagtaa agaatacatt 2340

ttttttgatt ccatagataa taagctaaaa gcaaagtcca agaatattcc aggtttagcg 2400

tcaatatcag aagatataaa aacattatta cttgatgcaa gtgttagtcc tgatacaaaa 2460

tttattttaa ataatcttaa gcttaatatt gaatcttcta ttggtgatta catttattat 2520

gaaaaattag aacctgttaa aaatataatc cacaattcta tagatgattt aatagatgag 2580

ttcaatctac ttgaaaatgt atctgatgaa ttatatgaat taaaaaaatt aaataatcta 2640

gatgagaagt atttaatatc ttttgaagat atctcaaaaa ataattcaac ttattctgta 2700

agatttatta acaaaagtaa tggtgaatca gtttatgtag agacagaaaa agaaattttt 2760

tcaaaatata gcgaacatat tacaaaagaa ataagtacta taaagaatag tataattaca 2820

gatgttaatg gtaatttatt ggataatata cagttagatc atacttctca agttaataca 2880

ttaaacgcag cattctttat tcaatcatta atagattata gtagcaataa agatgtactg 2940

aatgatttaa gtacctcagt taaggttcaa ctttatgctc aactatttag tacaggttta 3000

aatactatat atgactctat ccaattagta aatttaatat caaatgcagt aaatgatact 3060

ataaatgtac tacctacaat aacagagggg atacctattg tatctactat attagacgga 3120

ataaacttag gtgcagcaat taaggaatta ctagacgaac atgacccatt actaaaaaaa 3180

gaactagaag ctaaggtggg tgttttagca ataaatatgt cattatctat agctgcaacg 3240

gtagcttcaa ttgttggaat aggtgctgaa gttactattt tcttattacc tatagctggt 3300

atatctgcgg gaataccttc attagttaat aatgaattaa tattgcatga taaggcaact 3360

tcagtggtaa actattttaa tcatttgtct gaatctaaag aatatggccc tcttaaaaca 3420

gaagatgata aaattttagt tcctattgat gatttagtaa tatcagaaat agattttaat 3480

aataattcga taaaactagg aacatgtaat atattagcaa tggagggggg atcaggacac 3540

acagtgactg gtaatataga tcactttttc tcatctccat atataagctc tcatattcct 3600

tcattatcag tttattctgc aataggtata aaaacagaaa atctagattt ttcaaaaaaa 3660

ataatgatgt taccaaatgc tccttcaaga gtgttttggt gggaaactgg agcagttcca 3720

ggtttaagat cattggaaaa taatgggact aaattgcttg attcaataag agatttatac 3780

ccaggcaaat tttactggag attctatgcc tttttcgatt atgcaataac tacattaaaa 3840

ccagtgtatg aagacactaa tactaaaatt aaactagata aagatactag aaactttata 3900

atgccaacta taactactga cgaaattaga aacaaattat cttattcatt tgatggagca 3960

ggaggaactt actctttatt attatcttca tatccaatat caatgaatat aaatttatct 4020

aaagatgatt tatggatatt taatattgat aatgaagtaa gagaaatatc tatagaaaat 4080

ggtactatta aaaaaggaaa tttaatagaa gatgttttaa gtaaaattga tataaataaa 4140

aataaactta ttataggcaa tcaaacaata gatttttcag gtgatataga taacaaagat 4200

agatatatat tcttgacttg tgagttagat gataaaatta gtttaataat agaaataaat 4260

cttgttgcaa aatcttatag tttgttattg tctggggata aaaattattt gatatccaat 4320

ttatctaata ctattgagaa aatcaatact ttaggcctag atagtaaaaa tatagcttac 4380

aattacactg atgaatctaa taataaatat tttggagcta tatctaaaac aagtcaaaaa 4440

agcataatac attataaaaa agacagtaaa aatatattag aattttataa tggcagtaca 4500

ttagaattta acagtaaaga ctttattgct gaagatataa atgtatttat gaaagatgat 4560

attaatacta taacaggaaa atactatgtt gataataata ctgataaaag tatagatttc 4620

tctatttctt tagttagtaa aaatcaagta aaagtaaatg gattatattt aaatgaatcc 4680

gtatactcat cttaccttga ttttgtgaaa aattcagatg gacaccataa tacttctaat 4740

tttatgaatt tatttttgaa caatataagt ttctggaaat tgtttgggtt tgaaaatata 4800

aattttgtaa tcgataaata ctttaccctt gttggtaaaa ctaatcttgg atatgtagaa 4860

tttatttgtg acaataataa aaatatagat atatattttg gtgaatggaa aacatcgtca 4920

tctaaaagca ctatatttag cggaaatggt agaaatgttg tagtagagcc tatatataat 4980

cctgatacgg gtgaagatat atctacttca ctagattttt cctatgaacc tctctatgga 5040

atagatagat atatcaataa agtattgata gcacctgatt tatatacaag tttaataaat 5100

attaatacca attattattc aaatgagtac taccctgaga ttatagttct taacccaaat 5160

acattccaca aaaaagtaaa tataaattta gatagttctt cttttgagta taaatggtct 5220

acagaaggaa gtgactttat tttagttaga tacttagaag aaagtaataa aaaaatatta 5280

caaaaaataa gaatcaaagg tatcttatct aatactcaat catttaataa aatgagtata 5340

gattttaaag atattaaaaa actatcatta ggatatataa tgagtaattt taaatcattt 5400

aattctgaaa atgaattaga tagagatcat ttaggattta aaataataga taataaaact 5460

tattactatg atgaagatag taaattagtt aaaggattaa tcaatataaa taattcatta 5520

ttctattttg atcctataga atctaactta gtaactggat ggcaaactat caatggtaaa 5580

aaatattatt ttgatataaa tactggagca gcttcaacta gttataaaat tattaatggt 5640

aaacactttt attttaataa taatggtgtg atgcagttag gagtatttaa aggacctgat 5700

ggatttgagt attttgcacc tgccaatact cagaataata acatagaagg tcaggctata 5760

gtttatcaaa gtaaattctt aactttgaat ggcaaaaaat attattttga taatgactca 5820

aaagcagtca ctggatggag gattattaac aatgagaaat attactttaa tcctaataat 5880

gctattgctg cagtcggatt gcaagtaatt gacaataata agtattattt caatcctgac 5940

actgctatca tctcaaaagg ttggcagact gttaatggta gtagatacta ctttgatact 6000

gataccgcta ttgcctttaa tggttataaa actattgatg gtaaacactt ttattttgat 6060

agtgattgtg tagtgaaaat aggtgtgttt agtggctcta atggatttga atatttcgca 6120

cctgctaata cttataataa taacatagaa ggtcaggcta tagtttatca aagtaaattc 6180

ttaactttga atggtaaaaa atattacttt gataataact caaaagcagt taccggatgg 6240

caaactattg atagtaaaaa atattacttt aatactaaca ctgctgaagc agctactgga 6300

tggcaaacta ttgatggtaa aaagtattac tttaatacta acactgctga agcagctact 6360

ggatggcaaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacacttc tatagcttca 6420

actggttata caattattaa tggtaaatat ttttatttta atactgatgg tattatgcag 6480

ataggagtgt ttaaagtacc taatggattt gaatactttg cacctgctaa tactcataat 6540

aataacatag aaggtcaagc tatactttac caaaataaat tcttaacttt gaatggtaaa 6600

aaatattact ttggtagtga ctcaaaagca attactggat ggcaaaccat tgatggtaaa 6660

aaatattact ttaatcctaa taatgctatt gctgcgactc atctatgcac tataaataac 6720

gacaagtatt actttagtta tgatggaatt cttcaaaatg gatatattac tattgaaaga 6780

aataatttct attttgatgc taataatgaa tctaaaatgg taacaggagt atttaaagga 6840

cctaatggat ttgagtattt tgcacctgct aatactcata ataataacat agaaggtcag 6900

gctatagttt accagaataa attcttaact ttgaatggca aaaaatatta ttttgataat 6960

gactcaaaag cagttactgg atggcaaact attgatagta aaaaatatta ctttaatctt 7020

aacactgctg ttgcagttac tggatggcaa actattgatg gtgaaaaata ttactttaat 7080

cttaacactg ctgaagcagc tactggatgg caaactattg atggtaaaag atactacttt 7140

aatactaaca cttatatagc ttcaactggt tatacgatta ttaatggtaa acatttttat 7200

tttaatactg atggtattat gcagatagga gtgtttaaag gacctgatgg atttgaatac 7260

tttgcacctg ctaatactca taataataac atagaaggtc aagctatact ttaccaaaat 7320

aaattcttaa ctttgaatgg taaaaaatat tactttggta gtgactcaaa agcagttacc 7380

ggattgcgaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tgttgcagtt 7440

actggatggc aaactattaa tggtaaaaaa tactacttta atactaacac ttatatagct 7500

tcaactggtt atacaattat tagtggtaaa catttttatt ttaatactga tggtattatg 7560

cagataggag tgtttaaagg acctgatgga tttgaatact ttgcacctgc taatacggat 7620

gctaacaaca tagaaggtca agctatacgt tatcaaaata gattcctata tttacatgac 7680

aatatatatt actttggcaa tgattcaaaa gcggctactg gttgggcaac tattgatggt 7740

aatagatatt acttcgagcc taatacagct atgggtgcga atggttataa aactattgat 7800

aataaaaatt tttactttag aaatggttta cctcagatag gagtgtttaa aggacctaat 7860

ggatttgaat actttgcacc tgctaatacg gatgctaaca atatagatgg tcaagctata 7920

cgttatcaaa atagattcct acatttactt ggaaaaatat attactttgg taataactca 7980

aaagcagtta ctggatggca aactattaat agtaaagtat attactttat gcctgatact 8040

gctatggctg cagctggtgg acttttcgag attgatggtg ttatatattt ctttggtgtt 8100

gatggagtaa aagcccctgg gatatatggc taa 8133

<210> 19

<211> 2710

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 19

Met Ser Leu Ile Ser Lys Glu Glu Leu Ile Lys Leu Ala Tyr Ser Ile

1 5 10 15

Arg Pro Arg Glu Asn Glu Tyr Lys Thr Ile Leu Thr Asn Leu Asp Glu

20 25 30

Tyr Asn Lys Leu Thr Thr Asn Asn Asn Glu Asn Lys Tyr Leu Gln Leu

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asp Val Phe Met Asn Lys Tyr Lys Thr

50 55 60

Ser Ser Arg Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu Lys Lys Asp Ile Leu Lys

65 70 75 80

Glu Val Ile Leu Ile Lys Asn Ser Asn Thr Ser Pro Val Glu Lys Asn

85 90 95

Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Glu Val Ser Asp Ile Ala Leu Glu

100 105 110

Tyr Ile Lys Gln Trp Ala Asp Ile Asn Ala Glu Tyr Asn Ile Lys Leu

115 120 125

Trp Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Leu Val Asn Thr Leu Lys Lys Ala Ile

130 135 140

Val Glu Ser Ser Thr Thr Glu Ala Leu Gln Leu Leu Glu Glu Glu Ile

145 150 155 160

Gln Asn Pro Gln Phe Asp Asn Met Lys Phe Tyr Lys Lys Arg Met Glu

165 170 175

Phe Ile Tyr Asp Arg Gln Lys Arg Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ser Gln

180 185 190

Ile Asn Lys Pro Thr Val Pro Thr Ile Asp Asp Ile Ile Lys Ser His

195 200 205

Leu Val Ser Glu Tyr Asn Arg Asp Glu Thr Val Leu Glu Ser Tyr Arg

210 215 220

Thr Asn Ser Leu Arg Lys Ile Asn Ser Asn His Gly Ile Asp Ile Arg

225 230 235 240

Ala Asn Ser Leu Phe Thr Glu Gln Glu Leu Leu Asn Ile Tyr Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Leu Asn Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Val Arg

260 265 270

Leu Leu Ala Leu Lys Asn Phe Gly Gly Val Tyr Leu Asp Val Asp Met

275 280 285

Leu Pro Gly Ile His Ser Asp Leu Phe Lys Thr Ile Ser Arg Pro Ser

290 295 300

Ser Ile Gly Leu Asp Arg Trp Glu Met Ile Lys Leu Glu Ala Ile Met

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Tyr Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Asp Lys

325 330 335

Leu Asp Gln Gln Leu Lys Asp Asn Phe Lys Leu Ile Ile Glu Ser Lys

340 345 350

Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe Ser Lys Leu Glu Asn Leu Asn Val Ser

355 360 365

Asp Leu Glu Ile Lys Ile Ala Phe Ala Leu Gly Ser Val Ile Asn Gln

370 375 380

Ala Leu Ile Ser Lys Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Asn Leu Val Ile Glu

385 390 395 400

Gln Val Lys Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Asn Gln His Leu Asn Pro Ala

405 410 415

Ile Glu Ser Asp Asn Asn Phe Thr Asp Thr Thr Lys Ile Phe His Asp

420 425 430

Ser Leu Phe Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asn Ser Met Phe Leu Thr Lys

435 440 445

Ile Ala Pro Tyr Leu Gln Val Gly Phe Met Pro Glu Ala Arg Ser Thr

450 455 460

Ile Ser Leu Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Ala Ser Ala Tyr Tyr Asp Phe

465 470 475 480

Ile Asn Leu Gln Glu Asn Thr Ile Glu Lys Thr Leu Lys Ala Ser Asp

485 490 495

Leu Ile Glu Phe Lys Phe Pro Glu Asn Asn Leu Ser Gln Leu Thr Glu

500 505 510

Gln Glu Ile Asn Ser Leu Trp Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ala Lys Tyr

515 520 525

Gln Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Tyr Thr Gly Gly Ser Leu Ser Glu

530 535 540

Asp Asn Gly Val Asp Phe Asn Lys Asn Thr Ala Leu Asp Lys Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Asn Asn Lys Ile Pro Ser Asn Asn Val Glu Glu Ala Gly Ser

565 570 575

Lys Asn Tyr Val His Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Gly Asp Asp Ile Ser

580 585 590

Tyr Glu Ala Thr Cys Asn Leu Phe Ser Lys Asn Pro Lys Asn Ser Ile

595 600 605

Ile Ile Gln Arg Asn Met Asn Glu Ser Ala Lys Ser Tyr Phe Leu Ser

610 615 620

Asp Asp Gly Glu Ser Ile Leu Glu Leu Asn Lys Tyr Arg Ile Pro Glu

625 630 635 640

Arg Leu Lys Asn Lys Glu Lys Val Lys Val Thr Phe Ile Gly His Gly

645 650 655

Lys Asp Glu Phe Asn Thr Ser Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Asp Ser

660 665 670

Leu Ser Asn Glu Ile Ser Ser Phe Leu Asp Thr Ile Lys Leu Asp Ile

675 680 685

Ser Pro Lys Asn Val Glu Val Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser

690 695 700

Tyr Asp Phe Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Ser

705 710 715 720

Ile Met Asp Lys Ile Thr Ser Thr Leu Pro Asp Val Asn Lys Asn Ser

725 730 735

Ile Thr Ile Gly Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly

740 745 750

Arg Lys Glu Leu Leu Ala His Ser Gly Lys Trp Ile Asn Lys Glu Glu

755 760 765

Ala Ile Met Ser Asp Leu Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Phe Phe Asp Ser

770 775 780

Ile Asp Asn Lys Leu Lys Ala Lys Ser Lys Asn Ile Pro Gly Leu Ala

785 790 795 800

Ser Ile Ser Glu Asp Ile Lys Thr Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val Ser

805 810 815

Pro Asp Thr Lys Phe Ile Leu Asn Asn Leu Lys Leu Asn Ile Glu Ser

820 825 830

Ser Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Glu Lys Leu Glu Pro Val Lys Asn

835 840 845

Ile Ile His Asn Ser Ile Asp Asp Leu Ile Asp Glu Phe Asn Leu Leu

850 855 860

Glu Asn Val Ser Asp Glu Leu Tyr Glu Leu Lys Lys Leu Asn Asn Leu

865 870 875 880

Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Lys Asn Asn Ser

885 890 895

Thr Tyr Ser Val Arg Phe Ile Asn Lys Ser Asn Gly Glu Ser Val Tyr

900 905 910

Val Glu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Ser Lys Tyr Ser Glu His Ile Thr

915 920 925

Lys Glu Ile Ser Thr Ile Lys Asn Ser Ile Ile Thr Asp Val Asn Gly

930 935 940

Asn Leu Leu Asp Asn Ile Gln Leu Asp His Thr Ser Gln Val Asn Thr

945 950 955 960

Leu Asn Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Asp Tyr Ser Ser Asn

965 970 975

Lys Asp Val Leu Asn Asp Leu Ser Thr Ser Val Lys Val Gln Leu Tyr

980 985 990

Ala Gln Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Tyr Asp Ser Ile Gln

995 1000 1005

Leu Val Asn Leu Ile Ser Asn Ala Val Asn Asp Thr Ile Asn Val

1010 1015 1020

Leu Pro Thr Ile Thr Glu Gly Ile Pro Ile Val Ser Thr Ile Leu

1025 1030 1035

Asp Gly Ile Asn Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Leu Asp Glu

1040 1045 1050

His Asp Pro Leu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ala Lys Val Gly Val

1055 1060 1065

Leu Ala Ile Asn Met Ser Leu Ser Ile Ala Ala Thr Val Ala Ser

1070 1075 1080

Ile Val Gly Ile Gly Ala Glu Val Thr Ile Phe Leu Leu Pro Ile

1085 1090 1095

Ala Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu

1100 1105 1110

Ile Leu His Asp Lys Ala Thr Ser Val Val Asn Tyr Phe Asn His

1115 1120 1125

Leu Ser Glu Ser Lys Lys Tyr Gly Pro Leu Lys Thr Glu Asp Asp

1130 1135 1140

Lys Ile Leu Val Pro Ile Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp

1145 1150 1155

Phe Asn Asn Asn Ser Ile Lys Leu Gly Thr Cys Asn Ile Leu Ala

1160 1165 1170

Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Gly Asn Ile Asp His

1175 1180 1185

Phe Phe Ser Ser Pro Ser Ile Ser Ser His Ile Pro Ser Leu Ser

1190 1195 1200

Ile Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Glu Thr Glu Asn Leu Asp Phe Ser

1205 1210 1215

Lys Lys Ile Met Met Leu Pro Asn Ala Pro Ser Arg Val Phe Trp

1220 1225 1230

Trp Glu Thr Gly Ala Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp

1235 1240 1245

Gly Thr Arg Leu Leu Asp Ser Ile Arg Asp Leu Tyr Pro Gly Lys

1250 1255 1260

Phe Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala Phe Phe Asp Tyr Ala Ile Thr Thr

1265 1270 1275

Leu Lys Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Lys Ile Lys Leu Asp

1280 1285 1290

Lys Asp Thr Arg Asn Phe Ile Met Pro Thr Ile Thr Thr Asn Glu

1295 1300 1305

Ile Arg Asn Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Asp Gly Ala Gly Gly Thr

1310 1315 1320

Tyr Ser Leu Leu Leu Ser Ser Tyr Pro Ile Ser Thr Asn Ile Asn

1325 1330 1335

Leu Ser Lys Asp Asp Leu Trp Ile Phe Asn Ile Asp Asn Glu Val

1340 1345 1350

Arg Glu Ile Ser Ile Glu Asn Gly Thr Ile Lys Lys Gly Lys Leu

1355 1360 1365

Ile Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile Asp Ile Asn Lys Asn Lys Leu

1370 1375 1380

Ile Ile Gly Asn Gln Thr Ile Asp Phe Ser Gly Asp Ile Asp Asn

1385 1390 1395

Lys Asp Arg Tyr Ile Phe Leu Thr Cys Glu Leu Asp Asp Lys Ile

1400 1405 1410

Ser Leu Ile Ile Glu Ile Asn Leu Val Ala Lys Ser Tyr Ser Leu

1415 1420 1425

Leu Leu Ser Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Ile Ser Asn Leu Ser Asn

1430 1435 1440

Thr Ile Glu Lys Ile Asn Thr Leu Gly Leu Asp Ser Lys Asn Ile

1445 1450 1455

Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Glu Ser Asn Asn Lys Tyr Phe Gly Ala

1460 1465 1470

Ile Ser Lys Thr Ser Gln Lys Ser Ile Ile His Tyr Lys Lys Asp

1475 1480 1485

Ser Lys Asn Ile Leu Glu Phe Tyr Asn Asp Ser Thr Leu Glu Phe

1490 1495 1500

Asn Ser Lys Asp Phe Ile Ala Glu Asp Ile Asn Val Phe Met Lys

1505 1510 1515

Asp Asp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Lys Tyr Tyr Val Asp Asn Asn

1520 1525 1530

Thr Asp Lys Ser Ile Asp Phe Ser Ile Ser Leu Val Ser Lys Asn

1535 1540 1545

Gln Val Lys Val Asn Gly Leu Tyr Leu Asn Glu Ser Val Tyr Ser

1550 1555 1560

Ser Tyr Leu Asp Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly His His Asn Thr

1565 1570 1575

Ser Asn Phe Met Asn Leu Phe Leu Asp Asn Ile Ser Phe Trp Lys

1580 1585 1590

Leu Phe Gly Phe Glu Asn Ile Asn Phe Val Ile Asp Lys Tyr Phe

1595 1600 1605

Thr Leu Val Gly Lys Thr Asn Leu Gly Tyr Val Glu Phe Ile Cys

1610 1615 1620

Asp Asn Asn Lys Asn Ile Asp Ile Tyr Phe Gly Glu Trp Lys Thr

1625 1630 1635

Ser Ser Ser Lys Ser Thr Ile Phe Ser Gly Asn Gly Arg Asn Val

1640 1645 1650

Val Val Glu Pro Ile Tyr Asn Pro Asp Thr Gly Glu Asp Ile Ser

1655 1660 1665

Thr Ser Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Pro Leu Tyr Gly Ile Asp Arg

1670 1675 1680

Tyr Ile Asn Lys Val Leu Ile Ala Pro Asp Leu Tyr Thr Ser Leu

1685 1690 1695

Ile Asn Ile Asn Thr Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Tyr Tyr Pro Glu

1700 1705 1710

Ile Ile Val Leu Asn Pro Asn Thr Phe His Lys Lys Val Asn Ile

1715 1720 1725

Asn Leu Asp Ser Ser Ser Phe Glu Tyr Lys Trp Ser Thr Glu Gly

1730 1735 1740

Ser Asp Phe Ile Leu Val Arg Tyr Leu Glu Glu Ser Asn Lys Lys

1745 1750 1755

Ile Leu Gln Lys Ile Arg Ile Lys Gly Ile Leu Ser Asn Thr Gln

1760 1765 1770

Ser Phe Asn Lys Met Ser Ile Asp Phe Lys Asp Ile Lys Lys Leu

1775 1780 1785

Ser Leu Gly Tyr Ile Met Ser Asn Phe Lys Ser Phe Asn Ser Glu

1790 1795 1800

Asn Glu Leu Asp Arg Asp His Leu Gly Phe Lys Ile Ile Asp Asn

1805 1810 1815

Lys Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu

1820 1825 1830

Ile Asn Ile Asn Asn Ser Leu Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Phe

1835 1840 1845

Asn Leu Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr

1850 1855 1860

Phe Asp Ile Asn Thr Gly Ala Ala Leu Thr Ser Tyr Lys Ile Ile

1865 1870 1875

Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asp Gly Val Met Gln Leu

1880 1885 1890

Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

1895 1900 1905

Asn Thr Gln Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln

1910 1915 1920

Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn

1925 1930 1935

Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Glu Lys

1940 1945 1950

Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Val Gly Leu Gln

1955 1960 1965

Val Ile Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala Ile

1970 1975 1980

Ile Ser Lys Gly Trp Gln Thr Val Asn Gly Ser Arg Tyr Tyr Phe

1985 1990 1995

Asp Thr Asp Thr Ala Ile Ala Phe Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp

2000 2005 2010

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asp Ser Asp Cys Val Val Lys Ile Gly

2015 2020 2025

Val Phe Ser Thr Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2030 2035 2040

Thr Tyr Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Ser

2045 2050 2055

Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn

2060 2065 2070

Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr

2090 2095 2100

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala

2105 2110 2115

Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn

2120 2125 2130

Thr Asn Thr Ala Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Asn Gly

2135 2140 2145

Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val

2150 2155 2160

Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr

2165 2170 2175

Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Glu

2180 2185 2190

Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser

2195 2200 2205

Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Lys Lys Tyr Tyr

2210 2215 2220

Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Ile His Leu Cys Thr Ile

2225 2230 2235

Asn Asn Asp Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Asp Gly Ile Leu Gln Asn

2240 2245 2250

Gly Tyr Ile Thr Ile Glu Arg Asn Asn Phe Tyr Phe Asp Ala Asn

2255 2260 2265

Asn Glu Ser Lys Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly

2270 2275 2280

Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu

2285 2290 2295

Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly

2300 2305 2310

Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp

2315 2320 2325

Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala

2330 2335 2340

Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr

2345 2350 2355

Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile

2360 2365 2370

Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe Ile Ala Ser

2375 2380 2385

Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr

2390 2395 2400

Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe

2405 2410 2415

Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly

2420 2425 2430

Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys

2435 2440 2445

Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg

2450 2455 2460

Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val

2465 2470 2475

Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe

2480 2485 2490

Asn Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser

2495 2500 2505

Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly

2510 2515 2520

Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn

2525 2530 2535

Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn

2540 2545 2550

Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn

2555 2560 2565

Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr

2570 2575 2580

Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr

2585 2590 2595

Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile

2600 2605 2610

Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala

2615 2620 2625

Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln

2630 2635 2640

Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn

2645 2650 2655

Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Val

2660 2665 2670

Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu

2675 2680 2685

Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val

2690 2695 2700

Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

2705 2710

<210> 20

<211> 8133

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<400> 20

atgtctttaa tatctaaaga agagttaata aaactcgcat atagcattag accaagagaa 60

aatgagtata aaactatact aactaattta gacgaatata ataagttaac tacaaacaat 120

aatgaaaata aatatttgca attaaaaaaa ctaaatgaat caattgatgt ttttatgaat 180

aaatataaaa cttcaagcag aaatagagca ctctctaatc taaaaaaaga tatattaaaa 240

gaagtaattc ttattaaaaa ttccaataca agccctgtag aaaaaaattt acattttgta 300

tggataggtg gagaagtcag tgatattgct cttgaataca taaaacaatg ggctgatatt 360

aatgcagaat ataatattaa actgtggtat gatagtgaag cattcttagt aaatacacta 420

aaaaaggcta tagttgaatc ttctaccact gaagcattac agctactaga ggaagagatt 480

caaaatcctc aatttgataa tatgaaattt tacaaaaaaa ggatggaatt tatatatgat 540

agacaaaaaa ggtttataaa ttattataaa tctcaaatca ataaacctac agtacctaca 600

atagatgata ttataaagtc tcatctagta tctgaatata atagagatga aactgtatta 660

gaatcatata gaacaaattc tttgagaaaa ataaatagta atcatgggat agatatcagg 720

gctaatagtt tgtttacaga acaagagtta ttaaatattt atagtcagga gttgttaaat 780

cgtggaaatt tagctgcagc atctgacata gtaagattat tagccctaaa aaattttggc 840

ggagtatatt tagatgttga tatgcttcca ggtattcact ctgatttatt taaaacaata 900

tctagaccta gctctattgg actagaccgt tgggaaatga taaaattaga ggctattatg 960

aagtataaaa aatatataaa taattataca tcagaaaact ttgataaact tgatcaacaa 1020

ttaaaagata attttaaact cattatagaa agtaaaagtg aaaaatctga gatattttct 1080

aaattagaaa atttaaatgt atctgatctt gaaattaaaa tagctttcgc tttaggcagt 1140

gttataaatc aagccttgat atcaaaacaa ggttcatatc ttactaacct agtaatagaa 1200

caagtaaaaa atagatatca atttttaaac caacacctta acccagccat agagtctgat 1260

aataacttca cagatactac taaaattttt catgattcat tatttaattc agctaccgca 1320

gaaaactcta tgtttttaac aaaaatagca ccatacttac aagtaggttt tatgccagaa 1380

gctcgctcca caataagttt aagtggtcca ggagcttatg cgtcagctta ctatgatttc 1440

ataaatttac aagaaaatac tatagaaaaa actttaaaag catcagattt aatagaattt 1500

aaattcccag aaaataatct atctcaattg acagaacaag aaataaatag tctatggagc 1560

tttgatcaag caagtgcaaa atatcaattt gagaaatatg taagagatta tactggtgga 1620

tctctttctg aagacaatgg ggtagacttt aataaaaata ctgccctcga caaaaactat 1680

ttattaaata ataaaattcc atcaaacaat gtagaagaag ctggaagtaa aaattatgtt 1740

cattatatca tacagttaca aggagatgat ataagttatg aagcaacatg caatttattt 1800

tctaaaaatc ctaaaaatag tattattata caacgaaata tgaatgaaag tgcaaaaagc 1860

tactttttaa gtgatgatgg agaatctatt ttagaattaa ataaatatag gatacctgaa 1920

agattaaaaa ataaggaaaa agtaaaagta acctttattg gacatggtaa agatgaattc 1980

aacacaagcg aatttgctag attaagtgta gattcacttt ccaatgagat aagttcattt 2040

ttagatacca taaaattaga tatatcacct aaaaatgtag aagtaaactt acttggatgt 2100

aatatgttta gttatgattt taatgttgaa gaaacttatc ctgggaagtt gctattaagt 2160

attatggaca aaattacttc cactttacct gatgtaaata aaaattctat tactatagga 2220

gcaaatcaat atgaagtaag aattaatagt gagggaagaa aagaacttct ggctcactca 2280

ggtaaatgga taaataaaga agaagctatt atgagcgatt tatctagtaa agaatacatt 2340

ttttttgatt ctatagataa taagctaaaa gcaaagtcca agaatattcc aggattagca 2400

tcaatatcag aagatataaa aacattatta cttgatgcaa gtgttagtcc tgatacaaaa 2460

tttattttaa ataatcttaa gcttaatatt gaatcttcta ttggggatta catttattat 2520

gaaaaattag agcctgttaa aaatataatt cacaattcta tagatgattt aatagatgag 2580

ttcaatctac ttgaaaatgt atctgatgaa ttatatgaat taaaaaaatt aaataatcta 2640

gatgagaagt atttaatatc ttttgaagat atctcaaaaa ataattcaac ttactctgta 2700

agatttatta acaaaagtaa tggtgagtca gtttatgtag aaacagaaaa agaaattttt 2760

tcaaaatata gcgaacatat tacaaaagaa ataagtacta taaagaatag tataattaca 2820

gatgttaatg gtaatttatt ggataatata cagttagatc atacttctca agttaataca 2880

ttaaacgcag cattctttat tcaatcatta atagattata gtagcaataa agatgtactg 2940

aatgatttaa gtacctcagt taaggttcaa ctttatgctc aactatttag tacaggttta 3000

aatactatat atgactctat ccaattagta aatttaatat caaatgcagt aaatgatact 3060

ataaatgtac tacctacaat aacagagggg atacctattg tatctactat attagacgga 3120

ataaacttag gtgcagcaat taaggaatta ctagacgaac atgacccatt actaaaaaaa 3180

gaattagaag ctaaggtggg tgttttagca ataaatatgt cattatctat agctgcaact 3240

gtagcttcaa ttgttggaat aggtgctgaa gttactattt tcttattacc tatagctggt 3300

atatctgcag gaataccttc attagttaat aatgaattaa tattgcatga taaggcaact 3360

tcagtggtaa actattttaa tcatttgtct gaatctaaaa aatatggccc tcttaaaaca 3420

gaagatgata aaattttagt tcctattgat gatttagtaa tatcagaaat agattttaat 3480

aataattcga taaaactagg aacatgtaat atattagcaa tggagggggg atcaggacac 3540

acagtgactg gtaatataga tcactttttc tcatctccat ctataagttc tcatattcct 3600

tcattatcaa tttattctgc aataggtata gaaacagaaa atctagattt ttcaaaaaaa 3660

ataatgatgt tacctaatgc tccttcaaga gtgttttggt gggaaactgg agcagttcca 3720

ggtttaagat cattggaaaa tgacggaact agattacttg attcaataag agatttatac 3780

ccaggtaaat tttactggag attctatgct tttttcgatt atgcaataac tacattaaaa 3840

ccagtttatg aagacactaa tattaaaatt aaactagata aagatactag aaacttcata 3900

atgccaacta taactactaa cgaaattaga aacaaattat cttattcatt tgatggagca 3960

ggaggaactt actctttatt attatcttca tatccaatat caacgaatat aaatttatct 4020

aaagatgatt tatggatatt taatattgat aatgaagtaa gagaaatatc tatagaaaat 4080

ggtactatta aaaaaggaaa gttaataaaa gatgttttaa gtaaaattga tataaataaa 4140

aataaactta ttataggcaa tcaaacaata gatttttcag gcgatataga taataaagat 4200

agatatatat tcttgacttg tgagttagat gataaaatta gtttaataat agaaataaat 4260

cttgttgcaa aatcttatag tttgttattg tctggggata aaaattattt gatatccaat 4320

ttatctaata ctattgagaa aatcaatact ttaggcctag atagtaaaaa tatagcgtac 4380

aattacactg atgaatctaa taataaatat tttggagcta tatctaaaac aagtcaaaaa 4440

agcataatac attataaaaa agacagtaaa aatatattag aattttataa tgacagtaca 4500

ttagaattta acagtaaaga ttttattgct gaagatataa atgtatttat gaaagatgat 4560

attaatacta taacaggaaa atactatgtt gataataata ctgataaaag tatagatttc 4620

tctatttctt tagttagtaa aaatcaagta aaagtaaatg gattatattt aaatgaatcc 4680

gtatactcat cttaccttga ttttgtgaaa aattcagatg gacaccataa tacttctaat 4740

tttatgaatt tatttttgga caatataagt ttctggaaat tgtttgggtt tgaaaatata 4800

aattttgtaa tcgataaata ctttaccctt gttggtaaaa ctaatcttgg atatgtagaa 4860

tttatttgtg acaataataa aaatatagat atatattttg gtgaatggaa aacatcgtca 4920

tctaaaagca ctatatttag cggaaatggt agaaatgttg tagtagagcc tatatataat 4980

cctgatacgg gtgaagatat atctacttca ctagattttt cctatgaacc tctctatgga 5040

atagatagat atataaataa agtattgata gcacctgatt tatatacaag tttaataaat 5100

attaatacca attattattc aaatgagtac taccctgaga ttatagttct taacccaaat 5160

acattccaca aaaaagtaaa tataaattta gatagttctt cttttgagta taaatggtct 5220

acagaaggaa gtgactttat tttagttaga tacttagaag aaagtaataa aaaaatatta 5280

caaaaaataa gaatcaaagg tatcttatct aatactcaat catttaataa aatgagtata 5340

gattttaaag atattaaaaa actatcatta ggatatataa tgagtaattt taaatcattt 5400

aattctgaaa atgaattaga tagagatcat ttaggattta aaataataga taataaaact 5460

tattactatg atgaagatag taaattagtt aaaggattaa tcaatataaa taattcatta 5520

ttctattttg atcctataga atttaactta gtaactggat ggcaaactat caatggtaaa 5580

aaatattatt ttgatataaa tactggagca gctttaacta gttataaaat tattaatggt 5640

aaacactttt attttaataa tgatggtgtg atgcagttgg gagtatttaa aggacctgat 5700

ggatttgaat attttgcacc tgccaatact caaaataata acatagaagg tcaggctata 5760

gtttatcaaa gtaaattctt aactttgaat ggcaaaaaat attattttga taataactca 5820

aaagcagtca ctggatggag aattattaac aatgagaaat attactttaa tcctaataat 5880

gctattgctg cagtcggatt gcaagtaatt gacaataata agtattattt caatcctgac 5940

actgctatca tctcaaaagg ttggcagact gttaatggta gtagatacta ctttgatact 6000

gataccgcta ttgcctttaa tggttataaa actattgatg gtaaacactt ttattttgat 6060

agtgattgtg tagtgaaaat aggtgtgttt agtacctcta atggatttga atattttgca 6120

cctgctaata cttataataa taacatagaa ggtcaggcta tagtttatca aagtaaattc 6180

ttaactttga atggtaaaaa atattacttt gataataact caaaagcagt taccggattg 6240

caaactattg atagtaaaaa atattacttt aatactaaca ctgctgaagc agctactgga 6300

tggcaaacta ttgatggtaa aaaatattac tttaatacta acactgctga agcagctact 6360

ggatggcaaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tatagcttca 6420

actggttata caattattaa tggtaaacat ttttatttta atactgatgg tattatgcag 6480

ataggagtgt ttaaaggacc taatggattt gaatattttg cacctgctaa tacggatgct 6540

aacaacatag aaggtcaagc tatactttac caaaatgaat tcttaacttt gaatggtaaa 6600

aaatattact ttggtagtga ctcaaaagca gttactggat ggagaattat taacaataag 6660

aaatattact ttaatcctaa taatgctatt gctgcaattc atctatgcac tataaataat 6720

gacaagtatt actttagtta tgatggaatt cttcaaaatg gatatattac tattgaaaga 6780

aataatttct attttgatgc taataatgaa tctaaaatgg taacaggagt atttaaagga 6840

cctaatggat ttgagtattt tgcacctgct aatactcaca ataataacat agaaggtcag 6900

gctatagttt accagaacaa attcttaact ttgaatggca aaaaatatta ttttgataat 6960

gactcaaaag cagttactgg atggcaaacc attgatggta aaaaatatta ctttaatctt 7020

aacactgctg aagcagctac tggatggcaa actattgatg gtaaaaaata ttactttaat 7080

cttaacactg ctgaagcagc tactggatgg caaactattg atggtaaaaa atattacttt 7140

aatactaaca ctttcatagc ctcaactggt tatacaagta ttaatggtaa acatttttat 7200

tttaatactg atggtattat gcagatagga gtgtttaaag gacctaatgg atttgaatac 7260

tttgcacctg ctaatacgga tgctaacaac atagaaggtc aagctatact ttaccaaaat 7320

aaattcttaa ctttgaatgg taaaaaatat tactttggta gtgactcaaa agcagttacc 7380

ggactgcgaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tgttgcagtt 7440

actggatggc aaactattaa tggtaaaaaa tactacttta atactaacac ttctatagct 7500

tcaactggtt atacaattat tagtggtaaa catttttatt ttaatactga tggtattatg 7560

cagataggag tgtttaaagg acctgatgga tttgaatact ttgcacctgc taatacagat 7620

gctaacaata tagaaggtca agctatacgt tatcaaaata gattcctata tttacatgac 7680

aatatatatt attttggtaa taattcaaaa gcggctactg gttgggtaac tattgatggt 7740

aatagatatt acttcgagcc taatacagct atgggtgcga atggttataa aactattgat 7800

aataaaaatt tttactttag aaatggttta cctcagatag gagtgtttaa agggtctaat 7860

ggatttgaat actttgcacc tgctaatacg gatgctaaca atatagaagg tcaagctata 7920

cgttatcaaa atagattcct acatttactt ggaaaaatat attactttgg taataattca 7980

aaagcagtta ctggatggca aactattaat ggtaaagtat attactttat gcctgatact 8040

gctatggctg cagctggtgg acttttcgag attgatggtg ttatatattt ctttggtgtt 8100

gatggagtaa aagcccctgg gatatatggc taa 8133

<210> 21

<211> 2366

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 21

Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gln Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg

1 5 10 15

Phe Arg Val Gln Glu Asp Glu Tyr Val Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu

20 25 30

Glu Tyr His Asn Met Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Lys Tyr Leu Lys

35 40 45

Leu Lys Asp Ile Asn Ser Leu Thr Asp Ile Tyr Ile Asp Thr Tyr Lys

50 55 60

Lys Ser Gly Arg Asn Lys Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Val

65 70 75 80

Thr Glu Val Leu Glu Leu Lys Asn Asn Asn Leu Thr Pro Val Glu Lys

85 90 95

Asn Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Gln Ile Asn Asp Thr Ala Ile

100 105 110

Asn Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Val Asn Ser Asp Tyr Asn Val Asn

115 120 125

Val Phe Tyr Asp Ser Asn Ala Phe Leu Ile Asn Thr Leu Lys Lys Thr

130 135 140

Ile Val Glu Ser Ala Thr Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn

145 150 155 160

Leu Asn Asp Pro Arg Phe Asp Tyr Asn Lys Phe Tyr Arg Lys Arg Met

165 170 175

Glu Ile Ile Tyr Asp Lys Gln Lys Asn Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Thr

180 185 190

Gln Arg Glu Glu Asn Pro Asp Leu Ile Ile Asp Asp Ile Val Lys Ile

195 200 205

Tyr Leu Ser Asn Glu Tyr Ser Lys Asp Ile Asp Glu Leu Asn Ser Tyr

210 215 220

Ile Glu Glu Ser Leu Asn Lys Val Thr Glu Asn Ser Gly Asn Asp Val

225 230 235 240

Arg Asn Phe Glu Glu Phe Lys Gly Gly Glu Ser Phe Lys Leu Tyr Glu

245 250 255

Gln Glu Leu Val Glu Arg Trp Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Leu

260 265 270

Arg Ile Ser Ala Leu Lys Glu Val Gly Gly Val Tyr Leu Asp Val Asp

275 280 285

Met Leu Pro Gly Ile Gln Pro Asp Leu Phe Glu Ser Ile Glu Lys Pro

290 295 300

Ser Ser Val Thr Val Asp Phe Trp Glu Met Val Lys Leu Glu Ala Ile

305 310 315 320

Met Lys Tyr Lys Glu Tyr Ile Pro Gly Tyr Thr Ser Glu His Phe Asp

325 330 335

Met Leu Asp Glu Glu Val Gln Ser Ser Phe Glu Ser Val Leu Ala Ser

340 345 350

Lys Ser Asp Lys Ser Glu Ile Phe Ser Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala

355 360 365

Ser Pro Leu Glu Val Lys Ile Ala Phe Asn Ser Lys Gly Ile Ile Asn

370 375 380

Gln Gly Leu Ile Ser Val Lys Asp Ser Tyr Cys Ser Asn Leu Ile Val

385 390 395 400

Lys Gln Ile Glu Asn Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Asn Ser Leu Asn Pro

405 410 415

Ala Ile Ser Glu Asp Asn Asp Phe Asn Thr Thr Thr Asn Ala Phe Ile

420 425 430

Asp Ser Ile Met Ala Glu Ala Asn Ala Asp Asn Gly Arg Phe Met Met

435 440 445

Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Arg Val Gly Phe Phe Pro Asp Val Lys Thr

450 455 460

Thr Ile Asn Leu Ser Gly Pro Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Tyr Gln Asp

465 470 475 480

Leu Leu Met Phe Lys Glu Gly Ser Met Asn Ile His Leu Ile Glu Ala

485 490 495

Asp Leu Arg Asn Phe Glu Ile Ser Lys Thr Asn Ile Ser Gln Ser Thr

500 505 510

Glu Gln Glu Met Ala Ser Leu Trp Ser Phe Asp Asp Ala Arg Ala Lys

515 520 525

Ala Gln Phe Glu Glu Tyr Lys Lys Asn Tyr Phe Glu Gly Ser Leu Gly

530 535 540

Glu Asp Asp Asn Leu Asp Phe Ser Gln Asn Thr Val Val Asp Lys Glu

545 550 555 560

Tyr Leu Leu Glu Lys Ile Ser Ser Leu Ala Arg Ser Ser Glu Arg Gly

565 570 575

Tyr Ile His Tyr Ile Val Gln Leu Gln Gly Asp Lys Ile Ser Tyr Glu

580 585 590

Ala Ala Cys Asn Leu Phe Ala Lys Thr Pro Tyr Asp Ser Val Leu Phe

595 600 605

Gln Lys Asn Ile Glu Asp Ser Glu Ile Ala Tyr Tyr Tyr Asn Pro Gly

610 615 620

Asp Gly Glu Ile Gln Glu Ile Asp Lys Tyr Lys Ile Pro Ser Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asp Arg Pro Lys Ile Lys Leu Thr Phe Ile Gly His Gly Lys Asp

645 650 655

Glu Phe Asn Thr Asp Ile Phe Ala Gly Leu Asp Val Asp Ser Leu Ser

660 665 670

Thr Glu Ile Glu Thr Ala Ile Asp Leu Ala Lys Glu Asp Ile Ser Pro

675 680 685

Lys Ser Ile Glu Ile Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser Tyr Ser

690 695 700

Val Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Arg Val Lys

705 710 715 720

Asp Lys Val Ser Glu Leu Met Pro Ser Ile Ser Gln Asp Ser Ile Ile

725 730 735

Val Ser Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly Arg Arg

740 745 750

Glu Leu Leu Asp His Ser Gly Glu Trp Ile Asn Lys Glu Glu Ser Ile

755 760 765

Ile Lys Asp Ile Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Ser Phe Asn Pro Lys Glu

770 775 780

Asn Lys Ile Ile Val Lys Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Ser Thr Leu

785 790 795 800

Leu Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asp Ile Glu Leu Glu

805 810 815

Glu Lys Val Met Leu Ala Glu Cys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn Ile

820 825 830

Asp Thr Gln Val Val Glu Gly Arg Ile Glu Glu Ala Lys Ser Leu Thr

835 840 845

Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asn Glu Phe Lys Leu Ile Glu Ser

850 855 860

Ile Ser Asp Ala Leu Tyr Asp Leu Lys Gln Gln Asn Glu Leu Glu Glu

865 870 875 880

Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Leu Glu Thr Asp Glu Gly Phe

885 890 895

Ser Ile Arg Phe Ile Asp Lys Glu Thr Gly Glu Ser Ile Phe Val Glu

900 905 910

Thr Glu Lys Ala Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn His Ile Thr Glu Glu

915 920 925

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr Val Asn Gly Lys Leu

930 935 940

Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Ala Thr His Glu Val Asn Thr Leu Asn

945 950 955 960

Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr Asn Ser Ser Lys Glu

965 970 975

Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys Val Gln Val Tyr Ala Gln

980 985 990

Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Thr Asp Ala Ala Lys Val Val

995 1000 1005

Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro

1010 1015 1020

Thr Leu Ser Glu Gly Leu Pro Val Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly

1025 1030 1035

Val Ser Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp

1040 1045 1050

Pro Leu Leu Arg Gln Glu Ile Glu Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala

1055 1060 1065

Val Asn Leu Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ile Ile Thr Ser Ser Leu

1070 1075 1080

Gly Ile Ala Ser Gly Phe Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly

1085 1090 1095

Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Ile Leu

1100 1105 1110

Arg Asp Lys Ala Thr Lys Val Val Asp Tyr Phe Ser His Ile Ser

1115 1120 1125

Leu Ala Glu Ser Glu Gly Ala Phe Thr Ser Leu Asp Asp Lys Ile

1130 1135 1140

Met Met Pro Gln Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp Phe Asn

1145 1150 1155

Asn Asn Ser Ile Thr Leu Gly Lys Cys Glu Ile Trp Arg Met Glu

1160 1165 1170

Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Asp Asp Ile Asp His Phe Phe

1175 1180 1185

Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Glu Pro His Leu Ser Ile Tyr

1190 1195 1200

Asp Val Leu Glu Val Gln Lys Glu Glu Leu Asp Leu Ser Lys Asp

1205 1210 1215

Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro Asn Arg Val Phe Ala Trp Glu

1220 1225 1230

Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp Gly Thr

1235 1240 1245

Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr

1250 1255 1260

Trp Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu

1265 1270 1275

Lys Pro Arg Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Arg Ile Asn Leu Asp Ser

1280 1285 1290

Asn Thr Arg Ser Phe Ile Val Pro Val Ile Thr Thr Glu Tyr Ile

1295 1300 1305

Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr

1310 1315 1320

Ala Leu Ser Leu Ser Gln Tyr Asn Met Asn Ile Asn Ile Glu Leu

1325 1330 1335

Asn Glu Asn Asp Thr Trp Val Ile Asp Val Asp Asn Val Val Arg

1340 1345 1350

Asp Val Thr Ile Glu Ser Asp Lys Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ile

1355 1360 1365

Glu Asn Ile Leu Ser Lys Leu Ser Ile Glu Asp Asn Lys Ile Ile

1370 1375 1380

Leu Asp Asn His Glu Ile Asn Phe Ser Gly Thr Leu Asn Gly Gly

1385 1390 1395

Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe Ser Ile Leu Glu Gly Ile Asn

1400 1405 1410

Ala Val Ile Glu Val Asp Leu Leu Ser Lys Ser Tyr Lys Val Leu

1415 1420 1425

Ile Ser Gly Glu Leu Lys Thr Leu Met Ala Asn Ser Asn Ser Val

1430 1435 1440

Gln Gln Lys Ile Asp Tyr Ile Gly Leu Asn Ser Glu Leu Gln Lys

1445 1450 1455

Asn Ile Pro Tyr Ser Phe Met Asp Asp Lys Gly Lys Glu Asn Gly

1460 1465 1470

Phe Ile Asn Cys Ser Thr Lys Glu Gly Leu Phe Val Ser Glu Leu

1475 1480 1485

Ser Asp Val Val Leu Ile Ser Lys Val Tyr Met Asp Asn Ser Lys

1490 1495 1500

Pro Leu Phe Gly Tyr Cys Ser Asn Asp Leu Lys Asp Val Lys Val

1505 1510 1515

Ile Thr Lys Asp Asp Val Ile Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys

1520 1525 1530

Asp Asp Ile Lys Ile Ser Leu Ser Phe Thr Ile Gln Asp Glu Asn

1535 1540 1545

Thr Ile Lys Leu Asn Gly Val Tyr Leu Asp Glu Asn Gly Val Ala

1550 1555 1560

Glu Ile Leu Lys Phe Met Asn Lys Lys Gly Ser Thr Asn Thr Ser

1565 1570 1575

Asp Ser Leu Met Ser Phe Leu Glu Ser Met Asn Ile Lys Ser Ile

1580 1585 1590

Phe Ile Asn Ser Leu Gln Ser Asn Thr Lys Leu Ile Leu Asp Thr

1595 1600 1605

Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe

1610 1615 1620

Ile Cys Asp Lys Asp Asn Asn Ile Gln Pro Tyr Phe Ile Lys Phe

1625 1630 1635

Asn Thr Leu Glu Thr Lys Tyr Thr Leu Tyr Val Gly Asn Arg Gln

1640 1645 1650

Asn Met Ile Val Glu Pro Asn Tyr Asp Leu Asp Asp Ser Gly Asp

1655 1660 1665

Ile Ser Ser Thr Val Ile Asn Phe Ser Gln Lys Tyr Leu Tyr Gly

1670 1675 1680

Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val Ile Ile Ser Pro Asn Ile Tyr

1685 1690 1695

Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro Ile Tyr Glu Ala Asn Asn Thr

1700 1705 1710

Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp Thr Asn Tyr Ile Ser Glu Lys

1715 1720 1725

Ile Asn Ile Asn Ile Asn Asp Leu Ser Ile Arg Tyr Val Trp Ser

1730 1735 1740

Asn Asp Gly Ser Asp Phe Ile Leu Met Ser Thr Asp Glu Glu Asn

1745 1750 1755

Lys Val Ser Gln Val Lys Ile Arg Phe Thr Asn Val Phe Lys Gly

1760 1765 1770

Asn Thr Ile Ser Asp Lys Ile Ser Phe Asn Phe Ser Asp Lys Gln

1775 1780 1785

Asp Val Ser Ile Asn Lys Val Ile Ser Thr Phe Thr Pro Ser Tyr

1790 1795 1800

Tyr Val Glu Gly Leu Leu Asn Tyr Asp Leu Gly Leu Ile Ser Leu

1805 1810 1815

Tyr Asn Glu Lys Phe Tyr Ile Asn Asn Phe Gly Met Met Val Ser

1820 1825 1830

Gly Leu Val Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro

1835 1840 1845

Ile Lys Asn Leu Ile Thr Gly Phe Thr Thr Ile Gly Asp Asp Lys

1850 1855 1860

Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Asn Gly Gly Ala Ala Ser Val Gly Glu

1865 1870 1875

Thr Ile Ile Asp Gly Lys Asn Tyr Tyr Phe Ser Gln Asn Gly Val

1880 1885 1890

Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe

1895 1900 1905

Ala Pro Ala Asp Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile

1910 1915 1920

Asp Phe Thr Gly Lys Leu Thr Ile Asp Glu Asn Val Tyr Tyr Phe

1925 1930 1935

Gly Asp Asn Tyr Arg Ala Ala Ile Glu Trp Gln Thr Leu Asp Asp

1940 1945 1950

Glu Val Tyr Tyr Phe Ser Thr Asp Thr Gly Arg Ala Phe Lys Gly

1955 1960 1965

Leu Asn Gln Ile Gly Asp Asp Lys Phe Tyr Phe Asn Ser Asp Gly

1970 1975 1980

Ile Met Gln Lys Gly Phe Val Asn Ile Asn Asp Lys Thr Phe Tyr

1985 1990 1995

Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Ser Gly Tyr Thr Glu Ile Asp

2000 2005 2010

Gly Lys Tyr Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly

2015 2020 2025

Val Phe Asn Thr Ala Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asp

2030 2035 2040

Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Ala Leu Ser Tyr Ser Gly

2045 2050 2055

Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe

2060 2065 2070

Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr

2075 2080 2085

Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Ile Ser Ile

2090 2095 2100

Ile Asn Asp Gly Lys Tyr Tyr Phe Asn Asp Ser Gly Ile Met Gln

2105 2110 2115

Ile Gly Phe Val Thr Ile Asn Asn Glu Val Phe Tyr Phe Ser Asp

2120 2125 2130

Ser Gly Ile Val Glu Ser Gly Met Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr

2135 2140 2145

Phe Tyr Ile Asp Glu Asn Gly Leu Val Gln Ile Gly Val Phe Asp

2150 2155 2160

Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn

2165 2170 2175

Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg

2180 2185 2190

Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu

2195 2200 2205

Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr

2210 2215 2220

Phe Asp Pro Glu Thr Lys Lys Ala Tyr Lys Gly Ile Asn Val Ile

2225 2230 2235

Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asn Gly Ile Met Arg Thr

2240 2245 2250

Gly Leu Ile Thr Phe Glu Asp Asn His Tyr Tyr Phe Asn Glu Asp

2255 2260 2265

Gly Ile Met Gln Tyr Gly Tyr Leu Asn Ile Glu Asp Lys Thr Phe

2270 2275 2280

Tyr Phe Ser Glu Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr

2285 2290 2295

Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu

2300 2305 2310

Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu

2315 2320 2325

Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr

2330 2335 2340

Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp

2345 2350 2355

Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu

2360 2365

<210> 22

<211> 7101

<212> ДНК

<213> Clostridium difficile

<400> 22

atgagtttag ttaatagaaa acagttagaa aaaatggcaa atgtaagatt tcgtgttcag 60

gaagatgaat atgtagcaat attggatgct ttagaagaat atcataatat gtcagagaat 120

actgtagtcg aaaaatattt aaaattaaaa gatataaata gtttaacaga tatttatata 180

gatacatata aaaagtctgg tagaaataaa gccttaaaaa aatttaagga atacctagtt 240

acagaagtat tagagctaaa gaataataat ttaactccag ttgagaaaaa tttacatttt 300

gtttggattg gaggtcaaat aaatgacact gctattaatt atataaatca atggaaagat 360

gtaaatagtg attataatgt taatgttttt tatgatagta atgcattttt gataaacaca 420

ttgaaaaaaa ctatagtaga atcagcaaca aatgatacac ttgaatcatt tagagaaaac 480

ttaaatgacc ctagatttga ctataataaa ttttacagaa aacgtatgga gataatctat 540

gataagcaga aaaatttcat aaattactat aaaactcaaa gagaagaaaa tcctgacctt 600

ataattgatg atattgtaaa gatatatctt tcaaacgagt attcaaagga tatagatgaa 660

cttaattcct atattgaaga gtcattaaat aaagttacag aaaatagtgg gaatgatgtt 720

agaaactttg aagaatttaa aggtggagag tcattcaaat tatatgaaca agagttggta 780

gaaagatgga atttggcagc tgcttctgac atattaagaa tatctgcctt aaaagaagtt 840

ggtggtgtat atttagatgt tgatatgtta ccaggaatac aaccagacct atttgagtct 900

atagagaaac ctagttcagt aacagtggat ttttgggaaa tggtaaaatt agaagctata 960

atgaaataca aagaatacat accaggatat acttcagagc attttgatat gttggatgaa 1020

gaagttcaaa gtagttttga atctgttcta gcttctaagt cagataagtc agaaatattc 1080

tcatcacttg gcgatatgga ggcatcacca ctagaagtta aaattgcatt taatagtaaa 1140

ggtattataa atcaaggact aatttctgtg aaagactcat attgtagcaa tttaatagta 1200

aaacaaatcg agaacagata taagatattg aataatagtt taaatccagc tattagcgag 1260

gataacgatt tcaatactac aacgaatgct tttattgata gtataatggc tgaagctaat 1320

gcagataatg gtagatttat gatggaacta ggaaagtatt taagagttgg tttcttccca 1380

gatgttaaaa ctactattaa cttaagtggc cctgaagcat atgcggcagc ttatcaagat 1440

ttattaatgt ttaaagaagg tagtatgaat atccatttga tagaagctga cttaagaaac 1500

tttgaaatct ctaaaactaa tatttctcaa tcaactgaac aagaaatggc tagcttatgg 1560

tcatttgacg atgcaagagc taaagctcaa tttgaagaat acaaaaaaaa ttactttgaa 1620

ggttctcttg gagaagatga caatcttgac ttttctcaaa atacagtagt tgacaaggag 1680

tatcttttag aaaaaatatc ttcattagca agaagttcag agagaggata tatacactat 1740

attgttcagt tacaaggaga taaaattagt tatgaagcag catgtaactt atttgcaaag 1800

actccttatg atagtgtact gtttcagaaa aatatagaag attcagaaat tgcatattat 1860

tataatcctg gagatggtga aatacaagaa atagacaagt ataaaattcc aagtataatt 1920

tctgatagac ctaagattaa attaacattt attggtcatg gtaaagatga atttaatact 1980

gatatatttg caggtcttga tgtagattca ttatccacag aaatagaaac agcaatagat 2040

ttagctaaag aggatatttc tcctaagtca atagaaataa acttactggg atgtaacatg 2100

tttagctatt ctgtaaatgt agaggagact tatcctggga aattattact tagagttaaa 2160

gataaagtat cagaattaat gccatctata agtcaagact ctattatagt aagtgcaaat 2220

caatatgaag ttagaataaa tagtgaagga agaagagaat tattggatca ttctggtgaa 2280

tggataaata aagaagaaag tattataaag gatatttcat caaaagaata tatatcattt 2340

aatcctaaag aaaataaaat tatagtaaaa tctaaaaatt tacctgaatt atctacatta 2400

ttacaagaaa ttagaaacaa ttctaattca agtgatattg aactagaaga aaaagtaatg 2460

ttagcagaat gtgagataaa tgttatttca aatatagata cacaagtggt agaaggaagg 2520

attgaagaag ctaaaagctt aacttctgac tctattaatt atataaagaa tgaatttaaa 2580

ctaatagaat ctatttctga tgcactatac gatttaaaac aacagaatga attagaagag 2640

tctcatttta tatcttttga ggatatattg gagactgatg aaggctttag tataagattt 2700

attgataaag aaactggaga atctatattt gtagaaactg aaaaggcaat attctctgaa 2760

tatgctaatc atataactga agagatttct aagataaaag gtactatatt tgatactgta 2820

aatggtaagt tagtaaaaaa agtaaattta gatgctacac atgaagtgaa tactttaaat 2880

gctgcatttt ttatacaatc attaatagaa tataatagtt ctaaagaatc tcttagtaat 2940

ttaagtgtag caatgaaagt tcaagtttat gctcaattat ttagtactgg tttaaatact 3000

attacagatg cagccaaagt tgttgaatta gtatcaactg cattagatga aactatagat 3060

ttacttccta cattatctga aggattacct gtaattgcaa ctatcataga tggtgtaagt 3120

ttaggtgcag caatcaaaga gctaagtgaa acaagtgacc cattattaag acaagaaata 3180

gaagctaaga taggtataat ggcagtaaat ttaacagcag ctacaactgc aatcattact 3240

tcatctttag gaatagctag tggatttagt atacttttag ttcctttagc aggaatttca 3300

gcaggtatac caagtttagt aaacaatgag cttatcctaa gagataaagc aacaaaagtt 3360

gtagattatt ttagtcatat atcattagct gagtctgaag gagcatttac ttcattagat 3420

gataaaataa tgatgccaca agatgattta gtaatatctg agatagactt taataacaat 3480

tcaataactt taggtaaatg tgaaatctgg agaatggaag gtggctcagg tcatactgta 3540

actgatgata tagatcactt cttttcagca ccatcaataa catatagaga gccacactta 3600

tctatatatg acgtattgga agtacaaaaa gaagaacttg atttgtcaaa agatttaatg 3660

gtattaccta atgctccaaa tagagtattt gcttgggaaa caggatggac accaggttta 3720

agaagcttag aaaatgatgg cacaaaactg ttagaccgta taagagataa ctatgaaggt 3780

gagttttatt ggagatattt tgcttttata gctgatgctt taataacaac attaaaacca 3840

agatatgaag atactaatat aagaataaat ttagatagta atactagaag ctttatagtc 3900

ccagtgataa ctacagaata tataagagag aaattatcat attcttttta tggttctgga 3960

ggaacttatg cattatctct ttctcaatac aatatgaata taaacataga attaaatgaa 4020

aatgatactt gggttataga tgtcgacaat gtcgtaagag atgtcactat agaatctgat 4080

aaaattaaaa aaggagattt aatagagaat attttatcta aattaagtat tgaagacaat 4140

aaaattattt tagataatca tgaaattaat ttctctggaa cattaaatgg aggtaatgga 4200

tttgtatctt taacattctc aatcttagaa ggaataaatg cagttataga agttgattta 4260

ttatctaaat catataaagt tcttatttct ggtgaactaa aaacattgat ggcaaattca 4320

aattctgttc aacagaaaat agattatata ggattgaaca gcgaattaca aaaaaatata 4380

ccttatagtt ttatggatga taaaggaaaa gaaaatggat ttattaattg ttctacaaaa 4440

gaaggtttat ttgtatctga attatctgat gtagttctta taagtaaagt ttatatggac 4500

aatagtaaac ctctatttgg atattgtagt aatgatttga aagatgttaa agtcataact 4560

aaagatgacg ttattatatt aacaggatat tatttaaaag atgatataaa aatctctctt 4620

tcttttacta tacaagatga aaatactata aaattaaatg gagtatattt agatgaaaat 4680

ggagtagctg aaatattgaa atttatgaat aaaaaaggta gtacaaatac ttcagattct 4740

ttaatgagct ttttagaaag tatgaatata aaaagtattt tcataaattc cttacaatct 4800

aatactaagc ttatattaga tactaatttt ataataagtg gtactacttc tattggtcaa 4860

tttgagttta tttgtgataa agataataat atacaaccat atttcattaa gtttaataca 4920

ctagaaacta aatatactct atatgtaggt aatagacaaa atatgatagt agaaccaaat 4980

tatgatttag atgattctgg agatatatct tcaactgtca ttaatttttc tcagaaatac 5040

ctttatggaa tagacagttg tgttaataaa gttataattt cgccaaatat atatacagat 5100

gaaataaaca taacacctat atatgaagca aataatactt atccagaagt gattgtatta 5160

gatacaaatt atataagtga aaaaatcaat attaatatca atgatttatc tatacgatat 5220

gtatggagta atgatggaag tgattttatt cttatgtcaa ctgatgaaga gaacaaggta 5280

tcacaagtta aaataagatt tactaatgtt tttaaaggta atactatatc agataagata 5340

tcttttaatt ttagtgataa gcaagatgta tctataaata aagttatttc aacatttaca 5400

ccttcatatt atgtggaagg attacttaat tatgatttag gtctgatttc tttatacaat 5460

gagaaatttt atattaataa ctttggaatg atggtgtctg gattagtata tattaatgat 5520

tcattatatt atttcaagcc accaataaag aacttgataa ctggatttac aactataggt 5580

gatgataaat actactttaa tccagataat ggtggagctg cttcagtcgg agaaacaata 5640

attgatggca aaaactacta cttcagccaa aatggagtgt tacaaacagg tgtatttagt 5700

acagaagatg gatttaaata ttttgctcca gcagatacac ttgatgaaaa tctagagggg 5760

gaagcaattg attttactgg caaactaact attgatgaaa atgtttatta ttttggagat 5820

aattatagag cagctataga atggcaaaca ttagatgatg aagtgtacta ttttagtaca 5880

gatacaggta gagcttttaa agggctaaat caaataggtg atgataaatt ctatttcaac 5940

tctgatggta ttatgcaaaa aggatttgtt aatataaatg ataagacatt ctattttgat 6000

gattctggtg tgatgaagtc aggatatact gaaatagatg gaaaatattt ttactttgct 6060

gagaatggag aaatgcaaat aggagtattt aatacagcag atggatttaa atattttgct 6120

catcatgatg aagatttagg aaatgaagaa ggtgaagcac tttcatattc tggtatactt 6180

aattttaaca ataagattta ttattttgat gattcattta cagcagtagt tggatggaag 6240

gatttagaag atggttcaaa atattacttt gatgaagata cagcagaagc atatataggt 6300

atctcaataa ttaatgatgg taaatattat tttaatgatt ctggaatcat gcaaattgga 6360

tttgtcacaa taaataatga agtattttat ttctctgatt ctggaatagt agaatctgga 6420

atgcaaaata tagatgataa ttatttctat atagacgaaa atggtctagt tcaaattggt 6480

gtatttgaca cttcagatgg atataaatac tttgcaccag ctaatactgt aaatgataat 6540

atctatggac aagcagttga atatagtggt ttagttagag ttggtgaaga tgtatattat 6600

tttggagaaa catatacaat tgagactggt tggatatatg atatggaaaa tgaaagtgat 6660

aaatattatt tcgatccaga aactaaaaaa gcatataaag gtattaatgt aattgatgat 6720

ataaaatact attttgatga gaatggaata atgagaacag gtcttataac atttgaagat 6780

aatcattact attttaatga agatggtatt atgcaatatg gttatctaaa tatagaagat 6840

aagacgttct actttagtga agatggtatt atgcagattg gagtatttaa tacaccagat 6900

ggatttaaat attttgcaca tcaaaatact ttagatgaga attttgaggg agaatcaata 6960

aactatactg gttggttaga tttagatgaa aagagatatt attttacaga tgaatatatt 7020

gcagcaactg gttcagttat tattgatggt gaggagtatt attttgatcc tgatacagct 7080

caattagtga ttagtgaata g 7101

<210> 23

<211> 2366

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium difficile

<400> 23

Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gln Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg

1 5 10 15

Phe Arg Val Gln Glu Asp Glu Tyr Val Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu

20 25 30

Glu Tyr His Asn Met Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Lys Tyr Leu Lys

35 40 45

Leu Lys Asp Ile Asn Ser Leu Thr Asp Ile Tyr Ile Asp Thr Tyr Lys

50 55 60

Lys Ser Gly Arg Asn Lys Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Val

65 70 75 80

Thr Glu Val Leu Glu Leu Lys Asn Asn Asn Leu Thr Pro Val Glu Lys

85 90 95

Asn Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Gln Ile Asn Asp Thr Ala Ile

100 105 110

Asn Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Val Asn Ser Asp Tyr Asn Val Asn

115 120 125

Val Phe Tyr Asp Ser Asn Ala Phe Leu Ile Asn Thr Leu Lys Lys Thr

130 135 140

Ile Val Glu Ser Ala Thr Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn

145 150 155 160

Leu Asn Asp Pro Arg Phe Asp Tyr Asn Lys Phe Tyr Arg Lys Arg Met

165 170 175

Glu Ile Ile Tyr Asp Lys Gln Lys Asn Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Thr

180 185 190

Gln Arg Glu Glu Asn Pro Asp Leu Ile Ile Asp Asp Ile Val Lys Ile

195 200 205

Tyr Leu Ser Asn Glu Tyr Ser Lys Asp Ile Asp Glu Leu Asn Ser Tyr

210 215 220

Ile Glu Glu Ser Leu Asn Lys Val Thr Glu Asn Ser Gly Asn Asp Val

225 230 235 240

Arg Asn Phe Glu Glu Phe Lys Gly Gly Glu Ser Phe Lys Leu Tyr Glu

245 250 255

Gln Glu Leu Val Glu Arg Trp Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Leu

260 265 270

Arg Ile Ser Ala Leu Lys Glu Val Gly Gly Val Tyr Leu Asp Val Asp

275 280 285

Met Leu Pro Gly Ile Gln Pro Asp Leu Phe Glu Ser Ile Glu Lys Pro

290 295 300

Ser Ser Val Thr Val Asp Phe Trp Glu Met Val Lys Leu Glu Ala Ile

305 310 315 320

Met Lys Tyr Lys Glu Tyr Ile Pro Gly Tyr Thr Ser Glu His Phe Asp

325 330 335

Met Leu Asp Glu Glu Val Gln Ser Ser Phe Glu Ser Val Leu Ala Ser

340 345 350

Lys Ser Asp Lys Ser Glu Ile Phe Ser Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala

355 360 365

Ser Pro Leu Glu Val Lys Ile Ala Phe Asn Ser Lys Gly Ile Ile Asn

370 375 380

Gln Gly Leu Ile Ser Val Lys Asp Ser Tyr Cys Ser Asn Leu Ile Val

385 390 395 400

Lys Gln Ile Glu Asn Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Asn Ser Leu Asn Pro

405 410 415

Ala Ile Ser Glu Asp Asn Asp Phe Asn Thr Thr Thr Asn Ala Phe Ile

420 425 430

Asp Ser Ile Met Ala Glu Ala Asn Ala Asp Asn Gly Arg Phe Met Met

435 440 445

Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Arg Val Gly Phe Phe Pro Asp Val Lys Thr