ГИБРИДНЫЕ НЕЙРОТОКСИНЫ Российский патент 2022 года по МПК C07K14/33 C07K14/28 C07K19/00 C12N15/09 C12N15/63 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к гибридным нейротоксинам с улучшенными терапевтическими свойствами, в частности, с более селективной аффинностью связывания ганглиозидов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Бактерии рода Clostridia вырабатывают высокоэффективные и специфичные белковые токсины, которые могут отравлять нейроны и другие клетки, в которые они попадают. Примеры таких токсинов клостридий включают нейротоксины, продуцируемые C. tetani (TeNT) и серотипами A-G C. botulinum (BoNT), а также те, которые продуцируются C. baratii и C. butyricum.

Среди нейротоксинов клостридий есть некоторые из самых сильных известных токсинов. Например, ботулинические нейротоксины имеют медианное значение летальной дозы (LD50) для мышей в диапазоне от 0,5 до 5 нг/кг, в зависимости от серотипа. Как столбнячный, так и ботулинический токсины действуют, подавляя функцию пораженных нейронов, в частности, высвобождение нейротрансмиттеров. В то время как ботулинический токсин действует на нервно-мышечное соединение и ингибирует холинергическую передачу в периферической нервной системе, столбнячный токсин действует в центральной нервной системе.

В природе нейротоксины клостридий синтезируются в виде одноцепочечного полипептида, который посттрансляционно модифицируется в результате протеолитического расщепления с образованием двух полипептидных цепей, соединенных друг с другом дисульфидной связью. Расщепление происходит по определенному сайту расщепления, часто называемому сайтом активации, который расположен между остатками цистеина, обеспечивающими межцепочечную дисульфидную связь. Именно эта двухцепочечная форма является активной формой токсина. Две цепи называются тяжелой цепью (H-цепью), которая имеет молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепью), которая имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа. H-цепь включает N-концевой транслоцирующий компонент (H_N-домен) и С-концевой направляющий компонент (H_C-домен). Сайт расщепления расположен между L-цепью и транслоцирующим доменом. После связывания H_C-домена с его нейроном-мишенью и интернализации связавшегося токсина в клетку через эндосому H_N-домен транслоцирует L-цепь через эндосомальную мембрану и в цитозоль, а L-цепь обеспечивает протеолитическую функцию (также известна как нецитотоксическая протеаза).

Нецитотоксические протеазы действуют путем протеолитического расщепления внутриклеточных транспортных белков, известных как белки SNARE (например, SNAP-25, VAMP или синтаксин) - см. Gerald K (2002) «Cell and Molecular Biology» (4-е издание) John Wiley & Sons, Inc. Акроним SNARE происходит от термина «растворимый рецептор прикрепления NSF», где NSF означает чувствительный к N-этилмалеимиду фактор. Белки SNARE необходимы для слияния внутриклеточных везикул и, таким образом, для секреции молекул посредством везикулярного транспорта из клетки. Протеолитическая функция представляет собой цинк-зависимую эндопептидазную активность и имеет высокую субстратную специфичность в отношении белков SNARE. Соответственно, после доставки в желаемую клетку-мишень нецитотоксическая протеаза способна ингибировать клеточную секрецию из клетки-мишени. Протеолитические L-цепи нейротоксинов клостридий представляют собой нецитотоксические протеазы, которые расщепляют белки SNARE. Протеолитические L-цепи из BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G расщепляют VAMP, протеолитические L-цепи из BoNT/A и BoNT/E расщепляют SNAP25, а протеолитическая L-цепь BoNT/C расщепляет как SNAP25, так и синтаксин, что приводит к ингибированию высвобождения нейротрансмиттера и последующему нейропараличу (Rossetto, O. et al., "Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights." Nature Reviews Microbiology 12.8 (2014): 535-549).

Ввиду того, что белки SNARE экспрессируются во всех клетках, нейротоксины клостридий, такие как ботулинический токсин, успешно используются в широком спектре методов лечения. В настоящее время все утвержденные лекарственные средства/косметические препараты, содержащие BoNT, содержат природные нейротоксины, очищенные из штаммов клостридий (BoNT/A в случае DYSPORT®, BOTOX® или XEOMIN®, и BoNT/B в случае MYOBLOC®).

В качестве примера авторы изобретения приводят ссылку на William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004), в которой описано использование нейротоксинов клостридий, таких как ботулинические нейротоксины (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G, а также столбнячного нейротоксина (TeNT), для ингибирования передачи сигнала в нейронах в ряде терапевтических и косметических или эстетических применений - например, доступные в продаже продукты ботулинического токсина в настоящее время одобрены в качестве терапевтических средств для показаний, включающих фокальную спастичность, спастичность верхних конечностей, спастичность нижних конечностей, шейную дистонию, блефароспазм, гемифациальный спазм, гипергидроз подмышечных впадин, хроническую мигрень, нейрогенную гиперактивность детрузора, глабелярных морщин и глубоких боковых периорбитальных морщин. Кроме того, терапия нейротоксинами клостридий описана для лечения нервно-мышечных расстройств (см. US 6872397); для лечения заболеваний матки (см. US 2004/0175399); для лечения язвеной и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (см. US 2004/0086531); для лечения дистонии (см. US 6319505); для лечения глазных болезней (см. US 2004/0234532); для лечения блефароспазма (см. US 2004/0151740); для лечения косоглазия (см. US 2004/0126396); для лечения боли (см. US 6869610, US 6641820, US 6464986 и US 6113915); для лечения фибромиалгии (см. US 6623742, US 2004/0062776); для лечения боли в пояснице (см. US 2004/0037852); для лечения мышечных травм (см. US 6423319); для лечения головной боли в области придаточных пазух носа (см. US 6838434); для лечения тензионной головной боли (см. US 677692); для лечения головной боли (см. US 6458365); для уменьшения головной боли при мигрени (см. US 5714469); для лечения сердечно-сосудистых заболеваний (см. US 6767544); для лечения неврологических заболеваний, таких как болезнь Паркинсона (см. US 6620415, US 6306403); для лечения психоневрологических заболеваний (см. US 2004/0180061, US 2003/0211121); для лечения эндокринных заболеваний (см. US 6827931); для лечения заболеваний щитовидной железы (см. US 6740321); для лечения холинергических заболеваний потовых желез (см. US 6683049); для лечения диабета (см. US 6337075, US 6416765); для лечения заболеваний поджелудочной железы (см. US 6261572, US 6143306); для лечения раковых заболеваний, таких как опухоли кости (см. US 6565870, US 6368605, US 6139845, US 2005/0031648); для лечения ушных заболеваний (см. US 6358926, US 6265379); для лечения вегетативных нарушений, таких как заболевания желудочно-кишечных мышц и другие нарушения функций гладких мышц (см. US 5437291); для лечения повреждений кожи, связанных с пролиферативными заболеваниями клеток кожи (см. US 5670484); для лечения нейрогенных воспалительных заболеваний (см. US 6063768); для уменьшения выпадения волос и стимуляции роста волос (см. US 6299893); для лечения опущенных уголков рта (см. US 6358917); для снижения аппетита (см. US 2004/40253274); при стоматологической терапии и процедурах (см. US 2004/0115139); для лечения нервно-мышечных заболеваний и расстройств (см. US 2002/0010138); для лечения различных заболеваний и расстройств и связанной с ними боли (см. US 2004/0013692); для лечения состояний, возникающих в результате повышенной секреции слизи, таких как астма и ХОБЛ (см. WO 00/10598); и для лечения ненейрональных заболеваний, таких как воспаление, эндокринные заболевания, экзокринные расстройства, иммунологические заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, заболевания костей (см. WO 01/21213). Все вышеперечисленные публикации полностью включены в настоящее описание путем ссылки.

Тем не менее, нативные BoNT не различают пространственное распределение нейромышечных соединений или различных типов нейронов, что может привести к побочным эффектам. Например, лечение спастичности верхних конечностей с помощью BoNT может привести к нежелательным явлениям, таким как сухость во рту и дисфагия (Nair, K. P., and Jonathan Marsden. "The management of spasticity in adults." Bmj 349 (2014): g4737).

Повышение специфичности нейротоксинов клостридий к определенным популяциям нейронов позволит адаптировать нейротоксин клостридий к определенным патологиям с повышением безопасности и уменьшением побочных эффектов.

Настоящее изобретение относится к нейротоксинам с улучшенными терапевтическими свойствами, в частности, с более избирательной аффинностью связывания с определенными нейронами, обеспечивающими мышечные сокращения (нейромышечное соединение) или холинергическую секрецию.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к гибридному нейротоксину, содержащему легкую цепь нейротоксина клостридий (L) и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент (GBM), где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей гибридный нейротоксин по изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеотидную последовательность по изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей нуклеотидную последовательность или вектор по изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей гибридный нейротоксин по изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к гибридному нейротоксину или фармацевтической композиции по изобретению для применения в терапии.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к нетерапевтическому применению гибридного нейротоксина или фармацевтической композиции по изобретению для лечения эстетического или косметического нарушения.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к гибридному нейротоксину, содержащему легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из GM1a, GM1b, GD1a и GalNAc-GD1a, для применения при лечении заболеваний конечностей, связанных с нежелательной нейрональной активностью.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к гибридному нейротоксину, содержащему легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из GT1a и GQ1b, для применения при лечении заболеваний головы или шеи, связанных с нежелательной нейрональной активностью.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения, включающему введение терапевтически эффективного количества гибридного нейротоксина или фармацевтической композиции по изобретению нуждающемуся в этом пациенту.

В другом аспекте изобретение относится к гибридному нейротоксину, содержащему легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с GM1 для использования при лечении сиалореи (или избыточного слюноотделения или слюнотечения).

В другом аспекте изобретение относится к гибридному нейротоксину, содержащему легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из NeuAc GM3, NeuGc GM3, GM2, GM1, GD3 и GD2, для использования при лечении рака.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания конечностей, связанного с нежелательной нейрональной активностью, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества гибридного нейротоксина, содержащего легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из GM1a, GM1b, GD1a и GalNAc-GD1a.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания головы или шеи, связанного с нежелательной нейрональной активностью, включающему себя введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества гибридного нейротоксина, содержащего легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из GT1a и GQ1b.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения сиалореи (или избыточного слюноотделения или слюнотечения), включающему введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества гибридного нейротоксина, включающего легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с GM1.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества гибридного нейротоксина, содержащего легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из NeuAc GM3, NeuGc GM3, GM2, GM1, GD3 и GD2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на открытии авторами изобретения того, что селективность (избирательность) нейротоксина клостридий в отношении нервно-мышечных соединений можно изменять путем введения экзогенных (не принадлежащих клостридиям) ганглиозидсвязывающих доменов в нейротоксин клостридий.

Ботулинические нейротоксины (BoNT) взаимодействуют с нейронами, используя двойной механизм связывания рецепторов, включающий белковые рецепторы и ганглиозиды плазматической мембраны. Было показано, что BoNT/B/G и /DC распознают люминальный домен SytI и SytII (двух основных изоформ синаптотагмина). Было показано, что синаптические везикулярные гликопротеины 2 (SV2), включая три изоформы SV2A, SV2B и SV2C, являются белковыми рецепторами для BoNT/A, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F.

Ганглиозиды представляют собой олигогликозилцерамиды, образующиеся из лактозилцерамида и содержащие остаток сиаловой кислоты, такой как N-ацетилнейраминовая кислота («NANA», «SA», «Neu5Ac» или «NeuAc»). В некоторых случаях компонент сиаловой кислоты представляет собой N-гликолилнейраминовую кислоту (Neu5Gc) или аналог Neu5Ac, в котором аминогруппа заменена на OH (3-дезокси-D-глицеро-D-галактононулозоновая кислота, сокращенно называемая «KDN»). Ганглиозиды классифицируются в соответствии с системой номенклатуры, предложенной Свеннерхолмом, в которой M, D, T и Q относятся к моно-, ди-, три- и тетрасиалоганглиозидам соответственно, а числа 1, 2, 3 и т.д. относятся к порядку миграции ганглиозидов в тонкослойной хроматографии. Например, порядок миграции моносиалоганглиозидов - GM3> GM2> GM1. Чтобы указать различия в базовых структурах, добавляются дополнительные термины, например, GM1a, GD1b и т.д. Гликосфинголипиды, содержащие 0, 1, 2 и 3 остатка сиаловой кислоты, связанные с внутренним галактозным звеном, называются ганглиозидами асиало- (или 0-), a-, b- и c-серий, соответственно, тогда как ганглиозиды, имеющие остатки сиаловой кислоты, связанные с внутренним остатком N-галактозамина, классифицируются как ганглиозиды α-серий. Пути биосинтеза ганглиозидов серий 0, a, b и c включают последовательную активность сиалилтрансфераз и гликозилтрансфераз, что проиллюстрировано, например, в Ledeen et al., 2015 (Ledeen et al., 2015 (Ledeen, Robert W., and Gusheng Wu. "The multi-tasked life of GM1 ganglioside, a true factotum of nature." Trends in biochemical sciences 40.7 (2015): 407-418). Дополнительные остатки сиаловой кислоты могут присоединяться к каждой серии по разным положениям в углеводной цепи, что дает все более сложный и гетерогенный спектр продуктов, таких как ганглиозиды α-серии с остатком (ами) сиаловой кислоты, связанным с внутренним остатком N-ацетилгалактозамина.

Ганглиозиды переносятся на внешнюю сторону плазматической мембраны с помощью транспортной системы, включающей образование везикул. Ганглиозиды присутствуют и концентрируются на поверхности клеток, причем две углеводородные цепи церамидного фрагмента встроены в плазматическую мембрану, а олигосахариды находятся на внеклеточной поверхности, где они представляют сайты распознавания для внеклеточных молекул или поверхностей соседних клеток. Сиалогликановые компоненты ганглиозидов выступают над поверхностью клетки, где они могут участвовать в межмолекулярных взаимодействиях. Они функционируют, распознавая специфические молекулы на поверхности клетки и регулируя активность белков на плазматической мембране. Ганглиозиды также специфично связываются с вирусами и бактериальными токсинами, такими как ботулинический, столбнячный и холерный токсины. Например, специфическим рецептором на клеточной поверхности для холерного токсина является ганглиозид GM1 (или GM1a): Neu5Acα2-3(Galβ1-3GalNAcβ1-4)Galβ1-4Glcβ1Cer.

BoNT имеют в H_CC-домене две независимые области связывания ганглиозидов и рецепторов нейрональных белков. BoNT/A/B/E/F и /G имеют консервативный ганглиозидсвязывающий сайт в H_CC-домене, состоящий из мотива «E(Q) … H (K) … SXWY… G», тогда как BoNT/C/D и /DC имеют два независимых сайта связывания ганглиозидов. (Lam, Kwok-Ho, et al. "Diverse binding modes, same goal: The receptor recognition mechanism of botulinum neurotoxin." Progress in biophysics and molecular biology 117.2 (2015): 225-231.) Большинство BoNT связываются только с ганглиозидами, которые имеют 2,3-связанный остаток N-ацетилнейраминовой кислоты (обозначаемый Sia5), присоединенный к Gal4 олигосахаридного ядра, тогда как соответствующий ганглиозидсвязывающий карман на TeNT также может связываться с GM1a, ганглиозидом, в котором отсутствует остаток сахара Sia5. Было показано, что введение мутации H1241K в рекомбинантный BoNT/F обеспечивает способность связывания GM1 (Benson, Marc A., et al. "Unique ganglioside recognition strategies for clostridial neurotoxins." Journal of Biological Chemistry 286.39 (2011): 34015-34022). Было обнаружено, что BoNT/D связывает GM1a и GD1a (Kroken, Abby R., et al. "Novel ganglioside-mediated entry of botulinum neurotoxin serotype D into neurons." Journal of Biological Chemistry 286.30 (2011): 26828-26837).

Объединяя данные, полученные на мышах с дефицитом ганглиозидов и из биохимических анализов, можно заключить, что BoNT/A, E, F и G предпочтительно связываются с концевым фрагментом NAcGal-Gal-NAcNeu, присутствующим в GD1a и GT1b, тогда как для BoNT/B, C, D и TeNT требуется дисиалильный мотив, присутствующий в GD1b, GT1b и GQ1b. Таким образом, по-видимому, распространенные комплексные полисиалоганглиозиды, такие как GD1a, GD1b и GT1b, необходимы для специфического накопления всех серотипов BoNT и TeNT на поверхности нейрональных клеток в качестве первого этапа интоксикации. (Rummel, Andreas. "Double receptor anchorage of botulinum neurotoxins accounts for their exquisite neurospecificity." Botulinum Neurotoxins. Springer Berlin Heidelberg, 2012. 61-90.)

Авторы изобретения выдвинули гипотезу о том, что можно воспользоваться преимуществом дифференциальной локализации ганглиозидов в организме, чтобы повысить селективность нейротоксинов клостридий в отношении нейронов в определенных положениях. Авторы изобретения, в частности, показали, что B-субъединица холерного токсина может быть использована для переноса способности связывания GM1 в BoNT/A.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к гибридному нейротоксину, содержащему легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий.

Используемый в настоящем документе термин «нейротоксин» означает любой полипептид, который входит в нейрон и ингибирует высвобождение нейротрансмиттера. Этот процесс включает связывание нейротоксина с низкоаффинным или высокоаффинным рецептором, интернализацию нейротоксина, транслокацию эндопептидазной части нейротоксина в цитоплазму и ферментативную модификацию субстрата нейротоксина. Более конкретно, термин «нейротоксин» охватывает любой полипептид, продуцируемый бактериями Clostridium (нейротоксины клостридий), который проникает в нейрон и ингибирует высвобождение нейротрансмиттера, и такие полипептиды, полученные рекомбинантными технологиями или химическими методами. Эта двухцепочечная форма является активной формой токсина. Две цепи называются тяжелой цепью (H-цепь), которая имеет молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепь), которая имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа.

Различные серотипы ботулинического нейротоксина (BoNT) можно различить по инактивации специфичными нейтрализующими антисыворотками, причем такая классификация по серотипу коррелирует с процентной идентичностью последовательностей на аминокислотном уровне. Белки BoNT данного серотипа далее делятся на различные подтипы на основе идентичности аминокислотных последовательностей в процентах. Пример аминокислотной последовательности BoNT/A представлен как SEQ ID NO: 1 (номер доступа в базе данных UniProt - A5HZZ9). Пример аминокислотной последовательности BoNT/B представлен как SEQ ID NO: 2 (номер доступа в базе данных UniProt - B1INP5). Пример аминокислотной последовательности BoNT/C представлен как SEQ ID NO: 3 (номер доступа в базе данных UniProt - P18640). Пример аминокислотной последовательности BoNT/D представлен как SEQ ID NO: 4 (номер доступа в базе данных UniProt - P19321). Пример аминокислотной последовательности BoNT/E представлен как SEQ ID NO: 5 (номер доступа в базе данных UniProt - Q00496). Пример аминокислотной последовательности BoNT/F представлен как SEQ ID NO: 6 (номер доступа в базе данных UniProt - Q57236). Пример аминокислотной последовательности BoNT/G представлен как SEQ ID NO: 7 (номер доступа в базе данных UniProt - Q60393). Пример аминокислотной последовательности TeNT (столбнячного нейротоксина) представлен как SEQ ID NO: 8 (номер доступа в базе данных UniProt - P04958).

Используемый в настоящем документе термин «легкая цепь нейротоксина клостридий» (или «L») означает эндопептидазный домен клостридий (или нецитотоксическую протеазу) с молекулярной массой приблизительно 50 кДа, которая обладает способностью расщеплять белок SNARE и тем самым нарушать высвобождение нейротрансмиттера из клетки-мишени.

Используемый в настоящем документе термин «H_N-домен» означает функционально отличную область тяжелой цепи нейротоксина с молекулярной массой приблизительно 50 кДа, которая обладает способностью транслоцировать (переносить) легкую цепь нейротоксина клостридий в цитоплазму клетки-мишени.

Используемый в настоящем документе термин «LH_N-домен» означает нейротоксин, который лишен H_C-домена и состоит из эндопептидазного домена («L» или «легкой цепи») и домена, ответственного за транслокацию эндопептидазы в цитоплазму (H_N-домен тяжелой цепи). LH_N-домен содержит сайт активации между L-доменом и H_N-доменом. При протеолитическом расщеплении сайта активации L-домен и H_N-домен соединяются вместе дисульфидной связью.

Используемый в настоящем документе термин «H_C-домен» означает функционально отличную область тяжелой цепи нейротоксина с молекулярной массой приблизительно 50 кДа, которая обеспечивает связывание нейротоксина с рецептором, расположенным на поверхности клетки-мишени. H_C-домен состоит из двух структурно различных субдоменов, «H_CN-субдомена» (N-концевая часть домена HC) и «H_CC-субдомена» (C-концевая часть H_C-домена), каждый из которых имеет молекулярную массу приблизительно 25 кДа.

Примеры доменов L, H_N, H_CN и H_CC показаны в таблице 1.

Таблица 1 - Примеры доменов L, H_N, H_CN и H_CC.

Нейротоксин Номер доступа SEQ ID NO L H_N H_CN H_CC BoNT/A1 A5HZZ9 1 1-448 449-872 873-1094 1095-1296 BoNT/B1 B1INP5 2 1-441 442-859 860-1081 1082-1291 BoNT/C1 P18640 3 1-449 450-867 868-1095 1096-1291 BoNT/D P19321 4 1-442 443-863 864-1082 1083-1276 BoNT/E1 WP_003372387 5 1-423 424-846 847-1069 1070-1252 BoNT/F1 Q57236 6 1-439 440-865 866-1087 1088-1278 BoNT/G WP_039635782 7 1-446 447-864 865-1089 1090-1297 TeNT P04958 8 1-456 457-880 881-1111 1112-1315

Вышеуказанные эталонные последовательности следует рассматривать в качестве примера, поскольку в зависимости от субсеротипов могут наблюдаться небольшие различия. В качестве примера, в US 2007/0166332 (таким образом полностью включенном путем ссылки) приводятся несколько отличающиеся последовательности из клостридий.

В одном варианте осуществления легкая цепь нейротоксина клостридий относится к BoNT типа A, типа B, типа C1, типа D, типа E, типа F или типа G, или к TeNT.

В одном варианте осуществления домен легкой цепи нейротоксина клостридий содержит последовательность, выбранную из:

- аминокислотных остатков с 1 по 448 из SEQ ID NO: 1 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1 по 441 из SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1 по 449 из SEQ ID NO: 3 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1 по 442 из SEQ ID NO: 4 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1 по 423 из SEQ ID NO: 5 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1 по 439 из SEQ ID NO: 6 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1 по 446 из SEQ ID NO: 7 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними, и

- аминокислотных остатков с 1 по 456 из SEQ ID NO: 8 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними.

Понятно, что легкая цепь нейротоксина клостридий по изобретению обладает способностью расщеплять белок SNARE.

В одном варианте осуществления гибридный нейротоксин содержит транслоцирующий фрагмент.

Термин «транслоцирующий фрагмент» (или «транслоцирующий домен»), используемый в настоящем документе, означает группу, которая обладает способностью переносить (транслоцировать) легкую цепь нейротоксина клостридий в цитоплазму клетки-мишени.

Подходящие транслоцирующие фрагменты включают транслоцирующие домены бактериальных токсинов, такие как H_N-домены клостридий и/или субъединица А2 холерного токсина (CtxA2), проникающие в клетку пептиды, в частности чувствительные к рН проникающие в клетку пептиды. Примером чувствительного к pH пептида, проникающего в клетки, является HBHAc (KKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKK), включающий pH-чувствительный маскирующий пептид, гистидинглутаминовую кислоту (HE) (Yeh et al, Mol Pharm 2016 ʺSelective Intracellular Delivery of Recombinant Arginine Deiminase (ADI) Using pH-Sensitive Cell Penetrating Peptides To Overcome ADI Resistance in Hypoxic Breast Cancer Cells.ʺ).

В предпочтительном варианте осуществления гибридный нейротоксин содержит транслоцирующий фрагмент, который представляет собой H_N-домен клостридий. В более предпочтительном варианте гибридный нейротоксин содержит сайт активации между легкой цепью и H_N-доменом клостридий.

В одном варианте осуществления H_N-домен клостридий содержит последовательность, выбранную из:

- аминокислотных остатков с 449 по 872 из SEQ ID NO: 1 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 442 по 859 из SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 450 по 867 из SEQ ID NO: 3 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 442 по 863 из SEQ ID NO: 4 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 423 по 846 из SEQ ID NO: 5 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 440 по 865 из SEQ ID NO: 6 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 447 по 864 из SEQ ID NO: 7 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними, и

- аминокислотных остатков с 457 по 880 из SEQ ID NO: 8 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними.

Понятно, что H_N-домен клостридий по изобретению обладает способностью транслоцировать легкую цепь в цитоплазму клетки-мишени.

В одном варианте осуществления L- и H_N-домены клостридий относятся к и тому же серотипу клостридий.

В одном варианте осуществления L- и H_N-домены клостридий относятся к разным серотипам клостридий.

В одном варианте осуществления гибридный нейротоксин содержит направляющий фрагмент.

Используемый в настоящем документе термин «направляющий фрагмент» (или «направляющий домен») означает фрагмент, который обладает способностью связываться с рецептором на клетке-мишени. Предпочтительно, чтобы направляющий фрагмент был способен связываться с белковым рецептором на клетке-мишени.

Подходящие направляющие фрагменты включают направляющие домены бактериальных токсинов, такие как H_C- или H_CC-домены клостридий, пептиды, антитела или фрагменты антител.

В одном варианте осуществления гибридный нейротоксин содержит направляющий фрагмент (TM), которая связывается с рецептором, не связывающий нейротоксин клостридий. ТМ может заменить часть или весь H_C- или H_CC-домен тяжелой цепи нейротоксина клостридий. Гибридные нейротоксины, содержащие ТМ, не принадлежащий клостридиям, могут называться «перенаправленными нейротоксинами» (или «направленными ингибиторами секреции», «TSI», «TVEMP» или «TEM»). Примеры ТМ, подходящих для перенаправленных нейротоксинов, раскрыты в WO96/33273, WO98/07864, WO00/10598, WO01/21213, WO01/53336, WO02/07759, WO2005/023309, WO2006/026780, WO2006/099590, WO2006/056093, WO2006/059105, WO2006/059113, WO2007/138339, WO2007/106115, WO2007/106799, WO2009/150469, WO2009/150470, WO2010/055358, WO2010/020811, WO2010/138379, WO2010/138395, WO2010/138382, WO2011/020052, WO2011/020056, WO2011/020114, WO2011/020117, WO2011/20119, WO2012/156743, WO2012/134900, WO2012/134897, WO2012/134904, WO2012/134902, WO2012/135343, WO2012/135448, WO2012/135304, WO2012/134902, WO2014/033441, WO2014/128497, WO2014/053651, WO2015/004464, которые все включены в настоящий документ путем ссылки.

В одном варианте осуществления гибридный нейротоксин содержит H_CN- и/или H_CC-домен клостридий. Предпочтительно, чтобы H_CN- и/или H_CC-домен клостридий относился к BoNT типа A, типа B, типа C1, типа D, типа E, типа F или типа G, или к TeNT.

В одном варианте осуществления гибридный нейротоксин содержит H_CN-домен клостридий, который содержит последовательность, выбранную из:

- аминокислотных остатков с 873 по 1094 из SEQ ID NO: 1 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 860 по 1081 из SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 868 по 1095 из SEQ ID NO: 3 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 864 по 1082 из SEQ ID NO: 4 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 847 по 1069 из SEQ ID NO: 5 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 866 по 1087 из SEQ ID NO: 6 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 865 по 1089 из SEQ ID NO: 7 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними, или

- аминокислотных остатков с 881 по 1111 из SEQ ID NO: 8 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними.

В одном варианте осуществления гибридный нейротоксин содержит H_CC-домен клостридий, который содержит последовательность, выбранную из:

- аминокислотных остатков с 1095 по 1296 из SEQ ID NO: 1 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1082 по 1291 из SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1096 по 1291 из SEQ ID NO: 3 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1083 по 1276 из SEQ ID NO: 4 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1070 по 1252 из SEQ ID NO: 5 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1088 по 1278 из SEQ ID NO: 6 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними,

- аминокислотных остатков с 1090 по 1297 из SEQ ID NO: 7 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними, или

- аминокислотных остатков с 1112 по 1315 из SEQ ID NO: 8 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними.

Понятно, что H_CC-домен по изобретению способен связываться с белковым рецептором нейротоксина клостридий.

В одном варианте осуществления H_CN- и/или H_CC-домен клостридий относится к такому же серотипу клостридий, что и легкая цепь.

В одном варианте осуществления H_CN- и/или H_CC-домен клостридий относится к разным серотипа клостридий по сравнению с легкой цепью.

В одном варианте осуществления гибридный нейротоксин содержит H_CN- домен клостридий и H_CC-домен клостридий. Соответственно, H_CN- и/или H_CC-домены клостридий могут относиться к одному и тому же серотипу. Соответственно, H_CN- и/или H_CC-домены клостридий могут относиться к разным серотипам. В одном варианте осуществления легкая цепь, H_CN- и H_CC-домен клостридий относятся к одному и тому же серотипу. В одном варианте осуществления легкая цепь, H_CN-домен относятся к одному серотипу, а H_CC-домен относится к другому серотипу.

В одном варианте осуществления гибридный нейротоксин содержит H_N-домен клостридий, H_CN-домен клостридий и H_CC-домен клостридий. Соответственно, H_N-, H_CN- и H_CC-домены клостридий могут относиться к одному и тому же серотипу. Соответственно, H_N-, H_CN- и H_CC-домены клостридий могут относиться к разным серотипам. В одном варианте осуществления легкая цепь, H_N-, H_CN- и H_CC-домены клостридий относятся к одному и тому же серотип. В одном варианте осуществления легкая цепь, H_N- и H_CN-домены принадлежат к одному и тому же серотипу, а H_CC-домен относится к другому серотипу. В одном варианте осуществления легкая цепь и H_N-домен клостридий принадлежат к одному и тому же серотипу, а H_CN- и H_CC-домены относятся к другому серотипу.

В одном варианте осуществления, когда гибридный нейротоксин включает H_CC-домен клостридий, его способность связываться с ганглиозидами снижена или совсем подавлена по сравнению с нативным H_CC-доменом клостридий. Это может быть достигнуто, например, путем введения мутаций в ганглиозидсвязывающий мотив H_CC-домена.

«Процент идентичности последовательностей» между двумя или большим числом нуклеотидных или аминокислотных последовательностей является функцией числа идентичных нуклеотидов/аминокислот в идентичных положениях, общих для выровненных последовательностей. Таким образом, % идентичности может быть рассчитан как количество идентичных нуклеотидов/аминокислот в каждой позиции в выравнивании, деленное на общее количество нуклеотидов/аминокислот в выровненной последовательности, умноженное на 100. При вычислении % идентичности последовательностей также можно учитывать количество разрывов и длину каждого разрыва, который необходимо ввести для оптимизации выравнивания двух или большего числа последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя или большим числом последовательностей могут быть выполнены с использованием определенных математических алгоритмов, которые известны специалисту в данной области, например, математический алгоритм глобального выравнивания (такой как описанный Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (3), 443-453, 1972).

Легкая цепь, домены H_N, H_CN и H_CC могут иметь свое происхождение из мозаичного нейротоксина. Термин «мозаичный нейротоксин», используемый в данном контексте, относится к встречающемуся в природе нейротоксину клостридий, который содержит по меньшей мере один функциональный домен из другого типа нейротоксинов клостридий (например, нейротоксин клостридий другого серотипа), причем данный нейротоксин клостридий обычно не содержит по меньшей мере один функциональный домен. Примерами мозаичных нейротоксинов являются природные токсины BoNT/DC и BoNT/CD. BoNT/DC включает L-цепь и H_N-домен серотипа D и H_C-домен серотипа C, тогда как BoNT/CD состоит из L-цепи и H_N-домена серотипа C и H_C-домена серотипа D.

Легкая цепь, домены H_N, H_CN и H_CC могут иметь свое происхождение из модифицированного нейротоксина и его производных, включая, но не ограничиваясь этим, описанные ниже нейротоксины. Модифицированный нейротоксин или его производное могут содержать одну или несколько аминокислот, которые были модифицированы по сравнению с нативной (немодифицированной) формой нейротоксина, или может содержать одну или несколько вставленных аминокислот, которые отсутствуют в нативной (немодифицированной) форме токсина. Например, модифицированный нейротоксин клостридий может иметь модифицированные аминокислотные последовательности в одном или нескольких доменах относительно нативной (немодифицированной) последовательности нейротоксина клостридий. Такие модификации могут менять функциональные свойства нейротоксина, например биологическую активность или устойчивость.

Модифицированный нейротоксин сохраняет по меньшей мере одну из функций нейротоксина, выбранных из способности связываться с низкоаффинным или высокоаффинным рецептором нейротоксина на клетке-мишени, транслоцировать эндопептидазную часть нейротоксина (легкую цепь) в цитоплазму клетки и расщеплять белок SNARE. Предпочтительно, чтобы модифицированный нейротоксин сохранял по меньшей мере две из этих функций. Более предпочтительно, чтобы модифицированный нейротоксин сохранял три эти функции.

Модифицированный нейротоксин может содержать одну или несколько модификаций в аминокислотной последовательности тяжелой цепи (такой как модифицированный H_C-домен), где данная модифицированная тяжелая цепь связывается с нервными клетками-мишенями с более высокой или более низкой аффинностью, чем нативный (немодифицированный) нейротоксин. Такие модификации в H_C-домене могут включать модификацию остатков в сайте связывания ганглиозидов в H_C-домене или в сайте связывания белка (SV2 или синаптотагмина), которая изменяет связывание с ганглиозидным рецептором и/или белковым рецептором нервной клетки-мишени. Примеры таких модифицированных нейротоксинов описаны в WO 2006/027207 и WO 2006/114308, которые оба полностью включены в настоящее описание путем ссылки.

Модифицированный нейротоксин может иметь одну или несколько модификаций в аминокислотной последовательности легкой цепи, например модификации в субстрат-связывающем или каталитическом домене, которые могут изменять или модифицировать специфичность в отношении белка SNARE у модифицированного LC. Примеры таких модифицированных нейротоксинов описаны в WO 2010/120766 и US 2011/0318385, которые оба полностью включены в настоящее описание путем ссылки.

Модифицированный нейротоксин может содержать одну или несколько модификаций, которые увеличивают или уменьшают биологическую активность и/или биологическую устойчивость модифицированного нейротоксина. Например, модифицированный нейротоксин может содержать лейциновый или тирозиновый мотив, где данный мотив увеличивает или уменьшает биологическую активность и/или биологическую устойчивость модифицированного нейротоксина. Подходящие лейциновые мотивы включают xDxxxLL, xExxxLL, xExxxIL и xExxxLM (где x представляет собой любую аминокислоту). Подходящие тирозиновые мотивы включают Y-x-x-Hy (где Hy представляет собой гидрофобную аминокислоту). Примеры модифицированных нейротоксинов, содержащих лейциновые и тирозиновые мотивы, описаны в WO 2002/08268, который полностью включен в настоящее описание путем ссылки.

Используемый в настоящем документе термин «селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент» означает фрагмент, который связывается с одним типом ганглиозидов с более высокой аффинностью, чем с другими ганглиозидами. Аффинность связывания можно определить количественно путем определения равновесной константы диссоциации или K_d между ганглиозидом и связывающим фрагментом (чем ниже K_d, тем выше аффинность). Способы определения аффинности связывания с ганглиозидом хорошо известны в данной области и включают, например, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), описанный, например, в Kuziemko, Geoffrey M. et al. "Cholera toxin binding affinity and specificity for gangliosides determined by surface plasmon resonance." Biochemistry 35.20 (1996): 6375-6384, или в MacKenzie, C. Roger, et al. "Quantitative analysis of bacterial toxin affinity and specificity for glycolipid receptors by surface plasmon resonance." Journal of Biological Chemistry 272.9 (1997): 5533-5538. В частности, Кузиемко и др. в 1996 г (цитируется выше) обнаружили с помощью SPR, что холерный токсин предпочтительно связывается с ганглиозидами в следующем порядке: GM1> GM2> GD1A> GM3> GT1B> GD1B> асиало-GM1, и что измеренная аффинность связывания (K_d) холерного токсина с ганглиозидной последовательностью составляет от 4,61×10^-12 М для GM1 до 1,88×10^-10 М для асиало-GM1. Маккензи и др. в 1997 г (цитируется выше) определили методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием метода захвата липосом, что CtxB связывается с GM1 и GD1b с аффинностью соответственно 7,3×10^-10 М и 8×10^-9 М, что термолабильный энтеротоксин (LT) из E. coli связывается с GM1 и GD1b с аффинностью соответственно 5,7×10^-10 М и 3,0×10^-9 М, и что С-фрагмент столбнячного токсина связывается с GD1b и GT1b со сродством соответственно 1,5×10^-7 М и 1,7×10^-7 м.

Аффинность связывания с ганглиозидом также можно определить с помощью конкурентного анализа ELISA, описанного, например, в Sinclair, Haydn R., et al. "Sialyloligosaccharides inhibit cholera toxin binding to the GM1 receptor." Carbohydrate research 343.15 (2008): 2589-2594. Другой способ определения аффинности связывания с ганглиозидом основан на использовании радиоактивно меченного лиганда (например, меченного ¹²⁵I), как описано, например, в Nishiki, Tei-ichi, et al. "The high-affinity binding of Clostridium botulinum type B neurotoxin to synaptotagmin II associated with gangliosides GT1b/GD1a." FEBS letters 378.3 (1996): 253-257. Еще одним способом определения аффинности связывания с ганглиозидом является использование изотермической титрационной калориметрии, как описано в Turnbull, W. Bruce, et al. "Dissecting the cholera toxin-ganglioside GM1 interaction by isothermal titration calorimetry." Journal of the American Chemical Society 126.4 (2004): 1047-1054.

В одном варианте осуществления K_d между селективным ганглиозидсвязывающим фрагментом и ганглиозидом составляет примерно менее 10^-9 М, предпочтительно, примерно менее 10^-10 М, более предпочтительно, примерно менее 10^-11 М, более предпочтительно, примерно менее 5×10^-12 М.

Подходящие ганглиозидсвязывающие фрагменты (GBM) включают GBM бактериальных токсинов (помимо H_C- или H_CC-доменов клостридий), пептиды, белки или фрагменты белков, антитела или фрагменты антител.

В одном варианте осуществления GBM представляет собой пептид. Примеры пептидов, подходящих для использования в качестве GBM, включают β-амилоидный пептид (Aβ), накапливающийся при болезни Альцгеймера, который связывается с GM1, ассоциированный с болезнью Паркинсона белок α-синуклеин, который связывается с GM3, и описанные химерные пептиды, такие как α-синуклеин/Aβ, описанные в Yahi and Fantini 2014, который связывается с GM1 и GM3 (Yahi, Nouara, and Jacques Fantini. "Deciphering the glycolipid code of Alzheimer's and Parkinson's amyloid proteins allowed the creation of a universal ganglioside-binding Peptide." PloS one 9.8 (2014): e104751).

В одном варианте осуществления GBM представляет собой белок или фрагмент белка. Примеры белков, пригодных для использования в качестве GBM, включают рецепторы фактора роста, такие как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), который связывается с GM3, GM1, GM2, GM4, GD3, GD1a и GT1b и рецептор фактора роста сосудистого эндотелия (VEGFR), который связывается с GM3, GD1a и GT1b (Krengel, Ute, and Paula A. Bousquet. "Molecular recognition of gangliosides and their potential for cancer immunotherapies." Frontiers in Immunology, 2014, vol 5, article 325).

В предпочтительном варианте осуществления GBM получен из бактериального токсина, например, GBM выбран из В-субъединицы холерного токсина (CtxB) и термолабильного энтеротоксина (LT) E. coli.

GM1 (или GM1a) является единственным известным рецептором для В-субъединицы холерного токсина (CtxB). Поэтому, путем введения B-субъединицы холерного токсина в нейротоксин клостридий или его фрагмент, можно селективно направлять его на нейроны, содержащие GM1. GM1 также является рецептором термолабильного энтеротоксина из Escherichia coli. (Zoeteweij, J. Paul, et al. "GM1 binding-deficient exotoxin is a potent noninflammatory broad spectrum intradermal immunoadjuvant." The Journal of Immunology 177.2 (2006): 1197-1207).

Также предполагается, что гибридный нейротоксин по изобретению, в котором GBM получен из бактериального токсина, особенно подходит для местной доставки гибридного нейротоксина. Действительно, было также показано, что бактериальные экзотоксины можно безопасно применять местно на коже человека (Zoeteweij, J. Paul, et al. "GM1 binding-deficient exotoxin is a potent noninflammatory broad spectrum intradermal immunoadjuvant." The Journal of Immunology 177.2 (2006): 1197-1207).

В одном варианте осуществления ганглиозидом является GM1, а GBM выбран из CtxB и термолабильного энтеротоксина (LT) E. coli.

Холерный токсин (СТ) секретируется грамотрицательной бактерией Vibrio cholerae. CT принадлежит к большему семейству AB-токсинов, которые имеют ферментативно активный A-домен, ответственный за индукцию токсичности, и B-домен, связывающийся с клеткой, который отвечает за проникновение в клетку. CT принадлежит к подсемейству AB₅, которое состоит из шести полипептидов - одной A-субъединицы и гомопентамерной B-субъединицы, которые самоорганизуются с образованием холотоксина до секреции. Другие токсины AB₅ включают термолабильные энтеротоксины, шига-токсин, шигаподобные токсины и коклюшный токсин. Субъединицы CT, A и B (CtxA и CtxB соответственно), связаны нековалентно. A-субъединица 27 кДа содержит сайт расщепления сериновой протеазой, расположенный между остатками 192 и 195, который позволяет расщеплять A-субъединицу на два полипептида: цепь A2 и цепь A1. Дисульфидная связь между остатками 187 и 199 соединяет эти цепи вместе. Цепь А1 отвечает за ферментативную активность СТ. Пять В-субъединиц по 11,5 кДа собираются нековалентно, образуя гомопентамер, который связывается с ганглиозидом GM1 на плазматической мембране. Комплекс B₅-субъединиц-GM1 переносит A-субъединицу в эндоплазматический ретикулум. После ретротранслокации цепь А1 входит в цитозоль в виде активной АДФ-рибозилтрансферазы, которая модифицирует гетеротримерный G-белок Gsα. Модификация этого G-белка приводит к конститутивной активации аденилатциклазы и быстрой продукции цАМФ. В клетках кишечника это вызывает секрецию хлорида в кишечнике, что сопровождается массивным движением воды и диареей, которая является отличительной чертой холеры. ((Wernick, Naomi LB, et al. "Cholera toxin: an intracellular journey into the cytosol by way of the endoplasmic reticulum." Toxins 2.3 (2010): 310-325.)

Пример аминокислотной последовательности В-субъединицы холерного токсина представлен как SEQ ID NO: 9 (номер доступа в UniProtKB - P01556), который состоит из сигнального пептида (аминокислотные остатки с 1 по 21 в SEQ ID NO: 9) и В-субъединицы (аминокислотные остатки с 22 по 124 в SEQ ID NO: 9).

Пример аминокислотной последовательности А-субъединицы холерного токсина представлен как SEQ ID NO: 10 (номер доступа в UniProtKB - P01555), который состоит из сигнального пептида (аминокислотные остатки с 1 по 18 в SEQ ID NO: 10), домена A1 (аминокислотные остатки с 19 по 212 в SEQ ID NO: 10) и домена А2 (аминокислотные остатки с 213 по 258 в SEQ ID NO: 10).

Было показано, что мономерной B-субъединицы достаточно для связывания с клетками и интоксикации (Jobling, Michael G., et al. "A single native ganglioside GM1-binding site is sufficient for cholera toxin to bind to cells and complete the intoxication pathway." MBio 3.6 (2012): e00401-12).

Авторы изобретения показали, что добавление домена CtxB к эндонегативному BoNT/A1 (BoNT/A1(0)) наделяет BoNT/A1 способностью связываться с GM1, ганглиозидом, который не является естественным рецептором для BoNT/A1.

Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы полагают, что субъединица CtxB приведет к увеличению силы действия вследствие того, что холерный токсин обладает большей аффинностью связывания с GM1, чем аффинность связывания BoNT с его соответствующими ганглиозидами. Например, было показано, что аффинность связывания BoNT/B с комплексом синаптотагмина, ассоциированного с GT1b/GD1a (модель двойного рецептора), находится в наномолярном диапазоне («высокая аффинность 0,4 нМ, низкая аффинность 4,1 нМ») (Nishiki et al, FEBS Letters 1996), что в 1000 раз выше пикомолярной аффинности связывания Ctx-B и GM1, опубликованной в Kuzimeko et al., Biochemistry 1996.

Домен CtxB по изобретению, предпочтительно, содержит аминокислотные остатки с 22 по 124 из SEQ ID NO: 9 или полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности с ними. Понятно, что домен CtxB по изобретению способен связываться с GM1.

В предпочтительном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит одну или несколько В-субъединиц холерного токсина (CtxB).

В одном варианте осуществления легкая цепь ковалентно связана с указанной одной или несколькими В-субъединицами холерного токсина (CtxB).

В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит одну CtxB. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит две CtxB. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит три CtxB. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит четыре CtxB. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит пять CtxB.

В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит одну или несколько CtxB, которые расположены на C-конце легкой цепи нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит одну или несколько CtxB, которые расположены на N-конце легкой цепи нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из одной CtxB, которая расположена на C-конце легкой цепи нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из одной CtxB, которая расположена на N-конце легкой цепи нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из двух CtxB, которые расположены на C-конце легкой цепи нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из двух CtxB, которые расположены на N-конце легкой цепи нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из трех CtxB, которые расположены на C-конце легкой цепи нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из трех CtxB, которые расположены на N-конце легкой цепи нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из четырех CtxB, которые расположены на C-конце легкой цепи нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из четырех CtxB, которые расположены на N-конце легкой цепи нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из пяти CtxB, которые расположены на C-конце легкой цепи нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из пяти CtxB, которые расположены на N-конце легкой цепи нейротоксина клостридий.

В одном варианте осуществления гибридный нейротоксин содержит H_N-домен клостридий, а селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит одну или несколько CtxB, которые расположены на C-конце H_N-домена клостридий. В другом варианте осуществления одна или несколько CtxB расположены на N-конце H_N-домена клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из одной CtxB, которая расположена на C-конце H_N-домена клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из одной CtxB, которая расположена на N-конце H_N-домена клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из двух CtxB, которые расположены на C-конце H_N-домена клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из двух CtxB, которые расположены на N-конце H_N-домена клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из трех CtxB, которые расположены на C-конце H_N-домена клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из трех CtxB, которые расположены на N-конце H_N-домена клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из четырех CtxB, которые расположены на C-конце H_N-домена клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из четырех CtxB, которые расположены на N-конце H_N-домена клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из пяти CtxB, которые расположены на C-конце H_N-домена клостридий. В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент состоит из пяти CtxB, которые расположены на N-конце H_N-домена клостридий.

В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит одну или несколько В-субъединиц холерного токсина (CtxB), а гибридный нейротоксин дополнительно содержит A2-субъединицу холерного токсина (CtxA2). Предпочтительно, чтобы CtxA2 была ковалентно связана с легкой цепью клостридий. Кроме того, предпочтительно, чтобы CtxA2 была ковалентно связана с легкой цепью нейротоксина клостридий, а CtxB образовала нековалентную связь с легкой цепью нейротоксина клостридий. В частности, считается, что А2-субъединица холерного токсина (CtxA2) может действовать как связующее звено, образуя нековалентную связь с пентамером B-субъединиц (CtxB5), который будет связываться с ганглиозидом на клетке-мишени и интернализировать легкую цепь нейротоксина клостридий в клетку.

Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы предполагают, что такие варианты осуществления, где CtxB связывается с гибридным нейротоксином через нековалентную связь (с субъединицей CtxA2), допускают пентамерное расположение субъединицы CtxB (CtxB₅) и, таким образом, обуславливают повышенную аффинность связывания гибридного нейротоксина с GM1.

Домен CtxA2 по изобретению предпочтительно содержит аминокислотные остатки с 213 по 258 из SEQ ID NO: 10 или полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по последовательности к ними. Понятно, что домен CtxA2 по изобретению способен связываться с доменом CtxB. Предпочтительно, чтобы домен CtxA2 содержал остатки с 255 по 258 (KDEL) из SEQ ID NO: 10.

Домен CtxA2 может быть расположен на С-конце или N-конце к легкой цепи нейротоксина клостридий.

В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит одну или несколько B-субъединиц холерного токсина (CtxB), которые нековалентно связаны с легкой цепью нейротоксина клостридий, и гибридный нейротоксин дополнительно содержит A2-субъединицу холерного токсина (CtxA2) и H_N-домен, который ковалентно связаны с легкой цепью нейротоксина клостридий. В одном варианте осуществления домен CtxA2 расположен на N-конце H_N-домена клостридий и предпочтительно расположен между сайтом активации и H_N-доменом («центральное расположение»). В одном варианте осуществления домен CtxA2 расположен на C-конце H_N-домена клостридий, и когда гибридный нейротоксин включает H_CN- и/или H_CC-домен, ганглиозидсвязывающий фрагмент может быть расположен на C-конце или N-конце H_CN- и/или H_CC-домена. Гибридный нейротоксин может содержать линкер между доменом CtxA2 и L-, HN-, H_CN- и/или H_CC-доменом.

В одном варианте осуществления легкая цепь нейротоксина клостридий ковалентно связана с селективным ганглиозидсвязывающим фрагментом. Селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент может быть расположен на С-конце или N-конце легкой цепи клостридий.

В одном варианте осуществления гибридный нейротоксин содержит H_N-домен клостридий, а H_N-домен клостридий ковалентно связан с селективным ганглиозидсвязывающим фрагментом. Селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент может быть расположен на С-конце или N-конце H_N-домена клостридий. Когда селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент расположен на N-конце H_N-домена клостридий, предпочтительно, чтобы он был расположен между сайтом активации и H_N-доменом («центральное расположение»).

Когда селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент расположен на C-конце H_N-домена клостридий, и когда гибридный нейротоксин дополнительно содержит H_CN-домен и/или H_CC-домен, ганглиозидсвязывающий фрагмент может быть расположен на C-конце или N-конце H_CN- или H_CC-домена.

Гибридный нейротоксин может содержать линкер между ганглиозидсвязывающим доменом и L-, HN-, H_CN- и/или H_CC-доменом. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы предполагают, что присутствие линкера может повысить стабильность гибридного нейротоксина и/или доступность ганглиозидсвязывающего фрагмента для его ганглиозида-мишени и/или увеличить экспрессию.

Примеры подходящих линкеров включают GS-линкеры различной длины, например, GS5, GS10, GS15, GS18 и GS20, N10, HX27, (EAAAK)₃ и A(EAAAK)₄ALEA(EAAAK)₄A. Дополнительные примеры приведены в литературе, например, в статье Chen, Xiaoying, et al. "Fusion protein linkers: property, design and functionality." Advanced drug delivery reviews 65.10 (2013): 1357-1369, включенной в настоящий документ путем ссылки.

Примеры структурного расположения гибридных нейротоксинов по изобретению приведены ниже (GBM: ганглиозидсвязывающий фрагмент; TD: транслоцирующий домен; BD: домен, связывающий белковый рецептор; L, HN, HCN, HCC: домены клостридий, описанные в настоящем документе; AS: сайт активации; слева направо: от C-конца к N-концу):

L - GBM

GBM - L

L - AS - GBM

GBM - AS - L

L - AS - GBM - TD

L - AS- TD - GBM

GBM - TD - AS -L

TD - GBM - AS -L

GBM - L - AS - TD

L - AS - GBM - TD - BD

L - AS - BD - TD - GBM

GBM - TD - BD - AS -L

BD - TD - GBM - AS -L

L - AS - GBM - HN

L - AS - HN - GBM

GBM - HN - AS -L

HN - GBM - AS -L

GBM - L - AS - HN

L - AS - GBM - HN - HCN

L - AS - GBM - HN - HCN - HCC

L - AS - HN - GBM

L - AS - HN - HCN - GBM

L - AS - HN - HCN - HCC- GBM

L - AS - GBM - линкер - HN

L - AS - GBM - линкер - HN - HCN

L - AS - GBM - линкер - HN - HCN - HCC

L - AS - HN - линкер - GBM

L - AS - HN - HCN - линкер - GBM

L - AS - HN - HCN - HCC - линкер - GBM

GBM -L - AS -HN -HCN -HCC

L - AS - линкер - GBM - HN

L - AS - линкер - GBM - HN - HCN

L - AS - линкер - GBM - HN - HCN - HCC

L - AS - линкер - GBM - линкер - HN

L - AS - линкер - GBM - линкер - HN - HCN

L - AS - линкер - GBM - линкер - HN - HCN - HCC

В одном варианте осуществления гибридный нейротоксин по изобретению содержит H_N-домен и имеет двухцепочечную форму, и содержит дисульфидную связь между L-доменом и H_N-доменом.

Предпочтительно, чтобы структурное расположение гибридного нейротоксина было таково, чтобы GBM имел свободный N- или C-конец. В вариантах осуществления, включающих сайт активации (AS), обеспечивающий превращение гибридного нейротоксина в двухцепочечную форму, структурное расположение гибридного нейротоксина предпочтительно является таким, чтобы GBM имел свободный N- или C-конец после превращения в двухцепочечную форму.

В вариантах осуществления, содержащих домен, связывающий белковый рецептор (BD), например H_C- или H_CC-домен, структурное расположение гибридного нейротоксина предпочтительно является таким, чтобы BD имел свободный N-конец или C-конец, и, более предпочтительно, чтобы оба GBM и BD имели свободный N- или C-конец. В вариантах осуществления, включающих сайт активации (AS), обеспечивающий превращение гибридного нейротоксина в двухцепочечную форму, структурное расположение гибридного нейротоксина предпочтительно является таким, чтобы BD имел свободный N- или C-конец после превращения в двухцепочечную форму и, более предпочтительно, чтобы оба GBM и BD имели свободный N-конец или C-конец после превращения в двухцепочечную форму.

Гибридные нейротоксины по настоящему изобретению могут быть получены с использованием рекомбинантных технологий. Таким образом, в одном варианте осуществления гибридный нейротоксин по изобретению представляет собой рекомбинантный гибридный нейротоксин.

В другом аспекте изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей гибридный нейротоксин по изобретению, например, к последовательности ДНК или РНК. В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность ДНК.

Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть получены с использованием любого подходящего способа, известного в данной области. Таким образом, молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены с использованием методов химического синтеза. В альтернативном варианте молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть получены с использованием методов молекулярной биологии.

Последовательность ДНК по настоящему изобретению предпочтительно конструируют in silico, а затем синтезируют обычными методами синтеза ДНК.

Вышеуказанную нуклеотидную последовательность необязательно модифицируют для изменения кодонов в соответствии с системой экспрессии конечной клетки-хозяина (например, E. coli), которая должна использоваться.

В другом аспекте изобретение относится к вектору, содержащему нуклеотидную последовательность по изобретению. В одном варианте нуклеотидную последовательность получают как часть ДНК-вектора, содержащего промотор и терминатор. В предпочтительном варианте осуществления вектор имеет промотор, выбранный из Tac, AraBAD, T7-Lac или T5-Lac.

Вектор может быть пригоден для экспрессии in vitro и/или in vivo вышеуказанной нуклеотидной последовательности. Вектор может быть вектором для транзиентной и/или стабильной экспрессии генов. Вектор может дополнительно содержать регуляторные элементы и/или селективные маркеры. Вектор может иметь вирусное происхождение, фаговое происхождение или бактериальное происхождение. Например, вектор экспрессии может представлять собой вектор pET, pJ401, pGEX или их производное.

В другом аспекте изобретение относится к клетке, содержащей нуклеотидную последовательность или вектор по изобретению. Подходящие типы клеток включают прокариотические клетки, например, E. coli, и эукариотические клетки, такие как клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых. Предпочтительно, чтобы клетка представляла собой E. coli.

Гибридные нейротоксины по изобретению особенно подходят для применения в терапии.

Синдром Гийена-Барре представляет собой острое воспалительное заболевание, которое поражает периферическую нервную систему и вызывается связыванием антител, вырабатываемых иммунной системой, с ганглиозидами. Основываясь на результатах клинических подтипов синдрома Гийена-Барре, ганглиозиды GM1a, GM1b, GD1a, GalNAc-GD1a связаны с нервно-мышечным соединением конечностей, а ганглиозиды GT1a, GQ1b связаны с нервно-мышечным соединением головы и шеи ((Van Den Berg, Bianca, et al. " syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis." Nature reviews. Neurology 10.8 (2014): 469; Willison, Hugh J., and Jaap J. Plomp. "Anti-ganglioside Antibodies and the Presynaptic Motor Nerve Terminal." Annals of the New York Academy of Sciences 1132.1 (2008): 114-123). Также было показано, что GM1 присутствует в околоушных железах (слюнных железах) (Nowroozi, Nakisa, et al. "HIGH LEVELS OF GM 1-GANGLIOSIDE AND GM 1-GANGLIOSIDE β-GALACTOSIDASE IN THE PAROTID GLAND: A New Model for Secretory Mechanisms of the Parotid Gland." Otolaryngologic Clinics of North America 32.5 (1999): 779-791).

Было опубликовано, что концентрации GM1 и GM2 в липидных рафтах из лобной и височной коры были выше у пациентов с болезнью Альцгеймера (AD). Кластеризация GM1 была продемонстрирована в ганглиозных нейронах дорсального корешка (сенсорных нейронах). ((Aureli, Massimo, et al. "GM1 ganglioside: past studies and future potential." Molecular neurobiology 53.3 (2016): 1824-1842.)

Было показано, что ганглиозиды NeuAc GM3, NeuGc GM3, GM2, GM1, GD3 и GD2 экспрессируются в опухолевых клетках человека (Krengel, Ute, and Paula A. Bousquet. "Molecular recognition of gangliosides and their potential for cancer immunotherapies." Frontiers in Immunology, July 2014, vol. 5, article 325).

В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из GM1a, GM1b, GD1a и GalNAc-GD1a. Полагают, что такие варианты осуществления особенно подходят для лечения расстройств конечностей, таких как спастичность верхних конечностей, спастичность нижних конечностей, очаговая дистония мышц конечностей, растяжение мышц конечностей, повторное травматическое растяжение (RSI), кумулятивная травма или синдром профессионального перенапряжения. Действительно, не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы предполагают, что нацеливание гибридного нейротоксина на ганглиозиды, присутствующие в нервно-мышечном соединении конечностей, позволит повысить селективность в отношении нервно-мышечных соединений конечностей и избежать побочных эффектов из-за неспецифических эффектов.

В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из GT1a и GQ1b. Считаются, что такие варианты осуществления являются особенно подходящими для лечения заболеваний головы и шеи, таких как цервикальная дистония, блефароспазм, мигрень, миофасциальные боли, косоглазие, гемифациальный спазм, заболевание век, спазматическая дисфония, ларингеальная дистония, оромандибулярная дисфония, язычная дистония, бруксизм и дисфагия. Действительно, не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы предполагают, что нацеливание гибридного нейротоксина на ганглиозиды, обнаруживаемые в нервно-мышечных соединениях головы и шеи, позволяет повысить селективность в отношении нервно-мышечных соединений головы и шеи и избежать побочных эффектов из-за неспецифических эффектов.

В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с GM1. Считается, что этот вариант особенно подходит для лечения сиалореи (избыточного слюноотделения, слюнотечения). Также предполагается, что этот вариант осуществления может подходить для лечения пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера или другими неврологическими расстройствами.

В одном варианте осуществления селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из NeuAc GM3, NeuGc GM3, GM2, GM1, GD3 и GD2. Считается, что такие варианты осуществления особенно подходят для лечения рака.

В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей гибридный нейротоксин по изобретению. Предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция содержала гибридный нейротоксин вместе по меньшей мере с одним компонентом, выбранным из фармацевтически приемлемого носителя, вспомогательного вещества, адъюванта, пропеллента и/или соли.

В другом аспекте изобретение относится к гибридному нейротоксину или фармацевтической композиции по изобретению для применения в терапии.

Гибридный нейротоксин или фармацевтическая композиция по изобретению подходят для применения при лечении заболевания, связанного с нежелательной нейрональной активностью, например, заболевания, выбранного из группы, состоящей из спастической дисфонии, спастической кривошеи, ларингеальной дистонии, оромандибулярной дисфонии, лингвальной дистонии, цервикальной дистонии, фокальной дистонии кисти, блефароспазма, косоглазия, гемифациального спазма, заболевания век, церебрального паралича, фокальной спастичности и других нарушений голоса, спастического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечностей, тиков, тремора, бруксизма, дисфарцизма, анальных трещин, ахалазии, дисфагии и других нарушений мышечного тонуса и других нарушений, характеризующихся непроизвольными сокращениями мышечных групп, слезотечения, гипергидроза, избыточного слюноотделения, избыточной секреции в желудочно-кишечном тракте, секреторных нарушений, боли от мышечных спазмов, головной боли, мигрени и дерматологических заболеваний.

В другом аспекте изобретение относится к нетерапевтическому применению гибридного нейротоксина или фармацевтической композиции по изобретению для лечения эстетического или косметического нарушения. Согласно этому аспекту изобретения субъект, подлежащий лечению при эстетическом или косметическом нарушении, предпочтительно не страдает от каких-либо патологических нарушений или состояний, которые описаны в настоящем документе. Более предпочтительно, чтобы указанный субъект являлся здоровым субъектом (т.е. не страдал каким-либо патологическим заболеванием или состоянием).

В другом аспекте изобретение относится к гибридному нейротоксину, содержащему легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из GM1a, GM1b, GD1a и GalNAc-GD1a, для применения при лечении заболеваний конечностей, связанных с нежелательной нейрональной активностью. В одном варианте осуществления заболевание конечностей выбирают из спастичности верхних конечностей, спастичности нижних конечностей и фокальной дистонии кисти. В предпочтительном варианте осуществления ганглиозид представляет собой GM1a.

В другом аспекте изобретение относится к гибридному нейротоксину, содержащему легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из GT1a и GQ1b, для использования при лечении заболевания головы или шеи, связанного с нежелательной нейрональной активностью. В одном варианте осуществления заболевание головы или шеи выбирают из цервикальной дистонии, блефароспазма, мигрени, миофасциальной боли, косоглазия, гемифациального спазма, заболевания век, спастической дисфонии, ларингеальной дистонии, оромандибулярной дисфонии, лингвальной дистонии, бруксизма и дисфагии.

В другом аспекте изобретение относится к гибридному нейротоксину, содержащему легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с GM1, для применения при лечении сиалореи (или избыточного слюноотделения или слюнотечения).

В другом аспекте изобретение относится к гибридному нейротоксину, содержащему легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из NeuAc GM3, NeuGc GM3, GM2, GM1, GD3 и GD2, для применения при лечении рака.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения, включающему введение терапевтически эффективного количества гибридного нейротоксина или фармацевтической композиции по изобретению нуждающемуся в этом пациенту.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания конечностей, связанного с нежелательной нейрональной активностью, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества гибридного нейротоксина, содержащего легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из GM1a, GM1b, GD1a и GalNAc-GD1a.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания головы или шеи, связанного с нежелательной нейрональной активностью, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества гибридного нейротоксина, содержащего легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из GT1a и GQ1b.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения сиалореи (или избыточного слюноотделения или слюнотечения), включающему введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества гибридного нейротоксина, включающего легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с GM1.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества гибридного нейротоксина, содержащего легкую цепь нейротоксина клостридий и селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент не является H_CC- или H_C-доменом клостридий, и где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент связывается с одним или несколькими ганглиозидами, выбранными из NeuAc GM3, NeuGc GM3, GM2, GM1, GD3 и GD2.

Следует понимать, что все другие разнообразные признаки, относящиеся к гибридному нейротоксину, описанному в настоящем документе и предпочтительным вариантам осуществления, применяются mutatis mutandis к терапевтическим и косметическим аспектам изобретения.

Также следует понимать, что фармацевтическая композиция по изобретению может использоваться для терапевтических и косметических целей по изобретению.

Генно-инженерные гибридные нейротоксины по настоящему изобретению могут быть представлены в виде препарата для перорального, парентерального, непрерывного инфузионного, ингаляционного или местного применения. Композиции, подходящие для инъекций, могут быть представлены в форме растворов, суспензий или эмульсий, или сухих порошков, которые растворяют или ресуспендируют в подходящем носителе перед использованием.

В случае гибридного нейротоксина, который должен вводиться локально, гибридный нейротоксин может быть изготовлен в виде крема (например, для местного применения) или изготовлен для подкожных инъекций.

Средства для местной доставки могут включать аэрозоль или другой спрей (например, небулайзер). В этом отношении аэрозольный состав гибридного нейротоксина обеспечивает доставку в легкие и/или другие носовые и/или бронхиальные или дыхательные пути.

Гибридные нейротоксины по изобретению могут вводиться пациенту путем интратекальной или эпидуральной инъекции в позвоночный столб на уровне спинного сегмента, участвующего в иннервации пораженного органа.

Предпочтительным путем введения является лапароскопическая и/или локализованная, в частности внутримышечная, инъекция.

Диапазоны доз для введения нейротоксинов по настоящему изобретению являются такими, чтобы обеспечить желаемый терапевтический эффект. Понятно, что требуемый диапазон доз зависит от природы конкретного гибридного нейротоксина или композиции, пути введения, типа препарата, возраста пациента, природы, степени или тяжести заболевания пациента, противопоказаний, если таковые имеются, и решения лечащего врача. Изменения в этих уровнях дозировки могут быть скорректированы с использованием стандартных эмпирических процедур для оптимизации.

Жидкие лекарственные формы обычно изготавливают с использованием гибридного нейротоксина и апирогенного стерильного носителя. Генно-инженерный гибридный нейротоксин в зависимости от используемого носителя и концентрации может быть либо растворен, либо ресуспендирован в носителе. При изготовлении растворов гибридный нейротоксин может быть растворен в носителе, при этом раствор при необходимости делают изотоническим путем добавления хлорида натрия и стерилизуют фильтрацией через стерильный фильтр с использованием асептических методов перед заполнением подходящих стерильных флаконов или ампул, и герметизацией. В качестве альтернативы, при достаточной стабильности раствора его в герметичных контейнерах можно стерилизовать в автоклаве. Предпочтительно, чтобы добавки, такие как буферные, солюбилизирующие, стабилизирующие, консервирующие или бактерицидные, суспендирующие или эмульгирующие агенты и/или местные анестетики, могли растворяться в носителе.

Сухие порошки, которые растворяют или ресуспендируют в подходящем носителе перед использованием, могут быть получены путем заполнения предварительно стерилизованными ингредиентами стерильного контейнера с использованием асептической техники в стерильной зоне. В альтернативном варианте, ингредиенты могут быть растворены в подходящих контейнерах с использованием асептической техники в стерильной зоне. Затем продукт высушивают при замораживании, и контейнеры герметично укупоривают.

Парентеральные суспензии, подходящие для внутримышечной, подкожной или внутрикожной инъекции, изготавливают по существу таким же образом, за исключением того, что стерильные компоненты ресуспендируют в стерильном носителе вместо растворения, и стерилизация не может быть выполнена фильтрацией. Компоненты могут быть выделены в стерильном состоянии или, в альтернативном варианте, они могут быть стерилизованы после выделения, например, гамма-излучением.

При введении согласно настоящему изобретению могут использоваться различные технологии доставки, включая инкапсуляцию в микрочастицы, вирусные системы доставки или введение с помощью аэрозоля под высоким давлением.

Данное изобретение не ограничено примерами способов и материалов, раскрытыми в данном документе, и любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут использоваться на практике или при тестировании вариантов осуществления этого изобретения. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, то любые нуклеотидные последовательности пишутся слева направо в 5'-3'-ориентации; аминокислотные последовательности пишутся слева направо в ориентации от аминоконца к карбоксильному концу, соответственно.

Когда приводится диапазон значений, то подразумевается, что также специально раскрывается каждое промежуточное значение с точностью до десятой доли нижнего предела, если контекст явно не диктует иное, между верхним и нижним пределами этого диапазона. Каждый меньший диапазон между любым заявленным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим заявленным или промежуточным значением в указанном диапазоне входит в данное описание. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться или исключаться из диапазона, и каждый диапазон, в котором любой, никакой или оба предела включены в меньшие диапазоны, также включен в данное описание при условии любого специально исключенного предела в заявленном диапазоне. В тех случаях, когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба из этих включенных пределов, также включены в данное описание.

Следует отметить, что используемые в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, например, ссылка на «нейротоксин клостридий» включает множество таких агентов-кандидатов, а ссылка на «данный нейротоксин клостридий» включает ссылку на один или несколько нейротоксинов клостридий и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д.

Информация о последовательностях

SEQ ID NO: 1 - BoNT/A1 - номер доступа в UniProtKB P10845 (Clostridium botulinum)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO: 2 - BoNT/B1 - номер доступа в UniProtKB P10844 (Clostridium botulinum)

MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

SEQ ID NO: 3 - BoNT/C1 - номер доступа в UniProtKB P18640 (Clostridium botulinum)

MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE

SEQ ID NO: 4 - BoNT/D - номер доступа в UniProtKB P19321 (Clostridium botulinum)

MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE

SEQ ID NO: 5 - BoNT/E - номер доступа WP_003372387 (Clostridium botulinum)

MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

SEQ ID NO: 6 - BoNT/F - номер доступа в UniProtKB YP_001390123 (Clostridium botulinum)

MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN

SEQ ID NO: 7 - BoNT/G - номер доступа в UniProtKB WP_039635782 (Clostridium botulinum)

MPVNIKNFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE

SEQ ID NO: 8 - TeNT - номер доступа в UniProtKB P04958 (Clostridium tetani)

MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND

SEQ ID NO: 9 - В-субъединица холерного токсина (Vibrio cholera)

MIKLKFGVFFTVLLSSAYAHGTPQNITDLCAEYHNTQIYTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGAIFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN

SEQ ID NO: 10 - А-субъединица холерного токсина (Vibrio cholera)

MVKIIFVFFIFLSSFSYANDDKLYRADSRPPDEIKQSGGLMPRGQSEYFDRGTQMNINLYDHARGTQTGFVRHDDGYVSTSISLRSAHLVGQTILSGHSTYYIYVIATAPNMFNVNDVLGAYSPHPDEQEVSALGGIPYSQIYGWYRVHFGVLDEQLHRNRGYRDRYYSNLDIAPAADGYGLAGFPPEHRAWREEPWIHHAPPGCGNAPRSSMSNTCDEKTQSLGVKFLDEYQSKVKRQIFSGYQSDIDTHNRIKDEL

SEQ ID NO: 11 - BoNT/A1(0)-CtxBCP (Искусственная последовательность)

MGSMEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMANSGGGGSGGGGSGGGGSPRGSALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLRKSFHHHHHH

Далее изобретение будет описано только в качестве примера на основе нижеследующих фигур и примеров.

ФИГУРЫ

Фигура 1: примеры гибридных нейротоксинов Ctx-BoNT

Фигура 2: фракции, проанализированные с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, после захватывающей колонки HisTrap HP. Целевая конструкция элюируется во фракциях E3-F6 (250-500 мМ имидазол).

Фигура 3: фракции, проанализированные с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, после второй хроматографической стадии, анионообменной хроматографии. Целевой белок элюируется во фракциях 13-30 (при увеличении концентрации NaCl).

Фигура 4: фракции, проанализированные с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, после активации энтерокиназой. Анализ показывает, что белок нестабилен до протеолитической активации, хотя некоторые из конструкций действительно остаются интактными. Активация энтерокиназой действительно расщепляет конструкцию между легкой и тяжелой цепью, и из анализа методом электрофореза в ДСН-ПААГ можно предположить, что по меньшей мере часть продукта имеет предсказанный состав, т.е. интактные легкую и тяжелую цепи, а также прикрепленные GS20 и CtxB в центральном положении.

Фигура 5: анализ методом Вестерн-блотинга после активации энтерокиназой. 5А - блоты, окрашенные моноклональным антителом к тетрагистидину и вторичным антимышиным конъюгатом; 5B - блоты, окрашенные анти-LcA антителом и вторичным антикроличьим конъюгатом.

Фигура 6: оценка свободного Ctx-B, BoNT/A1(0)-CtxBCP и BoNT/A1(0) в анализе конкурентного связывания GM1.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Экспрессия и очистка BoNT/A1(0)-CtxBCP

Конструкцию, оптимизированную по кодонам (для E. coli), конструировали на основе последовательности первичного белка CtxB (остатки с 22 по 103 в SEQ ID NO: 11) и субклонировали в эндонегативный BoNT/A в плазмиде pJ401 с T5-промотором для получения конструкции с центрально расположенным CtxB (BoNT/A1(0)-CtxBCP) с сайтом активации энтерокиназы (EK), линкером GS20 и C-концевым His-тэгом: L_cA(0)-EK-CtxB-GS20-H_c-A-6HT.

Конструкцией трансформировали штамм E. coli BL21 (DE3) в среде mTB (триптон 12 г/л, дрожжевой экстракт 24 г/л, дикалийфосфат 9,4 г/л, монокалийфосфат 2,2 г/л, Melford) с добавлением глицерина (0,4%, Sigma), глюкозамина (0,2%, Sigma) и 30 мкг/мл канамицина (Sigma). Отдельную колонию отбирали для заражения флакона с микробанком на шариках. Зараженные шарики хранили при -80°С до использования. Один шарик использовали для заражения 100 мл среды mTB при 37°С. Когда оптическая плотность при 600 нм достигла 4,6, 10 мл из 100 мл культуры добавляли к 1 л среды в колбе объемом 2 л, и культуру выращивали при 37°С до OD 600≥1,0. Температуру снижали до 16°С, и культуре давали остыть в течение 1 часа перед добавлением IPTG до конечной концентрации 1 мМ. Индукция продолжалась 20 часов. Культуру затем собирали центрифугированием при 6000×g в течение 20 минут при 4°С. Отработанный носитель декантировали, а осадок замораживали и хранили при -80°С, пока он не потребовался.

Клеточный осадок и ресуспендировали в буфере для лизиса до концентрации 6 мл/г (50 мМ Tris, рН 8,0, 200 мМ NaCl). Клетки лизировали однократным пропусканием через гомогенизатор при 20 kpsi. Клеточный дебрис и нерастворимый материал отделяли центрифугированием при 30000×g в течение 30 минут. Супернатант собирали и наносили на колонку HisTrap объемом 5 мл (предварительно заполненную смолой Ni²⁺ и уравновешенную лизирующим буфером). После нанесения колонку промывали 50 мл буфера для лизиса перед элюцией белка ступенчатым градиентом с увеличением концентрации имидазола: 25 мл 40 мМ имидазола, 50 мл 80 мМ имидазола, 25 мл 125 мМ имидазола, 25 мл 250 мМ имидазола и 25 мл 500 мМ имидазола. Фракции по 2,5 мл собирали на протяжении всей элюции, и местоположение целевой химеры определяли электрофорезом в ДСН-ПААГ (фигура 2).

Фракции E3-F6 (250-500 мМ имидазола), содержащие целевой белок, объединяли и обессоливали с использованием колонки для обессоливания 26/10 с объемом 53 мл. Материал обессоливали в QHP-буфере для связывания (50 мМ Tris, рН 8,0). Материал в новом буфере хранили в виде единого пула и далее очищали на анионообменнике.

Для дополнительной очистки химеры использовали колонку HiTrap QHP объемом 5 мл. Колонку предварительно уравновешивали в связывающем буфере (50 мМ Tris, рН 8,0) перед нанесением пула после обессоливания. Колонку промывали в течение 25 мл буфером для связывания, после чего элюировали белок в линейном градиенте от 0 до 350 мМ NaCl на 100 мл. Затем колонку промывали 25 мл буфера с линейны градиентом высокого содержания соли 350 мМ - 1 М NaCl. Фракции по 2,5 мл собирали в течение всей элюции и анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ, чтобы определить, какие фракции содержали целевой белок (фигура 3).

Фракции 13-30, содержащие целевой белок, объединяли и концентрировали перед активацией энтерокиназой в течение 18 часов при 4°С, и реакцию останавливали добавлением AEBSF.

Этот конечный материал анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ (фигура 4).

Анализ показывает, что белок был нестабилен до протеолитической активации, хотя некоторые из конструкций действительно остаются интактными. Активация энтерокиназой действительно расщепляет конструкцию между легкой и тяжелой цепью, и из анализа электрофорезом в ДСН-ПААГ можно предположить, что по меньшей мере часть продукта имеет предсказанный состав, т.е. интактные легкую и тяжелую цепи, а также прикрепленные GS20 и CtxB в центральном положении.

Образцы также были проанализировали методом вестерн-блоттинга для подтверждения наличия легкой цепи и гистидинового тэге (фигура 5). Белок переносили из геля на нитроцеллюлозную мембрану с использованием системы для переноса Bio-Rad Trans-Blot Turbo. Блоты блокировали в буфере PBST, содержащем 0,5% BSA. Блоты окрашивали либо моноклональным анти-тетраHis антителом и вторичным антимышиным конъюгатом, либо их анти-LcA антителом и вторичным антикроличьим конъюгатом. Для генерации сигнала использовали субстрат Super signal, и сигнал детектировали в системе гель-документации Pxi 4. Вестерн-блоттинг давал положительный сигнал для полноразмерного целевого продукта, а также для укороченных продуктов.

Пример 2 - Связывание BoNT/A1(0)-CtxBCP с GM1

Кратко, прозрачный планшет F96 Maxisorp покрывали 100 нг/мл GM1 в течение ночи, блокировали 2%-м раствором BSA-PBS и сначала инкубировали со свободной В-субъединицей холерного токсина (свободная Ctx-B), BoNT/A1(0)-CtxBCP или BoNT/A1(0) в указанных концентрациях. Затем планшеты инкубировали с 40 мкг/мл В-субъединицы холерного токсина, конъюгированной с пероксидазой хрена (Ctx-B-HRP). Активность HRP на планшете после промывки определяли с помощью проявляющего раствора, а оптическую плотность при 450 нм определяли после остановки реакции. Данные представляют собой среднее значение±стандартная ошибка средного для трех лунок (фигура 6).

На фигуре 6 показано, что:

BoNT/A1(0) не конкурировал за связывание Ctx-B (Ctx-B-HRP) с GM1, как ожидалось;

Свободный Ctx-B конкурировал с Ctx-B-HRP, как и ожидалось, с pEC₅₀ 0,2 мкг/мл;

BoNT/A1(0)-CtxBCP был способен конкурировать с Ctx-B-HRP, демонстрируя pEC₅₀ примерно в 100 раз ниже, чем свободный Ctx-B (49 мкг/мл).

Можно сделать вывод о том, что добавление домена Ctx-B наделяет BoNT/A1(0) способностью связываться с GM1, ганглиозидом, который не является естественным рецептором для BoNT/A1(0).

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> IPSEN BIOPHARM LIMITED

<120> ГИБРИДНЫЕ НЕЙРОТОКСИНЫ

<130> IBL 005-EP-PCT

<150> EP16191468.4

<151> 2016-09-29

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1296

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 1

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 2

<211> 1291

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 2

Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn

1 5 10 15

Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn

65 70 75 80

Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile

100 105 110

Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu

115 120 125

Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly

165 170 175

Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln

180 185 190

Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe

245 250 255

Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile

275 280 285

Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn

290 295 300

Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr

305 310 315 320

Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly

325 330 335

Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu

340 345 350

Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys

355 360 365

Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys

370 375 380

Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile

385 390 395 400

Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr

420 425 430

Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp

435 440 445

Val Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser

450 455 460

Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gln Ser Asn

465 470 475 480

Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp

485 490 495

Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr

500 505 510

Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys

515 520 525

Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln

530 535 540

Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp

545 550 555 560

Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp

565 570 575

Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly

580 585 590

Trp Val Lys Gln Ile Val Asn Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser

595 600 605

Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro

645 650 655

Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys

675 680 685

Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp

690 695 700

Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr

705 710 715 720

Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr

725 730 735

Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asp

740 745 750

Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gln Ala Ile

755 760 765

Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met

770 775 780

Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Glu Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn

785 790 795 800

Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr

805 810 815

Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Val Asn Lys Tyr Leu

820 825 830

Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Ile

835 840 845

Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile

850 855 860

Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly

865 870 875 880

Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys

885 890 895

Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr

900 905 910

Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val

915 920 925

Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn

930 935 940

Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile

965 970 975

Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg

980 985 990

Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu

1010 1015 1020

Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly

1025 1030 1035

Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe

1040 1045 1050

Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln

1055 1060 1065

Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr

1070 1075 1080

Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr

1085 1090 1095

Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys

1100 1105 1110

Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn

1115 1120 1125

Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu

1130 1135 1140

Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp

1145 1150 1155

Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn

1160 1165 1170

Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys

1175 1180 1185

Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu

1190 1195 1200

Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr

1205 1210 1215

Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp

1220 1225 1230

Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile

1235 1240 1245

Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr

1250 1255 1260

Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys

1265 1270 1275

Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1280 1285 1290

<210> 3

<211> 1291

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 3

Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asp Asn

1 5 10 15

Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr Leu Ala Asn Glu

20 25 30

Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp Val Ile Pro Asp

35 40 45

Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys Pro Pro Arg Val

50 55 60

Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Ser Asp Lys Asp Pro Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg

85 90 95

Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Thr

100 105 110

Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile Asn Thr Phe Asp

115 120 125

Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr Arg Gln Gly Asn

130 135 140

Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Val Ile Ile Thr Gly

145 150 155 160

Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr Phe Lys Leu Thr

165 170 175

Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gln Glu Gly Phe Gly Ala Leu Ser Ile Ile

180 185 190

Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn Ala Thr Asn Asp

195 200 205

Val Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys Met Asp Pro Ile

210 215 220

Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His Asn Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gln Thr Ile Ser Ser Val Thr Ser Asn Ile

245 250 255

Phe Tyr Ser Gln Tyr Asn Val Lys Leu Glu Tyr Ala Glu Ile Tyr Ala

260 265 270

Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Lys Tyr

275 280 285

Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn Lys Tyr Ile Gly

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe Val Val Glu Ser

325 330 335

Ser Gly Glu Val Thr Val Asn Arg Asn Lys Phe Val Glu Leu Tyr Asn

340 345 350

Glu Leu Thr Gln Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala Lys Ile Tyr Asn

355 360 365

Val Gln Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Val Tyr Thr Pro Val Thr

370 375 380

Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Val Tyr Asp Ile Gln Asn Gly Phe Asn

385 390 395 400

Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Val Leu Phe Met Gly Gln Asn Leu Ser

405 410 415

Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Val Asn Pro Glu Asn Met Leu Tyr Leu

420 425 430

Phe Thr Lys Phe Cys His Lys Ala Ile Asp Gly Arg Ser Leu Tyr Asn

435 440 445

Lys Thr Leu Asp Cys Arg Glu Leu Leu Val Lys Asn Thr Asp Leu Pro

450 455 460

Phe Ile Gly Asp Ile Ser Asp Val Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys

465 470 475 480

Asp Ile Asn Glu Glu Thr Glu Val Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Ser

485 490 495

Val Asp Gln Val Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gln Leu

500 505 510

Asp Leu Leu Tyr Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly

515 520 525

Glu Asn Gln Val Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gln Asn Val Asp Tyr Leu

530 535 540

Asn Ser Tyr Tyr Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asp Asn Val Glu

545 550 555 560

Asp Phe Thr Phe Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala

565 570 575

Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Val Asn Ala Gly

580 585 590

Val Gln Gly Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Val Val Glu Asp

595 600 605

Phe Thr Thr Asn Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp

610 615 620

Val Ser Ala Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn

625 630 635 640

Ser Val Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Val Thr Gly Val

645 650 655

Thr Ile Leu Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly

660 665 670

Ala Phe Val Ile Tyr Ser Lys Val Gln Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys

675 680 685

Thr Ile Asp Asn Cys Leu Glu Gln Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser

690 695 700

Tyr Glu Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gln Phe

705 710 715 720

Asn Asn Ile Ser Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gln Ala Gly

725 730 735

Ala Ile Lys Ala Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser

740 745 750

Asp Lys Glu Asn Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu

755 760 765

Asp Val Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg

770 775 780

Glu Cys Ser Val Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile

785 790 795 800

Asp Glu Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn

805 810 815

Leu Ile Asp Ser His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Lys Leu

820 825 830

Lys Ala Lys Val Asn Asn Ser Phe Gln Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile

835 840 845

Phe Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr

850 855 860

Phe Asn Asn Ile Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Arg Lys

865 870 875 880

Asn Thr Leu Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Ser Glu Glu

885 890 895

Gly Asp Val Gln Leu Asn Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly

900 905 910

Ser Ser Gly Glu Asp Arg Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn

915 920 925

Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile

930 935 940

Arg Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp

945 950 955 960

Ser Val Lys Asn Asn Ser Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe

965 970 975

Leu Val Phe Thr Leu Lys Gln Asn Glu Asp Ser Glu Gln Ser Ile Asn

980 985 990

Phe Ser Tyr Asp Ile Ser Asn Asn Ala Pro Gly Tyr Asn Lys Trp Phe

995 1000 1005

Phe Val Thr Val Thr Asn Asn Met Met Gly Asn Met Lys Ile Tyr

1010 1015 1020

Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr

1025 1030 1035

Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile Thr Phe Glu Ile Asn Lys Ile

1040 1045 1050

Pro Asp Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp Ser Asp Asn Ile Asn Met

1055 1060 1065

Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Glu Leu Asp Gly Lys

1070 1075 1080

Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr Thr Asn Val Val

1085 1090 1095

Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Asp Leu Arg Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr

1100 1105 1110

Met Val Asn Ile Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Met Tyr Ala Asn Ser

1115 1120 1125

Arg Gln Ile Val Phe Asn Thr Arg Arg Asn Asn Asn Asp Phe Asn

1130 1135 1140

Glu Gly Tyr Lys Ile Ile Ile Lys Arg Ile Arg Gly Asn Thr Asn

1145 1150 1155

Asp Thr Arg Val Arg Gly Gly Asp Ile Leu Tyr Phe Asp Met Thr

1160 1165 1170

Ile Asn Asn Lys Ala Tyr Asn Leu Phe Met Lys Asn Glu Thr Met

1175 1180 1185

Tyr Ala Asp Asn His Ser Thr Glu Asp Ile Tyr Ala Ile Gly Leu

1190 1195 1200

Arg Glu Gln Thr Lys Asp Ile Asn Asp Asn Ile Ile Phe Gln Ile

1205 1210 1215

Gln Pro Met Asn Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ala Ser Gln Ile Phe Lys

1220 1225 1230

Ser Asn Phe Asn Gly Glu Asn Ile Ser Gly Ile Cys Ser Ile Gly

1235 1240 1245

Thr Tyr Arg Phe Arg Leu Gly Gly Asp Trp Tyr Arg His Asn Tyr

1250 1255 1260

Leu Val Pro Thr Val Lys Gln Gly Asn Tyr Ala Ser Leu Leu Glu

1265 1270 1275

Ser Thr Ser Thr His Trp Gly Phe Val Pro Val Ser Glu

1280 1285 1290

<210> 4

<211> 1276

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 4

Met Thr Trp Pro Val Lys Asp Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asp

1 5 10 15

Asn Asp Ile Leu Tyr Leu Arg Ile Pro Gln Asn Lys Leu Ile Thr Thr

20 25 30

Pro Val Lys Ala Phe Met Ile Thr Gln Asn Ile Trp Val Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Phe Ser Ser Asp Thr Asn Pro Ser Leu Ser Lys Pro Pro Arg Pro

50 55 60

Thr Ser Lys Tyr Gln Ser Tyr Tyr Asp Pro Ser Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Glu Gln Lys Asp Thr Phe Leu Lys Gly Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg

85 90 95

Ile Asn Glu Arg Asp Ile Gly Lys Lys Leu Ile Asn Tyr Leu Val Val

100 105 110

Gly Ser Pro Phe Met Gly Asp Ser Ser Thr Pro Glu Asp Thr Phe Asp

115 120 125

Phe Thr Arg His Thr Thr Asn Ile Ala Val Glu Lys Phe Glu Asn Gly

130 135 140

Ser Trp Lys Val Thr Asn Ile Ile Thr Pro Ser Val Leu Ile Phe Gly

145 150 155 160

Pro Leu Pro Asn Ile Leu Asp Tyr Thr Ala Ser Leu Thr Leu Gln Gly

165 170 175

Gln Gln Ser Asn Pro Ser Phe Glu Gly Phe Gly Thr Leu Ser Ile Leu

180 185 190

Lys Val Ala Pro Glu Phe Leu Leu Thr Phe Ser Asp Val Thr Ser Asn

195 200 205

Gln Ser Ser Ala Val Leu Gly Lys Ser Ile Phe Cys Met Asp Pro Val

210 215 220

Ile Ala Leu Met His Glu Leu Thr His Ser Leu His Gln Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Asn Ile Pro Ser Asp Lys Arg Ile Arg Pro Gln Val Ser Glu Gly

245 250 255

Phe Phe Ser Gln Asp Gly Pro Asn Val Gln Phe Glu Glu Leu Tyr Thr

260 265 270

Phe Gly Gly Leu Asp Val Glu Ile Ile Pro Gln Ile Glu Arg Ser Gln

275 280 285

Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gly His Tyr Lys Asp Ile Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Asn Asn Ile Asn Lys Thr Ile Pro Ser Ser Trp Ile Ser Asn Ile Asp

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Ile Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Lys Asp Asn

325 330 335

Thr Gly Asn Phe Val Val Asn Ile Asp Lys Phe Asn Ser Leu Tyr Ser

340 345 350

Asp Leu Thr Asn Val Met Ser Glu Val Val Tyr Ser Ser Gln Tyr Asn

355 360 365

Val Lys Asn Arg Thr His Tyr Phe Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Phe

370 375 380

Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ile Tyr Thr Ile Arg Asp Gly Phe Asn

385 390 395 400

Leu Thr Asn Lys Gly Phe Asn Ile Glu Asn Ser Gly Gln Asn Ile Glu

405 410 415

Arg Asn Pro Ala Leu Gln Lys Leu Ser Ser Glu Ser Val Val Asp Leu

420 425 430

Phe Thr Lys Val Cys Leu Arg Leu Thr Lys Asn Ser Arg Asp Asp Ser

435 440 445

Thr Cys Ile Lys Val Lys Asn Asn Arg Leu Pro Tyr Val Ala Asp Lys

450 455 460

Asp Ser Ile Ser Gln Glu Ile Phe Glu Asn Lys Ile Ile Thr Asp Glu

465 470 475 480

Thr Asn Val Gln Asn Tyr Ser Asp Lys Phe Ser Leu Asp Glu Ser Ile

485 490 495

Leu Asp Gly Gln Val Pro Ile Asn Pro Glu Ile Val Asp Pro Leu Leu

500 505 510

Pro Asn Val Asn Met Glu Pro Leu Asn Leu Pro Gly Glu Glu Ile Val

515 520 525

Phe Tyr Asp Asp Ile Thr Lys Tyr Val Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr

530 535 540

Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asn Asn Val Glu Asn Ile Thr Leu

545 550 555 560

Thr Thr Ser Val Glu Glu Ala Leu Gly Tyr Ser Asn Lys Ile Tyr Thr

565 570 575

Phe Leu Pro Ser Leu Ala Glu Lys Val Asn Lys Gly Val Gln Ala Gly

580 585 590

Leu Phe Leu Asn Trp Ala Asn Glu Val Val Glu Asp Phe Thr Thr Asn

595 600 605

Ile Met Lys Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Val Ile

610 615 620

Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Ser Ala Leu Arg

625 630 635 640

Gly Asn Phe Asn Gln Ala Phe Ala Thr Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu

645 650 655

Glu Gly Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Val Phe Thr Phe

660 665 670

Tyr Ser Ser Ile Gln Glu Arg Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Glu Asn

675 680 685

Cys Leu Glu Gln Arg Val Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Gln Trp Met

690 695 700

Val Ser Asn Trp Leu Ser Arg Ile Thr Thr Gln Phe Asn His Ile Asn

705 710 715 720

Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Ser Tyr Gln Ala Asp Ala Ile Lys Ala

725 730 735

Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn

740 745 750

Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Val Lys Ile

755 760 765

Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Val

770 775 780

Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile Asp Glu Leu Asn

785 790 795 800

Lys Phe Asp Leu Arg Thr Lys Thr Glu Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser

805 810 815

His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Arg Leu Lys Ala Lys Val

820 825 830

Asn Glu Ser Phe Glu Asn Thr Met Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr

835 840 845

Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Ser Ile

850 855 860

Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Ala Leu Val

865 870 875 880

Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Gly Asp Asn Val Gln

885 890 895

Leu Asn Thr Ile Tyr Thr Asn Asp Phe Lys Leu Ser Ser Ser Gly Asp

900 905 910

Lys Ile Ile Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Tyr

915 920 925

Glu Asn Ser Ser Val Ser Phe Trp Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Thr

930 935 940

Asn Ser His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Ser Ile Glu Gln Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Leu Cys Ile Arg Asn Gly Asn Ile Glu Trp Ile Leu Gln

965 970 975

Asp Val Asn Arg Lys Tyr Lys Ser Leu Ile Phe Asp Tyr Ser Glu Ser

980 985 990

Leu Ser His Thr Gly Tyr Thr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Ile Met Gly Tyr Met Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Glu Leu

1010 1015 1020

Lys Gln Ser Gln Lys Ile Glu Asp Leu Asp Glu Val Lys Leu Asp

1025 1030 1035

Lys Thr Ile Val Phe Gly Ile Asp Glu Asn Ile Asp Glu Asn Gln

1040 1045 1050

Met Leu Trp Ile Arg Asp Phe Asn Ile Phe Ser Lys Glu Leu Ser

1055 1060 1065

Asn Glu Asp Ile Asn Ile Val Tyr Glu Gly Gln Ile Leu Arg Asn

1070 1075 1080

Val Ile Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Pro Leu Lys Phe Asp Thr Glu

1085 1090 1095

Tyr Tyr Ile Ile Asn Asp Asn Tyr Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Pro

1100 1105 1110

Glu Ser Asn Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Pro Asp Arg Ser Lys

1115 1120 1125

Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Ile Thr Ile Lys Ser Val Ser Asp Lys

1130 1135 1140

Asn Pro Tyr Ser Arg Ile Leu Asn Gly Asp Asn Ile Ile Leu His

1145 1150 1155

Met Leu Tyr Asn Ser Arg Lys Tyr Met Ile Ile Arg Asp Thr Asp

1160 1165 1170

Thr Ile Tyr Ala Thr Gln Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn Cys Val

1175 1180 1185

Tyr Ala Leu Lys Leu Gln Ser Asn Leu Gly Asn Tyr Gly Ile Gly

1190 1195 1200

Ile Phe Ser Ile Lys Asn Ile Val Ser Lys Asn Lys Tyr Cys Ser

1205 1210 1215

Gln Ile Phe Ser Ser Phe Arg Glu Asn Thr Met Leu Leu Ala Asp

1220 1225 1230

Ile Tyr Lys Pro Trp Arg Phe Ser Phe Lys Asn Ala Tyr Thr Pro

1235 1240 1245

Val Ala Val Thr Asn Tyr Glu Thr Lys Leu Leu Ser Thr Ser Ser

1250 1255 1260

Phe Trp Lys Phe Ile Ser Arg Asp Pro Gly Trp Val Glu

1265 1270 1275

<210> 5

<211> 1252

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 5

Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg

1 5 10 15

Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser

20 25 30

Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile

35 40 45

Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys

65 70 75 80

Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn

85 90 95

Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro

100 105 110

Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp

115 120 125

Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu

130 135 140

Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr

145 150 155 160

Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His

165 170 175

Gly Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe

180 185 190

Arg Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu

195 200 205

Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala

210 215 220

Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu

225 230 235 240

Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr

260 265 270

Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys

275 280 285

Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu

290 295 300

Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn

305 310 315 320

Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu

325 330 335

Phe Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile

340 345 350

Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile

355 360 365

Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe

370 375 380

Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr

385 390 395 400

Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val

405 410 415

Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly

420 425 430

Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile

435 440 445

Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr

450 455 460

Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala

465 470 475 480

Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala

485 490 495

Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His

500 505 510

Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val

515 520 525

Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala

530 535 540

Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile

545 550 555 560

Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile

565 570 575

Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr

580 585 590

Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu

595 600 605

Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala

610 615 620

Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu

625 630 635 640

Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser

645 650 655

Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys

660 665 670

Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn

675 680 685

Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met

690 695 700

Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu

705 710 715 720

Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn

725 730 735

Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser

740 745 750

Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser

755 760 765

Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu

770 775 780

Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His

785 790 795 800

Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr

805 810 815

Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp

820 825 830

Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys

835 840 845

Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp

850 855 860

Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys

865 870 875 880

Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser

885 890 895

Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr

900 905 910

Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn

915 920 925

Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg

930 935 940

Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile

945 950 955 960

Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn

965 970 975

Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe

980 985 990

Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn

995 1000 1005

Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile

1010 1015 1020

His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr

1025 1030 1035

Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu

1040 1045 1050

Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn

1055 1060 1065

Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp

1070 1075 1080

Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile

1085 1090 1095

Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser

1100 1105 1110

Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys

1115 1120 1125

Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg

1130 1135 1140

Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His

1145 1150 1155

Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys

1160 1165 1170

Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val

1175 1180 1185

Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn

1190 1195 1200

Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr

1205 1210 1215

Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr

1220 1225 1230

Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly

1235 1240 1245

Trp Gln Glu Lys

1250

<210> 6

<211> 1278

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 6

Met Pro Val Val Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp

1 5 10 15

Asp Thr Ile Leu Tyr Met Gln Ile Pro Tyr Glu Glu Lys Ser Lys Lys

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Glu Ile Met Arg Asn Val Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Asn Thr Ile Gly Thr Asp Pro Ser Asp Phe Asp Pro Pro Ala Ser

50 55 60

Leu Glu Asn Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Thr

65 70 75 80

Asp Ala Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Lys Thr Thr Ile Lys Leu Phe Lys

85 90 95

Arg Ile Asn Ser Asn Pro Ala Gly Glu Val Leu Leu Gln Glu Ile Ser

100 105 110

Tyr Ala Lys Pro Tyr Leu Gly Asn Glu His Thr Pro Ile Asn Glu Phe

115 120 125

His Pro Val Thr Arg Thr Thr Ser Val Asn Ile Lys Ser Ser Thr Asn

130 135 140

Val Lys Ser Ser Ile Ile Leu Asn Leu Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro

145 150 155 160

Asp Ile Phe Glu Asn Ser Ser Tyr Pro Val Arg Lys Leu Met Asp Ser

165 170 175

Gly Gly Val Tyr Asp Pro Ser Asn Asp Gly Phe Gly Ser Ile Asn Ile

180 185 190

Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Glu Tyr Thr Phe Asn Asp Ile Ser Gly

195 200 205

Gly Tyr Asn Ser Ser Thr Glu Ser Phe Ile Ala Asp Pro Ala Ile Ser

210 215 220

Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Arg

225 230 235 240

Gly Val Thr Tyr Lys Glu Thr Ile Lys Val Lys Gln Ala Pro Leu Met

245 250 255

Ile Ala Glu Lys Pro Ile Arg Leu Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly

260 265 270

Gln Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Met Lys Glu Lys Ile Tyr Asn

275 280 285

Asn Leu Leu Ala Asn Tyr Glu Lys Ile Ala Thr Arg Leu Ser Arg Val

290 295 300

Asn Ser Ala Pro Pro Glu Tyr Asp Ile Asn Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe

305 310 315 320

Gln Trp Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asn Ala Asp Gly Ser Tyr Thr Val

325 330 335

Asn Glu Asn Lys Phe Asn Glu Ile Tyr Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr

340 345 350

Glu Ile Asp Leu Ala Asn Lys Phe Lys Val Lys Cys Arg Asn Thr Tyr

355 360 365

Phe Ile Lys Tyr Gly Phe Leu Lys Val Pro Asn Leu Leu Asp Asp Asp

370 375 380

Ile Tyr Thr Val Ser Glu Gly Phe Asn Ile Gly Asn Leu Ala Val Asn

385 390 395 400

Asn Arg Gly Gln Asn Ile Lys Leu Asn Pro Lys Ile Ile Asp Ser Ile

405 410 415

Pro Asp Lys Gly Leu Val Glu Lys Ile Val Lys Phe Cys Lys Ser Val

420 425 430

Ile Pro Arg Lys Gly Thr Lys Ala Pro Pro Arg Leu Cys Ile Arg Val

435 440 445

Asn Asn Arg Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Ser Ser Tyr Asn Glu

450 455 460

Asn Asp Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Thr Asn Leu Asn

465 470 475 480

Asn Asn Tyr Arg Asn Asn Leu Asp Glu Val Ile Leu Asp Tyr Asn Ser

485 490 495

Glu Thr Ile Pro Gln Ile Ser Asn Gln Thr Leu Asn Thr Leu Val Gln

500 505 510

Asp Asp Ser Tyr Val Pro Arg Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Glu Ile

515 520 525

Glu Glu His Asn Val Val Asp Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu His Ala

530 535 540

Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Thr Asn Ile Ser Leu Thr Ser Ser Ile

545 550 555 560

Asp Thr Ala Leu Ser Glu Glu Ser Gln Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser

565 570 575

Glu Phe Ile Asn Thr Ile Asn Lys Pro Val His Ala Ala Leu Phe Ile

580 585 590

Ser Trp Ile Asn Gln Val Ile Arg Asp Phe Thr Thr Glu Ala Thr Gln

595 600 605

Lys Ser Thr Phe Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Val Val Pro Tyr

610 615 620

Val Gly Leu Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Val Gln Lys Glu Asn Phe

625 630 635 640

Lys Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Val

645 650 655

Pro Glu Leu Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe

660 665 670

Ile Gly Ser Ser Glu Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Ala Ile Asn Asn

675 680 685

Ser Leu Met Glu Arg Glu Thr Lys Trp Lys Glu Ile Tyr Ser Trp Ile

690 695 700

Val Ser Asn Trp Leu Thr Arg Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys

705 710 715 720

Glu Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asp Ala Ile Lys Thr

725 730 735

Val Ile Glu Tyr Lys Tyr Asn Asn Tyr Thr Ser Asp Glu Arg Asn Arg

740 745 750

Leu Glu Ser Glu Tyr Asn Ile Asn Asn Ile Arg Glu Glu Leu Asn Lys

755 760 765

Lys Val Ser Leu Ala Met Glu Asn Ile Glu Arg Phe Ile Thr Glu Ser

770 775 780

Ser Ile Phe Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Ala Lys Val Ser Lys

785 790 795 800

Leu Arg Glu Tyr Asp Glu Gly Val Lys Glu Tyr Leu Leu Asp Tyr Ile

805 810 815

Ser Glu His Arg Ser Ile Leu Gly Asn Ser Val Gln Glu Leu Asn Asp

820 825 830

Leu Val Thr Ser Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Glu Leu Ser Ser

835 840 845

Tyr Thr Asn Asp Lys Ile Leu Ile Leu Tyr Phe Asn Lys Leu Tyr Lys

850 855 860

Lys Ile Lys Asp Asn Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys

865 870 875 880

Phe Ile Asp Ile Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asp

885 890 895

Val Tyr Ile Tyr Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Ser Ser

900 905 910

Lys Pro Ser Glu Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn

915 920 925

Gly Arg Tyr Gln Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys

930 935 940

Tyr Phe Asn Lys Val Asn Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asp Cys

945 950 955 960

Ile Arg Asn Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Asn Tyr Asn Lys

965 970 975

Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Ala Gly Asn Asn Gln Lys Leu Val

980 985 990

Phe Asn Tyr Thr Gln Met Ile Ser Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp

995 1000 1005

Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn Ser Arg Ile

1010 1015 1020

Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Asp Glu Lys Ser Ile Ser Asn Leu

1025 1030 1035

Gly Asp Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Gly

1040 1045 1050

Cys Asn Asp Thr Arg Tyr Val Gly Ile Arg Tyr Phe Lys Val Phe

1055 1060 1065

Asp Thr Glu Leu Gly Lys Thr Glu Ile Glu Thr Leu Tyr Ser Asp

1070 1075 1080

Glu Pro Asp Pro Ser Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu

1085 1090 1095

Leu Tyr Asn Lys Arg Tyr Tyr Leu Leu Asn Leu Leu Arg Thr Asp

1100 1105 1110

Lys Ser Ile Thr Gln Asn Ser Asn Phe Leu Asn Ile Asn Gln Gln

1115 1120 1125

Arg Gly Val Tyr Gln Lys Pro Asn Ile Phe Ser Asn Thr Arg Leu

1130 1135 1140

Tyr Thr Gly Val Glu Val Ile Ile Arg Lys Asn Gly Ser Thr Asp

1145 1150 1155

Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg Lys Asn Asp Leu Ala Tyr

1160 1165 1170

Ile Asn Val Val Asp Arg Asp Val Glu Tyr Arg Leu Tyr Ala Asp

1175 1180 1185

Ile Ser Ile Ala Lys Pro Glu Lys Ile Ile Lys Leu Ile Arg Thr

1190 1195 1200

Ser Asn Ser Asn Asn Ser Leu Gly Gln Ile Ile Val Met Asp Ser

1205 1210 1215

Ile Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn Asn Gly Gly

1220 1225 1230

Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Leu Val Ala Ser

1235 1240 1245

Ser Trp Tyr Tyr Asn Asn Ile Arg Lys Asn Thr Ser Ser Asn Gly

1250 1255 1260

Cys Phe Trp Ser Phe Ile Ser Lys Glu His Gly Trp Gln Glu Asn

1265 1270 1275

<210> 7

<211> 1297

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 7

Met Pro Val Asn Ile Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asn Asn

1 5 10 15

Asp Asp Ile Ile Met Met Glu Pro Phe Asn Asp Pro Gly Pro Gly Thr

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Arg Ile Ile Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu

35 40 45

Arg Phe Thr Tyr Gly Phe Gln Pro Asp Gln Phe Asn Ala Ser Thr Gly

50 55 60

Val Phe Ser Lys Asp Val Tyr Glu Tyr Tyr Asp Pro Thr Tyr Leu Lys

65 70 75 80

Thr Asp Ala Glu Lys Asp Lys Phe Leu Lys Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Asn Ser Lys Pro Ser Gly Gln Arg Leu Leu Asp Met Ile

100 105 110

Val Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ala Ser Thr Pro Pro Asp Lys

115 120 125

Phe Ala Ala Asn Val Ala Asn Val Ser Ile Asn Lys Lys Ile Ile Gln

130 135 140

Pro Gly Ala Glu Asp Gln Ile Lys Gly Leu Met Thr Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Ser Asp Asn Phe Thr Asp Ser Met Ile

165 170 175

Met Asn Gly His Ser Pro Ile Ser Glu Gly Phe Gly Ala Arg Met Met

180 185 190

Ile Arg Phe Cys Pro Ser Cys Leu Asn Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Asp Thr Ser Ile Phe Ser Arg Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Ile Ser Asn Leu Pro Ile Thr Pro Asn Thr Lys Glu Phe

245 250 255

Phe Met Gln His Ser Asp Pro Val Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly His Asp Pro Ser Val Ile Ser Pro Ser Thr Asp Met Asn Ile

275 280 285

Tyr Asn Lys Ala Leu Gln Asn Phe Gln Asp Ile Ala Asn Arg Leu Asn

290 295 300

Ile Val Ser Ser Ala Gln Gly Ser Gly Ile Asp Ile Ser Leu Tyr Lys

305 310 315 320

Gln Ile Tyr Lys Asn Lys Tyr Asp Phe Val Glu Asp Pro Asn Gly Lys

325 330 335

Tyr Ser Val Asp Lys Asp Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ala Leu Met

340 345 350

Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ile Lys Thr

355 360 365

Arg Tyr Ser Tyr Phe Ser Glu Tyr Leu Pro Pro Ile Lys Thr Glu Lys

370 375 380

Leu Leu Asp Asn Thr Ile Tyr Thr Gln Asn Glu Gly Phe Asn Ile Ala

385 390 395 400

Ser Lys Asn Leu Lys Thr Glu Phe Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Asn

405 410 415

Lys Glu Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Leu Glu His Leu Val Ile Tyr Arg

420 425 430

Ile Ala Met Cys Lys Pro Val Met Tyr Lys Asn Thr Gly Lys Ser Glu

435 440 445

Gln Cys Ile Ile Val Asn Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asn Lys

450 455 460

Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Ala Lys Ala Glu Thr Ile Ala Tyr Asn

465 470 475 480

Thr Gln Asn Asn Thr Ile Glu Asn Asn Phe Ser Ile Asp Gln Leu Ile

485 490 495

Leu Asp Asn Asp Leu Ser Ser Gly Ile Asp Leu Pro Asn Glu Asn Thr

500 505 510

Glu Pro Phe Thr Asn Phe Asp Asp Ile Asp Ile Pro Val Tyr Ile Lys

515 520 525

Gln Ser Ala Leu Lys Lys Ile Phe Val Asp Gly Asp Ser Leu Phe Glu

530 535 540

Tyr Leu His Ala Gln Thr Phe Pro Ser Asn Ile Glu Asn Leu Gln Leu

545 550 555 560

Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ala Leu Arg Asn Asn Asn Lys Val Tyr Thr

565 570 575

Phe Phe Ser Thr Asn Leu Val Glu Lys Ala Asn Thr Val Val Gly Ala

580 585 590

Ser Leu Phe Val Asn Trp Val Lys Gly Val Ile Asp Asp Phe Thr Ser

595 600 605

Glu Ser Thr Gln Lys Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Asp Val Ser Ile

610 615 620

Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala

625 630 635 640

Lys Glu Asn Phe Lys Asn Ala Phe Glu Ile Gly Gly Ala Ala Ile Leu

645 650 655

Met Glu Phe Ile Pro Glu Leu Ile Val Pro Ile Val Gly Phe Phe Thr

660 665 670

Leu Glu Ser Tyr Val Gly Asn Lys Gly His Ile Ile Met Thr Ile Ser

675 680 685

Asn Ala Leu Lys Lys Arg Asp Gln Lys Trp Thr Asp Met Tyr Gly Leu

690 695 700

Ile Val Ser Gln Trp Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile

705 710 715 720

Lys Glu Arg Met Tyr Asn Ala Leu Asn Asn Gln Ser Gln Ala Ile Glu

725 730 735

Lys Ile Ile Glu Asp Gln Tyr Asn Arg Tyr Ser Glu Glu Asp Lys Met

740 745 750

Asn Ile Asn Ile Asp Phe Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Asn Gln Ser

755 760 765

Ile Asn Leu Ala Ile Asn Asn Ile Asp Asp Phe Ile Asn Gln Cys Ser

770 775 780

Ile Ser Tyr Leu Met Asn Arg Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu

785 790 795 800

Lys Asp Phe Asp Asp Asn Leu Lys Arg Asp Leu Leu Glu Tyr Ile Asp

805 810 815

Thr Asn Glu Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Val Asn Ile Leu Lys Ser Lys

820 825 830

Val Asn Arg His Leu Lys Asp Ser Ile Pro Phe Asp Leu Ser Leu Tyr

835 840 845

Thr Lys Asp Thr Ile Leu Ile Gln Val Phe Asn Asn Tyr Ile Ser Asn

850 855 860

Ile Ser Ser Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu

865 870 875 880

Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val

885 890 895

Ile Phe Asn Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu

900 905 910

Asn Ser Asn Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser

915 920 925

Met Phe Asp Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr

930 935 940

Asn Asn Asn Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile

945 950 955 960

Ser Cys Ile Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn

965 970 975

Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile

980 985 990

Phe Phe Glu Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys

995 1000 1005

Trp Phe Ser Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn

1010 1015 1020

Ile Tyr Ile Asn Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn

1025 1030 1035

Leu Asp Arg Ile Asn Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile

1040 1045 1050

Asn Cys Thr Asp Thr Thr Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn

1055 1060 1065

Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr

1070 1075 1080

Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn

1085 1090 1095

Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Gln Tyr Tyr Leu Phe Asn Gln Gly Met

1100 1105 1110

Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr Phe Ser Lys Ala Ser Met Gly Glu

1115 1120 1125

Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn Asn Ala Ala Ile Asn Tyr Gln

1130 1135 1140

Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile Ile Lys Lys Ala Ser Asn

1145 1150 1155

Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val Arg Glu Gly Asp Tyr

1160 1165 1170

Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu Ser Tyr Arg Val

1175 1180 1185

Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln Leu Phe Leu

1190 1195 1200

Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu Gln Ile

1205 1210 1215

Lys Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu Cys

1220 1225 1230

Glu Lys Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe

1235 1240 1245

Val Lys Asp Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe

1250 1255 1260

Cys Ile Ser Gln Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn

1265 1270 1275

Lys Leu Arg Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu

1280 1285 1290

Gly Trp Thr Glu

1295

<210> 8

<211> 1315

<212> Белок

<213> Clostridium tetani

<400> 8

Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn

1 5 10 15

Asp Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser

50 55 60

Leu Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr

65 70 75 80

Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn

85 90 95

Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile

100 105 110

Asn Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe

115 120 125

Asp Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro

130 135 140

Ser Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe

145 150 155 160

Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu

165 170 175

Arg Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser

180 185 190

Ile Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn

195 200 205

Val Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe

210 215 220

Gln Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His

225 230 235 240

Gly Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys

245 250 255

Gln Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu

260 265 270

Phe Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys

275 280 285

Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn

290 295 300

Lys Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp

305 310 315 320

Ser Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser

325 330 335

Asn Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn

340 345 350

Ser Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn

355 360 365

Ile Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys

370 375 380

Ile Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe

385 390 395 400

Asn Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met

405 410 415

Arg Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val

420 425 430

Ser Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile

435 440 445

Arg Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly

450 455 460

Glu Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu

465 470 475 480

Lys Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr

485 490 495

Asn Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile

500 505 510

Ile Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg

515 520 525

Thr Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser

530 535 540

Asn Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile

545 550 555 560

Tyr Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile

565 570 575

Thr Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile

580 585 590

Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln

595 600 605

Gly Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr

610 615 620

Asn Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser

625 630 635 640

Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly

645 650 655

Tyr Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu

660 665 670

Leu Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu

675 680 685

Ser Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile

690 695 700

Asp Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys

705 710 715 720

Leu Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys

725 730 735

Arg Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile

740 745 750

Lys Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys

755 760 765

Glu Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu

770 775 780

Lys Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser

785 790 795 800

Ser Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln

805 810 815

Leu Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile

820 825 830

Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu

835 840 845

Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser

850 855 860

Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile

865 870 875 880

Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile

885 890 895

Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala

900 905 910

Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn

915 920 925

Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn

930 935 940

Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys

945 950 955 960

Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile

965 970 975

Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser

980 985 990

Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala

995 1000 1005

Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe

1010 1015 1020

Asn Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn

1025 1030 1035

Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met

1040 1045 1050

Gly Ser Ala Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn

1055 1060 1065

Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr

1070 1075 1080

Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro

1085 1090 1095

Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe

1100 1105 1110

Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr

1115 1120 1125

Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys

1130 1135 1140

Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn Ala Pro Ser Tyr Thr

1145 1150 1155

Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu Tyr Asn Gly Leu

1160 1165 1170

Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser

1175 1180 1185

Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser Tyr Asn

1190 1195 1200

Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala Phe

1205 1210 1215

Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly

1220 1225 1230

Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu

1235 1240 1245

Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala

1250 1255 1260

Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp

1265 1270 1275

Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His

1280 1285 1290

Leu Lys Asp Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr

1295 1300 1305

Asp Glu Gly Trp Thr Asn Asp

1310 1315

<210> 9

<211> 124

<212> Белок

<213> Vibrio cholerae

<400> 9

Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser Ser

1 5 10 15

Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu

20 25 30

Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr

35 40 45

Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys

50 55 60

Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

65 70 75 80

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala

85 90 95

Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

100 105 110

Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn

115 120

<210> 10

<211> 258

<212> Белок

<213> Vibrio cholerae

<400> 10

Met Val Lys Ile Ile Phe Val Phe Phe Ile Phe Leu Ser Ser Phe Ser

1 5 10 15

Tyr Ala Asn Asp Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp

20 25 30

Glu Ile Lys Gln Ser Gly Gly Leu Met Pro Arg Gly Gln Ser Glu Tyr

35 40 45

Phe Asp Arg Gly Thr Gln Met Asn Ile Asn Leu Tyr Asp His Ala Arg

50 55 60

Gly Thr Gln Thr Gly Phe Val Arg His Asp Asp Gly Tyr Val Ser Thr

65 70 75 80

Ser Ile Ser Leu Arg Ser Ala His Leu Val Gly Gln Thr Ile Leu Ser

85 90 95

Gly His Ser Thr Tyr Tyr Ile Tyr Val Ile Ala Thr Ala Pro Asn Met

100 105 110

Phe Asn Val Asn Asp Val Leu Gly Ala Tyr Ser Pro His Pro Asp Glu

115 120 125

Gln Glu Val Ser Ala Leu Gly Gly Ile Pro Tyr Ser Gln Ile Tyr Gly

130 135 140

Trp Tyr Arg Val His Phe Gly Val Leu Asp Glu Gln Leu His Arg Asn

145 150 155 160

Arg Gly Tyr Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Asp Ile Ala Pro Ala

165 170 175

Ala Asp Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Phe Pro Pro Glu His Arg Ala Trp

180 185 190

Arg Glu Glu Pro Trp Ile His His Ala Pro Pro Gly Cys Gly Asn Ala

195 200 205

Pro Arg Ser Ser Met Ser Asn Thr Cys Asp Glu Lys Thr Gln Ser Leu

210 215 220

Gly Val Lys Phe Leu Asp Glu Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile

225 230 235 240

Phe Ser Gly Tyr Gln Ser Asp Ile Asp Thr His Asn Arg Ile Lys Asp

245 250 255

Glu Leu

<210> 11

<211> 1430

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> BoNT/A1(0)-CtxBCP

<400> 11

Met Gly Ser Met Glu Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro

1 5 10 15

Val Asn Gly Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln

20 25 30

Met Gln Pro Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile

35 40 45

Pro Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro

50 55 60

Pro Pro Glu Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys

85 90 95

Leu Phe Glu Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr

100 105 110

Ser Ile Val Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr

115 120 125

Glu Leu Lys Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp

130 135 140

Gly Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser

145 150 155 160

Ala Asp Ile Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu

165 170 175

Asn Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser

180 185 190

Pro Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn

195 200 205

Pro Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu

210 215 220

Ala His Gln Leu Ile Tyr Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile

225 230 235 240

Asn Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met

245 250 255

Ser Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His

260 265 270

Asp Ala Lys Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr

275 280 285

Tyr Tyr Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys

290 295 300

Ser Ile Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe

305 310 315 320

Lys Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val

325 330 335

Asp Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr

340 345 350

Thr Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr

355 360 365

Tyr Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys

370 375 380

Val Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu

385 390 395 400

Ala Ala Asn Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe

405 410 415

Thr Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu

420 425 430

Cys Val Asp Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Asp Asp Asp Asp

435 440 445

Lys Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr

450 455 460

Gln Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu

465 470 475 480

Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr

485 490 495

Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys

500 505 510

Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu

515 520 525

Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala

530 535 540

Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

545 550 555 560

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Gly Ser Ala Leu Asn Leu

565 570 575

Gln Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu

580 585 590

Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp

595 600 605

Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gln

610 615 620

Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser

625 630 635 640

Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu Glu Leu Met Pro

645 650 655

Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr

660 665 670

Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu His Gly Lys Ser

675 680 685

Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser

690 695 700

Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys

705 710 715 720

Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu Gln Leu Val Tyr

725 730 735

Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala

740 745 750

Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly

755 760 765

Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly

770 775 780

Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu

785 790 795 800

Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr Val

805 810 815

Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu

820 825 830

Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln

835 840 845

Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala

850 855 860

Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu

865 870 875 880

Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys

885 890 895

Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu

900 905 910

Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly

915 920 925

Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu

930 935 940

Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gln Val Asp Arg

945 950 955 960

Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gln

965 970 975

Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr Phe Thr Glu

980 985 990

Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu

995 1000 1005

Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn

1010 1015 1020

Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile

1025 1030 1035

Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys

1040 1045 1050

Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

1055 1060 1065

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn

1070 1075 1080

Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp

1085 1090 1095

Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp

1100 1105 1110

Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met

1115 1120 1125

Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile

1130 1135 1140

Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg

1145 1150 1155

Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala

1160 1165 1170

Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His

1175 1180 1185

Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu

1190 1195 1200

Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser

1205 1210 1215

Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys

1220 1225 1230

Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp

1235 1240 1245

Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro

1250 1255 1260

Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu

1265 1270 1275

Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn

1280 1285 1290

Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val

1295 1300 1305

Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln

1310 1315 1320

Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val

1325 1330 1335

Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln

1340 1345 1350

Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly

1355 1360 1365

Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala

1370 1375 1380

Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser

1385 1390 1395

Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp

1400 1405 1410

Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu Arg Lys Ser Phe His His His His

1415 1420 1425

His His

1430

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, конкретно к гибридному полипептиду для связывания с ганглиозидом. Гибридный полипептид содержит легкую цепь нейротоксина клостридий (L), HN-домен нейротоксина клостридий, HCN-домен нейротоксина клостридий, HCC-домен нейротоксина клостридий с аминокислотными последовательностями, идентичными по меньшей мере на 95% последовательностям с аминокислотными остатками, соответственно, 1-448 SEQ ID NO: 1, 449-872 SEQ ID NO: 1, 873-1094 SEQ ID NO: 1, 1095-1296 SEQ ID NO: 1; и селективный, способный связываться с GM1 ганглиозидсвязывающий фрагмент с аминокислотной последовательностью, идентичной на по меньшей мере 95% последовательности с аминокислотными остатками 22-124 SEQ ID NO: 9. Также изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей указанный гибридный полипептид, вектору экспрессии, содержащему указанную последовательность, и клетке для экспрессии указанного гибридного полипептида, содержащей указанный вектор. Изобретение позволяет повысить селективность аффинности связывания ганглиозидов. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Гибридный полипептид для связывания с ганглиозидом, содержащий:

легкую цепь нейротоксина клостридий (L), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотными остатками 1-448 SEQ ID NO: 1;

H_N-домен нейротоксина клостридий, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотными остатками 449-872 SEQ ID NO: 1,

H_CN-домен нейротоксина клостридий, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотными остатками 873-1094 SEQ ID NO: 1;

H_CC-домен нейротоксина клостридий, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотными остатками 1095-1296 SEQ ID NO: 1; и

селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент способен связываться с GM1, и причем селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотными остатками 22-124 SEQ ID NO: 9.

2. Гибридный полипептид по п. 1, дополнительно содержащий сайт активации.

3. Гибридный полипептид по п. 2, где гибридный полипептид содержит от N-конца к С-концу:

легкую цепь нейротоксина клостридий (L), содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотными остатками 1-448 SEQ ID NO: 1;

сайт активации;

селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент, где указанный селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент способен связываться с GM1 и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотными остатками 22-124 SEQ ID NO: 9;

H_N-домен нейротоксина клостридий, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотными остатками 449-872 SEQ ID NO: 1;

H_CN-домен нейротоксина клостридий, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотными остатками 873-1094 SEQ ID NO: 1; и

H_CC-домен нейротоксина клостридий, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотными остатками 1095-1296 SEQ ID NO: 1.

4. Гибридный полипептид по п. 3, дополнительно содержащий линкер между селективным ганглиозидсвязывающим фрагментом и H_N-доменом нейротоксина клостридий.

5. Гибридный полипептид по п. 4, где линкер представляет собой линкер GS20.

6. Гибридный полипептид по любому из пп. 2-5, где сайт активации представляет собой сайт активации энтерокиназы.

7. Гибридный полипептид по любому из пп. 1-6, где селективный ганглиозидсвязывающий фрагмент содержит аминокислотные остатки 22-124 SEQ ID NO: 9.

8. Гибридный полипептид по любому из пп. 1-7, где:

легкая цепь нейротоксина клостридий (L) содержит аминокислотные остатки 1-448 SEQ ID NO: 1;

H_N-домен нейротоксина клостридий содержит аминокислотные остатки 449-872 SEQ ID NO: 1;

H_CN-домен нейротоксина клостридий содержит аминокислотные остатки 873-1094 SEQ ID NO: 1; а также

H_CC-домен нейротоксина клостридий содержит аминокислотные остатки 1095-1296 SEQ ID NO: 1.

9. Нуклеотидная последовательность, кодирующая гибридный полипептид по любому из пп. 1-8.

10. Вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность по п. 9.

11. Клетка для экспрессии гибридного полипептида, содержащая вектор экспрессии по п. 10.