СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ ЗАМЕЩЕННОГО ПОЛИ(3,4-ЭТИЛЕНДИОКСИТИОФЕНА) Российский патент 2022 года по МПК G01N27/30 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области электроаналитической химии, а именно электрохимическим сенсорам для определения редокс-активных веществ (гексацианоферрата калия, хлорид гексааммин рутения, наночастиц берлинской лазури) в жидких средах, а также биосенсорам на их основе.

Уровень техники

В электрохимических биосенсорах, содержащих биомолекулы для специфического распознавания, могут использоваться редокс-активные вещества (также называются медиаторами электронного переноса [WO2006057722A1]). Сигнал, генерируемый медиаторами, связан с концентрацией определяемого вещества. Для повышения производительности биосенсора необходимо повысить чувствительность определения медиатора.

При разработке электрохимических (био)сенсоров одним из ключевых этапов является модификация поверхности электродов, которая обеспечивает надежную иммобилизацию биомолекул. Известен способ снижения неспецифической адсорбции биомолекул в результате модификации электродов этиленгликолем [Doneux et al., Controlled Tuning of the Ferri/Ferrocyanide Electron Transfer at Oligo(Ethylene Glycol)-Modified Electrodes, Electrochimica Acta, 219, 412-417, 2016]. Однако в результате наблюдается значительное снижение скорости переноса заряда для редокс-активной пары [Fe(CN)₆]^3−/4− и снижение чувствительности её определения.

Известен способ функционализации поверхности электрода, заключающийся в модификации поверхности электрода самособирающимися слоями цистеамина [US10520462B1]. Для этого золотые электроды после полировки выдерживали в водном растворе хлорида цистеамина не менее 2 часов. Разность потенциалов пиков окисления и восстановления гексацианоферрата калия (pH 7,4), рассчитанная из циклической вольтамперограммы, зарегистрированной на модифицированном электроде, составляла не менее 90 мВ. К недостаткам такого способа относятся ограниченный выбор материалов для электродной поверхности, длительность процесса, снижение электроактивности в присутствии [Fe(CN)₆]³⁻ по сравнению с немодифицированным электродом, о чём свидетельствует увеличение разности потенциалов между пиками на циклической вольтамперограмме. Это также ограничивает разработку и масштабное производство электрохимических биосенсоров на основе самособирающихся монослоёв.

Для модификации поверхности электродов широко используются проводящие полимеры (например, полианилин, пилипиррол, политиофен). Поли(3,4-этилендиокситиофен) (ПЭДОТ) является одним из самых распространенных проводящих полимеров. Его основными преимуществами являются коммерческая доступность, устойчивость к внешним воздействиям, высокая электроактивность в водных и в органических средах. Производные поли(3,4-этилендиокситиофена) (азидометил-ПЭДОТ, хлорометил-ПЭДОТ, гидроксиметил-ПЭДОТ) – проводящие полимеры, обладают преимуществами поли(3,4-этилендиокситиофена) и позволяют провести ковалентную иммобилизацию биомолекул благодаря наличию функциональных групп. Здесь под биомолекулами подразумеваются ДНК, РНК, олигонуклеотиды, белки, ферменты, антитела, антигены и т.д.

Известны способы синтеза поли(3,4-этилендиокситиофена) в результате химической [WO2013034688A1] или электрохимической полимеризации [US9562293B2] для создания сенсоров. Электрохимическая полимеризация обеспечивает воспроизводимое получение полимера непосредственно на ограниченной поверхности рабочего электрода, позволяет контролировать толщину и морфологию полимерной плёнки и потому предпочтительнее для сенсорных приложений. Из-за ограниченной растворимости мономеров в воде синтез поли(3,4-этилендиокситиофена) и его производных преимущественно проводят в органических растворителях.

Известны сенсоры на основе поли(3,4-этилендиокситиофена) [Motshakeri et al., Rapid electroanalysis of uric acid and ascorbic acid using a poly(3,4-ethylenedioxythiophene)-modified sensor with application to milk, Electrochimica Acta, 265, 184-193, 2018], синтезированного в присутствии органических растворителей. С целью создания сенсоров для определения мочевой и аскорбиновой кислот в молоке проводилась электрополимеризация 3,4-этилендиокситиофена в растворе пропиленкарбоната, содержащем LiClO₄. Для подготовки сенсора к использованию в водной среде было необходимо зарегистрировать в водном растворе NaClO₄ циклические вольтамперограммы модифицированных электродов. Поскольку анализ биообразцов проводится в водной среде, модификацию поверхности электродов предпочтительно проводить в похожих условиях, так как органические молекулы, включенные в полимерную пленку, могут ингибировать активные центры или центры распознавания биомолекул в процессе функционирования (био)сенсора. Кроме того, синтез в водной среде более экологичен и коммерчески выгоден.

Известны способы электрохимического синтеза поли(3,4-этилендиокситиофена) и его производных в водной среде в присутствии поверхностно-активных веществ [WO2008/130327; WO2008/130326]. Для этого поли(3,4-этилендиокситиофен) или его производные синтезируют на поверхности электродов в результате электрополимеризации в мицеллярном растворе, образованном поверхностно-активными веществами (например, додецилсульфатом натрия) с мономером. Модифицированные электроды представляют собой платформы, на которые могут быть ковалентно иммобилизованы биомолекулы, для создания (био)сенсоров. Однако поверхностно-активные вещества также являются органическими веществами и могут снижать как активность и распознающие свойства рецепторов, так и ухудшать электронтранспортные свойства электродов в составе биосенсоров.

Известен подход для повышения растворимости поли(3,4-этилендиокситиофена) в водном растворе без использования поверхностно-активных веществ, заключающийся во введении полистиролсульфоната в качестве противоиона [Wen et al., Scientific Importance of Water‐Processable PEDOT–PSS and Preparation, Challenge and New Application in Sensors of Its Film Electrode: A Review, Polymer Chemistry, 85, 1121-1150, 2017]. Водную суспензию поли(3,4-этилендиокситиофена) и полистиролсульфоната получают в результате химической полимеризации. Для модификации поверхности электрода полученным полимером можно использовать метод капельного нанесения, метод центрифугирования, метод струйной печати. Однако из-за высокой гидрофильности полистиролсульфоната получаемые полимерные плёнки обладают низкой водостойкостью, разбухают и постепенно отслаиваются от электрода в водном растворе. Значительное количество внедренного полистиролсульфоната приводит к снижению электроактивности и проводимости, особенно снижается чувствительность определения отрицательно заряженных аналитов, поскольку полистиролсульфонат заряжен отрицательно.

Известен способ создания электрохимических ДНК-сенсоров на основе электродов, модифицированных азидометил-замещенным поли(3,4-этилендиокситиофеном) [Galan et al. Label-free electrochemical DNA sensor using “click”-functionalized PEDOT electrodes, Biosensors and Bioelectronics, 74, 751-756, 2015]. Для создания сенсоров на поверхности золотых электродов синтезировали азидометил-ПЭДОТ в результате электрополимеризации в дихлорметане азидометил-замещенного 3,4-этилендиокситиофена. Алкинированные ДНК-зонды иммобилизовали на поверхности модифицированных электродов в результате 1,3-диполярного азид-алкинового циклоприсоединения. Однако синтез полимера проводился в органической среде, а рассматриваемый аналитический сигнал (уменьшение тока окисления) не является специфическим, поскольку может возникать в результате блокировки поверхности электрода непроводящими биомолекулами, деградации полимера.

В результате необходимо разработать способ изготовления электрохимических (био)сенсоров на основе производных поли(3,4-этилендиокситиофена), включающий электрополимеризацию производных 3,4-этилендиокситиофена в водной среде, которые способствуют повышению электроактивности медиаторов на модифицированных электродах при pH 1,1–7,0.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение электрохимических сенсоров на основе производных поли(3,4-этилендиокситиофена) (а именно азидометил-, гидроксиметил-хлорометил-ПЭДОТ), которые обеспечивают разность потенциалов пиков окисления и восстановления гексацианоферрата калия в водной среде при pH 1,1–7,0 не более 70 мВ (скорость развертки 40 мВ/c), которая рассчитана из циклической вольтамперограммы, зарегистрированной на сенсоре, а также достижение чувствительности определения редокс-активных веществ в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии не более 0,2 А·М^-1·см^-2.

Технический результат достигается способом изготовления сенсоров для определения редокс-активных веществ в водной среде, включающий в себя синтез на поверхности электрода производных поли(3,4-этилендиокситиофена) из мономеров в результате электрополимеризации в водном растворе кислоты, характеризующейся постоянным увеличением скорости окисления мономеров при фиксированном потенциале. При этом в качестве мономера используют 2-хлорометил-3,4-этилендиокситиофен или 2-азидометил-3,4-этилендиокситиофен или 2-гидроксиметил-3,4-этилендиокситиофен, при этом синтез проводят в водном растворе кислоты с нормальностью не менее 0.05. Предпочтительно проводить синтез производных поли(3,4-этилендиокситиофена) в 0,05–0,2 М кислоте, в качестве которой предпочтительно использовать хлорную кислоту, серную кислоту. Предпочтительно, когда концентрация мономера составляет 0.01 моль/л. Получаемый в результате электрополимеризации материал является сополимером 3,4-этилендиокситиофена с 2-хлорометил-3,4-этилендиокситиофеном, 2-азидометил-3,4-этилендиокситиофеном, 2-гидроксиметил-3,4-этилендиокситиофеном. Разность потенциалов пиков окисления и восстановления гексацианоферрата калия в нейтральной водной среде, рассчитанная из циклической вольтамперограммы, зарегистрированной на сенсоре, полученном заявляемым способом, после погружения в раствор, составляет не более 67 мВ при скорости развертки 40 мВ/с.

Технический результат также достигается способ определения редокс-активных веществ в водной среде с помощью сенсоров, полученных заявляемым способом, путем погружения в исследуемую среду, регистрации линейной, циклической, дифференциально-импульсной или квадратно-волновой вольтамперограммы и определением из нее плотности тока пика окисления или восстановления вещества, с последующим определением концентрации искомого соединения методом градуировочного графика, предварительно полученного для определяемого вещества. В качестве редокс-активных веществ, определяемых сенсором, используются гексацианоферрат калия, хлорид гексааммин рутения, наночастицы берлинской лазури. Для построения градуировочного графика сенсор погружают в водный буферный раствор определяемого редокс-активного вещества с известной концентрацией, регистрируют линейную, циклическую, дифференциально-импульсную или квадратно-волновую вольтамперограмму, определяют плотность тока пика окисления или восстановления редокс-активного вещества, затем строят градуировочный график, представляющий собой линейную зависимость плотности тока от концентрации вещества.

Таким образом, технический результат достигается за счет электрохимического синтеза производных ПЭДОТ (азидометил-ПЭДОТ или хлорометил-ПЭДОТ или гидроксиметил-ПЭДОТ) в водной среде в отсутствие поверхностно-активных веществ и органических растворителей, которые негативно влияют на электроактивность редокс-активных веществ на поверхности электродов.

После модификации поверхности производными поли(3,4-этилендиокситиофена) редокс-активные вещества (а именно гексацианоферрат калия и хлорид гексаамин рутения) должны иметь повышенную электроактивность, по сравнению с немодифицированными печатными графитовыми электродами, при значениях pH от 1,1 до 7,0. Для подтверждения повышения электроактивности медиаторов предпочтительно рассчитывать электрохимическую константу скорости, используя расширенный метод Николсона [Lavagnini I. et al. An Extended Method for the Practical Evaluation of the Standard Rate Constant from Cyclic Voltammetric Data // Electroanalysis, 2004. V. 16, № 6. P. 505–506; Shavokshina V.A. et al. Improved Electroactivity of Redox Probes onto Electropolymerized Azidomethyl-PEDOT: Enabling Click Chemistry for Advanced (Bio)Sensors // Appl. Polym. Mater. American Chemical Society, 2021. V. 3, № 3. P. 1518–1524].

После модификации поверхности азидометил-ПЭДОТ в водной среде разность потенциалов между пиками на циклической вольтамперограмме K₃[Fe(CN)₆] на 27 % меньше, по сравнению с циклическими вольтамперограммами азидометил-ПЭДОТ, синтезированного в ацетонитриле и 0,1 М перхлорате тетрабутиламмония [US10591435B2].

Наличие функциональных групп у производных поли(3,4-этилендиокситиофена), подтвержденное методом ИК-спектроскопии, позволяет ковалентно иммобилизовать биомолекулы на поверхности электродов. Биомолекула может быть иммобилизована на поверхности электрода за счёт образования амидной связи, 1,2,3-триазольного цикла, сложноэфирной связи. В отличие от существующих решений, в предложенном способе исключено использование органических растворителей, которые могут ингибировать активные центры биомолекул и ухудшать характеристики биосенсоров.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг.1 показаны циклические вольтамперограммы 5 мМ K₃[Fe(CN)₆] на немодифицированном электроде (- -) и электроде, модифицированном азидометил-ПЭДОТ (―).

На фиг.2 показаны циклические вольтамперограммы 5 мМ [Ru(NH₃)₆]Cl₃ на немодифицированном электроде (- -) и электроде, модифицированном азидометил-ПЭДОТ (―).

На фиг.3 представлена градуировочная зависимость вольтамперометрического определения K₃[Fe(CN)₆].

На фиг.4 представлена градуировочная зависимость вольтамперометрического определения наночастиц берлинской лазури.

Осуществление изобретения

Сенсоры изготавливают в результате электрополимеризации производных 3,4-этилендиокситиофена в водной среде на поверхности печатных графитовых электродов. Синтез проводят в электрохимической ячейке, функционирующей по трехэлектродной схеме, с разделенными пространствами рабочего, вспомогательного электродов и электрода сравнения. Синтез проводят в потенциодинамическом режиме из раствора, содержащего 0,05–0,2 М HClO₄ и 0,01 М мономера, например, азидометил-ЭДОТ, хлорометил-ЭДОТ, гидроксиметил-ЭДОТ. Выбранное значение максимального анодного потенциала не должно приводить к переокислению полимера. О формировании проводящего полимера свидетельствует самопересечение токов на первом цикле циклической вольтамперограммы электрополимеризации, также увеличение токов с каждым циклом при анодных потенциалах 0,9–1,0 В.

Электроактивность медиаторов (гексацианоферрата калия K₃[Fe(CN)₆], хлорида гексааммин рутения [Ru(NH₃)₆]Cl₃) на поверхности сенсоров исследуют в режиме циклической вольтамперометрии при разных скоростях развертки потенциала (10 мВ/c – 1000 мВ/с) в буферных растворах с различным pH.

Представленные циклические вольтамперограммы демонстрирует увеличение электроактивности [Fe(CN)₆]^3-/4- и [Ru(NH₃)₆]^3+/2+ на поверхности модифицированных электродов (фиг.1, фиг.2). Циклическая вольтамперограмма [Fe(CN)₆]^3-/4- на немодифицированных электродах соответствует необратимой системе, поскольку не наблюдается выраженных пиков редокс активности. Для [Ru(NH₃)₆]^3+/2+ система квазиобратима: разность потенциалов между пиками не менее 150 мВ при скорости развертки потенциала 40 мВ/с.

Модифицированные производными азидометил-ПЭДОТ электроды демонстрируют поведение, близкое к обратимому. Разность потенциалов между пиками (∆E_п) не более 67 мВ, при увеличении скорости развертки потенциала до 1 В/c ∆E_п составляет не более, чем 110 мВ. Электроактивность гексацианоферрата калия на поверхности электродов, модифицированных азидометил-ПЭДОТ, синтезированного в органическом растворителе (ацетонитрил) в присутствии перхлората тетрабутиламмония, ниже по сравнению с азидометил-ПЭДОТ, полученным в водной среде. Об этом свидетельствует разность потенциалов между пиками на циклических вольтамперограммах азидометил-ПЭДОТ, полученного в органической среде - не менее 92 мВ, что на 27 % больше, чем на азидометил-ПЭДОТ, синтезированном в водной среде без использования поверхностно-активных веществ.

Данное повышение электроактивности подтверждается и расчетом электрохимической константы скорости (k). Расчёт k проводили согласно уравнению:

,

где D_о и D_в коэффициенты диффузии окисленной и восстановленной формы окислительно-восстановительной пары, υ скорость развертки потенциала, коэффициент переноса α =0.5.

Модификация поверхности электродов производными поли(3,4-этилендиокситиофена) способствует увеличению k в широком диапазоне pH (от 1,1 до 7,0).

Для функционирования (био)сенсоров особенно важно значительное повышение электроактивности при pH, близкому к физиологическим значениям. В присутствии [Fe(CN)₆]^3-/4- в результате модификации поверхности электрода k возрастает не менее, чем в 2000 раз (от 1 × 10^-5 до 2,3 × 10^-2 см/c) при pH 7,0.

Для [Ru(NH₃)₆]^3+/2+ , который гораздо менее чувствителен к свойствам поверхности, k возрастает не менее, чем в 2 раза.

Для количественной оценки редокс-активных веществ выполняли построение градуировочной зависимости.

Пример 1: Сенсор для определения гексацианоферрата калия на основе азидометил-ПЭДОТ, синтезированного в потенциодинамическом режиме

Электрополимеризацию проводили на печатных графитовых электродах в стеклянной ячейке, функционирующей по трехэлектродной схеме, с тремя разделенными пространствами. Ростовая смесь содержала 0,1 М HClO₄ и 0,01 М азидометил-ЭДОТ. Электрополимеризацию выполняли в потенциодинамическом режиме, потенциал изменяли в диапазоне от -0,2 до 1,0 В со скоростью 40 мВ/с в течение 10 циклов.

Электрод, модифицированный азидометил-ПЭДОТ, погружали в фосфатный буферный раствор (pH 7,0), содержащий гексацианоферрат калия. Измерения проводили в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии. Регистрировали последовательно не менее трёх вольтамперограмм до их наложения. Заменяли анализируемый раствор на раствор с большей концентрацией K₃[Fe(CN)₆]. Строили градуировочный график зависимости тока от концентрации K₃[Fe(CN)₆] (фиг. 3). Коэффициент чувствительности полученного сенсора равен 170±12 мА·М^-1·см^-2, что в 200 раз выше, чем коэффициент чувствительности немодифицированных печатных графитовых электродов.

Пример 2: Сенсор для определения наночастиц берлинской лазури на основе азидометил-ПЭДОТ

Электрополимеризацию азидометил-ЭДОТ проводили по методике, описанной в примере 1.

Полученный сенсор погружали в фосфатный буферный раствор (pH 6.0), содержащий наночастицы берлинской лазури, проводили измерения в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии. Строили градуировочный график зависимости тока от концентрации наночастиц берлинской лазури (фиг. 4). Диапазон линейности полученного графика 0,2–4,8 нМ. Коэффициент чувствительности сенсора равен 2,1±0,2 мА·М^-1·см^-2, что в 175 раз выше коэффициента чувствительности немодифицированных электродов.

Группа изобретений относится к электроаналитической химии, а именно электрохимическим сенсорам на основе проводящих полимеров для определения редокс-активных веществ в жидких средах, а также является основой для создания биосенсоров. Способ изготовления сенсоров для определения редокс-активных веществ в водной среде, включает синтез на поверхности электрода производных поли(3,4-этилендиокситиофена) из мономеров в результате электрополимеризации в водном растворе кислоты при постоянном увеличением скорости окисления мономеров при максимальном анодном потенциале. Согласно изобретению определение редокс-активных веществ в водной среде с помощью сенсора, изготовленного предложенным способом, осуществляют путем погружения в исследуемую среду, регистрации линейной, циклической, дифференциально-импульсной или квадратно-волновой вольтамперограммы и определения из нее плотности тока пика окисления или восстановления вещества, с последующим определением концентрации искомого соединения методом градуировочного графика, предварительно полученного для определяемого вещества. Изобретение обеспечивает возможность получения электрохимических сенсоров с разностью потенциалов пиков окисления и восстановления гексацианоферрата калия в водной среде при pH 1,1–7,0 не более 70 мВ (скорость развертки 40 мВ/c), а также достижение чувствительности определения редокс-активных веществ в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии не более 0,2 А⋅М^-1⋅см^-2. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Способ изготовления сенсоров для определения редокс-активных веществ в водной среде, включающий в себя синтез на поверхности электрода производных поли(3,4-этилендиокситиофена) из мономеров в результате электрополимеризации в водном растворе кислоты, характеризующейся постоянным увеличением скорости окисления мономеров при максимальном анодном потенциале.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве мономера используют 2-хлорометил-3,4-этилендиокситиофен или 2-азидометил-3,4-этилендиокситиофен или 2-гидроксиметил-3,4-этилендиокситиофен, при этом синтез проводят в водном растворе кислоты с нормальностью не менее 0,05.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве кислоты используют хлорную или серную кислоту.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что концентрация мономера составляет 0,01 моль/л.

5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что получаемый в результате электрополимеризации материал является сополимером 3,4-этилендиокситиофена с 2-хлорометил-3,4-этилендиокситиофеном, 2-азидометил-3,4-этилендиокситиофеном, 2-гидроксиметил-3,4-этилендиокситиофеном.

6. Способ определения редокс-активных веществ в водной среде с помощью сенсоров, полученных способом по п. 1, путем погружения в исследуемую среду, регистрации линейной, циклической, дифференциально-импульсной или квадратно-волновой вольтамперограммы и определением из нее плотности тока пика окисления или восстановления вещества, с последующим определением концентрации искомого соединения методом градуировочного графика, предварительно полученного для определяемого вещества.

7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что в качестве редокс-активных веществ, определяемых сенсором, используют гексацианоферрат калия, или хлорид гексаамминрутения, или наночастицы берлинской лазури.

8. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что для построения градуировочного графика сенсор погружают в водный буферный раствор определяемого редокс-активного вещества с известной концентрацией, регистрируют линейную, циклическую, дифференциально-импульсную или квадратно-волновую вольтамперограмму, определяют плотность тока пика окисления или восстановления редокс-активного вещества, затем строят градуировочный график, представляющий собой линейную зависимость плотности тока от концентрации вещества.