Способ экспресс-определения кардиомиоглобина в плазме крови с помощью электрохимического сенсора на основе углеродных нанотрубок и молекулярно импринтированного поли-о-фенилендиамина как биоаффинного реагента Российский патент 2017 года по МПК G01N27/327 

Изобретение относится к области клинической биохимии, диагностики, электрохимии и аналитической химии и касается электрохимического биосенсора на основе углеродных нанотрубок и молекулярно импринтированного полимера (МИЛ) на основе о-фенилендиамина для прямого определения миоглобина и способа получения указанного биосенсора.

Изобретение может быть использовано в медицинской практике для диагностики ранних стадий инфаркта миокарда (ИМ) с помощью анализа раннего маркера инфаркта миокарда - миоглобина [1].

Согласно статистике, сердечно-сосудистые заболевания занимают первое место среди причин смерти населения в России (www.gks.ru) и вызывают почти половину из общего числа смертей в Европе (www.ehnheart.org). На сегодняшний день известно примерно 200 соединений маркеров сердечно-сосудистых заболеваний (кардиомаркеров) и исследования в данной области продолжаются [2].

Кардиомиоглобин - один из наиболее ранних биомаркеров ИМ. Кардиомиоглобин появляется в крови в пределах от 1 до 4 часов [2, 3]. Пороговые концентрации кардиомиоглобина в крови, превышение которых свидетельствует об ИМ, варьируются в достаточно широких пределах (от 70-90 мкг/л до 200 мкг/л) и, по всей видимости, зависят от индивидуальных особенностей организма. Пороговым значением считают 100 мкг/л миоглобина [3].

На сегодняшний день на рынке представлены следующие тесты и системы иммуноанализа белков-кардиомаркеров, выпускаемые зарубежными производителями: Stratus® CS STAT (Dade Behring Inc), i-STAT® (Abbott), Triage® Cardiac Panel (Biosite), RAMP® (Response Biomedical Corp), Cardiac Reader™ (Roche), PATHFAST® (Mitsubishi Chemical Europe GmbH), MGL-CHECK-1 (Vedalab), HEXAGON TROPONIN (HUMAN GmbH). Bсe вышеперечисленные методы анализа миоглобина основаны на использовании природных антител, обеспечивающих специфичность анализа.

Ранее нами были разработаны электрохимические сенсоры на основе антител к миоглобину для определения миоглобина в водных буферных растворах и в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда.

Так, описан электрохимический биосенсор для прямого определения миоглобина в водных буферных растворах и способ его получения, заключающийся в том, что на поверхность рабочего электрода, предварительно модифицированного коллоидным золотом, стабилизированным диметилдидодециламмонийбромидом (ДДАБ) и моноклональными антителами к миоглобину, наносят анализируемый водный буферный раствор, содержащий миоглобин в определенной концентрации [4].

Описан также способ экспресс-определения кардиомиоглобина в плазме крови здоровых доноров и больных инфарктом миокарда с помощью электрохимического иммуносенсора, заключающийся в том, что на поверхность рабочего электрода, предварительно модифицированного коллоидным золотом и моноклональными антителами к миоглобину, наносят анализируемую плазму крови [5].

Недостатками описанных биосенсоров является использование моноклональных антител, которые являются нестабильными и дорогостоящими белковыми молекулами, что сказывается на стоимости анализа, стабильности сенсора и возможности его многократного использования.

Получено решение о выдаче патента на изобретение, заключающееся в получении методом электрополимеризации молекулярно импринтированного полимера (МИЛ) для регистрации миоглобина в водных буферных растворах [6].

Целью настоящего изобретения является разработка метода определения кардиомиоглобина в образцах плазмы крови с помощью электрохимического сенсора на основе углеродных нанотрубок и молекулярно импринтированного поли-о-фенилендиамина как биоаффинного реагента. Способ получения электрохимического сенсора на основе углеродных нанотрубок (УНТ) и молекулярно импринтированного поли-о-фенилендиамина (МИП) как биоаффинного реагента (УНТ/МИП-сенсор) описан в заявке [6]. Ранее была показана возможность селективного определения миоглобина в водных буферных растворах.

Проведение экспресс-анализа миоглобина в образцах плазмы крови потребовало значительных доработок методики определения и изготовления УНТ/МИП-сенсоров. Основными задачами были: 1) повышение чувствительности определения и 2) сокращение времени анализа.

В отличие от большинства зарубежных исследователей, реализующих схему анализа, основанную на электрохимической регистрации биоматериала по изменению параметров электрода с помощью внешнего электролита (ферро/феррицианида калия) [7, 8] или по изменению комплексного сопротивления системы (спектроскопия электрохимического импеданса) [9], предлагаемый метод основан на электроактивности миоглобина при встраивании в молекулярно импринтированный полимер (МИП), получаемый электрополимеризацией о-фенилендиамина непосредственно на электроде как измерительном инструменте. Регистрация миоглобина реализуется за счет прямого переноса электрона с электрода на ион железа Fe (III) гема, усиленная электрокаталитическим взаимодействием восстановленной формы иона железа Fe (II) гема с кислородом воздуха:

Задачей настоящего изобретения является разработка экспресс-метода для регистрации миоглобина в плазме крови с помощью электрода, модифицированного полимером с молекулярными отпечатками миоглобина (МИП на миоглобин) в качестве биораспознающего элемента. Для повышения чувствительности биосенсора используется МИП на миоглобин, сопряженный с углеродными нанотрубками.

В соответствии с изобретением описывается метод регистрации миоглобина в плазме крови с помощью электрохимического биосенсора путем измерения высоты пика восстановления железа гема миоглобина методом дифференциально-импульсной вольтамперометрии (ДИВА). Электрохимический биосенсор представляет собой планарный графитовый электрод, модифицированный углеродными нанотрубками и аналогом антител к миоглобину, на основе молекулярно импринтированного для миоглобина полимера поли-о-фенилендиамина (МИП на миоглобин).

Описывается также способ получения указанного электрохимического биосенсора для прямой регистрации миоглобина, заключающийся в том, что поверхность планарного электрода модифицируют суспензией углеродных нанотрубок, полученной методом ультразвуковой дезинтеграции углеродных нанотрубок в органическом растворителе, с последующей модификацией полученного электрода путем электрополимеризации о-фенилендиамина в присутствии миоглобина, осуществляемой на поверхности электрода.

Аналитическим сигналом миоглобина в плазме крови служит величина измеряемого тока переноса электрона с железа гема миоглобина на поверхность планарного электрода, модифицированного углеродными нанотрубками и молекулярно импринтированным для миоглобина полимером на основе о-фенилендиамина. Полимер получают методом электрополимеризации на поверхности планарного рабочего электрода [6-8].

Электрохимический биосенсор для безреагентного определения миоглобина изготавливается на основе одноразовых графитовых электродов, полученных методом трафаретной печати, которые модифицируют углеродными нанотрубками для усиления аналитического электрохимического сигнала и молекулярно импринтированным для миоглобина полимером (МИП на миоглобин).

Экспресс-метод анализа плазмы крови основан на взаимодействии МИП, полученного электрополимеризацией о-фенилендиамина на поверхности электрода, модифицированного углеродными нанотрубками, с последующей электрохимической регистрацией миоглобина в анализируемых пробах плазмы крови за счет взаимодействия миоглобина с полостями в полимере, соответствующими молекуле миоглобина.

ПРИМЕР 1. Изготовление электрохимических УНТ/МИП-сенсоров на миоглобин в плазме крови

Для приготовления биосенсоров используют трехконтактные электродные структуры, полученные методом трафаретной печати (ООО «КолорЭлектроникс», Россия, http://www.colorel.ru) с графитовыми рабочим и вспомогательным электродами (графит фирмы Acheson) и хлорсеребряным электродом сравнения. Диаметр рабочего электрода 2 мм. Все потенциалы приведены относительно хлорсеребряного Ag/AgCl электрода сравнения (vs. Ag/AgCl). Все измерения проводили в 0,1 М калий-фосфатном буфере, содержащем 0.05 М NaCl, рН 7.4.

Получение суспензии углеродных нанотрубок

Для получения суспензии углеродных нанотрубок была приготовлена смесь 1 мг УНТ/1 мл хлороформа, затем смесь озвучивали с помощью ультразвукового дезинтегратора (модель Elmasonic "Elma" S10Н). Время озвучивания 5 минут.

Приготовление предполимеризационной смеси о-фенилендиамин - миоглобин.

Для синтеза МИП на основе о-фенилендиамина и миоглобина были приготовлены исходные растворы реагентов: 100 мкМ миоглобин в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4, 10 мМ раствор о-фенилендиамина в 0,5 М ацетатном буфере, рН 5,2. Меньшие концентрации миоглобина и мономера получали при разведении исходных растворов теми же буферными растворами. Предполимеризационную смесь готовили смешиванием 30 мкл 1×10^-7 М раствор миоглобина с 30 мкл 1×10^-6 М о-фенилендиамина.

Модификация поверхности электрода

На поверхность рабочего графитового планарного электрода наносили 2 мкл озвученной суспензии УНТ в хлороформе (1 мг/мл) и инкубировали 15 мин при 37°С; затем на электрод наносили 60 мкл предполимеризационной смеси о-фенилендиамин: миоглобин в соотношении 10:1 (30 мкл 1×10^-7 М раствор миоглобина с 30 мкл 1×10^-6 М о-фенилендиамина). Электросинтез пленок осуществлялся методом циклической вольтамперометрии (ЦВА), 20 сканов при сканировании в диапазоне потенциалов от 0 В до +1,1 В со скоростью сканирования 50 мВ/с. После полимеризации модифицированный электрод промывали деионизованной водой, а затем инкубировали в растворе этанол: 0,25 М NaOH (2:1) 15 мин при 50°С с последующим промыванием водой в течение 15 мин при комнатной температуре. Модифицированные электроды высушивались под аргоном и хранились при +4°С (МИП/УНТ-электроды).

ПРИМЕР 2. Измерения концентрации миоглобина с помощью электрохимического УНТ/МИП-сенсора (сенсора на основе углеродных нанотрубок и молекулярно импринтированного полимера (МИП) в качестве аналогов антител (МИП/УНТ-сенсоры) в образцах плазмы крови

Электрохимические измерения проводили с помощью потенциостата AUTOLAB 12 (Metrohm Autolab, Нидерланды), снабженного программным обеспечением GPES (версия 4.9.7).

Подготовка к измерению

На рабочую поверхность электрохимического биосенсора с помощью пипетки наносят 2 мкл исследуемого образца плазмы крови и помещают в сушильный шкаф с температурой 37±1°С на 15 мин.

Параметры измерения сигнала

В программе к прибору устанавливают следующие параметры измерения сигнала:

- Метод: Дифференциально-импульсная вольтамперометрия (ДИВА);

- Время установления равновесия: 5 с;

- Продолжительность импульса: 50 мс;

- Начальный потенциал: 0.1 В;

- Конечный потенциал: -0.7 В;

- Шаг потенциала: 0.00495 В;

- Амплитуда: 0.025 В.

Измерение сигнала

На электрод наносят 60 мкл фосфатного буферного раствора. Закрепляют биосенсор с нанесенной пробой в измерительной ячейке, и запускают процедуру измерения сигнала. Полученную вольтамперометрическую кривую запоминают в виде самостоятельного файла. Если на полученной вольтамперограмме наблюдается пик в области потенциалов (E_max=-400 ÷ -500 мВ), то с помощью программы к прибору GPES (версия 4.9.7) производят определение высоты полученного пика восстановления миоглобина.

ПРИМЕР 3. Определение миоглобина в образцах плазмы крови больных с инфарктом миокарда (ОИМ) и здоровых доноров (К)

Разработанный биосенсор и методика экспресс-определения кардиомиоглобина были протестированы на 8 образцах плазмы больных ОИМ и здоровых доноров (К). В таблице 1 приведены значения концентраций миоглобина, полученные сразу после забора крови с помощью системы RAMP (Response Biomedical Corp, Канада), для каждого из образцов согласно инструкции к прибору. Полученные образцы хранили при -70±2°С и размораживали непосредственно перед проведением измерений.

Описание чертежей

На приведенных ниже чертежах представлены типичные дифференциально импульсные вольтамперограммы восстановления миоглобина, полученные согласно разработанной методике экспресс-анализа для разных образцов: УНТ/МИП-сенсор в буферном растворе (контрольный образец), 10^-7 М миоглобина, 10^-11 М миоглобина (Фиг. 1), а также показана линейная зависимость между концентрацией миоглобина, определенной с помощью анализатора RAMP^® (Response Biomedical Corp, Канада), и сигналом УНТ/МИП-сенсора (высотой пика восстановления железа гема миоглобина, скорректированного по базовой линии), полученным согласно разработанной методике (Фиг. 2).

На основе зависимости высоты восстановительного пика миоглобина, скорректированного по базовой линии, от концентрации миоглобина проводят построение калибровочной кривой для определения концентрации миоглобина в плазме крови (Фиг. 2).

На основе величины высоты восстановительного пика миоглобина, скорректированного по базовой линии, проводят определение концентрации миоглобина в образце плазмы крови с помощью полученной калибровочной кривой (Фиг. 2).

ЛИТЕРАТУРА

1. Qureshi A., Gurbuz Y. and Niazi J.H. (2012). Biosensors for cardiac biomarkers detection: A review. Sensors and Actuators B: Chemical, 171-172, 62-76.

2. Aldous S.J. // Int. J. Cardiol. 2013. V. 164. P. 282-294.

3. Matveeva E.G., Gryczynski Z., Lakowicz J.R. // J. Immunol. Methods 2005. V. 302, P. 26-35.

4. Патент RU №2367958, опубл. 20. 09. 2009.

5. Патент RU №2425382, опубл. 27.07.2011.

6. Заявка на изобретение №2015113453 от 13.04.2015 г.

7. Najmeh Karimian, Mikhail Vagin, Mohammad Hossein Arbab Zavar, Mahmoud Chamsaz, Anthony P.F. Turner, Ashutosh Tiwari, An ultrasensitive molecularly-imprinted human cardiac troponin sensor. Biosensors and Bioelectronics, 2013, 50, 492-498.

8. Najmeh Karimian, Anthony P.F. Turner, Ashutosh Tiwari, Electrochemical evaluation of troponin T imprinted polymer receptor. Biosensors and Bioelectronics, 2014, 59, 160-165.

9. F. Moreira et al. Sensors and Actuators B: Chemical, 2014, 196, 123-132.

Изобретение относится к области аналитической химии, электрохимии и медицинской диагностики. Способ экспресс-определения миоглобина в плазме крови с помощью электрохимического сенсора заключается в том, что на поверхность рабочего электрода, предварительно модифицированного суспензией углеродных нанотрубок, с последующей модификацией полученного электрода путем электрополимеризации о-фенилендиамина в присутствии миоглобина, осуществляемой на поверхности электрода, и последующего удаления шаблона миоглобина, наносят 2 мкл образца плазмы крови, выдерживают полученный сенсор с пробой 15 мин при 37±1°C, проводят электрохимическую регистрацию гемопротеина путем измерения высоты пика восстановления железа гема методом дифференциально-импульсной вольтамперометрии и определяют содержание миоглобина в пробе по предварительно полученному калибровочному графику. 2 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ экспресс-определения миоглобина в плазме крови с помощью электрохимического сенсора, заключающийся в том, что на поверхность рабочего электрода, предварительно модифицированного суспензией углеродных нанотрубок, с последующей модификацией полученного электрода путем электрополимеризации о-фенилендиамина в присутствии миоглобина, осуществляемой на поверхности электрода, и последующего удаления шаблона миоглобина наносят 2 мкл образца плазмы крови, выдерживают полученный сенсор с пробой 15 мин при 37±1°C, проводят электрохимическую регистрацию гемопротеина путем измерения высоты пика восстановления железа гема методом дифференциально-импульсной вольтамперометрии и определяют содержание миоглобина в пробе по предварительно полученному калибровочному графику.