Очистка фикобилипротеинов Российский патент 2022 года по МПК C12N1/12 C07K1/14 C07K14/405 C12P21/02 A23L5/46 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к новому способу очистки фикобилипротеинов, в частности, фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, к полученным фикобилипротеинам и к их применению.

ПРЕДЫДУЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Очистка фикобилипротеинов из Galdieria sulphuraria, в частности, фикоцианина С (С-РС), гораздо более сложна, чем из Arthrospira platensis (Spirulina) или других цианобактерий. Это отчасти обусловлено составом клеточной стенки Galdieria sulphuraria, для разрушения которой требуется механическое воздействие (Sorensen et al., 2013). Механический лизис приводит к образованию мицелл, которые только частично удаляются ультрацентрифугированием. Присутствие хлорофилла и растворенных каротиноидов в этих мицеллах способствует увеличению показателей абсорбции при 280 нм (специфичное в отношении белков поглощение в UV (ультрафиолетовой) области), что может объяснять низкую степень чистоты в первичных экстрактах С-РС по сравнению с таковыми из Spirulina (Sorensen et al., 2013). Таким образом, степень чистоты первичного экстракта можно увеличить посредством удаления мицелл и растворимых белков, отличных от фикобилипротеинов.

Очистка фикобилипротеинов, экстрагированных из Cyanidioschyzon merolae, Cyanidium caldarium, Galdieria sulphuraria и Spirulina путем осаждения сульфатом аммония уже описана в литературе (WO 2016/099261; Eisele et al., 2000; Kao et al. Moon et al., 1975; 2015; Cruz de et al., 2006), однако очень трудно применима в промышленном масштабе, поскольку требует больших количеств сульфата аммония, что ставит значительные проблемы переработки сульфата аммония и надосадочной жидкости.

Осуществление других описанных способов очистки, позволяющих достигать степень чистоты, таких как хроматографические способы, является очень дорогостоящим.

В этой связи, изобретение относится к способу очистки фикобилипротеинов, полученных путем культивирования в биореакторе микроорганизмов, продуцирующих фикобилипротеины, который легко осуществить и который подходит с экономической точки зрения для осуществления в промышленном масштабе.

Кроме того, фикобилипротеины, в частности, фикоцианины, представляют собой смесь фикоцианина С и аллофикоцианина. Известные способы очистки не позволяют разделить их промышленно-контролируемым образом. Очистка посредством осаждения сульфатом аммония приводит к неконтролируемому осаждению обоих белков, поэтому получение пигмента со стабильными свойствами может быть затруднительно. Данный способ осаждения также приводит к существенному снижению выхода экстракта (Cruz de et al., 2006).

Таким образом, изобретение также относится к получению очищенных фикобилипротеинов, в частности, очищенного фикоцианина, содержащего по существу фикоцианин С или по существу аллофикоцианин, в частности, фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, с контролируемым составом фикоцианинов, где устойчивость к кислым значениям рН не требует добавления стабилизирующих агентов, таких как аскорбиновая кислота (WO 2005/065697) или полифенолы (WO 2015/090697).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, изобретение относится к способу очистки фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, из первичного экстракта фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, отличающемуся тем, что он включает стадии

а) доведения рН первичного экстракта фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, до рН ниже 6, чтобы осадить органические вещества, отличные от фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН,

б) сбора надосадочной жидкости, содержащей фикобилипротеины, устойчивые к кислым значениям рН, и

в) выделения фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, из надосадочной жидкости.

Изобретение также относится к фикобилипротеинам, устойчивым к кислым значениям рН, полученным указанным способом, и, в частности, к фикоцианинам, устойчивым к кислым значениям рН, содержащим смесь фикоцианина С и аллофикоцианина, более конкретно, где молярное соотношение фикоцианина С и аллофикоцианина составляет по меньшей мере 2.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Увеличение индекса чистоты первичного экстракта из лизата свежих клеток в зависимости от рН.

Фиг. 2. Определение концентрации С-РС и АРС (аллофикоцианин) в различных первичных экстрактах, полученных путем центрифугирования лизата свежих клеток, при различных значениях рН. Концентрации АРС (мг/мл) показаны серым, а концентрации С-РС (мг/мл) показаны черным.

Фиг. 3. Определение концентрации С-РС и АРС в осадках, полученных путем центрифугирования лизата свежих клеток, при различных значениях рН. Концентрации АРС (мг/г DM (сухого вещества)) показаны серым, а концентрации С-РС (мг/г DM) показаны черным.

Фиг. 4. Увеличение индекса чистоты первичного экстракта из лизата лиофилизированных и регидратированных клеток в зависимости от рН.

Фиг. 5. Определение концентрации С-РС и АРС в различных первичных экстрактах, полученных путем центрифугирования лизата лиофилизированных и регидратированных клеток, при различных значениях рН. Концентрации АРС (мг/мл) показаны серым, а концентрации С-РС (мг/мл) показаны черным.

Фиг. 6. Очистка и концентрирование С-РС посредством тангенциальной фильтрации. Первичный экстракт, предварительно очищенный путем осаждения при кислых значениях рН, фильтровали с применением половолоконной системы.

Фиг. 7. Увеличение концентрации С-РС в ретентате в ходе фильтрации с применением половолоконных фильтров.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, изобретение относится к способу очистки фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН, из первичного экстракта фикобилипротеинов, устойчивых к кислым значениям рН.

Первичный экстракт фикобилипротеинов обычно получают из клеток микроорганизмов, выращиваемых промышленным способом в биореакторах большой емкости, предпочтительно таким образом, чтобы получить ферментационный бульон с высокой плотностью микроорганизмов, продуцирующих фикобилипротеины (высокую плотность обычно определяют как более 50 г сухого вещества (DM) на литр ферментационного бульона, предпочтительно более 100 г/л). Указанные способы культивирования известны специалистам в области техники и могут осуществляться при автотрофии, гетеротрофии или миксотрофии, в частности, как описано в заявках WO 2017/050917, WO 2017/050918 и PCT/EP2016/079325, поданной 30 ноября 2016. Фикобилипротеины, продуцированные культивируемыми микроорганизмами, должны высвобождаться после лизиса клеток. Действительно, клетки микроорганизмов содержат большие количества фикобилипротеинов (Moon et al., 2015, Sorensen et al., 2013, Eriksen 2008). Следовательно, осуществление способа по изобретению требует прежде всего получения водного экстракта из ферментационного бульона.

Водный экстракт можно получать непосредственно из ферментационного бульона после его сбора из реактора в конце ферментации, возможно с добавлением соответствующего количества воды.

Его можно получать из свежих клеток, отделенных от ферментационного бульона любым способом разделения, хорошо известным специалистам в области техники. Его также можно получать из клеток, которые были лиофилизированы или высушены для хранения.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, водный экстракт получают из свежих клеток, отделенных от ферментационного бульона после культивирования.

Лизис клеток можно осуществлять любым способом, известным специалисту в области техники. Его можно осуществлять, когда клетки суспендированы в воде, ферментационном бульоне или восстановленной суспензии.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, лизис клеток осуществляют на клетках, отделенных от ферментационного бульона, перед их ресуспендированием.

Предпочтительно, водный экстракт получают из суспензии, содержащей лизированные клетки, отделяя твердые вещества, любым способом разделения, известным специалистам в области техники, для отделения твердых остатков клеточного лизиса, в частности, путем фильтрования.

Это приводит к получению водного экстракта, обозначаемого «первичным экстрактом фикобилипротеинов» или «первичным экстрактом», который содержит, помимо желаемых фикобилипротеинов, в частности, устойчивых к кислым значениям рН фикобилипротеинов, другие органические вещества, такие как мицеллы и другие водорастворимые белки.

Первичный экстракт фикобилипротеинов может быть получен из свежих лизированных клеток (непосредственно в ферментационном бульоне или после отделения от ферментационного бульона) или из лиофилизированных или высушенных клеток, где лизис клеток происходит до или после лиофилизации или высушивания.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, первичный экстракт получают из свежих клеток.

Способ очистки по изобретению заключается в отделении фикобилипротеинов, в частности, устойчивых к кислым значениям рН фикобилипротеинов, от других органических веществ, таких как мицеллы и другие водорастворимые белки.

Микроорганизмы, культивируемые для получения фикобилипротеинов, хорошо известны специалистам в области техники, в частности, выбраны из группы Cyanophyceae, как, например, Arthrospira platensis (Spirulina), Spirulina maxima, Synechococcus elongatus, или группы Cyanidiophyceae, как, например, Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldiarium, Cyanidioschyzon merolae.

Предпочтительно, фикобилипротеины представляют собой устойчивые к кислым значениям рН фикоцианины. Устойчивые к кислым значениям рН фикобилипротеины или устойчивые к кислым значениям рН фикоцианины определяют как фикобилипротеины, которые устойчивы к осаждению при кислых значениях рН. Согласно изобретению, кислые значения рН означают рН ниже 7, предпочтительно 6 или менее. Предпочтительно, устойчивые к кислым значениям рН фикобилипротеины не осаждаются в водном растворе при значениях рН ниже 6. Их также можно описать как устойчивые или стабильные при кислых значениях рН.

Конечно, очищенные фикобилипротеины по изобретению будут более или менее стабильны в зависимости от рассматриваемых значений рН. Некоторые будут стабильны при значениях рН около 6, другие будут стабильны при значениях рН существенно ниже 6. Следовательно, устойчивые к кислым значениям рН фикобилипротеины также определяют как смесь фикобилипротеинов, большинство которых не осаждается при рН ниже 7, предпочтительно, ниже 6 или менее.

Предпочтительно, изобретение относится к фикобилипротеинам, стабильным при рН менее 5, предпочтительно менее или равном 4, более предпочтительно в диапазоне от 4 до 2, еще более предпочтительно менее или равном 3,5.

Такие устойчивые к кислым значениям рН фикоцианины известны специалистам в области техники, в частности, описаны в заявке WO 2016/099261 или заявке WO 2017/050918. В частности, это фикоцианины, продуцируемые штаммами микроводорослей родов Cyanidioschyzon, Cyanidium или Galdieria, в частности, выбранных из видов Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita, Galdieria sulphuraria, в частности, штаммами Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium и Cyanidioschyzon merolae.

Указанные фикоцианины представляют собой смесь фикоцианина С (С-РС) и аллофикоцианина (АРС).

Предпочтительно, апопротеин С-РС содержит белок SEQ ID NO 1 или SEQ ID NO 2 или их вариант. В частности, апопротеин α-субъединицы С-РС содержит белок с SEQ ID NO 1, а апопротеин β-субъединицы С-РС содержит белок с SEQ ID NO 2 или их варианты.

SEQ ID 1: MKTPITEAIA AADNQGRFLS NTELQAVNGR YQRAAASLEA ARSLTSNAQR LINGAAQAVY SKFPYTSQMP GPQYASSAVG KAKCARDIGY YLRMVTYCLV VGGTGPMDEY LIAGLEEINR TFDLSPSWYV EALNYVKSNH GLSGQAANEA NTYIDYAINA LS

SEQ ID 2: MLDAFAKVVA QADARGEFLS NTQLDALSKM VSEGNKRLDV VNRITSNASA IVTNAARALF SEQPQLIQPG GNAYTNRRMA ACLRDMEIIL RYVSYAIIAG DSSVLDDRCL NGLRETYQAL GVPGASVAVG VEKMKDSAIA IANDPSGITT GDCSALMAEV GTYFDRAATA VQ

Также, предпочтительно, α-субъединица указанного АРС содержит SEQ ID NO 3 или ее варианты, а апопротеин β-субъединицы указанного АРС содержит SEQ ID NO 4 или ее варианты.

SEQ ID 3: MSLISQIINT ADEELRYPNG GELSTLIYFF NTANTRINII NKLKEREKDI IQNASKKLFQ LHPEYVSSGG NASGPKQRAL CLRDYGWYLR LVTYGILAGD ITPIEKIGII GVKDMYNSLG VPIIGMYDAI KCLKEASINI FELSEEKDLI IPYFDYLSNA ILS

SEQ ID 4: MSIVTKSIVN ADAEARYLSP GELDRIKSFV LSGQRRLRIA QILTDNRERI VKQAGQQLFQ QRPDIVSPGG NAYGEEMTAT CLRDLDYYLR LVTYGVVAGD ISPIEEIGLE DFMQDAITAV INTADVQGKY LDNSSIEKLK GYFQTGELRV RAAATIAANA AGIIKDAVAK SLLYSDITRP GGNMYTTRRY AACIRDLDYY LRYATYSMLA GDPSILDERV LNGLKETYNS LGVPIGATIQ SIQAMKEVTS SLV

Апопротеины С-РС и АРС из одинакового источника фикоцианинов обычно имеют различные изоэлектрические точки. За счет снижения рН можно по меньшей мере частично отделять С-РС от АРС.

Авторы изобретения обнаружили, что чем больше понижали рН первичного экстракта, тем более чистый С-РС получали.

Предпочтительно, когда фикобилипротеин представляет собой устойчивый к кислым значениям рН фикоцианин, снижение рН ниже изоэлектрической точки АРС приводит к получению фикоцианина, содержащего смесь С-РС/АРС с молярным соотношением по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15.

Предпочтительно, рН первичного экстракта на стадии (а) доводят до рН ниже 5. Таким образом, можно получить устойчивый к кислым значениям рН фикоцианин, содержащий менее 5 мол. % АРС, предпочтительно менее 1%, более предпочтительно менее 0,1% АРС, где процентные содержания выражены по отношению к общей сумме АРС и С-РС.

На стадии (а) доведение рН осуществляют путем добавления сильной или слабой неорганической или органической кислоты в твердой форме или в форме раствора, количество добавляемой кислоты определяется рН первичного экстракта, подлежащего обработке, и значением рН, которое стремится получить специалист в области техники. Среди неорганических кислот, хорошо известных специалистам в области техники, следует отдельно упомянуть соляную кислоту и фосфорную кислоту. Среди органических кислот, хорошо известных специалистам в области техники, следует отдельно упомянуть уксусную кислоту, лимонную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, предпочтительно лимонную кислоту. Следует также упомянуть кислые полифенолы, такие как розмариновая кислота, дубильная кислота, дигалловая кислота, дубодубильная кислота, галлодубильная кислота, кислые таннины, такие как кверцетин, эллагитаннины, касталагин, касталин, казуаритицин, грандинин, пуникалигин, пуникалин, робурин А, теллимаграндин II, терфлавин В, вескалигин, пендункулагин, казуариин, кастлин, вескалин, предпочтительно дубильную кислоту. Предпочтительно, используемые кислоты представляют собой кислоты, разрешенные для применения в пищевых продуктах, в частности, фосфорную кислоту, лимонную кислоту или дубильную кислоту.

Для стадии (б) сбора надосадочной жидкости, содержащей устойчивые к кислым значениям рН фикобилипротеины, можно использовать любой известный специалистам в области техники способ разделения, в частности, тангенциальную фильтрацию на керамических мембранах или органических мембранах, таких как полиэфирсульфоновые половолоконные. Можно выбрать порог отсечения этих фильтров для отделения молекул, имеющих большую или меньшую молекулярную массу по сравнению с целевыми фикобилипротеинами.

Согласно конкретному воплощению изобретения, разделение на стадии (б) осуществляют посредством тангенциальной фильтрации. На данной стадии концентрируют и удаляют некоторые белки, отличные от фикобилипротеинов, таким образом увеличивая степень чистоты конечного продукта.

Стадию в) высушивания/дегидратации устойчивых к кислым значениям рН фикобилипротеинов из надосадочной жидкости осуществляют любым способом удаления растворителя, в данном случае воды, например, путем выпаривания при атмосферном давлении или под вакуумом. Отдельно следует упомянуть распыление, лиофилизацию, цеодратацию, сушку инфракрасным излучением или сушку по технологии «окна преломления».

В случае выпаривания путем нагревания специалисту в области техники следует позаботиться о том, чтобы не применять чрезмерно высоких температур, которые могут привести к денатурации фикобилипротеинов.

После сбора надосадочной жидкости на стадии (б) возможно повторное использование фикобилипротеинов, содержащихся в преципитате. Для этого остаточные фикобилипротеины растворяют в водном растворе с кислым значением рН, составляющими приблизительно 6 или менее, при которых примеси остаются нерастворимыми, тогда как фикобилипротеины являются растворимыми.

Эти остаточные фикобилипротеины затем отделяют от примесей и выделяют, повторяя стадии (б) и (в) способа. Это итеративный процесс, который можно повторять столько раз, сколько потребуется. Когда условия, используемые в способе по изобретению, позволяют предпочтительно очищать С-РС, остаточные фикобилипротеины представляют собой смесь С-РС/АРС, обогащенную АРС.

При повторном использовании преципитата получают фикобилипротеины, содержащие смесь С-РС/АРС в молярном соотношении менее 5, в частности менее 4, предпочтительно в диапазоне от 3 до 0,1.

Повторяя стадии (а)-(в) описанного выше способа, возможно посредством итеративного процесса извлекать из преципитата С-РС, который можно добавлять к ранее полученным фракциям для их обогащения, а также обогащать остаточную смесь фикобилипротеинов АРС, получая соотношение АРС/С-РС по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15.

Таким образом, можно получить смесь АРС, содержащую менее 5 мол. % СРС, предпочтительно менее 1%, более предпочтительно менее 0,1% СРС, где процентные содержания выражены по отношению к общей сумме АРС и С-РС.

Указанные АРС, выделенные из преципитата, могут быть затем очищены методиками препаративной хроматографии, хорошо известными специалистам в области техники, для получения аллофикоцианинов, которые можно применять, например, в области медицинской визуализации, благодаря их флуоресцентным свойствам.

Изобретение также относится к устойчивым к кислым значениям рН фикобилипротеинам, в частности, фикоцианинам, которые получают указанным способом очистки.

Изобретение также относится к очищенным устойчивым к кислым значениям рН фикоцианинам, содержащим смесь С-РС/АРС с молярным соотношением по меньшей мере 2.

В частности, изобретение относится к устойчивому к кислым значениям рН фикоцианину, содержащему по меньше 95 мол. % С-РС и менее 5 мол. % АРС, предпочтительно по меньшей мере 99 мол. % С-РС и менее 1 мол. % АРС, где процентные содержания выражены по отношению к общей сумме АРС и С-РС.

Указанные С-РС известны специалистам в области техники и, в частности, охарактеризованы выше, в частности, те из них, у которых α-субъединица С-РС содержит белок с SEQ ID NO 1, а апопротеин β-субъединицы С-РС содержит белок с SEQ ID NO 2 или их варианты.

Предпочтительно, варианты по изобретению имеют идентичность последовательности по меньшей мере 83% для α-субъединиц С-РС и по меньшей мере 82% для β-субъединиц С-РС.

Предпочтительно, варианты по изобретению имеют идентичность по меньшей мере 90% для субъединиц β (SEQ ID NO 1) и β (SEQ ID NO 2).

Изобретение также относится к очищенному фикоцианину, обогащенному АРС, который можно получить способом по изобретению.

В частности, изобретение относится к очищенному фикоцианину, который содержит смесь, обогащенную АРС, где молярное соотношение С-РС/АРС составляет менее 5, в частности, 4, предпочтительно в диапазоне от 3 до 0,1.

Согласно конкретному воплощению изобретения, смесь, обогащенная АРС, имеет соотношение АРС/С-РС по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15.

Согласно более конкретному воплощению изобретения, фикоцианин по существу состоит из АРС, при этом по меньшей мере 95 мол. % составляет АРС и менее 5 мол. % составляет С-РС, предпочтительно по меньшей мере 99 мол. % АРС и менее 1 мол. % С-РС, где процентные содержания выражены по отношению к общей сумме АРС и С-РС.

Указанные АРС известны специалистам в области техники и, в частности, охарактеризованы выше, в частности, те из них, у которых α-субъединица указанного АРС содержит SEQ ID NO 3 или ее варианты, а апопротеин β-субъединицы указанного АРС содержит SEQ ID NO 4 или ее варианты.

Предпочтительно, варианты по изобретению имеют идентичность последовательности по меньшей мере 83% для α-субъединиц АРС и по меньшей мере 82% для β-субъединиц АРС.

Специалисту в области техники известно, как определять идентичность белковых последовательностей с применением существующих способов, в частности, программы BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Аналогичным образом, специалисту в области техники известно, как идентифицировать варианты указанных последовательностей и верифицировать, что они сохраняют такие же структурные свойства, простым исследованием стабильности при кислых значениях рН, например, проводя такое исследование, как описанное в Примере 3 заявки WO 2017/050918.

Специалистам в области техники известно, что полипептид может быть модифицирован путем замены, вставки и/или делеции по меньшей мере одной аминокислоты без существенной модификации его функции.

Например, замена аминокислоты в заданном положении на другую химически эквивалентную аминокислоту представляет собой известный пример вариации последовательности, которая не влияет существенным образом на свойства белка.

Такие «консервативные» замены можно охарактеризовать как замены внутри следующих групп аминокислот:

- Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

- Asp, Asn, Glu, Gln

- His, Arg, Lys

- Met, Leu, Ile, Val, Cys и

- Phe, Tyr, Trp.

Таким образом, варианты апопротеинов фикоцианинов и/или аллофикоцианинов по изобретению могут содержать от 1 до 30 аминокислот, отличных по числу по сравнению с соответствующей так называемой референсной последовательностью, в частности, в отношении α и/или β-субъединиц фикоцианина, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и имеет проценты гомологии/идентичности, указанные выше.

Более конкретно, согласно изобретению,

- варианты апопротеинов α-субъединицы фикоцианинов, которые можно применять в кислотных композициях по изобретению, образующиеся в результате замен, вставок и/или делеций, могут содержать от 1 до 27 аминокислот, отличающихся от соответствующей так называемой референсной последовательности, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и проценты идентичности, указанные выше;

- варианты апопротеинов β-субъединицы фикоцианинов, которые можно применять в кислотных композициях по изобретению, образующиеся в результате замен, вставок и/или делеций, могут содержать от 1 до 30 аминокислот, отличающихся от соответствующей так называемой референсной последовательности, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и проценты идентичности, указанные выше;

- варианты апопротеинов α-субъединицы аллофикоцианинов, которые можно применять в кислотных композициях по изобретению, образующиеся в результате замен, вставок и/или делеций, могут содержать от 1 до 24 аминокислот, отличающихся от соответствующей так называемой референсной последовательности, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и проценты идентичности, указанные выше;

- варианты апопротеинов β-субъединицы аллофикоцианинов, которые можно применять в кислотных композициях по изобретению, образующиеся в результате замен, вставок и/или делеций, могут содержать от 1 до 20 аминокислот, отличающихся от соответствующей так называемой референсной последовательности, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и проценты идентичности, указанные выше.

В частности, согласно изобретению, кокой бы ни была референсная последовательность (α и/или β-субъединицы фикоцианина и/или α и/или β-субъединицы аллофикоцианина), варианты указанных субъединиц могут предпочтительно содержать от 1 до 15 отличающихся аминокислот, предпочтительно от 1 до 10 отличающихся аминокислот, в частности 1, или 2, или 3, или 4, или 5, или 6 или 7, или 8, или 9 отличающихся аминокислот по сравнению с соответствующей так называемой референсной последовательностью, при условии, что полученный вариант сохраняет свойства референсного белка и проценты идентичности, указанные выше.

Предпочтительно, изобретение относится к С-РС, где белок субъединицы альфа состоит из белка с SEQ ID 1, а белок субъединицы бета состоит из белка с SEQ ID 2.

Согласно другому предпочтительному воплощению, изобретение относится к АРС, где белок субъединицы альфа состоит из белка с SEQ ID NO 3, а белок субъединицы бета состоит из белка с SEQ ID NO 4.

Фикобилипротеины представляют собой естественные красители, в основном применяющиеся для окрашивания пищевых продуктов.

Изобретение также относится к применению устойчивых к кислым значениям рН фикобилипротеинов, полученных способом по изобретению и, в частности, устойчивых к кислым значениям рН фикоцианинов, определенных выше, в качестве красителей в пищевых продуктах.

Изобретение также относится к композиции, в частности, пищевой композиции, содержащей устойчивый к кислым значениям рН фикобилипротеин, полученный способом по изобретению и, в частности, устойчивый к кислым значениям рН фикоцианин, как определено выше.

Указанные применения и указанные композиции известны специалистам в области техники.

Предпочтительно, пищевой продукт или пищевая композиция представляет собой кислотную композицию, как определено в заявке WO 2017/050918.

Согласно изобретению, кислотная композиция определена как любая композиция, содержащая неорганическую или органическую кислоту и фикоцианин. Такая композиция может быть жидкой, текучей или вязкой, пастообразной или твердой композицией, имеющей кислое значение рН, в которую включен устойчивый к кислым значениям рН фикоцианин.

У водных жидких композиций рН определяют обычным способом. У неводных жидких композиций или пастообразных или твердых композиций рН определяют после растворения композиции в количестве воды, достаточном для растворения твердых соединений, которые она содержит, включая неорганические или органические кислоты и фикоцианин.

Предпочтительно, композиция по изобретению представляет собой водную жидкую композицию, возможно в форме геля или пастообразную или твердую композицию, предназначенную для растворения в водном растворе или в твердой или пастообразной композиции, содержащей воду. Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения, кислотная композиция представляет собой пастообразную или твердую композицию, предназначенную для применения и/или хранения во влажной окружающей среде.

Неорганические или органические кислоты, которые можно применять в композициях по изобретению, хорошо известны специалистам в области техники. Среди неорганических кислот отдельно следует упомянуть угольную, фосфорную, соляную, серную, хлорную, сульфоновую и азотную кислоты. Среди органических кислот отдельно следует упомянуть лимонную, молочную, яблочную, винную, янтарную кислоты, предпочтительно лимонную кислоту.

Согласно изобретению, кислотная пищевая композиция означает любую композицию, предназначенную для приема внутрь человеком или животными, которая подпадает под приведенное выше определение. Нутрицевтические кислотные композиции следует считать подпадающими под определение кислотных пищевых композиций в контексте изобретения.

Кислотные пищевые композиции по изобретению хорошо известны специалистам в области техники. Они могут включать носитель, который может включать структурные компоненты, ассоциированные с активными соединениями, идентифицированные в отношении их питательного вклада или свойств, благотворно влияющих на здоровье человека или животного. Кислотная пищевая композиция по изобретению может также включать пищевые добавки, такие как текстурирующие агенты, корригенты, консерванты, все из которых хорошо известны специалистам в области техники. Носитель может включать воду и/или белок, и/или жир, и/или волокна, и/или сахара. Компоненты носителя могут обладать лишь структурными свойствами, но обычно они известны своим питательным вкладом.

Кислотная пищевая композиция по изобретению может быть представлена в готовой для употребления форме или в форме пищевой добавки, которую добавляют в твердый, пастообразный или жидкий препарат для получения пищи, которую можно употреблять внутрь.

Кислоту для пищевых композиций следует предпочтительно выбирать из перечня разрешенных к применению пищевых подкисляющих агентов, в частности, угольной, фосфорной, лимонной, яблочной, винной и молочной кислот, более конкретно, лимонной кислоты.

Что касается кислотных композиций, отличных от пищевых композиций по изобретению, они могут быть в том числе фармацевтическими, ветеринарными или косметическими и могут дополнительно содержать любые добавки и/или активные вещества, известные и применяемые в композициях такого типа.

В твердую, жидкую или пастообразную кислотную композицию по изобретению фикоцианин может быть включен, например, в форме порошка. Указанная кислотная композиция, в частности, указанная кислотная пищевая композиция, может тогда находиться в любой обычной форме, такой как кремы, гели, пены, пасты и так далее. В частности, для твердой пищевой композиции следует отдельно упомянуть кексы или печенья, сухие продукты для приготовления, порошки для разведения, твердые или желеобразные желатиновые композиции, муссы и так далее.

Согласно изобретению, указанная жидкая кислотная композиция может представлять собой водную композицию, в которой растворен фикоцианин. Она может быть в форме готовой для употребления композиции или в виде жидкого концентрата для разведения, в частности, для приема внутрь или для добавления в твердую пищу для ее приготовления или для употребления, например жидкий концентрат для глазирования или композиция «топпинга», которыми покрывают кекс для придания ему цвета. Среди указанных концентрированных композиций следует упомянуть сиропы, возможно содержащие спирт.

Жидкие кислотные композиции по изобретению могут иметь различную вязкость и могут включать или не включать такие добавки, как агенты, регулирующие вязкость, желирующие вещества и другие структурирующие добавки, известные специалистам в области техники и обычные для изготовления жидких пищевых композиций.

Согласно конкретному воплощению изобретения, жидкая пищевая композиция может быть подкисленным напитком, возможно газированным. Сюда входят газированные напитки, соки, спортивные напитки, фитнес-напитки, восстановительные напитки и так далее. Композиции указанных напитков хорошо известны специалистам в области техники и могут включать, в частности, сахара, минеральные соли, пищевые добавки, растворенный газ и так далее. Напиток по изобретению представляет собой обычный кислый напиток, в котором обычно используемый краситель заменен полностью или частично устойчивым к кислым значениям рН фикоцианином по изобретению.

Согласно изобретению, содержание фикоцианина в композициях по изобретению может соответствовать стандартной практике, принятой в области техники.

Например, когда фикоцианин используют для окрашивания кислотной композиции, содержание фикоцианина в указанной композиции может соответствовать стандартной практике, принятой в области техники в отношении красителей.

В жидкой кислотной композиции по изобретению содержание фикоцианина может находиться в диапазоне от 2,5 мг/л до 2500 мг/л, предпочтительно от 25 мг/л до 300 мг/л.

В готовой для употребления жидкой питьевой композиции содержание фикоцианина может обычно находиться в диапазоне от 25 мг/л до 300 мг/л, предпочтительно от 50 мг/л до 100 мг/л.

В концентрированной жидкой композиции, которую следует разводить перед применением, такой как сироп, содержание фикоцианина обычно может находиться в диапазоне от 250 мг/л до 2500 мг/л, предпочтительно от 500 мг/л до 1000 мг/л.

В твердой композиции содержание фикоцианина обычно может находиться в диапазоне от 0,01 мг/г до 10 мг/г, предпочтительно от 0,1 мг/г до 5,0 мг/г, особенно предпочтительно от 0,25 мг/г до 2,5 мг/г.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Очистка посредством кислотного осаждения на свежих клетках

Ферментационный бульон клеток Galdieria sulphuraria, центрифугированный и промытый эквивалентным объемом воды, механически измельчают для высвобождения фикобилипротеинов в водную фазу при рН 6. Измельченный материал подкисляют, поэтапно изменяя рН на 0,5 единиц путем добавления лимонной кислоты. На каждой стадии отбирают образец смеси и затем центрифугируют в течение 10 мин при 11000 g. Собирают надосадочную жидкость, содержащую фикобилипротеины, и определяют индекс чистоты путем определения отношения поглощения при 618 нм к поглощению при 280 нм при помощи спектрофотометра (Amersham Biosciences Ultra Spec 2100 Pro).

Очевидно, что чем ниже рН, тем выше индекс чистоты (Фиг. 1). Такое увеличение индекса чистоты отражает уменьшение контаминирующих белков в надосадочной жидкости, тогда как С-РС остается преимущественно в надосадочной жидкости. Благодаря своей устойчивости к кислым значениям рН не происходит существенной потери содержания С-РС в надосадочной жидкости (Фиг. 2). Неожиданно, что аллофикоцианин (АРС) полностью исчезает из надосадочной жидкости при значениях рН ниже 5, оказываясь в осадке вместе с другими осажденными белками и клеточным дебрисом (Фиг. 3). Данный осадок также содержит С-РС и АРС, при этом содержание АРС выше (Фиг. 3).

Подкисление также приводит к лучшему разделению жидкой и твердой фаз и более компактному осадку клеточного дебриса и белков, который легче отделить от водной фазы.

Пример 2. Очистка посредством кислотного осаждения на лиофилизированных и регидратированных клетках

Ферментационный бульон клеток Galdieria sulphuraria, центрифугированный и промытый эквивалентным объемом воды, механически измельчают для высвобождения фикобилипротеинов в водную фазу при рН 6. Затем измельченный материал подвергают лиофильной сушке. Лиофилизированный сухой материал суспендируют в объеме воды, эквивалентном исходному объему бульона, и затем подкисляют, поэтапно изменяя рН на 0,5 единиц путем добавления лимонной кислоты. На каждой стадии отбирают образец смеси и затем центрифугируют в течение 10 мин при 11000 g. Собирают надосадочную жидкость, содержащую фикобилипротеины, и определяют индекс чистоты путем определения отношения поглощения при 618 нм к поглощению при 280 нм при помощи спектрофотометра (Amersham Biosciences Ultra Spec 2100 Pro).

Как описано выше в Примере 1, можно заметить увеличение индекса чистоты, коррелирующее с уменьшением рН (Фиг. 4). В данном случае подкисление также приводит к лучшему разделению жидкой и твердой фаз и более компактному осадку клеточного дебриса и белков, который легче отделить от водной фазы. Аналогично тому, что наблюдалось в Примере 1, при значениях рН ниже 5 АРС обнаруживается в осадке, а не в водной фазе (Фиг. 5). При значениях рН от 6 до 5 количество АРС в надосадочной жидкости уменьшается по мере снижения рН.

Пример 3. Очистка и концентрирование С-РС посредством тангенциальной фильтрации

Первичный экстракт после кислотного осаждения и центрифугирования фильтруют с применением половолоконного модуля тангенциальной фильтрации. Фильтрование через такую сетку удаляет некоторые из белков, не являющихся С-РС, таким образом, увеличивая индекс чистоты (Фиг. 6). Индекс чистоты, достигаемый при таком способе, приближается к значениям, обычно получаемым при намного более сложных способах, включающих двухфазные экстракции или осаждение сульфатом аммония или даже хроматографические методы (Soresen et al., 2013; Cruz de et al., 2006). Параллельно с процессом очистки данная стадия фильтрования обеспечивает удаление воды из экстракта С-РС (Фиг. 7) и облегчает последующее высушивание продукта.

Литература

- Cruz de et al., "Methods for Extraction, Isolation and Purification of C-phycocyanin: 50 years of Research in Review" (2016) Int J Food Nutr Sci 3(3): 1-10.

- Eisele et al., "Studies on C-phycocyanin from Cyanidium caldarium, a eukaryote at the extremes of habitat" Biochemica et Biophysica Acta 1456 (2000) 1456, 2-3, 99-107.

- Eriksen NT. "Production of phycocyanin - a pigment with applications in biology, biotechnology, foods and medicine" Appl Microbiol Biotechnol. 2008 Aug; 80(1): 1-14.

- Kao et al., "Physical-chemical properties of C-phycocyanin isolated from an acido-thermophilic eukaryote, Cyanidium caldarium" Biochem. J. (1975) 147, 63-70.

- Myounghoon et al. "Isolation and Characterization of Thermostable Phycocyanin from Galdieria Sulphuraria, "Korean journal of chemical engineering, 31 (2014): 1-6.

- et al. "Purification of the photosynthetic pigment C-phycocyanin from heterotrophic Galdieria sulphuraria" J Sci Food Agric. 2013 Sep; 93(12): 2933-8.

- WO 2005/065697, WO 2015/090697, WO 2016/099261, WO 2017/050917, WO 2017/050918 и PCT/EP 2016/079325, поданная 30 ноября 2016.

Изобретение относится к способу очистки фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям рН. Доводят pH первичного экстракта фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям pH, из клеток микроорганизмов, продуцирующих фикоцианины, до pH ниже 5, чтобы осадить органические вещества, отличные от фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям pH. Собирают надосадочную жидкость, содержащую фикоцианины, устойчивые к кислым значениям pH. Выделяют фикоцианины. Микроорганизм, продуцирующий фикоцианины, выбран из микроводорослей родов Cyanidioschyzon, Cyanidium или Galdieria. Обеспечивается получение очищенных фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям рН, с контролируемым составом фикоцианинов и индексом чистоты не менее 1,20. 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 пр.

1. Способ очистки фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям pH, из первичного экстракта фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям pH, из клеток микроорганизмов, продуцирующих фикоцианины, отличающийся тем, что он включает стадии

а) доведения pH первичного экстракта фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям pH, до pH ниже 5, чтобы осадить органические вещества, отличные от фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям pH,

б) сбора надосадочной жидкости, содержащей фикоцианины, устойчивые к кислым значениям pH, и

в) выделения фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям pH, из надосадочной жидкости,

где микроорганизм, продуцирующий фикоцианины, выбран из видов микроводорослей родов Cyanidioschyzon, Cyanidium или Galdieria.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фикоцианин содержит смесь фикоцианина C (C-PC) и аллофикоцианина (APC), где молярное соотношение C-PC/APC составляет по меньшей мере 5.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что рН первичного экстракта на стадии (а) доводят до рН ниже изоэлектрической точки аллофикоцианина (АРС).

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что фикоцианин содержит по меньшей мере 95% устойчивого к кислым значениям pH C-PC и менее 5 мол.% APC, где процентные содержания выражены по отношению к общей сумме APC и C-PC.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что сбор надосадочной жидкости (б) осуществляют путем фильтрования.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что микроводоросли выбраны из видов Galdieria sulphuraria, Cyanidium caldarium и Cyanidioschyzon merolae.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что остаточные фикоцианины, содержащиеся в осадке со стадии (а), растворяют в водном растворе с кислым значением pH, и отделяют от примесей, и выделяют, повторяя стадии (б) и (в).