Способ очистки фикоцианинов Российский патент 2023 года по МПК A23J1/00 

Область техники

Изобретение относится к новому способу очистки фикоцианинов, продуцируемых ферментацией микроводорослей, в частности, продуцируемых Galdieria sulphuraria, который включает ферментативное разложение гликогена.

Уровень техники

Очистка фикобилипротеинов, выделенных из Galdieria sulphuraria и Spirulina путем осаждения сульфатом аммония уже описана в литературе (Moon et al., 2015; Cruz de Jesus et al., 2006, CN106190853), но ее очень трудно применять в промышленном масштабе, потому что для этого требуется большое количество сульфата аммония, что создает значительные проблемы при переработке сульфата аммония и надосадочной жидкости.

Другие способы очистки, описанные для получения высокой степени чистоты, такие как методы хроматографии, очень дороги в реализации.

Способы выделения фикоцианина (PC) обычно заключаются в осаждении органических веществ, отличных от фикоцианинов, присутствующих в водном неочищенном экстракте от ферментации микроводорослей, для сохранения фикоцианинов в надосадочной жидкости, которую отфильтровывают перед осаждением фикоцианинов. Однако некоторые органические соединения, в частности сложные полисахариды, такие как гликоген, остаются не подверженными этому осаждению.

В промышленном способе очистки фикоцианинов для удаления воды можно использовать стадию фильтрации (ультрафильтрации), чтобы сконцентрировать фикоцианин и удалить небольшие молекулы (белки, ионы, органическую кислоту и т.д.), размер которых меньше порога отсечки фильтра, используемого для получения насколько возможно чистого фикоцианина. Однако если порог отсечки фильтра ниже, чем размер гликогена, он не удаляется и увеличивает вязкость ретентата, ограничивая осуществление фильтрации и поддержание ее оптимальных параметров. Зависящий от концентрации эффект вязкости гликогена был продемонстрирован с использованием очищенного гликогена из Galdieria sulphuraria (Martinez-Garcia et al., 2017).

Более того, полученные очищенные фикоцианины сохраняют высокое содержание этих Сахаров, что может изменять свойства очищенных продуктов, в частности их красящую способность, требуя большего количества фикоцианинов для достижения того же визуального эффекта. Эти остаточные полисахариды действуют как наполнитель, что добавляет затраты на производство фикоцианина и может ограничивать промышленное применение полученного фикоцианина, например, при приготовлении пищевых продуктов с низким содержанием сахара. Присутствие остаточных полисахаридов может ограничивать применение продукта при приготовлении пищевых продуктов с низким содержанием сахара, таким образом приводя к дополнительным расходам для удаления этих сахаров.

Гликоген представляет собой сложный сахар, который трудно удалить, если цель состоит в том, чтобы уберечь фикоцианин от обычных условий разложения сахара. Гликоген представляет собой разветвленный полиглюкозид, состоящий из α1-6-глюкозидных цепей, разветвленных α1-6-связями.

Использование ферментов для лизиса клеток известно в способе выделения фикоцианина из культуры микроорганизмов (CN 106749633, CN102433015 и CN1117973). Эта стадия лизиса клеток, разрушения клеточной стенки для высвобождения фикоцианинов с последующим выделением фикоцианина, высвобождаемого в среду, не оказывает значительного воздействия на гликоген, высвобождаемый с фикоцианином и выделяемым с последним.

Возможно осуществление ферментативного разложения гликогена. Однако этот полисахарид представляет собой полимер, частично устойчивый к ферментам, которые могут его разлагать. Из-за особенно большого количества разветвленных связей αl-6-глюкозидов использование ферментов, таких как β-амилаза (αl-4-глюкозидаза), нецелесообразно, как показано Martinez-Garcia et al. Эти авторы показывают относительно ограниченную активность панкреатической α-амилазы (αl-4-глюкозидазы) на гликоген. Измеренное снижение сахара, отражающее уровень расщепления, остается низким и быстро прекращается. Использование фермента с активностью αl-6-глюкозидазы (изоамилаза, пуллуланаза) для расщепления разветвленной структуры гликогена возможно, как показано в работе Martinez-Garcia et al. или Shimonaga et al. Но опять же, расщепление является неполным из-за высвобождения полимеров глюкозы после длительного времени расщепления (от 24 до 48 часов).

Эти эксперименты по расщеплению гликогена, о которых сообщалось в предшествующем уровне техники, не объединяли с проблемой сохранения фикоцианина, даже несмотря на то, что используемые ферменты могут влиять на целостность фикоцианина, тем самым изменяя его окраску и антиоксидантные свойства.

Цель состоит в том, чтобы улучшить способы очистки фикоцианинов, экстрагированных из биомассы, как с качественной точки зрения, так и с промышленной и экономической точки зрения, путем снижения остаточного содержания сахаров в конечном продукте, в частности остаточного содержания гликогена, при сохранении свойств фикоцианина.

Краткое описание изобретения

Способ в соответствии с изобретением состоит в выполнении ферментативной обработки раствора фикоцианинов для уменьшения содержания гликогена с помощью фермента, подходящего для разложения гликогена в условиях температуры и рН, которые существенно не разлагают присутствующие фикоцианины, т.е. с помощью ферментов, активных при рН ниже 6 и температуре реакции ниже 40°С, таких как глюкоамилазы, пектиназы и пуллуланазы, и их смеси.

Способ в соответствии с изобретением особенно подходит для очистки кислотоустойчивых фикобилипротеинов, продуцируемых Galdieria sulphuraria, причем ферментативную реакцию проводят при рН ниже 6, предпочтительно примерно 4.

Изобретение также относится к экстракту фикоцианина с отношением гликоген/фикоцианин (по сухой массе) менее 6, преимущественно менее 4, предпочтительно менее 3, более предпочтительно менее 2,5, даже более предпочтительно менее 1.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены кривые потери фикоцианина (%) с течением времени для расщепления при рН=4 при различных концентрациях фермента.

На фиг. 2 представлены кривые потери фикоцианина (%) с течением времени для расщепления при рН=7 при различных концентрациях фермента.

На фиг. 3 представлены кривые высвобождения глюкозы после расщепления гликогена с течением времени для расщепления при рН=4 при различных концентрациях фермента.

На фиг. 4 представлены кривые высвобождения глюкозы после расщепления гликогена с течением времени для расщепления при рН=7 при различных концентрациях фермента.

На фиг. 5 представлено изменение потока пермеата в зависимости от времени для фильтрации экстракта фикоцианина (С-РС) с ферментативным расщеплением и без него.

На фиг. 6 представлена кривая после расщепления гликогена при рН=4 для различных ферментов.

На фиг. 7 представлена кривая после расщепления гликогена при рН=7 для различных ферментов.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к способу очистки фикоцианинов из раствора, содержащего фикоцианин(ы) и гликоген, который включает стадию ферментативного разложения гликогена с помощью фермента, подходящего для разложения гликогена в условиях температуры и рН, которые не приводят к существенному разложению присутствующих фикоцианинов, и стадию отделения фикоцианинов от продуктов разложения гликогена.

Способ в соответствии с изобретением особенно подходит для очистки раствора фикоцианинов, экстрагированного из культуры микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин, которые также продуцируют гликоген, в частности, в контексте промышленного способа производства фикоцианина, который включает культивирование микроорганизмов с последующим извлечением произведенной биомассы для выделения фикоцианина, и извлечение фикоцианина из этой биомассы.

Способ особенно подходит для фикоцианинов, продуцируемых микроорганизмами, которые продуцируют гликоген на высоком уровне, в частности для выделения и очистки фикоцианинов из биомассы, которая содержит более 10% гликогена в пересчете на общее количество сухого вещества.

Микроорганизмы, продуцирующие фикоцианин, хорошо известны, в частности, водоросли (или микроводоросли) отряда Cyanidiales. Отряд Cyanidiales включает семейства Cyanidiaceae или Galdieriaceae, которые подразделяются на роды Cyanidioschyzon, Cyanidium или Galdieria, к которым среди других видов принадлежат Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita и Galdieria sulphuraria. Особо следует отметить штамм Galdieria sulphuraria (также известный как Cyanidium caldarium) UTEX2919.

Можно также отметить известные продуценты фикоцианина, такие как нитчатые цианобактерии из рода Arthrospira, которые промышленно культивируют под общим названием спирулина.

Микроорганизмы, которые продуцируют фикоцианин с высоким содержанием гликогена, особенно идентифицированы среди микроорганизмов, указанных выше, особенно видов родов Arthrospira, Spirulina, Synechococcus, Cyanidioschyzon, Cyanidium и Galdieria, в частности Galdieria sulphuraria.

Гликоген представляет собой полисахарид, широко присутствующий в природе в различных организмах (бактериях, дрожжах, клетках животных и т.д.). Если структура полимера глюкозы с αl-4-связью, разветвленного αl-6-связью, является распространенной, разница возникает из-за процентного содержания и распределения ответвлений. В частности, под «гликогеном» в контексте изобретения понимают полимер глюкозы, присутствующий в ранее указанных организмах, продуцирующих фикоцианин, отличительным признаком которого является размер большинства ответвлений менее 10 звеньев глюкозы, как показано в работе Martinez-Garcia et al.

Промышленные способы культивирования микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин, хорошо известны специалистам в данной области техники. Особо следует отметить патентные заявки WO 2017/093345, WO 2017/050917 и WO 2018/178334.

Извлечение фикоцианина из биомассы также известно специалисту. Особо следует отметить заявку WO 2018/178334. Обычно требуется стадия либо механического, либо ферментативного лизиса клеток для высвобождения фикоцианина, продуцируемого в клеточных компартментах микроорганизмов. В результате лизиса клеток обычно образуется раствор фикоцианина, который содержит органическую массу в суспензии (называемой неочищенной суспензией), которую можно разделить обычными методами разделения, в частности фильтрацией, особенно микрофильтрацией, или центрифугированием с последующей фильтрацией, более конкретно микрофильтрацией. Затем получают неочищенный раствор фикоцианина, который может быть дополнительно очищен для удаления низкомолекулярных органических остатков обычными способами ультрафильтрации для получения очищенного раствора, из которого фикоцианин может быть получен обычными способами осаждения и сушки. Особо следует отметить тангенциальную фильтрацию на керамических мембранах или органических мембранах, таких как полые волокна из полиэфирсульфона или полисульфона, в частности, предлагаемые компанией Repligen. Пороги этих фильтров могут быть выбраны для отделения молекул с молекулярной массой выше или ниже целевых фикоцианинов.

Затем полученные фикоцианины могут быть очищены, в частности, с помощью стадии диафильтрации для максимального удаления низкомолекулярных органических остатков.

Ферментативную обработку в соответствии с изобретением можно проводить как с неочищенной суспензией, так и с неочищенным раствором.

Способ в соответствии с изобретением особенно подходит для очистки растворов кислотоустойчивых фикоцианинов, в частности фикоцианинов, описанных в заявке WO 2017/050918.

В частности, способ в соответствии с изобретением используют для очистки кислотоустойчивых фикоцианинов, продуцируемых Galdieria sulphuraria, в частности, в промышленном способе получения этих фикоцианинов с помощью ферментерной культуры Galdieria sulphuraria.

Предпочтительными условиями для проведения ферментативной реакции являются рН ниже 7 и температура реакции ниже 60°С, предпочтительно ниже 50°С, еще более предпочтительно ниже 30°С.

Преимущественно ферментативный лизис гликогена проводят при рН меньше или равном 5, предпочтительно примерно 4,5.

Предпочтительно ферментативную реакцию проводят при комнатной температуре. Эта комнатная температура соответствует определению использования в температурной зоне с умеренным климатом или в комнате с температурой, соответствующей температурной зоне, то есть в диапазоне от 18 до 28°С, в более общем случае от 20°С до 25°С.

Эти условия температуры и рН особенно подходят для сохранения фикоцианина во время ферментативной реакции.

Ферменты, активные в условиях кислого рН и при комнатной температуре, известны специалисту в данной области техники. Однако условия расщепления гликогена с целью сохранения фикоцианина и облегчения его производства неизвестны.

Неожиданно было обнаружено, что ферменты, обладающие активностью αl-4-галактозидазы, также обладают активностью αl-4-глюкозидазы (или альфа-глюкозидазы) в условиях рН и температуры, совместимых с очисткой фикоцианина.

Это, в частности, касается пектиназ, расщепляющих пектин, и, в частности, пектиназ, экстрагированных из нитчатых грибов, таких как Aspergillus, в частности пектиназ, экстрагированных из Aspergillus aculeatus, таких как ферменты, продаваемые под названием Pectinex® компанией Novozymes.

Действие этих ферментов уменьшает размер гликозидных цепей, которые затем могут быть удалены ультрафильтрацией в условиях, позволяющих удерживать фикоцианины, позволяя проходить фрагментам гликогена.

Было обнаружено, что эти условия ферментативного лизиса высвобождают полиглюкозидные цепи и небольшое количество мономеров глюкозы и поэтому особенно подходят для предотвращения загрязнения другими микроорганизмами, в частности, организмами, патогенными для людей или животных, что важно, когда полученный фикоцианин используют в качестве красителя для пищевых продуктов.

Согласно конкретному воплощению ферментативного лизиса гликогена также можно достигнуть с активностью αl-6-глюкозидазы в дополнение к активности α1-4-глюкозидазы или полигалактуроназы.

Фермент, используемый в способе, может быть смесью ферментов, первого фермента, обладающего активностью α1-4-глюкозидазы или полигалактуроназы, и второго фермента, обладающего активностью α1-6-глюкозидазы.

α1-6-глюкозидазы, активные в указанных выше условиях рН и температуры, также известны специалисту в данной области техники. В частности, это пуллуланазы, которые, как известно, гидролизуют α1-6-гликозидные связи пуллулана, в частности, удаляют ответвления крахмала.

Обычно это ферменты, извлеченные из бактерий, особенно из рода Bacillus. В US 6074854, US 5817498 и WO 2009/075682 описаны такие пуллуланазы, экстрагированные из Bacillus deramificans или Bacillus acidopullulyticus. Промышленно выпускаемые пуллуланазы также известны под названиями «Promozyme D2» (Novozymes), «Novozym 26062» (Novozymes) и «Optimax L 1000» (DuPont-Genencor). Следует отметить, что смеси пуллуланазы/альфа-амилазы описаны в предшествующем уровне техники, но, в частности, для получения сиропа глюкозы из крахмала (US 2017/159090).

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения фермент обладает как активностью αl-4-глюкозидазы, так и активностью αl-6-глюкозидазы.

Это, в частности, относится к глюкоамилазам. Это также ферменты, экстрагированные из микроорганизмов, в частности из дрожжей или грибов, таких как S. diastaticus или A. niger. Многочисленные глюкоамилазы известны из уровня техники, описаны в литературе и, в частности, в патентных заявках, таких как WO 2019/036721. Обычно их используют в процессах ферментации либо для производства спиртов для потребления (пиво, крепкие спиртные напитки), либо для ферментации биомассы для производства биоэтанола. Их также используют в качестве добавок для выпечки или пищевых добавок. Известно, что глюкоамилазы выпускаются в промышленности, в частности, под названиями «Amylase AG XXL» (Novozymes) или «Panzym® AG XXL» (Eaton).

Преимущественно ферменты, используемые в способе в соответствии с изобретением, являются ферментами, разрешенными для использования в пищевой промышленности.

Оптимальное содержание ферментов, используемых на этой стадии лизиса гликогена, может определить специалист в данной области в соответствии с активностью ферментов, используемых в условиях температуры и рН, описанных выше.

Концентрации фермента обычно составляют от 0,0001% до 5%, предпочтительно от 0,0025% до 1%, более предпочтительно от 0,005% до 0,5%, еще более предпочтительно от 0,01% до 0,25%, процентное содержание выражено в виде объема раствора фермента по отношению к общему объему неочищенной суспензии или неочищенной суспензии.

Растворы ферментов имеют концентрацию ферментов обычно от 100 до 20000 единиц/мл, причем активность ферментов обычно приписывают этим ферментам в соответствии с указаниями производителя.

Использование α1-6-глюкозидаз снижает количество задействованных αl-4-глюкозидазы или полигалактуроназы. Общие концентрации ферментов (α-1-4-глюкуронидаза + α1-6-глюкозидазы) обычно составляют от 0,0001% до 5%, предпочтительно от 0,0025% до 1%, более предпочтительно от 0,005% до 0,5%, еще более предпочтительно от 0,01% до 0,25%, при этом процентное содержание выражено в виде отношения объема раствора фермента к общему объему неочищенной суспензии или неочищенной суспензии.

С αl-4-глюкозидазой или полигалактуроназой по отдельности или в смеси с αl-6-глюкозидазой, или с ферментом с активностью α1-4-глюкозидазы и α1-6-глюкозидаз, реакцию преимущественно проводят в течение менее 48 часов, предпочтительно менее 24 часов, более предпочтительно от 5 до 12 часов.

Для способа в соответствии с изобретением и, в частности, для стадии выделения путем тангенциальной фильтрации для выделения фикоцианина нет необходимости в достижении полного расщепления гликогена до мономера глюкозы. Частичного расщепления полисахарида и его восстановления до олигомеров с размерами ниже порога отсечки фильтрации достаточно для удаления гликогена из суспензии или раствора фикоцианина.

Квалифицированный специалист знает, как определить подходящее время для наилучшего снижения количества гликогена в зависимости от исходного содержания гликогена, количества используемых ферментов и требуемой чистоты произведенного фикоцианина.

Осуществление снижения количества гликогена путем ферментативного расщепления может быть связано или заменено использованием микроорганизмов, способных разрушать этот полисахарид. Специалисту в данной области техники известно, как использовать способности этих микроорганизмов продуцировать и секретировать в неочищенном экстракте ферменты, способные расщеплять гликоген, в частности ферменты, указанные ранее. Специалисту известно, как выбрать и использовать способности этих микроорганизмов метаболизировать гликоген или продукты, возникающие в результате разложения полисахарида. Преимущественно специалисту известно, как использовать способности этих микроорганизмов для ограничения роста нежелательных или патогенных микроорганизмов, в частности, путем синтеза веществ, обладающих противомикробной активностью.

Предпочтительными условиями для проведения расщепления гликогена ex vivo или in vivo являются рН ниже 7 и температура реакции ниже 50°С, предпочтительно ниже 40°С, еще более предпочтительно ниже 37°С.

Преимущественно разложение гликогена ex vivo или in vivo проводят при рН, меньшем или равном 5, предпочтительно примерно 4,5 или 4.

Из-за их отличительной особенности роста и разложения полисахарида молочнокислые бактерии кажутся особенно подходящими. Среди них можно упомянуть бактерии, принадлежащие к родам Lactobacillus, Pediococcus, Tetragenococcus, Carnobacterium, Vagococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus, Atopobium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Aerococcus, Alloiococcus, Melissococcus или Bifidobacterium.

Изобретение также относится к экстракту фикоцианина с отношением гликоген/фикоцианин (по сухой массе) менее 6, преимущественно менее 4, предпочтительно менее 3, более предпочтительно менее 2,5, еще более предпочтительно менее 1.

Согласно первому воплощению, этот экстракт фикоцианина представляет собой неочищенную суспензию фикоцианина, полученную после ферментативного лизиса.

Эта обработанная неочищенная суспензия, также называемая «ферментативно обработанной неочищенной суспензией», включает, в частности, фикоцианин, высвобожденный после лизиса клеток, олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена и остаточный гликоген с нерастворимыми веществами, получаемыми в результате лизиса клеток в суспензии.

Согласно второму воплощению изобретения, экстракт фикоцианина представляет собой неочищенный раствор фикоцианина, полученный после разделения неочищенной суспензии и ферментативного лизиса гликогена, причем этот лизис проводят до или после разделения неочищенной суспензии или до и после разделения (разделение ферментивно обработанной неочищенной суспензии и/или проведение ферментативной реакции с неочищенным раствором).

Этот неочищенный раствор содержит, в частности, фикоцианин, высвобожденный после лизиса клеток, олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена и остаточный гликоген. Этот обработанный неочищенный раствор, также называемый «ферментативно обработанным неочищенным раствором фикоцианина», обычно содержит от 0,1 до 10 г/л фикоцианина, более предпочтительно от 1 до 5 г/л.

Отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе преимущественно составляет менее 3, предпочтительно менее 2,5.

Ферментативно обработанный неочищенный раствор в соответствии с изобретением можно опционально концентрировать путем удаления части воды обычными способами в данной области техники, проводимыми в условиях, которые по существу не нарушают целостность фикоцианина. В этом случае содержание фикоцианина в концентрированном ферментативно обработанном неочищенном растворе предпочтительно составляет от 10 до 50 г/л.

Согласно другому воплощению, экстракт фикоцианина представляет собой фикоцианин, выделенный после экстракции из ферментативно обработанного неочищенного раствора в соответствии со способами, описанными выше.

Для выделенного фикоцианина отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе преимущественно составляет менее 2, предпочтительно менее 1.

Согласно другому воплощению, экстракт фикоцианина представляет собой очищенный фикоцианин, полученный после очистки выделенного экстракта в соответствии со способами, описанными выше, в частности, путем диафильтрации.

Для очищенного фикоцианина отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе предпочтительно составляет менее 1, предпочтительно менее 0,1.

И выделенный фикоцианин, и очищенный фикоцианин могут все еще содержать следы олигомеров глюкозы, продуктов ферментативного лизиса гликогена.

Полученный фикоцианин имеет красящую способность Е10 от 90 до 400, предпочтительно по меньшей мере 120, более предпочтительно по меньшей мере 150.

Для ферментативно обработанного неочищенного раствора красящая способность Е10 предпочтительно составляет от 90 до 110.

Для выделенного фикоцианина окрашивающая способность Е10 предпочтительно составляет от 150 до 210.

Для очищенного фикоцианина красящая способность преимущественно составляет от 210 до 400.

Изобретение также относится к способу получения фикоцианина микробного происхождения, который включает стадии:

(a) культивирования микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин, как описано выше, в условиях культивирования для получения ферментационного сусла, содержащего более 30 г/л сухого вещества и не менее 4% фикоцианина в пересчете на сухое вещество;

(b) лизиса клеток для высвобождения продуцируемого фикоцианина и гликогена с получением неочищенной суспензии, как определено выше;

(c) разделения неочищенной суспензии для извлечения неочищенного раствора, содержащего фикоцианин и гликоген, а затем, возможно,

(d) выделения фикоцианина из неочищенного раствора, затем, возможно,

(e) очистки выделенного фикоцианина,

отличающийся тем, что проводят стадию ферментативного лизиса гликогена с ферментами и в условиях, определенных выше, или при разложении с помощью микроорганизмов, причем указанный ферментативный лизис проводят с неочищенной суспензией и/или с неочищенным раствором.

Преимущественно полученный фикоцианин представляет собой фикоцианин, который содержит менее 50% гликогена.

Способы культивирования хорошо известны специалистам, в частности, они описаны в заявках на патент WO 2017/050917, WO 2017/093345 и WO 2018/178334.

Они позволяют получать сусло после ферментации с содержанием сухого вещества более 30 г/л, которое может составлять более 100 г/л.

Содержание фикоцианина не менее 4% может достигать более 10% в зависимости от условий ферментации и культивируемых штаммов.

Специалист в данной области техники знает, как определить условия культивирования в соответствии с промышленной целью производства фикоцианина.

Стадия разделения (с) также известна и описана в предшествующем уровне техники, в частности, ее осуществляют обычными способами фильтрации, такими как микрофильтрация или центрифугирование с последующей фильтрацией, в частности, микрофильтрацией.

Изобретение также относится к применению полученных фикоцианинов в качестве красителей, в частности, в качестве пищевых красителей. Оно также относится к пищевым продуктам, твердым или жидким, в частности к напиткам, которые содержат фикоцианин с низким содержанием гликогена в соответствии с изобретением.

Фикоцианин, используемый в качестве красителя, может быть в форме ферментативно обработанного неочищенного раствора, выделенного фикоцианина или очищенного фикоцианина, как определено выше.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Отслеживание концентрации С-PC до и после ферментативного лизиса Отслеживание концентрации фикоцианина в неочищенном экстракте проводили при рН, составляющем 4, и рН, составляющем 7, с различным количеством фермента «Pectinex». Неочищенный экстракт фикоцианина из Galdieria sulphuraria получали в соответствии со способом, описанным в заявке WO 2018/178334. Для этого отслеживания фермент и неочищенный экстракт фикоцианина фильтровали на фильтре 0,22 мкм. Расщепление проводили при комнатной температуре. Для каждой кинетической точки измеряли оптическую плотность, пригодную для определения концентрации фикоцианина, параллельно с измерением глюкозы после денатурации фермента (95°С, 5 минут) с помощью биохимического анализатора YSI 2700. Результаты показаны на фиг. 1-4.

Эти результаты показывают, что количество расщепленного гликогена варьируется в зависимости от рН и концентрации фермента. Избыток фермента может привести к разложению фикоцианина.

Однако можно видеть, что спустя менее чем 24 ч расщепления при рН=4 и 0,05% «Pectinex» достигается значительный лизис гликогена, при существенном ограничении разложения фикоцианина.

Пример. 2. Отслеживание скорости расщепления гликогена в неочищенном растворе фикоцианина

Отслеживание скорости расщепления гликогена в неочищенном растворе осуществляли при рН, составляющем 4, и рН, составляющем 7, с помощью различных ферментов: альфа-амилазы (Ban 480L от Novozymes), полигалактуроназы (Pectinex Ultra SP-L от Novozymes) и глюкоамилазы (Amylase AG XXL от Novozymes).

Неочищенный раствор фикоцианина из Galdieria sulphuraria получали в соответствии со способом, описанным в заявке WO 2018/178334. Для этого отслеживания фермент и неочищенный раствор фикоцианина фильтровали на фильтре 0,22 мкм. Расщепление проводили при комнатной температуре. Для каждой кинетической точки измерение глюкозы выполняли после денатурации фермента (95°С, 5 минут) с помощью биохимического анализатора YSI2700. Процент расщепления гликогена представляет собой отношение концентрации глюкозы к концентрации глюкозы после полного гидролиза полисахарида.

Результаты показаны на фиг. 6 (рН=4) и 7 (рН=7).

Пример 3. Содержание гликогена в очищенном продукте с ферментативным лизисом или без него

Неочищенный раствор фикоцианина, необработанный или подвергнутый расщеплению в течение 12 часов с 0,25 об.% α1-6-глюкозидаз, затем в течение 2 часов с 0,1 об.% α1-4-полигалактуроназы фильтровали на половолоконной мембране с пористостью 70 кДа с заключительной стадией диафильтрации.

Различные измерения, проводимые в конце каждой стадии фильтрации и/или фильтрации, показывают, что концентрация гликогена в ретентате значительно увеличивается, пока не достигает заметной концентрации по сравнению с PC. Следовательно, необходимо удалить весь или часть этого гликогена, чтобы избежать снижения красящей способности конечного продукта, а красящая способность Е10 составляет от 90 до 400.

Цветность Е10 (10% Е618 нм) указывает на интенсивность окрашивания, которую измеряют при 618 нм после растворения порошка в водном растворе.

Протокол:

Отмеряют 0,25 грамма образца и растворяют его в 100 мл буферного раствора лимонной кислоты, доведенного до рН, составляющего 6,0. Затем раствор разбавляют в 10 раз буфером лимонной кислоты и измеряют оптическую плотность при 618 нм, используя кювету толщиной 1 см. Цветность Е10 (10% Е618 нм) = поглощение (при 618 нм) × 100 / 0,25 грамма.

Пример 4. Перепад давления на мембране с ферментативным лизисом или без него Неочищенный экстракт фикоцианина из Galdieria sulphuraria, полученный в соответствии со способом, описанным в заявке на патент WO 2018/178334, осветляли на половолоконной мембране PES 0,05 мкм. Приведенные ниже результаты представляют отслеживание параметров фильтрации с расщеплением с «Pectinex» (0,05%, 5,5 ч, при комнатной температуре и рН=4) или без него того же объема 250 мл неочищенного экстракта.

Результаты показаны на фиг. 5. Они демонстрируют влияние расщепления гликогена на микрофильтрацию неочищенного экстракта. Можно видеть, что для фильтрации данного объема время, необходимое для подвергнутого расщеплению образца, примерно в два раза меньше, чем для образца, не подвергнутого расщеплению, из-за увеличения потока через мембрану.

Список литературы

- Cruz deet al., Int J Food Nutr Sci (2016) 3(3): 1-0.

- Martinez-Garcia et al., Int J Biol Macromol. (2016) 89:12-8.

- Martinez-Garcia et al., Carbohydrate Polymers (2017) 169: 75-82.

- Moon et al, Korean Journal of Chemical Engineering (2014) 31, 490-495.

- Shimonaga et al., Marine Biotechnology (2007) 9, 192-202.

- Shimonaga et al., Plant and Cell Physiology (2008) 49, 103-116.

- CN 106749633, CN102433015 и CN1117973.

- US 6074854, US 5817498, US 2017/159090.

- WO 2009/075682, WO 2017/050917, WO 2017/050918, WO 2017/093345, WO 2018/178334, WO 2019/036721.

Изобретение относится к микробиологической и пищевой промышленности. Предложен способ очистки фикоцианинов, получаемых путем ферментации микроводорослей, в частности продуцируемых Galdieria sulphuraria. Способ включает (i) стадию ферментативного разложения гликогена с помощью фермента, обладающего активностью α1-4-глюкозидазы или активностью полигалактуроназы, или ферментативной смеси, содержащей фермент, обладающий активностью α1-4-глюкозидазы или активностью полигалактуроназы, и фермент, обладающий активностью α1-6-глюкозидазы, или фермент, обладающий активностью α1-4-глюкозидазы или полигалактуроназы и активностью α1-6-глюкозидазы, при рН ниже 6 и температуре реакции ниже 40°С и (ii) стадию отделения фикоцианинов от продуктов разложения гликогена. Предложен способ получения фикоцианина микробного происхождения; предложен выделенный фикоцианин, полученный заявленным способом, включающий следы ферментов с активностью альфа1-4-глюкозидазы и/или 1-6-глюкозидазы, и/или олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена. Предложен экстракт фикоцианина, включающий фикоцианин и гликоген, где отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 6, и он включает следы ферментов с активностью альфа1-4-глюкозидазы и/или 1-6-глюкозидазы и/или олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена; применение выделенного фикоцианина или экстракта фикоцианина в качестве пищевого красителя, а также пищевой продукт, включающий выделенный фикоцианин или экстракт фикоцианина. Изобретение позволяет улучшить способы очистки фикоцианинов, экстрагированных из биомассы с качественной точки зрения путем снижения остаточного содержания сахаров в конечном продукте, в частности остаточного содержания гликогена, при сохранении свойств фикоцианина. 6 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Способ очистки фикоцианинов из раствора, содержащего фикоцианин(ы) и гликоген, причем указанные фикоцианины продуцированы микроорганизмами, принадлежащими к отряду Cyanidiales, отличающийся тем, что он включает (i) стадию ферментативного разложения гликогена с помощью фермента, обладающего активностью α1-4-глюкозидазы или активностью полигалактуроназы, или ферментативной смеси, содержащей фермент, обладающий активностью α1-4-глюкозидазы или активностью полигалактуроназы, и фермент, обладающий активностью α1-6-глюкозидазы, или фермент, обладающий активностью α1-4-глюкозидазы или полигалактуроназы и активностью α1-6-глюкозидазы, при рН ниже 6 и температуре реакции ниже 40°С и (ii) стадию отделения фикоцианинов от продуктов разложения гликогена.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что температура составляет ниже 30°С и/или рН на стадии (i) меньше или равен 5.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что фермент, обладающий активностью α1-4-глюкозидазы или активностью полигалактуроназы, представляет собой пектиназу.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что фермент, обладающий активностью α1-6-глюкозидазы, представляет собой пуллуланазу.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что фермент, обладающий и активностью α1-4-глюкозидазы и активностью α1-6-глюкозидазы, представляет собой глюкоамилазу.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что раствор, содержащий фикоцианин(ы) и гликоген, представляет собой неочищенную суспензию, полученную после лизиса клеток биомассы микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин, или неочищенный раствор, полученный после фильтрации неочищенной суспензии как таковой, полученной после лизиса клеток биомассы микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин.

7. Способ получения фикоцианина микробного происхождения, который включает стадии:

(a) культивирования микроорганизмов, продуцирующих фикоцианин, как описано выше, в условиях культивирования для получения ферментационного сусла, содержащего более 30 г/л сухого вещества и по меньшей мере 4% фикоцианина в пересчете на сухое вещество;

(b) лизиса клеток для высвобождения продуцируемого фикоцианина и гликогена с получением неочищенной суспензии, как определено выше;

(c) разделения неочищенной суспензии для извлечения неочищенного раствора, содержащего фикоцианин и гликоген, а затем, возможно,

(d) выделения фикоцианина из неочищенного раствора, затем, возможно,

(e) очистки выделенного фикоцианина,

отличающийся тем, что указанный способ дополнительно содержит стадию очистки, как определено в любом из пп. 1-6, причем указанную стадию очистки проводят с неочищенной суспензией, полученной на стадии (b), и/или с неочищенным раствором, полученным на стадии (с).

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что раствор, содержащий фикоцианин(ы) и гликоген, представляет собой неочищенную суспензию, полученную на стадии (b).

9. Способ п. 7 или 8, отличающийся тем, что ферментативный лизис проводят с неочищенным раствором, полученным на стадии (с).

10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что фикоцианин представляет собой фикоцианин микробного происхождения, продуцируемый микроорганизмом, выбранным из видов родов Cyanidioschyzon, Cyanidium и Galdieria, в частности Galdieria sulphuraria.

11. Выделенный фикоцианин, полученный способом по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что он включает следы ферментов с активностью альфа1-4-глюкозидазы и/или 1-6-глюкозидазы, и/или олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена.

12. Экстракт фикоцианина, включающий фикоцианин и гликоген, отличающийся тем, что отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 6, и отличающийся тем, что он включает следы ферментов с активностью альфа1-4-глюкозидазы и/или 1-6-глюкозидазы и/или олигомеры глюкозы, продукты ферментативного лизиса гликогена.

13. Экстракт по п. 12, отличающийся тем, что отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 4.

14. Экстракт по п. 12, отличающийся тем, что отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 3.

15. Экстракт по п. 12, отличающийся тем, что отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 2,5.

16. Экстракт по п. 12, отличающийся тем, что отношение гликогена к фикоцианину по сухой массе составляет менее 1.

17. Применение выделенного фикоцианина по п. 11 или экстракта по любому из пп. 12-16 в качестве пищевого красителя.

18. Пищевой продукт, отличающийся тем, что он включает выделенный фикоцианин по п. 11 или экстракт по любому из пп. 12-16.