Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора Российский патент 2020 года по МПК C12N15/00 

Область техники

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии.

Уровень техники

Генная терапия - это современный медицинский подход, направленный на лечение наследственных и приобретенных заболеваний путем введения нового генетического материала в клетки пациента с целью компенсации или подавления функции мутантного гена и/или исправления генетического дефекта. Конечным продуктом экспрессии гена может являться молекула РНК или белка. Однако осуществление большей части физиологических процессов в организме связано с функциональной активностью белковых молекул, тогда как молекулы РНК являются либо промежуточным продуктом в синтезе белков, либо осуществляют регуляторные функции. Таким образом целью генной терапии является, в большинстве случаев, введение в организм генов, обеспечивающих транскрипцию и последующую трансляцию белковых молекул, кодируемых этими генами. В рамках описания настоящего изобретения под экспрессией гена подразумевается продукция белковой молекулы, аминокислотная последовательность которой кодируется этим геном.

Гены BMP-2, BMP-7, NELL-1, LMP-1, входящие в группу генов, играют ключевую роль в ряде процессов в организме человека и животных. Показана связь низких/недостаточных концентраций этих белков с различными неблагоприятными состояниями человека, которая, в ряде случаев, подтверждена нарушениями в нормальной экспрессии генов, кодирующих эти белки. Таким образом, генотерапевтическое повышение экспрессии гена, выбранного из группы генов BMP-2, BMP-7, NELL-1, LMP-1, обладает потенциалом для коррекции различных состояний человека и животных.

Гены BMP-7 и ВМР-7 кодируют костные морфогенетические белки 2 и 7 соответственно. Белки BMPs - цитокины, относящиеся к семейству TGF, которые обнаруживаются преимущественно в костной ткани. Название BMP описывает только одну специфическую функцию, но на самом деле данные белки оказывают на организм ряд других эффектов, а именно: формирование хряща, развитие внутренних органов - морфогенез, пролиферация, апоптоз и дифференцировка клеток. Кроме этого, BMP блокируют миогенез и адипогенез. Некоторые BMPs, включая BMP-7, BMP-4 и ВМР-7, играют роль в специализации гемопоэтической ткани из мезодермы зародыша. Они регулируют пролиферацию и дифференцировку человеческих гемопоэтических клеток как у взрослых, так и у новорожденных. К настоящему времени идентифицировано 20 видов BMP. Наиболее полно изученными применительно к регенерации кости и хряща являются ВМР-2 и ВМР-7. Известно, что они способны индуцировать рост кости, а именно, воздействовать на пролиферацию и дифференцировку четырех типов клеток - остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов. In vitro BMP-7, -3, -4 и -7 способствуют росту остеобластов и производных костных клеток. Место локализации BMP - внеклеточный соединительнотканный матрикс, содержащий остеопрогениторные и мезенхимные клетки. Показано, что BMP распределены по коллагеновым волокнам костной ткани, в клетках остеогенного слоя надкостницы; в умеренных количествах они имеются в клетках пластинчатой кости и в избытке присутствует в тканях зуба. BMP синтезируются остеобластами, хондроцитами и их предшественниками. Отмечена повышенная активность BMP в ростовых зонах большеберцовой кости (эпифиз, метафиз, хрящ). Кроме скелета, BMP экспрессируются во внескелетных тканях организма. Высокое содержание BMP отмечено в простате и плаценте (Paralkar V et al. // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273, N 22. - P. 13760-13767).

Многие исследователи отмечают крайне нестабильные или низкие показатели остеоиндуктивности аллогенных костных имплантатов, произведенных в разных тканевых банках. Биологическая оптимизация или активизация остеоиндуктивности аллогенных или ксеногенных костных имплантатов может быть достигнута процессом деминерализации с добавлением остеоиндуктивных белков либо других ростовых факторов. ВМР-2 совместно с деминерализованным костным матриксом в экспериментах на крысах демонстрировал повышенное образование остеоида по сравнению с таковым при применении аутологичной кости (Schwartz Z et al. //J. Periodontol. - 1998. - Vol. 69, N 12. - P. 1337-1345). Добавляя ВМР-7 к аллогенному костному имплантату, в экспериментах на собаках получали более высокий процент костных сращений, чем при использовании аутологичной кости (Lewandrowski K. // Spine J. - 2007. - Vol .7J5. - P. 609-614). Было проведено сравнение по степени влияния на остеогенную дифференцировку мезенхимных стволовых клеток и активность щелочной фосфатазы таких материалов как: деминерализованный костный матрикс (ДКМ), деминерализованный костный матрикс с добавлением ВМР-7 (ДКМ+ВМР-7), костный коллаген+ВМР-7, костный коллаген, замороженный костный имплантат, замороженный костный имплантат с ВМР-7. Выявлено, что ДКМ+ВМР-7 в большей степени стимулировал остеогенную дифференцировку мезенхимных стволовых клеток и активизацию щелочной фосфатазы (Tsiridis E. et al. // J. Orthop.Res. - 2007. - Vol. 25, N 11. -P. 1425-1437).

Эффективность применения BMP-7 для достижения костного сращения при вертебральной патологии оказалась сопоставимой или незначительно превосходила эффективность аутологичного костного материала (Johnsson R et al. // Spin. - 2002. - Vol. 27. - P. 2654-2661). В исследовании, включавшем 9 пациентов в возрасте от 21 года до 24 лет с факторами риска костных несращений (недостаточность надпочечников, гипертония, длительное курение, ожирение, гипертиреоз, ревматоидный артрит), выявлено, что ВМР-7 безопасен и эффективен для достижения спондилодеза (Govender S et al. // J. Bone Jt Surg. - 2002. - Vol. 84A. - P. 2123-2134). Vaccaro и соавт. обследовали 36 пациентов, подвергшихся хирургическому лечению по поводу дегенеративного поясничного спондилолиза со стенозом позвоночного канала. У одной части больных применялась паста «Ossigraft» с rhBMP-7 совместно с аутотрансплантатом из гребня подвздошной кости (основная группа), у другой части пациентов - только аутотрансплантат из гребня подвздошной кости (контрольная группа). Через 1 год наблюдения костное сращение констатировано в основной группе в 86%, в контрольной - в 73% случаев, через 4 года - соответственно в 69 и 50% (Vaccaro A.R. et al. // Eur. Spine J. - 2005. - Vol. 14. - P. 623-629). Govender и соавт.сообщают о клиническом применении rhBMP-7 на коллагеновой носителе в дозе 0,75 мг/мл (суммарная доза 6 мг) и 1,50 мг/мл (суммарная доза 12 мг). В исследование были включены 450 пациентов из 11 стран с открытыми переломами большеберцовой кости. Всем пострадавшим производился интрамедуллярный остеосинтез титановым стержнем. Сращение перелома без повторных вмешательств было достигнуто у 74% пациентов. Данные этого исследования способствовали одобрению Европейским агентством по оценке лекарственных продуктов (ЕМЕА) в 2002 г.и Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в 2004 г.применения rhBMP-7/ACS при лечении открытых переломов большеберцовой кости методом интрамедуллярного остеосинтеза (Govender S et al. // J. Bone Jt Surg. - 2002. - Vol. 84A. - P. 2123-2134).

При использовании rhBMP-7 на коллагеновой губке отмечена идентичная или большая частота достижения костного сращения тел позвонков по сравнению с таковой при применении аутологичного трансплантата из гребня подвздошной кости. Более того при использовании rhBMP-7 сообщается о получении костного сращения у 100% пациентов (SchwenderJ.D. et al. // J. Spin. Disord. Tech. - 2005. - Vol. 18. - P. S1-S6). При этом отсутствовали осложнения, характерные для хирургического забора аутологичной кости.

Применение rhBMP-7 в виде коллагеновой пасты при лечении больных с открытыми переломами большеберцовой кости способствовало достижению сращения переломов в большем проценте случаев, сокращало частоту повторных хирургических вмешательств (Fricdlaender G. et al. // J. Bone Jt Surg. - 2001. - Vol. 83A. - P. S151-S158). При применении в сочетании с аутологичной костью или аллогенным деминерализованным костным матриксом было показано сокращение сроков заживления переломов по сравнению с таковыми при использовании только аутологичной кости (Bilic R et al. // Int. Orthop.-2006. - Vol.30. - P. 128-134).

Успехи в использовании рекомбинантных белков BMPs послужили поводом для ряда работ с использованием генотерапевтических подходов. Так, в различных исследованиях для регенерации костных дефектов успешно были использованы вирусные, плазмидные и клеточные векторы для экспрессии генов BMPs (Schwabe P et al. // ScientificWorldJournal. 2012; 2012: 560142; Wegman F et al. // Eur Cell Mater. 2011 Mar 15; 21: 230-42; discussion 242; Wang CJ et al. // Arthroscopy. 2010 Jul; 26 (7): 968-76; Heggeness MH. // Spine J. 2015 Nov 1; 15 (11): 2410-1; Wu G et al. // J Craniofac Surg. 2015 Mar; 26 (2): 378-81; Loozen LD et al. // Tissue Eng Part A. 2015 May; 21 (9-10): 1672-9). В одной работ было показано, что генотерапевтический подход с использованием комбинации генов ВМР-2 и ВМР-7 оказывал более выраженный терапевтический эффект, чем использование каждого из этих генов по отдельности (Koh JT et al. // J Dent Res. 2008 Sep; 87 (9): 845-9).

Помимо применения белков BMPs для регенерации повреждений костной и хрящевой ткани было показано, что повышение экспрессии гена ВМР-7 способствует заживлению ран и предотвращению образования фиброза тканей (Tandon A et al. // PLoS One. 2013 Jun 14; 8 (6): e66434; 19; Zhong et al. // Int J Med Sci. 2013; 10 (4): 441-50.). Также аденовирусный вектор, экспрессирующий ген ВМР-7, оказывает модулирующее действие на эпителиальные клетки в процессе регенерации повреждений глаз (Saika S et al. // Am J Physiol Cell Physiol. 2006 Jan; 290 (1): C282-9). Более того, было показано, что аденовирусный вектор, экспрессирующий ВМР-7, способен оказывать благоприятное действие на течение экспериментального язвенного колита у крыс (Hao Z et al. // J Gene Med. 2012 Jul; 14 (7): 482-90).

Ген LMP-1 кодирует белок LMP-1 (Lim mineralization protein-1), который повышает способность клеток вовлекаться в сигнальный каскад ВМР и индуцирует секрецию белков ВМР-2 и ВМР-7, а также повышает продукцию протеогликанов. В работе на кроликах было показано, что аденовирусный вектор, экспрессирующий ген LMP-1, приводит к значительному повышению экспрессии аггрекана, коллагена, ВМР-2 и ВМР-7 и может рассматриваться как одно из направлений для разработки средств терапии дегенеративных изменений дисков и других повреждений костной и хрящевой ткани (Yoon ST et al. // Spine (Phila Pa 1976). 2004; 29 (23): 2603-2611).

В отношении онкологических заболеваний, было продемонстрировано, что повышенная экспрессия гена LMP-1, в том числе достигнутая за счет генотерапевтического подхода с использованием аденовирусного вектора, может подавлять пролиферацию клеток остеосаркомы и способствовать их апоптозу (Liu H et al. // Int J Mol Sci. 2014 Apr 23; 15 (4): 7037-48).

Ген NELL-1 кодирует белок NELL-1. NELL1 является сигнальным белком, который запускает пути роста и созревания тканей, включая скелет, сердечную мышцу и кровеносные сосуды. Хотя он наиболее активен во время развития плода, было показано, что когда очищенный рекомбинантный белок NELL-1 вводится непосредственно в сильно поврежденные ткани взрослого организма, NELL-1 опосредует и стимулирует врожденные регенеративные пути (контролируемое воспаление, стимулирование роста и дифференцировки клеток, образование кровеносных сосудов и т.д.) для создания новой ткани правильной архитектуры и функции. Было показано, что NELL-1 играет важную роль в производстве внеклеточного матрикса плода (ECM), особенно тенаксинов, коллагенов и протеогликанов. ECM обеспечивает как структурную, так и сигнальную среду, необходимую для ключевых событий регенерации тканей, таких как выживаемость клеток, пролиферация и дифференциация. Рекомбинантный белок NELL-1 также обладает высоким терапевтическим потенциалом для лечения остеопороза и регенерации повреждения костей (Kwak JH et al. // Biomaterials. 2015 Jul; 57: 73-83; Tanjaya J et al. // Biores Open Access. 2016 Jun 1; 5 (1): 159-70).

Таким образом предшествующий уровень техники свидетельствует о том, гены BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 обладают потенциалом для коррекции ряда отклонений, включающих в себя, но не ограничивающихся, повреждениями костной и хрящевой ткани (спондилодез, переломы), аутоиммунными заболеваниями, раком, наследственными и приобретенными патологическими состояниями, такими как повреждения соединительной ткани, и другими процессами. Этим обусловлено объединение генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 в рамках данного патента в группу генов. Генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию белков, кодируемых генами из группы BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1, могут быть использованы для разработки лекарственных препаратов для предотвращения и терапии различных заболеваний и патологических состояний.

Более того, приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия белков, кодируемых генами BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1, входящими в группу генов, связана не только с патологическими состояниями, но и с предрасположенность к их развитию. Также приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия данных белков может не проявляться в явном виде в форме патологии, которая может быть однозначно описана в рамках существующих стандартов клинической практики (например, с применением кода МКБ), однако при этом вызывать состояния, которые неблагоприятны для человека и животных и связанны с ухудшением качества жизни.

Анализ подходов для повышения экспрессии целевых генов подразумевает возможность использования различных генотерапевтических векторов.

Генотерапевтические векторы разделяют на вирусные, клеточные и ДНК-векторы (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA/CAT/80183/2014). В последнее время в генной терапии все большее внимание уделяется разработке невирусных систем доставки генетического материала, среди которых лидируют плазмидные векторы. Плазмидные векторы лишены недостатков, присущих клеточным и вирусным векторам. В клетке-мишени они существуют в эписомальной форме, не интегрируют в геном, производство их достаточно дешево, отсутствие иммунного ответа и побочных реакций на введение плазмидного вектора делают их удобным инструментом генной терапии и генетической профилактики (ДНК-вакцины) (Li L, Petrovsky N. // Expert Rev Vaccines. 2016; 15 (3): 313-29).

Тем не менее, ограничениями для использования плазмидных векторов для генной терапии являются: 1) наличие генов устойчивости к антибиотикам для наработки в бактериальных штаммах, 2) наличие различных регуляторных элементов, представленных последовательностями вирусных геномов 3) размер терапевтического плазмидного вектора, определяющий эффективность проникновения вектора в клетку-мишень.

Известно, что Европейское агентство по лекарственным средствам считает необходимым избегать введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies). Данная рекомендация связана, в первую очередь, с потенциальной опасностью проникновения ДНК-вектора или горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности в клетки бактерий, представленных в организме в составе нормальной или оппортунистической микрофлоры. Помимо этого, наличие генов антибиотикорезистентности значительно увеличивает размер ДНК-вектора, что приводит к снижению эффективности его проникновения в эукариотические клетки.

Необходимо отметить, что гены антибиотикорезистентности также вносят принципиальный вклад в способ получения ДНК-векторов. В случае наличия генов антибиотикорезистентности штаммы для наработки ДНК-векторов обычно культивируются в среде, содержащей селективный антибиотик, что создает риск наличия следовых количеств антибиотика в недостаточно очищенных препаратах ДНК-векторов. Таким образом, получение ДНК-векторов для генной терапии, в которых отсутствуют гены антибиотикорезистентности, связано с получением штаммов, обладающих такой отличительной особенностью как способность к стабильной амплификации целевых ДНК-векторов в среде без содержания антибиотиков.

Кроме того, Европейское Медицинское Агентство рекомендует избегать наличия в составе терапевтических плазмидных векторов регуляторных элементов для повышения экспрессии целевых генов (промоторов, энхансеров, посттрансляционных регуляторных элементов), являющихся нуклеотидными последовательностями геномов различных вирусов (Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products,http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf). Данные последовательности, хотя и могут увеличивать уровень экспрессии целевого трансгена, однако создают риск рекомбинации с генетическим материалом вирусов дикого типа и интеграции в геном эукариотической клетки. Более того, целесообразность гиперэкспрессии того или иного гена в целях терапии остается нерешенным вопросом.

Также, существенным моментом является размер терапевтического вектора. Известно, что современные плазмидные векторы зачастую перегружены нефункциональными участками, серьезно увеличивающими размер вектора (Mairhofer J, Grabherr R. // Mol Biotechnol. 2008.39 (2): 97-104). Например, ген устойчивости к ампициллину в векторах серии pBR322, как правило, состоит из не менее чем 1000 п.н., что составляет более 20% от размера самого вектора. При этом наблюдается обратная зависимость между размером вектора и его способностью проникать в эукариотические клетки - ДНК-векторы с небольшим размером эффективней проникаю в клетки человека и животных. Так, например, в серии экспериментов по трансфекции клеток HELA ДНК-векторами с размером от 383 до 4548 п.н. было показано, что разница в эффективности проникновения может достигать двух порядков (отличаться в 100 раз) (Hornstein BD et al. // PLoS ONE. 2016; 11 (12): e0167537.).

Таким образом при выборе ДНК-вектора в целях безопасности и наибольшей эффективности следует отдавать предпочтение тем конструкциям, в которых не содержатся гены устойчивости к антибиотикам, последовательности вирусного происхождения и размер которых позволяет эффективно проникать в эукариотические клетки. Штамм для получения такого ДНК-вектора в количествах, достаточных для целей генной терапии, должен обеспечивать возможность стабильной амплификации ДНК-вектора с использованием питательных сред, не содержащих антибиотики.

Примером использования рекомбинантных ДНК-векторов для генной терапии является способ получения рекомбинантного вектора для генетической иммунизации по патенту US 9550998 В2. Плазмидный вектор представляет собой суперскученный плазмидный ДНК-вектор и предназначен для экспрессии клонированных генов в клетках животных и человека. Вектор состоит из ориджина репликации, регуляторных элементов, включающих промотор и энхансер цитомегаловируса человека, регуляторные элементы из Т-лимфотропного вируса человека.

Накопление вектора проводят в специальном штамме E.coli без использования антибиотиков за счет антисенс-комплементации гена sacB, введенного в штамм посредством бактериофага. Недостатком данного изобретения является наличие в составе ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.

Прототипами настоящего изобретения в части использования генотерапевтических подходов для повышения уровня экспрессии генов из группы BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 являются следующие заявки.

Патент US 5942496 A, в котором описывается метод регенерации костной ткани и лечения связанных с костной тканью заболеваний путем введения в клетки или в организм человека или животных генов, выбранных из группы генов, включающих в себя, в том числе, гены BMP-7 и BMP-7. Недостатком данного изобретения являются неопределенные требования к свойствам векторов.

Патент US 6300127 B1, в котором описан способ использования векторов, экспрессирующих ген LMP-1, для регенерации костной ткани. Недостатком данного изобретения является отсутствие требований к безопасности используемых векторов.

Патент US 7807787 B2, в котором описывается использование рекомбинантного белка NELL-1 для регенерации костной ткани. Недостатком данного изобретения является отсутствие генотерапевтического подхода в реализации изобретения.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 в организме человека и животных, сочетающих в себе следующие свойства:

I) Эффективность генотерапевтического ДНК-вектора для повышения уровня экспрессии целевых генов в эукариотических клетках.

II) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов.

III) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности.

IV) Технологичность получения и возможность наработки генотерапевтического ДНК-вектора в промышленных масштабах.

Пункты II и III предусмотрены в данном техническом решении в соответствии с рекомендациями государственных регуляторов к лекарственным средствам для генной терапии, в частности, Европейского Агентства по лекарственным средствам касательно отказа от введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011, EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies) и касательно отказа от введения в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии элементов вирусных геномов (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA/CAT/80183/2014, Committee for Advanced Therapies).

Задачей изобретения также является конструирование штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора, для наработки и производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов.

Поставленная задача решается за счет того, что создан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1, для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 соответственно. При этом каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающей 3200 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки и экспрессировать клонированный в него целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 соответственно. В составе генотерапевтического ДНК-вектора отсутствуют нуклеотидные последовательности вирусного происхождения и отсутствуют гены антибиотикорезистентности, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.

Создан также способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген BMP-2, ген BMP-7, ген LMP-1, ген NELL-1, который заключается в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена из группы BMP-2, или BMP-7, или LMP-1, или NELL-1 клонируют в ДНК-вектор VTvaf17 и получают генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, SEQ ID №1, или VTvaf17-BMP-7, SEQ ID №2 или VTvaf17-LMP-1, SEQ ID №3, или VTvaf17-NELL-1, SEQ ID №4 соответственно.

Способ применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген BMP-2, ген BMP-7, ген LMP-1, ген NELL-1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, заключается во введении выбранного генотерапевтического ДНК-вектора или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов в клетки, органы и ткани человека или животного, и/или во введении в органы и ткани человека или животного аутологичных клеток человека или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, или в сочетании обозначенных способов.

Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1 заключается в электропорации компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF созданным генотерапевтическим ДНК-вектором и последующей селекцией стабильных клонов штамма с использованием селективной среды.

Заявлен штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор для его наработки с возможностью культивирования штамма без использования антибиотиков.

Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора заключается в масштабировании бактериальной культуры штамма до количеств, необходимых для наращивания бактериальной биомассы в промышленном ферментере, после чего биомассу используют для выделения фракции, содержащей целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2 или VTvaf17-BMP-7 или VTvaf17-LMP-1 или VTvaf17-NELL-1 многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.

Краткое описание фигур

На фиг. 1

приведена схема генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1, который представляет собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетках бактерии Escherichia coli.

На фиг. 1 приведены схемы, соответствующие:

A - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2,

B - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-7,

C - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LMP-1,

D - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-NELL-1.

На схемах отмечены следующие структурные элементы вектора:

EF1a - промоторная область гена человеческого фактора элонгации EF1A с собственным энхансером, содержащимся в первом интроне гена. Служит для обеспечения высокого уровня транскрипции рекомбинантного гена в большинстве тканей человека;

Рамка считывания целевого гена, соответствующая кодирующей части гена BMP-2 (фиг. 1A), или BMP-7 (фиг. 1B), или LMP-1 (фиг. 1C), или NELL-1 (фиг. 1D) соответственно;

hGH-TA - терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования гена фактора роста человека;

ori - ориджин репликации, служащий для автономной репликации с однонуклеотидной заменой для повышения копийности плазмиды в клетках большинства штаммов Escherichia coli;

RNA-out - регуляторный элемент РНК-out транспозона Tn 10, обеспечивающий возможность положительной селекции без использования антибиотиков при использовании штамма Eshcerichia coli SCS 110.

Отмечены уникальные сайты рестрикции.

На фиг. 2

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена BMP-2, в культуре остеобластов человека HOb (Cell Applications, Inc Кат. 406-05a) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг. 2 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена BMP-2 в культуре остеобластов человека HOb до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2;

2 - кДНК гена BMP-2 в культуре остеобластов человека HOb после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2;

3 - кДНК гена B2M в культуре остеобластов человека HOb до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2;

4 - кДНК гена B2M в культуре остеобластов человека HOb после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 3

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена BMP-7, в культуре остеосаркомы человека MG-63 (ATCC® CRL-1427™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг. 3 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена BMP-7 в культуре остеосаркомы человека MG-63 до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7;

2 - кДНК гена BMP-7 в культуре остеосаркомы человека MG-63 после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7;

3 - кДНК гена B2M в культуре остеосаркомы человека MG-63 до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7;

4 - кДНК гена B2M в культуре остеосаркомы человека MG-63 после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 4

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена LMP-1 в клетках культуры костных фибробластов человека линии Hs 870.T (ATCC® CRL-7606™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг. 4 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена LMP-1 в клетках костных фибробластов человека линии Hs 870.T до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1;

2 - кДНК гена LMP-1 в клетках костных фибробластов человека линии Hs 870.T после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1;

3 - кДНК гена B2M в клетках костных фибробластов человека линии Hs 870.T до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1;

4 - кДНК гена B2M в клетках костных фибробластов человека линии Hs 870.T после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 5

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена NELL-1, в культуре клеток человеческих хондроцитов Human Chondrocytes (HC) (Cell Applications, Inc Кат. 402K-05a) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг. 5 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена NELL-1 в культуре клеток человеческих хондроцитов Human Chondrocytes (HC) до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1;

2 - кДНК гена NELL-1 в культуре клеток человеческих хондроцитов Human Chondrocytes (HC) после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1;

3 - кДНК гена B2M в культуре клеток человеческих хондроцитов Human Chondrocytes (HC) до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1;

4 - кДНК гена B2M в культуре клеток человеческих хондроцитов Human Chondrocytes (HC) после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 6

показана диаграмма концентрации белка BMP-2 в клеточном лизате культуры остеобластов человека HOb после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка BMP-2 в лизате клеток.

На фиг. 6 отмечены следующие элементы:

культура А - культура остеобластов человека HOb, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура остеобластов человека HOb, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура остеобластов человека HOb, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2.

На фиг. 7

показана диаграмма концентрации белка BMP-7 в лизате клеток культуры клеток остеосаркомы человека MG-63 (ATCC® CRL-1427™), после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген BMP-7.

На фиг. 7 отмечены следующие элементы:

культура А - культура остеосаркомы человека MG-63, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура остеосаркомы человека MG-63, трансфицированная ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура остеосаркомы человека MG-63, трансфицированная ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7.

На фиг. 8

показана диаграмма концентрации белка LMP-1 в лизате культуры клеток костных фибробластов человека линии Hs 870.T (ATCC® CRL-7606™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген LMP-1.

На фиг. 8 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток костных фибробластов человека линии Hs 870.T, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура клеток костных фибробластов человека линии Hs 870.T, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура клеток костных фибробластов человека линии Hs 870.T, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1.

На фиг. 9

показана диаграмма концентрации белка NELL-1 в лизате клеток человеческих хондроцитов Human Chondrocytes (HC) (Cell Applications, Inc Кат. 402K-05a) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген NELL-1.

На фиг. 9 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток человеческих хондроцитов HC, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура клеток человеческих хондроцитов HC, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура клеток человеческих хондроцитов HC, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1.

На фиг. 10

показана диаграмма концентрации белка NELL-1 в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген NELL-1.

На фиг. 10 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-NELL-1;

П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка;

П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-NELL-1;

П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;

П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-NELL-1;

П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка.

На фиг. 11

показана диаграмма концентрации белка LMP-1 в биоптатах икроножной мышцы трех пациентов после введения в икроножную мышцу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген LMP-1.

На фиг. 11 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат икроножной мышцы пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LMP-1;

П1II - биоптат икроножной мышцы пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П1;

П2I - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LMP-1;

П2II - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П2;

П3I - биоптат икроножной мышцы пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LMP-1;

П3II - биоптат икроножной мышцы пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П3.

На фиг. 12

показана диаграмма концентрации белка BMP-7 в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген BMP-7.

На фиг. 12 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-BMP-7;

П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка;

П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-BMP-7;

П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;

П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-BMP-7;

П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка.

На фиг. 13

показана диаграмма концентрации белка BMP-7 в биоптатах кожи человека после введения в кожу культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7 с целью демонстрации способа применения путем введения аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7.

На фиг. 13 отмечены следующие элементы:

П1C - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения культуры аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7;

П1B - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17;

П1A - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка.

На фиг. 14

показана диаграмма концентраций белков: белка BMP-2 человека, белка BMP-7 человека, белка LMP-1 человека, белка NELL-1 человека в костных фрагментах нижней трети бедра трех крыс линии Wistar после инъекционного введения зону эпифиза бедренной кости смеси генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1 с целью демонстрации способа применения смеси генотерапевтических ДНК-векторов.

На фиг. 14 отмечены следующие элементы:

К1I - костный фрагмент нижней трети бедра крысы К1 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: VTvaf17-BMP-2, VTvaf17-BMP-7, VTvaf17-LMP-1 и VTvaf17-NELL-1;

К1II - костный фрагмент нижней трети бедра крысы К1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

К1III - костный фрагмент бедра контрольного интактного участка крысы К1;

К2I - костный фрагмент нижней трети бедра крысы К2 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: VTvaf17-BMP-2, VTvaf17-BMP-7, VTvaf17-LMP-1 и VTvaf17-NELL-1;

К2II - костный фрагмент нижней трети бедра крысы К2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

К2III - костный фрагмент бедра контрольного интактного участка крысы К2;

К3I - костный фрагмент нижней трети бедра крысы К3 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: VTvaf17-BMP-2, VTvaf17-BMP-7, VTvaf17-LMP-1 и VTvaf17-NELL-1;

К3II - костный фрагмент нижней трети бедра крысы К3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

К3III - костный фрагмент бедра контрольного интактного участка крысы К3.

На фиг. 15

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена LMP-1 в клетках остеобластов собаки Canine Osteoblasts (CnOb) (Cell Application Кат. Cn406K-05) до и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1 с целью демонстрации способа применения путем введения генотерапевтического ДНК-вектора животным

На фиг. 15 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена LMP-1 в клетках остеобластов собаки CnOb до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1;

2 - кДНК гена LMP-1 в клетках остеобластов собаки CnOb после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1;

3 - кДНК гена GAPDH в клетках остеобластов собаки CnOb до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1;

4 - кДНК гена GAPDH в клетках остеобластов собаки CnOb после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1.

В качестве референтного гена использовали ген GAPDH собаки, приведенного в базе данных GenBank под номером NC_006609.3, GENE ID 403755.

Реализация изобретения

На основе ДНК-вектора VTvaf17 размером 3165 п.н. созданы генотерапевтические ДНК-векторы, несущие целевые гены человека, предназначенные для повышения уровня экспрессии этих целевых генов в тканях человека и животных. При этом способ получения каждого генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевые гены заключается в том, что в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 клонируют белок-кодирующую последовательность целевого гена, выбранного из группы генов: ген BMP-2 (кодирует белок BMP-2), ген BMP-7 (кодирует белок BMP-7), ген LMP-1 (кодирует белок LMP-1), ген NELL-1 (кодирует белок NELL-1) человека. Известно, что способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки обусловлена, главным образом, размером вектора. При этом ДНК-вектора с наименьшим размером обладают более высокой проникающей способностью. Таким образом, предпочтительным является отсутствие в составе вектора элементов, которые не несут функциональной нагрузки, но при этом увеличивают размер ДНК-вектора. Данные особенности ДНК-векторов были учтены при получении генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 путем отсутствия в составе вектора крупных нефункциональных последовательностей и генов антибиотикорезистентности, что позволило, помимо технологических преимуществ и преимуществ в плане безопасности применения, значительно уменьшить размер полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1. Таким образом, способность проникать в эукариотические клетки полученного генотерапевтического ДНК-вектора обусловлена его небольшими размерами.

Каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 получали следующим образом: кодирующую часть целевого гена BMP-2, или BMP-7, или LMP-1, или NELL-1 клонировали в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 и получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, SEQ ID №1, или VTvaf17-BMP-7, SEQ ID №2 или VTvaf17-LMP-1, SEQ ID №3, или VTvaf17-NELL-1, SEQ ID №4 соответственно. Кодирующую часть гена BMP-2 размером 1219 п.н., или гена BMP-7 размером 1322 п.н., или гена LMP-1 размером 1375 п.н., или гена NELL-1 размером 2294 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека. Для получения первой цепи кДНК генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 человека использовали реакцию обратной транскрипции. Амплификацию проводили с использованием созданных для этого методом химического синтеза олигонуклеотидов. Расщепление продукта амплификации специфическими эндонуклеазами рестрикции проводили с учетом оптимальной процедуры дальнейшего клонирования, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводили по сайтам рестрикции BamHI, EcoRI, HindIII, NheI, KpnI расположенными в полилинкере вектора VTvaf17. Выбор сайтов рестрикции проводили таким образом, чтобы клонированный фрагмент попадал в рамку считывания экспрессионной кассеты вектора VTvaf17, при этом белок-кодирующая последовательность не содержала сайты рестрикции для выбранных эндонуклеаз. При этом специалистам в данной области техники понятно, что методическая реализация получения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 может варьировать в рамках выбора известных методов молекулярного клонирования генов, при этом эти способы подпадают под объем настоящего изобретения. Так, например, могут быть использованы различные последовательности олигонуклеотидов для амплификации гена BMP-2, или BMP-7, или LMP-1, или NELL-1 различные эндонуклеазы рестрикции или такие лабораторные техники как безлигазное клонирование генов.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 обладает нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 соответственно. При этом специалистам в данной области техники известно свойство вырожденности генетического кода, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей, отличающихся инсерцией, делецией или заменой нуклеотидов, которые не приводят к изменению полипептидной последовательности, кодируемой целевым геном, и/или не приводят к потере функциональной активности регуляторных элементов вектора VTvaf17. При этом специалистам в данной области техники известно явление генетического полиморфизма, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей генов из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1, которые при этом кодируют различные варианты аминокислотных последовательностей белков BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1, не отличающихся от приведенных по своей функциональной активности при физиологических условиях.

Способность проникать в эукариотические клетки и функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 подтверждают путем введения в эукариотические клетки полученного вектора и последующим анализом экспрессии специфической мРНК и/или белкового продукта целевого гена. Наличие специфической мРНК в клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 свидетельствует как о способности полученного вектора проникать в эукариотические клетки, так и о его способности экспрессировать мРНК целевого гена. При этом, как известно специалистам в данной области техники, наличие мРНК гена является обязательным условием, но не доказательством трансляции белка, кодируемого целевым геном. Поэтому для подтверждения свойства генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 экспрессировать целевой ген на уровне белка в эукариотических клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор, проводят анализ концентрации белков, кодируемых целевыми генами, с использованием иммунологических методов. Наличие белка BMP-2, или BMP-7, или LMP-1, или NELL-1 подтверждает эффективность экспрессии целевых генов в эукариотических клетках и возможность повышения уровня концентрации белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1. Таким образом для подтверждения эффективности экспрессии созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, несущего целевой ген, а именно, ген BMP-2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего целевой ген, а именно, ген BMP-7, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего целевой ген, а именно, ген LMP-1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, несущего целевой ген, а именно, ген NELL-1 использовали следующие методы:

А) ПЦР в реальном времени - изменение накопления ампликонов кДНК целевых генов в лизате клеток человека и животного, после трансфекции различных клеточных линий человека и животного генотерапевтическим ДНК-векторами;

B) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в лизате клеток человека, после трансфекции различных клеточных линий человека генотерапевтическими ДНК-векторами;

C) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека и животного, после введения в эти ткани генотерапевтических ДНК-векторов;

D) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека, после введения в эти ткани аутологичных клеток этого человека, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.

Для подтверждения реализуемости способа применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, несущего целевой ген, а именно, ген BMP-2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего целевой ген, а именно, ген BMP-7, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего целевой ген, а именно, ген LMP-1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, несущего целевой ген, а именно, ген NELL-1 выполняли:

А) трансфекцию генотерапевтическими ДНК-векторами различных клеточных линий человека и животного;

B) введение генотерапевтических ДНК-векторов в различные ткани человека и животного;

С) введение в ткани животного смеси генотерапевтических ДНК-векторов;

D) введение в ткани человека аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.

Указанные способы применения характеризуются отсутствием потенциальных рисков для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов, и за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов устойчивости к антибиотикам, что подтверждается отсутствием участков, гомологичных вирусным геномам и генам антибиотикорезистентности в нуклеотидных последовательностях генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1 (SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 соответственно).

Как известно специалистам в данной области техники, гены антибиотикорезистентности в составе генотерапевтических ДНК-векторов используются с целью получения этих векторов в препаративных количествах путем наращивания бактериальной биомассы в питательной среде, содержащей селективный антибиотик. В рамках настоящего изобретения в целях возможности безопасного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген BMP-2 или BMP-7, или LMP-1 или NELL-1, использование селективных питательных сред, содержащих антибиотик, не представляется возможным. В качестве технологического решения для получения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 для возможности масштабирования до промышленных масштабов получения генотерапевтических векторов предлагается способ получения штаммов для наработки указанных генотерапевтических векторов на основе бактерии Escherichia coli SCS110-AF. Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1 заключается в получении компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с введением в эти клетки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, или ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, или ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, или ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1 соответственно с помощью методов трансформации (электропорации), общеизвестных специалистам в данной области техники. Полученный штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1 используется для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 соответственно с возможностью использования сред без содержания антибиотиков.

Для подтверждения получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1 проводили трансформацию, селекцию и последующее наращивание с выделением плазмидной ДНК.

Для подтверждения технологичности получения и возможности масштабирования до промышленного производства генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, несущего целевой ген, а именно, ген BMP-2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего целевой ген, а именно, ген BMP-7, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего целевой ген, а именно, ген LMP-1 генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, несущего целевой ген, а именно, ген NELL-1, выполняли ферментацию в промышленном масштабе штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий целевой ген, а именно BMP-2, или BMP-7, или LMP-1, или NELL-1.

Способ масштабирования получения бактериальной массы до промышленных масштабов для выделения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1, заключается в том, что затравочную культуру штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1 инкубируют в объеме питательной среды без содержания антибиотика обеспечивающим подходящую динамику накопления биомассы, по достижению достаточного количества биомассы в логарифмической фазе роста, бактериальную культуру переносят в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы роста, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-7, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LMP-1, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-NELL-1 многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. При этом специалистам в данной области техники понятно, что условия культивирования штаммов, состав питательных сред (за исключением содержания антибиотиков), используемое оборудование, методы очистки ДНК могут варьировать в рамках стандартных операционных процедур в зависимости от отдельно взятой производственной линии, но известные подходы к масштабированию, промышленному получению и очистке ДНК-векторов с использованием штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1, или подпадают под объем настоящего изобретения.

Описанное раскрытие изобретения подтверждается примерами реализации настоящего изобретения.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, несущего целевой ген, а именно, гена BMP-2.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2 конструировали клонированием кодирующей части гена BMP-2 размером 1219 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции NheI и HindIII. Кодирующую часть гена BMP-2 размером 1219 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

BMP-2_F ACAGCTAGCCTCCTAAAGGTCCACCATGGT

BMP-2_R TATAAGCTTCTAGCGACACCCACAACCCT

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США).

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали объединением шести фрагментов ДНК, полученных из разных источников:

(а) ориджин репликации получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pBR322 с внесением точечной мутации;

(б) промоторный регион EF1а получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;

(в) терминатор транскрипции hGH-TA получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;

(г) регуляторный участок транспозона Tn10 РНК-out получали путем синтеза из олигонуклеотидов;

(д) ген устойчивости к канамицину получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pET-28 человека;

(е) полилинкер получали отжигом двух синтетических олигонуклеотидов.

ПЦР-амплификацию проводили с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты имеют перекрывающиеся области для возможности их объединения с последующей ПЦР-амплификацией. Объединяли фрагменты (а) и (б) с использованием олигонуклеотидов Ori-F и EF1-R, а также фрагменты (в), (г) и (д) с использованием олигонуклеотидов hGH-F и Kan-R. Далее полученные участки объединяли путем рестрикции с последующим лигированием по сайтам BamHI и NcoI. В результате получали плазмиду, пока еще не содержащую полилинкер. Для его введения проводили расщепление плазмиды по сайтам BamHI и EcoRI, и лигирование с фрагментом (е). Таким образом, получали вектор размером 3165 п.н., несущий ген устойчивости к канамицину, который фланкирован сайтами рестрикции SpeI. Далее этот участок выщепляли по сайтам рестрикции SpeI, после чего оставшийся фрагмент лигировали сам на себя. Таким образом получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н., который является рекомбинантным, с возможностью селекции без антибиотиков.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена BMP-2 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции NheI и HindIII (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2 размером 4360 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 и общей структурой изображенной на фиг. 1A.

Пример 2.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего целевой ген, а именно, гена BMP-7.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-7 конструировали клонированием кодирующей части гена BMP-7 размером 1322 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции NheI и HindIII. Кодирующую часть гена BMP-7 размером 1322 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

BMP-7_F TCAGCTAGCGTAGAGCCGGCGCGATGCA

BMP-7_R TATAAGCTTCTAGTGGCAGCCACAGGC

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции NheI и HindIII (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-BMP-7 размером 4463 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2 и общей структурой изображенной на фиг. 1B.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 3

Получение ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего целевой ген, а именно, гена LMP-1 человека.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LMP-1 конструировали клонированием кодирующей части гена LMP-1 размером 1375 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI. Кодирующую часть гена LMP-1 размером 1375 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

LMP-1_F GGATCCACCATGGATTCCTTCAAAGTAGTGC

LMP-1_R ATAGAATTCACACATGAGAGAAGGCATGGCT

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-LMP-1 размером 4516 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3 и общей структурой изображенной на фиг. 1C.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 4.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, несущего целевой ген, а именно, гена NELL-1.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-NELL-1 конструировали клонированием кодирующей части гена NELL-1 размером 2294 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHII и KpnI. Кодирующую часть гена NELL-1 размером 2294 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

NELL-1_F GGATCCACCATGCCGATGGATTTGATTTTAGTTG

NELL-1_R TTCGGTACCTAATTATTTTGAAGACACTCAAAATCC

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHII и KpnI (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-NELL-1 размером 5441 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4 и общей структурой изображенной на фиг. 1D.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 5.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, несущего целевой ген, а именно, ген BMP-2, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена BMP-2, в культуре остеобластов человека HOb (Cell Applications, Inc Кат. 406-05a) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2, несущим ген BMP-2 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Для оценки изменения накопления мРНК целевого гена BMP-2, использовалась первичная культура остеобластов человека HOb. Клеточную культуру HOb выращивали в стандартных условиях (37°С, 5% СО2) с использованием питательной среды Human Osteoblast Growth Medium: All-in-one ready-to-use (Cell Applications, Inc Кат. 417-500). В процессе культивирования каждые 48 ч происходила смена ростовой среды.

Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2, экспрессирующим ген BMP-2 человека, проводили с использованием Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. В пробирке №1 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2 (концентрация 500 нг/мкл) и 1 мкл реагента Р3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. В пробирке №2 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора Lipofectamin 3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. Добавляли содержимое пробирки №1 к содержимому пробирки №2, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор по каплям добавляли к клеткам в объеме 40 мкл.

В качестве контроля использовали клетки HOb, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена BMP-2 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано выше.

Суммарную РНК из клеток HOb выделяли с использованием Trizol Reagent (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. В лунку с клетками добавляли 1 мл Trizol Reagent и гомогенизировали с последующим прогреванием в течении 5 мин при 65°С. Далее образец центрифугировали при 14000 g в течении 10 мин и снова прогревали в течении 10 мин при 65°С. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, плавно перемешивали и центрифугировали при 14000 g в течении 10 мин. Затем отбирали водную фазу, добавляли к ней 1/10 объема 3М ацетата натрия, рН 5.2 и равный объем изопропилового спирта. Инкубировали образец при -20°С в течении 10 мин с последующим центрифугированием при 14000 g в течении 10 мин. Осадок промывали 1 мл 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКаз. Определение уровня экспрессии мРНК гена BMP-2 после трансфекции проводили путем оценки динамики накопления ампликонов кДНК методом ПЦР в режиме реального времени. Для получения и амплификации кДНК, специфичной для гена BMP-2 человека, использовали олигонуклеотиды BMP-2_SF и BMP-2_SR:

BMP-2_SF ATGCAAGCAGGTGGGAAAGT

BMP-2_FR GGGAGCCACAATCCAGTCAT

Длина продукта амплификации - 353 п.н.

Реакцию обратной транскрипции и ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) для ПЦР в режиме реального времени. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащих: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 мM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С - 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°C - 30 сек и элонгацию 72°С - 30 сек. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов BMP-2 и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество динамику накопления ампликонов кДНК генов BMP-2 и B2M оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 2.

Из фигуры 2 следует, что в результате трансфекции первичной культуры клеток остеобластов человека HOb генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2, уровень специфической мРНК гена BMP-2 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген BMP-2 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2 для повышения уровня экспрессии гена BMP-2 в эукариотических клетках.

Пример 6.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего целевой ген, а именно, ген BMP-7, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена BMP-7, в культуре остеосаркомы человека MG-63 (ATCC® CRL-1427™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, несущим ген BMP-7 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Первичную культуру клеток остеосаркомы человека MG-63 (ATCC® CRL-1427™) выращивали в среде EMEM (ATCC® 30-2003™) с добавление 10% сыворотки крупного рогатого скота (Панэко, Россия) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, экспрессирующим ген BMP-7 человека, проводили как описано в примере 5. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток остеосаркомы человека MG-63, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена BMP-7 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 5, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 5 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена BMP-7 человека, использовали олигонуклеотиды BMP-7_SF и BMP-7_SR:

BMP-7_SF GCTGGCTGGTGTTTGACATC

BMP-7_SR TGGTGGCGTTCATGTAGGAG

Длина продукта амплификации - 459 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов BMP-7 и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов BMP-7 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 3.

Из фигуры 3 следует, что в результате трансфекции культуры клеток остеосаркомы человека MG-63 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, уровень специфической мРНК гена BMP-7 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген BMP-7 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7 для повышения уровня экспрессии гена BMP-7 в эукариотических клетках.

Пример 7.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего целевой ген, а именно, ген LMP-1, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена LMP-1 в культуре клеток костных фибробластов человека линии Hs 870.T (ATCC® CRL-7606™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1, несущим ген LMP-1 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток костных фибробластов человека линии Hs 870.T выращивали в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (ATCC® 30-2002™) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (ATCC® 30-2020™) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1, экспрессирующим ген LMP-1 человека, проводили как описано в примере 5. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток костных фибробластов человека линии Hs 870.T, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена LMP-1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 5, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 5 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена LMP-1 человека, использовали олигонуклеотиды LMP-1_SF и LMP-1_SR:

LMP-1_SF TCATGCAAGACCCGGATGAG

LMP-1_SR CACTGTGCTCGTTTTGTCCG

Длина продукта амплификации - 194 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов LMP-1 и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов LMP-1 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 4.

Из фигуры 4 следует, что в результате трансфекции культуры клеток костных фибробластов человека линии Hs 870.T генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1 уровень специфической мРНК гена LMP-1 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген LMP-1 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1 для повышения уровня экспрессии гена LMP-1 в эукариотических клетках.

Пример 8.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, несущего целевой ген, а именно, ген NELL-1, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена NELL-1, в культуре клеток человеческих хондроцитов Human Chondrocytes (HC) (Cell Applications, Inc Кат. 402K-05a) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1, несущим ген NELL-1 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток хондроцитов человека линии HС выращивали в среде Human Chondrocyte Growth Medium: All-in-one ready-to-use (Cell Applications, Inc Кат. 402K-05a) стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1, экспрессирующим ген NELL-1 человека, проводили как описано в примере 5. В качестве контроля использовали культуру клеток хондроцитов человека линии HС, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена NELL-1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 5, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 5 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена NELL-1 человека, использовали олигонуклеотиды NELL-1_SF и NELL-1_SR:

NELL-1_SF CCACTGTACAGCAGAAGCCA

NELL-1_SR CTGACAGTGCAACCTTGTGC

Длина продукта амплификации - 195 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов NELL-1 и B2M. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов NELL-1 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 5.

Из фигуры 5 следует, что в результате трансфекции культуры клеток хондроцитов человека линии HС генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1, уровень специфической мРНК гена NELL-1 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген NELL-1 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1 для повышения уровня экспрессии гена NELL-1 в эукариотических клетках.

Пример 9.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, несущего ген BMP-2, для повышения экспрессии белка BMP-2 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка BMP-2 в лизате культуры остеобластов человека HOb (Cell Applications, Inc Кат. 406-05a) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2, несущим ген BMP-2 человека.

Клеточную культуру остеобластов человека HOb человека выращивали как это описано в примере 5.

Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена BMP-2 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, несущий ген BMP-2 человека (C). Приготовление комплекса ДНК/дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Handbook, 2002) с некоторыми изменениями. Для трансфекции клеток в одной лунке 24-луночного планшета к 1 мкг ДНК-вектора, растворенного в буфере ТЕ, добавляли культуральную среду до конечного объема 60 мкл, затем добавляли 5 мкл SuperFect Transfection Reagent и осторожно перемешивали пятикратным пипетированием. Комплекс инкубировали при комнатной температуре в течении 10-15 мин. Далее отбирали из лунок культуральную среду, лунки промывали 1 мл буфера PBS. К образовавшемуся комплексу добавляли 350 мкл среды, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, осторожно перемешивали и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали с комплексом 2-3 часа при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2.

Затем осторожно удаляли среду, промывали клеточный монослой 1 мл буфера PBS. Затем добавляли среду, содержащую 10 мкг/мл гентамицина, и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере 5% СО2.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка BMP-2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human BMP-2 DuoSet ELISA (R&D Systems Кат. DY355-05, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка BMP-2, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 50 пг/мл, диапазон измерения - от 50 пг/мл до 4000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 6.

Из фигуры 6 следует, что трансфекция клеток остеобластов человека HOb генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2 приводит к увеличению количества белка BMP-2 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген BMP-2 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2 для повышения уровня экспрессии BMP-2 в эукариотических клетках.

Пример 10.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего ген BMP-7, для повышения экспрессии белка BMP-7 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка BMP-7 в лизате клеток остеосаркомы человека MG-63 (ATCC® CRL-1427™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, несущим ген BMP-7 человека. Клетки выращивали как описано в примере 6.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена BMP-7 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-BMP-7, несущий ген BMP-7 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток MG-63 проводили как описано в примере 9.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка BMP-7 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human BMP-7 ELISA (Raybiotech, Inc Кат. ELH-BMP7-1, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка BMP-7, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 10 пг/мл, диапазон измерения - от 10 пг/мл до 6000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 7.

Из фигуры 7 следует, что трансфекция культуры клеток остеосаркомы человека MG-63 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7 приводит к увеличению количества белка BMP-7 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген BMP-7 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7 для повышения уровня экспрессии BMP-7 в эукариотических клетках.

Пример 11.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего ген LMP-1, для повышения экспрессии белка LMP-1 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка LMP-1 в лизате культуре клеток костных фибробластов человека линии Hs 870.T (ATCC® CRL-7606™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1, несущим ген LMP-1 человека. Клетки культивировали как описано в примере 7.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена LMP-1 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-LMP-1, несущий ген LMP-1 человека (C). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток костных фибробластов человека линии Hs 870.T проводили как описано в примере 9.

После трансфекции клетки промывали три раза PBS, далее к клеткам добавляли 1 мл PBS и подвергали трехкратному замораживанию/оттаиванию. Далее суспензию центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка LMP-1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор PDZ and LIM domain 7 (enigma) (PDLIM7), ELISA Kit (MyBioSource Кат MBS9327056, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка LMP-1, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 8.

Из фигуры 8 следует, что трансфекция культуры клеток костных фибробластов человека линии Hs 870.T генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1 приводит к увеличению количества белка LMP-1 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген LMP-1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1 для повышения уровня экспрессии LMP-1 в эукариотических клетках.

Пример 12.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, несущего ген NELL-1, для повышения экспрессии белка NELL-1 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка NELL-1 в лизате культуры клеток человеческих хондроцитов Human Chondrocytes (HC) (Cell Applications, Inc Кат. 402K-05a) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1, несущим ген NELL-1 человека. Клетки культивировали как описано в примере 8.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена NELL-1 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-NELL-1, несущий ген NELL-1 человека (C). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию клеток HС проводили как описано в примере 9.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка NELL-1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор NELL1 ELISA Kit (Human) (Aviva Systems Biology Кат. OKCA00780, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка NELL-1, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 31,25 пг/мл, диапазон измерения - от 31,25 пг/мл до 2000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 9.

Из фигуры 9 следует, что трансфекция культуры клеток человеческих хондроцитов HC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1 приводит к увеличению количества белка NELL-1 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген NELL-1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1 для повышения уровня экспрессии NELL-1 в эукариотических клетках.

Пример 13.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, несущего ген NELL-1, для повышения экспрессии белка NELL-1 в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, несущего целевой ген, а именно, ген NELL-1 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка NELL-1 в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, несущего ген человека NELL-1.

С целью анализа изменения количества белка NELL-1 трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-NELL-1, несущий ген NELL-1 и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена NELL-1.

Пациент 1, мужчина 59 лет, (П1); пациент 2, женщина 49 лет, П2); пациент 3, мужчина, 53 года, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-NELL-1, который содержит кДНК гена NELL-1 и генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК гена NELL-1, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор VTvaf17-NELL-1, несущий ген NELL-1 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-NELL-1, несущего ген NELL-1 - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-NELL-1, несущего ген NELL-1 (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000 g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Количественное определение белка NELL-1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа как это описано в примере 12.

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка NELL-1, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 10.

Из фигуры 10 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-NELL-1, несущего целевой ген NELL-1 человека, произошло увеличение количества белка NELL-1 в сравнении с количеством белка NELL-1 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген NELL-1 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.

Пример 14.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего ген LMP-1, для повышения экспрессии белка LMP-1 в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего целевой ген LMP-1 и реализуемости способа его применения оценивали изменение количества белка LMP-1 в мышечной ткани человека при введении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего целевой ген, а именно, ген LMP-1 человека.

С целью анализа изменения количества белка LMP-1 трем пациентам вводили в ткань икроножной мышцы генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LMP-1, несущий ген LMP-1 с транспортной молекулой, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена LMP-1 с транспортной молекулой.

Пациент 1, женщина 50 лет, (П1); пациент 2, мужчина 42 года (П2); пациент 3, мужчина 62 года, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция), пробоподготовку проводили в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор VTvaf17-LMP-1, несущий ген LMP-1 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину около 10 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LMP-1, несущего ген LMP-1 - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагали медиально на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков мышечной ткани пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LMP-1, несущего ген LMP-1 (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактного участка икроножной мышцы (III), используя устройство для взятия биопсии MAGNUM (BARD, США). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 20 куб. мм, масса - около 22 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000 g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка LMP-1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа как это описано в примере 11.

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка LMP-1, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 11.

Из фигуры 11 следует, что в икроножной мышце всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-LMP-1, несущего целевой ген, а именно, ген LMP-1 человека, произошло увеличение количества белка LMP-1 в сравнении с количеством белка LMP-1 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген LMP-1 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутримышечном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.

Пример 15.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего ген BMP-7, для повышения экспрессии белка BMP-7 в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего целевой ген, а именно, ген BMP-7 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка BMP-7 в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего ген человека BMP-7.

С целью анализа изменения количества белка BMP-7 трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-7, несущий ген BMP-7 и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена BMP-7.

Пациент 1, женщина 57 лет (П1); пациент 2, мужчина 50 лет (П2); пациент 3, мужчина, 59 лет (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-7, который содержит кДНК гена BMP-7 и генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК гена BMP-7, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор VTvaf17-BMP-7, несущий ген BMP-7 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-BMP-7, несущего ген BMP-7 - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-BMP-7, несущего ген BMP-7 (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг.Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000 g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка методом твердофазного иммуноферментного анализа как это описано в примере 10.

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка BMP-7, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 12.

Из фигуры 12 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-BMP-7, несущего целевой ген BMP-7 человека, произошло увеличение количества белка BMP-7 в сравнении с количеством белка BMP-7 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген BMP-7 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.

Пример 16.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего ген BMP-7 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка BMP-7 в тканях человека путем введения аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего ген BMP-7 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка BMP-7 в коже человека при введении в кожу пациента культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7.

Пациенту вводили в кожу предплечья соответствующую культуру аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, несущим ген BMP-7, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген BMP-7.

Первичную культуру фибробластов человека выделяли из биоптатов кожи пациента. Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия) брали образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, а именно за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 10 кв. мм, массой - около 11 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Культивирование первичной культуры клеток осуществляли при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 в среде DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Пересев культуры и смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 5×10⁴ клеток. Культуру фибробластов пациента трансфицировали генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, несущим ген BMP-7 или плацебо - вектор VTvaf17, не несущий целевой ген BMP-7.

Трансфекцию осуществляли с помощью катионного полимера полиэтиленимина JETPEI (Polyplus Transfection, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя. Клетки культивировали 72 часа и затем вводили пациенту. Введение пациенту культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, и плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, осуществляли туннельным методом в область предплечья иглой 30G длиной 13 мм на глубину около 3 мм. Концентрация модифицированных аутологичных фибробластов в вводимой суспензии составляла примерно 5 млн клеток на 1 мл суспензии, количество вводимых клеток не превышало 15 млн. Очаги введения культуры аутологичных фибробластов располагались на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 4-е сутки после введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, несущим целевой ген, а именно, ген BMP-7 и плацебо. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациента в зоне введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, несущим целевой ген, а именно, ген BMP-7 (C), культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген BMP-7 (плацебо) (B), а также из участков интактной кожи (A), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу в зоне отбора биоптата пациентов предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг.Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000 g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка как это описано в примере 15.

Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 13.

Из фигуры 13 следует, что в коже пациента в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, несущим ген BMP-7, произошло увеличение количества белка BMP-7 в сравнении с количеством белка BMP-7 в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген BMP-7 (плацебо), что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7 и подтверждает реализуемость способа его применения для повышения уровня экспрессии BMP-7 в тканях человека, в частности при введении аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7.

Пример 17.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, несущего ген BMP-2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего ген BMP-7, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего ген LMP-1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, несущего ген NELL-1, для повышения уровня экспрессии белков BMP-2, BMP-7, LMP-1 и NELL-1 в тканях млекопитающих.

Оценивали изменение количества белков BMP-2, BMP-7, LMP-1 и NELL-1 в бедренной кости крысы при введении в эту зону смеси генотерапевтических векторов. Исследование проводили на 3 лабораторных животных - самцах крысы линии Wistar 8 месячного возраста массой 240-290 г. Под наркозом (Золетил в дозе 40 мг/кг массы внутрибрюшинно) из разреза кожных покровов до 5 мм по наружной поверхности нижней трети бедра животных путем прокола осуществляли чрезмышечный доступ к эпифизу бедренной кости. С помощью сверла диаметром 1,7 мм формировали канал на глубину 3,0 мм (Семенов // Вестник ВолГУ. Серия 9. Вып. 11. 2013).

В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Эквимолярную смесь генотерапевтических ДНК-векторов растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя. Объем вводимого раствора составлял 0,3 мл с суммарным количеством ДНК 100 мкг.Введение раствора осуществляли пипеткой с автодозатором Gilson Pipetman P1000L (Gilson, США). Через 48 часов животных выводили из эксперимента передозировкой Золетила (200 мг/кг массы), для исследования забирали костный фрагмент бедра (Семенов // Вестник ВолГУ. Серия 9. Вып. 11. 2013).

Образцы отбирали на 2 сутки после введения генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие материала осуществляли из участков костного фрагмента нижней трети правого бедра в зоне введения смеси четырех генотерапевтических ДНК-векторов, несущих гены BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 (зона I), костного фрагмента нижней трети левого бедра в зоне введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (зона II), а также из участков костных фрагментов бедра (верхней трети), не подвергавшегося никаким манипуляциям (зона III). Каждый образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000 g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевых белков, как это описано в примере 9 (количественное определение белка BMP-2), примере 10 (количественное определение белка BMP-7), примере 11 (количественное определение белка LMP-1), примере 12 (количественное определение белка NELL-1). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 14.

Из фигуры 14 следует, что в зоне костного фрагмента нижней трети правого бедра (зона I), в которую вводилась смесь генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, несущего целевой ген BMP-2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, несущего целевой ген BMP-7, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего целевой ген LMP-1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, несущего целевой ген NELL-1, произошло увеличение количества белков BMP-2, BMP-7, LMP-1 и NELL-1 по сравнению с зоной II (зона плацебо) и зоной III (интактная зона). Полученные результаты свидетельствуют об эффективности сочетанного применения генотерапевтических ДНК-векторов и подтверждает реализуемость способа применения для повышения уровня экспрессии целевых белков в тканях млекопитающих.

Пример 18.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего ген LMP-1 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка LMP-1 в клетках млекопитающих.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, несущего ген LMP-1 оценивали изменение накопления мРНК целевого гена LMP-1 в клетках остеобластов собаки Canine Osteoblasts (CnOb) (Cell Application Кат. Cn406K-05) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1, несущим ген LMP-1 человека.

Клетки остеобластов собаки CnOb выращивали в среде Canine Osteoblast Growth Medium (Cell Application Кат. Cn406K-05) в стандартных условиях. Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1, несущим ген LMP-1 человека и ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген LMP-1 человека (контроль), выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, ПЦР амплификации и анализ данных проводили как описано в примере 7. В качестве референтного гена использовали ген GAPDH собаки, приведенного в базе данных GenBank под номером NC_006609.3, GENE ID 403755. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности генов LMP-1 и GAPDH. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов LMP-1 и GAPDH, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1. (Bio-Rad, USA).

Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 15.

Из фигуры 15 следует, что в результате трансфекции клеток остеобластов собаки CnOb генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1, уровень специфической мРНК гена LMP-1 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген LMP-1 на уровне мРНК. Представленные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1 для повышения уровня экспрессии гена LMP-1 в клетках млекопитающих.

Пример 19.

Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, и способ его получения.

Конструирование штамма для наработки в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1, а именно штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 соответственно для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2, или ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, или ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1, или ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1, после чего клетки высеваются на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола. При этом штамм Escherichia coli SCS110-AF для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или генотерапевтических ДНК-векторов на его основе с возможностью положительной селекции без использования антибиотиков получали путем конструирования линейного фрагмента ДНК, содержащего регуляторный элемент RNA-in транспозона Tn10 для селекции без применения антибиотиков размером 64 п.н., ген левансахаразы sacB, продукт которого обеспечивает селекцию на сахарозо-содержащей среде размером 1422 п.н., ген устойчивости к хлорамфениколу catR, необходимый для отбора клонов штамма, в которых прошла гомологичная рекомбинация размером 763 п.н. и две гомологичные последовательности, обеспечивающие процесс гомологичной рекомбинации в области гена recA с одновременной его инактивацией размером 329 п.н. и 233 п.н., после чего проводили трансформацию клеток Escherichia coli путем электропорации и отбирали клоны, выжившие на среде, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола.

Полученные штаммы для наработки были внесены в коллекции Национального биоресурсного центра - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ), РФ и NCIMB Patent Deposit Service, UK с присвоением регистрационных номеров:

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2 - регистрационный № ВКПМ: B-13167, дата депонирования: 11.05.2018, accession № NCIMB: 43034, дата депонирования: 20.04.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7 - регистрационный № ВКПМ: B-13166, дата депонирования: 11.05.2018, accession № NCIMB: 43036, дата депонирования: 20.04.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1 - регистрационный № ВКПМ: B-13325, дата депонирования: 12.11.2018, accession № NCIMB: 43247, дата депонирования: 08.11.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1 - регистрационный № ВКПМ: B-13324, дата депонирования: 12.11.2018, accession № NCIMB: 43249, дата депонирования: 08.11.2018.

Пример 20.

Способ масштабирования получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 до промышленного масштаба.

Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2 (SEQ ID №1), или VTvaf17-BMP-7 (SEQ ID №2), или VTvaf17-LMP-1 (SEQ ID №3), или VTvaf17-NELL-1 (SEQ ID №4), проводили масштабную ферментацию штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий целевой ген, а именно BMP-2, или BMP-7, или LMP-1, или NELL-1. Каждый штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1 получали на базе штамма Escherichia coli SCS110-AF (Cell and Gene Therapy LLC, Великобритания) по примеру 19 путем электропорации компетентных клеток этого штамма генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1, несущим целевой ген, а именно, BMP-2, или BMP-7, или LMP-1, или NELL-1 с последующим высевом трансформированных клеток на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы и отбором отдельных клонов.

Ферментацию полученного штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2 проводили в ферментере объемом 10 л с последующим выделением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2.

Для ферментации штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2 готовили среду, содержащую на 10 л: 100 г триптон, 50 г дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), доводили водой до 8800 мл и автоклавировали при 121°С 20 мин, затем добавляли 1200 мл 50% (вес/объем) сахарозы. Далее засевали в колбу затравочную культуру штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2 в объеме 100 мл. Инкубировали в шейкере-инкубаторе 16 ч при 30°С. Переносили затравочную культуру в ферментер Techfors S (Infors HT, Швейцария), растили до достижения стационарной фазы. Контроль осуществляли измерением оптической плотности культуры при длине волны 600 нм. Клетки осаждали центрифугированием 30 мин при 5000-10000 g. Супернатант удаляли, клеточную массу ресуспендировали в 10% по объему фосфатно-солевого буфера. Повторно центрифугировали 30 мин при 5000-10000 g. Супернатант удаляли, к клеточной массе добавляли раствор 20 мМ TrisCl, 1 мМ ЭДТА, 200 г/л сахароза, рН 8,0 в объеме 1000 мл, тщательно перемешивали до образования гомогенной суспензии. Добавляли раствор яичного лизоцима до конечной концентрации 100 мкг/мл. Инкубировали 20 мин на льду при бережном перемешивании. Далее, добавляли 2500 мл раствора 0,2 М NaOH, 10 г/л додецилсульфат натрия, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании, затем добавляли 3500 мл раствора 3M ацетат натрия, 2М уксусная кислота, рН 5-5,5, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании. Полученный образец центрифугировали 20-30 мин при 15000 g или более. Раствор аккуратно декантировали, от остатков осадка избавлялись фильтрацией через грубый фильтр (фильтровальную бумагу). Добавляли РНКазу А (Sigma, США) до конечной концентрации 20 нг/мл, инкубировали ночь 16 ч при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 20-30 мин при 15000 g, затем фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм (Millipore, США). Далее проводили ультрафильтрацию через мембрану размером отсечения 100 кДа (Millipore, США) и разбавляли до начального объема буфером 25 мМ TrisCl, pH 7.0. Операцию повторяли три-четыре раза. Наносили раствор, на колонку с 250 мл сорбента DEAE sepharose HP (GE, США), уравновешенную раствором 25 мМ TrisCl, pH 7.0. После нанесения образца колонку промывали тремя объемами этого же раствора, а затем проводили элюцию генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2 линейным градиентом от раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0 до раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0, 1М NaCl в объеме пяти объемов колонки. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм. Хроматографические фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, объединяли и проводили гель-фильтрацию на сорбенте Superdex 200 (GE, США). Колонку уравновешивали фосфатно-солевым буфером. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм, фракции анализировали электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2 объединяли и хранили при -20°С. Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно. Все технологические операции для штаммов Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1 проводили аналогичным образом.

Воспроизводимость техпроцесса и количественные характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1.

Таким образом, созданный генотерапевтический ДНК-вектор с целевым геном может быть использован для введения в клетки организма животных и человека, характеризующихся сниженной или недостаточной экспрессией белка, кодируемого данным геном, обеспечивая таким образом достижение терапевтического эффекта.

Задача, поставленная в данном изобретении решена, а именно: конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1, сочетающих в себе следующие свойства:

I) Эффективность повышения экспрессии целевых генов в эукариотических клетках за счет полученных генотерапевтических векторов с минимальным размером;

II) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов и генов антибиотикорезистентности;

III) Технологичность получения и возможность наработки в штаммах в промышленных масштабах;

IV) Также задача решена по конструированию штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора для производства этих генотерапевтических ДНК-векторов, что подтверждается примерами:

для п. I - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18;

для п. II - пример 1, 2, 3, 4;

для п. III и п. IV - пример 19, 20.

Промышленная применимость:

Все представленные выше примеры подтверждают промышленную применимость предлагаемого генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген BMP-2, ген BMP-7, ген LMP-1, ген NELL-1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1, несущего генотерапевтический ДНК-вектор, способа получения генотерапевтического ДНК-вектора, способа производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.

Перечень сокращений

VTvaf17 - вектор генотерапевтический, не содержащий последовательностей вирусных геномов и маркеров антибиотико-резистентности (vector therapeutic virus-antibiotic-free)

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

мл - миллилитр, мкл - микролитр

куб. мм - кубический миллиметр

л - литр

мкг - микрограмм

мг - миллиграмм

г - грамм

мкМ - микромоль

мМ - миллимоль

мин - минута

сек - секунда

об/мин - обороты в минуту

нм - нанометр

см - сантиметр

мВт - милливатт

о.е. ф - относительная единица флуоресценции

РВС - фосфатно-солевой буфер

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. BilicR., Simic P., Jelic М. et al. Osteogenic protein-1 (BMP-7) accelerates healing of scaphoid non-union with proximal pole sclerosis // Int. Orthop. - 2006. - Vol. 30. - P. 128-134.

2. Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products, http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf.

3. Fricdlaender G.E., Perry C.R., Cole J.D. et al. Osteogenic protein 1 (bone morphogenic protein-7) in the treatment of tibial non-unions // J. Bone Jt Surg. - 2001. - Vol. 83A. - P. S151-S158.

4. Govender S., Csimma C, Genant H.K., Valentin-Orpan A. The BMP-7 evaluation in surgery for tibial trauma (BESTT) study group.Recombinant human bone morphogenetic protein-2 for treatment of open tibial fractures: a prospective, controlled, randomized study of 450 patients // J. Bone Jt Surg. - 2002. - Vol. 84A. - P. 2123-2134.

5. Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA/CAT/80183/2014.

6. Hao Z, Yang X, Lv Y, Li S, Purbey BK, Su H. Intracolonically administered adeno-associated virus-bone morphogenetic protein-7 ameliorates dextran sulphate sodium-induced acute colitis in rats. J Gene Med. 2012 Jul; 14 (7): 482-90.

7. Heggeness MH. Gene therapy for spinal fusion using an insect vector. Spine J. 2015 Nov 1; 15 (11): 2410-1.

8. Hornstein BD, Roman D, Engevik MA, Zechiedrich L. Effects of Circular DNA Length on Transfection Efficiency by Electroporation into HeLa Cells. ed. PLoS ONE. 2016; 11 (12): e0167537.

9. Johnsson R., Stromqvist В., Aspenberg P. Randomized ra-diostereometric study comparing osteogenic protein-1 (BMP-7) and autograft bone in human noninstrumented posterolateral lumbar fusion: Volvo Award in clinical studies //Spin. - 2002. - Vol. 27. - P. 2654-2661.

10. Koh JT, Zhao Z, Wang Z, Lewis IS, Krebsbach PH, Franceschi RT. Combinatorial gene therapy with BMP2/7 enhances cranial bone regeneration. J Dent Res. 2008 Sep; 87 (9): 845-9. PubMed PMID: 18719211; PubMed Central PMCID: PMC 2593032.

11. Kwak JH, Zhang Y, Park J, Chen E, Shen J, Chawan C, Tanjaya J, Lee S, Zhang X, Wu BM, Ting K, Soo C. Pharmacokinetics and osteogenic potential of PEGylated NELL-1 in vivo after systemic administration. Biomaterials. 2015 Jul; 57: 73-83.

12. Lewandrowski K.U., Nanson C, Calderon R. Vertebral osteolysis after posterior interbody lumbar fusion with recombinant human bone morphogenetic protein 2: a report of five cases //Spine J. - 2007. - Vol. 7J5. - P. 609-614.

13. Li L, Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immuLMP-1enicity. Expert Rev Vaccines. 2016; 15 (3): 313-29.

14. Liu H, Huang L, Zhang Z, Zhang Z, Yu Z, Chen X, Chen Z, Zen Y, Yang D, Han Z, Shu Y, Dai M, Cao K. LIM mineralization protein-1 inhibits the malignant phenotypes of human osteosarcoma cells. Int J Mol Sci. 2014 Apr 23; 15 (4): 7037-48.

15. Loozen LD, van der Helm YJ, FC, Dhert WJ, Kruyt MC, Alblas J. Bone morphogenetic protein-2 nonviral gene therapy in a goat iliac crest model for bone formation. Tissue Eng Part A. 2015 May; 21 (9-10): 1672-9.

16. Mairhofer J, Grabherr R. Rational vector design for efficient non-viral gene delivery: challenges facing the use of plasmid DNA. Mol Biotechnol. 2008. 39 (2): 97-104.

17. Paralkar V.M., Vail A.L., Crasser W.A. et al. Cloning and characterization of a novel member of the transforming growth factor-beta/bone morphogenetic protein family //J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273, N 22. - P. 13760-13767.

18. Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies.

19. Saika S, Ikeda K, Yamanaka O, Flanders KC, Ohnishi Y, Nakajima Y, Muragaki Y, Ooshima A. Adenoviral gene transfer of BMP-7, Id2, or Id3 suppresses injury-induced epithelial-to-mesenchymal transition of lens epithelium in mice. Am J Physiol Cell Physiol. 2006 Jan; 290 (1): C282-9.

20. Schwabe P, Greiner S, Ganzert R, Eberhart J, K, Stemberger A, Plank C, Schmidmaier G, Wildemann B. Effect of a novel nonviral gene delivery of BMP-7 on bone healing. ScientificWorldJournal. 2012; 2012: 560142.

21. Schwartz Z., Somers A., Mellonig J.T. et al. Addition of human recombinant bone morphogenetic protein-2 to inactive commercial human demineralized freezedried bone allograft makes an effective composite bone inductive implant material //J. Periodontol. - 1998. - Vol. 69, N 12. - P. 1337-1345.

22. SchwenderJ.D., Holly L.T., Rouben D.P., Foley K.T. Minimally invasive transforaminal lumbar interbody fusion (TLIF): technical feasibility and initial results // J. Spin. Disord. Tech. - 2005. - Vol. 18. - P. S1-S6.

23. Tandon A, Sharma A, Rodier JT, Klibanov AM, Rieger FG, Mohan RR. BMP7 gene transfer via gold nanoparticles into stroma inhibits corneal fibrosis in vivo. PLoS One. 2013 Jun 14; 8 (6): e66434.

24. Tanjaya J, Zhang Y, Lee S, Shi J, Chen E, Ang P, Zhang X, Tetradis S, Ting K, Wu B, Soo C, Kwak JH. Efficacy of Intraperitoneal Administration of PEGylated NELL-1 for Bone Formation. Biores Open Access. 2016 Jun 1; 5 (1): 159-70.

25. Tsiridis E., Ali Z., Bhalla A. et al. In vitro and in vivo optimization of impaction allografting by demineralization and addition of rh-OP-1 // J. Orthop.Res. - 2007. - Vol. 25, N 11. - P. 1425-1437.

26. Vaccaro A.R., Patel Т., Fischgrund J. et al. A 2-year follow-up pilot study evaluating the safety and efficacy of op-1 putty (rhbmp-7) as an adjunct to iliac crest autograft in posterolateral lumbar fusions // Eur. Spine J. - 2005. - Vol. 14. - P. 623-629.

27. Wang CJ, Weng LH, Hsu SL, Sun YC, Yang YJ, Chan YS, Yang YL. pCMV-BMP-7-transfected cell-mediated gene therapy in anterior cruciate ligament reconstruction in rabbits. Arthroscopy. 2010 Jul; 26 (7): 968-76.

28. Wegman F, Bijenhof A, Schuijff L, Oner FC, Dhert WJ, Alblas J. Osteogenic differentiation as a result of BMP-7 plasmid DNA based gene therapy in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 2011 Mar 15; 21: 230-42; discussion 242.

29. Wu G, Zhou B, Hu C, Li S. Gene expression of osteogenic factors following gene therapy in mandibular lengthening. J Craniofac Surg. 2015 Mar; 26 (2): 378-81.

30. Yoon ST, Park JS, Kim KS, et al. ISSLS prize winner: LMP-1 upregulates intervertebral disc cell production of proteoglycans and BMPs in vitro and in vivo. Spine (Phila Pa 1976). 2004; 29 (23): 2603-2611.

31. Zhong L, Wang X, Wang S, Yang L, Gao H, Yang C. The anti-fibrotic effect of bone morphogenic protein-7(BMP-7) on liver fibrosis. Int J Med Sci. 2013; 10 (4):441-50.

32. Молекулярная биология, 2011, том 45, №1, с. 44-55.

33. Патент US 5942496 A.

34. Патент US 6300127 B1.

35. Патент US 7807787 B2.

36. Семенов П. С. Использование костного морфогенетического белка 2 для стимуляции остеорегенерации // Вестник ВолГУ. Серия 9: Исследования молодых ученых. 2013. №11.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Селл энд Джин Терапи Лтд (CELL and GENE THERAPY Ltd), Общество с ограниченной ответственностью «Прорывные Инновационные Технологии».

<120> Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.

<160> 4

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 4360

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 1

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagct agcctcctaa aggtccacca tggtggccgg gacccgctgt cttctagcgt 1260

tgctgcttcc ccaggtcctc ctgggcggcg cggctggcct cgttccggag ctgggccgca 1320

ggaagttcgc ggcggcgtcg tcgggccgcc cctcatccca gccctctgac gaggtcctga 1380

gcgagttcga gttgcggctg ctcagcatgt tcggcctgaa acagagaccc acccccagca 1440

gggacgccgt ggtgcccccc tacatgctag acctgtatcg caggcactca ggtcagccgg 1500

gctcacccgc cccagaccac cggttggaga gggcagccag ccgagccaac actgtgcgca 1560

gcttccacca tgaagaatct ttggaagaac taccagaaac gagtgggaaa acaacccgga 1620

gattcttctt taatttaagt tctatcccca cggaggagtt tatcacctca gcagagcttc 1680

aggttttccg agaacagatg caagatgctt taggaaacaa tagcagtttc catcaccgaa 1740

ttaatattta tgaaatcata aaacctgcaa cagccaactc gaaattcccc gtgaccagac 1800

ttttggacac caggttggtg aatcagaatg caagcaggtg ggaaagtttt gatgtcaccc 1860

ccgctgtgat gcggtggact gcacagggac acgccaacca tggattcgtg gtggaagtgg 1920

cccacttgga ggagaaacaa ggtgtctcca agagacatgt taggataagc aggtctttgc 1980

accaagatga acacagctgg tcacagataa ggccattgct agtaactttt ggccatgatg 2040

gaaaagggca tcctctccac aaaagagaaa aacgtcaagc caaacacaaa cagcggaaac 2100

gccttaagtc cagctgtaag agacaccctt tgtacgtgga cttcagtgac gtggggtgga 2160

atgactggat tgtggctccc ccggggtatc acgcctttta ctgccacgga gaatgccctt 2220

ttcctctggc tgatcatctg aactccacta atcatgccat tgttcagacg ttggtcaact 2280

ctgttaactc taagattcct aaggcatgct gtgtcccgac agaactcagt gctatctcga 2340

tgctgtacct tgacgagaat gaaaaggttg tattaaagaa ctatcaggac atggttgtgg 2400

agggttgtgg gtgtcgctag aagcttggta ccgaattccc tgtgacccct ccccagtgcc 2460

tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa taaaattaag 2520

ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga ggggggtggt 2580

atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct attgggaacc 2640

aagctggagt gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct gggttcaagc 2700

gattctcctg cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga ccaggctcag 2760

ctaatttttg tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc tggtctccaa 2820

ctcctaatct caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat tacaggcgtg 2880

aaccactgct cccttccctg tccttacgcg tagaattggt aaagagagtc gtgtaaaata 2940

tcgagttcgc acatcttgtt gtctgattat tgatttttgg cgaaaccatt tgatcatatg 3000

acaagatgtg tatctacctt aacttaatga ttttgataaa aatcattaac tagtccatgg 3060

ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 3120

ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 3180

gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta 3240

tactggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt 3300

gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg 3360

ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 3420

gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 3480

ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 3540

cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 3600

ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 3660

accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 3720

catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 3780

gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 3840

tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 3900

agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 3960

actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 4020

gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 4080

aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 4140

gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 4200

aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 4260

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 4320

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 4360

<210> 2

<211> 4463

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 2

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagct agcgtagagc cggcgcgatg cacgtgcgct cactgcgagc tgcggcgccg 1260

cacagcttcg tggcgctctg ggcacccctg ttcctgctgc gctccgccct ggccgacttc 1320

agcctggaca acgaggtgca ctcgagcttc atccaccggc gcctccgcag ccaggagcgg 1380

cgggagatgc agcgcgagat cctctccatt ttgggcttgc cccaccgccc gcgcccgcac 1440

ctccagggca agcacaactc ggcacccatg ttcatgctgg acctgtacaa cgccatggcg 1500

gtggaggagg gcggcgggcc cggcggccag ggcttctcct acccctacaa ggccgtcttc 1560

agtacccagg gcccccctct ggccagcctg caagatagcc atttcctcac cgacgccgac 1620

atggtcatga gcttcgtcaa cctcgtggaa catgacaagg aattcttcca cccacgctac 1680

caccatcgag agttccggtt tgatctttcc aagatcccag aaggggaagc tgtcacggca 1740

gccgaattcc ggatctacaa ggactacatc cgggaacgct tcgacaatga gacgttccgg 1800

atcagcgttt atcaggtgct ccaggagcac ttgggcaggg aatcggatct cttcctgctc 1860

gacagccgta ccctctgggc ctcggaggag ggctggctgg tgtttgacat cacagccacc 1920

agcaaccact gggtggtcaa tccgcggcac aacctgggcc tgcagctctc ggtggagacg 1980

ctggatgggc agagcatcaa ccccaagttg gcgggcctga ttgggcggca cgggccccag 2040

aacaagcagc ccttcatggt ggctttcttc aaggccacgg aggtccactt ccgcagcatc 2100

cggtccacgg ggagcaaaca gcgcagccag aaccgctcca agacgcccaa gaaccaggaa 2160

gccctgcgga tggccaacgt ggcagagaac agcagcagcg accagaggca ggcctgtaag 2220

aagcacgagc tgtatgtcag cttccgagac ctgggctggc aggactggat catcgcgcct 2280

gaaggctacg ccgcctacta ctgtgagggg gagtgtgcct tccctctgaa ctcctacatg 2340

aacgccacca accacgccat cgtgcagacg ctggtccact tcatcaaccc ggaaacggtg 2400

cccaagccct gctgtgcgcc cacgcagctc aatgccatct ccgtcctcta cttcgatgac 2460

agctccaacg tcatcctgaa gaaatacaga aacatggtgg tccgggcctg tggctgccac 2520

tagaagcttg gtaccgaatt ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag 2580

ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg 2640

actaggtgtc cttctataat attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggcaag 2700

ttgggaagac aacctgtagg gcctgcgggg tctattggga accaagctgg agtgcagtgg 2760

cacaatcttg gctcactgca atctccgcct cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc 2820

ctcccgagtt gttgggattc caggcatgca tgaccaggct cagctaattt ttgttttttt 2880

ggtagagacg gggtttcacc atattggcca ggctggtctc caactcctaa tctcaggtga 2940

tctacccacc ttggcctccc aaattgctgg gattacaggc gtgaaccact gctcccttcc 3000

ctgtccttac gcgtagaatt ggtaaagaga gtcgtgtaaa atatcgagtt cgcacatctt 3060

gttgtctgat tattgatttt tggcgaaacc atttgatcat atgacaagat gtgtatctac 3120

cttaacttaa tgattttgat aaaaatcatt aactagtcca tggctgcctc gcgcgtttcg 3180

gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt 3240

aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc 3300

ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc 3360

ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 3420

cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 3480

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 3540

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 3600

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 3660

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 3720

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 3780

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 3840

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 3900

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 3960

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 4020

cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 4080

tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 4140

cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 4200

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 4260

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 4320

gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 4380

gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 4440

ttcatccata gttgcctgac tcc 4463

<210> 3

<211> 4516

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 3

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagga tccaccatgg attccttcaa agtagtgctg gaggggccag caccttgggg 1260

cttccggctg caagggggca aggacttcaa tgtgcccctc tccatttccc ggctcactcc 1320

tgggggcaaa gcggcgcagg ccggagtggc cgtgggtgac tgggtgctga gcatcgatgg 1380

cgagaatgcg ggtagcctca cacacatcga agctcagaac aagatccggg cctgcgggga 1440

gcgcctcagc ctgggcctca gcagggccca gccggttcag agcaaaccgc agaaggcctc 1500

cgcccccgcc gcggaccctc cgcggtacac ctttgcaccc agcgtctccc tcaacaagac 1560

ggcccggccc tttggggcgc ccccgcccgc tgacagcgcc ccgcagcaga atggacagcc 1620

gctccgaccg ctggtcccag atgccagcaa gcagcggctg atggagaaca cagaggactg 1680

gcggccgcgg ccggggacag gccagtcgcg ttccttccgc atccttgccc acctcacagg 1740

caccgagttc atgcaagacc cggatgagga gcacctgaag aaatcaagcc aggtgcccag 1800

gacagaagcc ccagccccag cctcatctac accccaggag ccctggcctg gccctaccgc 1860

ccccagccct accagccgcc cgccctgggc tgtggaccct gcgtttgccg agcgctatgc 1920

cccggacaaa acgagcacag tgctgacccg gcacagccag ccggccacgc ccacgccgct 1980

gcagagccgc acctccattg tgcaggcagc tgccggaggg gtgccaggag ggggcagcaa 2040

caacggcaag actcccgtgt gtcaccagtg ccacaaggtc atccggggcc gctacctggt 2100

ggcgctgggc cacgcgtacc acccggagga gtttgtgtgt agccagtgtg ggaaggtcct 2160

ggaagagggt ggcttctttg aggagaaggg cgccatcttc tgcccaccat gctatgacgt 2220

gcgctatgca cccagctgtg ccaagtgcaa gaagaagatt acaggcgaga tcatgcacgc 2280

cctgaagatg acctggcacg tgcactgctt tacctgtgct gcctgcaaga cgcccatccg 2340

gaacagggcc ttctacatgg aggagggcgt gccctattgc gagcgagact atgagaagat 2400

gtttggcacg aaatgccatg gctgtgactt caagatcgac gctggggacc gcttcctgga 2460

ggccctgggc ttcagctggc atgacacctg cttcgtctgt gcgatatgtc agatcaacct 2520

ggaaggaaag accttctact ccaagaagga caggcctctc tgcaagagcc atgccttctc 2580

tcatgtgtga attccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac 2640

tccagtgccc accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt 2700

gtccttctat aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa 2760

gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc 2820

ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga 2880

gttgttggga ttccaggcat gcatgaccag gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag 2940

acggggtttc accatattgg ccaggctggt ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc 3000

accttggcct cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct 3060

tacgcgtaga attggtaaag agagtcgtgt aaaatatcga gttcgcacat cttgttgtct 3120

gattattgat ttttggcgaa accatttgat catatgacaa gatgtgtatc taccttaact 3180

taatgatttt gataaaaatc attaactagt ccatggctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga 3240

cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga 3300

tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc 3360

agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca 3420

gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 3480

agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 3540

gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 3600

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 3660

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 3720

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 3780

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 3840

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 3900

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 3960

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 4020

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 4080

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 4140

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 4200

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 4260

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 4320

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 4380

ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 4440

agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 4500

atagttgcct gactcc 4516

<210> 4

<211> 5441

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 4

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagga tccaccatgc cgatggattt gattttagtt gtgtggttct gtgtgtgcac 1260

tgccaggaca gtggtgggct ttgggatgga ccctgacctt cagatggata tcgtcaccga 1320

gcttgacctt gtgaacacca cccttggagt tgctcaggtg tctggaatgc acaatgccag 1380

caaagcattt ttatttcaag acatagaaag agagatccat gcagctcctc atgtgagtga 1440

gaaattaatt cagctgttcc ggaacaagag tgaattcacc attttggcca ctgtacagca 1500

gaagccatcc acttcaggag tgatactgtc cattcgagaa ctggagcaca gctattttga 1560

actggagagc agtggcctga gggatgagat tcggtatcac tacatacaca atgggaagcc 1620

aaggacagag gcacttcctt accgcatggc agatggacaa tggcacaagg ttgcactgtc 1680

agttagcgcc tctcatctcc tgctccatgt cgactgtaac aggatttatg agcgtgtgat 1740

agaccctcca gataccaacc ttcccccagg aatcaattta tggcttggcc agcgcaacca 1800

aaagcatggc ttattcaaag ggatcatcca agatgggaag atcatcttta tgccgaatgg 1860

atatataaca cagtgtccaa atctaaatca cacttgccca acctgcagtg atttcttaag 1920

cctggtgcaa ggaataatgg atttacaaga gcttttggcc aagatgactg caaaactaaa 1980

ttatgcagag acaagactta gtcaattgga aaactgtcat tgtgagaaga cttgtcaagt 2040

gagtggactg ctctatcgag atcaagactc ttgggtagat ggtgaccatt gcaggaactg 2100

cacttgcaaa agtggtgccg tggaatgccg aaggatgtcc tgtccccctc tcaattgctc 2160

cccagactcc ctcccagtgc acattgctgg ccagtgctgt aaggtctgcc gaccaaaatg 2220

tatctatgga ggaaaagttc ttgcagaagg ccagcggatt ttaaccaaga gctgtcggga 2280

atgccgaggt ggagttttag taaaaattac agaaatgtgt cctcctttga actgctcaga 2340

aaaggatcac attcttcctg agaatcagtg ctgccgtgtc tgtagaggtc ataacttttg 2400

tgcagaagga cctaaatgtg gtgaaaactc agagtgcaaa aactggaata caaaagctac 2460

ttgtgagtgc aagagtggtt acatctctgt ccagggagac tctgcctact gtgaagatat 2520

tgatgagtgt gcagctaaga tgcattactg tcatgccaat actgtgtgtg tcaaccttcc 2580

tgggttatat cgctgtgact gtgtcccagg atacattcgt gtggatgact tctcttgtac 2640

agaacacgat gaatgtggca gcggccagca caactgtgat gagaatgcca tctgcaccaa 2700

cactgtccag ggacacagct gcacctgcaa accgggctac gtggggaacg ggaccatctg 2760

cagagctttc tgtgaagagg gctgcagata cggtggaacg tgtgtggctc ccaacaaatg 2820

tgtctgtcca tctggattca caggaagcca ctgcgagaaa gacattgatg aatgtgcctt 2880

aagaactcac acctgttgga acgattctgc ctgcatcaac ctggcagggg gctttgactg 2940

tctctgcccc tctgggccct cctgctctgg tgactgtcct catgaagggg ggctgaagca 3000

caatggccag gtgtggacct tgaaagaaga caggtgttct gtctgctcct gcaaggatgg 3060

caagatattc tgccgacgga cagcttgtga ttgccagaat ccaagtgctg acctattctg 3120

ttgcccagaa tgtgacacca gagtcacaag tcaatgttta gaccaaaatg gtcacaagct 3180

gtatcgaagt ggagacaatt ggacccatag ctgtcagcag tgtcggtgtc tggaaggaga 3240

ggtagattgc tggccactca cttgccccaa cttgagctgt gagtatacag ctatcttaga 3300

aggggaatgt tgtccccgct gtgtcagtga cccctgccta gctgataaca tcacctatga 3360

catcagaaaa acttgcctgg acagctatgg tgtttcacgg cttagtggct cagtgtggac 3420

gatggctgga tctccctgca caacctgtaa atgcaagaat ggaagagtct gttgttctgt 3480

ggattttgag tgtcttcaaa ataattaggt accgaattcc ctgtgacccc tccccagtgc 3540

ctctcctggc cctggaagtt gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa 3600

gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg 3660

tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac 3720

caagctggag tgcagtggca caatcttggc tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag 3780

cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt tgggattcca ggcatgcatg accaggctca 3840

gctaattttt gtttttttgg tagagacggg gtttcaccat attggccagg ctggtctcca 3900

actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt 3960

gaaccactgc tcccttccct gtccttacgc gtagaattgg taaagagagt cgtgtaaaat 4020

atcgagttcg cacatcttgt tgtctgatta ttgatttttg gcgaaaccat ttgatcatat 4080

gacaagatgt gtatctacct taacttaatg attttgataa aaatcattaa ctagtccatg 4140

gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga 4200

cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag 4260

cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt 4320

atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg 4380

tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc 4440

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 4500

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 4560

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 4620

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 4680

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 4740

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 4800

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 4860

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 4920

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 4980

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 5040

cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 5100

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 5160

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 5220

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 5280

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 5340

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 5400

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc c 5441

<---

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

BMP-2_F ACAGCTAGCCTCCTAAAGGTCCACCATGGT

BMP-2_R TATAAGCTTCTAGCGACACCCACAACCCT

BMP-2_SF ATGCAAGCAGGTGGGAAAGT

BMP-2_SR GGGAGCCACAATCCAGTCAT

BMP-7_F TCAGCTAGCGTAGAGCCGGCGCGATGCA

BMP-7_R TATAAGCTTCTAGTGGCAGCCACAGGC

BMP-7_SF GCTGGCTGGTGTTTGACATC

BMP-7_SR TGGTGGCGTTCATGTAGGAG

LMP-1_F GGATCCACCATGGATTCCTTCAAAGTAGTGC

LMP-1_R ATAGAATTCACACATGAGAGAAGGCATGGCT

LMP-1_SF TCATGCAAGACCCGGATGAG

LMP-1_SR CACTGTGCTCGTTTTGTCCG

NELL-1_F GGATCCACCATGCCGATGGATTTGATTTTAGTTG

NELL-1_R TTCGGTACCTAATTATTTTGAAGACACTCAAAATCC

NELL-1_SF CCACTGTACAGCAGAAGCCA

NELL-1_SR CTGACAGTGCAACCTTGTGC

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии. Создан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1, для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1, или SEQ ID №2, или SEQ ID №3, или SEQ ID №4 соответственно. При этом каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающей 3200 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки и экспрессировать клонированный в него целевой ген, выбранный из группы генов BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 соответственно. В составе генотерапевтического ДНК-вектора отсутствуют нуклеотидные последовательности вирусного происхождения и отсутствуют гены антибиотикорезистентности, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных. 12 н. и 2 з.п. ф-лы, 15 ил., 20 пр.

1. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением регенерации костной и хрящевой тканей, несращением переломов костей различных отделов скелета, а также для индукции роста костной и хрящевой тканей путем регулировки пролиферации и дифференциации остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, для повышения остеоиндуктивности аллогенных и ксеногенных костных имплантов, для достижения спондилодеза, повышения процента костных сращений при терапии переломов костей и сокращения сроков их заживления, для терапии дегенеративных изменений межпозвоночных дисков, остеопороза и других повреждений костной и хрящевой тканей, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена BMP-2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1.

2. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением регенерации костной и хрящевой тканей, несращением переломов костей различных отделов скелета, а также для индукции роста костной и хрящевой тканей путем регулировки пролиферации и дифференциации остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, для повышения остеоиндуктивности аллогенных и ксеногенных костных имплантов, для достижения спондилодеза, повышения процента костных сращений при терапии переломов костей и сокращения сроков их заживления, для терапии дегенеративных изменений межпозвоночных дисков, остеопороза и других повреждений костной и хрящевой тканей, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена BMP-7, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2.

3. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением регенерации костной и хрящевой тканей, несращением переломов костей различных отделов скелета, а также для индукции роста костной и хрящевой тканей путем регулировки пролиферации и дифференциации остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, для повышения остеоиндуктивности аллогенных и ксеногенных костных имплантов, для достижения спондилодеза, повышения процента костных сращений при терапии переломов костей и сокращения сроков их заживления, для терапии дегенеративных изменений межпозвоночных дисков, остеопороза и других повреждений костной и хрящевой тканей, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена LMP-1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3.

4. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением регенерации костной и хрящевой тканей, несращением переломов костей различных отделов скелета, а также для индукции роста костной и хрящевой тканей путем регулировки пролиферации и дифференциации остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, для повышения остеоиндуктивности аллогенных и ксеногенных костных имплантов, для достижения спондилодеза, повышения процента костных сращений при терапии переломов костей и сокращения сроков их заживления, для терапии дегенеративных изменений межпозвоночных дисков, остеопороза и других повреждений костной и хрящевой тканей, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена NELL-1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4.

5. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 по пп.1-3 или 4, отличающийся тем, что каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 по пп.1-3 или 4, за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающей 3200 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген BMP-2, или BMP-7, или LMP-1, или NELL-1.

6. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 по пп.1-3 или 4, отличающийся тем, что в составе каждого из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 по пп.1-3 или 4, в качестве структурных элементов используются нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.

7. Способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 по пп.1-3 или 4, заключающийся в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-BMP-2, или VTvaf17-BMP-7, или VTvaf17-LMP-1, или VTvaf17-NELL-1 получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 по пп.1-3 или 4 клонируют в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 и получают генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, SEQ ID №1, или VTvaf17-BMP-7, SEQ ID №2, или VTvaf17-LMP-1, SEQ ID №3, или VTvaf17-NELL-1, SEQ ID №4 соответственно, при этом кодирующую часть целевого гена BMP-2, или BMP-7, или LMP-1, или NELL-1 получают путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят по сайтам рестрикции NheI и HindIII, причем селекцию проводят без антибиотиков,

при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-2, SEQ ID №1 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

BMP-2_F ACAGCTAGCCTCCTAAAGGTCCACCATGGT

BMP-2_R TATAAGCTTCTAGCGACACCCACAACCCT,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена BMP-2 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции NheI и HindIII,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP-7, SEQ ID №2 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

BMP-7_F TCAGCTAGCGTAGAGCCGGCGCGATGCA

BMP-7_R TATAAGCTTCTAGTGGCAGCCACAGGC,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена BMP-7 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции NheI и HindIII,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-LMP-1, SEQ ID №3 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

LMP-1_F GGATCCACCATGGATTCCTTCAAAGTAGTGC

LMP-1_R ATAGAATTCACACATGAGAGAAGGCATGGCT,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена LMP-1 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI,

причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NELL-1, SEQ ID №4 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды

NELL-1_F GGATCCACCATGCCGATGGATTTGATTTTAGTTG

NELL-1_R TTCGGTACCTAATTATTTTGAAGACACTCAAAATCC,

а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена NELL-1 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHII и KpnI.

8. Способ использования генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 по пп.1-3 или 4, для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением регенерации костной и хрящевой тканей, несращением переломов костей различных отделов скелета, а также для индукции роста костной и хрящевой тканей путем регулировки пролиферации и дифференциации остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, для повышения остеоиндуктивности аллогенных и ксеногенных костных имплантов, для достижения спондилодеза, повышения процента костных сращений при терапии переломов костей и сокращения сроков их заживления, для терапии дегенеративных изменений межпозвоночных дисков, остеопороза и других повреждений костной и хрящевой тканей, заключающийся в трансфекции выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, клеток органов и тканей пациента или животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного выбранного генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или в сочетании обозначенных способов.

9. Способ получения штамма для производства генотерапевтического ДНК-вектора по пп.1-3 или 4 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением регенерации костной и хрящевой тканей, несращением переломов костей различных отделов скелета, а также для индукции роста костной и хрящевой тканей путем регулировки пролиферации и дифференциации остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, для повышения остеоиндуктивности аллогенных и ксеногенных костных имплантов, для достижения спондилодеза, повышения процента костных сращений при терапии переломов костей и сокращения сроков их заживления, для терапии дегенеративных изменений межпозвоночных дисков, остеопороза и других повреждений костной и хрящевой тканей, заключающийся в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с последующим проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP-2, или ДНК-вектором VTvaf17-BMP-7, или ДНК-вектором VTvaf17-LMP-1, или ДНК-вектором VTvaf17-NELL-1, после чего клетки высеивают на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола с получением в результате штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1.

10. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, полученный способом по п.9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением регенерации костной и хрящевой тканей, несращением переломов костей различных отделов скелета, а также для индукции роста костной и хрящевой тканей путем регулировки пролиферации и дифференциации остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, для повышения остеоиндуктивности аллогенных и ксеногенных костных имплантов, для достижения спондилодеза, повышения процента костных сращений при терапии переломов костей и сокращения сроков их заживления, для терапии дегенеративных изменений межпозвоночных дисков, остеопороза и других повреждений костной и хрящевой тканей.

11. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, полученный способом по п.9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-7, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением регенерации костной и хрящевой тканей, несращением переломов костей различных отделов скелета, а также для индукции роста костной и хрящевой тканей путем регулировки пролиферации и дифференциации остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, для повышения остеоиндуктивности аллогенных и ксеногенных костных имплантов, для достижения спондилодеза, повышения процента костных сращений при терапии переломов костей и сокращения сроков их заживления, для терапии дегенеративных изменений межпозвоночных дисков, остеопороза и других повреждений костной и хрящевой тканей.

12. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, полученный способом по п.9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LMP-1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением регенерации костной и хрящевой тканей, несращением переломов костей различных отделов скелета, а также для индукции роста костной и хрящевой тканей путем регулировки пролиферации и дифференциации остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, для повышения остеоиндуктивности аллогенных и ксеногенных костных имплантов, для достижения спондилодеза, повышения процента костных сращений при терапии переломов костей и сокращения сроков их заживления, для терапии дегенеративных изменений межпозвоночных дисков, остеопороза и других повреждений костной и хрящевой тканей.

13. Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1, полученный способом по п.9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-NELL-1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением регенерации костной и хрящевой тканей, несращением переломов костей различных отделов скелета, а также для индукции роста костной и хрящевой тканей путем регулировки пролиферации и дифференциации остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, для повышения остеоиндуктивности аллогенных и ксеногенных костных имплантов, для достижения спондилодеза, повышения процента костных сращений при терапии переломов костей и сокращения сроков их заживления, для терапии дегенеративных изменений межпозвоночных дисков, остеопороза и других повреждений костной и хрящевой тканей.

14. Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген BMP-2, BMP-7, LMP-1, NELL-1 по пп.1-3 или 4, для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением регенерации костной и хрящевой тканей, несращением переломов костей различных отделов скелета, а также для индукции роста костной и хрящевой тканей путем регулировки пролиферации и дифференциации остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, для повышения остеоиндуктивности аллогенных и ксеногенных костных имплантов, для достижения спондилодеза, повышения процента костных сращений при терапии переломов костей и сокращения сроков их заживления, для терапии дегенеративных изменений межпозвоночных дисков, остеопороза и других повреждений костной и хрящевой тканей, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-2, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP-7, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-LMP-1, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-NELL-1 получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру, выбранную из штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-LMP-1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NELL-1, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.