СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ФУНКЦИЙ СПИННОГО МОЗГА ПОСЛЕ ЕГО ПЕРЕСЕЧЕНИЯ, С ПОМОЩЬЮ КОНЪЮГАТА ПЭГ-ХИТОЗАНА Российский патент 2022 года по МПК G09B23/28 A61B17/00 A61K31/722 A61K31/745 A61P25/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, нейрохирургии и регенеративной медицине, и может быть использовано для реконструкции спинного мозга после его анатомического разрыва или контузии.

Способ позволяет восстанавливать функциональную и морфологическую целостность спинного мозга после его и полного или частичного пересечения, а также при контузии и разрыве.

Известно, что несмотря на успехи современной хирургии в стабилизации позвоночника, подавляющее большинство пациентов с позвоночно-спинномозговой травмой, сопровождающейся значительным повреждением спинного мозга, не восстанавливаются, и неврологический дефицит сохраняется на всю жизнь [1].

Проблема восстановления спинного мозга обусловлена его гистологической структурой, и биохимическими процессами, протекающими в месте травмы. В отличие от шванновских клеток в периферической нервной системе, глиальные клетки в спинном мозге не способствуют восстановлению и росту аксонов, а напротив, препятствуют. Высвобождающиеся из разрушенных клеток вещества индуцируют вторичное повреждение, которое распространяется за границы первичной травмы, делая большую часть нервной ткани нежизнеспособной, а соответственно и не способной к репарации. Образующийся глиальный конгломерат в дальнейшем претерпевает кистозную трансформацию, что уже является механическим барьером для восстановления спинного мозга [2].

За последние 15 лет мировой наукой накоплены сведения о репаративных свойствах хитозана [3] и полиэтиленгликоля при травме спинного мозга [4, 5]. Предполагается, что хитозан усиливает процессы аксональной репарации, а также является нейропротектором, ограничивая увеличение вторичного повреждения. Полиэтиленгликоль, предположительно увеличивает текучесть разрушенных аксональных мембран, индуцируя их слияние. Эти эффекты были выделены нами как ведущие.

Известны способы восстановления спинного мозга с применением трансплантатов, например интеграция линии эмбриональных стволовых клеток мыши, в место травмы спинного мозга [6]. Имеются способы с применением буферных сред, например использование гидрогеля, для замещения травмированного участка спинного мозга [7].

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является методика восстановления функций спинного мозга на основе хирургической техники [8]. Способ заключается в плотном сопоставлении отрезков спинного мозга, наложении узловых швов в проекции зубчатых связок, выполнении крестообразных разрезов твердой мозговой оболочки, наложении шва на мягкую мозговую оболочку, с последующей пластикой твердой мозговой оболочки и оментомиелопексией. Способ дополняется проведением высокоинтенсивной импульсной магнитной терапии аппаратом АМИТ-01.

Однако при применении трансплантатов и буферных сред, моделировалось частичное повреждение спинного мозга и не применялись техники сопоставления спинного мозга, а в случае сугубо хирургического решения проблемы, игнорировался факт отсутствия буферных сред, индукторов репарации и рост вторичного очага.

Целью предлагаемого технического решения является восстановление функциональной и морфологической целостности спинного мозга после его полного или частичного пересечения, а также при его контузии и разрыве.

Технический результат предлагаемого решения достигается путем получения конъюгата хитозана и полиэтиленгликоля (ПЭГ-хитозан), для взаимного усиления их эффекта, и его интраоперационного введения в диастаз спинного мозга после иссечения его нежизнеспособной части, с последующим сближением отрезков спинного мозга, и одновременным введением водного раствора полиэтиленгликоля внутривенно.

Предлагаемый способ обладает следующими отличительными признаками:

1) поперечным иссечением ткани спинного мозга в пределах жизнеспособной ткани, формированием ровных, гладких поверхностей, для их дальнейшего сопоставления;

2) синтезируемым препаратом конъюгата полиэтиленгликоля и хитозана (ПЭГ-хитозан), введением его интраоперационно в диастаз спинного мозга, с сопоставлением концов спинного мозга;

3) внутривенным введением водного раствора полиэтиленгликоля, его системным действием и увеличением биодоступности на микроциркуляторном уровне для спинного мозга на всем протяжении, и усилением в результате местного эффекта от ПЭГ-хитозана;

4) отсутствием необходимости в проведении оментомиелопексии и крестообразных разрезов твердой мозговой оболочки;

Способ осуществляют следующим образом.

Путем ковалентного связывания ПЭГ с фотосшитым хитозаном получают препарат конъюгата ПЭГ-хитозана. Для этого 400 мг хитозана растворяют в 25 мл 50% водного диметилсульфоксида, затем к раствору добавляют смесь 300 мкл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина, 90 мг 4-азидобензойной кислоты и 140 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида в 2 мл 50% водного диметилсульфоксида. После чего рН раствора доводят 1 М раствором соляной кислоты до 5. Реакционную смесь выдерживают в течение 24 ч при комнатной температуре в защищенной от света колбе при интенсивном перемешивании. Осадок 4-азидобензойной кислоты удаляют центрифугированием при 12000 об/мин в течение 1 часа. 4-Азидобензоил хитозан очищают щелочным осаждением 1 М гидроксидом калия, с последующим кислотным растворением не менее 5 раз.

Для проведения фотополимеризации осадок 4-азидобензоил хитозана суспензируют в фосфатно-солевом буфере (40 мг/мл) и облучают УФ-лампой в течение 10 мин при интенсивном перемешивании. Затем к суспензии фотосшитого хитозана добавляют 400 мг ПЭГ и 150 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида и выдерживают смесь в течение 24 часов при комнатной температуре, при интенсивном перемешивании. Конъюгат ПЭГ-хитозана отделяют центрифугированием и дважды промывают фосфатно-солевым буфером и водой I типа, после чего растворяют осадок в фосфатно-солевом буфере до концентрации 20 мг/мл.

Возможность реализации предлагаемого изобретения была подтверждена экспериментом на 40 кроликах, весом от 1,8 до 2,5 кг. Животных разделили на 3 группы: первую, вторую и третью - контрольную, с подгруппами А и В. После наркотизации животных золетил-ксилазиновой смесью (1:4), подготавливают операционное поле шириной 5 см, протяженностью от шейного до поясничного уровня. Животное фиксируют на операционном столе в положении на животе. Операцию выполняют с помощью микрохирургической техники под операционным микроскопом. Выполняют линейный разрез в проекции остистых отростков от V грудного до I поясничного позвонков, производят послойный доступ и скелетирование дужек VII, VIII, IX грудных позвонков. Выполняют ляминэктомию указанных дужек, визуализируют твердую мозговую оболочку спинного мозга. Последнюю, вскрывают продольно и разводят в стороны нитями-держалками. Мягкую мозговую оболочку надсекают поперечно. Добиваются тщательного гемостаза. В субдуральное пространство вводят 0,1 мл конъюгата ПЭГ-хитозана так, чтобы спинной мозг был погружен в него. Спинной мозг пересекают поперечно и резецируют на протяжении 1 мм лезвием скальпеля №11. Останавливают кровотечение, накладывают наводящие узловые швы нейлоном 9/0 на мягкую мозговую оболочку. В диастаз вводят 0,2 мл конъюгата ПЭГ-хитозана, после чего ушивают твердую мозговую оболочку обвивным швом про леном 8/0. В перидуральное пространство устанавливают дренажную трубку. Рану ушивают послойно. Внутривенно выполняют инъекцию 5 мл водного раствора полиэтиленгликоля. Животных в течение 12 часов поддерживают в состоянии седации в жестком ортезе, периодически опорожняют мочевой пузырь. На 2-й день убирают дренажную трубку. В течение 10 дней применяют анальгетики, противовоспалительные препараты, антибиотики.

У животных первой группы (N=15) пересекали только половину поперечника спинного мозга.

У животных второй группы (N=15), спинной мозг пересекали полностью.

В третьей группе - контрольной (N=10), ПЭГ-хитозан не применяли, у 5-ти животных группы (подгруппа А) выполнена гемисекция спинного мозга, и у 5-ти животных (подгруппа В) - полное поперечное пересечение.

Результаты первой группы: из 15 животных выжили только 10. У животных в течение первых 3-4 дней сохранялись явления нижней моноплегии, затем в срок до 1 месяца двигательная и чувствительная функции были полностью восстановлены.

Результаты второй группы: из 15 животных выжили только 8. У животных в течение первых 5-6 дней сохранялась нижняя параплегия, которая затем сменилась парапарезом и в течение 30-45 дней двигательная и чувствительная функции полностью восстановилась.

Результаты третьей группы: из подгруппы А выжило 3 животных, из подгруппы В выжило 2 животных. У всех отмечался стойкий неврологический дефицит.

При гистологическом исследовании спинного мозга опытных животных выявлены «аксональные мостики», укрупнение некоторых глиальных клеток. В остальном картина мало отличалась от гистологической картины нормального спинного мозга. В контрольной группе, в месте травмы, отмечались явления кистозно-глиозной трансформации с элементами фиброза, отдельными очагами некроза, с различной степенью его организации.

Таким образом, результаты исследований дают основание утверждать, что в условиях данного эксперимента, конъюгат ПЭГ-хитозан вместе с хирургическим сопоставлением отрезков спинного мозга, способствуют восстановлению функций спинного мозга, что подтверждается клинически и морфологически. Предлагаемый препарат действует местно, вероятно создавая буферную среду для аксонального роста, ограничивая развитие вторичного повреждения нервной ткани, способствуя слиянию мембран поврежденных клеток. Количество введения препарата в субдуральное пространство и диастаз, может варьироваться от 0,1 мл до 10 мл, в зависимости от размеров спинного мозга объекта.

При обширных повреждениях спинного мозга, возможно расширение хирургического пособия и выполнение вертерброэктомии для облегчения сопоставления отрезков спинного мозга, и установка позвоночных металлоконструкций для стабилизации. Данный способ также может быть дополнен последующим комплексом реабилитации, включающим электротерапию, магнитотерапию.

Изобретение может быть применено в нейрохирургии, для лечения пациентов с травмой спинного мозга, а также с иными ограниченными поражениями спинного мозга.

Источники информации

1. Воронович И.Р., Белецкий А.В., Дулуб О.И., Макаревич СВ. и др. Диагностика и лечение травматических полисегментарных поражений спинного мозга. Матер, научн. конф. посвящ. 40-летию отделения патологии позвоночника «Хирургия позвоночника - полный спектр». М. 2007. С.281-283.

2. Смирнов В.А., Гринь А.А. Регенеративные методы лечения травмы спинного мозга. Обзор литературы. Часть 1. Нейрохирургия 2019; 21(2):66-75.

3. Canavero S, Ren X, Kim CY. Reconstructing the severed spinal cord. Surg Neurol Int. 2017; 8:285. Published 2017 Nov 21. doi: 10.4103/sni.sni_406_17.

4. Cho Y, Borgens RB. Polymer and nano-technology applications for repair and reconstruction of the central nervous system. Exp Neurol. 2012; 233 (1): 126-144. doi:10.1016/j.expneurol. 2011.09.28.

5. Kouhzaei S, Rad I, Mousavidoust S, Mobasheri H. Protective effect of low molecular weight polyethylene glycol on the repair of experimentally damaged neural membranes in rat's spinal cord. Neurol Res. 2013; 35 (4): 415-423. doi: 10.1179/1743132812Y.0000000133.

6. Патент RU №2489176 C1. Способ тканевой инженерии спинного мозга после его анатомического разрыва. - МПК₇ А61М 37/00 (2006.01), A61K 35/48 (2006.01), A61K 31/722 (2006.01), A61K 31/726 (2006.01), А61Р 25/00 (2006.01) - 14.02.2012)

7. Патент RU №2644278 С1. Способ микрохирургической реконструкции спинного мозга на животной модели с использованием биодеградируемого гидрогеля на основе поливинилового спирта. - МПК₇: G09B 23/28 (2006.01), A61K 31/74 2006.01), А61Р 41/00 (2006.01) - 21.12.2016.

8. Патент RU №2341830 С1. Способ восстановления функций спинного мозга при моделировании его полного анатомического перерыва в остром периоде в эксперименте. - МПК₇: G09B 23/28 (2006.01), А61В 17/00 (2006.01), A61K 31/02 (2006.01), A61N 2/00 (2006.01) - 26.06.2007.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, нейрохирургии и регенеративной медицине, и может быть использовано для восстановления функций спинного мозга после его пересечения. Осуществляют синтез ПЭГ-хитозана, путем ковалентного связывания ПЭГ с фотосшитым хитозаном. После доступа к спинному мозгу и надсечения мягкой мозговой оболочки в субдуральное пространство вводят синтезированный методом ковалентного связывания препарат конъюгата ПЭГ-хитозана, пересекают и резецируют спинной мозг в пределах жизнеспособной части. Затем осуществляют введение конъюгата ПЭГ-хитозана в субдуральное пространство и диастаз спинного мозга в количестве, необходимом для покрытия поверхности отрезков спинного мозга и заполнения диастаза. Производят сближение отрезков спинного мозга, наложение швов на мягкую мозговую оболочку, ушивание твердой мозговой оболочки и внутривенную инъекцию водного раствора полиэтиленгликоля. Способ обеспечивает восстановление функциональной и морфологической целостности спинного мозга после его полного или частичного пересечения, а также при его контузии и разрыве за счет интраоперационного введения в диастаз спинного мозга конъюгата хитозана и полиэтиленгликоля.

Способ восстановления функций спинного мозга после его пересечения, с помощью конъюгата ПЭГ-хитозана, включающий хирургическое сопоставление отрезков спинного мозга, отличающийся тем, что осуществляют синтез ПЭГ-хитозана путем ковалентного связывания ПЭГ с фотосшитым хитозаном: после доступа к спинному мозгу и надсечения мягкой мозговой оболочки в субдуральное пространство вводят синтезированный методом ковалентного связывания препарат конъюгата ПЭГ-хитозана, пересекают и резецируют спинной мозг в пределах жизнеспособной части с последующим введением конъюгата ПЭГ-хитозана в субдуральное пространство и диастаз спинного мозга в количестве, необходимом для покрытия поверхности отрезков спинного мозга и заполнения диастаза, затем производят плотное сближение отрезков спинного мозга, наложение швов на мягкую мозговую оболочку, ушивание твердой мозговой оболочки и внутривенную инъекцию водного раствора полиэтиленгликоля.