Способ доставки бактериофага к бактериальному возбудителю инфекции в ране Российский патент 2022 года по МПК A61K35/76 A61P31/04 A61G10/00 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, и может быть использовано для лечения бактериальных раневых инфекций, а также инфекции в области хирургического вмешательства, любой локализации.

Накопленный за десятилетия опыт работы с бактериофагами, подтвержденный строго доказанными научными фактами, позволяет выделить несколько важнейших областей применения этих вирусов: молекулярная биология и методы геномного редактирования, создание нанообъектов заданной структуры, получение биологически активных веществ из фаговых ферментов, разработка диагностических систем, биологическая дезинфекция в пищевой промышленности, сельском хозяйстве, ветеринарии и медицине. Наиважнейшим направлением развития науки о медицинском использовании препаратов бактериофагов, бесспорно, считается разработка инновационных технологий лечения и профилактики инфекционных болезней, с помощью которых человечества может значительно повлиять на развитие персонализированной медицины [1,2].

В XXI веке интенсификация исследований по клиническому использованию коммерческих препаратов и адаптированных бактериофагов связана с целом рядом объективных причин. Несмотря на высокотехнологичную направленность современного здравоохранения, остро стоит вопрос о создании принципиально новых антибактериальных препаратов и сохранении потенциала уже использующихся антибиотиков. Во многом, триггерами таких процессов является нарастающее количество сообщений о фактах выделения антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, необоснованная стратегия и тактика применения антибиотиков, неэффективность или невозможность применения антибиотиков для коморбидных пациентов в целом. Кроме того, доказанная возможность внутрибольничного инфицирования (а не только внебольничного) и сложность контроля эпидемического процесса инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, также заставляют вновь задумываться о терапевтических и противоэпидемических возможностях фагов, расширении сфер их использования и поиске наиболее эффективных способов применения [3,4,5]. В принятой Правительством РФ «Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в РФ на период до 2030 года» в рамках ограничения распространения антимикробной устойчивости четко сформулирована необходимость разработки новых средств профилактики, в том числе на основе бактериофагов, а также оптимизации их применения (разработка регламента) в различных областях здравоохранения. В этом программном документе отведено особое место интеграции практики применения бактериофагов с современными технологиями лечения пациентов и реализации персонифицированного подхода к фаготерапии и фагопрофилактике. Еще одной причиной вновь возросшего интереса к клиническому использованию бактериофагов, несомненно, выступает серьезная потребность у практикующих врачей к использованию в их рутинной практике научно обоснованных рекомендаций по рациональному назначению бактериофагов, чьи положения согласовывались бы с принципами доказательной медицины (доказанная безопасность и эффективность, изучение фагов в исследованиях с корректным дизайном и достаточной статистической мощностью, систематическое обобщение постоянно обновляющейся информации о терапевтическом применении фагов с возможной объективной оценкой на основе мета-анализа и пр.) [6,7,8].

Особую роль играет назначение препаратов бактериофагов у больных с раневой инфекцией и особенно – с ИСМП, прежде всего инфекциями в области хирургического вмешательства [9]. Инфекционные осложнения ран, как вне-, так и внутрибольничного характера, характеризуются высокой распространенностью, встречаются и у детей, и у взрослых, регистрируются в различных странах, независимо от уровня доходов. В числе указанных нозологий раневая инфекция при наличии ожогов отличается чрезвычайной серьёзностью, приносит большие страдания пациенту и требует достаточного длительных курсов лечения и реабилитации. Следовательно, с учетом имеющегося международного опыта представляется целесообразным отметить следующие основы, обусловливающие широкое применению препаратов фагов в лечебно-профилактических целях при рассматриваемой патологии: 

1) эффективность в отношении инфекций, вызванных антибиотикорезистентными вариантами бактерий (в т.ч. панрезистентными микроорганизмами), в частности, ИСМП.

2) возможность применения при аллергических реакциях на антибиотики.

3) привлекательный профиль безопасности фаговых препаратов, а значит потенциал к их назначению у детей, беременных и кормящих женщин, а также – у коморбидных пациентов. 

4) высокая специфичность, отсутствие негативного влияния на нормальную микрофлору человека, отсутствие отрицательного воздействия на иммунную систему.

5) высокая эффективность в терапии хронических инфекций, особенно ассоциированных с формированием биопленок.

Лечение раневых инфекций – сложный терапевтический процесс, неотъемлемым компонентом которого является ликвидация этиологического фактора, в купе с ослаблением инфекционно-воспалительной. Применение бактериофагов в этом случае позволит избежать полипрагмазии, что свойственно традиционной антибактериальной фармакологической терапии, а также сделает облегчит процесс подбора литического бактериофага как важного прогностического фактора успешности лечения раневой инфекции. Также отметим и возможность полного сочетание с другими лекарственными препаратами, в том числе при комбинированной терапии с различными антимикробными средствами [1,2,10]. Одним из лимитирующих факторов использования различных способов локального лечения в том числе является чувствительность раневой ожоговой поверхности к температурным и влажностным характеристикам окружающей среды. Известно, что рана заживает быстрее в определенных физиологических условиях, в частности постоянной температуре на уровне 36°С, влажности, оптимальной для регенерации поврежденных тканей, изоляции раны от инфицирования. Поэтому одним из существенных факторов заживления раны выступает влажная раневая среда, которая способствует делению клеток и аутолизу пораженных тканей. При заживлении раны в условиях влажной среды сохраняются факторы роста, снижается вероятность вторичного повреждения тканей. Необходимые постоянные влажностно-температурные характеристики среды возможно достичь только с помощью устройства управляемой влажной среды.

Способы применения лечебно-профилактического бактериофага детально отражены в [11] и при лечении раневой инфекции учитывают стадийность раневого процесса, характер сопоставления и сближения краев и стеной раны, происхождение раны и локализацию гнойно-воспалительного процесса. Эффективное введение лечебно-профилактических препаратов бактериофагов при лечении раневой инфекции имеет особое значение, несмотря на большую известность и популярность местного применения, напр., в виде орошения или аппликаций кожи и слизистых, примочек и тампонирования. Актуальность разработки усовершенствованных способов вызвана прежде всего необходимостью «адресно» доставлять препарат, а также пролонгировать нахождение бактериофага в патологическом очаге без травмирующего действия раневой повязки.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату, выбранным в качестве прототипа, является аппликационный способ нанесения антимикробного препарата на рану. Традиционный способ местного применения бактериофагов заключается в поддержании влажной среды вокруг раневой поверхности путем орошения раны и повязки с раствором, содержащим бактериофаги.

Однако этот способ имеет недостатки:

1) поскольку при высыхании марлевой повязки активность бактериофагов резко падает, необходимо повторное периодическое обильное смачивание повязки раствором бактериофага и частые перевязки, и не обеспечивает покой ране;

2)частые смачивания повязки ведут к нецелевому расходованию трудовых, временных и материальных ресурсов в медицинской организации;

Указанные недостатки значительно снижают эффективность способа.

Задачи заявляемого решения – способ доставки бактериофага, путем аэрозольного нанесения бактериофага в условиях управляемой влажной среды.

Технический результат, достигаемый при использовании предлагаемого способа, – расширение арсенала технических средств для специфического этиологического воздействия на возбудителя раневой инфекции, в том числе при антибиотикорезистентых штаммах микроорганизма, вне- или внутрибольничного происхождения, повышение эффективности бактериоцидного воздействия, оказываемого на возбудителя инфекции, за счет оптимальных температурно-влажностных условиях управляемой среды и бактериофага.

Технический результат, достигигается тем, что в способе доставки бактериофага к бактериальному возбудителю инфекции в ране, включающем выбор бактериофага с литической активностью не менее «++++» для выделенного возбудителя бактериальной инфекции, 6 мл бактериофага подают через небулайзер, введенный в камеру устройства управляемой влажной среды, на протяжении 60 минут при создании влажной среды с параметрами температуры 36°С и влажности 75%.

Способ осуществляют следующим образом:

Выполняют этиологическую расшифровку раневой инфекции согласно МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологическую лабораторию», приказу Минздрава СССР от 22.04.1985 №535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений», изучении чувствительности микроорганизма к лечебно-диагностическому бактериофагу с использованием spot-метода согласно «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике: федеральные клинические (методические) рекомендации» (2014). Подбирают специфический бактериофаг (моно-или поливалентный) с литической активностью не менее «++++». Используют устройство управляемой влажной среды, например, полезную модель RU 183680, в камере которого выполнено отверстие с фиксированным в нем патрубком, соединенным с внутренней стороны камеры дисковой площадкой, предотвращающей повреждение камеры, обеспечивающими герметичность соединения, внутренний диаметр которого соответствует внешним размерам загубника небулайзера. В камеру устройства управляемой влажной среды помещают объект с раневой поверхностью. Лечебно-профилактический бактериофаг в объеме 6 мл заливают в подготовленную (очищенную и высушенную) емкость для лекарственных средств компрессорного небулайзера. Загубник небулайзера вставляют в патрубок. В устройство управляемой влажной среды заливают дистиллированную стерильную воду и устанавливают параметры устройства на значениях температуры 36°С и влажности 75%. Включают небулайзер на 60 минут.

Распыления аэрозоля с фаговыми частицами в камеру устройства происходит с помощью небулайзера, подключенного через загубник к подающей трубе через герметичное технологическое отверстие. При включении небулайзера, дисперсное лекарственное вещество смешивается с подготовленным воздухом и попадает в бокс устройства управляемой влажной среды.

Для доказательства сохранения активности бактериофага в условиях управляемой влажной среды были проведены экспериментальные лабораторные исследования, в которых изучалась выживаемость в аэрозоле и заданных температурно-влажностных условиях фаговых частиц. В качестве микроорганизма использовались тест-культуры S. aureus с изученными свойствами (тест-штамм и клинический штамм, выделенный из раневого отделяемого пациента с ожоговой раной). Согласно тестируемым микроорганизмам были использованы следующие коммерческие препараты лечебно-профилактических бактериофагов «Бактериофаг стафилококковый жидкий».

При использовании spot-метода было выявлено, что штаммы были чувствительны к соответствующему препарату лечебно-профилактического бактериофага. Был проведен лабораторный эксперимент по оценки выживаемости фага в аэрозоле и его воздействия на возбудителя инфекции в условиях управляемой влажной среды. В ламинарном шкафу воссоздали условия управляемой влажной среды, собрали установку устройства, подключили небулайзер, заложили в камеру устройства чашки Петри со стерильный подсушенным агаром, после герметизации установки, включили устройство управляемой среды и небулайзер, задали параметры среды температура 36°С и влажность 75%. Время работы устройства составляло 30, 60, 120 мин, после каждого временного интервала производился смыв с чашек Петри, ,2 мл смыва смешиваются 0,2 мл суспензии тест-культуры, добавляется 5 мл 0,2% полужидкого агара Мюллер-Хинтон, затем выливается на стерильную, предварительно подсушенную чашку Петри с агаром Мюллер-Хинтон. Оставляются чашки на столе до полного застывания и склеивания слоев агара, после застывания двойного агара, переворачиваются чашки и погружаются в термостат (24-48 часов при температуре 36-37°С). По окончанию термостатирования учитываются результаты (количество лизированных точек, подсчет бляшкообразующих единиц (БОЕ)).

Дальнейшие результаты исследования оценивались исходя из следующего предположения: при отсутствии негативного (разрушающего) действия среды на фаговые частицы присутствие бактериофага определяют по наличию прозрачных пятен (с подсчетом их количества), хорошо видимых на матовом фоне глубинного роста бактерий (метод Грациа).

Результаты эксперимента показали, что при аэрозольном способе применения бактериофага в условиях управляемой влажной среды наличие специфической активности бактериофага в отношении индикаторной культуры сохраняется в течение времени наблюдения. По результатам эксперимента в питательной среде образуются негативные колонии, округлой формы, с четкими ровными краями, размер ∅3-4 мм, присутствуют сливные негативные колонии. Суммарное количество до 120 БОЕ. Количество БОЕ при этом снижается с увеличением времени.

Таким образом, при проведении лабораторных исследований была подтверждена возможность применения бактериофагов в условиях управляемой влажной среды, сохранeние высокую литическую активность в аэрозоле жидкого препарата бактериофага в течение времени в заданных и поддерживаемых параметрах температуры и влажности.

Приводим экспериментально-лабораторные примеры использования предложенного способа.

Пример 1. От пациента с инфицированной ожоговой раной был взят клинический материал – раневое отделяемое), в лабораторных условиях произошло выделение, идентификация, изучение фенотипических свойств клинического штамма, а именно был выделен S. aureus, резистентный к 4 из 10 тестируемым антибиотикам, чувствительный к стафилококковому бактериофагу «++++». Культура микроорганизма, выращенная на плотной питательной среде в течение 18-24 часов, до эксперимента смывалась стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Бактериальная суспензия микроорганизма доводилась до мутности, соответствующей концентрации 1,5×108 клеток/мл, что соответствует 0,5 единицам Мак-Фарланда. В предварительно продезинфицированную камеру устройства управляемой влажной среды закладываются чашки Петри с агаром Мюллер-Хинтон: 2 штуки - стерильный подсушенный агар. В чашу небулайзера наливали 6 мл бактериофага, направляли распыление в камеру. За 15 минут до окончания эксперимента делается суспензию тестируемой культуры заданной мутности. Подключаем установку влажной среды. Задаем параметры на установке: температура 36°С и влажность 75%, подключаем небулайзер. Смывы с каждой чашки берутся через 60 мин после работы 2 мл стерильного физиологическим раствором, далее по методу Грации происходит изучение концентрации фаговых частиц в БОЕ на мл. Получены результаты – в агаре идентифицированы негативные колонии, округлой формы, с четкими ровными краями, размер 3-4 мм в диаметре, есть сливные негативные колонии, суммарное количество – 100-120 БОЕ. Таким образом при аэрозольном способе доставки бактериофага в условиях управляемой среды фаг оседал на горизонтальную поверхность чашки Петри, происходило сохранение его литической активности, бактерицидное действие на клинический штамм возбудителя раневой инфекции.

Пример 2. В лабораторных условиях на белой лабораторной крысе при применении контактного воздействия нагретых металлических пластин смоделирована ожоговая рана II ст., площадью 200 мм2, для её инфицирования использовался тест-штамм S.aureus №906 с изученными фенотипическими свойствами, чувствительный к стафилококковому бактериофагу «++++». На 2, 3, 4 сутки инфицирования лабораторное животное на 60 мин помещали в камеру устройства управляемой влажной среды подключенного совместно к небулайзеру для реализации аэрозольного способа доставки специфического фага к возбудителю бактериальной инфекции в ране. Микробиологическое исследование раневого отделяемого и клинический осмотр раны производили на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 сутки инфицирования. На 1-2 сутки инфицирования: состояние краев ран – отек, гиперемия сильно выражены, из раны умеренное гнойное отделяемое, грануляций нет, эпителизации нет, из раны выделяется S.aureus №906. На 3-4 сутки инфицирования: состояние краев ран - отек, гиперемия умеренные, отделяемое скудное гнойное, эпителизация раны слабо выражена, из раны на 3 сутки выделяется S.aureus №906, на 4 сутки – роста нет. На 5-6 сутки инфицирования: состояние краев ран - отек, гиперемия отсутствуют, отделяемого нет, эпителизация раны краевая и очаговая, бактериологический посев дал отрицательный результат. На 7 сутки инфекционный процесс в ране полностью купирован, эпителизация раны краевая и очаговая активная практически на всей поверхности завершена.

Проведенные сравнительные исследования позволяют говорить о следующих преимуществах заявляемого изобретения:

1) в условиях управляемой влажной среды обеспечено максимальное присутствие и сохранение концентрации бактериофага, за счет контроля других физических факторов, которые могут повлиять на его биодоступность препарата не зависит от других биохимических процессов; исходная активность фагов способствует проявлению их бактерицидный эффект сразу после встречи с клеткой-мишенью;

2) физико-химические и биологические свойства литического бактериофага за время нахождения в управляемой влажной среде не изменяются, что обеспечивает транспорт фаговых частиц в патологический очаг в максимально активном состоянии;

3) использование управляемой влажной среды способствует стойкому положительному результату бактериофаготерапии, в том числе вызванных антибиотикорезистентными штаммами;

4) введение бактериофагов в условиях искусственной среды может совмещаться и с комплексной терапией, совместим с любыми лекарственными препаратами, не имеет противопоказаний в отношении возраста пациента;

5) данный способ доставки бактериофага реализуется неинвазивной технологией, что имеет положительный эффект у пациентов детского возраста, а также минимизирует риск развития внутрибольничных инфекционных осложнений вследствие нарушения цеклостности кожного покрова, слизистых.

6) конструктивные особенности устройства для генерирования управляемой влажной среды позволяют изготавливать его компоненты с учетом импортозамещения.

Способ доставки бактериофага к бактериальному возбудителю инфекции в ране, основанный на воздействии бактериофагом на этиологический агент инфекции в условиях управляемой влажной среды, отличается наличием возможности объективного контроля всех необходимых физических и биологических параметров среды; возможностью стандартизации использования фаговых препаратов; возможностью воздействовать на раневые поверхности различной площади; способностью предотвращать преждевременное подсыхание перевязочного материала, пропитанного жидким препаратом; возможностью сочетания местного воздействия и присутствия фага в воздушной среде (при соответствующей модификации рабочей камеры).

Литература:

1. Valente L, Prazak J, Que YA, Cameron DR. Progress and pitfalls of bacteriophage therapy in critical care: A Concise Definitive Review. Crit Care Explor. 2021 Mar 8;3(3):e0351.

2. Liu D, Van Belleghem JD, de Vries CR, Burgener E et al. The safety and toxicity of phage therapy: a review of animal and clinical studies. Viruses. 2021 Jun 29;13(7):1268.

3. Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике. Федеральные клинические рекомендации. - Москва, 2014. – 39 с.

4. Костюкевич О.И. Применение бактериофагов в клинической практике: эпоха Возрождения // РМЖ. 2015. № 21. С. 1258–1262.

5. Gelaman, Yerushalmy O, Alkalay-Oren S, Chani R et al. Clinical Phage Microbiology: a suggested framework and recommendations for the in-vitro matching steps of phage therapy. Lancet Microbe. 2021; 10.1016/S2666-5247(21)00127-0.

6. Sulakvelidze A., Alavidze Z., Morris J.G.Jr. Bacteriophage therapy // Antimicrobal Agents and Chemotherapy. 2001. Vol. 45. No. 3. P. 649–659.

7. Sillankorva S.M., Oliveira H., Azeredo J. Bacteriophages and their role in food safety // Int. J. Microbiol. 2012. 863945. 10.1155/2012/863945.

8. Housby J.N., Mann N.H Phage therapy // Drug Discov. Today. 2009. Vol. 14. Р. 536–540. 10.1016/j.drudis.2009.03.006.

9. Асланов, Б.И. Бактериофаги - эффективные антибактериальные средства в условиях глобальной устойчивости к антибиотикам / Б.И. Асланов // Медицинский Совет. – 2015. - №(13). – С. 106-111. https://doi.org/10.21518/2079-701X-2015-13-106-111

10. Додова, Е.Г. Постантибиотиковая эра: бактериофаги как лечебная стратегия / E.Г. Додова, Е.А. Горбунова, И.А. Аполихина // Медицинский вестник. - 2015. - №1. - С. 49-53

11. Бактериофаги. Общая фармакопейная статья. ОФС.1.7.1.0002.15. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II.

12. Патент на полезную модель № RU 147611 от 11.06.2014 "Устройство для лечения ран в условиях влажной среды".

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, вирусологии и хирургии, и может быть использовано для лечения бактериальных раневых инфекций, а также инфекции в области хирургического вмешательства любой локализации. Осуществляют выбор бактериофага с литической активностью «++++» для выделенного возбудителя бактериальной инфекции. Используют устройство для формирования в его камере влажной среды заданной температуры и влажности, в камере выполнено отверстие с герметично фиксированным в нем патрубком, внутренний диаметр которого соответствует внешним размерам загубника компрессорного небулайзера. В рабочую камеру устройства помещают объект с раневой поверхностью. Бактериофаг в объеме 6 мл заливают в емкость для лекарственных средств компрессорного небулайзера. Загубник компрессорного небулайзера вставляют в патрубок устройства, устанавливают параметры устройства на значениях температуры 36°С и влажности 75%, включают компрессорный небулайзер на 60 минут. Способ обеспечивает повышение эффективности бактериоцидного воздействия, оказываемого на возбудителя инфекции, за счет оптимальных температурно-влажностных условиях управляемой среды и бактериофага. 2 пр.

Способ доставки бактериофага к бактериальному возбудителю инфекции в ране, включающий выбор бактериофага с литической активностью «++++» для выделенного возбудителя бактериальной инфекции, отличающийся тем, что используют устройство для формирования в его камере влажной среды заданной температуры и влажности, в камере выполнено отверстие с герметично фиксированным в нем патрубком, внутренний диаметр которого соответствует внешним размерам загубника компрессорного небулайзера; в рабочую камеру устройства помещают объект с раневой поверхностью; бактериофаг в объеме 6 мл заливают в емкость для лекарственных средств компрессорного небулайзера; загубник компрессорного небулайзера вставляют в патрубок устройства; устанавливают параметры устройства на значениях температуры 36°С и влажности 75%; включают компрессорный небулайзер на 60 минут.