Способ лечения инфекции, связанной с оказанием медицинской помощи, вызванной возбудителем или возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью Российский патент 2018 года по МПК A61K35/76 A61P31/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, микробиологии, может быть использовано при лечении инфекции, связанной с оказанием медицинской помощи (ИСМП), вызванной возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью.

ИСМП представляет собой любое клинически выраженное заболевание микробного происхождения, которое поражает больного в результате его поступления в больницу или обращения за медицинской помощью вне зависимости от появления симптомов заболевания у пациента во время пребывания в стационаре или после его выписки, а также инфекционное заболевание сотрудника лечебной организации вследствие его инфицирования при работе в данной организации. К наиболее часто встречающимся ИСМП могут быть отнесены ИВЛ-ассоциированные пневмонии, катетер-ассоциированные инфекции мочевых путей и кровотока.

Проблема ИСМП является одной из важнейших для современного здравоохранения, принимая во внимание растущую резистентность штаммов-возбудителей ИСМП к большинству антибиотиков и широкое распространение в условиях внутрибольничной среды.

Данные опубликованных научных исследований свидетельствуют о том, что 5-10% находящихся в стационарах пациентов страдают ИСМП, что соответствует 2-2,5 млн человек в год. С учетом высокого коэффициента смертности, достигающего в отделениях высокого риска, к которым в первую очередь относятся отделения реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) - 80%, ИСМП занимают десятую строчку в ряду причин смертности населения нашей страны.

По данным ряда европейских и американских медицинских общественных организаций ИСМП поражают в среднем 5-15% госпитализированных пациентов, а в отделениях высокого риска до 40% больных. Социальный и экономический ущерб, наносимый ИСМП, ежегодно составляет в США около 55-60 млрд долларов; в странах ЕЭС - 13-24 млрд евро; в Великобритании - около 10 млрд фунтов стерлингов; в России 10-15 млрд рублей.

Наиболее часто среди возбудителей ИСМП обнаруживают антибиотикорезистентные микроорганизмы, зачастую обладающие множественной лекарственной устойчивостью, способные формировать резистентность к основным классам антимикробных препаратов.

Одним из альтернативных подходов к уничтожению патогенных бактерий практически во всех без исключения отраслях производственной деятельности человека, включая медицину, являются бактериофаги.

Более восьмидесяти лет в бывшем Советском Союзе, а позднее и в Российской Федерации на Уфимском, Пермском и Нижегородском филиалах НПО «Микроген» производятся свыше десятка наименований лекарственных средств, как на основе отдельных видов бактериофагов, так и их комбинаций для лечения и профилактики острых кишечных инфекций и декомпенсированных форм дисбактериоза, а также против возбудителей ряда гнойно-воспалительных заболеваний.

Это жидкие и таблетированные формы лечебных моновалентных препаратов стафилококкового, стрептококкового, коли, клебсиеллезного, сальмонеллезного, дизентерийного, брюшнотифозного, протейного и синегнойного бактериофагов и комбинированные рецептуры, содержащие несколько видов фагов: коли-протейный, пиобактериофаг поливалентный (т.н. секстафаг) и комплексный (против стафило-, стрептококков, клебсиелл, протея, синегнойной и кишечной палочек), интести-бактериофаг (против шигелл, сальмонелл, стафило-, энтерококков, протея, кишечной и синегнойной палочек).

Лекарственные препараты представляют собой стерильные фильтраты бактериальных фаголизатов, их назначают внутрь и местно: орошение ран и слизистых оболочек, введение в полость матки, мочевого пузыря, среднего уха, придаточных пазух носа, конъюнктиву глаза, а также в дренированные полости - брюшную, плевральную, в полости абсцессов после удаления гноя.

Сегодня фаготерапия при лечении ИСМП является эксклюзивным методом оказания медицинской помощи, к которому обращаются только в случае ИСМП, вызванной полирезистентными возбудителями.

Традиционная фаготерапия основана на применении серийно выпускаемых препаратов без учета индивидуализированного подбора штаммового состава бактериофагов. Бактериальные штаммы, вызывающие инфекционные заболевания во внебольничной среде, обладают определенным фено- и генотипическим консерватизмом в сравнении с быстро изменяющимися госпитальными штаммами.

По данным литературы чувствительность возбудителей острых кишечных и респираторных инфекций, циркулирующих во внебольничной среде, к коммерческим препаратам бактериофагов достигает 85-90%, в то время как спектр литической активности последних охватывает лишь 8-10% ИСМП-патогенов (доклад «Ключевые аспекты фаготерапии», Тапальский Д.В., XVI международный конгресс по антимикробной терапии, 21-23 мая 2014 года Москва).

В случае игнорирования индивидуализированного алгоритма подбора бактериофагов можно столкнуться с разницей в составах тестируемого в бактериологической лаборатории стационара и закупаемого родственниками пациента или клиникой для непосредственного проведения фаготерапии препарата: коллекции трех филиалов производителя, выпускающих одноименные препараты бактериофагов различны, ежесерийная смена фагов, осуществляемая в полном соответствии с действующей нормативной документацией на лекарственный препарат для медицинского применения, повышает его эффективность в отношении внебольничных патогенов, но снижает вероятность совпадения анализируемого в конкретный момент времени в лаборатории и назначаемого пациенту в ОРИТ препарата.

Так, чувствительность MRSA штаммов-возбудителей ИСМП, выделенных из клинического материала пациентов, находящихся в ОРИТ нескольких стационаров РФ, к сериям препаратов, содержащих стафилококковые бактериофаги и выпущенным одновременно на филиалах производителя в Уфе и Перми, различна. Чувствительность MRSA-штаммов не совпала и к поли- и моновалентному препарату, выпущенному на одном и том же заводе.

Классическая фаготерапия с помощью коммерческих препаратов бактериофагов не позволяет учесть возникновение штаммо-специфического антифагового иммунного ответа при повторном курсе назначения бактериофагов пациентам, длительно находящимся в стационаре при развитии рецидива инфекционного процесса. Сложности возникают и с самой лекарственной формой серийно выпускаемых бактериофагов, первично ориентированной только на пероральный прием препарата.

Известен способ оценки эффективности фаготерапии при лечении инфекционных заболеваний (RU 2624511, С1), который предполагает введение раствора коммерческого бактериофага в биологический материал больного, определение концентрации бактериофага через 18-24 часа после его введения и вынесение суждения об эффективном воздействии раствора коммерческого бактериофага на целевой патогенный микроорганизм при установлении титра не менее 10⁶ БОЕ/мл, при этом на 4-5 сутки после хирургического вмешательства выполняют повторную оценку эффективности фаготерапии и продолжают фаготерапию, если сделан вывод об ее эффективности.

Однако известный способ предполагает оценку эффективности в процессе лечения, при этом, в случае выявления его неэффективности будет потрачено время на поиск эффективного фага или комбинации фагов. Причем оценка эффективности каждого нового фага также потребует дополнительного времени. Поскольку исследование используемого фага ограничено определенными сроками: предоперационный период и 4-5 сутки после операции, то возможности объективного исследования других фагов в соответствии с известным способом будут упущены, могут быть просто определены показания к смене фага, который также может оказаться неэффективным. При использовании коммерческого фага отсутствие клинического эффекта, особенно при ИСМП, может быть обусловлено отсутствием индивидуального подхода к выбору фага для данного конкретного больного до начала лечения с учетом быстрого изменения циркулирующих в организме больного штаммов-возбудителей, формирования антифагового иммунитета, определения оптимального пути введения и лекарственной формы, содержащей бактериофаг.

Кроме того, нельзя признать адекватным критерий эффективности проводимой фаготерапии известного способа. Важно получить не просто подтверждение наличия титра фага, а оценить отношение фаг/бактерия (множественность инфицирования) оптимальное для размножения in situ. В известном способе не может быть изменена концентрация фага, необходимая пациенту на прием, поскольку коммерческий препарат предполагает жесткую (фиксированную) концентрацию включенного в него фага.

Известен способ лечении ИСМП, вызванной возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью, содержащий рекомендации об использовании фагового препарата неизменного штаммового состава в титре 10⁸ БОЕ/мл при проведении фаготерапии (A.V. Aleshkin et al. Phagebiotics in treatment and prophylaxis of healthcare-associated infections BACTERIOPHAGE, 2016, v. 6, No 4).

Известен способ лечения ИСМП, вызванной возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью (S.S. Bochkareva et al. Anti-phage antibody response in phage therapy against healthcare-associated infections (HAIs), Infectious diseases, 2017, volume 15, No 1, p. 35-40), при котором при проведении повторных курсов фаготерапии производят смену фагового препарата, использованного на первом курсе.

В качестве прототипа нами выбран способ лечения ИСМП, вызванной возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью, предполагающий для сохранения результативности фаготерапии при проведении повторного курса у одного и того же пациента из-за образования антифаговых антител изменение штаммового состава коктейля бактериофагов, а также возможность использования не только пероральной, но и суппозиторной формы препарата (А.В. Алешкин и др. Инновационные направления использования бактериофагов в сфере санитарно-эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации, Бактериология, 2016, том 1, №1, с. 22-31).

Указанные способы лечения ИСМП, включая прототип, содержат лишь некоторые рекомендации, позволяющие варьировать проведение фаготерапии для повышения ее эффективности. В них отсутствуют сведения о приемах, позволяющих персонифицировать использование фагов при лечении ИСМП путем подбора штаммового состава бактериофагов с учетом быстрого изменения циркулирующих штаммов-возбудителей и формирования антифагового иммунитета, выбора новых лекарственных форм и путей введения препаратов.

Техническая проблема заключается в разработке персонифицированной фаготерапии при лечении ИСМП, вызванной возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью, сочетающей в себе индивидуализированный алгоритм подбора оптимального штаммового состава бактериофагов в зависимости от конкретных характеристик возбудителей заболевания, состояния иммунной системы больного, а также выбор пути введения и лекарственной формы, обеспечивающих максимальную доставку фагов к очагу инфекции и длительное персистирование в нем.

Технический результат заключается в повышении эффективности фаготерапии ИСМП, вызванной возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью,

путем персонифицированного подбора штаммового состава бактериофагов за счет повышения точности определения чувствительности возбудителей к тестируемым штаммам бактериофагов и повышения объективизации наличия фагового иммунитета у больных;

установления индивидуальных доз вводимого препарата с учетом отношение количества бактериофагов к титру бактерий-возбудителей;

выбора оптимальных лекарственных форм и путей их введения путем учета локализации инфекционного очага и фармакокинетики отобранных фага или фагов.

Таким образом, нами предложен индивидуализированный (персонифицированный) алгоритм подбора штаммового состава бактериофагов с учетом быстрого изменения циркулирующих штаммов-возбудителей и формирования антифагового иммунитета, предложено также использовать различные лекарственные формы бактериофагов и пути их введения, обеспечивая максимальную доставку фагов к очагу инфекции и длительное персистирование в нем.

Учет антифагового иммунного ответа имеет принципиальное значение для иммунокомпроментированных длительно находящихся в стационаре больных, которые подвержены частым рецидивам инфекционного процесса.

Подбор оптимального пути введения бактериофагов требует не только выбора адекватной лекарственной формы, но и фармакокинетического подтверждения рациональности использования тех или иных штаммов фагов с учетом их биологических свойств.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для лечения ИСМП, вызванной возбудителем или возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью, проводят персонифицированную фаготерапию. При этом подбирают бактериофаг или бактериофаги. Для чего сначала определяют в две стадии чувствительность выделенных от больного бактерий-мишеней к отдельным штаммам вирулентных фагов. При этом на первой стадии используют спот-тест на чашке с бактериальным газоном, посеянным на плотной питательной среде, содержащей 1,5-2% агара, отбирая фаг или фаги под воздействием которых произошел полный или частичный лизис бактериального газона или в зоне нанесенного пятна, есть отдельные негативные колонии. На второй стадии отобранные фаг или фаги каплей объемом 10-100 мкл наносят поверх застывшего второго слоя агаризованной среды в чашку или чашки Петри. При этом первым слоем наносят 1,5-2% питательный агар, на который после его застывания, вторым слоем наносят 0,7% агаризованную среду, содержащую выделенную от больного бактериальную культуру. Для нанесения используют бактериофаги в титре, обеспечивающем множественность инфицирования от 0,01 до 1 с учетом титра бактерии-мишени, высеянной из очага инфекции, Выбирают фаг или фаги, под воздействием которых произошло формирование отдельных негативных колоний или сливной лизис бактериальной культуры. Учет результатов на первой и второй стадии проводят после инкубации чашек при 37°С в течение 18 часов.

Затем с помощью иммуноферментного анализа определяют наличие в сыворотке пациента IgG-антител к выбранному фагу или фагам. После чего проводят реакции нейтрализации, подтверждая нейтрализующие свойства найденных антител и отбирают фаг или фаги, к которым у пациента отсутствуют IgG-антитела, обладающие подтвержденными нейтрализующими свойствами.

Далее, учитывая локализацию инфекционного процесса и фармакокинетику отобранных фага или фагов, определяют один из следующих путей введения: per os, per rectum, ингаляционно, местно и соответствующую этому пути введения лекарственную форму. При этом обеспечивают максимальную доставку фагов к очагу инфекции (возможное падение титра бактериофагов не более чем два порядка от исходно содержащегося в препарате) и длительное персистирование в нем (сохранение бактериофагов в очаге инфекции подтверждалось в течение всего периода выделения из него бактерии-мишени и не менее 24-48 часов после ее элиминации).

Вводят пациенту выбранные фаг или фаги в эффективном количестве, используя определенные путь введения и лекарственную форму.

В частном случае на второй стадии определения чувствительности выделенных от больного бактерий-мишеней к отдельным штаммам вирулентных фагов чашку Петри делят на сектора для проверки различных разведений фага и/или разных фагов на одной чашке одновременно.

При введении пациенту отношение количества бактериофагов к титру бактерий-возбудителей, высеваемых из очага воспаления, составляет от 1 до 100.

Способ осуществляется следующим образом.

Для лечения ИСМП, вызванной возбудителем или возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью проводят персонифицированную фаготерапию.

Сначала выделяют от больного и идентифицируют штаммы бактерий-мишеней. Для этого используют микробиологические методы с посевом патологического материала на несколько видов питательных сред и использованием отечественных и импортных коммерческих биохимических тест-систем. Видовую идентификацию труднокультивируемых микроорганизмов проводили масс-спектрометрическим методом с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI-TOF MS.

На основании определения чувствительности/резистентности выделенных бактериальных штаммов к антимикробным средствам - антибиотикам, антисептикам определяют возбудителей ИСМП, обладающих множественной лекарственной устойчивостью.

Микроорганизмы с множественной лекарственной устойчивостью могут быть тестированы иммуноферментным методом для идентификации фактора, обеспечивающего резистентность. Известные локусы антибиотикорезистентности регистрируют с помощью амплификации со специфическими праймерами в ПЦР-реакции.

Далее отбирают вирулентные штаммы бактериофагов, специфически лизирующие эти патогенные микроорганизмы.

При этом, подбирая бактериофаг или бактериофаги, используют банки или коллекции бактериофагов с известными фено- и генотипическими характеристиками, а также известными особенностями фармакокинетики в организме человека, позволяющими установить оптимальный путь введения и выбрать необходимую лекарственную форму с учетом локализации очага инфекции.

В упомянутых банках собраны вирулентные штаммы, безопасные для применения в клинике. Оценку безопасности производственных штаммов фагов проводят с использованием микробиологических, биохимических, молекулярно-генетические тестов, а также испытаний на лабораторных животных (Киселева И.А. Специализированный продукт диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов: конструирование, технология производства, оценка безопасности и эффективности применения: автореферат диссертации автореферат диссертации кандидата биологических наук: 03.01.06, 03.02.03 - Москва, 2015. - 26 с).

При подборе бактериофагов сначала определяют в две стадии чувствительность выделенных от больного бактерий-мишеней к отдельным штаммам вирулентных фагов.

При этом на первой стадии используют спот-тест на чашке с бактериальным газоном, посеянным на плотной питательной среде, содержащей 1,5-2% агара, отбирая фаг или фаги под воздействием которых произошел полный или частичный лизис бактериального газона или в зоне нанесенного пятна есть отдельные негативные колонии.

На второй стадии отобранные фаг или фаги каплей объемом 10-100 мкл наносят поверх застывшего второго слоя агаризованной среды в чашку или чашки Петри. При этом первым слоем наносят 1,5-2% питательный агар, на который после его застывания, вторым слоем наносят 0,7% агаризованную среду, содержащую выделенную от больного бактериальную культуру. Для нанесения используют бактериофаги в титре, обеспечивающем множественность инфицирования от 0,01 до 1 с учетом титра бактерии-мишени, высеянной из очага инфекции,.

На второй стадии определения чувствительности выделенных от больного бактерий-мишеней к отдельным штаммам вирулентных фагов чашка Петри может быть разделена на сектора для проверки различных разведений фага и/или разных фагов на одной чашке одновременно.

Сложности в интерпретации частичного лизиса бактериального газона в зоне пятна, который может отражать как недостаточный титр бактериофага, так и наличие в культуре бактерии-мишени двух фаготипов, входящих в препарат: чувствительного к бактериофагам, и фагорезистентного. Разрешить сомнения можно с помощью второго этапа определения чувствительности выявленного возбудителя к тестируемому фагу. Второй этап позволяет оценить эффективность фаговой инфекции, т.е. удостовериться в возможности размножения фаговых частиц на штамме-возбудителе при их попадании in vivo в очаг воспаления в титре, соизмеримом с концентрацией вирионов в раститрованном испытуемом препарате.

Выбирают фаг или фаги, под воздействием которых произошло формирование отдельных негативных колоний или сливной лизис бактериальной культуры. Учет результатов на первой и второй стадии проводят после инкубации чашек при 37°С в течение 18 часов.

Использование двухэтапного определения чувствительности выделенных микроорганизмов к тестируемым фагам позволяет исключить все сомнительные случаи, отобрать штаммы бактериофагов, способные к репликации на бактерии-мишени in vivo.

Затем с помощью иммуноферментного анализа определяют наличие в сыворотке пациента IgG-антител к выбранному фагу или фагам, наблюдаемое при наличии антифагового иммунитета, сформировавшегося после первого курса фаготерапии, проведенного в клинике или при самолечении, не отмеченном в анамнезе. Это может привести к неэффективности повторного курса фаготерапии с использованием бактериофагов, назначавшихся больному ранее.

Нежелательный антифаговый иммунный ответ может проявиться на фоне бактериофаг-опосредованной биодезинфекции помещения, где расположен больной, так как фаги, используемые для обработки больничной среды, и в составе коммерческих препаратов бактериофагов, используемых для терапии, совпадают (Приложение 1 «Наименование лечебно-профилактических бактериофагов и их специфическая направленность» на стр. 9 в кн: Биологический метод дезинфекции с использованием бактериофагов Методические рекомендации. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016. - 12 с.).

Для объективного подтверждения необходимости смены фага проводят определение IgG-антител к бактериофагам. Может быть использована методика определения IgG-антител к бактериофагам с помощью иммуноферментного анализа, которая включает следующие этапы.

А. Получение кроличьей антисыворотки к бактериофагу для контроля работы коньюгата в тест-системе.

Для получения антисыворотки проводят внутримышечную иммунизацию кролика.

Схема иммунизации:

1. 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда + 0,5 мл раствора фага (концентрация 10⁸-10¹⁰ БОЕ/мл);

2. через 10 дней 0,25 мл неполного адьюванта Фрейнда + 0,25 мл раствора фага в том же титре;

3. через 20 дней 0,1 мл неполного адьюванта Фрейнда + 0,1 мл раствора фага в том же титре;

4. через 30 дней 0,5 мл неполного адьюванта Фрейнда + 0,5 мл раствора фага в том же титре.

Полученная после иммунизации кролика сыворотка содержит антитела, если выявляются дуги преципитации по методу Оухтерлони.

Б. Конструирование тест-системы и проведение иммуноферментного анализа.

1. Собирают антиген на пластиковый планшет. В лунки планшета вносят по 100 мкл бактериофага в концентрации 10⁸-10¹⁰ БОЕ/мл, закрывают пленкой и оставляют на 18-20 часов в холодильнике. В последние лунки рядов антиген не вносят - данные лунки являются отрицательным контролем в отсутствии антигена.

2. После инкубации удаляют содержимое лунок (резко вытряхивают), планшет герметично упаковывают и замораживают при температуре (-10)-(-12)°С. Перед работой планшет размораживают при комнатной температуре в течение 30 минут.

3. Разводят исследуемую сыворотку в PBS-T (забуференный фосфатами физиологический раствор, содержащий твин-20 в концентрации 0,1%). Минимальное разведение сыворотки 1:100.

4. Вносят исследуемые образцы по 100 мкл в лунки планшета.

5. В качестве положительного контроля вносят сыворотку, полученную из пула, заведомо содержащую IgG-антитела к тестируемому бактериофагу.

6. В качестве контроля работы коньюгата вносят сыворотку иммунизированного одноименным бактериофагом кролика в дубле или триплете.

7. В качестве дополнительного отрицательного контроля вносят в дубле физиологический раствор.

8. Инкубируют 60 мин при 37°С, со встряхиванием 700 об/мин.

9. После инкубации промывают планшет 5-6 раз в моющем растворе (BSM Diagnostics, США). После промывки тщательно удаляют промывочный раствор, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге, сложенной в несколько раз, для полного удаления жидкости из лунок.

10. Для выявления связавшегося с сорбированным антигеном иммуноглобулина G, используют конъюгат Protein A-Peroxidase, Staphylococcus aureus/horseradish (Lot 084K132, Sigma, США). Данный конъюгат был выбран на том основании, что содержащийся в нем реагент Protein А стафилококка имеет сродство к иммуноглобулинам G разных видов млекопитающих, в том числе человека и кролика.

11. Для разведения конъюгата используют PBS-T (забуференный фосфатами физиологический раствор, содержащий твин-20 в концентрации 0,1%).

12. Рабочее разведение конъюгата предварительно подбирают в каждом случае индивидуально, поскольку оно зависит от иммуногенности и аффиности конкретного фага (подбирают разведение конъюгата, соответствующее его концентрации вносимой в лунки планшета, содержащие сорбированный антиген и ряд разведений сыворотки иммунизированного кролика, при значении оптической плотности больше 0,4 и меньше или равной 1,0).

13. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл конъюгата в рабочем разведении.

14. Инкубируют 60 мин при 37°С, со встряхиванием 700 об/мин.

15. Промывают планшет как описано в п. 9.

16. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл субстратного раствора, содержащего 3,3',5,5' тетраметилбензидина гидрохлорид (ВСМ Diagnostics).

17. Инкубируют 15-25 мин в темноте при комнатной температуре.

18. Для прекращения реакции в каждую лунку вносят по 100 мкл стоп-реагента (ВСМ Diagnostics).

19. Проводят измерение оптической плотности при 450 нм на планшетном фотометре Infinite (Tecan, Австрия).

После чего проводят реакции нейтрализации, подтверждая нейтрализующие свойства найденных антител и отбирают фаг или фаги, к которым у пациента отсутствуют IgG-антитела, обладающие подтвержденными нейтрализующими свойствами.

Реакцию нейтрализации проводят следующим образом.

Сыворотку крови пациента разводят в 1500 раз в стандартном фосфатном буфере (PBS) во избежание неспецифической реакции. Затем к 450 мкл разведенной сыворотки добавляют 50 мкл фаголизата исследуемого бактериофага в титре 10⁶ БОЕ/мл. Полученную смесь инкубируют в термостате в течение 30 минут при температуре 37°С. После инкубации смесь разводят в 100 раз жидкой питательной средой и титруют по методу Грациа. Падение титра бактериофага в сыворотке крови пациента свидетельствует о наличии антител.

Далее, учитывая локализацию инфекционного процесса и фармакокинетику отобранных фага или фагов, определяют один из следующих путей введения: per os, per rectum, ингаляционно, местно и соответствующую этому пути введения лекарственную форму. Обеспечивают максимальную доставку фагов к очагу инфекции и длительное персистирование в нем. При этом, падение титра бактериофагов в очаге инфекции должно составлять не более чем два порядка от исходно содержащегося в препарате, а персистирование фагов в очаге инфекции должно происходить в течение всего периода выделения из него бактерии-мишени и не менее 24-48 часов после ее элиминации.

Например, суппозиторная форма препарата бактериофагов позволяет повысить эффективность проводимой фаготерапии за счет исключения отрицательного воздействия кислой среды желудка на титр бактериофагов в составе препарата (RU 2622762, С1). Фармакокинетические испытания суппозиторной лекарственной формы на основе коктейля бактериофагов на лабораторных животных (кроликах), подтвердили достижение терапевтического уровня бактериофагов в крови, моче и фекалиях животных. Данный суппозиторий целесообразно использовать при ИСМП с локализацией очага инфекции в кишечнике, при катетер-ассоциированных инфекциях мочевых путей.

Нами выявлены определенные закономерности в изменении уровня бактериофагов в моче, крови и кале, связанные с размером вирусных частиц: фаги, обладающие меньшим размером, быстрее, чем бактериофаги большего размера проникают из просвета прямой кишки кроликов в кровь и далее в мочу.

Вводят пациенту выбранные фаг или фаги в эффективном количестве, используя определенные путь введения и лекарственную форму.

При введении пациенту отношение количества бактериофагов к титру бактерий-возбудителей, высеваемых из очага воспаления, составляет от 1 до 100.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1. Пациент Б., 49 лет. Диагноз: коксартроз правого тазобедренного сустава. Состояние после эндопротезирования тазобедренного сустава. Осложнение: нагноение послеоперационной раны. Состояние после вскрытия и дренирования абсцесса. При микробиологическом исследовании в гнойном отделяемом был выявлен Staphylococcus aureus в титре 10⁷ КОЕ/мл, устойчивый к метициллину и оксациллину. S. aureus с таким же спектром резистентности к антибиотикам в количестве 10⁶ КОЕ/мл был выявлен в соскобах из носа и зева. Чувствительность выделенной культуры S. aureus к штаммам стафилококковых вирулентных бактериофагов K, 812, CH1, SCH1, SCH111 определялись в две стадии. На первой стадии использовали спот-тест на чашке Петри с бактериальным газоном, посеянным на мясопептонном агаре, содержащем 2% агара. Под воздействием бактериофага СН1 произошел полный, а под воздействием бактериофагов K и 812 частичный лизис бактериального газона в зоне пятна после инкубации чашек Петри при 37°С в течение 18 часов. Под воздействием бактериофагов SCH1 и SCH111 лизиса бактериального газона не происходило. Бактериофаги СН1, K и 812 в титрах 10⁵, 10⁶ и 10⁷ БОЕ/мл (множественность инфицирования равняется 0,01 при отношении титра фага 10⁵ к титру бактерии-мишени в абсцессе 10⁷ и 1 при их одинаковой концентрации 10⁷, для титра бактерии-мишени из носа и зева имеем два соотношения - 0,1 и 1) каждый наносились каплей объемом 50 мкл поверх застывшего второго слоя мясопептонного агара в чашки Петри, при этом первым слоем наносился мясопептонный агар, содержащий 1,5% агара, на который после его застывания, вторым слоем наносился мясопептонный агар, содержащий 0,7% агара и выделенную от больного бактериальную культуру в количестве 10⁷ КОЕ/мл. После инкубации чашек Петри при 37°С в течение 18 часов под действием бактериофагов СН1 и K произошло формирование отдельных негативных колоний при их нанесении в титрах 10⁵ и 10⁶ БОЕ/мл и сливной лизис бактериальной культуры при использовании 10⁷ БОЕ/мл. Под действием бактериофага 812 не происходило формирование сливного лизиса бактериальной культуры и формирования отдельных негативных колоний. С помощью иммуноферментного анализа было выявлено отсутствие в сыворотке пациента IgG-антител к бактериофагам СН1 и K. Предварительно проведенные фармакокинетические исследования на животных и у людей показали возможность достижения высоких титров указанных бактериофагов при их использовании в виде раствора для приема внутрь (возможное максимальное падение титра от исходного не более двух порядков), местного (возможное максимальное падение титра от исходного не более одного порядка) и наружного (возможное максимальное падение титра от исходного не более одного порядка) применения при условии наличия в очаге инфекции бактерии-мишени. Длительную персистенцию (фаги выделяли из очага инфекции в течение всего периода выделения оттуда бактерии-мишени и не менее 24-48 часов после ее элиминации) и сохранение титров фагов (возможное максимальное падение титра от исходного не более одного порядка) СН1 и K на слизистых верхних дыхательных путей обеспечивали также гелеобразующие основы. Коктейль стерильных очищенных от токсинов фаголизатов СН1 и K вводился в виде раствора в полость абсцесса через дренаж, спрея для санации зева и назального геля в титре 10⁸ БОЕ/мл (множественность инфицирования равняется 10 при отношении титра фага 10⁸ к титру бактерии-мишени в абсцессе 10⁷ и 100 при отношении титра фага 10⁸ к титру бактерии-мишени на слизистых носа и зева 10⁶, при этом согласно фармакокинетических исследованиям при приеме внутрь ожидаемое падение титра - два порядка, а при местном применении - один порядок) 3 раза в день в течение 14 суток. После проведенной фаготерапии абсцесс разрешился, при микробиологическом исследовании в раневого отделяемого, в соскобах из носа и зева S. aureus не выявлялся.

Пример 2. Пациент К., 42 года. Диагноз: сочетанная травма грудной клетки. Осложнение: левосторонняя полисегментарная пневмония. При микробиологическом исследовании в эндотрахеальном аспирате была выявлена панрезистентная Klebsiella pneumoniae в титре 10⁶ КОЕ/мл. Чувствительность выделенной культуры K. pneumoniae к штаммам клебсиеллезных вирулентных бактериофагов KPV811, KPV15, Kp1, Kp2, Kp3, Kp4 определялись в две стадии. На первой стадии использовали спот-тест на чашке Петри с бактериальным газоном, посеянным на среде LB, содержащей 1,8% агара. Под воздействием бактериофагов KPV811 и KPV15 произошел полный, а под воздействием бактериофага Kp1 частичный лизис бактериального газона в зоне пятна после инкубации чашек Петри при 37°С в течение 18 часов. Под воздействием бактериофагов Kp2, Kp3 и Kp4 лизиса бактериального газона не происходило. Бактериофаги KPV811, KPV15 и Kp1 в титрах 10⁴, 10⁵ и 10⁶ БОЕ/мл (множественность инфицирования равняется 0,01 при отношении титра фага 10⁴ к титру бактерии-мишени в эндотрахеальном аспирате 10⁶ и 1 при их одинаковой концентрации 10⁶), каждый наносились каплей объемом 10 мкл поверх застывшего второго слоя LB-агара в чашки Петри, при этом первым слоем наносилась среда LB, содержащая 1,8% агара, на который после его застывания, вторым слоем наносилась среда LB, содержащая 0,7% агара и выделенную от больного бактериальную культуру в количестве 10⁶ КОЕ/мл. После инкубации чашек Петри при 37°С в течение 18 часов под действием бактериофагов KPV811 и KPV15 в титрах 10⁴, 10⁵ и 10⁶ БОЕ/мл произошло формирование отдельных негативных колоний на газоне бактериальной культуры. При использовании бактериофага Kp1 негативные колонии не образовывались. С помощью иммуноферментного анализа было выявлено отсутствие в сыворотке пациента IgG-антител к бактериофагу KPV811 и наличие IgG-антител к бактериофагу KPV15 в титре 1/64. Проведение реакции нейтрализации показало отсутствие у пациента IgG-антител, обладающих нейтрализующими свойствами в отношении бактериофага KPV15. Предварительно проведенные фармакокинетические исследования на животных и у людей показали возможность длительной персистенции (бактериофаги выделяли из эндотрахеального аспирата в течение всего периода выделения из очага инфекции бактерии-мишени и не менее 24-48 часов после ее элиминации) и достижения высоких титров (возможное максимальное падение титра от исходного не более одного порядка) указанных бактериофагов при их использовании в виде дополнительно очищенного с помощью ультрафильтрации раствора для ингаляций при условии наличия в очаге инфекции бактерии-мишени. Коктейль бактериофагов KPV811 и KPV15 назначался ингаляционно в титре 10⁷ БОЕ/мл (множественность инфицирования равняется 10 при отношении титра фага 10⁷ к титру бактерии-мишени в эндотрахеальном аспирате 10⁶, при этом согласно фармакокинетических исследованиям при местном применении ожидаемое падение титра - один порядок) при помощи небулайзера компрессорного типа 2 раза в день в течение 10 суток. Спустя неделю после курса фаготерапии на контрольной рентгенограмме признаки пневмонии отсутствовали, при микробиологическом исследовании эндотрахеального аспирата через сутки после окончания фаготерапии K. pneumoniae не выявлялась, повторное исследование через 4 недели также подтвердило полную санацию исследуемого локуса.

Пример 3. Пациент Б., 63 года. Диагноз: злокачественное новообразование нижней доли правого легкого. Состояние после лобэктомии. Осложнение: эмпиема плевры. При микробиологическом исследовании плеврального выпота был выявлен Enterococcus faecium в титре 10⁶ КОЕ/мл, устойчивый к ванкомицину и тейкопланину. Е. feacium с таким же спектром резистентности к антибиотикам в количестве 10⁷ КОЕ/мл был выявлен в моче. Чувствительность выделенной культуры Е. feacium к штаммам энтерококковых вирулентных бактериофагов Efm1, Efm2, Efm3, Efm4, Efm5, Efm6 определялись в две стадии. На первой стадии использовали спот-тест на чашке Петри с бактериальным газоном, посеянным на мясопептонном агаре, содержащем 1,5% агара. Под воздействием бактериофага Efm2 произошел полный, а под воздействием бактериофагов Efm1, Efm5 и Efm6 частичный лизис бактериального газона в зоне пятна после инкубации чашек Петри при 37°С в течение 18 часов. Под воздействием бактериофагов Efm3 и Efm4 лизиса бактериального газона не происходило. Бактериофаги Efm1, Efm2, Efm5 и Efm6 в титрах 10⁵, 10⁶ и 10⁷ БОЕ/мл (множественность инфицирования равняется 0,01 при отношении титра фага 10⁵ к титру бактерии-мишени в моче 10⁷ и 1 при их одинаковой концентрации 10⁷, для титра бактерии-мишени, выделенной из плевральном выпоте имеем два соотношения - 0,1 и 1) каждый наносились каплей объемом 100 мкл поверх застывшего второго слоя мясопептонного агара в чашки Петри, при этом первым слоем наносился мясопептонный агар, содержащий 2% агара, на который после его застывания, вторым слоем наносился мясопептонный агар, содержащий 0,7%) агара и выделенную от больного бактериальную культуру в количестве 10⁶ КОЕ/мл. После инкубации чашек Петри при 37°С в течение 18 часов под действием бактериофагов Efm1, Efm2 и Efm6 в титре 10⁴, 10⁵ и 10⁶ БОЕ/мл произошло формирование отдельных негативных колоний на газоне бактериальной культуры. При использовании бактериофага Efm5 негативные колонии не образовывались. С помощью иммуноферментного анализа было выявлено отсутствие в сыворотке пациента IgG-антител к бактериофагу Efm1 и наличие IgG-антител к бактериофагам Efm2 1/32 и Efm6 1/4096. Проведение реакции нейтрализации показало отсутствие у пациента IgG-антител, обладающих нейтрализующими свойствами в отношении бактериофага Efm2 и наличие IgG-антител, обладающих нейтрализующими свойствами в отношении бактериофага Efm6 (титр бактериофага по Грациа после его инкубации с разведенной сывороткой пациента полностью отсутствовал). Предварительно проведенные фармакокинетические исследования на животных и у людей показали возможность достижения высоких титров указанных бактериофагов при их использовании в виде раствора для приема внутрь (возможное максимальное падение титра от исходного не более двух порядков) и местного (возможное максимальное падение титра от исходного не более одного порядка) применения при условии наличия в очаге инфекции бактерии-мишени, а также длительную персистенцию в крови и выведение с мочой (бактериофаги идентифицировали в моче в течение всего периода выделения из нее бактерии-мишени и не менее 24-48 часов после ее элиминации) в случае внутрижелудочного введения. Коктейль бактериофагов Efm1 и Efm2 вводился интраплеврально через дренаж в титре 10⁷ БОЕ/мл и через назогастральный зонд в титре 10⁹ БОЕ/мл (множественность инфицирования равняется 10 при отношении титра фага 10⁷ к титру бактерии-мишени в плевральном выпоте 10⁶ и 100 при отношении титра фага 10⁹ к титру бактерии-мишени в моче 10⁷, при этом согласно фармакокинетическим исследованиям при приеме внутрь ожидаемое падение титра - два порядка, а при местном применении - один порядок) 3 раза в день в течение 14 суток. По данным физикальных и инструментальных методов обследования после проведенной фаготерапии эмпиема плевры разрешилась, при микробиологическом исследовании плевральной жидкости и мочи E. faecium не выявлялся. Контрольный бактериологический посев, проведенный спустя три недели, подтвердил полную санацию очагов ИСМП.

Пример 4. Пациент Ф., 45 лет. Диагноз: черепно-мозговая травма. Осложнение: Правосторонняя нижнедолевая пневмония, сепсис. В бактериологическом посеве крови обнаружен Acinetobacter baumannii в титре 10⁴ КОЕ/мл, устойчивый к азтреонаму и имипенему. При микробиологическом исследовании эндотрахеального аспирата выделен имипенем- и ципрофлоксацин резистентный штамм Pseudomonas aeruginosa в титре 10^{5 КОЕ/мл. Чувствительность выделенных культур к вирулентным бактериофагам АР22 и АМ24 (A. baumannii) и РА5, РА10, РА1С (P. aeruginosa) определялась в две стадии. Спот-тест показал чувствительность A. baumannii к бактериофагу АМ24 и P. aeruginosa к РА10 и РА1С. На второй стадии бактериофаг АМ24 в титре 104 и РА10 и РА1С в титрах 104 и 105 БОЕ/мл (в данном случае использовали множественность инфицирования 1 для А. baumannii и 0,1 и 1 для P. aeruginosa, титр фага меньше 104 БОЕ/мл не используется из-за низкой вероятности встречи фага и бактерии-мишени в среде) каждый наносились каплей объемом 50 мкл поверх застывшего второго слоя агара Мюллера-Хинтона в чашки Петри, при этом первым слоем наносилась питательная среда Мюллера-Хинтона, содержащая 1,5% агара, на которую после ее застывания, вторым слоем наносилась среда Мюллера-Хинтона, содержащая 0,7% агара и выделенные от больного Acinetobacter baumannii в титре 104 КОЕ/мл и Pseudomonas aeruginosa в титре 105 КОЕ/мл. После инкубации чашек Петри при 37°С в течение 18 часов под действием бактериофагов АМ24 в титре 104 и РА10 в титрах 105 и 106 БОЕ/мл произошло формирование отдельных негативных колоний на газонах гомологичных бактериальных культур. С помощью иммуноферментного анализа было выявлено отсутствие в сыворотке пациента IgG-антител к бактериофагам АМ24 и РА10. Предварительно проведенные фармакокинетические исследования на животных и у людей показали возможность длительной персистенции указанных бактериофагов в крови (сохранение бактериофагов подтверждалось в течение всего периода выделения бактерии-мишени из крови и не менее 24-48 часов после ее элиминации) и достижения ими высоких титров (возможное максимальное падение титра от исходного не более двух порядков) в эндотрахеальном аспирате при их энтеральном введение (per os и per rectum) при условии наличия в очаге инфекции бактерии-мишени. Коктейль бактериофагов АМ24 и РА10 назначался в двух лекарственных формах: суппозиториях для ректального применения и растворе через назогастральный зонд в титрах 106 и 107 БОЕ/мл соответственно (множественность инфицирования равняется 100 при отношении титров фагов 106 и 107 к титрам их бактерий-мишеней в крови 104 и эндотрахеальном аспирате 105 соответственно, при этом согласно фармакокинетических исследованиям при приеме внутрь ожидаемое падение титра - два порядка), по 1 разу в день в течение 5 дней. Спустя неделю после курса фаготерапии на контрольной рентгенограмме признаки пневмонии отсутствовали, при микробиологическом исследовании эндотрахеального аспирата и крови через сутки после окончания фаготерапии штаммы-возбудители ИСМП (А. baumannii и P. aeruginosa) не выделялись, повторное исследование через 4 недели также подтвердило полную санацию исследуемых локусов.}

Предлагаемый способ лечения был использован у 60 пациентов (в том числе 10 пациентов повторно от 2 до 4 раз) отделений хирургического профиля и ОРИТ (90% процентов из которых находились в критическом состоянии) со следующими видами ИСМП: инфекции области хирургического вмешательства, ИВЛ-ассоциированные пневмонии, катетер-ассоциированные инфекции мочевых путей и инфекции кровотока, вызванные полирезистентными штаммами A. baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa и S. aureus. Лечебная эффективность, выражавшаяся в уменьшении клинических проявлений заболеваний, по данным объективных методов исследований была достигнута в 60% случаев, что в случае пациентов, находившихся в критическом состоянии на фоне ИСМП, вызванными возбудителями с МЛУ, является серьезным достижением. В то время как микробиологическая эффективность индивидуализированной фаготерапии, которая оценивалась после завершения курса и через 3-4 недели после проведения курса лечения и определялась как элиминация возбудителя - прекращение высева (выявления) возбудителя из очага первичной локализации инфекции, подтверждалась в 75% случаев. На эту величину негативное влияние оказала не полная исходная идентификация штаммов-возбудителей в случае микст-(3-4 штаммовой)-инфекции, что повлекло за собой применение у пациента коктейля бактериофагов, санировавших лишь часть патогенов.

Таким образом, постоянное изменение штаммов-возбудителей ИСМП в ОРИТ влечет за собой необходимость постоянного мониторинга чувствительности используемых бактериофагов и внесение изменений в штаммовый состав фагового коктейля для поддержания необходимого уровня его спектра литической активности. Высокая вероятность проведения повторных курсов фаготерапии у данной категории пациентов заставляет учитывать образование специфических антифаговых антител к уже использованным фагам. Персонифицированный подход к пациентам ОРИТ подразумевает оказание им высокотехнологичной медицинской помощи на основе фаготерапии, включающей в себя индивидуализированный алгоритм подбора штаммового состава бактериофагов с учетом быстрого изменения циркулирующих штаммов-возбудителей и формирования антифагового иммунитета.

Выбор оптимальной лекарственной формы, первично ориентированной на пероральный прием фага, требует не только изменения консистенции и вспомогательных компонентов состава для иных путей применения, но и проведения фармакокинетических исследований.

Расширение продуктового портфеля для нового направления фаготерапии невозможно проводить в рамках существующих фармацевтических предприятий, нацеленных исключительно на выпуск готовых лекарственных средств. Для постоянного обоснованного и безопасного обновления штаммовых составов фагов, используемых против возбудителей ИСМП, необходима организация национального референс-центра по контролю за применением бактериофаговых препаратов, в функции которого будет входить создание актуальной коллекции фено- и генотипически охарактеризованных бактериофагов, полностью прошедших современный пайп-лайн биотехнологического продукта и ожидающих лишь их включения в лекарственную форму по первому требованию предприятия производителя или ЛПУ.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и инфекционным болезням, и может быть использовано для лечения инфекции, вызванной возбудителем или возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью путем проведения персонифицированной фаготерапии. Для этого подбирают бактериофаг или бактериофаги в две стадии, определяя чувствительность выделенных от больного бактерий-мишеней к отдельным штаммам вирулентных фагов. При этом на первой стадии используют спот-тест на чашке с бактериальным газоном, посеянным на плотной питательной среде, содержащей 1,5-2% агара, отбирая фаг или фаги, под воздействием которых произошел полный или частичный лизис бактериального газона или в зоне нанесенного пятна есть отдельные негативные колонии. На второй стадии отобранные фаг или фаги каплей объемом 10-100 мкл наносят поверх застывшего второго слоя агаризованной среды в чашку или чашки Петри, при этом первым слоем наносят 1,5-2% питательный агар, на который после его застывания вторым слоем наносят 0,7% агаризованную среду, содержащую выделенную от больного бактериальную культуру. Для нанесения используют бактериофаги в титре, обеспечивающем множественность инфицирования от 0,01 до 1 с учетом титра бактерии-мишени, высеянной из очага инфекции; выбирают фаг или фаги, под воздействием которых произошло формирование отдельных негативных колоний или сливной лизис бактериальной культуры, учет результатов на первой и второй стадиях проводят после инкубации чашек при 37°С в течение 18 ч. Затем с помощью иммуноферментного анализа определяют наличие в сыворотке пациента IgG-антител к выбранному фагу или фагам, после чего проводят реакции нейтрализации, подтверждая нейтрализующие свойства найденных антител, и отбирают фаг или фаги, к которым у пациента отсутствуют IgG-антитела, обладающие подтвержденными нейтрализующими свойствами. Далее, учитывая локализацию инфекционного процесса и фармакокинетику отобранных фага или фагов, определяют по меньшей мере один из следующих путей введения: per os, per rectum, ингаляционно, местно и соответствующую этому пути введения лекарственную форму, обеспечивая сохранение бактериофагов в очаге инфекции в титре не более чем на два порядка ниже исходного, содержащегося в применяемом у пациента препарате, в течение всего периода выделения из очага инфекции бактерии-мишени и не менее 24-48 ч после ее элиминации. Использование данного способа позволяет эффективно проводить фаготерапию инфекций, вызванных возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью, путем персонифицированного подбора штаммового состава бактериофагов, установления индивидуальных доз вводимого препарата, а также с учетом антифагового иммунного ответа пациента. 2 з.п. ф-лы, 4 пр.

1. Способ лечения инфекции, связанной с оказанием медицинской помощи, вызванной возбудителем или возбудителями с множественной лекарственной устойчивостью путем проведения персонифицированной фаготерапии, при которой подбирают бактериофаг или бактериофаги, для чего

сначала определяют в две стадии чувствительность выделенных от больного бактерий-мишеней к отдельным штаммам вирулентных фагов, при этом на первой стадии используют спот-тест на чашке с бактериальным газоном, посеянным на плотной питательной среде, содержащей 1,5-2% агара, отбирая фаг или фаги, под воздействием которых произошел полный или частичный лизис бактериального газона или в зоне нанесенного пятна есть отдельные негативные колонии, на второй стадии отобранные фаг или фаги каплей объемом 10-100 мкл наносят поверх застывшего второго слоя агаризованной среды в чашку или чашки Петри, при этом первым слоем наносят 1,5-2% питательный агар, на который после его застывания вторым слоем наносят 0,7% агаризованную среду, содержащую выделенную от больного бактериальную культуру, для нанесения используют бактериофаги в титре, обеспечивающем множественность инфицирования от 0,01 до 1 с учетом титра бактерии-мишени, высеянной из очага инфекции; выбирают фаг или фаги, под воздействием которых произошло формирование отдельных негативных колоний или сливной лизис бактериальной культуры, учет результатов на первой и второй стадиях проводят после инкубации чашек при 37°С в течение 18 ч;

затем с помощью иммуноферментного анализа определяют наличие в сыворотке пациента IgG-антител к выбранному фагу или фагам, после чего проводят реакции нейтрализации, подтверждая нейтрализующие свойства найденных антител, и отбирают фаг или фаги, к которым у пациента отсутствуют IgG-антитела, обладающие подтвержденными нейтрализующими свойствами;

далее, учитывая локализацию инфекционного процесса и фармакокинетику отобранных фага или фагов, определяют по меньшей мере один из следующих путей введения: per os, per rectum, ингаляционно, местно и соответствующую этому пути введения лекарственную форму, обеспечивая сохранение бактериофагов в очаге инфекции в титре не более чем на два порядка ниже исходного, содержащегося в применяемом у пациента препарате, в течение всего периода выделения из очага инфекции бактерии-мишени и не менее 24-48 ч после ее элиминации;

вводят пациенту выбранные фаг или фаги в эффективном количестве, используя определенные пути введения и лекарственную форму.

2. Способ лечения инфекции по п. 1, отличающийся тем, что на второй стадии определения чувствительности выделенных от больного бактерий-мишеней к отдельным штаммам вирулентных фагов чашку Петри делят на сектора для проверки различных разведений фага и/или разных фагов на одной чашке одновременно.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при введении пациенту используют отобранные фаг или фаги в титре, обеспечивающем множественность инфицирования in vitro от 1 до 100 с учетом титра бактерии-мишени, высеянной из очага инфекции.