ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Acinetobacter baumannii АР22 ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ Acinetobacter baumannii ПРИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ A.baumannii-ИНФЕКЦИЙ Российский патент 2012 года по МПК C12N7/00 C12R1/19 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии и касается штамма бактериофага Acinetobacter baumannii AP22, который может быть использован для создания новых диагностических и лечебных препаратов.

Бактерии Acinetobacter baumannii могут быть причиной развития госпитальных пневмоний, раневых инфекций, в том числе у больных с термическими поражениями, менингитов (при нейрохирургических вмешательствах и травмах спинного мозга), эндокардитов, перитонитов, абсцессов мозга и лёгких, урологических катетерных инфекций, а также бактериемий и септицемий.

Клинически значимыми особенностями бактерий A. baumannii являются множественная устойчивость к различным классам антимикробных препаратов, устойчивость к дезинфицирующим средствам, высушиванию, ультрафиолетовому облучению, толерантность к детергентам. Высокая выживаемость на объектах внешней среды и способность персистировать в течение продолжительного периода в условиях больничного окружения увеличивает риск горизонтальной передачи этого микроба через медицинский персонал или предметы обихода, что на фоне интенсивного использования антибиотиков широкого спектра приводит к все возрастающему распространению бактерий рода Acinetobacter в стационарах лечебных учреждениях, особенно в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

В связи с этим чрезвычайно актуальной является проблема поиска и разработки новых средств против госпитальных Acinetobacter-инфекций. Одним из таких средств могут быть бактериофаги, хорошо зарекомендовавшие себя, например, при комплексном лечении госпитальных инфекций, вызываемых псевдомонадами или стафилококком.

В настоящее время не существует коммерческих препаратов бактериофагов для лечения инфекций, вызванных бактериями Acinetobacter baumannii. Выделен и описан вирулентный бактериофаг АВ1, обладающий узким спектром литической активности: фаг лизирует только один штамм Acinetobacter baumannii из пяти проверенных в эксперименте [1]. Упоминания о крайне узком спектре антибактериального действия фагов Acinetobacter встречается в другой работе [2]. Имеются сообщения об использовании бактериофагов для фаготипирования штаммов Acinetobacter spp. [3], а также о применении бактериофага BS46 для лечения А. baumannii-инфекции, вызванной фагочувствительным штаммом A. baumannii, вирулентным для мышей [4]. Однако в указанной работе речь идет только о проверке активности фага in vivo с использованием одного чувствительного штамма A. baumannii без указания спектра действия фага.

Задача изобретения - получение нового штамма видоспецифического бактериофага A. baumannii с расширенным спектром действия, который может быть использован для получения диагностических и лечебных препаратов против А. baumannii-инфекций.

Поставленная задача решается получением нового видоспецифического вирулентного штамма бактериофага семейства Myoviridae, авторское название АР22, обладающего высокой литической активностью в отношении штаммов A. baumannii.

Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii AP22 выделен из клинического материала, то есть бактериальный вирус приспособлен к функционированию в данной экологической нише, и депонирован в коллекции музея микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФГУН ГНЦ ПМБ) под номером Ph-42.

Бактериофаг Acinetobacter baumannii AP22 относится к семейству Myoviridae и характеризуется следующими свойствами.

Морфология фаговой частицы: головка икосаэдрической формы диаметром 63-65 нм, сокращающийся хвостовой отросток длиной 85-90 нм. Морфотип А1 по классификационной схеме Ackermann, Dubow [5] (фиг.1).

Морфология негативных колоний: на чувствительном бактериальном штамме формирует круглые прозрачные негативные колонии диаметром около 2-3 мм с ореолом. Диаметр ореола варьирует от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров.

Частота образования фагорезистентных форм A. baumannii на одну клетку составляет 10^-6.

Спектр литического действия: бактериофаг лизирует 68% выбранных для проведения исследования штаммов A. baumannii (n=120), выделенных от больных ожеговых отделений, отделений плановой и экстренной хирургии, терапевтического отделения, отделения реанимации и интенсивной терапии, а также отделения урологии; не проявляет литической активности к штаммам других видов рода Acinetobacter (A. lwoffii, A. anitratus, A. calcoaceticus, A. aceti) и представителям других родов и семейств (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Yersinia pseudotuberulosis, Yersinia enterocolitica, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytocae, Enterobacter cloacae, Pasteurella multocida, Salmonella Enteritidis).

Геном бактериофага представлен двунитевой ДНК размером 51,8±2,7 тысяч пар оснований (kb). ДНК фага расщепляется рестрикционными эндонуклеазами HindIII, DraI, VspI, SspI, TaqI, AluI, RsaI, HinfI, MspI, CfrI, EcoRI, частично гидролизуется EcoRV, PstI, SalI, XmiI, SmiI, ClaI, BamHI, PvuII, BglII, EcoR91I, NcoI, NheI и не гидролизуется ферментами SmaI, ApaI, NotI, DraII, Eco52I (фиг.2).

Бактериофаг Acinetobacter baumannii AP22 хранится в виде фаголизата либо в лиофильно высушенном состоянии.

Штамм бактериофага AP22 может быть использован для идентификации A. baumannii на стадии бактериологического анализа клинического материала, а также в составе комплексных лечебных препаратов для обработки раневых и ожоговых поражений.

Пример 1. Получение фаголизата штамма бактериофага Acinetobacter baumannii AP22.

К 1 мл ночной бульонной культуры чувствительного штамма A. baumannii добавляют 4 мл бульона Лурия и 1 мкл суспензии штамма бактериофага AP22 с концентрацией 5×10⁹ БОЕ/мл. Смесь инкубируют на качалке при 37°С до наступления просветления бактериальной культуры. Добавляют 0,5 мл хлороформа и интенсивно перемешивают в смесителе в течение 20 мин. Низкоскоростным центрифугированием (10000 g, 15 мин) удаляют обломки бактериальных клеток и титруют фаголизат. Он содержит более 10⁹ частиц фага в 1 мл.

Пример 2. Проверка специфичности и спектра антибактериального действия бактериофага Acinetobacter baumannii AP22.

Специфичность штамма бактериофага проверяют методом спот-тестов. Для этого по 0,3 мл ночных бульонных бактериальных культур смешивают с 4 мл полужидкого агара (бульон Лурия с 0,7% агара) при температуре 45-50°С и распределяют по поверхности питательного агара (например, Nutrient Agar, HIMEDIA или минимальная среда) в чашке Петри. После застывания верхнего агара на поверхность наносят каплю штамма бактериофага AP22 (около 10⁸ БОЕ/мл) и инкубируют при температуре 37°С 18-24 часа. При визуальном осмотре на чашках с чувствительными культурами A. baumannii рост бактериального газона отсутствует в местах внесения штамма бактериофага (прозрачное пятно лизиса).

Таблица 1. Специфичность штамма бактериофага АР22 (спот-тесты). Представители вида Наличие (+) или отсутствие (-)   лизиса Acinetobacter baumannii (120)^* +(82)   -(38) Acinetobacter lwoffii (6) - Acinetobacter calcoaceticus (2) - Acinetobacter anitratus (4) - Acinetobacter aceti (1) - Pseudomonas aeruginosa (5) - Escherichia coli (3) - Yersinia pseudotuberulosis (3) - Yersinia enterocolitica (3) - Klebsiella pneumoniae (3) - Klebsiella oxytocae (3) - Enterobacter cloacae (3) - Pasteurella multocida (3) - Salmonella Enteritidis (3) - * - в скобках - количество штаммов данного вида, используемых при проверке

Пример 3. Получение электронно-микроскопических данных о бактериофаге Acinetobacter baumannii AP22, наработанном по примеру 1.

Заключение о принадлежности фага к тому или иному морфотипу делают на основании электронно-микроскопического исследования морфологии фаговой частицы. Исследование проводят методом негативного контрастирования. Образцы фаголизата, полученного по примеру 1, дополнительно очищают методом дифференциального центрифугирования, фиксируют 1%-м раствором глутарового альдегида, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0), и наносят на коллодиевые пленки-подложки, укрепленные на никелевых сетках. Нанесенные на подложки образцы контрастируют 1%-м водным раствором уранилацетата и изучают на электронном микроскопе.

Электронная микрофотография фага Acinetobacter baumannii AP22 представлена на фиг.1.

Пример 4. Рестрикционный анализ ДНК штамма бактериофага Acinetobacter baumannii AP22.

Составляют рестрикционную смесь, содержащую 0,1 мкг/мл ДНК штамма бактериофага AP22, 1 мкл 10-кратного рестрикционного буфера, 1 единицу соответствующего фермента, деионизованную воду - до общего объема 10 мкл. Смесь инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. Электрофорез проводят в горизонтальном электрофорезном аппарате при постоянной силе тока 150 мА в течение 1 часа. После 15 мин окрашивания в растворе 0,4 мкг бромистого этидия гель визуализируют под УФ-лампой (фиг.2).

Таким образом, штамм бактериофага AP22 относится к семейству Myoviridae (морфотип А1, содержит двунитевую ДНК), является специфичным и вирулентным для бактерий Acinetobacter baumannii. Выраженная видоспецифичность и достаточно широкий спектр активности в пределах данного вида (лизис 68% штаммов) позволяют использовать бактериофаг Acinetobacter baumannii AP22 для идентификации A. baumannii при бактериологическом анализе клинического материала, а также в составе комплексных лечебных препаратов для обработки раневых и ожоговых поражений при A. baumannii-инфекциях.

Видоспецифический вирулентный штамм бактериофага Acinetobacter baumannii AP22 семейства Myoviridae выделен из клинического материала и депонирован в коллекции музея микроорганизмов ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» под номером Ph-42. Бактериофаг обладает выраженной литической активностью, лизирует 68% штаммов A. baumannii, выделенных из клинического материала, и использован для идентификации микроорганизмов этого вида при бактериологическом анализе клинического материала, а также для разработки комплексных лечебных препаратов против A. baumannii-инфекций. Изобретение обеспечивает широкий спектр активности в пределах данного вида. 2 ил., 1 табл.

Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii AP22 для идентификации Acinetobacter baumannii при бактериологическом анализе клинического материала и для получения препарата против внутрибольничных A.baumannii-инфекций депонирован в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФГУН ГНЦ ПМБ) под номером Ph-42.