Способ культивирования личинок нематод подотряда ASCARIDATA Российский патент 2022 года по МПК A01K67/33 

Изобретение относится к паразитологии и может быть использовано в области профилактики гельминтозов человека и животных, а также в клинической лабораторной диагностике для создания иммуноферментных тест-систем на основе антигена нематод подотряда Ascaridata, получаемого из личинок.

Кишечные гельминтозы являются одними из самых экономически значимыми паразитозами человека (аскаридозы человека), животных и птиц. Диагностика паразитозов осуществляется различными методами. Классические копроскопические методы диагностики кишечных гельминтозов являются сравнительно простыми и доступными, но обладают рядом недостатков: зависимость от профессиональных качеств исследователя, низкая диагностическая эффективность при слабой степени инвазированности. Детектирование паразитозов с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) требует значительных трудозатрат, сложного оборудования. К тому же не для всех видов паразитов разработаны соответствующие видоспецифические праймеры. Поэтому совершенствование диагностики гельминтозов остается актуальной проблемой.

Одним из перспективных является серологический метод диагностики на основе иммуноферментного анализа, позволяющий выявлять специфические антитела к паразиту. Для разработки иммуноферментной системы требуется получение специфических паразитарных антигенов высокого качества. Наиболее подходящим источником таких паразитарных антигенов служат личинки нематод, вышедшие из своих яиц. Единственным способом получения личинок в лабораторных условиях является инкубирование яиц гельминтов. В свою очередь источником яиц могут служить - каловые массы или самки гельминтов.

Получение яиц гельминтов из каловых масс сопровождается трудностями по необходимости выделения яиц в чистом виде, высоким потерям, а также низкому выходу количества яиц. Гораздо более удобным является метод получения яиц непосредственно из самих гельминтов.

Главной трудностью в получении личинок нематод подотряда Ascaridata является необходимость простимулировать их выход из яйцевых оболочек с помощью специальных смесей имитирующих желудочный сок. Обычно для этого используют смесь раствора соляной кислоты с трипсином (искусственный желудочный сок), в отечественной паразитологии называемый методом культивирования личинок по Твердохлебову П.Т. Этот метод достаточно эффективно позволяет инкубировать личинки из яиц гельминтов, выделенных непосредственно из каловых масс, однако, он демонстрирует очень нестабильные результаты при инкубации яиц, выделенных непосредственно из взрослых самок гельминтов. Одним из способов увеличения доли выхода личинок из яиц можно считать подход, связанный с преинкубацией в течение 24 часов с хлорсодержащим препаратом ДП-2Т (Патент RU №2580655, МПК A01K 67/033 - 10.04.2016, Бюл. №10). Однако и в описываемом способе достигается не более 20-25% эффективности выхода личинок из яиц.

Вместе с тем известно, что некоторые вещества, например, хитозан, могут проникать через клеточные стенки организмов, а также стимулировать лизис клеточных оболочек. При этом хитозан является поликатионом, и его биологическая активность усиливается при понижении рН среды, поскольку именно в кислых условиях достигается максимальное связывание катионов водорода с аминогруппами хитозанового полимера. Поэтому добавление таких веществ может являться способом достижения более высокой доли выхода личинок из яиц.

В связи с этим задачей заявленного изобретения является разработка более эффективного способа, позволяющего получать личинки нематод подотряда Ascaridata с более высокой долей выхода из яиц.

Поставленная задача достигается путем разработки способа культивирования личинок нематод подотряда Ascaridata, который предусматривает их инкубирование в искусственном желудочном соке с добавлением низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой 10000 Да.

Способ осуществляется следующим образом: оплодотворенные яйца Ascaris suum инкубировали 24 часа при 27°С в искусственном желудочном соке с добавлением раствора хитозана в конечной концентрации 0,001%. Затем яйца промывали от искусственного желудочного сока и хитозана, центрифугированием в течение 10 минут при 1000 об/мин. и инкубировали в пенициллиновых флаконах с физиологическим раствором в объеме 2 мл в течение 30 суток. Процесс инкубирования контролировали микроскопированием.

Через 30 дней инкубирования производили подсчет количества вышедших из яиц личинок. Результаты представлены в таблице 1 - для Ascaris suum и таблице 2 - для Arcadia galli.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка простого и более эффективного способа получения личинок нематод подотряда Ascaridata, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов и высоким процентом выхода личинок из яиц.

ЛИТЕРАТУРА

1. Сергиев В.П., Лобзин Ю.В. и др. Паразитарные болезни человека (протозоозы и гельминтозы). - СПб, «Фолиант», 2006. - С. 2-444.

2. Сафиуллин Р.Т. Сравнительная эффективность копроскопических методов диагностики гельминтозов свиней и их усовершенствование на основе стандартизации. / Р.Т. Сафиуллин // Тр. ВИГИСа. - 2001. - Т. 37. - С. 149-159.

3. Долбин Д.А., Лутфуллин М.Х., Латыпов Д.Г. Сравнительная эффективность различных гельминтоовоскопических методов для диагностики неоаскаридоза телят. // Тр. ВИГИС. - Т. 41. - М. - 2005. - С. 2005. - С. 154-160.

4. Долбин Д.А., Агафонова Е.В., Смирнова Л.Р., Хазиева С.М. Пути улучшения качества лабораторной диагностики гельминтозов. // Казанский медицинский журнал. - 2007. - Т. LXXXVIII. - №4. - С. 398-402.

5. Куликов С.Н., Хайруллин Р.З., Варламов В.П. / Влияние поликатионов на антибактериальную активность лизостафина // Прикладная биохимия и микробиология 2015. Т. 51. №6. с. 610-615. DOT. 10.7868/S0555109915060082.

6. Патент RU 2689161 «Способ получения бактериальных антигенов».

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ культивирования личинок нематод подотряда Ascaridata, осуществляющийся следующим образом: оплодотворенные яйца Ascaris suum инкубируют 24 часа при 27°С в искусственном желудочном соке с добавлением раствора хитозана в конечной концентрации 0,001%. Затем яйца промывают от искусственного желудочного сока и хитозана, центирфугированием в течение 10 минут при 1000 об/мин и инкубируют в пенициллиновых флаконах с физиологическим раствором в объеме 2 мл в течение 30 суток. Через 30 дней инкубирования производят подсчет количества вышедших из яиц личинок. Изобретение позволяет увеличить процент выхода личинок из яиц. 2 табл.

Способ культивирования личинок нематод подотряда Ascaridata, заключающийся в том, что для инициации выхода личинок из яйцевых оболочек используется их предварительная преинкубация в искусственном желудочном соке с добавлением 0.001% раствора хитозана с молекулярной массой 10000 Да.