Экспресс-тест на токсокароз и способы изготовления компонентов для его проведения Российский патент 2025 года по МПК G01N33/00 A61K39/44 

Группа изобретений относится к области паразитологии, а именно к методам диагностики инвазионных болезней, и может быть использована в ветеринарии или медицине для выявления антигенов Toxocara canis и антител к ним в сыворотке или плазме крови животных или человека.

Токсокароз - зоонозная болезнь, вызываемая нематодами - геогельминтами. Возбудители заболевания - Toxocara canis и Toxocara cati - повсеместно распространены среди многих видов плотоядных животных. Основные источники возбудителя токсокароза - собаки, кошки и дикие плотоядные семейств Canidae и Felidae, которые выделяют с фекалиями яйца, устойчивые к неблагоприятным факторам окружающей среды. Яйца токсокар в почве сохраняют инвазионные свойства более одного года. Механизм передачи инвазии - оральный.

Человек для токсакар - паратенический хозяин. Кроме человека, резервуарными хозяевами нематод могут быть мышевидные грызуны и синантропные птицы

Болезнь протекает в острой или субклинической форме и проявляется у животных и человека синдромом мигрирующей личинки «larva migrans».

Синдром «larva migrans» Toxocara canis очень опасен и может протекать в тяжелой форме. Патология, вызываемая мигрирующими личинками токсокар, у плотоядных животных и человека весьма разнообразна и во многом похожа. Гепатопульмоэнтеральная миграция личиночных стадий развития Toxocara canis сопровождается патоморфологическими изменениями в тканях кишечника, печени, легких. Это полиморфно-клеточная пролиферация плазмоцитов, лимфоцитов, фибробластов, дистрофические изменения гепатоцитов, клеток альвеолярного и бронхиального эпителия, мезенхимы подслизистого слоя тонкого кишечника. При висцеральной форме токсокароза выражены геморрагический энтерит, гепатит, очаговый некроз и жировая дистрофия печени, бронхопневмония и бронхиальная астма (см., например, Лысенко А.Я. и др., Токсокароз, учеб. пособие, М., Российская медицинская академия последипломного образования, 2004, 40 с). Отечественные ученые сообщают о повреждающем действии личиночных стадий токсокар и аскарид на ДНК соматических и других клеток организма человека (см., например, Бекиш О.-Я.Л. и др., Повреждения ДНК клеток хозяина при экспериментальном висцеральном токсокарозе, Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы докладов научной конференции ВИГИС, М., 2005, с. 52-54). У человека нередко отмечают глазную форму токсокароза. Наиболее часто случаи заболевания токсокарозом регистрируют среди детей 5-12 лет (см., например, Бекиш Л.Э., Пораженность детского населения висцеральным токсокарозом в Беларуси, Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями, Материалы докладов научной конференции ВИГИС, М., 2009, с. 34-37).

Высокая напряженность эпизоотического процесса обусловлена длительным латентным носительством личинок Toxocara canis, постоянными суперинвазиями и передачей возбудителей токсокароза в цепи «хищник - жертва» от паратенических хозяев - грызунов и др. - восприимчивым видам диких и домашних плотоядных.

Эффективность мероприятий, направленных на купирование ларвального токсокароза и полное выздоровление человека, зависит от ранней диагностики заболевания и своевременно начатого его комплексного лечения.

Однако диагностика токсокароза сложна. Это обусловлено тем, что в организме человека токсокары не достигают половозрелой формы, в результате чего невозможно выявить взрослых особей или их яйца в экскрементах или дуоденальном содержимом, как при некоторых других гельминтозах. Поэтому создание новых модификаций методов диагностики, а также способов получения иммунореагентов, которые позволяли бы в короткие сроки и с высокой степенью достоверности диагностировать заболевание, является актуальной задачей.

В мировой ветеринарной и медицинской практике широко применяют экспресс-тесты при диагностике инфекционных и инвазионных болезней, как надежные, достаточно информативные и экономичные методы детекции антител и антигенов.

В зарубежных странах и в Российской Федерации разработан ряд иммунологических тестов для выявления антигенов Toxocara canis и антител к ним, циркулирующих в крови человека при синдроме «larva migrans» (см., например, Васильева Е.Г. и др., Иммунологические аспекты токсокароза, Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями, Материалы докладов научной конференции ВИГИС, М., 2009, с. 90-91 или Желева Р.Ц., Оценка эффективности реакции непрямой гемагглютинации с антигеном аскарид и токсокар при диагностике симптомокомплекса «larva migrans» у человека, Медицинская паразитология и паразитарные болезни, 1976, №2, с. 160-165).

Однако многие из известных тестов недостаточно чувствительны, как например, тест радиальной иммунодиффузии - РИД или реакция иммунофлуоресценции - РИФ, или малоспецифичны - например, РИД или реакция непрямой гемагглютинации - РНГА с цельным экстрактом из кутикулы имаго нематод, и поэтому непригодны для применения в широкой клинической практике.

Наилучший же результат обеспечивает иммуноферментный анализ - далее ИФА - с экскреторно-секреторным антигеном личинок токсокар (см., например, Солопов П.А., Иммуноферментный метод диагностики токсокароза собак, сероэпизоотологический мониторинг и терапия, Автореф. дисс. канд. вет. наук, М., 2009).

Однако метод ИФА трудоемкий и дорогостоящий, требует большого количества сывороток крови при постановке и использования антииммуноглобулиновых пироксидазных конъюгатов против IgG животного или человека, а также специального оборудования для оценки результатов.

Одним из востребованных методов лабораторной диагностики является иммунохроматографический анализ - далее ИХА. Принцип ИХА состоит в том, что погружают тест-полоски из нитроцеллюлозной мембраны в физиологическую жидкость или ее аналог - фосфатно-солевой буфер - далее ФСБ - , и физиологическая жидкость начинает мигрировать вдоль тест-полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с жидкостью перемещаются и меченые красителем антитела или антигены. В ИХА в качестве красителя используют коллоидное золото, которым и метят антитела к искомым антигенам. Если в исследуемой физиологической жидкости присутствует искомый антиген, то происходит его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что является уже иммунологическим методом анализа. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой темной полосы. Не связавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют с вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая темная полоса. Результаты определяют визуально или с помощью компьютерной обработки отсканированного изображения (см., например, Соколов Д.М. и др., Иммунохроматографический анализ, Экспресс-тесты Singlepath и Duopath для выявления патогенных микроорганизмов и токсинов в пищевых продуктах, Молочная промышленность, 2015, №1, с. 4-6).

Компонентами для проведения экспресс-теста методом ИХА являются антиген, иммунная сыворотка и исследуемый материал.

Известен способ изготовления токсокарового антигена для диагностики токсокароза, включающий выделение яиц токсокар из фекалий щенков, зараженных Toxocara canis, с последующим извлечением и дезинтеграцией личинок (см., например, RU 2783666 С1, 22.02.2022).

Приготовленный по известному способу токсокаровый антиген показал высокую специфичность при серологической диагностике токсокароза в иммуноферментном анализе - ИФА.

Однако в иммунохроматографическом анализе - ИХА - приготовленный по известному способу токсокаровый антиген не используется.

Задачей изобретения в части способа изготовления токсокарового антигена является получение высокоспецифичных экскреторно-секреторных компонентов - продуктов метаболизма личинок второй стадии Toxocara canis, пригодных для использования в иммунохроматографическом анализе.

Поставленная задача решается тем, что, согласно изобретению, способ изготовления токсокарового антигена и подготовки его для проведения экспресс-теста диагностики токсокароза иммунохроматографическим методом заключается в том, что проводят дегельминтизацию зараженных токсокарами животных, через 8-28 часов после дегельминтизации осуществляют макрогельминтологические исследования и отбирают самок токсокар с размером более 15 см в длину, извлекают у них матку, разрушают матку и получают яйца токсокар, которые культивируют в течение 3-6 недель в фосфатно-солевом буферном растворе с добавленным к нему глютамином в конечной концентрации 1%, после чего отбирают яйца токсокар со сформировавшимися в них и проявляющими подвижность личинками, помещают отобранные яйца в фосфатно-солевой буферный раствор, к которому добавлен панкреатин в конечной концентрации 1,25-1,5%, и культивируют отобранные яйца при температуре 37°С в течение 20-24 часов, затем освободившихся личинок токсокар продолжают культивировать в течение 48-72 часов в фосфатно-солевом буферном растворе, к которому также добавлен глютамин в конечной концентрации 1%, и выделяют антиген Toxocara canis путем центрифугирования культуральной жидкости при 6000-8000 об/мин в течение 10-60 минут, полученный антиген смешивают с фосфатно-солевым буферным раствором в соотношении 1:1,5-1:2,5, к полученному раствору антигена добавляют равный объем красителя, который также предварительно смешивают с фосфатно-солевым буферным раствором в соотношении 1:500, при этом в качестве красителя используют метиленовый синий, после чего смесь разбавленных токсокарого антигена и красителя выдерживают при комнатной температуре в течение 35-40 минут для конъюгации компонентов, а затем наносят на тест-полоски нитроцеллюлозной мембраны и помещают тест-полоски во влажную камеру термостата при температуре 37°С на 35-40 минут для соединения меченого красителем токсокарового антигена с нитроцеллюлозной мембраной.

Вторым компонентом экспресс-теста для диагностики ларвального токсокароза методом иммунохроматографического анализа является иммунная сыворотка.

Наиболее близким к заявленному является способ получения иммунной сыворотки, включающий внутримышечную иммунизацию кроликов по определенной схеме с использованием экскреторно-секреторного антигена токсокар с концентрацией белка 140 мкг/мл, взятие крови через 8-12 дней после введения антигена и получение сыворотки (см., например, Солопов П.А., Иммуноферментный метод диагностики токсокароза собак, сероэпизоотологический мониторинг и терапия, Автореф. дисс. канд. вет. наук, М., 2009, п. 2.2.3.2).

Однако полученная по известному способу иммунная сыворотка не используется в иммунохроматографическом анализе.

Задачей изобретения является получение иммунной сыворотки, содержащей высокоспецифичные антитела к личинкам Toxocara canis, пригодной для использования в иммунохроматографическом анализе.

Поставленная задача решается тем, что, согласно изобретению, способ изготовления иммунной сыворотки и подготовки ее для проведения экспресс-теста иммунохроматографическим методом для диагностики токсокароза, согласно изобретению, заключается в том, что смешивают полученный по п. 1 токсокаровый антиген с адъювантом Фрейда в соотношении 1:2,5-1:5,0 до получения однородной эмульсии, затем полученную эмульсию подогревают в термостате до 38-40°С и вводят кроликам подкожно в дозе по 0,2 мл в область регионарных лимфатических узлов с двух сторон, а также в область брюшной стенки на уровне расположения мезентеральных лимфатических узлов, затем через 7-8 дней кроликам дополнительно вводят полученный по п. 1 токсокаровый антиген внутримышечно дробно по 0,2-0,25 мл в области лопатки, поясницы и бедра с двух сторон, после чего на 12-й и 15-й дни после первого введения антигена у кроликов берут кровь из ушной вены в количестве 12-18 мл, помещают ее в термостат на 1,5-2 часа, затем отделяют иммунную сыворотку, отбирают иммунную сыворотку без признаков гемолиза с титром антител не менее 1:200, добавляют к ней фосфатно-солевой буферный раствор в соотношении 1:2-1:5, и полученный раствор в равных объемах смешивают с красителем, к которому предварительно добавляют фосфатно-солевой буферный раствор в соотношении 1:500, при этом в качестве красителя используют метиленовый синий, после чего смесь разбавленных иммунной сыворотки и красителя выдерживают при комнатной температуре в течение 30-40 минут, а затем наносят на тест-полоски нитроцеллюлозной мембраны, которые помещают во влажную камеру термостата при температуре 37°С на 35-40 минут для конъюгации иммунной сыворотки с красителем и соединения образовавшегося конъюгата с нитроцеллюлозной мембраной на молекулярном уровне.

Известен тест на токсокароз путем оценки специфичности реакции выброса миелопероксидазы - РВМ. Данный тест по специфичности совпадает с ИФА, но является более быстрым и простым в исполнении. Однако, как отмечают сами разработчики теста, условия подготовки компонентов и проведения реакции требуют повышенного внимания, чтобы исключить получение ошибочных результатов (см., например, Новиков П.Д. и др., Иммунодиагностика токсокароза, Иммунология, аллергология, инфектология, 2007, №2, с. 65-72).

Экспресс-тест на токсокароз, в котором бы использовали метод иммунохроматографического анализа, из уровня техники неизвестен.

Задачей изобретения в части экспресс-теста является разработка экспресс-теста для диагностики токсокароза методом иммунохроматографического анализа, который не уступал бы известным тестам по специфичности, чувствительности, эффективности и надежности, но позволял бы выполнить анализ и поставить диагноз с минимальными трудозатратами и требованиями к квалификации персонала, и в котором бы использовался более дешевый, по сравнению с используемым в стандартном ИХА, краситель.

Поставленная задача решается тем, что, согласно изобретению, исследуемый образец сыворотки или плазмы крови наносят на тест-полоски нитроцеллюлозной мембраны с либо конъюгированным токсокаровым антигеном, подготовленным по способу, описанному выше, либо с конъюгированными токсокаровыми антителами, подготовленными по способу, описанному выше, а токсокароз диагностируют по наличию или отсутствию на тест-полосках поперечно расположенных линий темно-синего цвета.

Техническим результатом, полученным в результате реализации заявленной группы изобретений является то, что возможно проведение анализа ветеринарным или медицинским врачом там, где это необходимо, т.е. без отправки биоматериала в лабораторию, и в максимально короткие сроки - в течение 3-5 минут, и с большой точностью, с минимальными трудозатратами и требованиями к квалификации персонала диагностировать токсокароз, снизить затраты на реактивы и на материалы, т.к. в заявленном тесте используется недорогой краситель - метиленовый синий, а на одну тест-полоску затрачивается всего 0,05-0,1 мл подготовленных иммунореагентов, а также отказаться от дорогостоящего оборудования, т.к. в наборы тестов уже включено все необходимое, и никакие дополнительные опции не требуются.

Группа изобретений иллюстрируется следующими примерами, которые, однако, не охватывают все формы ее выполнения.

Пример 1

Получение токсокарового антигена и подготовка его для использования в экспресс-тесте иммунохроматографическим методом.

В опыте использовали пять беспородных щенков 1,5-3 месячного возраста.

Провели копроовоскопические исследования щенков на яйца токсокар. Спонтанно зараженных токсокарами щенков дегельминтизировали. Через 18 часов после дегельминтизации провели макрогельминтологические исследования, отобрали самок токсокар размерами более 15 см в длину, промыли их в физиологическом растворе, извлекли у них трубчатые матки и разрушили их. Полученные яйца токсокар поместили в фосфатно-солевой буферный раствор (далее - ФСБ).

К полученной суспензии добавили раствор глютамина с конечной концентрацией 1%, и в данном растворе культивировали яйца токсокар в течение 5 недель. После чего отобрали яйца токсокар со сформировавшимися в них личинками, проявляющими подвижность. В ФСБ добавили панкреатин в конечной концентрации 1,35%, и в полученный раствор поместили отобранные яйца. Выдержали полученную суспензию в термостате при температуре 37°С в течение 22 часов. Освободившихся из яйцевых оболочек личинок токсокар культивировали в течение 60 часов в ФСБ с добавлением глютамина в конечной концентрации 1%. Затем выделили экскреторно-секреторный антиген личинок Toxocara canis путем центрифугирования культуральной жидкости при 7000 об./мин в течение 50 минут. Полученный центрифугат (надосадок) представляет собой токсокаровый антиген. Определили содержание белка в полученном антигене спектрофотометрическим методом в мкг/мл.

В заявленном экспресс-тесте все иммунореагенты готовят на основе ФСБ с рН 7,2-7,4, который включает двузамещенный фосфорнокислый натрий и однозамещенный фосфорнокислый калий (см. Приготовление буферных растворов, эл. адрес в Интернете - К http://agro-archive.ru/metody-issledovaniya/951-prigotovlenie-bufernyh-rastvorov.html, 03.02.14.

К полученному токсокаровому антигену добавили ФСБ в соотношении 1:2,0 К красителю метиленовый синий добавили ФСБ в соотношении 1:500. Смешали разбавленные токсокаровый антиген и метиленовый синий в равных объемах, выдержали при комнатной температуре 35 мин для конъюгации компонентов, и нанесли на тест-полоски. Использовали тест-полоски нитроцеллюлозной мембраны на основе сополимера дивинилбензен/стирена (Danger CAS №9004 - 70 - 0, Германия).

Тест-полоски на 40 минут поместили во влажную камеру термостата при температуре 37°С для образования молекулярных связей антигена, меченого красителем, с нитроцеллюлозной мембраной.

Необходимо отметить, что в данном примере указаны средние значения времени и условий проведения операций по получению качественного токсокарового антигена.

Однако проведенные заявителем исследования показали, что макрогельминтологические исследования возможно проводить через 8-48 часов после дегельминтизации, культивирование яиц токсокар в растворе с добавлением глютамина рекомендуется осуществлять в течение 3-6 недель, добавлять к суспензии яиц токсокар раствор панкреатина на ФСБ - в концентрации 1,25-1,5% и выдерживать полученный материал в термостате в течение 20-24 часов. Освободившихся личинок токсокар рекомендуется культивировать в растворе с добавлением глютамина в течение 48-72 часов. Рекомендуется выделять антиген Toxocara canis путем центрифугирования культуральной жидкости при 6000-8000 об/мин в течение 40-60 минут, а полученный токсокаровый антиген можно разводить ФСБ в соотношении 1:1,5-1:2,5. Тест-полоски для образования молекулярных связей антигена, меченого красителем, с нитроцеллюлозной мембраной, рекомендуется помещать во влажную камеру термостата при температуре 37°С на 35-40 минут.

Опытным путем установлено, что получить заявленный специфичный активный компонент для проведения ИХА, а именно токсокаровый антиген, возможно только при проведении операций по его изготовлению в указанных выше пределах концентраций используемых веществ, температур и времени проведения процессов,

При использовании режимов проведения способа со значениями ниже минимальных, указанных в формуле изобретения, полученный токсокаровый антиген теряет свою чувствительность, а использование режимов проведения способа со значениями выше максимальных, указанных в формуле изобретения, нецелесообразно.

Пример 2

Получение токсокаровой иммунной сыворотки и подготовка ее для использования в экспресс-тесте иммунохроматографического метода.

Полученный по примеру 1 токсокаровый антиген с концентрацией белка 90-110 мкг/мл в дозе 1 мл смешивают с адъювантом Фрейда в соотношении 1:3,5 до получения однородной эмульсии. Полученную эмульсию подогревают в термостате до 40°С и вводят кроликам по 0,2 мл подкожно в область регионарных лимфатических узлов с двух сторон, а также в область брюшной стенки на уровне расположения мезентериальных лимфатических узлов.

На 7-8-й дни кроликам дополнительно вводят полученный по примеру 1 токсокаровый антиген внутримышечно по 0,25 мл в области лопатки, поясницы и бедра с двух сторон.

На 12-й и 15-й дни курса иммунизации у кроликов берут кровь из ушной вены в количестве 15 мл, выдерживают ее в термостате в течение 2 часов и отделяют иммунную сыворотку от фибринового сгустка.

Кровь из ушной вены следует брать в количестве 12-18 мл. Если взять кровь в количестве менее 12 мл, то полученной сыворотки может быть недостаточно для проведения теста. Брать кровь у кроликов в количестве более 18 мл нецелесообразно.

С помощью РНГА устанавливают титр антител полученных иммунных сывороток. Для последующего использования в иммунохроматографическом методе отбирают иммунные сыворотки без признаков гемолиза и с титром антител не менее 1: 200, к которым добавляют ФСБ в соотношении 1:3 (для сыворотки с титром 1:800).

К красителю метиленовый синий добавляют ФСБ в соотношении 1:500. Разбавленные кроличью сыворотку и краситель метиленовый синий смешивают в равных объемах, выдерживают при комнатной температуре в течение 35 минут и наносят на тест-полоски нитроцеллюлозной мембраны, которые помещают во влажную камеру термостата при температуре 37°С на 40 минут.

В процессе выдерживания при комнатной температуре и во влажной камере термостата происходит конъюгация содержащихся в иммунной кроличьей сыворотке токсокаровых антител с красителем метиленовый синий и соединение образовавшегося конъюгата с нитроцеллюлозной мембраной на молекулярном уровне.

В результате проведенных исследований установлено, что, с целью точности диагностики, токсокаровый антиген перед введением кроликам рекомендуется смешивать с адъювантом Фрейда в соотношении 1:2,5-1:5,0 и подогревать в термостате до температуры 38-40°С. Через 7-8 дней кроликам рекомендуется дополнительно вводить токсокаровый антиген дробно по 0,2-0,25 мл, а кровь перед отделением иммунной сыворотки рекомендуется помещать в термостат на 1,5-2,0 часа. К отобранной иммунной сыворотке рекомендуется добавлять ФСБ в соотношении от 1:2 до 1:5. Смесь разбавленных иммунной сыворотки и красителя перед нанесением их на тест-полоски рекомендуется выдерживать при комнатной температуре в течение 30-40 минут, а тест-полоски для конъюгации токсокаровых антител с красителем метиленовый синий рекомендуется помещать во влажную камеру термостата при температуре 37°С на 35-40 минут для конъюгации иммунной сыворотки с красителем и соединения образовавшегося конъюгата с нитроцеллелюзной мембраной на молекулярном уровне. Время нахождения тест полосок в камере термостата менее 35 минут влияет на качество конъюгата, увеличение же времени нахождения тест полосок в камере термостата более 40 минут нецелесообразно.

Пример 3

Экспресс-тест на токсокароз иммунохроматографическим методом,

а) Экспресс-тест на выявление антител к личиночным стадиям возбудителя токсокароза проводят следующим образом:

Получают сыворотку крови от людей и собак.

Всего исследовано:

- 109 сывороток крови взрослых людей;

- 45 сывороток крови детей 6-14 лет;

- 57 сывороток крови беспородных щенков.

К исследуемым образцам добавляют ФСБ в соотношении 1:5 и полученный раствор наносят с помощью микротитровальной пипетки на тест-полоски, подготовленные по примеру 1.

Образцы сыворотки крови наносят в две зоны: тестовую и контрольную.

I вариант - зона с антигеном Toxocara canis, полученным по примеру 1(I - тестовая) и зона ФСБ + краситель (контрольная - К).

II вариант - зона с кроличьей иммунной сывороткой, полученной по примеру 2, которая содержит специфические антитела против Toxocara canis (II - тестовая) и зона ФСБ + краситель (контрольная - К).

Контрольные зоны не содержит токсокаровый антиген (I) и специфические антитела (II).

Токсокароз в заявленном экспресс-тесте диагностируют на основании того, что:

- до нанесения образцов тест-полоска нитроцеллюлозной мембраны имеет бледно-голубой цвет;

- каждая тест-полоска нитроцеллюлозной мембраны имеет зоны индикации антител (I), антигена (II) и контрольную (К) - фиг. 1;

- при индикации антител или антигена Toxocara canis в диагностических зонах тест-полоски при просмотре с помощью микроскопа МБС-10 (ок. 10 × об. 8) обнаруживают поперечно расположенные хроматографические линии темно-синего цвета - от 3 до 7.

Интенсивность окрашивания в синий цвет может различаться в зависимости от количества токсокаровых антител или антигенов в образцах сывороток крови;

- в контрольной зоне К (ФСБ + краситель метиленовый синий) после нанесения исследуемых образцов сыворотки крови поперечно расположенные линии темно-синего цвета на светло-голубом фоне при просмотре тест-полосок не выявляют, и результат считают отрицательным.

В 9 из 109 (8,2%) образцах сывороток крови от взрослых людей, в 4 из 45 (8,8%) - от детей и в 11 из 57 (19,3%) - от щенков при просмотре тест-полосок выявлены поперечно расположенные относительно короткие линии темно-синего цвета, т.е. экспресс-тест ИХА на токсокароз оказался положительным (фиг. 2).

При исследовании всех остальных образцов сывороток крови в тест-полосках на светло-голубом фоне не выявили хроматографические линии темно-синего цвета, соответствующие белковому спектру антигенов личинок токсокар, т.е. получен отрицательный результат (фиг. 3).

В контрольных зонах тест-полосок при просмотре линии темно-синего цвета на светло-голубом фоне также не выявлены (фиг. 4).

Сыворотки крови людей, у которых экспресс-тест на токсокароз, проведенный заявленным способом, оказался положительным, были исследованы при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) с тест-системой НПО «Вектор» (г. Новосибирск). Скрининг в ИФА позволил во всех случаях выявить специфические IgG антитела к токсокарам.

б) Проведение экспресс-теста на выявление антигена возбудителя токсокароза в исследуемом образце с помощью иммунохроматографического анализа.

Используют диагностические тест-полоски нитроцеллюлозной мембраны с конъюгированными токсокаровыми антителами, подготовленные по примеру 2. Исследуемые образцы сыворотки крови разводят ФСБ в соотношении 1:5 и наносят с помощью микротитровальной пипетки на тест-полоски. По обнаружению на тест-полоске с помощью микроскопа МБС-10 (×8) поперечно расположенных линий темно-синего цвета диагностируют токсокароз (фиг. 5 и фиг. 6).

Если после нанесения исследуемого образца тест-полоска в зоне индикации антител (I) или антигена (II) Toxocara canis сохраняет светло-голубой цвет (фиг. 3), как в контроле (фиг. 4), и при просмотре с помощью микроскопа МБС-10 (×8) не выявляют поперечно расположенные линии темно-синего цвета, то результат считают отрицательным.

Общее количество положительных результатов исследований на токсокароз с помощью экспресс-теста ИХА на антигены личинок токсокар у щенков - 2 из 45 (4,4%). При этом полученные результаты во всех случаях подтверждены в ИФА с тест-системой НПО «Вектор» (г. Новосибирск).

На основании изложенного выше можно сделать вывод о том, что заявленная группа изобретений позволяет:

- в максимально короткие сроки - в течение нескольких минут - и с большой точностью диагностировать токсокароз, т.к. при сопоставлении результатов ИФА и предложенного экспресс-теста установлена высокая корреляция в 98%. Кроме того, сероэпидемиологический мониторинг по токсокарозу в Центральном районе Российской Федерации показал соответствие полученных результатов известным среднестатистическим показателям за последние 10-20 лет;

- выполнить анализ и поставить диагноз с минимальными трудозатратами и требованиями к квалификации персонала;

- снизить затраты на реактивы, т.к. в заявленном тесте используется недорогой краситель - метиленовый синий;

- снизить затраты на материалы, т.к. на одну тест-полоску затрачивается всего 0,05-0,1 мл подготовленных иммунореагентов, и получение 5-10 мл антигена и примерно такого же объема кроличьей иммунной сыворотки позволяет выполнить исследования на токсокароз 250-500 образцов крови животных или человека;

- отказаться от дорогостоящего оборудования, т.к. в наборы тестов уже включено все необходимое, и никакие дополнительные опции не требуются.

Таким образом, заявленная группа изобретений обеспечивает возможность проведения анализа ветеринарным или медицинским врачом там, где это необходимо, т.е. без отправки биоматериала в лабораторию, что очень важно для оперативной оценки состояния пациента и принятия решения о начале терапии в течение клинического осмотра.

Коммерческая доступность заявленного экспресс-теста позволяет проводить исследования на токсокароз широкого круга населения, и, в случае подтверждения диагноза на синдром «larva migrans» Toxocara canis, начать эффективное лечение до развития органной патологии.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения токсокарового антигена для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, а также к способу получения конъюгата токсокарового антигена с красителем для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, его включающему. Также раскрыт способ получения тест-полоски для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, включающий получение коъюгата токсокарового антигена с красителем метиленовый синий, а также тест-полоска для проведения экспресс-теста на токсокароз, полученная указанным способом. Изобретение также относится к способу получения токсокаровой иммунной сыворотки для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, включающему получение токсокарового антигена вышеуказанным способом, способу получения конъюгата токсокаровой иммунной сыворотки с красителем для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом с его использованием, а также к способу получения тест-полоски для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, тест-полоске, им полученной, а также к экспресс-тесту для диагностики токсокароза иммунохроматографическим методом, ее включающему. Изобретение эффективно для анализа на токсокароз иммунохроматографическим методом без отправки биоматериала в лабораторию, и в максимально короткие сроки - в течение 3-5 минут, и с большой точностью. 9 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 пр.

1. Способ получения токсокарового антигена для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, отличающийся тем, что проводят дегельминтизацию зараженных токсокарами животных, через 8-28 часов после дегельминтизации осуществляют макрогельминтологические исследования и отбирают самок токсокар с размером более 15 см в длину, извлекают у них матку, разрушают матку и получают яйца токсокар, которые культивируют в течение 3-6 недель в фосфатно-солевом буферном растворе с добавленным к нему глютамином в конечной концентрации 1%, после чего отбирают яйца токсокар со сформировавшимися в них и проявляющими подвижность личинками, помещают отобранные яйца в фосфатно-солевой буферный раствор, к которому добавлен панкреатин в конечной концентрации 1,25-1,5%, культивируют отобранные яйца при температуре 37°С в течение 20-24 часов, затем освободившихся личинок токсокар помещают на 48-72 часа в фосфатно-солевой буферный раствор, к которому также добавлен глютамин в конечной концентрации 1%, отделяют культуральную жидкость и путем ее центрифугирования при 6000-8000 об/мин в течение 10-60 минут выделяют антиген Toxocara canis.

2. Способ получения конъюгата токсокарового антигена с красителем для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, отличающийся тем, что осуществляют способ получения токсокарового антигена по п. 1, полученный токсокаровый антиген смешивают с фосфатно-солевым буферным раствором в соотношении 1:1,5-1:2,5, добавляют равный объем красителя метиленовый синий, который также предварительно смешивают с фосфатно-солевым буферным раствором в соотношении 1:500, смесь разбавленных токсокарого антигена и красителя выдерживают при комнатной температуре в течение 35-40 минут для конъюгации компонентов.

3. Способ получения тест-полоски для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, отличающийся тем, что осуществляют способ получения коъюгата токсокарового антигена с красителем метиленовый синий по п. 2, полученный конъюгат наносят на тест-полоски нитроцеллюлозной мембраны и помещают тест-полоски во влажную камеру термостата при температуре 37°С на 35-40 минут.

4. Тест-полоска для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, отличающаяся тем, что получена способом по п. 3 и представляет собой соединенный с нитроцеллюлозной мембраной конъюгат токсокарового антигена с красителем метиленовый синий.

5. Способ получения токсокаровой иммунной сыворотки для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, отличающийся тем, что осуществляют способ получения токсокарового антигена по п. 1, полученный токсокаровый антиген смешивают с адъювантом Фрейда в соотношении 1:2,5-1:5,0 до получения однородной эмульсии, затем полученную эмульсию подогревают в термостате до 38-40°С и вводят кроликам подкожно в дозе по 0,2 мл в область регионарных лимфатических узлов с двух сторон, а также в область брюшной стенки на уровне расположения мезентеральных лимфатических узлов, затем через 7-8 дней кроликам дополнительно вводят полученный способом по п. 1 токсокаровый антиген внутримышечно дробно по 0,2-0,25 мл в области лопатки, поясницы и бедра с двух сторон, после чего на 12-й и 15-й дни после первого введения антигена у кроликов берут кровь из ушной вены в количестве 12-18 мл, помещают ее в термостат на 1,5-2 часа, затем отделяют иммунную сыворотку и отбирают иммунную сыворотку без признаков гемолиза с титром антител не менее 1:200.

6. Способ получения конъюгата токсокаровой иммунной сыворотки с красителем для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, отличающийся тем, что осуществляют способ получения токсокаровой иммунной сыворотки по п. 5, к полученной токсокаровой иммунной сыворотке добавляют фосфатно-солевой буферный раствор в соотношении 1:2-1:5, полученный раствор в равных объемах смешивают с красителем метиленовый синий, к которому также предварительно добавляют фосфатно-солевой буферный раствор в соотношении 1:500, после чего смесь разбавленных токсокаровой иммунной сыворотки и красителя выдерживают при комнатной температуре в течение 30-40 минут для конъюгации компонентов.

7. Способ получения тест-полоски для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, отличающийся тем, что осуществляют способ получения конъюгата токсокаровой иммунной сыворотки с красителем метиленовый синий по п. 6, полученный конъюгат наносят на тест-полоски нитроцеллюлозной мембраны и помещают тест-полоски во влажную камеру термостата при температуре 37°С на 35-40 минут.

8. Тест-полоска для проведения экспресс-теста на токсокароз иммунохроматографическим методом, отличающаяся тем, что получена способом по п. 7 и представляет собой соединенный с нитроцеллюлозной мембраной конъюгат токсокарововой иммунной сыворотки с красителем метиленовый синий.

9. Экспресс-тест для диагностики токсокароза иммунохроматографическим методом, включающий тест-полоску по п. 4 или тест полоску по п. 8, причем наличие на указанных тест-полосках после нанесения на них исследуемых образцов сыворотки или плазмы крови поперечно расположенных линий темно-синего цвета является индикатором положительного результата на токсокароз.