Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Виктория/2019/276 (H1N1) pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2022 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А, А/17/Виктория/2019/276 (H1N)pdm09.

В сентябре 2020 ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) дала рекомендации по замене A/H1N1pdm09 компонента в составе противогриппозных вакцин для Южного полушария на 2021 эпидемический сезон на А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09-подобные вирусы [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2021 southern hemisphere influenza season. 25 September 2020. https://wvm.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2021_south/en/]. В феврале 2021 года этот вирус был рекомендован в качестве A/H1N1pdm09 компонента в составе противогриппозных вакцин и для Северного полушария на эпидемический сезон 2021-2022 [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2021 - 2022 northern hemisphere influenza season. 26 February 2021. https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2021-22_north/en/].

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа, А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09, известный вакцинный штамм А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 - прототип [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Баженова Е.А., Киселева И.В., Матюшенко В.А., Исакова-Сивак И.Н., Ларионова Н.В., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2735291. Опубликовано: 29.10.2020 Бюл. №31] - утратил свою актуальность.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09-подобного вакцинного штамма живой гриппозной вакцины для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического вируса А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Shcherbik, S.; Pearce, N.; Kiseleva, I.; Larionova, N.; Rudenko, L.; Xu, X.; Wentworth, D.E.; Bousse, T. Implementation of new approaches for generating conventional reassortants for live attenuated influenza vaccine based on Russian master donor viruses. J Virol Methods 2016, 227, 33-39, doi: 10.1016/j.jviromet.2015.10.009].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный Минздравом РФ для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации. На основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) был создан вакцинный штамм А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09 с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts, и са-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к реассортантному вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в перекрестной РТГА с гомологичными сыворотками антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09, поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 и родительского штамма А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09 с крысиными антисыворотками, полученными к эпидемическому вирусу А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09 и к вакцинному штамму А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09, полностью совпадали (табл.1). Соответствие последовательности белка вакцинного реассортанта А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 и родительского вируса А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09 подтверждено секвенированием соответствующего сегмента генома;

- генетическая последовательность второго ответственного за антигенную специфичность поверхностного белка вакцинного штамма -нейраминидазы (NA) - была определена методом полного секвенирования соответствующего сегмента генома и было показано соответствие последовательности соответствующему генетическому сегменту вируса А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09.

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов, аналогичный описанному [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины.// «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» - №2. - 2018. - с. 101-107] с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклеотидов, разработанных в программе PSQ Assay Design для анализа генома современных штаммов подтипа H3N2 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), принадлежат пандемическому родительскому вирусу А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09, а гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), - донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Таким образом, полное секвенирование генома штамма А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 подтвердило его вакцинную формулу генома.

Генетическая стабильность кодирующих мутаций. Генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 изучали определением сохранности кодирующих мутаций во внутренних генах до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, в куриных эмбрионах. Определение последовательности соответствующих фрагментов генома производилось с использованием метода пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры разработаны с использованием компьютерной программы PSQ Assay Design.

На фиг. 1 приведен пример пирограммы, полученной для фрагмента гена РА, содержащего аттенуирующую мутацию в позиции Т-107-С у донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), приводящую к замене Leu-28-Pro. Чтение нуклеотидов происходит с комплементарной цепи. Присутствие замены характеризуется отсутствием пика во второй позиции и увеличенным пиком в третьей позиции. Фрагмент А - пиросеквенирование гена РА «дикого» варианта вируса, не содержащего замены. Фрагмент Б - пиросеквенирование гена РА донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57. Фрагмент В - пиросеквенирование гена РА вакцинного штамма А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09.

В результате пиросеквенирования вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) - эпидемического предшественника донора аттенуации, не обладающего аттенуирующей мутацией, пики во второй (А) и третьей (G) позициях одинаковой высоты (фиг. 1, фрагмент А). Наличие аттенуирующей мутации Т-107-С характеризуется пиком увеличенной высоты в третьей позиции (G) и отсутствием пика во второй позиции (А), что можно увидеть на пирограмме, полученной для донора аттенуации

А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (фиг. 1, фрагмент Б), а также на пирограмме, полученной для гена РА вакцинного штамма А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 (фиг. 1, фрагмент В).

Полученные данные пиросеквенирования подтвердили наличие всех кодирующих нуклеотидных замен, охарактеризованных для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственных за его аттенуацию, во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 до и после его пятикратного пассирования (табл. 3).

Фенотипические характеристики пассажного варианта также не претерпели никаких изменений (табл. 4).

Все вышесказанное подтверждает высокую генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 проводили путем его параллельного титрования в развивающихся куриных эмбрионах при разных температурах инкубации. Вакцинный штамм А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 обладает фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила менее ≤1.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации составила 6.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Все результаты фенотипического анализа представлены в табл. 4.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04. 2016. https://cdnimg.rg.ru/pril/130/25/64/43232.pdf].

Мышам вводили однократно одну человеческую дозу (0,5 мл), вакцинного вируса внутрибрюшинно в титре 7.0 lg ЭИД₅₀/мл. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 5) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

В результате исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека. Заявляемый штамм по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: PN003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную алланто-исную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 депонирован 11.11.2020 г в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2964.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов составляет 8.7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:128.

Штамм проявляет генетическую стабильность и стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен вакцинный А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09 - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса А/Виктория/2570/2019 (H1N1)pdm09 с холодоадаптированным температуро-чувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Предложенный штамм может быть использован для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. 1 ил., 5 табл.

Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Виктория/2019/276 (H1N1)pdm09, депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2964, для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.