Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/БРИСБЕН/2018/8175 (H1N1) pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2020 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А, А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1) pdm09.

В феврале 2019 ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) дала рекомендации по замене H1N1pdm09 компонента в составе противогриппозных вакцин для Северного полушария на эпидемический сезон 2018-2019 гг. на А/Брисбен/02/2018 (Н1N1)dpm09-подобные вирусы [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2019-2020 northern hemisphere influenza season. 21 February 2019. https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2019_20_ north/en/].

В результате появления в циркуляции нового высоко эпидемического штамма вируса гриппа, A/Брисбен/02/2018(H1N1)pdm09, известный вакцинный штамм A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1)pdm09 - прототип [Дубровина И.А., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2653388. Опубликовано 08.05.2018, Бюлл. №13] - утратил свою актуальность.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального А/Брисбен/02/2018 (Н1N1)pdm09-подобного вакцинного штамма живой гриппозной вакцины для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического вируса А/Брисбен/02/2018(Н1N1)pdm09.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопросы вирусологии. 1977. №4. С. 387-395].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный Минздравом РФ для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации. На основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) был создан вакцинный штамм А/17/Брисбен/2018/8175(Н1N1)pdm09.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Брисбен/02/2018(Н1N1)pdm09 с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts, са-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к реассортантному вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Брисбен/02/2018(Н1N1)pdm09, поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 и родительского штамма А/Брисбен/02/2018(Н1N1)pdm09с крысиной антисывороткой, полученной к эаидемическому вирусу А/Брисбен/02/2018 (H1N1)pdm09, полностью совпадали (табл. 1). Соответствие последовательности белка вакцинного реассортанта А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 и родительского вируса А/Брисбен/02/2018 (H1N1)pdm09 подтверждено секвенированием соответствующего сегмента генома;

- соответствие второго ответственного за антигенную специфичность поверхностного белка вакцинного штамма - нейраминидазы (NA) - подтверждено путем определения генетической последовательности бго сегмента генома, по которой он соответствует 6му сегменту генома вируса А/Брисбен/02/2018 (H1N1)pdm09.

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали частичное секвенирование ДНК копий генов [Matyushenko V. et al. Genotyping assay for differentiation of wild-type and vaccine viruses in subjects immunized with live attenuated influenza vaccine. PLoSOne. 2017. Vol. 12 №7. P.e0180497. doi: 10.1371/journal.pone.0180497].

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), принадлежат пандемическому родительскому вирусу А/Брисбен/02/2018 (H1N1)pdm09, а гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1,РА, NP, М, NS), - донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Таким образом, полное секвенирование генома штамма А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 подтвердило его вакцинную формулу генома.

Генетическая стабильность кодирующих мутаций. Генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Брисбен/2018/8175(Н1N1)pdm09 изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций во внутренних генах до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, в куриных эмбрионах с использованием метода пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры разработаны с использованием компьютерной программы PSQ AssayDesign. Полученные данные пиросеквенирования подтвердили наличие всех кодирующих нуклеотидных замен, охарактеризованных для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию, во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Брисбен/2018/8175 (Н1N1)pdm09 до и после его пятикратного пассирования (табл. 3).

Все вышесказанное подтверждает высокую генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Брисбен/2018/8175(H1N 1)pdm09.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Брисбен/2018/8175 (Н1N1)pdm09 проводили путем его параллельного титрования в развивающихся куриных эмбрионах при разных температурах инкубации. Вакцинный штамм А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 обладает фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила менее ≤1.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации составила 5.4log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Все результаты фенотипического анализа представлены в табл. 4.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Брисбен/2018/8175(Н1N1)pdm09 проводили на белых беспородныхмыщах в соответствии с Руководствомпо проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководствопо проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04. 2016. https://rg.ru/2016/09/02/minzdrav-prikaz 199-site-dok.html].

Мышам вводили однократно одну человеческую дозу (0,5 мл), вакцинного вируса внутрибрюшинно в титре7,0lg ЭИД₅₀/мл. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 5) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

Заключение

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинньш штамм живой гриппозной вакцины А/17/Брисбен/2018/8175(Н1N1)pdm09 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Брисбен/02/2018(Н1N1)pdm09, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека. Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Брисбен/2018/8175(Н1N1)pdm09 прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Брисбен/2018/8175(Н1N1)pdm09 по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак^®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Брисбен/2018/8175(Н1N1)pdm09 депонирован 12.07.2019 года в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2931.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Брисбен/2018/8175(Н1N1)pdm09 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов составляет 8,4log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:256.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Брисбен/2018/8175(Н1N1)pdm09 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Заявляемый вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/2018/8175(Н1N1)pdm09 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм вируса А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1) pdm09 - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса А/Брисбен/02/2018 (Н1N1) pdm09 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Изобретение может быть использовано для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1) pdm09. 5 табл

Штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1) pdm09, депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2931, для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.