Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А.

Полученные данные из опорных баз Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), расположенных в странах Северного полушария, показали, что с сентября 2019 по февраль 2020 в человеческой популяции социркулировали вирусы A/H1N1pdm09, принадлежащие к трем субклайдам 6В.1А.5А, 6В.1А.5В и 6В.1А.7, но наиболее широкое распространение получили штаммы, относящиеся субклайду 6В.1А.5А. В связи с этим на основании этих данных в феврале 2020 ВОЗ дала рекомендации по замене A/H1N1pdm09 компонента в составе противогриппозных вакцин для Северного полушария на 2020-2021 эпидемический сезон на А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09-подобные вирусы, относящиеся к субклайду 6В.1А.5А, являющимся доминирующими в странах Северного полушария [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2020-2021 northern hemisphere influenza season. 28 February 2020. https://www.who.int/publications/m/item/recommended-composition-of-influenza-virus-vaccines-for-use-in-the-2020-2021-northern-hemisphere-influenza-season]. Сравнительный анализ последовательности поверхностных белков гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) вирусов А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09 и А/Айова/59/2018 (H1N1)pdm09, показал что вирус А/Айова/59/2018 (H1N1)pdm09 генетически относится к субклайду 6В.1А.5А, что свидетельствует от том, что данный вирус можно отнести А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09-подобным вирусам.

В результате появления в циркуляции А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09-подобных вирусов, к которым можно отнести новый эпидемический штамм вируса гриппа A/Айова/59/2018(H1N1)pdm09, известный вакцинный штамм А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 - прототип [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Баженова Е.А., Киселева И.В., Матюшенко В.А., Исакова-Сивак И.Н., Ларионова Н.В., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2735291. Опубл: 29.10.2020 Бюл. №31] - утратил свою актуальность и вследствие этого не может эффективно защищать население во время эпидемии, вызванной А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического вируса А/Айова/59/2018 (H1N1)pdm09.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными, безвредными для человека штаммами - донорами аттенуации [Shcherbik, S.; Pearce, N.; Kiseleva, L; Larionova, N.; Rudenko, L.; Xu, X.; Wentworth, D.E.; Bousse, T. Implementation of new approaches for generating conventional reassortants for live attenuated influenza vaccine based on Russian master donor viruses. J Virol Methods 2016, 227, 33-39, doi:10.1016/j.jviromet.2015.10.009].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2 - два гена, кодирующих поверхностные белки вируса гриппа НА и NA, наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) - от донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма

Вакцинный штамм А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса A/Айова/59/2018(H1N1)pdm09 с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Выбранный чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 показало, что ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок НА вакцинного штамма был изучен в перекрестной реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с сыворотками, полученными против донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 и эпидемического вируса А/Айова/59/2018(H1N1)pdm09.

Было показано, что эпидемический вирус A/Айова/59/2018(H1N1)pdm09 и вакцинный реассортант А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 не имеют антигенного сродства с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57, поскольку титры, при которых происходит торможение гемагглютинации антисывороткой, у исследуемых вирусов были ниже порога детекции. В то время как показатели торможения гемагглютинации реассортанта А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 и родительского штамма A/Айова/59/2018(H1N1)pdm09 в перекрестной РТГА с гомологичными крысиными антисыворотками, полученными к эпидемическому вирусу A/Айова/59/2018(H1N1)pdm09 и к вакцинному реассортанту А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09, полностью совпадали (табл. 1), что свидетельствует о антигенной идентичности вакцинного штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 эпидемическому вирусу A/Айова/59/2018(H1N1)pdm09. Кроме того, секвенированием четвертого сегмента генома было показано соответствие последовательности транслируемого белка вакцинного реассортанта А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 и родительского вируса A/Айова/59/2018(H1N1)pdm09.

Второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок NA вакцинного штамма проверен методом полного секвенирования последовательности соответствующего гена, в ходе которого была подтверждена идентичность последовательности данного гена соответствующему гену эпидемического родительского вируса А/Айова/59/2018 (H1N1)pdm09, из чего очевидно следует его полная антигенная идентичность.

Для анализа состава генома полученных в процессе подготовки вакцинного штамма реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов, аналогичный описанному [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины // «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» - №2. - 2018. - с. 101-107] с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклеотидов, разработанных для анализа генома современных штаммов подтипа A/H1N1pdm09 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 представлены в табл. 2. Установлено, что формула генома вакцинного штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 - 6:2, что соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: сегменты генома, кодирующие поверхностные белки НА и NA, унаследованы от эпидемического родительского вируса А/Айова/59/2018 (H1N1)pdm09, сегменты генома, кодирующие внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), унаследованы от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Данные, полученные при отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома. Было показано, что последовательность сегментов, генома, кодирующих внутренние и неструктурные белки, полностью соответствует последовательности соответствующих сегментов генома донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2), последовательность генов, кодирующих НА и NA, полностью соответствует последовательности соответствующих генов вируса А/Айова/59/2018(H1N1)pdm09.

Генетическую стабильность кодирующих мутаций, связанных с аттенуированным фенотипом вакцинного штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 изучали сравнением сохранности данных мутаций до и после пятикратного пассирования в РКЭ вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57. Последовательность нуклеотидов на интересующем участке определяли методом пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры были разработаны с использованием компьютерной программы PSQ Assay Design. Пример пирограммы, полученной для фрагмента гена М, содержащего аттенуирующую мутацию в позиции 457 у донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), приведен на фиг. 1.

В результате пиросеквенирования вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) - эпидемического предшественника донора аттенуации, не обладающего аттенуирующей мутацией, пик во второй позиции оказался выше пика в четвертой позиции (рисунок 1, А). Наличие аттенуирующей мутации Т → G характеризуется снижением пика во второй позиции и повышением - в четвертой, что можно увидеть на пирограмме, полученной для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (фиг. 1, Б), а также на пирограмме, полученной для фрагмента гена М вакцинного штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 (фиг. 1, В). В таблице 3 приведены результаты пиросеквенирования всех фрагментов генов вакцинного штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09, содержащих аттенуирующие мутации, соответствующие донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), до и после пятикратного пассирования в РКЭ. Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 и не утрачиваются в процессе пассирования. Таким образом, анализ сохранности аттенуирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 показал генетическую стабильность его аттенуирующих мутаций и отсутствии их реверсий в процессе пассирования.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 в РКЭ обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤1.2 lg ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 5.5 lg ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Безвредность для мышей

Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с.] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04.2016. https://cdnimg.rg.ru/pril/130/25/64/43232.pdf]

Мышам вводили однократно внутрибрюшинно вакцинный вирус с титром 7.0 lg ЭИД₅₀/мл в 0.5 м, что соответствовало одной дозе вакцинного препарата для человека. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 5) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью актуального эпидемического вируса А/Айова/59/2018 (H1N1)pdm09, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека. Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 депонирован 11.11.2020 года в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского под №2968 и имеет характеристики, представленные в образце паспорта штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 при репродукции в РКЭ при 32°С в течение 48 часов - 9.0 lg ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:1024 с 1.0% куриными эритроцитами.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей в РКЭ (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09, депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2968. Вакцинный штамм А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09 – реассортант получен путем скрещивания эпидемического вируса А/Айова/59/2018 (H1N1)pdm09 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Штамм характеризуется температурочувствительностью, холодоадаптированностью и безвредностью и может быть использован для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины. 1 ил., 5 табл.

Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Айова/2018/5388 (H1N1)pdm09, депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2968, для получения живой гриппозной интраназальной гриппозной вакцины для взрослых и для детей.