Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2022 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А.

В сентябре 2019 Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала заменить A(H3N2) компонент в составе противогриппозных вакцин для Южного полушария на 2020 гг.эпидемический сезон на А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2)-подобные вирусы [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2020 southern hemisphere influenza season. 27.09.2019. https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2020_south/en/]. Это было связано с появлением в циркуляции в странах Южного полушария значительной доли штаммов подтипа A (H3N2), относящихся к субкладу 3С.2а1 и антигенно отличающихся от вирусов гриппа, относящихся к субкладу 3С.3а, рекомендованных для производства компонента A (H3N2) вакцины в Северном полушарии, что привело к изменению компонента A (H3N2) на вирус субклада 3С.2а1 для Южного полушария. [Epperson S., et al. Update: Influenza activity-United States and worldwide, May 19-September 28, 2019, and composition of the 2020 southern hemisphere influenza vaccine. // Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 2019 - V. 68. - P. 880-884].

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2), известный вакцинный штамм А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) - прототип [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Баженова Е.А., Ларионова Н.В., Киселева И.В., Котомина Т.С., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2732610 от 20.09.2020 - Опубл. БИ 2020. - №27] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может обеспечить защиту во время эпидемии, вызванной А/Южная Австралия/34/2019-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического штамма А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2).

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Shcherbik, S.; Pearce, N.; Kiseleva, I.; Larionova, N.; Rudenko, L.; Xu, X.; Wentworth, D.E.; Bousse, T. Implementation of new approaches for generating conventional reassortants for live attenuated influenza vaccine based on Russian master donor viruses. J Virol Methods 2016, 227, 33-39, doi:10.1016/j.jviromet. 2015.10.009].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Южная Австралия/34/2019 с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2), поскольку показатели взаимодействия реассортанта A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) и родительского штамма А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2) с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2), и наоборот полностью совпадали (табл. 1).

- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом секвенирования и идентичен вирусу А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2).

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов, аналогичный описанному [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины // «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» - №2. - 2018. - с. 101-107] с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклеотидов, разработанных в программе PSQ Assay Design для анализа генома современных штаммов подтипа H3N2 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2), гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Полное секвенирование генома вакцинного штамма A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) показало генетическую стабильность сегментов генома, унаследованных вакцинным штаммом от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2). Кроме того, в генах, унаследованных от донора аттенуации, не появилось дополнительных мутаций в ходе получения вакцинного штамма.

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, в куриных эмбрионах с использованием метода пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры разработаны с использованием компьютерной программы PSQ Assay Design.

На фиг. 1 приведен пример результата пиросеквенирования фрагмента гена РВ2, содержащего в позиции 1459 необходимую для аттенуации замену G-1459-T, приводящую к замене Val-478-Leu. Чтение нуклеотидов происходит с комплементарной цепи. Присутствие замены характеризуется наличием пика в первой позиции. Фрагмент А - пиросеквенирование гена РВ2 «дикого» варианта вируса, не содержащего замены. Фрагмент Б - пиросеквенирование гена РВ2 донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57. Фрагмент В - пиросеквенирование гена РВ2 вакцинного штамма A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2).

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2), проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2), в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤1.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 6.8 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.:2010. 39 с.] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04.2016. https://cdnimg.rg.ru/pril/130/25/64/43232.pdf].

Мышам вводили однократно одну человеческую дозу, соответствующую 0.5 мл, вакцинного вируса внутрибрюшинно в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/мл. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 4) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интра-назального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) депонирован 11.11.2020 года в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского (Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2959 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 9.0 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:1024

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый вакцинный штамм вируса гриппа A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен реассортантный штамм A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2), полученный путем скрещивания эпидемического вируса А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Предложенный штамм может быть использован для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. 1 ил., 5 табл.

Реассортантный штамм вируса гриппа A/17/Южная Австралия/2019/122 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2959, для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.