Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А.

В связи с доминирующим распространением в странах Северного полушария с сентября 2019 года по февраль 2020 года штаммов вируса гриппа A/H1N1pdm09, относящиеся субклайду 6 В.1А.5А, в феврале 2020 года ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) рекомендовала заменить A/H1N1pdm09 компонента в составе противогриппозных вакцин для Северного полушария на 2020-2021 эпидемический сезон на А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09-подобные вирусы, относящиеся к субклайду 6В.1А.5А [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2020 - 2021 northern hemisphere influenza season. 28 February 2020. https://www.who.int/publications/m/item/recommended-composition-of-influenza-virus-vaccines-for-use-in-the-2020-2021-northern-hemisphere-influenza-seasonl. Поскольку вирус А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09 относится к субклайду 6 В.1А.5А, как и А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09-подобные вирусы, он может быть использован в качестве A/H1N1pdm09 компонента в составе противогриппозных вакцин для Северного полушария на 2020-2021 эпидемический сезон.

В результате появления в циркуляции А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09 - подобных вирусов, к которым можно отнести новый эпидемический штамм вируса гриппа А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09, известный вакцинный штамм А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1)pdm09 - прототип [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Баженова Е.А., Киселева И.В., Матюшенко В.А., Исакова-Сивак И.Н., Ларионова Н.В., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/2018/8175 (H1N1) pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2735291. Опубликовано: 29.10.2020 Бюл. №31] - утратил свою актуальность и вследствие этого не может эффективно защищать население во время эпидемии, вызванной А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09 - подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического А/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09 - подобного вируса А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными, безвредными для человека штаммами - донорами аттенуации [Shcherbik, S.; Pearce, N.; Kiseleva, I.; Larionova, N.; Rudenko, L.; Xu, X.; Wentworth, D.E.; Bousse, T. Implementation of new approaches for generating conventional reassortants for live attenuated influenza vaccine based on Russian master donor viruses. J Virol Methods 2016, 227, 33-39, DOI: 10.1016/j.jviromet.2015.10.009].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С.66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2 - два гена, кодирующих поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) - от донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09 с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Выбранный чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и ca- фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму. Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - НА - был изучен в перекрестной реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с сыворотками, полученными против донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 и эпидемического вируса А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09. Было показано, что эпидемический вирус А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09 и вакцинный реассортант А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm0, не имеют антигенного сродства с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57, поскольку титры, при которых происходит торможение гемагглютинации антисывороткой, у исследуемых вирусов были ниже порога детекции. В то же время показатели торможения гемагглютинации реассортанта А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 и родительского штамма А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09 в перекрестной РТГА с гомологичными крысиными антисыворотками, полученными к эпидемическому вирусу А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09 и вакцинному реассортанту А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 полностью совпадали (табл.1), что свидетельствует об антигенной идентичности вакцинного штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 эпидемическому вирусу А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09. Также секвенированием четвертого сегмента генома (гена, кодирующего НА) было показано соответствие последовательности транслируемого белка вакцинного реассортанта А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 и родительского вируса А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09.

Второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - NA - проверен методом полного секвенирования последовательности соответствующего гена, в ходе которого была подтверждена идентичность последовательности данного гена соответствующему гену эпидемического родительского вируса А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09, из чего очевидно следует его полная антигенная идентичность.

Для анализа состава генома полученных в процессе подготовки вакцинного штамма реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов, аналогичный описанному [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины // «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» - №2. - 2018. - с. 101-107] с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклеотидов, разработанных для анализа генома современных штаммов подтипа A/H1N1pdm09 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 представлены в табл.2. Установлено, что формула генома вакцинного штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 - 6:2, что соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки НА и NA унаследованы от эпидемического родительского вируса А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09, гены, кодирующие внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), унаследованы от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Данные, полученные при отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома. Было показано, что последовательность генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, полностью соответствует последовательности соответствующих генов донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл.2), последовательность генов, кодирующих НА и NA, полностью соответствует последовательности соответствующих генов вируса А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09.

Генетическую стабильность кодирующих мутаций, связанных с аттенуированным фенотипом вакцинного штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09, изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования в РКЭ вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Последовательность нуклеотидов на интересующем участке определяли методом пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры разработаны с использованием компьютерной программы PSQ Assay Design. Пример пирограммы, полученной для фрагмента гена NS, содержащего аттенуирующую нуклеотидную замену в позиции G798A у донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), приведен на фиг 1.

Данная замена приводит к аминокислотной замене Met-100-Ile в белке ядерного экспорта NS2 В результате пиросеквенирования вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) - эпидемического предшественника донора аттенуации, не обладающего аттенуирующей мутацией, присутствует пик в первой позиции и отсутствует - во второй (фиг.1, А). Наличие аттенуирующей мутации G→А характеризуется отсутствием пика в первой позиции и присутствием - во второй, что можно увидеть на пирограмме, полученной для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (фиг.1, Б), а также на пирограмме, полученной для фрагмента гена NS вакцинного штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 (фиг.1, В).

В таблице 3 приведены результаты пиросеквенирования всех фрагментов генов вакцинного штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09, содержащих аттенуирующие мутации, соответствующие донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), до и после пятикратного пассирования в РКЭ. Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл.3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 и не утрачиваются в процессе пассирования. Таким образом, анализ сохранности аттенуирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 показал генетическую стабильность его аттенуирующих мутаций и отсутствии их реверсий в процессе пассирования.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09, проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 в РКЭ обладает фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤1.2 lg ЭИД₅₀/МЛ, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 6.8 lg ЭИД₅₀/МЛ, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в табл.4.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с.] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04.2016. https://cdnimg.rg.ru/pril/130/25/64/43232.pdfl

Мышам вводили однократно внутрибрюшинно вакцинный вирус с титром 7.0 lg ЭИД₅₀/МЛ в 0.5 мл, что соответствовало одной дозе вакцинного препарата для человека. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл.5) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью актуального эпидемического вируса А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью, холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека. Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 депонирован 11.11.2020 года в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского под №2966 и имеет характеристики, представленные в образце паспорта штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 при репродукции в РКЭ при 32°С в течение 48 часов - 8.5 log₁₀ ЭИД₅₀/МЛ. Гемагглютинирующая активность - 1:512 с 1.0% куриными эритроцитами.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей в РКЭ (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

ПАСПОРТ ВАКЦИННОГО ШТАММА

1 Название штамма: А/17/Дарвин/2018/154

2 ИЭМ идентификационный №: DW/154/84

3 Серия: №1

4 Сероподтип: (H1N1)pdm09, субклайд 6 В.1А5А

5 Метод подготовки: классическая реассортация в куриных эмбрионах

6 Родительские вирусы

6.1 Эпидемический вирус: А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09, субклайд 6 В.1А.5А, WHO Collaborating Centre for Influenza, Melbourne, Australia, Sample ID SL 10012392, E3/E1_SPF

6.2 Донор аттенуации: А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), E37/E3_SPF/E1_SPF

7 Число пассажей в E7spf (совместное заражение, два селективных процессе реассортации: пассажа, три клонирования и одно накопление)

8 Состав генома: Гены РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS от донора аттенуации, НА и NA - от эпидемического вируса (формула генома 6:2)

9 Характеристика штамма до лиофильной сушки

9.1 Оптимальные условия репродукции: 32°, 48 часов

9.2 Гемагглютинирующая активность: 1: 512 с 1.0% куриными эритроцитами

9.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 8.5 lg ЭИД₅₀/мл

9.4 ts маркер (температурочувствительность репродукции; инфекционная активность при температуре 40°С):<1.2 lg ЭИД₅₀/МЛ (ts-фенотип)

9.5 са маркер (холодоустойчивость репродукции; инфекционная активность при температуре 26°С): 6.8 lg ЭИД₅₀/МЛ (са-фенотип)

10 Характеристика штамма после лиофильной сушки

10.1 Дата лиофилизации: 04.03.2020

10.2 Объем материала в ампуле: 0.5 мл

10.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 8.0 lg ЭИД₅₀/МЛ

10.4 Гемагглютинирующая активность: 1:256 с 1.0% куриными эритроцитами

11 Антигенная специфичность

11.1 Гемагглютинин: идентичен эцидемическому вирусу А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09 по данным секвенирования и РТГА

11.2 Нейраминидаза: идентична эпидемическому вирусу А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09 по данным секвенирования

12 Токсикологическое исследование не токсичен после внутрибрюшинного in vivo (острая токсичность): введения мышам

13 Контроль стерильности: стерилен

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09, депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2966. Вакцинный штамм А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 – реассортант - получен путем скрещивания эпидемического вируса А/Дарвин/123/2018 (H1N1)pdm09 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Штамм вируса гриппа А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09 позволяет получение живой интраназальной гриппозной вакцины для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей. 5 табл., 1 ил.

Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Дарвин/2018/154 (H1N1)pdm09, депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2966, для получения живой интраназальной гриппозной вакцины для взрослых и для детей.