Штамм клубеньковых бактерий RнIZовIUм LеGUмINоSаRUм для производства бактериального удобрения под чечевицу Советский патент 1988 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/41 

Изобретение относится к микробиологическим средствам повьшения урожая бобовых культур и может быть использовано для производства бактериального удобрения нитрагина под чечевицу ,

Целью изобретения является получение нового более эффективного штамма клубеньковых бактерий, повышающего урожай зерна чечевицы и содержание в нем белка.

Штамм клубеньковых бактерий Rh. leguminosarum(Lens) 724 вьщелен из клубеньков чечевицы сорта Петровская А/Ю5, произраставшей на обыкновенном черноземе.

Идентифицирован по определителю Берги.

Штамм клубеньковых бактерий Rh. legiBninos arum (Lens) 724 депонирован и хранится в коллекции ВНИИСХМ под 724.

Культурально-морфологические свойства штамма Rh.leg.(Lens) ВНИИСХМ 8 724.

Расчет на следукядих питательных средах.

Гороховый агар, г/л: горох 100,0; сахароза 20,0; агар-агар 20,0; рН среды 6,8-7,0. Колонии на гороховом агаре появляются на третьи сутки, однотипные, круглые, беловатые,силь- новыпуклые, 2-2,5 мм в диаметре.

Бактерии имеют палочек, в молодом возрасте подвижные. Величина клеток 2-суточной культуры на гороховом агаре 1,2-2,5 0,6-0,9 мко

Перитрихи. Бактеро;иды имеют булавовидную форму. Штрих на гороховом агаре - обильный, беловатый, слабо- вьтуклый, слизистый

Люпиновый агар: г/л: К НРО 0,5; KHjPO 0,5; MgSO -THiO 0,2; NaCl 0,2; CaS04 0,1; (NH)iMo04 следы; маннит 20,0; люпиновая мука 10,0; агар-агар 20,0, рН среды. 6,8-7,0.

Штрих обильный, беловатый, слабо- вьшуклый, слизистый, стекакяций. Колонии появляются на третьи сутки, однотипные, круглые, беловатые, выпуклые 2,5-3,0 мм в диаметре.

Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит 10,0; 0,4; агар-агар 15,0 рН среды 6,8-7,0.

Штрих обильный, бесцветный плоский, слизистый, сильно стекающий. Колонии появляются на третьи сутки, однотипные круглые, беловатые, выпук

0

5

0

5

0

5

лые, растекающиеся, 3-3,5 мм в диаметре .

Физиолого-биохимические признаки штамма Rh.leguminosarum(Lens)724.

Молоко с лакмусом не пептонизиру- ет, подщелачивает с образованием слизистого кольца на поверхности. Желатину не разжижает. Аэроб, Оптимум температуры 26-28 С.

Отношение к углеводам« Растет на средах с углеводами, подкисляя среду. Хорошо развивается на средах с глюкозой, галактозой, рамнозой, ксилозой, менее активно - на средах с мальтозой, сахарозой, лактозой. Клетчатку и крахмал не.усваивает.

Отношение к источникам азота. Хо- рошо растет на средах с азотнокислым натрием, аммонийными солями, тирозином, на МПА не растет Признаки штамма устойчивы Штамм не патогенен. Пересевается один раз в 6 мес и хранится на гороховом агаре при 4-5°С.

Методика приготовления препарата для проведения инокуляции чечевицы в полевых и вегетационных опытах. Приготовление жидкой посевной культуры. Жидкую культуру выращивают в качалочных колбах и в 5 литровых бутылях в течение 2 сут на среде следующего состава, %:

Гороховый отвар 10,0 Сахар (пищевой) 1,0 (Ш4)г5040,05

КН2.Р040,05

Kj HP04-3H2.00,05

MgS04 ,02

CaCOj0,1

Водопров одная

водаДо.100

рН (после стерилизации)6,8-7,0 Стерилизация при 1,0 ати 30 мин. Титр 5-8 млрд/мл. Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры в 5-литрояых бутылях или ферментаторах на среде следующего состава: %:

0

5

Кукурузный

экстракт

Меласса

(NH4)tS04

KHjP04

Kz.HP04 3HiO

MgS04-7HiO

CaCOj

Водопроводная

вода

1,0

2,0

0,1

0,025

0,025

0,02

0,1

До 00,0

1

рН (после стерилизации)6,8-7,0

Бутыли и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%. Бутыли встря- кивают на качалке в течение 40-48 ч. В ферментаторах бактерии выращивают 18-36 ч при аэрации 0,7-1,5 об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5ати температуре 28-30 С. Титр не менее 5,0 млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей или ферментаторов (иноку- люм) используют для смешивания с торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,2 с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах до 200-400 г стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный в пакетах инокулируют инъекцией смеси:куль туральная жидкость + меласса (6%) из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,3-0,5 млрд/г торфа и влажности 45-60%. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое.

Культуру в торфе подращивают, выдерживая пакеты 3-5 суток при 15 - 20°С, затем пакеты хранятся при 3 - 8°С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта.

Ризоторфин для чечевицы на предлагаемом штамме представляет по внеш- нецу виду увлажненную сыпучую массу темного цвета без запаха, нераство- римую в воде. Влажность готового препарата 50-55%о Ризоторфин содержит 4-6 млрд, клубеньковых бактерий на 1 г торфа. Срок годности препарата 6 мес со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян.

Инокуляцию с-емян чечевицы в вегетационных опытах проводят суспензией чистой культуры бактерий, смытой с агара, в полевых опытах - торфяным препаратом - ризоторфином.

Препарат на освоив штамма Rhizo- bium leguminosarum(Lens)724 для инокуляции чечевицы используют следую- щим образом.-

Пример 1. Вегетационные опыты проводят в сосудах с 6 кг дерново подзолистой почвы с внесением солей

32

по прописи Прянишникова, без азота. Повторность опытов 4-кратная„ Инокулируют семена штаммами чечевицы сорта Пензенская 14,

Результаты вегетационных опытов приведены в табл.1.

Как показывают данные табл.1, бактерии штамма 724 активно фиксируют атмосферный азот в симбиозе с чечевицей, в результате чего урожай зеленой массы растений, бактеризованных этим штаммом, на 53-107% выше, чем у растений без инокуляции, при одновременном увеличении общего азота на 0,34-0,70%. В итоге общее накопление азота у инокулированных растений в 2,3-2,6 раза в ыше, чем .у не- инокулированных.

В сравнении с известным штагчмом ризобий 250а штамм 724 увеличивает урожай зеленой массы растений на 0,-4 г/сосуд (30,8%) и содержание общего азота в чечевице на 0,31%.

П р и м е р 2. Полевые опыты проводят на черноземе обыкновенном. Площадь делянки 25 м , Повторность опытов 4-кратная. Препарат для проведения инокуляции чечевицы двух сортов Пензенская 14 и Петровская 4/105.

Результаты полевых опытов приведены в табл.2.

Как видно из табл.2, штамм R.legu minosarum(Lens)724 проявил себя эффективным симбиотическим азотфикса- тором в полевых условиях. Урожай зерна чечевицы при инокуляции этим штаммом повышается в среднем на 9,5 ц/га или на 79,8%, содержание белка в зерне на 0,9%.

Таким образом, при инокуляции чечевицы штаммом R. legximinosarum(Lens) 724 урожай зеленой массы повьш1ается в сравнении с инокуляцией штаммом 250а на 0,4 г/сосуд (30,8%) и содержание общего азота в растении на 0,31%, в сравнении с неинокулирован- ной чечевицей, урожай зерна повышается в среднем на 9,5 ц/га (79,8%) и содержание белка в зерне на 0,9%.

Формула изобретения

Штамм клубеньковых бактерий Rhizo bium leguminosarum(Lens) ВНИИСХМ . № 724 для производства бактериального удобрения под чечевицу.

Таблица I

Изобретение относится к микробиологическим средствам повышения урожая бобовых культур) и может быть использовано для производства удобрения нитрагина под чечевицу. Целью изобретения является получение нового более эффективного штамма клубеньковых бгистерий, 11овьш1ающего урожай зерна и содержание в нем белка. Штамм клубеньковых бактерий Rhizobium legu- rainosarum 724 выделен из клубеньков чечевицы сорта Петровская 4/105. Штамм клубеньковых бактерий чечевицы Rhizobium leguminosarxim(Lens) 724 депонирован и хранится в коллекции ВНИИСХМ под № 724. При инокуляции чечевицы штаммом Rhizobium legumino- sarum(Lens) 724 урожай зеленой массы повышается в сравнении с вариантом, инокулированным штаммом R.leguminoea- rum 250 а, на 0,4 г/ сосуд (30,8%) и содержание общего азота в растениях на 0,31% (вегетационный опыт), в сравнении с неинокулированной рязб-- биямн чечевицей урожай зерна в полевых опытах повьппается в среднем на 9,5 ц/га (79,8%) и содержание белка в зерне на 0,9%. 2 табл.

Вез инокуляI Без инокуляТаблица 2