Штамм бактерий RнIZовIUм LеGUмINоSаRUм вIоVаR VIceae для получения бактериального удобрения под вику Советский патент 1991 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/00 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур, и представляет собой штамм клубеньковых бактерий, используемых для предпосевной обработки семян вики.

Целью изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий вики с более высокой эффективностью симбиотической азотфиксации для

производства бактериального удобрения под вику.

Бактерии штамма Rhizobium leguminosarum biovar biceae № 0622 выделены из клубеньков вики посевной, экотипа из Марокко, произраставшей на дерново-подзолистой, хорошо окультуренной почвэ.

Штамм R.leguminosarum bv. viceae депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий

во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под № 0622.

Культурально-морфологические признаки штамма. Штамм 0622 растет на питательных средах. Гороховый агар, г/л: горох 100,0; сахароза 20,0; агар 20,0; рН среды 6,8-7,0. Ман- нитно-дрожжевой агар, г/л: маннит 10,0; КаНР04 0,5; 7H20 0,2; NaCl 0,1; дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0; рН среды 6,8-7,0.

Маннитно-дрожжевой агар с бром- тимол синим, г/л: маннит 10,0; К2НР04 0,5; MgS04x7Hj,0 0,2; NaCl 0,1; дрожжевой экстракт 0,4: агар 15,0; бромтимол синий 5 мл; 0,5% спиртового раствора, рН среды 6,8- 7,0.

Бактерии штамма № 0622 имеют форму палочек: до 36 ч подвижные, через 48 ч утрачивают подвижность, перитри хи, грамотрицательные. Величина клеток 2-суточной культуры на гороховом агаре 1,2-1,8x0,7-0,8 мкм. Бактерициды имеют ветвистую форму. Быстроратущая культура. Штрих на гороховом агаре умеренный, бесцветный, слабовыпуклый, слизистый, стекающий. Колонии появляются на 3-й сутки, однотипные, круглые, выпуклые, слизистые беловатые до 2 мм.

На маннитно-дрожжевом аг-аре штрих обильный, бесцветный, плоский, слизистый, стекающий. Колонии появляются на 3-й сутки, однотипные, круглые слабо-растекающиеся, выпуклые, слизистые, беловатые до 3 мм. На маннитно-дрожжевом агаре с бромтимол синим признаки штамма 0622 аналогичны рост на маннитно-дрожжевом агаре, но культура и среда окрашиваются в желтоватый цвет.

Физиолого-биохимические признаки штамма № 0622.

Молоко с лакмусом не пептонизиру- ет, подщелачивает с образованием слизистой прозрачной зоны на поверхност Нодщелачивание молока с лакмусом происходит на 2-е сутки, максимальное изменение окраски отмечается на 3-5-е сутки. Образование слизистой зоны происходит на 3-й сутки, максимальных размером (до 3 мм) она достигает через 15 сут. Маннитно-дрож

жёвб# агар с бромтимол синим подкис ляет .

Желатину не разжижает. Аэроб, оптимум температуры 26-2,8 С при оп

, 10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

тимуме рН 6,8-7,0. Предельные значения рН для роста 5,8-7,5.

Отношение к углеродам. Растет на средах с углеводами, подкисляя среду. Активно усваивает глюкозу, галактозу, рамнозу, ксилозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маннит, сорбит, клетчатку и крахмал не используют.

Отношение к источникам азота. Хорошо растет на средах с азотнокислым натрием, аммонийными солями, тирозином. На МПА не растет. Признаки штамма устойчивы. Штамм не патогенен. Штамм № 0622 хранится на гороховом агаре при 4-5°С и пересевается один раз в 6 мес.

Технология приготовления препарата на основе штамма № 0622.

Посевную культуру выращивают на качалке в колбах и пятилитровых бутылях в течение 2 сут на среде следующего состава, мас.%: гороховый агар 10,0; сахар (лищевой) 1,0; ( 0,05; КНгРО -0,05 KaHPOv3HtO 0,05; MgSQj, 0,02; CaCOj, 0,1 ; водопроводная вода до 100,0; рН после стерилизации (1,0 атм, 30 мин) 6,8-7,0. Титр клеток 3-4 млрд/мл.

Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят в пятилитровых бутылях или фермантаторах на среде следующего состава, мас.%: кукурузный экстракт 1,0; меласса 2,0; (. 0,1; КН2РОц. 0,025; К2НР04.ЗНгО 0,025; MgS04 7HiO 0,02; СаС03 0,1; водопроводная вода до 100,0; рН после стерилизации 6,8-7,0.

Бутыли и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%. Бутыли встряхивают на качалке в течение 40-48 ч. В ферментаторах бактерии выращивают 18-36 ч при аэрации 0,7-1,5 об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5 атм, при 28-ЗОйС. Титр 4-5,0 млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей или ферментаторов - инокулюм используют для смешивания с торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7 ,0, влажностью 30-40% в полиэтиле- vновых пакетах по 200-400 г стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией смеси: культуральная жидкость + меласса (6%) из расчета исходтот же день во влажную поч- Площадь опытных делянок iO-20 м2

10

15

20

ного титра бактерий в торфе 0,3- 0,5 млрд/г торфа и влажности 45-60%. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое. Культуру в торфе подращивают, выдерживая пакеты 3-5 сут при 15-20°С. Ризоторфин хранят при 3-8°С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта. Ризоторфин для вики на предлагаемом штамме представляет по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, нерастворимую в воде. Влажность готового препарата 50-55%. Ризоторфин содержит 4-6 млрд клубеньковых бактерий на 1 г торфа. Срок годности препарата 6 мес со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян.

Условия проведения вегетационных и полевых опытов. Вегетационные опыты проводят в сосудах с 6 кг дерново- подзолй стой -почвы с внесением солей по прописи Прянишникова, г/кг почвы: КС1 0,15; MgS04 0,06; СаНР04 0,172; MnS04 0,003; борная кислота 0,003; (Ш)гМо04 0,001; но без азота. Пов- торность опыта четырехкратная.

Используются районированный сорт вики Немчиновская 72. Для инокуляции семян вики чистую культуру бактерий выращивают на скошенном гороховом агаре. Культуру в пробирках с титром 4-6 млрд омывают водопроводной водой, затем суспензию наносят на семена вики, разложенные в лунки, сделанные в почве каждого сосуда. В сосуд вносят 10 клеток.

Полевые опыты проводят в районах, рекомендованных для возделывания вики, на почвах, типичных для этих регионов. Используется агротехника выращивания вики, принятая в каждом конкретном районе. Доза препарата - 200 г на гектарную норму семян. В опытах используются районированные сорта вики: Немчиновская 72, Бело- розовая 109, Камалинская 611. Повтор- достоверного повышения урожая (опыты

мена тщательно перемешивают для равномерного распределения преп рата. Обработанные ризоторфином семена высеивают в ву.

Пример 1. Эффективность сим биотической азотфиксации у штамма № 0622 в сравнении с известным штаммом № 145 определяют в вегетационных опытах, поставленных по описанной методике, по величине урожая зеленой массы вики.

Полученные данные приведены в табл.1.

Как показывают данные табл.1, клубеньковые бактерии в ики штамма №0622 обеспечивают более высокую эффективность азотфиксации, в результате чего урожай зеленой массы растений, иноку- лированных этим штаммом, на 20,7% выше, чем у растений, бактеризованных штаммом № 145, Содержание общего азота у растений, инокулировэнных штам- 25 мами, было одинаковым, но за счет более высокого уровня зеленой массы при бактеризации штаммом N 0622 накопление азота в этом варианте на 21,6% выше, чем от штамма № 145.

II р и м е р 2. Эффективность штаммов R.leguminosarum bv. viceae №0622 и № 145 определяют в полевых опытах по конкурсному испытанию штаммов клубеньковых бактерий вики в научных учреждениях Геогр зфической сети опытов с азотфиксирующими микроорганизма ми (табл.2) по величине урожая зерна и -зеленой массы (влажной и сухой).

Данные табл.2 показывают, что штамм № 0622 отличается от известного штамма № 145 более высокой и стабильной эффективностью. Средняя прибавка урожая зерна, зеленой массы (влажной и сухой) вики составляет 9,4, 76,5 и 21,0 ц/га соответственно, что на 6,0 (25,6%), 27 (8,8%) и 12,0 ц/га (16,2%) превышает урожай, полученный при использовании штамма № 145, который в ряде опытов не обеспечивает

30

35

40

45

ность опытов четырехкратная. В полевых опытах семена вики обрабатывают торфяным препаратом-ризоторфином, изготовленным, на опытах штаммах.

Способ внесения препарата следующий: 200 г ризоторфина разводят в 1,5 л водопроводной воды и, не давая суспензии отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян. Затем се55

1 и 4). Содержание белка в урожае вики, инокулированной штаммами № 0622 и № 145, было одинаковым.

Влияние штаммов № 145 и № 0622 клу беньковых бактерий вики на содержание белка в урожае (полевые опыты) показа но в табл.3.

Условия проведения полевых опытов и эффективность штаммов № 145 иК° 0622

тот же день во влажную поч- Площадь опытных делянок iO-20 м2.

5

достоверного повышения урожая (опыты

мена тщательно перемешивают для равномерного распределения преп рата. Обработанные ризоторфином семена высеивают в ву.

Пример 1. Эффективность сим- биотической азотфиксации у штамма № 0622 в сравнении с известным штаммом № 145 определяют в вегетационных опытах, поставленных по описанной методике, по величине урожая зеленой массы вики.

Полученные данные приведены в табл.1.

Как показывают данные табл.1, клубеньковые бактерии в ики штамма №0622 обеспечивают более высокую эффективность азотфиксации, в результате чего урожай зеленой массы растений, иноку- лированных этим штаммом, на 20,7% выше, чем у растений, бактеризованных штаммом № 145, Содержание общего азота у растений, инокулировэнных штам- 5 мами, было одинаковым, но за счет более высокого уровня зеленой массы при бактеризации штаммом N 0622 накопление азота в этом варианте на 21,6% выше, чем от штамма № 145.

II р и м е р 2. Эффективность штаммов R.leguminosarum bv. viceae №0622 и № 145 определяют в полевых опытах по конкурсному испытанию штаммов клубеньковых бактерий вики в научных учреждениях Геогр зфической сети опытов с азотфиксирующими микроорганизмами (табл.2) по величине урожая зерна и -зеленой массы (влажной и сухой).

Данные табл.2 показывают, что штамм № 0622 отличается от известного штамма № 145 более высокой и стабильной эффективностью. Средняя прибавка урожая зерна, зеленой массы (влажной и сухой) вики составляет 9,4, 76,5 и 21,0 ц/га соответственно, что на 6,0 (25,6%), 27 (8,8%) и 12,0 ц/га (16,2%) превышает урожай, полученный при использовании штамма № 145, который в ряде опытов не обеспечивает

0

5

0

5

достоверного повышения урожая (опыты

1 и 4). Содержание белка в урожае вики, инокулированной штаммами № 0622 и № 145, было одинаковым.

Влияние штаммов № 145 и № 0622 клубеньковых бактерий вики на содержание белка в урожае (полевые опыты) показано в табл.3.

Условия проведения полевых опытов и эффективность штаммов № 145 иК° 0622

клубеньковых бактерий вики даны- в табл.4.

Как показывают данные табл.4, штамм № 0622 дает значительную большую прибавку урожая зеленой массы вики, чем штамм № 145.

Пример 3. Дополнительным преимуществом штамма № 0622 являются его высокие технологические свойства, при-jQ веденные в табл.5.

Данные табл.5 показывают, что по основным технологическим показателям бактерии штамма № 0622 превосходят штамм № 145, т.е. более интенсивно размножаются на жидких регламентных средах, дают более высокие титры в торфяном препарате. Особо следует отметить стабильность показателя высокой

выживаемости бактерий., в препарате при хранении.

В изученных регионах возделывания вики при бактеризации ее семян ризо- торфином на основе штамма № 0622 получают более высокую урожайность зерна и зеленой массы, чем при использовании штамма № 145. Кроме того предлагаемый штамм клубеньковых бактерий вики превосходит штамм № 145 по технологическим свойствам.

Формула изобретения

Штамм бактерий Rhizobium legu- minosarum biovar viceae ВНИИСХМ № 0622 для получения бактериального удобрения под вику.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур, и представляет собой штамм клубеньковых бактерий, используемых для предпосевной обработки семян вики. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий вики с более высокой эффективностью симбиотической азот- фиксации для производства бактериального удобрения под вику. 1Чтамм бактерий Rhizobium leguminosarum biovar biceae № 0622 выделен из клубеньков вики посевной, экотипа из Марокко, произраставшей на дерново-подзолистой, хорошо окультуренной почве. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером ВНИИСХМ № 0622. Штамм 0622 позволяет увеличить в среднем урожай зерна- вики на 6 ц/гк (25,6%), влажной зеленой массы - на 27 ц/га (8,8%) и сухой зеленой массы - на 12,0 ц/га (16,2%) по сравнению с известным штаммом. 5 табл. I (П

Среднее

62,3 9,0

Таблиц

1

Таблица 2

21,0 15,1 33,2

12,0 16,2

Показатели

Доза препарата на 1 га,г Почва

1629295

Таблица 3

.10

Таблица 4

Вариант

200 с титром 3-5 млрд/г Дерново-подзо- Чернозем юж- листая, хороный карбонатшо окультуренная

ныи

Таблица 5