ШТАММ БАКТЕРИЙ RHIZOBIUM SP. (CORONILLA) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ УДОБРЕНИЯ ПОД ВЯЗЕЛЬ Российский патент 1994 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур.

Вязель пестрый Coronilla varia - травянистое многолетнее бобовое растение, является хорошим медоносом, используется как лекарственное. В свежем виде растение ядовито и не поедается скотом; сено с примесью вязеля безвредно для всех видов животных, кроме лошадей. Вязель распространен в Европейской части СССР, на Кавказе, в Туркмении. В последнее время его пытаются вводить в культуру в Дагестане и некоторых других районах страны.

Важнейшей биологической особенностью вязеля, как и всех бобовых культур, является его способность использовать атмосферный азот в симбиозе с клубеньковыми бактериями, благодаря чему значительную часть потребности в этом элементе питания он может удовлетворить за счет биологической азотфиксации. Однако при введении вязеля в культуру, когда он впервые высевается в севообороте, происходит только незначительное инфицирование его корней природной популяцией клубеньковых бактерий, в связи с чем растения лишь частично могут реализовать свой природный азотфиксирующий потенциал. Для получения высоких урожаев в этих условиях необходимо применять минеральные азотные удобрения, что негативно влияет как на себестоимость продукции так и на качество растительного сырья и экологическую обстановку.

Вместе с тем известно, что одним из резервов повышения продуктивности бобовых культур, в том числе и вязеля, может служить усиление у них процесса биологической азотфиксации путем обработки семян селекционными штаммами клубеньковых бактерий. Однако до настоящего времени активных и специфичных штаммов клубеньковых бактерий для усиления симбиотической азотфиксации у вязеля не было предложено.

Вязель пестрый по своему систематическому положению относится к трибе копеечниковых. В связи с этим исследовали способность клубеньковых бактерий копеечника Rhizobium sp. (Hedysarum), штаммы 1406 и 1410 образовывать клубеньки на корнях растений вязеля. Оказалось, что ни один из проверенных штаммов не был вирулентен по отношению к вязелю.

Целью изобретения является получение штамма Rhizobium sp. (Coronilla) - активного азотфиксирующего микросимбионта вязеля для усиления процесса симбиотической азотфиксации и повышения продуктивности этой культуры.

В качестве такого штамма предлагается штамм ВНИИСХМ 3401 клубеньковых бактерий вязеля.

Штамм 3401 был выделен из клубеньков растений вязеля местной популяции, произрастающей на Гунибском плато, Дагестан.

Штамм идентифицирован по определителю Берги.

Штамм Rhizobium sp. (Coronilla) 3401 депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 3401 (индекс коллекции во Всемирном каталоге коллекций Rhizobium - CIAM).

Штамм 3502 растет на питательных средах следующего состава.

1. Гороховый агар, г/л: горох 100,0; сахароза 20,0; агар-агар 20,0; рН среды 6,8-7,0.

2. Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит 10,0; K₂HPO₄ 0,5; MgSO₄ x 7H₂O 0,2; NaCl 0,1; дрожжевой экстракт 0,4; агар-агар 15,0; рН среды 6,6-7,0.

Морфолого-культуральные свойства. Бактерии штамма 3502 имеют форму мелких палочек с закругленными концами, подвижные. Величина клеток пятисуточной культуры на маннитно-дрожжевом агаре 2,2-4,6 х 0,7-0,8 мкм. Культура быстрорастущая.

Штрих на маннитно-дрожжевом агаре обильный, беловатый, слизистый, стекающий. Колонии появляются на 5 сут., однотипные, белые, круглые, выпуклые, слизистые, 1-2 мм в диаметре.

Штрих на бобовом агаре обильный, беловатый, слизистый. Колонии появляются на 5 сут., однотипные, круглые, белые, выпуклые, 1-2 мм в диаметре.

Физиолого-биохимические свойства.

Симбионт. Макросимбионт - бобовое растение вязель.

Отношение к:
а) кислороду - аэроб; б) Т максимальная 34^оС, минимальная 4^оС, оптимальная 26-28^оС; в) рН максимальный 7,5, минимальный 6,0, оптимальный 6,8-7,0.

Источники углерода
g e Глюкоза А_к (-) Лактоза А_к (-) Мальтоза А_к (-) Сахароза А_к (-) Арабиноза А_к (-) Рамноза А_к (-) Галактоза А_к (-) Дульцит А_к (-) Маннит А_к (-) Сорбит А_к (-) Ксилоза - Клетчатка - Крахмал - Источники азота NaNO₃ + (NH₄)₂S)₄ + МПА -
Азот фиксирует в симбиозе с вязелем.

Другие характерные физиологические особенности.

Желатину не разжижает.

Молоко с лакмусом не пептонизирует, слабо подщелачивает, вызывает образование слизистой зоны.

При 1,0%-ной концентрации NaCl в среде рост бактерий ингибируется, при 1,5% NaCl в среде не растет.

Признаки штамма устойчивы. Штамм не патогенен.

Штамм 3401 хранится на гороховом агаре указанного состава при 4^оС и пересевается 1 раз в 6 месяцев.

Оценку симбиотических свойств штамма 3401 - вирулентности, азотфиксирующей активности и эффективности симбиоза проводили в условиях микровегетационных и вегетационных опытов.

Вирулентность определяли по количеству и качеству клубеньков, образованных на корнях вязеля при инокуляции его клубеньковыми бактериями в условиях микровегетационного опыта.

Азотфиксирующую активность определяли по величине ацетиленредуктазной активности на интактных клубеньках.

Эффективность симбиотической азотфиксации определяли по общему накоплению азота растениями на сосуд. Этот показатель складывается из величины урожая зеленой массы растений вязеля и содержания в них азота, который определяли с помощью системы Къельтек-авто, Текатор (Швеция).

П р и м е р 1. Микровегетационный опыт.

В большие пробирки (200 х 20 мм) добавляют 12 мл агаризованной среды Красильникова-Кореняко, г/л: K₂HPO₄ 1,0; MgSO₄ x 7H₂O 1,0; Ca₃(PO₄)₂ 0,2; FeSO₄ следы; смесь микроэлементов по М.В. Федорову 1 мл. Состав раствора микроэлементов, г/л: H₃BO₃ 0,05; (NH₄)₂MoO₄ 0,05; KCl 0,005; NaBr 0,005; ZnSO₄ x 7H₂O 0,003; Al₂(SO₄)₃ x 7H₂O 0,003; MnSO₄ 0,002. Пробирки стерилизовали в автоклаве.

Семена вязеля, сорт "Разноцветный", стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 15 мин, после чего обильно промывали стерильной водой и раскладывали на увлажненные стерильные бумажные фильтры в чашки Петри для прорастания. Через 3 сут. проростки в асептических условиях раскладывали по 2 в пробирки со средой. Опыты ставили в шестикратной повторности.

Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивали на косяках с бобовым агаром указанного состава в течение 3 сут. при 28^оС и суспендировали в растворе микроэлементов. На следующие сутки после раскладки семян в каждую пробирку вносили по 1 мл инокулюма, содержащего 10⁷ клеток. Растения выращивали в фитотроне при 18-22^оС в течение 6 недель. По окончании периода вегетации ватно-марлевые пробки у пробирок заменяли герметичными резиновыми колпачками, через которые вводили по 5 мл ацетилена в каждую пробирку. Через 1 сут. определяли прижизненную ацетиленредуктазную активность на газовом хроматографе "Цвет-100". Величину нитрогеназной активности клубеньков, которая характеризует азотфиксирующую активность штамма, выражают в микромолях С₂Н₄ за 1 сут. на 2 растения. Результаты представлены в табл.1.

Данные табл. 1 показывают, что штамм 3401 вирулентен на вязеле, - он образует на его корнях типичные для этого растения клубеньки. Штаммы клубеньковых бактерий копеечника невирулентны на этом бобовом растении. Высокая ацетиленредуктазная активность указывает на то, что штамм 3401 является активным азотфиксирующим микросимбионтом вязеля.

Приведенные материалы свидетельствуют о том, что растения вязеля способны вступать в эффективный симбиоз только со специфичными штаммами клубеньковых бактерий, поэтому в дальнейших опытах неспецифичные штаммы не использовались.

П р и м е р 2. Вегетационный опыт N 1.

Опыт проводили на стерильном речном песке в двухкилограммовых сосудах в пятикратной повторности. В каждый сосуд высаживали по 5 растений. Соли вносили по прописи Прянишникова, г/кг песка: KCl 0,15; MgSO₄ x 7H₂O 0,06; CaHPO₄ 0,172; MnSO₄ 0,003; борная кислота 0,008; (NH₄)₂MoO₄ 0,001; NH₄NO₃ 0,24 (0,2 от полной нормы азота). Обработка семян перед посадкой такая же, как и для микровегетационного опыта.

Для инокуляции семян чистую культуру бактерий выращивали на качалке в бобовом отваре при 28^оС в течение 3 сут. Выросшую суспензию наносили на семена вязеля, разложенные в лунки, сделанные в песке каждого сосуда. В каждый сосуд вносили 20 мл суспензии титром 5 х 10⁷ клеток. Растения выращивали в теплице при искусственном освещении в течение 3 месяцев. Результаты представлены в табл.2.

Как видно из табл.2, штамм 3401 вступает в эффективный симбиоз с вязелем, усиливает у него процесс симботической азотфиксации, благодаря чему значительно возрастают урожай зеленой массы растений, содержание азота и качества растительного сырья.

П р и м е р 3. Получение препарата на основе штамма 3401.

Приготовление жидкой посевной культуры.

Жидкую культуру выращивают на качалке в качалочных колбах в течение 3 сут. на среде следующего состава, мас.%: гороховый отвар 10,0; сахар пищевой 0,5. рН после стерелизации 6,4-6,8. Среду стерилизуют при 1 ати 30 мин. Титр бактерий 4-5 млрд. клеток в 1 мл.

Для получения жидкой культуры штамм выращивают на скошенном бобовом агаре в течение 3 сут., выросшую массу клеток смывают стерильной водой и используют в качестве инокулюма. После микробиологического контроля культуральная жидкость из колб используется для смешивания с торфом.

Подготовка торфа.

Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,0 в полиэтиленовых пакетах по 200-400 г, стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией культуральной жидкости из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,15-0,8 млрд./г торфа и влажности 45-60% . Затем содержимое в пакетах перемешивается. Ризоторфин хранят при 10-15^оС в темном помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта.

Ризоторфин для вязеля на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета без запаха, не растворимую в воде. Ризоторфин содержит 3-4 млрд. бактерий в 1 г торфа. Срок годности препарата 6 месяцев со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян.

П р и м е р 4. Использование ризоторфина для обработки семян вязеля.

Эффективность симбиотической азотфиксации штамма 3401 определена также в вегетационном опыте в шестикилограммовых сосудах на нестерильном песке в четырехкратной повторности. Вносили минеральные удобрения по Прянишникову аналогично примеру 2. Азот - в количестве 0,2 от полной нормы. Семена вязеля стерилизовали аналогично примеру 2 и обрабатывали ризоторфином, изготовленным на основе штамма 3401.Доза препарата 200 г на гектарную порцию семян. Титр препарата 3 млрд./г. Способ внесения препарата: 200 г ризоторфина разводят в 1 л водопроводной воды и, не давая суспензии отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян. Затем семена тщательно перемешивают для равномерного распределения препарата. Обработанные ризоторфином семена высевают в тот же день. В каждом сосуде выращивали по 6 растений. Опыт ставили в пленочном вегетационном домике. Учет производили через 3 месяца. Результаты представлены в табл.3.

Данные табл. 3 подтверждают, что штамм 3401 является высокоэффективным симбиотическим азотфиксатором. Улучшение азотного питания инокулированных растений вязеля за счет более интенсивного поступления биологического азота оказывает положительное влияние как на урожай растений, так и на его качество.

Таким образом, штамм Rhizobium sp. (Coronilla) 3401 существенно увеличивает азотфиксирующую способность вязеля, повышает его урожай и улучшает качество урожая за счет увеличения в нем содержания белка. Это указывает на то, что штамм 3401 является активным азотфиксирующим микросимбионтом вязеля и может быть использован для повышения урожая.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур. Получен штамм бактерий Rhizobium sp. (Coronilla) ВНИИСХМ N 3401 для получения удобрения под вязель. Штамм выделен из клубеньков вязеля местной популяции, произраставшей на Гунибском плато, Дагестан. Штамм существенно увеличивает азотфиксирующую способность вязеля и улучшает качество его урожая. 3 табл.

Штамм бактерий Rhizobium sp. (Coronilla) ВНИИСХМ N 3401 для получения удобрения под вязель.