ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS GLOBERULUS 19Ф, РАЗЛАГАЮЩИЙ 1,1-ДИМЕТИЛГИДРАЗИН (ГЕПТИЛ) Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый бактериальный штамм, способный разлагать несимметричный 1,1-диметилгидразин (НДМГ) в аэробных условиях в объектах окружающей среды.

1,1-Диметилгидразин в качестве ракетного топлива (гептил) широко используется в российских космических кораблях типа "Космос", "Союз" и "Протон" и вызывает значительные загрязнения почвы на месте падения первых ступеней (топливных баков), а также на промышленных предприятиях при синтезе данного вещества. Большую озабоченность вызывает территория Горного Алтая, где наряду с промышленными выбросами предприятий имеет место загрязнение почв гептилом в результате сброса вторых ступеней ракет, стартующих с космодрома "Байконур".

Гептил - бесцветная жидкость с резким неприятным запахом, относится к легковоспламеняющимся жидкостям, к I классу опасности. Стабилен в объектах окружающей среды, возможен переход из почвы в растения и далее по пищевой цепочке [1, 2, 3].

В настоящее время недостаточно разработаны действенные и экологически безопасные методы очистки почв, загрязненных гептилом. Санация загрязненных гептилом почв проводится, в основном, с помощью химических средств, что очень дорого, экологически вредно, привносит дополнительные загрязнители и зачастую приводит к потере плодородия земель.

Среди биологических способов реставрации почв, загрязненных гептилом, можно отметить метод, предложенный агрофизическим институтом, с помощью насыпного слоя почвы и растений, однако это довольно трудоемкий и не всегда осуществимый способ; кроме того, возникает проблема, связанная с накоплением НДМГ в растениях [4].

Наиболее перспективным является использование биологических методов на основе специальных микроорганизмов-деструкторов гептила. Однако на сегодняшний день, судя по доступной нам литературе, микробиологические способы биоремедиации загрязненных гептилом почв не разработаны, отсутствуют и данные о патентах на микроорганизмы-деструкторы гептила [5, 6].

Целью изобретения является бактериальный штамм-деструктор гептила в почве. Технический результат, который был получен при использовании изобретения – высокая эффективностъ и безопасность разложения "in situ" ракетного топлива гептила в загрязненнной почве.

Для достижения цели предлагается штамм Rhodococcus globerulus 19Ф, выделенный из почвы, обобранной вблизи железнодорожной станции Валово Тульской области. Данная почва была загрязнена гептилом вследствие аварии. Штамм селекционирован путем длительных пересевов отдельных колоний бактерий на минимальной солевой среде, содержащей в качестве единственного источника углерода НДМГ в различных концентрациях [9, 10].

Штамм идентифицирован до вида и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), регистрационный номер АС-1642. Штамм также хранится в коллекции культур НИЦ ТБП в отделе экологической биотехнологии.

Штамм Rhodococcus globerulus 19Ф характеризуется следующими свойствами.

Морфолого-культуральные признаки

Аэроб, грам-положительный. Температура роста от +10 до +40° С. Клетки палочковидные, спор не образует. Палочки неравномерные по толщине, в молодой культуре слабо ветвящиеся, диаметр клеток 0,6-0,8 мкм, длина 4-8 мкм. Цикл развития хорошо выражен, на ранних стадиях (20-24 часа) наблюдается элементарное ветвление, в дальнейшем по мере старения культуры (3-4 суток) происходит распад длинных клеток на короткие палочковидные элементы, коккоидных форм практически нет.

Характер роста на агаризованных средах: глюкозопептонно-дрожжевой и ферментативном гидролизате рыбной муки - обильный, слизистый, окраска розовато-кремовая.

Физиолого-биохимические признаки

Отношение к источникам углерода: использует глюкозу, сахарозу, глицерин, трегалозу, малат, пируват, цитрат, сукцинат, не способен к росту на рамнозе и лактате, крахмал не гидролизует.

Отношение к источникам азота: усваивает органические и аммонийные формы азота. Желатину не разжижает.

В гидролизатах целых клеток обнаружена лизо-ДАПК, арабиноза и галактоза, что соответствует IV типу клетчатых стенок. Липид LCNA присутствует и по значению rf соответствует соответствующему липиду родококков.

Штамм хорошо растет на богатой питательной среде: ферментативный гидролизат рыбной муки (15 г/л), время культивирования - 1 сутки; средний титр клеток при этом - (1,5±0,6)· 10⁹. Возможно культивирование на минимальной солевой среде (см. пример №1), с глюкозой (10 г/л) вместо гептила, продолжительность роста составляет 4-5 суток, средний титр клеток - (2,0±0,5)· 10⁹.

Для хранения штамма используются вышеуказанные агаризованные среды (в виде косяков в пробирках), залитые стерильным вазелиновым маслом.

По совокупности признаков штамм был идентифицирован в ВКПМ как Rhodococcus globerulus 19Ф. Идентификация проводилась в соответствии с общепринятыми определителями Берджи [11].

Патогенные свойства

Штамм не обладает токсичностью в отношении теплокровных животных (штамм проверялся в НИЦ ТБП, справка сдана в ВКПМ при депонировании штамма).

Приведенные ниже примеры иллюстрируют сущность изобретения.

Пример 1

Культуру штамма Rhodococcus globerulus 19Ф высевают на чашки с агаризованной минимальной солевой средой и гептилом в качестве единственного источника углерода.

Состав среды, г/л:

(NH₄)₂HPO₄ 1,5

КН₂РO₄ 0,7

NaCl 0,5

MgSO₄·_{7H2O 0,8}

Агар 20

Гептил 100 мг/л

Вода дистиллированная До 1 л

Результат: рост газоном или отдельные колонии штамма Rhodococcus globerulus 19Ф, в зависимости от густоты посева на солевой среде с гептилом.

Пример 2

Культура штамма Rhodococcus globerulus 19Ф выращивают на жидкой питательной среде: ферментативный гидролизат рыбной муки (15 г/л), глубинным способом при температуре t=(29±2)° С и оборотах мешалки 200-220 об/мин в течение 24 часов.

Титр выросшей культуры составляет 1,5· 10⁹ кл/мл. В почву, загрязненную гептилом, вносят суспензию (культуральную жидкость штамма Rhodococcus globerulus 19Ф в концентрации ~ 10⁷ кл/мл; обработка ведется из расчета 1 л/м² почвы. В качестве контроля берут загрязненную гептилом необработанную почву. После внесения микроорганизмов почвенные образцы выдерживают до 1 месяца, поддерживая влажность почвы путем полива. Определяют начальную и конечную концентрацию гептила в пробах методом газовой хроматографии (9). Результаты в табл. 1.

Как видно из табл.1, степень разложения гептила в почве, обработанной культуральной жидкостью штамма Rhodococcus globerulus 19Ф, в среднем выше на 39%.

Пример 3

Штамм Rhodococcus globerulus 19Ф выращивают на синтетической минимальной солевой среде, г/л:

(NH₄)₂HPO₄ 1,5

КН₂РO₄ 0,7

NaCl 0,5

MgSO₄·_{7H2O 0,8}

Глюкоза 10,0

Вода дистиллированная До 1 л

Время культивирования 4 суток.

Почву, загрязненную гептилом (из расчета 200 мг/кг), обрабатывают культуральной жидкостью, имеющей титр клеток 10⁷ мл из расчета 1 л/м². После обработки почвенные образцы выдерживают при t=(20±2)° С в течение 1 месяца, периодически увляжняя. Пробы почвы отбирают в начале эксперимента и через месяц. В пробах определяют интегральную токсичность на дафниях. Результаты представлены в табл.2.

Как видно из табл. 2, обработка почвы, загрязненной гептилом, культурой Rhodococcus globerulus 19Ф приводит к значительному снижению интегральной токсичности почвы [12].

Таким образом, выделенный нами штамм позволяет значительно снижать концентрацию гептила в почве и суммарную (интегральную) токсичность почвы.

Библиографические данные

1. Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ. /Под ред. Горшковой Р.Б.

2. Положение о разработке инструкции по ТБ в Институте биофизики (Приложение №2 к постановлению Министерства труда РФ от 01.07.1993 г., №129).

3. 1,1-Диметилгидразин. Свидетельство о гос. регистрации. Серия ВТ №000899.

4. Петрова З.М., Остапенко Н.С., Бойцова Л.В. Миграция несимметричного диметилгидразина и его производных при рекультивации загрязненных почв. // Почвоведение, 1999, №12, с.1502-1508.

5. Ермаков Е.И., Панова Г.Г. Основы экологически гармоничной биореставрации химически загрязненных почв. // Доклады Россельхозакадемии, 2000, №5.

6. Ермаков Е.И. и др. Способ реставрации загрязненных почв. Патент РФ №2101898, БИ №2.

7. Добровольская Т.Г., Скворцова И.П., Лысак Л.В. Методы выделения и идентификации почвенных бактерий. - М.: Московский университет, 1989, 35 с.

8. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. - М.: Московский университет, 1991, 304 с.

9. Самсонов Д.П., Борновалова Г.В., Первунина Р.И., Жирюхина И.П. Хромато-масс-спектрометрическое определение N,N-диметилгидразина в почве. // Аналитическая химия, 1988, т.53, №2, с.191.

10. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. - М.: Наука, 1982, 144 с.

11. Bergey’s manual determinative bacteriology. T.S. Williams, Gibbons N.E. (Eds.). Baltimore, 1994, v. 4.

12. Методическое руководство по биотестированию почвы / Мособлкомприрода, вх. №621 от 08.08.95. - Серпухов: Архив НИЦ ТБП, 1994, 13 с.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для биоремедиации почв, загрязненных ракетным топливом - гептилом, и представляет собой новый бактериальный штамм, способный разлагать несимметричный 1,1-диметилгидразин (гептил). Штамм Rhodococcus globerulus 19Ф ВКПМ АС-1642 выделен из почвы, загрязненной гептилом в результате аварии. Штамм выращивается на жидкой питательной среде и вносится в почву, загрязненную гептилом, из расчета 1 л/м² при концентрации клеток 10⁷ кл/мл. Штамм позволяет значительно снижать содержание гептила и общую интегральную токсичность почвы. 2 табл.

Штамм бактерий Rhodococcus globerulus 19Ф ВКПМ AC-1642, разлагающий несимметричный 1,1-диметилгидразин (гептил).