Способ дифференциальной диагностики глиом высоких грейдов Российский патент 2022 года по МПК C12N1/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, в частности к нейроонкологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики глиальных опухолей мозга высоких степеней злокачественности.

Диагноз высоко-злокачественная глиома (High-Grade Glioma, HGG) ставят при биопсии или резекции опухоли. В категорию высокозлокачественных глиом входят глиомы III степени злокачественности различных гистологических профилей (анапластическая астроцитома, смешанная анапластическая олигоастроцитома и анапластическая олигодендроглиома) и глиомы IV степени злокачественности (глиобластома). Степень злокачественности опухоли является наиболее информативным фактором для отнесения в подгруппы с различными прогнозами. У глиобластом наблюдают худший прогноз с медианной общей выживаемостью всего 15 месяцев, в то время как у глиом III степени злокачественности средняя общая выживаемость четыре года.

Основным методом диагностики является цитологическое и гистологическое исследование биоптата опухоли. Известен способ диагностики степени злокачественности глиом по данным рутинного гистологического исследования (1). Исследование проводят путем окраски гематоксилином-эозином тонких срезов взятой биопсии участка опухоли и последующей световой микроскопии препарата. Способ позволяет ставить дифференциальный диагноз по морфологическим и гистологическим характеристикам препарата. Недостатками способа являются длительность исследования в несколько суток, возможность недооценки степени злокачественности глиомы вследствие того, что наиболее злокачественные участки глиомы могут не попасть в пробу, взятую нейрохирургом на операции, так как глиома часто состоит из пулов клеток разной степени злокачественности. Результат гистологического анализа опухоли не является количественным, не всегда точный, достаточно субъективный, требующий большого практического опыта при визуальной оценке клеточных структур опухоли на препаратах.

Известен способ диагностики и определения степени злокачественности глиальных опухолей на платформе однофотонной эмиссионной компьютерной томографии головного мозга (2). Способ заключается в следующем. После внутривенного введения радиофармпрепарата проводят однофотонную эмиссионную компьютерную томографию. Исследование осуществляют через 1 час и через 4 часа. При выявлении на томосцинтиграммах через 1 час после введения препарата очага интенсивного патологического накопления, который сохраняется и при повторном исследовании через 4 часа, диагностируют опухоль высокой степени злокачественности. При отсутствии патологического накопления препарата при исследовании через 1 час и появлении очагов накопления при повторном исследовании диагностируют глиальные опухоли низкой степени злокачественности. Способ позволяет поставить дифференциальный диагноз на основании однофотонной эмиссионной компьютерной томографии головного мозга. При этом, на наш взгляд, способ имеет ряд недостатков. Способ не дает количественных критериев при дифференциальной диагностике. Способ позволяет различать глиомы высоких и низких грейдов злокачественности, но не позволяет различать глиомы высоких грейдов, III и IV.

Существует способ, основанный на анализе экспрессии генов и микро - РНК в биоптатах опухолей мозга (3). Именно его мы выбрали в качестве прототипа. Способ заключается в следующем. У пациента получают тканевые пробы глиомы и перифокальной зоны. Из ткани выделяют тотальную РНК. Проводят обратную транскрипцию с последующей амплификацией в режиме реального времени RT-PCR. Измеряют экспрессию генов EGFR, MSI1, PSMC4, ТВР, RPLO и микро - РНК hsa-miR-92-1-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p.Вычисляют коэффициент относительной экспрессии Е с использованием трех высокоспецифичных референсных генов: PSMC4, ТВР, RPLO и двух референсных высокоспецифичных микро - РНК: hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p, сравнивают полученные значения Е в опухолевой ткани с контрольными и при значениях EEGFR<0,5 или EEGFR>1,5, EMSI1<0,5 или EMSI1>1,5, Ehsa-miR-92a-1-5p<0,5 или Ehsa-miR-92a-1-5p>1,5 хотя бы по одному локусу у пациента диагностируется глиома высокой степени злокачественности Ш, IV; отсутствие изменений экспрессии указанных локусов относительно контроля свидетельствует о соответствии опухоли II степени злокачественности. Способ позволяет выявлять глиомы высоких грейдов (III и IV), но не позволяет различать их. К достоинствам способа можно отнести отсутствие субъективности при осуществлении. При этом к недостаткам прототипа следует причислить необходимость помимо ткани глиомы анализировать ткань перифокальной зоны. Кроме того, необходимость анализировать экспрессию 8-ми генов и микро - РНК делает осуществление способа чрезмерно трудоемким.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является повышение точности способа, снижение трудоемкости и его упрощение. Это осуществляется подбором панели маркерных генов и использованием прогностической модели на основе линейной регрессии.

Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

- анализируется непосредственно ткань глиомы, без исследования образца ткани из перифокальной зоны, что сокращает трудоемкость способа;

- измеряется экспрессия 6-ти маркеров по сравнению с 8-ю у прототипа, что делает способ проще;

- способ позволяет надежно различать глиомы III и IV степеней злокачественности, что делает способ точнее.

Предлагаемый способ решения данной задачи заключается в следующем. Из ткани глиомы выделяют тотальную РНК, проводят реакцию обратной транскрипции для синтеза первой цепи кДНК. Определяют уровень экспрессии следующих генов: TEK, С3, MKI67, HIF1A, OLIG2, TNFRSF1A. Проводят расчет степени злокачественности глиомы по формуле:

у=1,69-2,844×Х₁-0,883×Х₂-0,043×Х₃+0,081×Х₄+0,169×Х₅-0,04×Х₆, где

X₁ - экспрессия гена TEK;

Х₂ - экспрессия гена С3;

Х₃ - экспрессия гена MKI67;

Х₄ - экспрессия гена HIF1A;

Х₅ - экспрессия гена OLIG2;

Х₆ - экспрессия гена TNFRSF1A;

значения «у» больше 2,4, но меньше 3,4 соответствуют степени злокачественности опухоли Grade III; значения «у» выше 3,4 соответствуют глиобластоме, Grade IV.

Для проверки адекватности выбора маркерных генов и для выведения формулы расчета злокачественности тканей мы провели исследование на 29-ти тканях глиом. Образцы тканей глиомы получали при операциях по резекции опухолей. Полученные ткани разбили на 2 группы по степени злокачественности. Критерием отнесения к той или иной группе служило заключение морфологического исследования опухоли. Группу Grade III составляли ткани от пациентов с диагнозами анапластическая астроцитома и олигодендроглиома Grade III. Группа Grade IV - это ткани, полученные из глиобластомы. Контрольную группу составляли 9 образцов, полученных при операциях, не связанных с онкологией.

Из образцов тканей выделяли общую РНК, проводили обратную транскрипцию и определяли нормализованную экспрессию 23-х генов.

Затем мы проанализировали полученные данные с помощью программного обеспечения IBM SPSS Statistics 26.0. Для отбора опорных генов для нашей модели мы нашли гены, у которых при подсчете коэффициента Джонкхира-Терпстры с поправкой на точный критерий Монте-Карло (при доверительном интервале 95% (CI 95) и количестве выборок 10000) с учетом поправки Бонферрони для 3 выборок была получена односторонняя значимость р<0,017. Такими генами оказались BCL2, GFAP, MELK, MKI67, TEK, TIE1, VEGFR2. Затем мы провели поиск мультиколлинеаров к этим генам, рассчитав парную корреляцию по методу Спирмена. Данные мультиколлинеары были исключены из нашего набора анализируемых генов для повышения точности модели и уменьшения итогового количества генов, необходимых для дифференциации образца ткани. Затем оставшиеся гены мы исследовали на лучшее соответствие типа используемой регрессионной модели с помощью метода подгонки кривых, в результате большинство отобранных генов лучше соответствовало модели на основе линейной регрессии. Модель линейной регрессии мы составляли на основе метода прямого шагового подбора модели с использованием информационного критерия включения\исключения AICC. На данном этапе наивысшую точность модели равную 67,0% (информационный критерий равен -1,746) дали гены TEK, TIE1, VEGFR2. Для повышения точности нашей модели мы проанализировали распределение результатов экспрессии всех отобранных генов, а затем на основе полученных данных для генов OLIG2, TEK, С3, HIF1 A, TNFRSF1A провели ранжирование. После этого у набора генов TEK, С3, MKI67, HIF1A, OLIG2, TNFRSF1A прогностическая точность возросла до 92,7% (информационный критерий равен -49,079), при этом точность разделения степеней злокачественности также увеличилась и проиллюстрирована Фигурой 1. На Фигуре 1 представлены предсказанные значения степеней злокачественности глиом, III и IV грейдов и контрольной группы.

Итоговая формула:

у=1,69-2,844×Х₁-0,883×Х₂-0,043×Х₃+0,081×Х₄+0,169×Х₅-0,04×Х₆, где

X₁ - экспрессия гена TEK;

Х₂ - экспрессия гена С3;

Х₃ - экспрессия гена MKI67;

Х₄ - экспрессия гена HIF1A;

Х₅ - экспрессия гена OLIG2;

Х₆ - экспрессия гена TNFRSF1A.

На основе предсказанных значений степени злокачественности для образцов из наших выборок мы рассчитали, что значения «у» больше 2,4, но меньше 3,4 соответствовали Grade III; значения «у» выше 3,4 соответствовали Grade IV.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Больная Р., женщина, 46 лет. Жалобы при поступлении: на однократный вторично генерализованный эпиприступ с тонико-клоническими судорогами. На МРТ головного мозга выявлено распространенное мутифокальное новообразование в области левой височной, затылочной долей. Проведена операция по удалению опухоли. Из образца опухолевой ткани выделена общая РНК реактивом «Tri Reagent», MRC, США, по прилагаемому протоколу. Обратную транскрипцию для синтеза первой цепи кДНК осуществляли набором реактивов «MMLV RT kit», Евроген, Россия, по прилагаемому протоколу. Объем пробы составлял 20 мкл, в реакционную смесь добавляли 2-5 мкг РНК и 2 мкл олиго(dT)16 праймера. Длительность инкубации 40 минут при 41°. Полученный образец кДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР в реальном времени. Проводили реакцию ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 Touch (BioRad,CIIIA). Для проведения реакции использовали «Набор реагентов для проведения ПЦР в реальном времени в присутствии SYBR Green I R-402» (Синтол, Россия). Температурно-временные характеристики реакции: предварительный прогрев при 95°С - 5 мин; 40 циклов (денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг и элонгация при 60°С - 30 сек). Определяли экспрессию генов: TEK, С3, MKI67, HIF1A, OLIG2, TNFRSF1A. Нормализацию значений экспрессии осуществляли при помощи референсного гена GAPDH. Предварительно к мРНК генов были подобраны прямой и обратный праймеры: TEK (TGTGCTGTTCCTTCTTGCCTCT; CCATGGCACCTTCCACAGTTC), С3 (GGGCGTGTTCGTGCTGAATA; CTGCTGCTCGTGAAGGTCAG), MKI67 (TGACCCTGATGAGAGTGAGGGA; GGTTGGGGCTTCTCCCCTTT), HIF1A (TTGGCAGCAACGACACAGAAACTG; TTGAGTGCAGGGTCAGCACTACTT), OLIG2 (CCAGAGCCCGATGACCTTTTT; CACTGCCTCCTAGCTTGTCC), TNFRSF1A (TCACCTAGGGGACAGGGAGA; CTGACCCATTTCCTTTCGGCA), GAPDH (AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG; GGCAGAGATGATGACCCTTTT).

По формуле рассчитали степень злокачественности.

у=1,69-2,844×Х₁-0,883×Х₂-0,043×Х₃+0,081×Х₄+0,169×Х₅-0,04×Х₆, где

X₁ - экспрессия гена TEK;

Х₂ - экспрессия гена С3;

Х₃ - экспрессия гена MKI67;

Х₄ - экспрессия гена HIF1A;

Х₅ - экспрессия гена OLIG2;

Х₆ - экспрессия гена TNFRSF1A

Значение «у» оказалось равным 2,551, что соответствует степени злокачественности Grade III. Позднее, по результатам морфологического исследования опухоли вынесено заключение: анапластическая астроцитома, WHO Grade III. Пример 2.

Больная 3., женщина, 55 лет. Жалобы: головные боли, нарушение речи, слабость в правой руке и ноге. По имеющимся рентгенологическим данным на МРТ объемное образование левой височно-лобно-теменной области, предположительно, опухоль глиального ряда WHO Grade III-IV. Проведена операция по хирургическому удалению опухоли. Образец ткани исследован заявляемым способом. Значение «у» оказалось равным 4,143. Это значение соответствует глиобластоме, Grade IV. Заключение по морфологическому исследованию подтвердило диагноз: глиобластома, WHO Grade IV.

Представленные примеры демонстрируют, что изобретение позволяет различать глиомы высоких грейдов злокачественности. Изобретение дает возможность рассчитать количественные критерии дифференциальной диагностики глиом.

Список использованной литературы.

1. Figarella-Branger D., Bouvier С. Classification anatomopathologique des gliomes: faits et controversies. Bulletin du Cancer. - 2005. - v.92. - №4. - p. 301-309.

2. Патент РФ 2375961. Способ проведения однофотонной эмиссионной компьютерной томографии головного мозга в диагностике и определении степени злокачественности глиальных опухолей. - 2009.

3. Патент РФ 2709651. Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-РНК. - 2019.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики глиальных опухолей мозга высоких степеней злокачественности. Описан способ дифференциальной диагностики глиом высоких грейдов, в котором из образца ткани глиомы выделяют общую РНК, осуществляют синтез 1-й цепи кДНК с помощью реакции обратной транскрипции, проводят ПЦР в реальном времени с праймерами, подобранными к мРНК генов ТЕK, С3, MKI67, HIF1A, OLIG2, TNFRSF1A. Рассчитывают степень злокачественности глиомы «у» по формуле: у=1,69-2,844×Х₁-0,883×Х₂-0,043×Х₃+0,081×Х₄+0,169×Х₅-0,04×Х₆, где X₁ - экспрессия гена ТЕK; Х₂ - экспрессия гена С3; Х₃ - экспрессия гена MKI67; Х₄ - экспрессия гена HIF1A; Х₅ - экспрессия гена OLIG2; Х₆ - экспрессия гена TNFRSF1A. При значениях «у» больше 2,4, но меньше 3,4 опухоль относят к Grade III; при значениях «у» больше, чем 3,4 ставят диагноз «глиобластома», Grade IV. Технический результат заключается в повышении точности способа, снижении трудоемкости и его упрощении. 1 ил., 1 пр.

Способ дифференциальной диагностики глиом высоких грейдов с использованием определения экспрессии генов, отличающийся тем, что определяют экспрессию генов ТЕK, С3, MKI67, HIF1A, OLIG2, TNFRSF1А и рассчитывают грейд глиомы по формуле:

у=1,69-2,844×Х₁-0,883×Х₂-0,043×Х₃+0,081×Х₄+0,169×Х₅-0,04×Х₆, где

X₁ - экспрессия гена ТЕK,

Х₂ - экспрессия гена С3,

Х₃ - экспрессия гена MKI67,

Х₄ - экспрессия гена HIF1А,

Х₅ - экспрессия гена OLIG2,

Х₆ - экспрессия гена TNFRSF1A;

при значениях «у» больше 2,4, но меньше 3,4 опухоль относят к Grade III;

при значениях «у» больше, чем 3,4 ставят диагноз «глиобластома», Grade IV.