Способ дифференциальной диагностики глиальных опухолей III и IV грейдов злокачественности Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 G01N33/574 G01N33/58 

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине, в частности к нейрохирургии, и может быть использовано при оценке степени злокачественности глиальных опухолей.

Глиома - это гетерогенное новообразование, поражающее глиальные клетки преимущественно центральной нервной системы и обладающее вариативностью по степени злокачественности. Это самая распространенная первичная опухоль головного мозга. Глиомы высоких грейдов - 3 и 4 - наиболее злокачественные. К 4 грейду относят глиобластому (ГБ), к 3 - анапластическую астроцитому (АА) и анапластическую олигодендроглиому (аОДГ). Средний срок жизни с ГБ составляет от 3-х месяцев до 2-х лет, АА и АОДГ - от 8 месяцев до 5 лет. Для эффективного прогноза и назначения дальнейшего лечения необходимо надежно различать опухоли по степени злокачественности. Существуют разные способы дифференциальной диагностики глиом, среди которых доплерография, МРТ-диагностика и измерение экспрессии генов.

Известен способ диагностики степени злокачественности глиом (1), предполагающий контактную высокочастотную допплерографию до и после гипервентиляции и измерение средней линейной скорости мозгового кровотока (ЛСКср) в артериях опухоли, переходной зоны и окружающего неизмененного мозгового вещества. Данный способ осуществляется следующим образом. При вскрытии твердой мозговой оболочки во время операционного удаления опухоли, используется аппарат ультразвуковой допплерографии со стерильным датчиком частотой 20 или 25 МГц. Посредствам контакта датчика через каплю стерильного физиологического раствора при нормокапнии проводят измерение ЛСКср в артериях по трем зонам: сама опухоль, переходная зона и окружающее условно неизмененное вещество мозга. Проводят гипервентиляцию, обеспечивающую падение et CO₂ на 5 мм рт.ст. по данным капнографии. Затем проводят повторное измерение ЛСКср в тех же артериях. Направление реакции того или иного показателя принимают за 1 в том случае, если показатель нарастает после гипервентиляции более чем на 5% от исходного уровня, направление реакции, равное 0, считают при изменении показателя в пределах 5% в ту или иную сторону, направление реакции, равное -1, считают в том случае, если значение показателя после гипервентиляции уменьшается более, чем на 5% от исходного уровня. Если направление реакции ЛСКср в артерии перифокальной зоны отличается от направления ЛСКср в артерии неизмененного мозгового вещества, диагностируют глиому 1-3 степени злокачественности, если направление реакции ЛСКср в артерии перифокальной зоны отличается от направления ЛСКср артерии опухоли, диагностируют глиому 4 степени злокачественности. Способ позволяет дифференцировать глиомы 3 и 4 степени злокачественности.

Недостатком данного способа является требование специального оборудования, способ недостаточно точен, требует регистрации незначительных (5%) изменений значений кровотока, а также предполагает значительное инвазивное вмешательство в организм.

Существует способ диагностики злокачественной глиомы головного мозга (2), основанный на методе МРТ. Способ включает получение 4-7 МРТ-изображений в режимах T₁ c контрастированием и Т2 без контрастирования. Проводят оценку величины перифокального отека, опухоли и ее кистевидного компонента по усредненному показателю площади вышеуказанных образований. Для постановки диагноза осуществляется томографическое исследование, включающее определение размеров областей опухоли и окружающего ее перифокального отека, а также измерение соотношения между ними. Анализ проводят на основе 4-7 сканов. Если усредненные показатели площади перифокального отека превышают средний показателя площади опухоли не менее чем на 20%, при этом опухоль содержит кистевидный компонент площадью 40-70% от площади опухоли, диагностируют злокачественную глиому астроцитарного ряда. Если средний показатель площади перифокального отека ниже среднего показателя площади опухоли не менее чем на 10% (при наличии в проекции опухоли кистевидного компонента любой площади), диагностируют злокачественную глиому олигодендроглиального ряда. Способ позволяет определить тип глиомы, отличать глиомы астроцитарного ряда от олигодендроглиального ряда.

Недостатком этого способа является отсутствие возможности различать глиомы по степени злокачественности. Помимо этого, способ применим не при любой локализации опухоли.

Существует способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека (3), основанный на определении экспрессии 10 микроРНК из ткани опухоли. Методом РТ ПЦР определяют Экспрессию микроРНК-21, -221, -31, -124, -125b, -16, -451, -191, -181b, -223 и рассчитывают значение комплексного критерия (К). При значении К, равного или больше 1, делают заключение о наличии глиобластомы, при значении К, лежащего в интервале от 0 до -3, делают заключение о наличии диффузной астроцитомы, а при значении К, равного или ниже -4, делают заключение о наличии анапластической астроцитомы. Способ позволяет различать глиомы астроцитарного ряда.

Однако данный способ имеет недостатки. Необходимость определять значения экспрессии десяти мишеней делает его сложным. Кроме того, способ позволяет различать по злокачественности глиомы только астроцитарного, но не олигодендроглиального ряда.

Наиболее близким к заявляемому нами является способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-РНК (4). Данный способ взят нами в качестве прототипа.

Способ включает следующие процедуры. Выделяют общую РНК из тканевых проб глиом и перифокальной зоны. Проводят обратную транскрипцию с целью получения матрицы для ПЦР в режиме реального времени в которой используют высокоспецифичные праймеры для генетических локусов EGFR - F: AGGACGGGGACCAGACAA, R: CTGCGTACTTCCAGACCAGG, MSI1 - F: GGCTGTGGTTCGAGGGAC, R: CTGGGAGTCGAACCTGGAG, PSMC4 - F: CGCTCACGCATTTCGAGC, R: CAGGTGGGCCATACATGAGG, ТВР - F: GTGCCCGAAACGCCGAA, R: GTGGTTCGTGGCTCTCTTATCC, RPLO - F: GAGGAAACTCTGCATTCTCGC, R: CTGCAGACAGACACTGGCA и микро-РНК hsa-miR-92-1-5p - F: GAGGTTGGGATCGGTTGGAA, R: AGGTCCAGT(15)AGCA, hsa-miR-126-5p - F: CGCAGCATTATTACTTTTGGTAC, R: GTCCAG 15(T)GCGTA, hsa-miR-7-5p - F: CGCAGTGGAAGACTAGTGA, R: GTCCAGT(15)CAAC.

После этого вычисляют коэффициент относительной экспрессии Е с использованием трех референсных генов: PSMC4, ТВР, RPLO и двух референсных микро-РНК: hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p. Затем сравнивают полученные значения Е в опухолевой ткани с контрольными. При значениях EEGFR<0,5 или EEGFR>1,5, EMSI1<0,5 или EMSI1>1,5, Ehsa-miR-92a-1-5p<0,5 или Ehsa-miR-92a-1-5p>1,5 хотя бы по одному локусу у пациента диагностируется глиома высокой степени злокачественности III, IV; отсутствие изменений экспрессии указанных локусов относительно контроля свидетельствует о соответствии опухоли П степени злокачественности; коэффициент Е рассчитывают по формуле:

где ΔCt(опухоль) - относительная экспрессия генов и микро-РНК в ткани глиом, где ΔCt (контроль) - относительная экспрессия генов и микро-РНК в ткани перифокальной зоны; при этом относительную экспрессию генетических локусов рассчитывают по формуле ΔCt=2-(Ct-4-целевого гена-Ct-референсных генов), где Ct-целевого гена - по трем повторам для целевых локусов EGFR или MSI1 и где Ct-референсных генов - среднее геометрическое значение референсных генов PSMC4, ТВР, RPLO; относительную экспрессию микро-РНК рассчитывают по формуле ΔCt=2-(С1-целевой микроРНК-Ct-референсных микроРНК), где Ct-целевой микроРНК - среднее по трем повторам для микро-РНК hsa-miR-92-1-5p и где Ct референсных микроРНК - среднее геометрическое значение референсных микро-РНК hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p. Способ позволяет различать глиомы II грейда злокачественности от глиом III и IV грейдов.

Способ имеет недостатки. К ним относится необходимость для анализа не только зоны глиомы, но и перифокальной зоны. Кроме того, способ сложен, он требует при постановке ПЦР 8-ми ДНК-мишней. Способ не дает возможности различать глиомы высоких грейдов, III и IV.

Задачами, на которые направлен заявляемый способ, является упрощение и повышение точности способа. Поставленная цель достигается тем, что измеряют экспрессию генов CD44, SOX2, CIRBP в ткани глиомы, а о степени злокачественности опухоли судят по значению

где CD44 - экспрессия гена CD44, SOX2 - экспрессия гена SOX2, CIRBP - экспрессия гена CIRBP.

Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

- анализируется непосредственно ткань глиомы, без исследования образца ткани из перифокальной зоны, что упрощает способ;

- измеряется экспрессия 3-х маркеров по сравнению с 8-ю у прототипа, что также делает способ проще;

- способ позволяет надежно различать глиомы III и IV степеней злокачественности, что делает способ точнее.

Предлагаемый способ решения данной задачи заключается в следующем. Из ткани глиомы выделяют тотальную РНК, проводят реакцию обратной транскрипции для синтеза первой цепи кДНК. Определяют уровень экспрессии следующих генов: CD44, SOX2, CIRBP. Проводят расчет значения

Значения «у» меньше 0,04 соответствуют степени злокачественности опухоли III грейда; значения «у» равное или выше 0,04 соответствуют глиобластоме, IV грейда.

Для проверки адекватности выбора маркерных генов и для выведения формулы расчета злокачественности тканей мы провели исследование на 112-ти тканях глиом высокой степени злокачественности. Образцы тканей глиомы получали при операциях по резекции опухолей. Полученные образцы разбили на 2 группы по степени злокачественности. Критерием отнесения к той или иной группе служило заключение морфологического исследования опухоли. Группу III грейда составляли ткани от пациентов с диагнозами анапластическая астроцитома и олигодендроглиома, грейд III. Группа IV грейда - это ткани, полученные от пациентов с диагнозом глиобластома.

В каждом из 112 образцов тканей были определены значения экспрессии следующих генов: BCL2, CD44, CDK4, CDK6, CIRBP, L1CAM, LEF1, МАР2, MDM2, MGMT, ОСТ4, PDGFRa, SOX2. Выделение РНК проводили при помощи раствора RNAzol, после чего путем реакции обратной транскрипции получали кДНК для проведения количественного определения экспрессии указанных выше генов с использованием ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX Real-Time System Bio-Rad (США). Нормализовали результаты экспрессии таргетных генов по housekeeping-гену GAPDH в тех же образцах ткани. Для расчета экспрессии генов использовали программное обеспечение прибора.

Исследовали связь между экспрессией генов и грейдом злокачественности опухоли при помощи критерия Спирмена. Были подобраны гены, экспрессия которых сильно коррелировала с грейдом злокачественности глиомы: CD44, CIRBP, SOX2, кодирующие следующие белки.

CD44 - белок, кодируемый этим геном, представляет собой гликопротеин клеточной поверхности, участвующий в клеточной адгезии, миграции и метастазировании опухолей.

CIRBP обеспечивает активность связывания 3'-UTR мРНК и активность связывания рРНК малых рибосомальных субъединиц. Участвует в стабилизации мРНК и позитивной регуляции трансляции.

Большие концентрации белка SOX2 ассоциированы с опухолевым процессом, метастазированием и резистентностью злокачественных новообразований к химиотерапии.

Значения экспрессий отобранных генов объединили в формулу

Связь рассчитанных значений у с грейдом глиомы выше, чем экспрессия отдельных генов.

Рассчитали значения у по формуле для образцов глиом III и IV грейдов злокачественности. Результаты представлены в табл. 1 в виде средних и стандартных ошибок среднего.

Различия между выборками оценивали по критерию Манна-Уитни. Различия статистически значимы, р≤0,01.

При значении у<0,04, опухоль относится к третьему грейду злокачественности, при значении у≥0,04, опухоль относится к грейду IV. Способ позволяет исключить глиобластому с надежностью 93%.

Заявляемый способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1

Больная К., 70 лет, обратилась с жалобами на левосторонний гемипарез. Стала развиваться слабость в левых конечностях. МРТ головного мозга выявила внутримозговое новообразование правой лобной и островковой долей. Проведена операция - микрохирургическое удаление новообразования правой лобной доли с нейрофизиологическим мониторингом проводящих путей мозга. Из биоптата ткани опухоли выделяли общую РНК реактивом RNAzol (MRC, США) по протоколу, прилагаемому к реактиву. Проводили реакцию обратной транскрипции набором «MMLV RT kit» (Евроген, Россия) по прилагаемому протоколу. На общий объем 20 мкл инкубационной смеси использовали 2 мкг тотальной и 2 мкл олиго(dT)16 праймера. Длительность инкубации 40 минут при 41°. Полученный образец кДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР в реальном времени.

Уровни экспрессии генов CD44, CIRBP, SOX2 определяли на амплификаторе CFX96 Touch (BioRad, США). Для проведения реакции использовали «Набор реагентов для проведения ПЦР в реальном времени в присутствии SYBR Green IR-402» (Синтол, Россия). Параметры реакции: предварительный прогрев при 95°С - 5 мин; 40 циклов (денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг и элонгация при 60°С - 30 сек). К каждому из выбранных генов были подобраны праймеры для проведения количественного ПЦР в реальном времени: CD44 (AGAAGGTGTGGGCAGAAGAA; AAATGCACCATTTCCTGAGA), SOX2 (ACACCAATCCCATCCACACT; CCTCCCCAGGTTTTCTCTGT), CIRBP (AGACTACTATAGCAGCCGGAGT; GCGTAACTGTCATAACTGTCTCT), GAPDH (AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG; GGCAGAGATGATGACCCTTTT).

Экспрессию генов рассчитывали, используя программное обеспечение, поставляемое с прибором. Для нормализации результатов применяли референсный ген GAPDH. Каждую реакцию проводили в трех параллельных измерениях.

Значение составило 0,0611, что позволило поставить диагноз - глиобластома, IV грейд.

Позднее, в лаборатории патоморфологии установили, что гистологическая картина соответствует глиобластоме, IV грейд.

Пример 2

Больная Л., 52 лет, слабость в левой руке. Неврологическая симптоматика постепенно нарастала. Выполнено МРТ головного мозга с контрастным усилением: в правой лобно-теменной области выявляется кортико-субкортикальное новообразование размером 30 мм, солидного строения с признаками некротического распада. Проведена операция - микрохирургическое удаление опухоли правой теменной доли с нейрофизиологическим мониторингом. Образец ткани исследован заявляемым способом, значение у оказалось равным 0,5874. Это значение соответствует глиобластоме, грейд IV. Заключение по морфологическому исследованию подтвердила диагноз - глиобластома, NOS, CNS WHO Grade IV.

Пример 3

Больной Г., 37 лет, судорожный приступ с потерей сознания. Выполнено МСКТ головного мозга, было предположение - менингоэнцефалит лобно-теменной области слева, височной области справа. Нейроинфекции были исключены. МРТ показало картину объемного внутримозгового солидного образования в правой височной доле. Была проведена операция - микрохирургическое удаление новообразования правой височной доли с нейрофизиологическим мониторингом проводящих путей. В ткани определяли уровни экспрессии генов и рассчитали по формуле значения злокачественности у, оно оказалось равным 0,0016. Это значение соответствует степени злокачественности опухоли грейд III.

Гистологическое заключение - анапластическая астроцитома, грейд III, что подтверждает результаты, полученные заявляемым способом.

Пример 4

Больной Р., 33 года. Пациент стал ощущать вспышки перед глазами, потемнение, случались обмороки. Выполнил самостоятельно МРТ, на котором было обнаружено новообразование правой затылочной доли. Проведена операция - микрохирургическое удаление новообразования правой затылочной доли с применением нейрофизиологического мониторинга. В биоптате из операционного материала было проведено исследование экспрессии генов заявляемым способом. Значение у было равным 0,0263. Это значение соответствует степени злокачественности III грейда. Позднее было получено морфологическое заключение о том, что опухоль соответствует анапластической олигодендроглиоме, грейд III.

Список использованной литературы

1. Способ диагностики степени злокачественности глиом. Патент РФ 2423920.

2. Способ диагностики злокачественной глиомы головного мозга. Патент РФ 2308225.

3. Способ дифференциальной диагностики глиом головного мозга человека. Патент РФ 2583871.

4. Способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-РНК. Патент РФ 2709651.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу дифференциальной диагностики глиальных опухолей III и IV грейдов злокачественности. Указанный способ предусматривает использование измерения экспрессии генов и характеризуется тем, что измеряют экспрессию генов CD44, SOX2, CIRBP в тканях глиальной опухоли, а о степени злокачественности опухоли судят по значению «у», рассчитанному исходя из полученных значений экспрессии указанных генов. Настоящее изобретение обеспечивает упрощение и повышение точности способа дифференциальной диагностики глиальных опухолей III и IV грейдов. 1 табл., 4 пр.

Способ дифференциальной диагностики глиальных опухолей III и IV грейдов злокачественности с использованием измерения экспрессии генов, отличающийся тем, что измеряют экспрессию генов CD44, SOX2, CIRBP в тканях глиальной опухоли, а о степени злокачественности опухоли судят по значению причем значение «у» меньше 0,04 соответствуют степени злокачественности опухоли III грейда; значения «у», равное или выше 0,04, соответствуют глиобластоме IV грейда.