СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ ЧЕРНУШКИ ПОСЕВНОЙ Российский патент 2022 года по МПК A61K36/71 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в траве чернушки посевной (Nigella sativa L.).

В настоящее время, система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах. Полученные данные позволяют объективно и селективно определять содержание целевых соединений (1).

Чернушка посевная (Nigella sativa L.) – травянистое растение семейства Чернушка (Nigella). Данный представитель рода Чернушка (Nigella L.) недостаточно изучен по сравнению с другими видами – подробно изучались только семена данного вида, исследований по фармакогностическому анализу травы отечественными исследователями ранее не проводилось. Чернушка посевная является перспективным видом официнального лекарственного растительного сырья, препараты которого оказывают ферментативное, гепатопротекторное и антиоксидантное действие (2).

Обзор литературы показал недостаточную степень изученности и возможности стандартизации травы чернушки посевной. Отечественные исследователи ссылаются на работу зарубежных ученых, где описывается изучение травы чернушки посевной методом ВЭЖХ из абсолютных метанольных экстрактов, которым определены 14 фенольных соединений, таких как ванилиновая кислота, галловая, транс-коричная кислота, катехин, апигенин и другие. Преобладающим фенольным соединением установлена ванилиновая кислота со средней концентрацией 143,21 и 89,94 мг на 100 г сухого веса побегов и корней, соответственно. Также метанольные экстракты из побегов и корней тунисской Nigella sativa L. были проверены на их антиоксидантную и антимутагенную активности с помощью теста Эймса. Побеги и корни продемонстрировали значительный антимутагенный эффект. Принимая во внимание, что пробоподготовка для ВЭЖХ более трудоемка и метанольные экстракты весьма токсичны, кроме того валидация данной методики не проводилась, актуальным является продолжение исследований в этом направлении. Данный способ определения фенольных соединений был взят как прототип для предлагаемой методики (3, 4).

Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в траве чернушки посевной, обладающего простой и безопасной пробоподготовкой, высокой специфичностью и точностью.

Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в траве чернушки посевной в пересчете нарутин.

Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 70% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30, время экстракции – извлечение на кипящей водяной бане в течение 45 мин, степень измельчения сырья – 2 мм. Количественное определение суммы флавоноидов в траве чернушки посевной проводят при длине волны 412 нм в пересчете на рутин; содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o – оптическая плотность раствора стандартного образца рутина;

m – масса сырья, г;

m_о – масса стандартного образца рутина, г;

W – потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца рутина для расчета целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 412 нм – 231:

где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

m – масса сырья, г;

231 – удельный показатель поглощения (E) СО рутина при 412 нм;

W – потеря в массе при высушивании в процентах.

При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно рутин определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из травы чернушки посевной. Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения травы чернушки посевной наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов (Фиг. 1), как и в случае рутина (Фиг. 2), где кривая 1 на Фиг. 1 и Фиг. 2 демонстрирует исходный раствор водно-спиртового извлечения из травы чернушки посевной или исходный раствор рутина соответственно, а кривая 2 – раствор водно-спиртового извлечения из травы чернушки посевной в присутствии алюминия хлорида или раствор рутина в присутствии алюминия хлорида соответственно.

Изучение УФ-спектров Фиг. 2 (где кривая 1 – раствор рутина, а кривая 2 - раствор рутина с добавлением алюминия хлорида) показало, что раствор СО рутина в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 406 нм, а при дифференциальном варианте (Фиг. 3) – 414 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из травы чернушки посевной в дифференциальном варианте (Фиг. 4) также обнаруживается при длине волны 412 нм максимум поглощения, который практически соответствует максимуму поглощения спиртового раствора рутина.

Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в траве чернушки посевной при аналитической длине волны 412 нм.

Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 (Фиг. 5) представлена зависимость выхода флавоноидов травы чернушки посевной от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 70% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.

Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, в таблице 2 (Фиг. 6) представлена зависимость выхода флавоноидов травы чернушки посевной от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 45 минут.

В таблице 3 (Фиг. 7) представлена зависимость выхода флавоноидов травы чернушки посевной от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы видно, что оптимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30, далее значения выходят на плато, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.

Также стоит отметить, что степень измельчения сырья в 2 мм является оптимальной, так как при тонком измельчении (меньше 2 мм) сырьё распределяется неравномерно – удельный вес цветков в аналитической пробе значительно возрастает, что может дать завышенный результат. Кроме того, более тонкое измельчение затрудняет очистку извлечений и увеличивает количество различных балластных компонентов в составе извлечения.

Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.

Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 70% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 45 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30.

Принимая по внимание тот факт, что рутин имеет схожие специфические спектральные характеристики с извлечением травы чернушки посевной, а максимумы поглощения раствора рутина и водно-спиртового извлечения травы чернушки посевной находятся в области 412 нм, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин при длине волны 412 нм.

Способ реализуется следующим образом.

Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве чернушки посевной. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 70 % этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 45 мин. Затем ее охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор сравнения).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 412 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора стандартного образца рутина.

Около 0,02 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 2 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б рутина).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o – оптическая плотность раствора стандартного образца рутина;

m – масса сырья, г;

m_о – масса стандартного образца рутина, г;

W – потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца рутина для расчета целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 412 нм – 231:

где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

m – масса сырья, г;

231 – удельный показатель поглощения (E) СО рутина при 412 нм;

W – потеря в массе при высушивании в процентах.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Аналитическую пробу сырья травы чернушки посевной измельчают до размера частиц 2 мм (заготовлено в рп. Чердаклы, Ульяновская обл., июль 2021 г.). 1,0052 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до +0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 45 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 412 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора стандартного образца рутина.

0,0208 г рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). После чего 2 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 %. Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 %.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где:

0,3310 – оптическая плотность испытуемого раствора;

0,7704 – оптическая плотность раствора стандартного образца рутина;

1,0052 – масса сырья, г;

0,0208 – масса стандартного образца рутина, г.

8,71 – потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин = 1,17 %.

Пример 2.

При необходимости определения суммы флавоноидов в траве чернушки посевной в отсутствии стандартного образца рутина, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца рутина.

После измерения оптической плотности извлечения из травы чернушки посевной при длине волны 412 нм, содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 412 нм – 231.

где:

0,3310 – оптическая плотность испытуемого раствора;

1,0052– масса сырья, г;

231 – удельный показатель поглощения (E - оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) стандартного образца рутина при 412 нм;

8,71 – потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин = 1,17 %, что совпадает со значением, полученном в примере 1.

Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±4,17%.

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве чернушки посевной с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:

1. Разработанный метод является специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно, поскольку в качестве экстрагента используется 70% этиловый спирт, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).

2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для травы чернушки посевной вещество – рутин.

3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±4,17%, что свидетельствует об объективности разработанного способа.

Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа травы чернушки посевной (Nigella sativa L.).

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). – 3-е изд., перераб. и доп. – Самара: ООО «Офорт»; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2016. – 1279 с.

2. Рудь Н.К. Разработка технологии лекарственных средств из семян чернушки посевной и нормирование их качества : специальность 14.04.01 "Технология получения лекарств" : автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук / Рудь Наталья Каремовна. – Пятигорск, 2017. – 22 с.

3. Рудь, Н. К. Основные результаты фитохимического и фармакологического исследования чернушки посевной / Н. К. Рудь, А. М. Сампиев, Н. А. Давитавян // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. – 2013. – № 25(168). – С. 207-212.

4. Phenolic composition and biological activities of Tunisian Nigella sativa L. shoots and roots / Soumaya Bourgou, Riadh Ksouri, Amor Bellila et al. // C. R. Biologies. – 2008. – № 331. – Р.48-55.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в траве чернушки посевной (Nigella sativa L.). Проводят экстракцию этиловым спиртом в концентрации 70% воздушно-сухого сырья точной навеской массой 1 г, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30 в течение 45 мин. Получают водно-спиртовое извлечение из травы чернушки посевной однократной экстракции. Количественное определение суммы флавоноидов в траве чернушки посевной проводят при длине волны 412 нм в пересчете на рутин. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле

где X - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье, %; D - оптическая плотность испытуемого раствора; D_о - оптическая плотность раствора стандартного образца рутина; m - масса сырья, г; m_о - масса стандартного образца рутина, г;

W - потеря в массе при высушивании, %; или по формуле

где 231 - удельный показатель поглощения () стандартного образца рутина при 412 нм. Способ позволяет количественно определить сумму флавоноидов в траве чернушки посевной в пересчете на рутин. 7 ил., 2 пр.

Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве чернушки посевной (Nigella sativa L.) путем экстракции сырья органическими растворителями с последующей пробоподготовкой и определения оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии, отличающийся тем, что получают водно-спиртовое извлечение из травы чернушки посевной однократной экстракции этиловым спиртом в концентрации 70% воздушно-сухого сырья точной навеской массой 1 г, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30 в течение 45 мин, количественное определение суммы флавоноидов в траве чернушки посевной проводят при длине волны 412 нм в пересчете на рутин и содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле

где X - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_о - оптическая плотность раствора стандартного образца рутина;

m - масса сырья, г;

m_о - масса стандартного образца рутина, г;

W - потеря в массе при высушивании, %;

или по формуле

где 231 - удельный показатель поглощения () стандартного образца рутина при 412 нм.