Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного Российский патент 2024 года по МПК A61K31/352 A61K36/53 A61K36/63 A61K36/73 G01N33/15 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L.) Maxim).

Лабазник вязолистный или Filipendula ulmaria (L.) Maxim. является представителем семейства Розоцветных (Rosaceae) и широко распространен в европейской части России в Западной и Восточной Сибири [1]. Сырье лабазника вязолистного содержит разнообразный набор биологически активных веществ, представленный в основном фенольными соединениями. В подземной части лабазника вязолистного фенольные соединения представлены салициловым альдегидом, фенологликозидами, дубильными веществами, флавоноидами. Листья лабазника вязолистного содержат фенолкарбоновые кислоты и их производные (кофейная и эллаговая кислоты), дубильные вещества, катехины, флавоноиды; стебли содержат дубильные вещества и следы флавоноидов. В цветках лабазника вязолистного обнаружены эфирное масло, ароматические соединения: метилсалицилат, салициловый альдегид, а также флавоноиды. В состав плодов лабазника вязолистного входят дубильные вещества и флавоноиды [2, 3].

Известен способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин с использованием дифференциальной спектрофотометрии [4].

Данный способ был взят нами в качестве прототипа. Данная методика не является селективной в виду низкой специфичности, неполноты экстракции, так как концентрация экстрагента (этилового спирта) подобрана не оптимальная, также разработанный метод включает в себя проведение реакции кислотного гидролиза, что увеличивает время проведения анализа.

Таким образом, целью изобретения является разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного, включающая оптимизацию процесса извлечения флавоноидов с использованием методов математического планирования эксперимента и спектрофотометрический анализ полученных извлечений.

В ходе разработки методики количественного определения суммы флавоноидов изучали УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из травы лабазника вязолистного. Так, при использовании реакции комплексообразования с 3% раствором алюминия хлорида в результате батохромного сдвига наблюдается максимум поглощения окрашенного комплекса водно-спиртового извлечения из травы лабазника вязолистного при длине волны 412±2 нм. На фиг. 1 представлен УФ-спектр водно-спиртового извлечения из травы лабазника вязолистного (кривая 1) и водно-спиртового извлечения с алюминием хлоридом (кривая 2).

Указанный максимум поглощения на дифференциальной кривой спектра поглощения характерен для гликозидных форм флавонолов, в частности, для рутина, что позволило выбрать в качестве аналитической длины волны значение 412 нм. На фиг. 2 представлен УФ-спектр раствора водно-спиртового извлечения из травы лабазника вязолистного (дифференциальный вариант). Стандартный образец (СО) рутина предложен нами для использования в методике количественного анализа.

Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного.

Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 40% в соотношении 1 г сырья к 50 мл спирта, время экстракции 90 минут, количественное определение суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного проводят методом дифференциальной спектрофотометрии при длине волны 412±2 нм в пересчете на рутин.

Содержание суммы флавоноидов Х, выраженное в процентах, в пересчете на стандартный образец рутина вычисляют по формуле:

где в числителе:

D_x – оптическая плотность исследуемого раствора;

50 – объём извлечения, мл;

25 – объём колбы для приготовления раствора А испытуемого раствора, мл;

2 – объём аликвоты для приготовления раствора А Государственного стандартного образца рутина, мл;

m₀ – масса СО рутина, г;

100 – содержание основного вещества в Государственном стандартном образце рутина, %;

в знаменателе:

D₀ – оптическая плотность раствора СО рутина;

50 – объём колбы для приготовления раствора А Государственного стандартного образца рутина, мл;

25 – объём Государственного стандартного образца рутина, мл;

m_x – масса исследуемого сырья, г;

W – потеря в массе при высушивании сырья, %;

В случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения – 215, расчет вести по формуле:

где в числителе:

D_х – оптическая плотность испытуемого раствора;

50 – объём извлечения, мл;

25 – объём колбы для приготовления раствора А испытуемого раствора, мл;

в знаменателе:

215 – удельный показатель поглощения (E) СО рутина при 412 нм;

m_х – масса сырья, г;

W – потеря в массе при высушивании, %.

Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного представлены в табл. 1.

Таблица 1

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного

f s P,% t(P,f) Δx ε,% 10 3,965 1,911×10^-3 4,4×10^-2 95 2,26 0,099 0,031 2,492

Статистическая обработка полученных результатов свидетельствует о том, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного в пересчете на СО рутин и абсолютно сухое сырье с достоверной вероятностью 95% составляет 2,492% (табл.1).

Валидационную оценку разработанной методики проводили по показателям: специфичность, линейность, правильность и воспроизводимость. Специфичность методики определяли по соответствию максимумов поглощения комплекса флавоноидов травы лабазника вязолистного и рутина с алюминия хлоридом. Линейную зависимость оптической плотности от концентрации в диапазоне от 8 до 41 мкг/мл СО рутина определяли с использованием серии из 4 проб стандартного образца. Коэффициент детерминации при этом составил 0,9956, что свидетельствует о сильной статистической взаимосвязи величин.

Методом добавок определяли правильность разработанной методики. Систематическая ошибка проведенного анализа (δ) составила – 4,22%. Погрешность, определяемая для проб с добавками рутина (25%, 50% и 75%), находилась в пределах относительной погрешности единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической погрешности.

С использованием разработанной методики нами исследован ряд образцов травы лабазника вязолистного (табл. 2). Определено, что содержание суммы флавоноидов варьирует от 3,90+0,02% до 4,02+0,04%.

Таблица 2

Содержание суммы флавоноидов в образцах травы лабазника вязолистного

№ п/п Характеристика образца сырья Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье (в %)
в пересчете на рутин 1 Самарская область,
п. Алексеевка (июль 2020 г.) 3,93±0,01 2 Самарская область,
п. Алексеевка (июнь 2021 г.) 3,95±0,04 3 Самарская область,
п. Алексеевка (июль 2022 г.) 3,92±0,02

Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать для травы лабазника вязолистного нижний предел содержания суммы флавоноидов не менее 3,5%.

Способ реализуется следующим образом.

Пример 1. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 40%-ного спирта этилового. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01 г, после чего колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 90 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 минут при комнатной температуре, закрывая той же пробкой, снова взвешивают и добавляют экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 3%-ного спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора 96%-ным спиртом этиловым до метки (испытуемый раствор А).

Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 412 нм через 40 минут после приготовления.

В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл извлечения (1:50) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора 96%-ным спиртом этиловым до метки (раствор сравнения А).

Приготовление раствора стандартного образца рутина.

Около 0,02 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 30 мл 70%-ного спирта этилового при нагревании на водяной бане. Затем содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят объем 96%-ным спиртом этиловым до метки (раствор А СО рутина). 1 мл раствора А СО рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3%-ного спиртового раствора алюминия хлорида и доводят 96%-ным спиртом этиловым до метки (раствор Б СО рутина). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А СО рутина, помещенного в мерную колбу на 25 мл, и 96%-ного спирта этилового, который добавляют до метки.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на СО рутина в процентах (Х) вычисляют по формуле:

где в числителе:

0,6880 – оптическая плотность испытуемого раствора;

50 – объём извлечения, мл;

25 – объём колбы для приготовления раствора А испытуемого раствора, мл;

2 – объём аликвоты для приготовления раствора А Государственного стандартного образца рутина, мл;

0,0221 – масса СО рутина, г;

100 – содержание основного вещества в Государственном стандартном образце рутина, %;

в знаменателе:

0,7596 – оптическая плотность раствора СО рутина;

50 – объём колбы для приготовления раствора А Государственного стандартного образца рутина, мл;

25 – объём Государственного стандартного образца рутина, мл;

1,0031 – масса сырья, г;

0,8688 – потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин X=4,02%.

Пример 2. В случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения – 215, расчет вести по формуле:

где в числителе:

0,6822 – оптическая плотность испытуемого раствора;

50 – объём извлечения, мл;

25 – объём колбы для приготовления раствора А испытуемого раствора, мл;

в знаменателе:

215– удельный показатель поглощения (E) СО рутина при 412 нм;

1,0070 – масса сырья, г;

0,3497 – потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин X=3,95%, что сравнимо со значением, полученным в примере 1.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Маевский П.Ф. Флора средней полосы европейской части России. М.: КМК, 2006; 292.

2. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Hydrangeaceae – Haloragaceae. Л.: Наука, 1987; 45-46.

3. Краснов Е.А., Авдеева Е.Ю. Химический состав растений рода Filipendula (обзор). Химия растительного сырья, 2012; 4: 5-12.

4. Заяц Д.В. Определение флавоноидов в лабазнике вязолистном (Filipendula ulmaria L.), произрастающем на территории Архангельской области // Современные научные исследования и инновации, 2016; № 4 [Электронный ресурс]. URL: https://web.snauka.ru/issues/2016/04/67343 (дата обращения: 29.05.2023 г.).

Изобретение относится к области химии и фармацевтики, а именно к способу количественного определения суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного. Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного, включающий однократную экстракцию воздушно-сухого сырья органическим растворителем с последующей пробоподготовкой и определением оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии, отличающийся тем, что экстракцию сырья осуществляют этиловым спиртом в концентрации 40% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1 г сырья к 50 мл спирта, время экстракции на кипящей водяной бане составляет 90 минут, степень измельчения сырья – 1 мм; количественное определение суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного проводят при длине волны 412±2 нм в пересчете на рутин; содержание суммы флавоноидов Х, выраженное в процентах, в пересчете на стандартный образец рутина вычисляют по формуле:

,

где в числителе: D_x – оптическая плотность исследуемого раствора; 50 – объём извлечения, мл; 25 – объём колбы для приготовления раствора А испытуемого раствора, мл; 2 – объём аликвоты для приготовления раствора А Государственного стандартного образца рутина, мл; m₀ – масса СО рутина, г; 100 – содержание основного вещества в Государственном стандартном образце рутина, %; в знаменателе: D₀ – оптическая плотность раствора СО рутина; 50 – объём колбы для приготовления раствора А Государственного стандартного образца рутина, мл; 25 – объём Государственного стандартного образца рутина, мл; m_x – масса исследуемого сырья, г; W – потеря в массе при высушивании сырья, %; в случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения – 215, расчет вести по формуле:

где в числителе: D_х – оптическая плотность испытуемого раствора; 50 – объём извлечения, мл; 25 – объём колбы для приготовления раствора А испытуемого раствора, мл; в знаменателе: 215 – удельный показатель поглощения (E ) СО рутина при 412 нм; m_х – масса сырья, г; W – потеря в массе при высушивании, %. Использование изобретения позволяет осуществлять эффективное количественное определение суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного, включающий однократную экстракцию воздушно-сухого сырья органическим растворителем с последующей пробоподготовкой и определением оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии, отличающийся тем, что экстракцию сырья осуществляют этиловым спиртом в концентрации 40% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1 г сырья к 50 мл спирта, время экстракции на кипящей водяной бане составляет 90 минут, степень измельчения сырья – 1 мм; количественное определение суммы флавоноидов в траве лабазника вязолистного проводят при длине волны 412±2 нм в пересчете на рутин; содержание суммы флавоноидов Х, выраженное в процентах, в пересчете на стандартный образец рутина вычисляют по формуле:

,

где в числителе:

D_x – оптическая плотность исследуемого раствора;

50 – объём извлечения, мл;

25 – объём колбы для приготовления раствора А испытуемого раствора, мл;

2 – объём аликвоты для приготовления раствора А Государственного стандартного образца рутина, мл;

m₀ – масса СО рутина, г;

100 – содержание основного вещества в Государственном стандартном образце рутина, %;

в знаменателе:

D₀ – оптическая плотность раствора СО рутина;

50 – объём колбы для приготовления раствора А Государственного стандартного образца рутина, мл;

25 – объём Государственного стандартного образца рутина, мл;

m_x – масса исследуемого сырья, г;

W – потеря в массе при высушивании сырья, %;

в случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения – 215, расчет вести по формуле:

где в числителе:

D_х – оптическая плотность испытуемого раствора;

50 – объём извлечения, мл;

25 – объём колбы для приготовления раствора А испытуемого раствора, мл;

в знаменателе:

215 – удельный показатель поглощения (E ) СО рутина при 412 нм;

m_х – масса сырья, г;

W – потеря в массе при высушивании, %.