СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ ТЫСЯЧЕЛИСТНИКА ОБЫКНОВЕННОГО Российский патент 2023 года по МПК A61K36/484 G01N33/15 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного (Achillea millefolium L.).

Род Тысячелистник имеет около 200 видов растений, произрастающих в лесной, лесостепной и степной зонах Европы, Азии (до Гималаев), Северной Америки (6). Тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium L.) является единственным фармакопейным представителем рода Achillea (1).

В качестве лекарственного растительного сырья (ЛРС) применяется трава тысячелистника обыкновенного. Растение содержит биологически активные вещества (БАВ) - эфирные масла, флавоноиды, и другие фенольные соединения, которые также вносят свой вклад в фармакологическое действие. Известно применение травы тысячелистника в народной и официнальной медицине в качестве желчегонного, кровоостанавливающего, противовоспалительного средства, а также как горечи для возбуждения аппетита (2, 3).

Известна методика количественного определения суммы флавоноидов, включенная в Государственную фармакопею XIV издания, в соответствии с которой на стадии экстракции данного сырья необходимо проведение кислотного гидролиза спиртом этиловым 96%, содержащим 1% хлористоводородной кислоты концентрированной, с последующим определением суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин (1, 5). Данная методика выбрана нами в качестве прототипа.

Недостатком данной методики является то обстоятельство, что в испытуемом растворе анализируются артефакты (лютеолин и др.), которые образуются в результате кислотного гидролиза в условиях экстракции сырья. Кроме того, необходимо принять во внимание тот факт, что содержащиеся в траве тысячелистника обыкновенного флавоноидные гликозиды, в том числе 7-О-глюкозиды лютеолина (цинарозид) и апигенина (космосиин), трудно поддаются кислотному гидролизу с использованием 1% хлористоводородной кислоты концентрированной, что не позволяет обеспечить полноту гидролиза и исчерпывающую экстракцию целевых веществ, т.к. флавоноидные гликозиды плохо растворяются в 96% спирте этиловом. Необоснованной представляется и продолжительность экстракции (1,5 часа), т.к. для осуществления полного кислотного гидролиза флавоноидов 7-О-глюкозидов требуется, как правило, более продолжительное время и более жесткие условия (10% хлористоводородная кислота) (3).

Известна также методика количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного при аналитической длине волны 412 нм в пересчете на рутин (4), однако данный способ не является селективным, так как спектральные характеристики испытуемого раствора обусловлены не рутином, а в основном гликозидами лютеолина и апигенина (цианарозид, космосиин и др.).

Следовательно, является актуальным исследование в плане совершенствования методики количественного определения суммы флавоноидов в сырье данного растения.

Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного, обладающего высокой специфичностью и точностью.

Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного в пересчете на цинарозид.

Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 50% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30, время экстракции - извлечение на кипящей водяной бане в течение 45 мин, степень измельчения сырья - 2 мм, реакция комплексообразования с хлоридом алюминия в течение 30 мин. Количественное определение суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного проводят при длине волны 400 нм в пересчете на цинарозид; содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца цинарозида;

m - масса сырья, г;

m_о - масса Государственного стандартного образца цинарозида, г;

W - потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца цинарозида для расчета целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения при 400 нм - 340:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

m_о - масса ГСО цинарозида, г;

340 - удельный показатель поглощения ГСО цинарозида при 400 нм;

W - потеря в массе при высушивании в процентах.

При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно
цинарозид определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из травы тысячелистника обыкновенного. Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения тысячелистника обыкновенного наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов - Фиг. 1, как и в случае цинарозида - Фиг. 2, где кривая 1 на фигуре 1 и фигуре 2 демонстрирует исходный раствор водно-спиртового извлечения из травы тысячелистника обыкновенного или исходный раствор цинарозида соответственно, а кривая 2 - раствор водно-спиртового извлечения из травы тысячелистника обыкновенного в присутствии алюминия хлорида или раствор цинарозида в присутствии алюминия хлорида соответственно.

Изучение УФ-спектров фигуры 2 (где кривая 1 - раствор цинарозида, а кривая 2 - раствор цинарозида с добавлением алюминия хлорида) показало, что раствор ГСО цинарозида в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 400 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из травы тысячелистника обыкновенного в дифференциальном варианте на фиг. 3 обнаруживается при длине волны 400 нм максимум поглощения, который соответствует максимуму поглощения спиртового раствора цинарозида.

Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного при аналитической длине волны 400 нм.

Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 на фиг.4 представлена зависимость выхода флавоноидов травы тысячелистника обыкновенного от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 50% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.

Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, в таблице 2 на фиг. 5 представлена зависимость выхода флавоноидов травы тысячелистника обыкновенного от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 45 минут.

В таблице 3 на фиг. 6 представлена зависимость выхода флавоноидов травы тысячелистника обыкновенного от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:30, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.

Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.

Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 50% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 45 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30.

Принимая по внимание тот факт, что специфическим для травы тысячелистника обыкновенного является цинарозид, а максимумы поглощения раствора цинарозида и водно-спиртового извлечения травы тысячелистника обыкновенного находятся в области 400 нм, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид при длине волны 400 нм.

Способ реализуется следующим образом.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 50% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 45 мин. Затем ее охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор сравнения).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца цинарозида, добавляют к нему 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 400 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора стандартного образца цинарозида.

Около 0,005 г (точная навеска) цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 10 мл 50% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 96% этиловым спиртом до метки (раствор А цинарозида). 2 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б цинарозида).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 400 нм через 30 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца цинарозида;

m - масса сырья, г;

m_о - масса Государственного стандартного образца цинарозида, г;

W - потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца цинарозида для расчета целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения при 400 нм - 340:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

m_о - масса ГСО цинарозида, г;

340 - удельный показатель поглощения ГСО цинарозида при 400 нм;

W - потеря в массе при высушивании в процентах.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Аналитическую пробу сырья тысячелистника обыкновенного измельчают до размера частиц 2 мм (заготовлено в Самарской области, июль 2020 г.). 1,0118 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 50% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до +0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 45 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца цинарозида, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 400 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора стандартного образца цинарозида.

0,005 г цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 10 мл 96% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 96% этиловым спиртом до метки (раствор А цинарозида). После чего 2 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 %. Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 %.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 400 нм через 30 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где:

0,4169 - оптическая плотность испытуемого раствора;

0,4605 - оптическая плотность раствора стандартного образца цинарозида;

1,0118 - масса сырья, г;

0,005 - масса стандартного образца цинарозида, г.

13 - потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид = 0,62 %.

Пример 2.

При необходимости определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного в отсутствии стандартного образца цинарозида, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца цинарозида.

После измерения оптической плотности извлечения из травы тысячелистника обыкновенного при длине волны 400 нм, содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения при 400 нм - 340.

где:

0,4805 - оптическая плотность испытуемого раствора;

1,0068 - масса сырья, г;

340 - удельный показатель поглощения - оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) Государственного стандартного образца цинарозида при 400 нм;

13 - потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид = 0,60%, что сравнимо со значением, полученном в примере 1.

Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±6,70%.

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в траве тысячелистника обыкновенного с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:

1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно, поскольку в качестве экстрагента используется 50% этиловый спирт, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).

2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для травы тысячелистника обыкновенного вещество - цинарозид -, содержащийся в сырье данного растения.

3. Время экстракции целевых веществ из травы тысячелистника обыкновенного сокращено с 90 минут до 45 минут, т.к. подобраны оптимальные условия экстракции.

Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа травы тысячелистника обыкновенного (Achillea millefolium L.).

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Государственная фармакопея Российской Федерации / МЗ РФ. XIV изд. Т. I-IV. М., 2018. [Электронный ресурс] URL: https://femb.ru/record/pharmacopea14 (дата обращения: 04.05.2022).

2. Куркин В.А. Фармакогнозия: учебник для фармацевтических вузов (факультетов). - 5-е изд., перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт», ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2020 - 1280 с.

3. Асланова Д., Кароматов И.Д. Тысячелистник обыкновенный в народной и научной фитотерапии. // Биология и интегративная медицина. 2018. № 1 (18). С. 167-186.

4. Дьякова Н.А. Разработка и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве тысячелистника обыкновенного. // Сборник материалов II Международной научной конференции "Роль метаболомики в совершенствовании биотехнологических средств производства" по направлению "Метаболомика и качество жизни". 2019. С. 500-506.

5. Евдокимова О.В. Разработка и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника. // Вестник Воронежского государственного университета. серия: Химия. Биология. Фармация. 2007. №2. С. 155-160.

6. Маевский П.Ф. Флора средней полосы европейской части России. 11-е изд. - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2014. - 360-362 с.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника. Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного путем экстракции сырья органическими растворителями с последующей пробоподготовкой и определения оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии, при этом экстракцию сырья осуществляют этиловым спиртом в концентрации 50% в соотношении сырье:экстрагент - 1:30, время экстракции – извлечение на кипящей водяной бане в течение 45 мин, степень измельчения сырья - 2 мм, реакция комплексообразования с хлоридом алюминия в течение 30 мин; количественное определение суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного проводят при длине волны 400 нм в пересчете на цинарозид; содержание суммы флавоноидов X в процентах в пересчете на цинарозид вычисляют по формуле

где D - оптическая плотность испытуемого раствора; Do - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца цинарозида; m - масса сырья, г; m_o - масса Государственного стандартного образца цинарозида, г; W - потеря в массе при высушивании, %; в случае отсутствия стандартного образца цинарозида целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения при 400 нм - 340

где D - оптическая плотность испытуемого раствора; m - масса сырья, г; 340 - удельный показатель поглощения (E) Государственного стандартного образца цинарозида при 400 нм; W - потеря в массе при высушивании, %. Вышеописанный способ эффективен для количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного в пересчете на цинарозид. 6 ил., 2 пр.

Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного путем экстракции сырья органическими растворителями с последующей пробоподготовкой и определения оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии, отличающийся тем, что экстракцию сырья осуществляют этиловым спиртом в концентрации 50% в соотношении сырье:экстрагент - 1:30, время экстракции – извлечение на кипящей водяной бане в течение 45 мин, степень измельчения сырья - 2 мм, реакция комплексообразования с хлоридом алюминия в течение 30 мин; количественное определение суммы флавоноидов в траве тысячелистника обыкновенного проводят при длине волны 400 нм в пересчете на цинарозид; содержание суммы флавоноидов X в процентах в пересчете на цинарозид вычисляют по формуле

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

Do - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца цинарозида;

m - масса сырья, г;

m_o - масса Государственного стандартного образца цинарозида, г;

W - потеря в массе при высушивании, %;

в случае отсутствия стандартного образца цинарозида целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения при 400 нм - 340

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

340 - удельный показатель поглощения (E) Государственного стандартного образца цинарозида при 400 нм;

W - потеря в массе при высушивании, %.