СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ СОЛОДКИ ГОЛОЙ Российский патент 2023 года по МПК A61K36/484 G01N33/15 

Данное изобретение создано в рамках направления развития химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в траве солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.).

Вопрос стандартизации биологически активных соединений (БАС) в лекарственном растительном сырье на сегодняшний день является весьма значимым в современной фармацевтической практике, а именно в процессе осуществления контроля качества. С этой целью необходимо разрабатывать новые и усовершенствовать имеющиеся методы количественного определения БАС как в сырье фармакопейном, так и в перспективном, но малоизученном сырье, каким является трава солодки голой.

Изучение химического состава перспективных растительных объектов является важным направлением в современной фармации. Солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.) - представитель семейства Бобовые (Fabaceae), в качестве фармакопейного лекарственного растительного сырья (ЛРС) которого применяются корни (1). Трава солодки голой является источником БАС флавоноидной природы, а именно флавонона - пиноцембрина.

Существует методика прямой спектрофотометрии определения флавоноидов в траве солодки голой, которая выбрана нами в качестве прототипа (2).

На наш взгляд, данная методика имеет ряд существенных недостатков, а именно: многостадийность процесса экстракции, неоптимальный экстрагент (96% этиловый спирт), который не позволяет исчерпывающе извлекать целевые вещества, использование прямой спектрофотометрии, в условиях который имеет место завышение результатов анализа.

Цель настоящего исследования - разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве солодки голой, позволяющей более объективно оценивать качество данного сырья.

Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в траве солодки голой в пересчете на пиноцембрин.

Технический результат достигается тем, что получают водно-спиртовое извлечение из травы солодки голой путем однократной экстракции в течение 60 минут 90% этиловым спиртом воздушно-сухого сырья точной навеской массой 1 г, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, в соотношении «сырье-экстрагент» 1:50; количественное определение суммы флавоноидов проводят методом дифференциальной спектрофотометрии при длине волны 310 нм, в пересчете на пиноцембрин и содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:

где:

x - содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора СО пиноцембрин;

m - масса сырья, г;

m_о - масса СО пиноцембрина, г;

W - потеря в массе при высушивании, %;

1,05 - коэффициент пересчета.

В случае отсутствия стандартного образца пиностробина целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 310 нм - 680.

где:

x - содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

680 - удельный показатель поглощения (E) СО пиноцембрина при 310 нм;

W - потеря в массе при высушивании, %.

Поскольку в траве данного растения преобладают флавононы, среди которых доминирующим флавоноидом является пиноцембрин - Фиг. 1А, на наш взгляд, именно пиноцембрин в основном определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из травы солодки голой. Этот вывод соответствует литературным данным (2). Нами была изучена возможность использования в качестве СО пиностробин (ФС 42-0073-01), близкого по химическому строению пиноцембрину - Фиг. 1Б.

При изучении спектральных характеристик было выявлено, что пиностробин -Фиг. 2 и пиноцембрин -Фиг. 3 определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из травы солодки голой Фиг - 4. Установлено, что при добавлении алюминия хлорида к испытуемому раствору и растворам пиноцембрина и пиностробина наблюдается батохромный сдвиг в длинноволновом спектре поглощения.

Изучение УФ-спектров фигуры 2 (где кривая 1 - раствор пиностробина, а кривая 2 - раствор пиностробина с добавлением алюминия хлорида) и фигуры 3 (где кривая 1 - раствор пиноцембрина, а кривая 2 - раствор пиностробина с добавлением алюминия хлорида) показало, что растворы СО пиностробина и пиноцембрина в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 310 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из травы солодки голой в дифференциальном варианте на фигуре 4 так же обнаруживается при длине волны 310 нм максимум поглощения, который соответствует максимуму поглощения спиртовых растворов пиностробина и пиноцембрина.

Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в траве солодки голой при аналитической длине волны 310 нм.

Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 Фиг. 5 представлена зависимость выхода флавоноидов травы солодки от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 90% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.

Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане. В таблице 2 Фиг. 6 представлена зависимость выхода флавоноидов травы солодки голой от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 60 минут.

В таблице 3 фиг. 7 представлена зависимость выхода флавоноидов травы солодки голой от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы 3 видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:50, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.

В таблице 4 Фиг. 8 представлена зависимость выхода флавоноидов травы солодки голой от степени измельчения листьев. Из таблицы 4 видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при степени измельчения - 2 мм.

Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.

Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 90% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50, оптимальная степень измельчения - 2 мм.

Способ реализуется следующим образом.

Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве солодке голой. Аналитическую пробу воздушно-сухого сырья травы солодки голой измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г точной навески измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 90% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до +0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу охлаждают в течение 60 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через фильтр с красной полосой.

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96 % этиловым спиртом (испытуемый раствор).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 310 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора стандартного образца пиностробина.

Около 0,02 г (точная навеска) пиностробина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл 96% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 96% этиловым спиртом до метки (раствор А СО пиностробина). После чего 1 мл раствора А СО пиностробина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б СО пиностробина). Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 310 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов (x, %) в пересчете на пиноцембрин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где:

x - содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора СО пиностробина;

m - масса сырья, г;

m_о - масса СО пиностробина, г;

W - потеря в массе при высушивании, %;

1,05 - коэффициент пересчета.

В случае отсутствия стандартного образца пиностробина целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 310 нм - 680.

где:

x - содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

680 - удельный показатель поглощения (E) СО пиноцембрина при 310 нм;

W - потеря в массе при высушивании, %.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Аналитическую пробу сырья травы солодки голой (заготовлено в Самарской области, Кинельский район, п. Алексеевка, август 2021 г.) измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. 1,0028 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 90% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до +0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 310 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора стандартного образца пиностробина.

0,0207 г пиностробина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл 96% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 96% этиловым спиртом до метки (раствор А СО пиностробина). После чего 1 мл раствора А СО пиностробина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 %. Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 %.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 310 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов (x, %) в пересчете на пиноцембрин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где:

x - содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора СО пиностробина;

m - масса сырья, г;

m_о - масса СО пиностробина, г;

W - потеря в массе при высушивании, %;

1,05 - коэффициент пересчета.

Пример 2.

При необходимости определения суммы флавоноидов в траве солодки голой в отсутствии стандартного образца пиноцембрина, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца пиностробина.

После измерения оптической плотности извлечения из травы солодки голой при длине волны 310 нм, содержание суммы флавоноидов (x, %) в пересчете на пиноцембрин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения пиноцембрина, равное 680:

где:

x - содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

680 - удельный показатель поглощения (E) СО пиноцембрина при 310 нм;

W - потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин x=3,41%, что сравнимо со значением, полученном в примере 1 в пределах погрешности (±0,015).

Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±0,43%.

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин в траве солодки голой с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:

1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно 90% этиловым спиртом, позволяющим исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).

2. Пересчет суммы флавоноидов осуществляется на специфическое и доминирующее для травы солодки голой вещество флавоноидной природы - пиноцембрин, определяющий характер кривой поглощения в УФ - спектре испытуемого раствора (длина волны 310 нм).

3. В методике количественного определения суммы флавоноидов в траве солодки голой используется СО пиностробин, имеющий фармакопейный статус (ФС 42-0073-01).

4. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±0,43%, что свидетельствует об объективности разработанного способа.

5. Этот способ может быть использован в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа травы солодки голой.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Маматханова М.А., Абдурахманов Б.А., Нигматуллаев Б.А., Сотимов Г.Б., Халилов Р.М., Маматханов А.У., Изучение надземной части Glycyrrhiza glabra в качестве перспективного сырья для производства препаратов на основе флавоноидов. // Химия растительного сырья. - 2016. - №1. - С. 171-176

2. Государственная фармакопея РФ XIV изд. Том I-IV. [Электронное издание]. Режим доступа: http://femb.ru/femb/pharmacopea.php

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу количественного определения суммы флавоноидов в траве солодки голой. Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве солодки голой путем экстракции органическим растворителем с последующим использованием метода спектрофотометрии, который включает однократную экстракцию 90% этиловым спиртом воздушно-сухого сырья точной навеской массой 1 г, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, в соотношении сырье:экстрагент - 1:50, в течение 60 минут с последующей пробоподготовкой, прибавление к исследуемому раствору 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и определение оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии с пересчетом на пиноцембрин при длине волны 310 нм с использованием стандартного образца пиностробина; содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин рассчитывают по формуле где x - содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин, %; D - оптическая плотность испытуемого раствора; D_o - оптическая плотность раствора стандартного образца (СО) пиностробина; m - масса сырья, г; m_о - масса стандартного образца пиностробина, г; W - потеря в массе при высушивании, %; 1,05 - коэффициент пересчета; в случае отсутствия стандартного образца пиностробина используют рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 310 нм, равное 680, и вычисляют содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин по формуле где x - содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин, %; D - оптическая плотность испытуемого раствора; m - масса сырья, г; 680 - удельный показатель поглощения (E) стандартного образца пиноцембрина при 310 нм; W - потеря в массе при высушивании, %. Вышеописанный способ количественного определения суммы флавоноидов в траве солодки голой позволяет объективно оценивать качество данного сырья. 8 ил., 2 пр.

Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве солодки голой путем экстракции органическим растворителем с последующим использованием метода спектрофотометрии, отличающийся тем, что включает однократную экстракцию 90% этиловым спиртом воздушно-сухого сырья точной навеской массой 1 г, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, в соотношении сырье:экстрагент - 1:50, в течение 60 минут с последующей пробоподготовкой, прибавление к исследуемому раствору 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и определение оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии с пересчетом на пиноцембрин при длине волны 310 нм с использованием стандартного образца пиностробина; содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин рассчитывают по формуле

где x - содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора стандартного образца (СО) пиностробина;

m - масса сырья, г;

m_о - масса стандартного образца пиностробина, г;

W - потеря в массе при высушивании, %;

1,05 - коэффициент пересчета;

в случае отсутствия стандартного образца пиностробина используют рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 310 нм, равное 680, и вычисляют содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин по формуле

где x - содержание суммы флавоноидов в пересчете на пиноцембрин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

680 - удельный показатель поглощения (E) стандартного образца пиноцембрина при 310 нм;

W - потеря в массе при высушивании, %.