Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами Российский патент 2022 года по МПК B09C1/10 

Изобретение относится к области охраны окружающей среды, в частности к экобиотехнологии и экологии, а именно к препаратам для очистки объектов окружающей среды, в частности почвы и воды, от загрязнения углеводородами нефти и нефтепродуктов, а также для повышения плодородия очищенной почвы, при помощи микроорганизмов и может быть использовано, например, при ликвидации последствий нефтяных разливов, а также для возвращения очищенных земель в сельскохозяйственный оборот.

Нефть и нефтепродукты являются одним из основных источников загрязнения окружающей среды. Во всем мире ведутся интенсивные исследования по изучению влияния нефтезагрязнений на живую природу и поиску способов ускорения деструкции нефти, загрязняющей почву и воду. Установлено, что микроорганизмы катализируют ферментативное разложение нефти и нефтепродуктов, что может быть использовано для разработки биопрепаратов для очистки нефтезагрязненных почв и воды. Процесс деструкции углеводородов нефти осуществляется микроорганизмами, однако практическая значимость микробной деградации в конечном итоге определяется составом биопрепарата, который обеспечивает жизнеспособность бактерий, их активность, а также технологичность изготовления, хранения, транспортировки и использования.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, содержащий аэробные нефтеокисляющие бактерии Acenitobacter oleovorum, остатки питательных сред, стабилизирующие добавки, минеральные соли и различные наполнители, см. "Препарат бактериальный Биоприн-Б", технические условия ТУ-оп. 11249895-12-22-92, М., 1992.

Недостатком этого препарата является необходимость наличия стабилизирующих добавок для поддержания жизнедеятельности нефтеокисляющих бактерий. Кроме того, бактерии Acenitobacter oleovorum недостаточно активно утилизируют тяжелые фракции нефти.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды, преимущественно почвы и воды, включающий нефтеокисляющие бактерии, например, Mycobacterium, углеводородные добавки нормальные парафины - C₁₂-C₁₈, минеральные добавки - щавелевокислый аммоний и воду в качестве наполнителя, RU 2053206 C.

Его недостатком является узкий диапазон температуры, при которой происходит активное окисление углеводородов нефти. Биопрепарат имеет достаточную активность только при Т=20-40°С, что резко сужает возможность его применения в условиях северных регионов.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель. В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий содержится консорциум мезофильных бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ - 896, Micrococcus species ПИ Ку-1 и консорциум психрофильных бактериальных штаммов Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3, Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8, Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7. В качестве минеральных добавок используют источники азота, фосфора, калия. В качестве наполнителя используют стерильный торф, RU 2138451 C1, опубл. 27.09.1999.

Недостаток биопрепарата - недостаточная скорость деструкции полиароматических углеводородов. Данный биопрепарат принят в качестве прототипа настоящего изобретения.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи создания высокоэффективного биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, в том числе, тяжелыми фракциями нефти, с высокой скоростью деструкции, эффективного в широком диапазоне рН и температуры очищаемой среды. Биопрепарат должен быть выполнен на основе твердого субстрата-носителя и минерального питательного субстрата и обеспечивать жизнеспособность сорбированной бактериальной углеводородокисляющей микрофлоры с высокой деструктивной активностью в широком диапазоне рН среды с высокой скоростью деструкции. Кроме того, препарат обладает способностью активировать полезную микрофлору почв, повышая азотфиксацию, что весьма существенно для повышения плодородия очищенных почв и возвращения им статуса сельскохозяйственных земель.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами в широком диапазоне рН и температуры очищаемой среды, с одновременным обеспечением повышения плодородия очищенных почв и возвращением им статуса сельскохозяйственных земель.

Технический результат достигается за счет того, что в биопрепарате для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, содержащем аэробные нефтеокисляющие бактерии в виде консорциума бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ К₀-1 и Micrococcus species ПИ Ку-1, минеральные добавки в виде источников азота, фосфора, калия и наполнитель, согласно изобретению, консорциум бактериальных штаммов дополнительно содержит штамм Rhodococcus erythropolis VS-0252 при весовом соотношении 4-12 мас. % каждого бактериального штамма в консорциуме, при этом минеральные добавки и наполнитель в биопрепарате имеют следующее соотношение компонентов, мас. %: источник азота - 0,30-0,70, источник фосфора - 0,20-0,55, источник калия - 0,15-0,30, наполнитель - остальное.

Каждый вид бактериального штамма, предпочтительно, окисляет углеводороды определенного строения. В консорциуме они наиболее полно способны к деструкции нефти и нефтепродуктов. Отбор штаммов, входящих в состав консорциума, проводили на основании их способности к утилизации углеводородов при культивировании в контакте с нефтью в широком диапазоне рН, что выражалось в увеличении динамики роста и активности ферментов, катализирующих окислительные процессы.

Таким образом, подобранная ассоциация микроорганизмов, содержащая минеральные добавки в виде источников азота, фосфора, калия и наполнитель, согласно изобретению, проявила свойство аккумулировать молекулярный азот в присутствии углеводородов нефти и нефтепродуктов. Это новое свойство предлагаемого препарата можно использовать для восстановления плодородия почвы после ее очистки с целью возвращения в сельскохозяйственный оборот.

Чистые культуры микроорганизмов выделены из почв, загрязненных нефтепродуктами, на селективных питательных средах, содержащих в качестве единственного источника углеродного питания углеводороды нефтепродуктов. Штаммы зарегистрированы в Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений. Штаммы хранятся на агаризованной питательной среде (МПА или СПА) при температуре +0-+5°С или в лиофилизированном состоянии в ампулах.

Штамм Pseudomonas putida ПИ K₀-1 - мелкие короткие прямые подвижные одиночные палочки, имеют полярные жгутики, размеры: (0,2-0,3) × (0,5-0,8) мкм; грам (-); аэроб. Колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слегка приподнятые в центре, желтоватые, полупрозрачные, диаметром 4-6 мм. Штамм усваивает аммонийный и нитратный азот, каталазоположителен, образует флюоресцирующие пигменты, аргининдигидролазу, не разжижает желатину, не гидролизует крахмал, оксидазная реакция положительна. Использует в качестве источников роста глюкозу, 2-кетоглюконат, L-валин, β-аланин, DL-аргинин, углеводороды.

Штамм Micrococcus sp. ПИ К_у-1 - кокки, сферические неподвижные клетки, диаметром 0,6-1,0 мкм; образуют неправильные группы или встречаются поодиночке. Колонии штамма круглые с ровным краем, теплого цвета, непрозрачные, гладкие, блестящие, диаметром 2-5 мм. Штамм усваивает аммонийный и нитратный азот, каталазоположителен, образует желтый пигмент, не гидролизует крахмал, не образует индол, образует гидролазы. Использует в качестве источников роста глюкозу, L-валин, β-аланин, углеводороды.

Штамм Rhodococcus erythropolis VS-0252 - изогнутые или прямые неподвижные палочки, иногда образуют нити с элементарным ветвлением, часто распадаются на кокковые формы. Штамм грамположительный, аэробный, неспоро образующий. На агаризованных средах образует шероховатые бежевые колонии с неровным краем. Оксидазный тест отрицательный, каталазный тест положительный, частично кислотоустойчивый. Штамм расщепляет треонин-7-АМК, глюкозиды, β-аланин, пироглутамат. В процессе роста способен использовать в качестве единственного источника углерода мальтозу, андостерон, бензойную кислоту, бутан-2,3диол, пимелинововую, цитраконовую и D-миндальную кислоты, углеводороды (декан, гексадекан, дизельное топливо, нефть, нафтеновые и полиароматические углеводороды). Отношение к рН: 5,5-9,0. Отношение к NaCl: 3-5%. Отношение к температуре: +4-30°С. Оптимальная температура культивирования: 28°С. Синтезирует природные биосурфактанты группы гликолипидов (тригазолипиды) в ответ на присутствие н-алканов в среде, способствующие снижению вязкости.

Для видовой идентификации штамма Rhodococcus sp.VS-0252 были выбраны и отсеквенированы два таксономически репрезентативных локуса: 16S рибосомальной РНК (16S) и фрагмент гена алкан-1-монооксигеназы (AlkB). Сравнение полученной последовательности 16S с задепонированными в Генбанке позволило установить высокий уровень сходства (Query coverage* 100%; Identity** 100%) с последовательностями Rhodococcus erythropolis (уникальный идентификатор: KJ009394; MZ026439, KC764993). Последовательность локуса AlkB исследуемого штамма была одинаково близка (Query coverage 100%; Identity 99.56%) последовательностям Rhodococcus erythropolis (уникальный идентификатор: СР050124, CP044284J и Rhodococcus qingshengii (уникальный идентификатор: СР042917, СР029297). В целом, на основании данных, полученных для двух локусов, можно с уверенностью отнести имеющийся штамм VS-0252 к виду Rhodococcus erythropolis.

Примечание

*Query coverage - процентное отношение области выравнивания к общей длине целевой нуклеотидной последовательности;

**Identity - процент сходства между целевой и референсной последовательностями в области выравнивания.

1. Последовательность 16S рибосомальной РНК исследуемого штамма Rhodococcus

Использованные для получения последовательности праймеры:

2. Последовательность гена алкан-1-монооксигеназы (AlkB) исследуемого штамма Rhodococcus

Использованные для получения последовательности праймеры

Для получения посевного материала бактериальные штаммы выращивали раздельно, затем в ферментере вели их совместное культивирование.

Консорциум бактериальных штаммов при соотношении компонентов согласно таблице 3 вносили в наполнитель, в качестве которого служил стерильный торф. После внесения в торф проводилось доращивание культур при Т=3°С, в течение 120 часов.

С целью поддержания жизнеспособности и каталитической активности нефтеокисляющих бактерий для их выращивания использована питательная среда следующего состава:

KH₂PO₄ - 2 г/л;

Na₂HPO₄ - 3 г/л;

MgSO₄⋅7H₂O - 0,5 г/л;

FeCl₃⋅6H₂O - 0,05 г/л;

СаСl₂⋅2H₂O - 0,01 г/л;

(NH₄)₂SO₄ - 2 г/л;

соевая мука - 5 г/л;

меласса - 20 г/л;

вода - до 1 л.

В качестве индуктора использовали 0,01% сырой нефти.

Процесс культивирования проводили в ферментерах при Т=20°С, рН 6,7-7,3 в течение 24 часов в аэробных условиях.

Затем выращенные в жидкой питательной среде нефтеокисляющие бактерии вводили в стерильные полиэтиленовые пакеты, наполненные стерильным торфом. Одновременно с препаратом в пакеты вносили минеральные добавки, в качестве которых использовали источники азота, фосфора и калия при соотношении компонентов согласно таблице 3.

Полиэтиленовые пакеты герметично закрывали, и осуществляли дополнительное поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий на торфе при температуре 30°С в течение 7 суток. Благодаря тому, что полиэтиленовые пакеты герметично закрыты, в них поддерживается практически постоянная влажность. Титр составляет 1⋅10¹² жизнеспособных клеток в 1 г готового биопрепарата.

Для подтверждения деструктивной активности полученного биопрепарата при очистке объектов окружающей среды (почвы и воды) от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, в частности, мазутом, а также чрезвычайно опасными загрязнителями: бенз(а)пиреном и хризеном, в широком диапазоне рН и температуры очищаемой среды проводили испытания.

Проводили 9 экспериментов с параметрами, указанными в таблице 3, при этом:

- эксперимент 1 соответствует максимальным значениям концентрации биопрепарата,

- эксперименты 2-5 соответствуют промежуточным значениям концентрации биопрепарата,

- эксперимент 6 соответствует минимальным значениям концентрации биопрепарата,

- эксперимент 7 соответствует значениям концентрации биопрепарата, меньше заявленной в формуле изобретения,

- эксперимент 8 соответствует значениям концентрации биопрепарата, превышающей заявленную в формуле изобретения,

- эксперимент 9 соответствует значениям концентрации биопрепарата, не содержащего штамм Rhodococcus erythropolis VS-0252.

При максимальных значениях концентрации биопрепарата (препарат 1) через 60 дней эффективность деструкции нефтепродуктов (мазута) в почве составила 80-97% при Т=3°С и 82-98%) при Т=40°С; эффективность деструкции нефти в почве составила 84-97% при Т=3°С и 86-99%) при Т=40°С; эффективность деструкции нефтепродуктов в воде составила 80-94%) при Т=3°С и 82-97% при Т=40°С; эффективность деструкции нефти в воде составила 85-95%) при Т=3°С и 88-98%) при Т=40°С.

При минимальных значениях концентрации биопрепарата (препарат 6) через 60 дней эффективность деструкции нефтепродуктов в почве составила 70-79%) при Т=3°С и 72-82% при Т=40°С; эффективность деструкции нефти в почве составила 64-84%) при Т=3°С и 68-86% при Т=40°С; эффективность деструкции нефтепродуктов в воде составила 66-77% при Т=3°С и 74-80% при Т=40°С; эффективность деструкции нефти в воде составила 62-81%) при Т=3°С и 68-85%) при Т=40°С.

При значениях концентрации биопрепарата, меньше заявленной в формуле изобретения (препарат 7), через 60 дней эффективность деструкции нефтепродуктов в почве составила 47-62% при Т=3°С и 49-65% при Т=40°С; эффективность деструкции нефти в почве составила 56-65%о при Т=3°С и 55-69% при Т=40°С; эффективность деструкции нефтепродуктов в воде составила 45-60% при Т=3°С и 48-64%) при Т=40°С; эффективность деструкции нефти в воде составила 53-63%) при Т=3°С и 57-68% при Т=40°С, что говорит о недостаточной эффективности способа очистки.

При значениях концентрации биопрепарата (препарат 8), превышающей заявленную в формуле изобретения, через 60 дней эффективность деструкции нефтепродуктов в почве составила 81-96% при Т=3°С и 83-99% при Т=40°С; эффективность деструкции нефти в почве составила 85-96% при Т=3°С и 87-99% при Т=40°С; эффективность деструкции нефтепродуктов в воде составила 77-96%) при Т=3°С и 82-98% при Т=40°С; эффективность деструкции нефти в воде составила 84-95% при Т=3°С и 85-99%) при Т=40°С, что не привело к значительному увеличению скорости деструкции загрязнителя, однако неоправданно увеличивает стоимость работ по очистке, так как увеличение скорости биодеструкции будет незначительным по сравнению с увеличением стоимости препарата.

Пример 1

Препарат при испытаниях был внесен в керамические сосуды, наполненные почвой с различным рН (в пределах от 4,5 до 8,2) и содержанием мазута 11,2 - 12,9 мг/кг. Количество внесенного препарата - 1 г на 1 кг почвы. Сосуды выдерживали в термостатах в диапазоне температуры от 3°С до 40°С в течение 60 суток. Содержание мазута в почве контролировали 1 раз в 30 дней, опыт проведен в трех повторностях для рН среды 4,5, 6,8 и 8,2. Результаты испытаний биопрепарата приведены в таблице 4.

Пример 2

Препарат при испытаниях был внесен в керамические сосуды, наполненные почвой с различным рН (в пределах от 4,5 до 8,2) и содержанием сырой нефти 11,2-12,9 мг/кг. Количество внесенного препарата - 1 г на 1 кг почвы. Сосуды выдерживали в термостатах в диапазоне температуры от 3°С до 40°С в течение 60 суток. Содержание нефти в почве контролировали 1 раз в 30 дней, опыт проведен в трех повторностях для рН среды 4,5, 6,8 и 8,2. Результаты испытаний биопрепарата приведены в таблице 5.

Пример 3

Препарат при испытаниях был внесен в керамические сосуды, наполненные водой с различным рН (в пределах от 4,5 до 8,2) и содержанием мазута 11,2 - 12,9 мг/л. Количество внесенного препарата - 1 г на 1 л воды. Сосуды выдерживали в термостатах в диапазоне температуры от 3°С до 40°С в течение 60 суток. Содержание нефтепродуктов в воде контролировали 1 раз в 30 дней, опыт проведен в трех повторностях для рН среды 4,5, 6,8 и 8,2. Результаты испытаний биопрепарата приведены в таблице 6.

Пример 4

Препарат при испытаниях был внесен в керамические сосуды, наполненные водой с различным рН (в пределах от 4,5 до 8,2) и содержанием сырой нефти 11,2-12,9 мг/л. Количество внесенного препарата - 1 г на 1 л воды. Сосуды выдерживали в термостатах в диапазоне температуры от 3°С до 40°С в течение 60 суток. Содержание нефтепродуктов в воде контролировали 1 раз в 30 дней, опыт проведен в трех повторностях для рН среды 4,5, 6,8 и 8,2. Результаты испытаний биопрепарата приведены в таблице 7.

В результате проведенных опытов можно констатировать весьма высокую деструктивную активность заявленного биопрепарата (до 98%), в том числе, и в отношении тяжелых фракций нефти. При этом препарат эффективен в широком диапазоне рН и температуры очищаемой среды (рН 4,5-8,2, Т=3-40°С), как загрязненной почвы, так и загрязненной воды.

Биопрепарат может быть изготовлен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых компонентов.

Пример 5

Препарат при испытаниях был внесен в керамические сосуды, наполненные грунтом по 1,0 кг в каждом сосуде, с содержанием сырой нефти 3,0-3,8 г/кг. Количество внесенного препарата - 2,0 г на 1 кг грунта. Сосуды выдерживали в термостате при постоянной температуре 25°С в течение 180 суток. Грунт еженедельно перемешивали и увлажняли, не допуская пересыхания поверхности.

Перед началом опыта и через 180 суток был проведен анализ основных агрохимических показателей грунта, в том числе, определение концентрации подвижных форм азота, органического вещества, углеводородов.

Результаты агрохимических анализов грунта приведены в таблице 8

В варианте опыта с внесением ассоциации микроорганизмов наблюдалось существенное улучшение анализируемых показателей. Содержание органического вещества повысилось на 36,8% (с 2,58% в начале эксперимента до 3,53% к окончанию эксперимента). Содержание аммиачного азота составляло 5,31 мг/кг, нитратного - 8,46 мг/кг, что превышало эти значения даже в газонной почве. Следует отметить, что содержание углеводородов нефти снизилось на 98% и составляло, в среднем, 40 мг/кг грунта. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что в варианте опыта с внесением ассоциации полезных микроорганизмов, произошло существенное улучшение агрохимического состава опытного грунта. В конце эксперимента во все варианты грунта высеяли семена бобовых кормовых культур.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, содержащий аэробные нефтеокисляющие бактерии в виде консорциума бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ К₀-1 и Micrococcus species ПИ К_у-1, минеральные добавки в виде источников азота, фосфора, калия и наполнитель, согласно изобретению консорциум бактериальных штаммов дополнительно содержит штамм Rhodococcus erythropolis VS-0252 при весовом соотношении 4-12 мас. % каждого бактериального штамма в консорциуме, при этом минеральные добавки и наполнитель в биопрепарате имеют следующее соотношение компонентов, мас. %: источник азота - 0,30-0,70, источник фосфора - 0,20-0,55, источник калия - 0,15-0,30, наполнитель - остальное. Изобретение позволяет повысить эффективность биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами в широком диапазоне рН и температуры очищаемой среды с одновременным обеспечением повышения плодородия очищенных почв и возвращением им статуса сельскохозяйственных земель. 8 табл.

Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, содержащий аэробные нефтеокисляющие бактерии, включающие бактериальные штаммы Pseudomonas putida ПИ К₀-1 и Micrococcus species ПИ К_У-1, минеральные добавки в виде источников азота, фосфора, калия и наполнитель, отличающийся тем, что он дополнительно содержит штамм Rhodococcus erythropolis VS-0252 при весовом соотношении 3-12 мас. % каждого бактериального штамма, при этом минеральные добавки и наполнитель в биопрепарате имеют следующее соотношение компонентов, мас. %: источник азота - 0,30-0,70, источник фосфора - 0,20-0,55, источник калия - 0,15-0,30, наполнитель – остальное.