Способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами Российский патент 2021 года по МПК B09C1/10 C12N1/20 

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды нефтью и нефтепродуктами.

Известен способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов путем глубинного культивирования бактериального штамма Pseudomonas putida 36 на жидкой питательной среде. Штамм получен путем селекции (Пальгунов П.П., Сумароков Н.В. Утилизация промышленных отходов. - М.: Стройиздат, 1990; "О биологической рекультивации нефтезагрязненных лесных почв Среднего Приобья", Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е. и др. Почвоведение, 1990, N 9, с. 148-151).

Данный способ позволяет поручить биопрепарат пригодный, главным образом, для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами воды. Эффективность полученного биопрепарата для очистки почвы весьма низкая (25 - 30%).

Известен также способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающий культивирование нефтеокисляющих бактерий на питательной среде, внесение в стерильные емкости наполнителя в виде стерильного торфа и минеральных добавок, RU2053205С, 1996).

Данный способ не позволяет обеспечить высокий титр клеток в конечном продукте, который не превышает 7•10⁹ кл./мл.

Известен также способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, включающий культивирование нефтеокисляющих бактерий на питательной среде, внесение в стерильные емкости наполнителя в виде стерильного торфа и минеральных добавок, дополнительное поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий на торфе в герметично закрытой емкости, RU2116145С, опубл.27.07.1998. Известный способ обеспечивает высокий титр клеток в конечном продукте (1,2-2,5)⋅10¹² кл/мл, благодаря использованию двух стадий культивирования, а именно, глубинного культивирования и последующего поверхностного культивирования, при этом нефтеокисляющие бактерии распределяются по поверхности пористого наполнителя, в результате улучшаются условия аэрации, увеличивается площадь питания клеток, вследствие чего происходит значительное увеличение биологической активности препарата в отношении углеводородов.

Данный способ выбран в качестве прототипа настоящего изобретения.

Недостатком известного способа является невозможность получить биопрепарат, который обеспечивал бы поддержание жизнеспособности нефтеокисляющих бактерий в конечном продукте длительное время, необходимое для хранения, транспортировки, адаптации бактерий к новым условиям их жизнедеятельности после введения в загрязненный объект и непосредственное время, необходимое для эффективной очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов. Хорошо растворимые минеральные соли, входящие в состав биопрепарата, быстро утилизируются микробными клетками и не способны обеспечить питание клеток в течение длительного времени.

Задачей изобретения является создание такого способа получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, который позволил бы поддерживать высокую концентрацию жизнеспособных нефтеокисляющих бактерий в конечном продукте длительное время, а также обеспечивать оптимальные условия для функционирования бактерий-нефтедеструкторов при внесении препарата в очищаемые объекты, что позволяет эффективно утилизировать нефтяные загрязнения.

Это достигается за счет того, что в способе получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, включающем культивирование нефтеокисляющих бактерий на питательной среде, внесение в стерильные емкости наполнителя в виде стерильного торфа и минеральной добавки и дополнительное поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий на торфе в герметично закрытой емкости, согласно изобретению, в качестве минеральной добавки используют удобрение АВА.

Заявителю не известны какие-либо источники информации, в которых содержались бы сведения о техническом решении, адекватном заявленным отличиям. Реализация отличительных признаков настоящего изобретения (в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы) обусловливает появление у объекта нового технического эффекта, который состоит в резком увеличении времени поддержания жизнеспособности нефтеокисляющих бактерий в полученном биопрепарате (не менее 3-х лет, в то время, как в прототипе это время составляет не более 1-го года). Увеличение времени жизнеспособности и высокой эффективности биопрепарата происходит за счет использования в качестве минеральной добавки удобрения АВА (https://udobryashkin.ru/domashnie/vse-chto-nuzhno-znat-ob-udobrenii-ava-dlja-pravilnogo-primenenija).

Минеральное удобрение для растений АВА (производитель ЗАО «Агровит») является комплексным и экологически безвредным, оно изготавливается путем расплавления натуральных минералов при высокой температуре.

Удобрение обладает не поликристаллической структурой, как большинство других минеральных удобрений, а гомогенной структурой, что обеспечивает постепенное его растворение в течение длительного периода. Таким образом, полученный биопрепарат в течение длительного времени постоянно снабжается источниками минерального питания, поддерживающими жизнеспособность нефтеокисляющих бактерий.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Осуществляют культивирование нефтеокисляющих бактерий в стерильных емкостях на питательной среде, получают консорциум микроорганизмов-деструкторов нефти. После этого в стерильные полиэтиленовые пакеты со стерильным торфом вводят выращенные микроорганизмы вместе с минеральной добавкой АВА. Затем пакеты герметично закрывают и осуществляют дополнительное поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий на торфе.

Благодаря использованию минерального удобрения АВА, гранулы которого растворяются постепенно в течение длительного времени, нефтеокисляющие бактерии постоянно снабжаются питательными компонентами, поддерживающими их жизнеспособность, причем концентрация питательных элементов не превышает оптимальных для нефтеокисляющих бактерий значений.

Для подтверждения высокой эффективности полученного биопрепарата в течение длительного времени проводили испытания, в которых определяли эффективность деструкции нефтепродуктов в очищаемых объектах, при использовании биопрепарата через 2, 12 и 36 месяцев после их получения.

Проводили 4 эксперимента с параметрами, указанными в примерах 1-4, при этом:

- эксперимент 1 соответствует прототипу (без использования минерального удобрения АВА);

- эксперименты 2 - 4 соответствуют составам биопрепарата с использованием минерального удобрения АВА.

Остаточная концентрация нефтепродуктов и эффективность деструкции нефтепродуктов при использовании биопрепарата через 2, 12 и 36 месяцев после их получения согласно прототипу и примерам приведены в таблице.

Пример 1 (прототип). В качестве нефтеокисляющих бактерий используют консорциум микроорганизмов-деструкторов нефти: Preudomonas putida ПИ Ко-1 и Pseudomonas fluorescens ПИ-896. Указанные штаммы зарегистрированы в Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ Всероссийский институт защиты растений. Различать штаммы можно следующим образом: штамм Pseudomonas putida ПИ Ко-1 - мелкие короткие палочки, размеры: (0,2-0,3) • (0,5-0,8) мкм, колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слабовыпуклые, полупрозрачные, бесцветные, диаметром 3-5 мм, штамм Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - мелкие короткие палочки, размеры: (0,1-0,4) • (0,6-0,7) мкм, колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слегка приподнятые в центре, желтоватые, полупрозрачные, диаметром 4-6 мм.

Глубинное культивирование указанных выше бактерий осуществляют на жидкой искусственной питательной среде следующего состава, г:

KH₂PO₄ - 2
Na₂HPO₄ - 3
NH₄Cl - 2
MgSO₄•7H₂O - 0,5
FeCl₃•6H₂O - 0,05
CaCl₂•2H₂O - 0,01
Соевая мука - 5
Меласса - 20
Мазут - 1
Вода, л - до 1
Жидкая питательная среда имеет pH 7,0.

Осуществляют совместное глубинное культивирование обоих штаммов-деструкторов нефти в течение 48 ч при температуре 28^oC, в пятилитровых бутылях.

Затем подготавливают стерильные полиэтиленовые пакеты, которые наполняют стерильным торфом, в конкретном примере 600 г. После этого в стерильный торф вводят выращенные путем глубинного культивирования на жидкой питательной среде нефтеокисляющие бактерии вместе с 1% раствором минеральной добавки (NH₄)₂HPO₄. Общий объем посевного материала - 150 мл на 600 г торфа. Затем полиэтиленовые пакеты герметично зарывают, и осуществляют дополнительное поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий на торфе при температуре 30^oC в течение 7 сут. Благодаря тому, что полиэтиленовые пакеты герметично закрыты, в них поддерживается, практически, постоянная влажность.

Титр полученного биопрепарата в результате реализации предлагаемого способа составил в конкретном примере 2,5•10¹² жизнеспособных клеток в 1 г препарата.

Пример 2. Параметры способа, использованные в примере 2, соответствуют параметрам примера 1, кроме одного различия. В примере 2 в качестве минеральной добавки использовано удобрение АВА, вместо минеральной добавки (NH₄)₂HPO₄, использованной в примере 1 (прототипе). Титр полученного биопрепарата в результате реализации предлагаемого способа составил в конкретном примере 2,5•10¹² жизнеспособных клеток в 1 г препарата.

Пример 3. В качестве нефтеокисляющих бактерий использован консорциум микроорганизмов-деструкторов нефти: Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ Ку-1. Последний штамм также зарегистрирован в Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ Всероссийский институт защиты растений. Его можно различать по следующим признакам: штамм Micrococcus species ПИ Ку-1 - кокки, диаметром 0,6 - 1,0 мкм, колонии штамма круглые с ровным краем, теплого цвета, непрозрачные, гладкие, блестящие, диаметром 2 - 5 мм.

Глубинное культивирование бактерий осуществляют на жидкой питательной среде следующего состава, г:

KH₂PO₄ - 2
Na₂HPO₄ - 3
NH₄Cl - 2
MgSO₄•7H₂O - 0,5
FeCl₃•6H₂O - 0,05
CaCl₂•2H₂O - 0,01
Кукурузная мука - 5
Меласса - 20
Мазут - 1
Вода, л - До 1
Жидкая питательная среда имеет pH 6,8.

Совместное глубинное культивирование осуществляют в течение 24 ч в ферментере объемом 100 л при температуре 30^oC.

Поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий в стерильных полиэтиленовых пакетах на стерильном торфе с добавлением 1% минерального удобрения АВА осуществляют таким же образом, как и в первом примере. При этом выращивание микроорганизмов проводят в течение 5 сут при температуре 28^oC.

Титр полученного биопрепарата составляет во втором примере реализации способа 1,2⋅10¹² жизнеспособных клеток в 1 г препарата.

Пример 4. В качестве нефтеокисляющих бактерий используют консорциум микроорганизмов-деструкторов нефти: Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Micrococcus species ПИ Ку-1, Rhodococcus erythropolis АС-1269.

Последний штамм также зарегистрирован в Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ Всероссийский институт защиты растений. Его можно различать по следующим признакам: Штамм Rhodococcus erythropolis АС-1269 - прямые или изогнутые палочки, распадающиеся на кокковые формы, иногда образующие нити с элементарным ветвлением. Штамм неспорообразующий, грамположительный, неподвижный. На агаризованных средах образует шероховатые светло-бежевые колонии с неровным краем.

Глубинное культивирование бактерий осуществляют на жидкой питательной среде, состав которой идентичен составу в примере 3.

Совместное глубинное культивирование осуществляют в течение 24 ч в ферментере объемом 100 л при температуре 30^oC.

Поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий в стерильных полиэтиленовых пакетах на стерильном торфе совместно с 1% минерального удобрения АВА осуществляют таким же образом, как и в первом примере. При этом выращивание микроорганизмов проводят в течение 5 сут при температуре 28^oC.

Титр полученного биопрепарата составляет во втором примере реализации способа 1,2⋅10¹² жизнеспособных клеток в 1 г препарата.

В прототипе (пример 1) без минерального удобрения АВА эффективность деструкции нефтепродуктов при использовании биопрепарата через 2 месяца после его получения составила 63%, через 12 месяцев – 38%, через 36 месяцев – 7%, что подтверждает тот факт, что без использования минерального удобрения АВА нефтеокисляющие микроорганизмы не сохраняют свою активность в течение длительного времени.

В примере 2 использован тот же, что и в прототипе, консорциум микроорганизмов-деструкторов нефти: Preudomonas putida ПИ Ко-1 и Pseudomonas fluorescens ПИ-896. При этом использовано минеральное удобрение АВА. Эффективность деструкции нефтепродуктов при использовании биопрепарата через 2 месяца после его получения составила 88%, через 12 месяцев – 86%, через 36 месяцев – 84%.

В примере 3 использован консорциум микроорганизмов-деструкторов нефти: Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, как в примере 1, и дополнительно Micrococcus species ПИ Ку-1. При этом также использовано минеральное удобрение АВА. Эффективность деструкции нефтепродуктов при использовании биопрепарата через 2 месяца после его получения составила 90%, через 12 месяцев – 88%, через 36 месяцев – 86%.

В примере 4 использован консорциум микроорганизмов-деструкторов нефти: Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Micrococcus species ПИ Ку-1, Rhodococcus erythropolis АС-1269. В качестве минеральной добавки использовано удобрение АВА. Эффективность деструкции нефтепродуктов при использовании биопрепарата через 2 месяца после его получения составила 98%, через 12 месяцев – 96%, через 36 месяцев – 90.

Высокие значения эффективности деструкции нефтепродуктов при использовании биопрепаратов совместно с минеральным удобрением АВА, подтверждают тот факт, что, благодаря использованию в качестве минеральной добавки удобрения АВА, гранулы которой растворяются постепенное в течение длительного периода времени, нефтеокисляющие микроорганизмы в течение продолжительного времени постоянно снабжаются питательными компонентами, поддерживающими их жизнеспособность и обеспечивающими высокую биологическую активность.

Кроме того, предлагаемый способ, благодаря дополнительному поверхностному культивированию нефтеокисляющих микроорганизмов на стерильном наполнителе с большой поверхностью - торфе в герметично закрытых пакетах, позволяет получать препарат с высокой биологической активностью в отношении углеводородов. Титр полученного биопрепарата составляет (1,2-2,5)⋅10¹² кл./мл.

Препарат хорошо сохраняется в течение трех лет. Достоинством предлагаемой технологии является и то, что проведение второй стадии культивирования в закрытых емкостях - полиэтиленовых пакетах исключает необходимость дополнительной расфасовки готового препарата, что удешевляет технологию получения препарата в целом.

Для промышленной реализации предлагаемого способа используется обычное оборудование и материалы, использующиеся на заводах-производителях биопрепаратов для сельского хозяйства.

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды нефтью и нефтепродуктами. Способ включает культивирование нефтеокисляющих бактерий на питательной среде, внесение в стерильные емкости наполнителя в виде стерильного торфа и минеральной добавки и дополнительное поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий на торфе в герметично закрытой емкости. Согласно изобретению в качестве минеральной добавки используют удобрение АВА. Способ обеспечивает получение биопрепарата, в котором длительное время поддерживается высокая концентрация жизнеспособных нефтеокисляющих бактерий, а также обеспечиваются оптимальные условия для функционирования бактерий-нефтедеструкторов при внесении препарата в очищаемые объекты, что позволяет эффективно утилизировать нефтяные загрязнения. 4 пр.

Способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, включающий культивирование нефтеокисляющих бактерий на питательной среде, внесение в стерильные емкости наполнителя в виде стерильного торфа и минеральной добавки, после чего емкости герметично закрывают и осуществляют дополнительное поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий на торфе, отличающийся тем, что в качестве минеральной добавки используют удобрение АВА.