СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ САЛЬМОНЕЛЛ ПО INDEL-МАРКЕРАМ Российский патент 2022 года по МПК A61K39/00 C12Q1/68 

Предлагаемый способ относится к области медицинской микробиологии, молекулярной эпидемиологии, молекулярной эпизоотологии, а именно к способам молекулярно-генетического типирования штаммов Salmonella enterica, циркулирующих на различных территориях, с целью их дифференциации.

По данным CDC, бактерии рода Salmonella вызывают около 1,35 миллиона инфекций, 26500 госпитализаций и 420 летальных исходов в США ежегодно. Основным источником большинства случаев заражения являются продукты питания [https://www.cdc.gov/salmonella/index.html, Дата обращения: 21.07.2021].

Salmonella spp.представляет угрозу как для здоровья человека, так и для животных: на сегодняшний день зарегистрировано более 2500 сероваров. Технологические достижения в области высокопроизводительного секвенирования генома привели к более глубокому пониманию генетического разнообразия популяций патогенных бактерий. Надежная филогенетика в сочетании с эпидемиологически информативными данными может применяться для изучения текущих временных и географических колебаний бактериальных патогенов. Серотип можно также дифференцировать с использованием соматических (О) и жгутиковых (Н) антигенов на основе схемы Кауфмана - Уайта. Из-за высокой избирательной способности серотипирования, данный способ используется для эпидемиологического анализа инфекций, вызываемых сальмонеллами [Akiba М, et.al. Rapid identification of Salmonella enterica serovars, Typhimurium, Choleraesuis, Infantis, Hadar, Enteritidis, Dublin and Gallinarum, by multiplex PCR. J Microbiol Methods. 2011 Apr; 85(l):9-15. doi: 10.1016/j.mimet.2011.02.002.]. Объединение генетических, фенотипических, пространственных и временных данных позволяет получить всестороннее представление об эпидемиологии бактериальных патогенов и их эволюции [Holden МТ et al.: Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance. Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101:9786-9791., Baker S, Dougan G: The genome of Salmonella enterica serovar Typhi. Clin Infect Dis 2007, 45(Suppl. 1): P29-33.]. Адаптация происходит посредством ряда процессов, включая мутации и перемещение генов между разными клонами посредством рекомбинации [Hanage WP, Fraser С, Spratt BG: The impact of homologous recombination on the generation of diversity in bacteria. J Theor Biol 2006, 239:210-219.]. Мутации и рекомбинации создают геномное разнообразие, которое можно использовать для различия родственных организмов молекулярно-генетическими методами.

Уровень техники

Известны способы молекулярного типирования Salmonella, а именно гель-электрофорез в пульсирующем поле (PFGE), анализ сиквенстипа мультилокусной последовательности генов домашнего хозяйства (MLST) [Zakaria Z, et.al. Analysis of Salmonella enterica serovar Enteritidis isolates from chickens and chicken meat products in Malaysia using PFGE, and MLST. BMC Vet Res. 2020 Oct 17; 16(1):393. doi: 10.1186/s12917-020-02605-y.], анализ SNP [Keefer AB, et.al. Retrospective whole-genome sequencing analysis distinguished PFGE and drug-resistance-matched retail meat and clinical Salmonella isolates. Microbiology (Reading). 2019 Mar; 165(3):270-286. doi: 10.1099/mic.0.000768.], применение универсальных праймеров (RAPD-PCR) и ПЦР-риботипирование [Monte DFM et.al. Highly clonal relationship among Salmonella Enteritidis isolates in a commercial chicken production chain, Brazil. Braz J Microbiol. 2020 Dec; 51(4):2049-2056. doi: 10.1007/s42770-020-00372-4].

Однако практическое использование многих из них ограничивается как сложностью методического характера, так и проблемами с воспроизводимостью и оценкой результатов [Van Belkum A et al. Role the genomic typing in taxonomy, evolutionary genetics and microbial epidemiology // J. Clin. Microbiol.Rev. - 2001. - Vol. 14(3). - P. 547-560].

Известны исследования, которые показали наличие в генах различных живых организмов особых стабильно наследуемых генетических характеристик, заключающихся во вставках-делециях (insertions/deletions) коротких фрагментов ДНК, при этом такие гены обозначают как INDEL-маркеры. Изучение полиморфизма INDEL-маркеров в настоящее время широко используется при молекулярном типировании [Larsson Р et.al. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis. // Emerging Infectious Diseases 2007. Vol. 13, No. 11, P. 1725-1732]. Использование ПЦР с праймерами, фланкирующими INDEL-локус, позволяет проводить дифференцировку между «вставкой» и «делецией» исходя из размера получаемого ампликона.

Технической проблемой является необходимость разработки нового способа, позволяющего достоверно, быстро и с невысокой стоимостью осуществлять дифференциацию штаммов Salmonella полученных от человека и животных для эпидемиологических и эпизоотических целей, выделенных в различных регионах, областях и странах.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является создание нового способа, позволяющего достоверно, быстро и с невысокой стоимостью осуществлять дифференциацию штаммов Salmonella полученных от человека и животных для эпидемиологических и эпизоотических целей, выделенных в различных регионах, областях и странах, расширение арсенала способов дифференциации штаммов Salmonella полученных от человека и животных.

Поставленная задача достигается тем, что в новом способе дифференциации штаммов Salmonella enterica путем молекулярно-генетического типирования, включающем выделение ДНК из исследуемого штамма, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза, из ДНК исследуемого штамма выявляют семь общих INDEL-локусов, имеющих делеции определенного размер, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфических праймеров подобранных в ходе исследования 48 геномов S.enterica, полученных из GenBank NCBI и 3 геномов S. enterica из коллекции Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко» РАН, выявляющих альтернативные аллели (таблица 1).

Учет результатов дифференциации проводят визуально после электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный InDel-генотип по 7 InDel-маркерам, а путем сравнения выявленных INDEL-маркеров между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы, устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов S. enterica.

При этом ПЦР проводят в объеме 25 мкл, и реакционная смесь содержит:

1,5 мМ Mg-буфер,

0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера), 25 нг ДНК-матрицы,

1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК, объемом 5 мкл, которую получают из разных штаммов S. enterica.

Кроме того, ПЦР проводят с соблюдением режимов:

1 этап - денатурация при 95 С - 5 мин (1 цикл);

2 этап - денатурация при 95 С - 22 с, отжиг при 53 С - 22 с, элонгация при 72 С - 45 с (35 циклов);

3 этап - элонгация при 72 С - 5 мин (1 цикл).

Полученные данные на основании проведенной виртуальной ПЦР in silico на 51 геноме (таблица 2), позволяют определить размер ампликонов у штаммов S. enterica (таблица 3).

Способ осуществляется следующим образом.

Перед осуществлением способа дифференциации штаммов S. enterica выделяют ДНК исследуемой культуры. Бактериальную суспензию исследуемого штамма в дистиллированной воде вносят в микропробирку объемом 1,5 мл, после чего проводят обеззараживание материала и выделение ДНК согласно МУ 1:3.2569-09. Затем проводят ПЦР амплификацию выделенной ДНК со специфическими праймерами из таблицы №1.

Условия проведения реакции амплификации.

Амплификацию проводят по следующей схеме: денатурация при 95 С - 5 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95 С - 22 с, отжиг при 53 С - 22 с, элонгация при 72 С - 45 с; элонгация при 72 С - 5 мин (1 цикл).

Реакционную смесь объемом 25 мкл готовят из расчета: 1,5 мМ Mg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера) 25 нг ДНК-матрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода. В качестве матрицы используют геномную ДНК (объемом 5 мкл), полученную из разных штаммов S. enterica. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.

При этом учет результатов типирования проводят визуально после электрофореза, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по семи INDEL-маркерам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы, устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов S. enterica, что дает возможность дифференцировать один штамм от другого.

Проведенные исследования доказывают, что использование разработанного способа молекулярно-генетического типирования штаммов S. enterica по структуре INDEL-генов позволяет проводить дифференцировку между «вставкой» и «делецией» исходя из размера получаемого ампликона.

Осуществление изобретения

Пример №1.

В эксперименте использовали штаммы S. enterica из лабораторной коллекции ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, используемые в повседневной рутинной практике (Salmonella infantis 1897 и Salmonella typhimurium Г1). Бактериальные штаммы рассевали на чашках Петри с питательной средой Mueller-Hinton agar (HiMedia, India) до единичных колоний, стерильной петлей переносили единичную колонию в бульон Mueller-Hinton broth (HiMedia, India) и оставляли инкубироваться при 37 С, до получения OD600=0.6. Затем 200 мкл пробы отбирали для выделения на микроколонках «К-Сорб» (Синтол, Россия), в соответствии с инструкцией производителя. ПЦР и полученной матрицей ДНК ставят отдельно в каждой пробирке с парами праймеров из таблицы №1. Продукты амплификации учитывают в 8% полиакриламидном геле и вносят в таблицу, сравнивая размер INDEL-гена между штаммами.

Вывод: использование разработанного способа генетического типирования на основании инсерций и делеций позволило выявить отличия друг от друга по четырем INDE1 - маркерам STY4288; STY3837; STY1159; STY3176 у двух лабораторных штаммов, не применяя дорогостоящих методов секвенирования нового поколения (NGS).

Пример №2.

В эксперименте использовали 4 изолята Salmonella spp. выделенные на одном из птицеводческих предприятий из корма, от птицы и продуктах убоя. Для выяснения сходства данных штаммов помимо классических методов, использовали INDEL генотипирование по 7 локусам, представленным в таблице 1.

Результаты показывают совпадение генотипов по INDEL-локусам между штаммами 4 и 7, из чего можно сделать вывод о заражении птицы штаммов сальмонеллы через корм. Но также на предприятии присутствовало еще минимум два штамма, отличавшихся от штаммов, выделенных из корма и от птицы.

Пример №3.

Из коллекции ФГБНУ ФНЦ Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН выбраны 10 штаммов сальмонелл различных серотипов, выделенных с птицеводческих предприятий на территории РФ в 2020 году. Штаммы дифференцировали между собой методом молекулярно-генетического типирования по предложным ранее семи INDEL-маркерам.

Анализ коллекции штаммов сальмонелл из коллекции ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН, подтвердил полиморфизм длин выбранных INDEL-маркеров.

Проведенное исследование доказывает, что использование разработанного способа молекулярно-генетического типирования штаммов S. enterica по структуре INDEL-маркеров позволяет проводить дифференцировку между «вставкой» и «делецией» исходя из размера получаемого ампликона.

Cпособ относится к биотехнологии, а именно к способам молекулярно-генетического типирования штаммов Salmonella enterica, циркулирующих на различных территориях, с целью их дифференциации. Способ молекулярно-генетического типирования штаммов сальмонелл по INDEL-маркерам, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма S. enterica, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза в ПААГ, отличающийся тем, что из ДНК исследуемого штамма S. enterica выявляют семь общих INDEL-маркеров, имеющих делеции определенного размера, а именно STY4288, STY3837, STY1159, STY0523, STY0257, STY2730 и STY3176, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфических праймеров, выявляющих два альтернативных аллеля. при этом учет результатов дифференциации проводят визуально после электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по семи INDEL-маркерам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов S. enterica. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

1. Способ молекулярно-генетического типирования штаммов сальмонелл по INDEL-маркерам, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма S. enterica, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза в ПААГ, отличающийся тем, что из ДНК исследуемого штамма S. enterica выявляют семь общих INDEL-маркеров, имеющих делеции определенного размера, а именно STY4288, STY3837, STY1159, STY0523, STY0257, STY2730 и STY3176, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфических праймеров, выявляющих два альтернативных аллеля:

к локусу STY4288 - праймеры AGGAGAAGATCATGACTATCGCA и CGTTGGCCTTCCTGCTTG, с длиной фрагмента 97 п.н. или 85 п.н.,

к локусу STY3837 - праймеры TCGATGAGTTTGATCCCATTGC и TCTTTCTTCTCGGTCGCCTT, с длиной фрагмента 100 п.н. или 89 п.н.,

к локусу STY1159 - праймеры CGACTCCGACAAGCTACGAA и ACCCCTGTACCGACACTATC, с длиной фрагмента 92 п.н. или 74 п.н.,

к локусу STY0523 - праймеры CGAACGGAAGGGTTGCAAA и CGATGAGCCCAGGTTCCA, с длиной фрагмента 127 п.н. и 115 п.н.,

к локусу STY0257 - праймеры CGGCAGGAATCATGTTGAGC и GGCGTTAATGGTCATTGGCTC, с длиной фрагмента 80 п.н. и 67 п.н.,

к локусу STY2730 - праймеры TGAGGTGATTAACGCTCCCG и TCCACGACAATCTCTACGCC, с длиной фрагмента 105 п.н. и 99 п.н.,

к локусу STY3176 - праймеры AGCGATTTCCATAACCCGGA и AGACGGCTCTGCACGCTG, с длиной фрагмента 104 п.н. и 98 п.н.,

при этом учет результатов дифференциации проводят визуально после электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по семи INDEL-маркерам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов S. enterica.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:

1,5 мМ Mg-буфер,

0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера) 25 нг ДНК-матрицы,

1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода.

В качестве матрицы используют геномную ДНК (объемом 5 мкл), полученную из разных штаммов S. enterica.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ПЦР проводят с соблюдением режимов:

1 этап - денатурация при 95°С - 5 мин (1 цикл);

2 этап - денатурация при 95°С - 22 с, отжиг при 53°С - 22 с, синтез при 72°С - 45 с (35 циклов);

3 этап - элонгация при 72°С - 5 мин (1 цикл).