Способ дифференциации штаммов Pseudomonas aeruginosa с помощью молекулярно-генетического типирования Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12N15/10 

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способам молекулярно-генетического типирования штаммов Pseudomonas aeruginosa, которое может быть использовано при эпидемиологической диагностике внутрибольничных гнойно-септических, нозокомиальных инфекций на основе внутривидового типирования возбудителя.

В настоящее время P. aeruginosa является третьим наиболее часто выделяемым патогеном среди грамотрицательных палочек и седьмым среди всех микробных агентов, способных вызывать нозокомиальные инфекции. При этом на фоне эпидемии Covid - 19 данный этиологический агент продемонстрировал высокие показатели летальности среди пациентов с бактеримией (1, 2). Знание о клональной природе штаммов позволяет не только проводить противоэпидемические мероприятия, но и выявлять штаммы ранее не известные, поэтому необходимо использовать современные методы молекулярного типирования.

Несмотря на то, что существуют современные методы идентификации P. aeruginosa - ПЦР, серотипирование, сиквенирование в Российской Федерации на сегодняшний день, в нормативно-методической документации преобладают бактериологические методы идентификации синегнойной палочки (3,4,5).

Известное INDEL - типирование основано на определении «вставок-делеций» (INsertion-DELetion) в различных генах, что позволяет выявлять индивидуальные различия между штаммами микроорганизмов (6). По этому методу у искомого гена есть в наличии всего лишь два аллеля («вставка» и «делеция») указанный способ является гораздо проще остальных методов типирования, который был опробован на микроорганизмах V. cholerae (7), В. melitensis(8), Н. pylori (9). В связи с этим возник вопрос о создании нового способа внутривидового типирования и дифференциации для синегнойной палочки.

Известен способ типирования P. aeruginosa, основанный на применении серологических сывороток, используя которые возможно по структуре О-антигена разделять штаммы синегнойной палочки на 20 серогрупп (10,11). Их недостатком является, сложность получения, наличие чистой культуры для точности проведения анализа, ограниченность распространения сывороток для диагностики.

. Известны молекулярные методы типирования P. aeruginosa, как гель-электрофорез в пульсирующем поле, пульс-электрофореза в контролируемом гомогенном электрическом поле, MLST - типирование, VNTR-анализ (12,13,14,15,16). Однако недостатками этих методов является время выполнения анализа, достоверность, зависимость от иностранных баз данных, высокие затраты для проведения анализа, использование иностранного оборудования.

Наиболее близким методом к предлагаемому изобретению является способ генетического типирования штаммов P. aeruginosa за счет выявления SNP/INDEL, основанный на полногеномном секвенировании (17).

Однако данный способ имеет ряд недостатков. Анализ данных проводился с использованием полногеномных последовательностей, в которых сравнивались лишь парные изоляты от нескольких пациентов, между которыми сравнивались Indel-ассоциированные полиморфизмы, по которым определялись факторы фенотипической вариации. Получение полногеномных сиквенсов требует наличия дорогостоящего ДНК-секвенатора, а также использования дорогостоящих импортных расходных материалов, работы квалифицированного персонала.

Кроме того продолжительным и сложным остается анализ и интерпретация результатов, от десятков часов до нескольких дней с использованием высокопроизводительной техники и дорогостоящего программного обеспечения. Что в совокупности приводит к ограничению применения и высокой стоимости анализа.

Технической задачей предполагаемого изобретения является разработка нового способа позволяющего достоверно, быстро и с низкой себестоимостью осуществлять внутривидовую дифференциацию штаммов Р. aeruginosa.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе дифференциации штаммов Pseudomonas aeruginosa с помощью INDEL типирования, включающем выделение ДНК из исследуемого штамма Р. aeruginosa, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза, отличие состоит в том, что из ДНК исследуемого штамма выявляют четыре общих INDEL-генов, имеющие делеции определенного размера, а именно IND-РА0168, РА3324, РА0659 и РА1451, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфических праймеров, выявляющих два альтернативных аллеля:

к гену IND-PA0168 - праймеры

AGGACATGGACTGCGTGG и

CCTGCTGCAGGCACTTGG

с длиной амплифицированного фрагмента 100 п. н. или 114 п. н.;

к гену IND-РА3324 - праймеры

GAGTCCCGGATGTGGTAGTC и

GATCACGCTCCACAGGTTGA

с длиной амплифицированного фрагмента 99 п. н. или 113 п. н.;

к гену IND-РА0659 - праймеры

GCGGCATCATCATCGAGAAG и

CTGGGCGGTGTGTAGGGA

с длиной амплифицированного фрагмента 106 п. н. или 112 п. н.;

к гену IND-РА1451 - праймеры

CAATTTCAGCGCCGGCGG и

CGAAGACGAACTGGACGAAC

с длиной амплифицированного фрагмента 100 п. н. или 109 п. н., при этом учет результатов дифференциации проводят визуально после электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по четырем INDEL-генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов P.aeruginosa, позволяя дифференцировать один штамм от другого.

При этом ПЦР проводят в объеме 10 мкл и реакционная смесь содержит:

1,5 мМ MgCl, 0,2 мМ смеси дНТФ,

1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера), 25 нг ДНК матрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК объемом 5 мкл, которую получают из разных штаммов P. aeruginosa.

Кроме того ПЦР проводят с соблюдением режимов:

1 этап - денатурация при 94°С -10 с;

2 этап - отжиг при 60°С - 10 с;

3 этап - синтез при 72°С - 15 с (39 циклов)

Обоснование выбора праймеров.

С помощью программного обеспечения, разработанного авторами (ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора) было проанализировано более 5000 генов P. aeruginosa в базе данных GenBank. В процессе анализа нуклеотидных последовательностей штаммов P. aeruginosa в базе данных GenBank был определен ряд INDEL-генов, отличающихся по размеру у различных штаммов P. aeruginosa, и несущих только два аллельных варианта, с различными длинами ампликонов. По итогу анализа было выделено 4 общих INDEL-гена, формирующих продукты амплификации удобные для учета.

С помощью программного обеспечения BLAST и Primer - BLAST к вариабельным участкам выбранных генов РА0168, РА3324, РА0659, РА1451 были сконструированы специфические INDEL праймеры, смотри идентификационную таблицу 1.

Значения размеров амплифицированных фрагментов для каждого штамма по каждому из четырех INDEL-генов являются его индивидуальной характеристикой, что в свою очередь и позволяет дифференцировать один штамм от другого и определять их происхождение при помощи кластерного анализа.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед осуществлением типирования штаммов P. aeruginosa выделяют ДНК исследуемой культуры. Бактериальную суспензию исследуемого штамма вносят в микропробирку объемом 1,5 мл, после чего проводят обеззараживание материала и выделение нуклеиновых кислот (ДНК) согласно МУ 1.3.2569-09 (18). Затем в четырех пробирках проводят амплификацию выделенной ДНК со специфическими праймерами.

Условия проведения реакции амплификации

Амплификацию проводят по следующей схеме: денатурация при 94°С -10 с, отжиг при 63°С - 10 с, синтез при 72°С - 15 с (39 циклов).

Реакционную смесь объемом 10 мкл готовят из расчета: 1,5 мМ MgCl, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера) 25 нг ДНКматрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем -вода. В качестве матрицы используют геномную ДНК (объемом 5 мкл), полученную из разных штаммов P. aeruginosa. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.

Учет результатов типирования проводят визуально после электрофореза, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по четырем INDEL-генам, а путем сравнения выявленных NDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы, устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов P. aeruginosa, что дает возможность дифференцировать один штамм от другого.

Общее время проведения исследования не превышает 9-12 часов.

Экспериментальные исследования подтверждают, что использование разработанного способа молекулярно-генетического типирования штаммов P. aeruginosa по структуре INDEL-генов, позволяет выявлять штаммы с их различными аллельными вариантами.

Таким образом, предложенный способ позволяет достоверно и быстро в течение 9-12 часов, проводить анализ штаммов P. aeruginosa, выделенных в различных странах, областях, регионах.

Пример 1.

В эксперименте использованы штаммы P. aeruginosa из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора, выделенные в ДНР (2350, 2424, 2630, 2632) ив г. Хабаровске (21-10, 21-122, 21-454, 21-52). P. aeruginosa суспендировали в 100 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводят выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 (10). Для постановки полимеразной цепной реакции используют специфичные праймеры к INDEL-генам РА0168, РА3324, РА0659 и РА 1451.

Реакционную ПЦР смесь объемом 10 мкл готовят из расчета: 1,5 мМ MgCl, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера) 25 нг ДНКматрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, 5 микролитров ДНК, оставшийся объем - вода, после закапывали 1 каплю вазелинового масла. Смесь перемешивают и амплифицируют при условиях: денатурация при 94°С - 10 с, отжиг при 60°С - 10 с, синтез при 72°С - 15 с (39 циклов) в амплификаторе Терцик. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле.

В таблице 2 показаны результаты электрофореза продуктов амплификации INDEL-генов: РА0168, РА3324, РА0659, РА1451.

Вывод: Анализ результата амплификации INDEL-генов РА0168, РА3324, РА0659, РА1451, продемонстрировал, что значительная часть штаммов, выделенных в ДНР, отличаются по 4 INDEL - локусам от штаммов, выделенных в Хабаровске. Таким образом, изучаемые штаммы можно разделить на две большие группы. Следовательно, на этих территориях распространены генетически разные клоны. При этом в ДНР циркулируют преимущественно штаммы с набором аллелей: РА0168 - 114 п. н, РА3324 - 113 п. н, РА0659 - 106 п. н, РА1451 - 100 п. н. а в Хабаровске с набором аллелей: РА0168 - 100 п. н, РА3324 - 99 п. н, РА0659 - 112 п. н, РА 1451 - 109 п. н.

Пример 2.

В эксперименте использованы штаммы P. aeruginosa из коллекции Ростовского-на - Дону научно-исследовательского противочумного института, выделенные в ДНР (2679, 2889, 2911) и г. Ростов-на-Дону (39926, 45048, 45528). Условия проведения см

Пример 1.

В таблице 3 предоставлены результаты электрофореза продуктов амплификации INDEL-генов: РА0168, РА3324, РА0659, РА1451.

Таким образом анализ продуктов амплификации INDEL-генов РА0168, РА3324, РА0659, РА1451, выявил генетическое сходство штаммов по трем INDEL-локусам (РА0168, РА3324, РА1451), выделенных как на территории Ростова-на-Дону, так и на территории ДЫР. Однако у штамма 2889 есть отличие по длине аллельного варианта гена РА 1451 - 109 п. н. Различие штаммов выделенных в двух разных регионах идентифицируют по размеру алельного варианта гена РА0659, у штаммов из Ростова-на-Дону он составляет 106 п. н, а у штаммов из ДНР 112 п. н..

Вывод: на данных территориях циркулируют штаммы P. aeruginosa, которые можно разделить на две группы по INDEL-гену РА0659, отличающиеся от Хабаровска. Штамм 2889 будет входить в общую группу штаммов ДНР, и являтется обособленным генотипом.

Использование предполагаемого изобретения позволяет достоверно и быстро за счет сконструированных праймеров унифицировать и создать набор значений размера фрагментов аллелей для каждого штамма Р. aeruginosa по каждому из четырех INDEL-генов. Найденные INDEL-гены позволяют дифференцировать штаммы и определять их генетическое родство.

Предложенный способ дает возможность экономически выгодно проводить анализ штаммов P. aeruginosa, выделенных в различных странах, областях, регионах. К тому же это хорошее дополнение к молекулярной дифференциации штаммов с помощью полногеномного секвенирования.

Источники информации.

1. Малыгин А.С. и др. «ИССЛЕДОВАНИЕ СЛУЧАЕВ БАКТЕРИЕМИИ PSEUDOMONAS AERUGINOSA У БОЛЬНЫХ С ТЯЖЕЛЫМ ТЕЧЕНИЕМ COVID-19 », /Инфекционные болезни: Новости. Мнения. Обучение. - 2022. - Т. 11. - №. 4 (43). - С.47-55.

2. Sadeeva Z. Z. et al. Characterization of Pseudomonas aeruginosa isolated from positive samples of hemocultures and cerebrospinal fluid of children //Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. - 2022. - T. 99. - №. 3. - C. 309-321.

3. MP Методические рекомендации по бактериологической диагностике. синегнойной инфекции. М., 1984.

4. 6. МУК 4.2.2942-11. Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях.

5. ГОСТ Р 54755-2011. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa

6. Водопьянов, А. С., Водопьянов, С. О., Олейников, И. П., Мишанькин, Б. Н. INDEL-типирование штаммов Vibriocholerae //Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2017. - Т. 22. - №. 4. - С.195-200.

7. «Способ молекулярно-генетического внутривидового типирования V. cholerae 01 и 0139 серогрупп », патент №2575046, кл. C12N 15/10, опубл. 10.02.2016 г. Бюл.№4.

8. «Способ генетического INDEL-типирования штаммов Brucella melitensis», патент №2732425,кл. C12Q 1/68, опубл. 16.09.2020 г. Бюл.№26

9. «Способ дифференциации штаммов Helicobacter pylori путем молекулярно-генетического типирования», патент №2688434, C12N 15/10, опубл.21.05.2019 Бюл. 15.

10. Brokopp С. D., Gomez-Lus R., Farmer III J. J. Serological typing of Pseudomonas aeruginosa: Use of commerical antisera and live antigens //Journal of Clinical Microbiology. - 1977. - T. 5. - №. 6. - C. 640-649.

11. Huszczynski S. M., Lam J. S., Khursigara С.M. The role of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide in bacterial pathogenesis and physiology //Pathogens. - 2019. - T. 9. - №. 1. - C. 6.

12. Martak D. et al. Comparison of pulsed-field gel electrophoresis and whole-genome-sequencing-based typing confirms the accuracy of pulsed-field gel electrophoresis for the investigation of local Pseudomonas aeruginosa outbreaks //Journal of Hospital Infection. - 2020. - T. 105. - №. 4. - C. 643-647.

13. Миронова Л. В., Афанасьев М. В., Балахонов С. В. Применение технологии пульс-электрофореза в молекулярном типировании возбудителей особо опасных инфекций //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2015. -Т. 33. - №. 3. - С.28-32.

14. Curran В. et al. Development of a multilocus sequence typing scheme for the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa //Journal of clinical microbiology. - 2004. - T. 42. - №. 12. - C. 5644-5649.

15. Vu-Thien H. et al. Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis for longitudinal survey of sources of Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis patients //Journal of clinical microbiology. - 2007. - T. 45. - №. 10. - C. 3175-3183.

16. Babenko D. et al. In silico comparison of different types of MLVA with PFGE based on Pseudomonas aeruginosa genomes //Acta Medica. - 2017. - T. 33. - C. 347.

17. Chung J. C. S. et al. Genomic variation among contemporary Pseudomonas aeruginosa isolates from chronically infected cystic fibrosis patients //Journal of bacteriology. -2012. -T. 194. -№. 18. -C. 4857-4866. -7

18. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: Методические указания. МУ 1.3.2569-09. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2009. - 35 с. - 8.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Способ дифференциации штаммов Pseudomonas aeruginosa с

помощью молекулярно-генетического типирования.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2023-04-24">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>187</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-05-11</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>187</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>187</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-05-24</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Ростовский- на –Дону противочумный

институт Роспотребнадзора</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Rostov-on-Don Plague Control Research Institute

of the Rospotrebnadzor</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Ковалевич Алексей

Александрович</InventorName>

<InventorNameLatin>Kovalevich Aleksey

Aleksandrovich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ дифференциации штаммов

Pseudomonas aeruginosa с помощью молекулярно-генетического

типирования.</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>36</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..36</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Pseudomonas aeruginosa

</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aggacatggactgcgtggcctgctgcaggcacttgg</INSDSeq_seq

uence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Pseudomonas aeruginosa

</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagtcccggatgtggtagtcgatcacgctccacaggttga</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>38</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..38</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Pseudomonas aeruginosa

</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcggcatcatcatcgagaagctgggcggtgtgtaggga</INSDSeq_s

equence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>38</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..38</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Pseudomonas

aeruginosa</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caatttcagcgccggcggcgaagacgaactggacgaac</INSDSeq_s

equence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способам молекулярно-генетического типирования штаммов Pseudomonas aeruginosa, которое может быть использовано при эпидемиологической диагностике внутрибольничных гнойно-септических, нозокомиальных инфекций на основе внутривидового типирования возбудителя. Способ дифференциации штаммов Pseudomonas aeruginosa с помощью INDEL-типирования включает выделение ДНК из исследуемого штамма P. aeruginosa, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза. Из ДНК исследуемого штамма выявляют четыре общих INDEL-генов, имеющих делеции определенного размера, а именно IND-РА0168, РА3324, РА0659 и РА1451, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфических праймеров, выявляющих два альтернативных аллеля: к гену IND-PA0168 - праймеры AGGACATGGACTGCGTGG и CCTGCTGCAGGCACTTGG с длиной амплифицированного фрагмента 100 п. н. или 114 п. н.; к гену IND-РА3324 - праймеры GAGTCCCGGATGTGGTAGTC и GATCACGCTCCACAGGTTGA с длиной амплифицированного фрагмента 99 п. н. или 113 п. н.; к гену IND-РА0659 - праймеры GCGGCATCATCATCGAGAAG и CTGGGCGGTGTGTAGGGA с длиной амплифицированного фрагмента 106 п. н. или 112 п. н.; к гену IND-РА1451 - праймеры CAATTTCAGCGCCGGCGG и CGAAGACGAACTGGACGAAC с длиной амплифицированного фрагмента 100 п. н. или 109 п. н. Учет результатов дифференциации проводят визуально после электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК. Путем сравнения выявленных INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов P. aeruginosa. Способ позволяет достоверно, быстро и с низкой себестоимостью осуществлять внутривидовую дифференциацию штаммов Р. aeruginosa. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. Способ дифференциации штаммов Pseudomonas aeruginosa с помощью INDEL типирования, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма P. aeruginosa, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза, отличающийся тем, что из ДНК исследуемого штамма выявляют четыре общих INDEL-генов, имеющих делеции определенного размера, а именно IND-РА0168, РА3324, РА0659 и РА1451, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфических праймеров, выявляющих два альтернативных аллеля:

к гену IND-PA0168 - праймеры

AGGACATGGACTGCGTGG и

CCTGCTGCAGGCACTTGG

с длиной амплифицированного фрагмента 100 п. н. или 114 п. н.;

к гену IND-РА3324 - праймеры

GAGTCCCGGATGTGGTAGTC и

GATCACGCTCCACAGGTTGA

с длиной амплифицированного фрагмента 99 п. н. или 113 п. н.;

к гену IND-РА0659 - праймеры

GCGGCATCATCATCGAGAAG и

CTGGGCGGTGTGTAGGGA

с длиной амплифицированного фрагмента 106 п. н. или 112 п. н.;

к гену IND-РА1451 - праймеры

CAATTTCAGCGCCGGCGG и

CGAAGACGAACTGGACGAAC

с длиной амплифицированного фрагмента 100 п. н. или 109 п. н.,

при этом учет результатов дифференциации проводят визуально после электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по четырем INDEL-генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов P.aeruginosa, позволяя дифференцировать один штамм от другого.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ПЦР проводят в объеме 10 мкл и реакционная смесь содержит:

1,5 мМ MgCl, 0,2 мМ смеси дНТФ,

1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера), 25 нг ДНК матрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК объемом 5 мкл, которую получают из разных штаммов P.aeruginosa.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ПЦР проводят с соблюдением режимов:

1 этап - денатурация при 94°С - 10 с;

2 этап - отжиг при 60°С - 10 с;

3 этап - синтез при 72°С - 15 с (39 циклов).