Белки DCLK1 и RIPK1 биомаркеры простой шизофрении Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 C12Q1/68 

Настоящее изобретение относится к медицине, конкретно к психиатрии и может быть использовано для более точной дифференциальной параклинической диагностики простой формы шизофрении, на основании определения концентрации белков DCLK1 и RIPK1 в сыворотке крови больных и здоровых лиц.

Шизофрения является тяжелым мультифакториальным заболеванием, требующим больших медицинских ресурсов из-за раннего начала и высокой хронизации процесса [5], что приводит к стойкому нарушению социальной адаптации и трудоспособности больных в молодом возрасте [19]. Шизофрения проявляется разными клиническими фенотипами, гетерогенность которых препятствует пониманию ее патофизиологических процессов [1]. Наличие выраженной негативной симптоматики у больных простой шизофренией отражает более тяжелое течение простой формы шизофрении [18]. Основным препятствием в разработке высокоэффективных тактик лечения шизофрении является отсутствие в диагностических критериях современные данных о патогенезе заболевания.

Диагностические тесты на основе протеомных биомаркеров предполагается использовать для повышения точности диагностики, мониторинга прогрессирования заболевания, для определения вариантов лечения и ответа на терапию. Создание панели протеомных маркеров будет являться более точной и чувствительной диагностической системой, отвечающей таким требованиям, как воспроизводимость в клинических условиях, экономическая доступность и использование неинвазивных материалов, таких как плазма и сыворотка крови [4]. Учитывая неоднородность симптомов внутри нозологии, биомаркеры помогут стратифицировать пациентов на основе молекулярных подтипов, что позволит эффективней подбирать лекарственную терапию.

Первые попытки создать диагностическую панель для дифференциальной диагностики психических расстройств были предприняты в 2010 году. Группой исследователей под руководством E. Schwarz был разработан тест для диагностики шизофрении, основанный на количественной оценке белков сыворотки крови. Данный тест позволял количественно оценить 51 белок с чувствительностью и специфичностью 83% [13]. Высокая чувствительность и специфичность позволили авторам идентифицировать заболевание до проявления клинических симптомов и дифференцировать подтипы внутри одной нозологии на основе молекулярных профилей. Однако последующие этапы оптимизации тестовой панели для дифференцировки шизофрении от иных психических расстройств проведены не были. Причины, приведшие к остановке разработки, авторами не озвучены. Таким образом, диагностическая панель для дифференциальной диагностики шизофрении не была создана.

В работе [12] описана попытка разработать панель диагностики развития психотических состояний у лиц с высоким риском психоза. Авторами описаны доказательства нарушения регуляции каскада комплемента и свертывающей системы при данных расстройствах. Некоторые белки комплемента оказались важными предикторами развития психоза, включая C4BPA, C1r, C6 и C8A. Данные белки функционально взаимодействуют с белками свертывающей системы крови - плазминогеном и витамин К-зависимым белком S. Основные причины этих изменений согласуются с данными об активации воспалительных процессов, предшествующих психозу и другим психическим расстройствам, что может быть связанно с генетической изменчивостью комплемента C4. Некоторые выявленные в исследовании белки, такие как альфа-2-макроглобулин (A2M), μu тяжелая цепь иммуноглобулина М (IGHM), и белок-переносчик фосфолипидов (PLTP) были выделены среди 10% наиболее информативных предикторов [12]. Однако эти результаты также невозможно рассматривать в качестве биомаркеров отдельных психических расстройств, т.к. эти нейроиммунные аномалии, сходные для многих заболеваний, могут проявляться при множестве фенотипических проявлений.

Кроме этого, расширенный патентный поиск выявил 6 патентов, по маркерам психических расстройств. В частности, Korth опубликовал патент под названием «Метод и биомаркеры для диагностики психических заболеваний in vitro» [8]. Это изобретение относится к способу диагностики наличия психического расстройства или предрасположенности к психическому расстройству на основании изменения уровня экспрессии мРНК ряда маркерных генов NKG7, RGS1, CCL4, IFNG, IL12RB2, IL13RA1, KMO, FPR2, SLC27A2 и C3. К недостаткам этого способа относится то, что экспрессия мРНК не может быть постоянным и точным диагностическим маркером, так как зависит от множества факторов. Кроме того, основная доказательная база данного патента построена на животных моделях, что не может иметь прямой интерпретации на человека.

Известен еще один патент, описывающий применение биомаркера для диагностики психических заболеваний: «Применение GSK-3beta в качестве раннего диагностического реагента психических расстройств по крови» (Application of GSK-3beta as a blood marker in preparation of mental disorder early-diagnosis reagent) [3] В данном изобретении раскрыто применение GSK-3beta в качестве маркера для расстройств аутистического спектра (РАС). GSK-3beta можно использовать в качестве реагента для ранней диагностики РАС по крови, а время выявления его у новорожденных составляет 0-3 месяца. Неинвазивная вспомогательная диагностика РАС может быть проведена с использованием небольшого количества крови, таким образом упрощается крупномасштабный скрининг РАС у младенцев, а также облегчается раннее обнаружение, раннее вмешательство и раннее лечение РАС. Основным недостатком этого метода является то, что эта модель основана на полуколичественном анализе выполняемым с помощью очень трудоемкого и редко используемого в клинической практике метода вестерн-блоттинга. И РАС далеко не всегда во взрослом возрасте перерастают в шизофрению.

Кроме того, известно еще 4 патента, относящихся к маркерам психических расстройств. Применение белка, связывающего витамин d, в качестве маркера в диагностике депрессии при психических заболеваниях (Application of vitamin D binding protein as marker in diagnosis of mental disease depression) [16]. Белковый маркер сыворотки для диагностики депрессии и его применение (Serum protein marker for diagnosing depression and application thereof) [14]. Мутации 5 'области гена 5-ht1a человека, ассоциированные белки 5' области и диагностический тест для большой депрессии и связанных с ней психических заболеваний (Mutations of the 5' region of the human 5-ht1a gene, associated proteins of the 5' region and a diagnostic test for major depression and related mental illnesses) [2] Маркер депрессии и соответствующий способ диагностики (Depression diagnosis marker and preparation method thereof) [15]. Но все эти патенты описывают маркеры депрессии, а не шизофрении.

Представленные в практически во всех приведенных выше исследованиях белки в основном являются высокоэкспрессируемыми в сыворотке крови, задействованы в очень многих биологических процессах в организме и потому не могут претендовать на роль специфических биомаркеров. Следовательно, в дальнейшей перспективе исследования должны быть сосредоточены на минорных белках с низким содержанием в сыворотке крови, в частности нейроспецифичные белки, обладают большим диагностическим потенциалом для психических расстройств. Несмотря на явную необходимость изучения минорных белков, таких исследований не выявлено.

Современные методы количественной протеомики представленные безметочными масс-спектрометрическими подходами, использующими зависимость между содержанием измеряемого пептида и уровнем масс-спектрометрического сигнала, являются одним из лучших решений в поиске протеомных биомаркеров, в том числе и для минорных белков. Использование метода - мониторинг множественных или выбранных реакций SRM/MRM (Single/Multiple Reaction Monitoring) [10] для обнаружения пептидов в сложных биологических смесях, таких как плазма и сыворотка человека является самым точным из существующих методов детекции аналитов в биологических жидкостях. Преимущество этого подхода в том, что нет ограничений в отношении количества выборок и это обеспечивает большую статистическую мощность. Основным преимуществом количественной масс-спектрометрии является чувствительность данного метода к малым концентрациям аналитов, что позволяет анализировать в том числе и нейроспецифичные белки, не определяющиеся в плазме крови здоровых лиц. Создание платформ, использующих меньшее количество аналитов, но большее количество клинических образцов, обеспечит точную статистическую интерпретацию и позволит быстро валидировать полученные результаты.

Для постановки диагноза простой формы шизофрении используют анамнестические и клинико-психометрические шкалы, основанные на клинических оценках преобладания тех или иных симптомов. До сих пор не существует параклинических методов диагностики шизофрении, так как до настоящего времени не выявлено специфичных биологических маркеров этого заболевания.

Задачей предлагаемого изобретения является выявление биомаркеров, которые могут быть использованы для дифференциальной диагностики простой формы шизофрении.

Настоящее изобретение основано на открытии новых протеомных маркеров простой шизофрении, DCLK1 и RIPK1, которые могут служить в качестве дополнительных параклинических критериев дифференциальной диагностики простой и параноидной шизофрении.

Поставленную задачу решают путем определения концентрации белков DCLK1 и RIPK1 в сыворотке крови с помощью метода количественной масс-спектрометрии и проведения оценки уровня различий в концентрациях белков в исследуемых группах с помощью статистического анализа.

В результате проведенного комплекса исследований выявлены белки, которые могут являться биомаркерами простой формы шизофрении - белки серин/треонин-протеинкиназа (DCLK1) и рецепторная серин/треонин-протеинкиназа 1 (RIPK1). Эти белки впервые выявлены в высоких концентрациях в сыворотке крови больных простой шизофренией.

В настоящем изобретении описаны результаты выявленных значимых различий уровней DCLK1 и RIPK1 у больных простой и параноидной шизофренией, а именно: значительное увеличение содержания DCLK1 и RIPK1 в сыворотке крови больных простой шизофренией (DCLK1 22,3 [7,2;57,0] нг/мл, RIPK1 51,5 [29,2;75,6] нг/мл) в сравнении с больными параноидной шизофренией (DCLK1 9,9 [2,8;15,5] нг/мл, RIPK1 28,0 [1,5;54,3] нг/мл). Сравнение общей группы больных шизофренией со здоровыми лицами также показало статистически значимые различия, что дает основание предложить белки DCLK1 и RIPK1 в качестве биомаркеров простой шизофрении.

Оба белка участвуют в модулировании нейротрансмиссии. Так белок DCLK1 связан с белками, регулирующими нейротрансмиссию через глутаматные и ГАМК рецепторы, а белок RIPK1 участвует в процессах апоптоза и некроптоза в нейронах головного мозга, запускающихся воспалением. Так по данным литературы DCLK1 был выявлен в качестве регулятора полимеризации микротрубочек в нейронах [0], что является одним из ключевых механизмов в обеспечении нейропластичности. Кроме того варианты гена, кодирующего DCLK1 связывают с психическими расстройствами [0]. Другой белок RIPK1 принимает ключевое участие в регуляции TNF-опосредованного апоптоза, некроптоза клеток в процессе иммунного ответа и воспалении [0]. В литературе имеются многочисленные доказательства, что иммунологические нарушения у больных шизофренией могут играть значимую роль в этиологии и патогенезе этого заболевания [17].

Таким образом, сущностью данного изобретения являются белковые биомаркеры, предлагаемые в качестве дополнительных критериев (достоверные различия по уровню DCLK1 и RIPK у больных простой шизофренией по сравнению с больными параноидной шизофренией) дифференциальной диагностики простой и параноидной шизофрении. При повышении содержания белков DCLK1 до 22,3 нг/мл и RIPK1 до 51,5 нг/мл в сыворотке крови, диагностируется простая шизофрения. Таким образом, эти белки, характеризуются тем, что могут служить в качестве дополнительных параклинических критериев при проведении дифференциальной диагностики простой и параноидной шизофрении.

Уровни DCLK1 и RIPK могут быть определенны с помощью таких методов, как иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблоттинг, хроматография, спектроскопия, масс-спектрометрия и других аналитических методов.

Предлагаемое изобретение осуществляют следующим образом.

Условия проведения исследования, определяющие значимость его результатов

В качестве основного материала биохимических исследований использовалась сыворотка крови больных простой и параноидной шизофренией и здоровых лиц. Клиническая верификация диагнозов выполнена квалифицированными врачами клиник Научно-исследовательского института психического здоровья Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук» согласно клиническим критериям, утвержденным Международной классификации болезней 10-го пересмотра (МКБ-10). Забор крови осуществляли из локтевой вены утром натощак с использованием пробирок типа Vacuette с активатором образования сгустка согласно стандартной процедуре и до назначения лекарственной терапии. Для отделения сыворотки, от форменных элементов кровь центрифугировали при 1500 об/мин и охлаждении до +4°С в течении 30 мин.

В исследование были включены 35 больных шизофренией (18 женщин, 17 мужчин) в возрасте 30,0 [23,0;49,0] лет, поделенных на две подгруппы пациенты с простой (F20.6) и параноидной (F20.0) шизофренией. Согласно анамнестическим данным у отобранных пациентов наблюдался перерыв в приеме антипсихотической терапии от 2-3 месяцев до года. На момент обследования длительность заболевания обследуемых пациентов с простой шизофренией составила 12,5 [6,5;17] лет и возрастом дебюта шизофрении 21,3±6,5 лет. В группе пациентов с параноидной шизофренией длительность заболевания составила 5,0 [3,5;7,0] лет и средним возраст дебюта заболевания 29,6±9 лет. Контрольную группу составили 13 здоровых лиц (6 женщин, 7 мужчин) в возрасте 37 [26;49] лет.

Методология исследования:

Для проведения протеомного количественного масс-спектрометрического исследования применялись следующие методы:

1. иммуноаффинная жидкостная хроматография,

2. ферментативный гидролиз белков на ультрафильтрах,

3. Количественный масс-спектрометрический анализ с использованием синтетических пептидных стандартов,

4. Статистическая обработка и анализ полученных результатов.

Сыворотка крови на первом этапе подвергалась иммуноаффинной хроматографии. Сыворотку 3-кратно разводили натрий-фосфатный буфером и центрифугировали при 16 000 об/мин в течение 1 минуты при 4°С, и фильтровали через стандартный фильтр Filtropur S (Sarstedt, Germany) диаметром 22 микрона. После этого образцы очищали на хроматографической колонке Multiple Affinity Removal Column Human-14 4.6 x 100 mm (Agilent, USA) от мажорных белков (альбумин, IgG, антитрипсин, IgA, трансферрин, гаптоглобин, фибриноген, альфа-2-макроглобулин, кислый альфа-1-гликопротеин, IgM, аполипопротеин AI, аполипопротеин AII, комплемент C3 и транстиретин) [13;4]. Далее очищенную смесь белков подвергали ферментативному гидролизу на концентрирующих фильтрах Amicon Ultra-0.5 mL (Merk Millipore, France) на 30 кДа, в объеме 100 мкл и содержанием около 1,5 мг белка в образце. Белки в образцах подвергались алкилированию 50 мМ йодацетамидом в течение 1 часа при 25°С а затем для гидролиза сывороточных белков применяли фермент Трипсин Sequencing Grade Modified Trypsin (Promega, USA) в соотношении общая масса фермента/общая масса белка =1/100 в течение 12 часов при температуре 37°C. Для получения раствора пептидов фильтры промывали 30% раствором муравьиной кислоты c помощью центрифугирования при 9000 об/мин в течение 15 минут и температуре 20°C. Затем пробы высушивали на роторном испарителе.

На следующем этапе проводился количественный масс-спектрометрический анализ для определения абсолютной концентрации белков серин/треонин-протеинкиназы DCLK1 (Serine/threonine-protein kinase DCLK1, DCLK1) и рецепторной серин/треонин-протеинкиназы 1 (Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1, RIPK1 в группах простой и параноидной шизофрении методом мониторинга селективных реакций (Selected Reaction Monitoring, SRM) с использованием синтетических пептидных стандартов с включением стабильных изотопов углерода 13C и азота 15N. Образцы анализировали на нано-потоковой хроматографической системе Dionex UltiMate 3000 RSLCnano System с аналитической колонкой Zorbax 300SB-C18, при скорости потока 0,4 мкл/мин Целевой масс-спектрометрический анализ выполняли на тройном квадрупольном масс-спектрометре TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific, USA). ESI ионизацию образца проводили при напряжении 2,0 кВ. Сканирование осуществляли с окном изоляции 1,2 m/z и 0,8 m/z для первого и третьего квадруполя, соответственно, диапазон окна толерантности родительского иона составил 0,5 m/z, время цикла составило 1,2 сек. Результаты сравнения хроматографических профилей эндогенного пептида и синтетического стандарта были проверены в автоматическом режиме при помощи Skyline MacCoss Lab Software (версия 4.1.0) для. Для определения количества белка соотношение, рассчитанное в Skyline, перемножали на известное содержание каждого стандарта, а затем данные обрабатывались в автоматическом режиме в программном обеспечении QuanBrowser Thermo Xcalibur 2.2 SP1.48.

Статистическая обработка результатов и выявление значимых различий между несколькими независимыми группами, характеризующимися количественными признаками и не подчиняющихся нормальному закону распределения (данные были проверены на нормальность при помощи критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка), оценивалась с использованием непараметрического рангового критерия Краскела-Уоллиса, для двух независимых групп - с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводился с расчетом коэффициента ранговой корреляции по Спирмену.

Первым этапом выполнением этой задачи было проведение качественной масс-спектрометрии сыворотки крови и сравнительного анализа белковых спектров сыворотки крови больных простой и параноидной формой шизофрении и здоровых лиц. Работа включала в себя иммуноаффинную хроматографию сыворотки крови, гель-электрофорез по методу Лэммли [9] и масс-спектрометрический анализ и идентификацию белков в помощью международных баз данных. В результате были выявлены статистически значимые отличия белкового профиля исследуемых групп. Далее было проведено сравнение протеомов больных простой и параноидной шизофренией при условии исключения из массива данных белков, обнаруженных в контрольной группе с помощью статистических методов. Анализ показал высокий процент различий между протеомами больных простой и параноидной формами шизофрении. Далее, для выявления белков, которые могут использоваться в качестве маркерных белков, были использованы с методы биоинформатики и программа PANTHER ™ GO slim, а также базы данных REACTOME. Также для каждого белка проводился анализ ассоциации гена с шизофренией по базе данных DISGENET.

По результатам такого анализа для валидации белков в качестве биомаркеров шизофрении были выбраны 2 белка: серин/треонин-протеинкиназа DCLK1 (Serine/threonine-protein kinase DCLK1, DCLK1) и рецепторная серин/треонин-протеинкиназа 1 (Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1, RIPK1).

Измерение содержания белка DCLK1 в сыворотке крови исследуемых групп

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему таблиц.

Авторы патента с помощью количественной масс-спектрометрии выявили трехкратное увеличение концентрации DCLK1 у больных шизофренией по сравнению со здоровыми лицами. При разделении больных шизофренией на подгруппы пациентов с простой и параноидной шизофренией было выявлено, что медиана в группе больных простой шизофренией значительно превышает показатели остальных групп. Корреляционный анализ исключил влияние половых и возрастных факторов, на концентрацию DCLK1 в группах больных параноидной и простой шизофренией.

Таблица 1 Концентрация DCLK1 в сыворотке крови в группах параноидной, простой шизофрении и здоровых лиц

Концентрация F20.0 20.6 Контроль Критерий Краскела-Уоллиса, р DCLK1 (нг/мл) Me [Q25;Q75] N Me [Q25;Q75] N Me [Q25;Q75] N 0,02 9,9 [2,8;15,5] 20 22,3 [7,2;57,0] 13 3,6 [3,0;7,2] 12

Эти результаты также подтверждены с помощью парных сравнений исследуемых групп. Сравнение уровней DCLK1 с помощью U-критерия Манна-Уитни в сыворотке крови здоровых лиц и пациентов с параноидной шизофренией не выявило достоверных различий (p=0,2), однако значимы различия были выявлены между группами больных простой шизофренией и здоровыми лицами (р=0,01) а также между больными простой и параноидной шизофрении (р=0,037). На основании этого авторы патента делают вывод, что основной вклад в достоверность различий концентраций DCLK1 вносят показатели именно пациентов с простой шизофренией.

Кроме того, выявленное значительное повышение концентрации DCLK1 в сыворотке крови пациентов с негативной симптоматикой в общей группе больных шизофренией (p=0,0017). В группе параноидной шизофрении достоверных отличий в концентрациях между позитивной и негативной симптоматикой выявлено не было. На основании этих данных можно сделать вывод, что основной вклад в достоверность различий концентраций DCLK1 вносят показатели именно пациентов с простой шизофренией. Это также подтверждается результатами парных сравнений исследуемых групп.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что DCLK1 является значимым патогенетическим фактором простой шизофрении. Кроме того, белок DCLK1 ранее уже был ранее связан с патогенезом шизофрении. Предполагается, что регуляция экспрессии гена Dclk1 может происходить под действием психотропных препаратов. Таким образом, полученные результаты позволяют использовать концентрации белка DCLK1 в качестве дополнительного параклинического критерия и обозначить DCLK1 как биомаркер простой формы шизофрении.

Измерение содержания белка RIPK1 в сыворотке крови исследуемых групп

В результате количественного масс спектрометрического анализа авторы патента выявили, что концентрации RIPK1 в группе больных шизофренией (0,2-89 нг/мл) значительно превышают таковые в группе контроля (0,2-34 нг/мл) (U-критерий Манна-Уитни p=0,009). В дальнейшем был проведен сравнительный анализ концентраций белка RIPK1 в подгруппах больных простой и параноидной шизофренией. С помощью критерия Краскела-Уоллиса выявлены значительные отличия между всеми исследуемыми группами. Результаты концентраций представлены в Таблице 2. DCLK1 в исследуемых подгруппах больных в сравнении со здоровыми лицами. При этом медиана концентрации RIPK1 больных простой шизофренией двукратно превышает аналогичный показатель в группе больных параноидной шизофренией.

Таблица 2. Концентрация RIPK1 в сыворотке крови в группах параноидной, простой шизофрении и здоровых лиц

Концентрация F20.0 20.6 Контроль Критерий Краскела-Уоллиса, р RIPK1 (нг/мл) Me [Q25;Q75] N Me [Q25;Q75] N Me [Q25;Q75] N 0,004 28,0 [1,5;54,3] 17 51,5 [29,2;75,6] 10 1,4 [0,2;16,5] 9

Групповое сравнение уровней RIPK1 в сыворотке крови здоровых лиц и пациентов в подгруппах больных простой и параноидной шизофренией подтверждает описанный выше результат. Так попарное сравнение с применением U-критерия Манна-Уитни выявило значимые различия между группами больных простой шизофренией и здоровых лиц (р=0,002), а также между больными простой и параноидной шизофрении (р=0,04), и не выявило достоверных различий между больными параноидной шизофрении и здоровыми лицами (p=0,057).

При анализе различий в концентрациях RIPK1 при помощи U-критерия Манна-Уитни в сыворотке крови пациентов с негативной и позитивной симптоматикой (p=0,02) выявлены достоверные различия в концентрациях RIPK1. Значения медиан для негативной симптоматики составили 48,7 [24,7;61,5] нг/мл и для позитивной симптоматики 4,9 [0,3;36,5] нг/мл. Этот факт также указывает связь концентраций RIPK1 с патогенетическими механизмами простой формы шизофрении. Корреляционный анализ также исключил влияние половых и возрастных факторов, и длительности заболевания на концентрацию RIPK1 в группах больных параноидной и простой шизофренией.

Таким образом, было обнаружено, что концентрации белка RIPK1 в сыворотке крови пациентов с простой шизофренией в два раза выше, чем у пациентов с параноидной шизофренией и значительно выше, чем у здоровых лиц. Таким образом, это доказывает возможность использования белка RIPK1 в качестве белкового маркера простой шизофрении.

Использование в качестве биомаркеров простой шизофрении, представленных в данном патенте белков, обусловлено их функциональными свойствами и участием в патогенезе данного заболевания. Выявленное увеличение их абсолютной концентрации в сыворотке крови больных простой шизофренией позволяет использовать данные белки в качестве биомаркеров данного заболевания.

Клинический пример №1. Пациент Н., 36 лет, не работает, инвалид 2 группы. Неоднократно лечился в психиатрических стационарах с 2003 года.

Диагноз: Шизофрения простая. F20.6

Соматически: Бронхиальная астма, атопическая. Скользящая грыжа пищеводного отверстия диафрагмы. Язвенная болезнь ДПК, ремиссия. Дискинезия ЖКТ по гипотоническому типу. Хр. Бронхит. Синусовая тахикардия, контролируемая бета блокаторами.

Неврологически: Головная боль напряжения.

Психическое состояние при поступлении: Полностью ориентирован. Неусидчив. Совершал множество мелких движений. Одет неряшливо. Предъявлял жалобы на раздражительность, сниженное настроение, тревогу. Указывал, что в периоды особенной апатии не мог себя заставить встать с постели, заниматься какими-либо делами. Из-за ощущения необъяснимого страха не выходил на улицу, не посещал врача. Отмечал беспокойный сон, чувство разбитости утром. Периодически чувствовал дискомфорт в животе, который «поднимался в голову, а из головы выходил наружу». При шуме воды слышал оклики, испытывал напряжение в многолюдных местах. Боялся возможного ухудшения самочувствия. Критика к состоянию частичная. Многословен. Склонен к рассуждательству. Мимика и парамимика обеднены, парамимичен. Постоянно требовал назначить больше нейролептиков и капельниц, "чтобы очистить сосуды". Высказывал опасения, что "вдруг станет хуже, и никто не подойдет". Суицидальные мысли не выявлялись.

Лечение: Риссет 8 мг, депакин хроно 1500 мг, азалептин 100 мг на ночь, циклодол 4 мг. Психическое состояние при выписке: В результате лечения состояние больного улучшилось. Выровнялось настроение, нормализовался сон, упорядочилось поведение, прошла тревога, перестали беспокоить оклики и неприятные ощущения в животе.

При поступлении в сыворотке крови определялось повышенные концентрации RIPK1 (47 нг/мл) и DCLK1 (41 нг/мл), оба показателя значительно превосходят референтные значения показателей у здоровых лиц, 1,8-10,4 нг/мл и 0,2-34 нг/мл соответственно.

Клинический пример №2. Пациент К., 55 лет, не работает, инвалид 2 группы. Неоднократно лечился в психиатрических стационарах с 2003 года.

Диагноз: Шизофрения простая. F20.6

Соматически: ИБС, стенокардия напряжения. Ревматическая болезнь сердца, сложный митральный порок с преобладанием стеноза. Нарушение липидного обмена П стадии. Гастроэзофагальная рефлюксная болезнь. Хр. эзофагит. Сахарный диабет П типа, ст. компенсации. Хр. панкреатит, ремиссия.

Неврологически: Знаков очагового поражения ЦНС не найдено.

Психическое состояние при поступлении: Полностью ориентирован. Беседовал охотно. Подробно описывал свои переживания. Монотонен, гипомимичен. Речь в форме монолога. Выражение лица страдальческое. Настроение снижено, испытывал тревогу, беспокойство о собственном здоровье, страх смерти. Жаловался на боли в левом подреберье и по ходу кишечника. Боли постоянные, ноющие, не связанные с погрешностью в диете, усиливающиеся при психоэмоциональной нагрузке. Высказывал опасения, что болен тяжелым заболеванием поджелудочной железы, от которого может умереть. Временами сомневался в справедливости подобных опасений, но совладать с ними не мог. Испытывал слабость, утомляемость, вялость. Был нарушен сон. Не мог собраться с мыслями, они расплывались, временами пропадали или, наоборот, «крутились в голове», «наплывали». По-прежнему думал о смерти отца, испытывал чувство вины, что не помог ему. Дома «оборудовал спальное место» в чуланчике, где скрывался от грозы, сильного ветра, любого сильного ненастья. В мышлении склонность к резонерству, бедность, однообразие образов и ассоциаций, схематизм. Бредово-галлюцинаторные расстройства не выявлялись. Отмечалась рассеянность.

Лечение: эглонил 100 мг в/м, трифтазин 10 мг, анафранил 50 мг, финлепсин 400 мг, симптоматическая, витаминотерапия, гепатопротекторы.

Психическое состояние при выписке: В результате лечения состояние больного значительно улучшилось. Выровнялось настроение, боли в животе не возникали, однако сохранялась тяжесть в подреберье. Нормализовался сон. Прошел страх за свое здоровье. Стал бодрее, подвижнее. Однако ипохондрическая настороженность сохраняется. Стало более упорядоченным мышление, уменьшилось чувство вины в отношении отца. Сохраняется эмоциональная монотонность, резонерство, бедность и однообразие ассоциаций.

При поступлении в сыворотке крови определялось повышенные концентрации RIPK1 (52 нг/мл) и DCLK1 (69 нг/мл), оба показателя значительно превосходят референтные значения показателей у здоровых лиц, 1,8-10,4 нг/мл и 0,2-34 нг/мл соответственно.

Клинический пример №3. Пациент П., 63 года, работает, инвалид 2 группы. Неоднократно лечился в психиатрических стационарах с 1996 года.

Диагноз: Шизофрения параноидная, эпизодический тип течения со стабильным дефектом. F20.02

Соматически: Гипертоническая болезнь 2 ст. Хр. калькул. пиелонефрит (ремиссия), хр. некальк. холецистит (ремиссия).

Неврологически: Остеохондроз пояснично-крестцового отдела диска L₄-L₅.

Психическое состояние при поступлении: Считал, что за ним следят, хотят навредить, «подставить», «посадить за наркотики». Был тревожным, не спал ночами, появились странности в поведении, в высказываниях. Без конца звонил сыновьям, и посторонним лицам, спрашивая не приходили ли милиционеры, «все ли в порядке», «не сгорела ли дача». Выявляется тревога, подавленное настроение, пессимистичные размышления о жизни, работе, семье. При описании своих страхов и проблем становится напряженным и хмурым, избегает визуального контакта.

Лечение: Хлорпротиксен 120 мг, рисперидон 6 мг, циклодол 4 мг.

Психическое состояние при выписке: На фоне лечения уменьшилась тревога, улучшилось настроение, нормализовался сон. Сохраняется пассивность, бездеятельность, отгороженность.

При поступлении в сыворотке крови определялось немного превышенная концентрация RIPK1 (19 нг/мл) и концентрация DCLK1 (11 нг/мл) соответствующая референтным значениям показателей у здоровых лиц, 1,8-10,4 нг/мл и 0,2-34 нг/мл соответственно.

Клинический пример №4. Пациентка А., 19 лет, студентка, инвалид 2 группы.

Диагноз: Шизофрения параноидная, непрерывный тип течения. F20.00

Соматически: Без соматической патологии.

Неврологически: Знаков очагового поражения ЦНС не найдено.

Психическое состояние при поступлении: При поступлении испытывала сильный страх, казалось, что окружающие и родители хотят ей смерти: считала, что «в ней течет ядовитая кровь. Отмечались неприятные давящие ощущения внизу живота, сонливость, головокружения, чувство общей слабости и снижения психической продуктивности.

Лечение: трифтазин 10 мг, флоуксетин 20 мг, циклодол 4 мг, феназепам 2.0 в/м н/н №8.

Психическое состояние при выписке: На фоне лечения стала спокойней, упорядочилось поведение, уменьшилась тревога. Сохранились параноидные переживания, хоть и в несколько деактуализированной форме.

При поступлении в сыворотке крови определялось немного превышенная концентрация RIPK1 (15 нг/мл) и концентрация DCLK1 (6 нг/мл) соответствующая референтным значениям показателей у здоровых лиц, 1,8-10,4 нг/мл и 0,2-34 нг/мл соответственно.

Литература

1. Ahmed, A. O. Schizophrenia heterogeneity revisited: Clinical, cognitive, and psychosocial correlates of statistically-derived negative symptoms subgroup / A. O. Ahmed, G. P. Strauss, R. W. Buchanan, B. Kirkpatrick, W. T. Carpenter // J Psychiatr Res. - 2018. - Vol. 97. - P. 8-15.

2. Albert Paul, Lemonde Sylvie. Mutations of the 5' region of the human 5-HT1A gene, associated proteins of the 5' region and a diagnostic test for major depression and related mental illnesses. United States patent US20060019293, 13 July 2005.

3. Chu Dandan; Gu Jinhua; Wu Qian; Shen Xin. Application of GSK-3beta as a blood marker in preparation of mental disorder early-diagnosis reagent. Chinese patent. CN111690732A, september 2020.

4. Garcia, S. Depletion of Highly Abundant Proteins of the Human Blood Plasma: Applications in Proteomics Studies of Psychiatric Disorders / S. Garcia, P. A. Baldasso, P. C. Guest, D. Martins-de-Souza // Methods Mol Biol. - 2017. - Vol. 1546. - P. 195-204.

5. Hany, M. Schizophrenia [Electronic resource] / M. Hany, B. Rehman, Y. Azhar, J. Chapman // Treasure Island (FL): StatPearls Publishing. - 2020. - Mode of access: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK539864/. - Date of access: 15.02.2021.

6. B. DCLK1 variants are associated across schizophrenia and attention deficit/hyperactivity disorder / B. F. A. Degenhardt, S. Johansson, C. P. Fernandes, A. Hinney, A. Scherag, H. , S. Djurovic, A. Christoforou, K. M. Ersland, S. Giddaluru, M. C. O'Donovan, M. J. Owen, N. Craddock, T. W. M. Mattheisen, B. G. Schimmelmann, T. Renner, A. Warnke, B. Herpertz-Dahlmann, J. Sinzig, Albayrak, M. Rietschel, M. M. C. R. Bramham, T. Werge, J. Hebebrand, J. Haavik, O. A. Andreassen, S. Cichon, V. M. Steen, L. S. Hellard // PLoS One. - 2012. - Vol. 7, № 4. - P. e35424.

7. Koizumi, H. DCLK1 phosphorylates the microtubule-associated protein MAP7D1 to promote axon elongation in cortical neurons / H. Koizumi, H. Fujioka, K. Togashi, J. Thompson, J.R. Yates 3rd, J. G. Gleeson, K. Emoto // Dev Neurobiol. - 2017. - Vol. 77, № 4. - P. 493-510.

8. Korth, Carsten Trossbach, Svenja, Hecher Laura. Method and biomarkers for in vitro diagnosis of mental disorders. International petent No.PCT/EP2017/080504, WO/2018/096141, 31 June.2018.

9. Laemmli U. Slab gel electrophoresis: SDS-PAGE with discontinuous buffers /U. Laemmli // Nature. - 1979. - Vol. 227. - P. 680-685.

10. Lange, V. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial / V. Lange, P. Picotti, B. Domon, R. Aebersold // Molecular systems biology. - 2008. - Vol. 4. - P. 222.

11. Meng, H. Death-domain dimerization-mediated activation of RIPK1 controls necroptosis and RIPK1-dependent apoptosis / H. Meng, Z. Liu, X. Li, H. Wang, T. Jin, G. Wu, B. Shan, D.E. Christofferson, C. Qi, Q. Yu, Y. Li, J. Yuan // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2018. - Vol. 115. - P. E2001-E2009.

12. Mongan D. Development of Proteomic Prediction Models for Transition to Psychotic Disorder in the Clinical High-Risk State and Psychotic Experiences in Adolescence / D. Mongan, M. , C. Healy, S. R. Susai, M. Heurich, K. Wynne, B. Nelson, P. D. McGorry, G. P. Amminger, Me. Nordentoft, M.-O.Krebs, A. et al. // JAMA Psychiatry. - 2020 - P. e202459.

13. Schwarz, E. Validation of a blood-based laboratory test to aid in the confirmation of a diagnosis of schizophrenia / E. Schwarz, R. Izmailov, M. Spain, A. Barnes, J. P. Mapes, P. C. Guest, H. Rahmoune, S. Pietsch, F. M. Leweke, M. Rothermundt, J. Steiner, D. Koethe, L. Kranaster, P. Ohrmann, T. Suslow, Y. Levin, B. Bogerts, N. J. van Beveren, G. McAllister, N. Weber, D. Niebuhr, D. Cowan, R. H. Yolken, S. Bahn // Biomark Insights. - 2010. - Vol. 5. - P. 39-47.

14. Yuan Yonggui, Chen Suzhen. Serum protein marker for diagnosing depression and application thereof. Chinese patent CN111551751, 18 August.2020.

15. Zhang Xiaozhe, Liu Xinxin, Liu Dan, Cheng Mengchun, Zhao Nan. Depression diagnosis marker and preparation method thereof. Chinese patent CN111141863 12. May.2020.

16. Zhang Zhijun, Shi Yachen, Application of vitamin D binding protein as marker in diagnosis of mental disease depression. Chinese patent CN111351945, 30 June 2020.

17. Ветлугина, Т. П. Клинико-динамические аспекты психонейроиммунологии (на модели шизофрении) / Т. П. Ветлугина, О. А. Лобачева, Н. Н. Найденова, А. В. Семке // Патофизиология психических расстройств. - 2006. - С. 143-154.

18. Корнетова, Е. Г. Шизофрения с преобладанием негативных нарушений: клинико-конституциональные закономерности, адаптация, терапия: диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук: 14.01.06 / Корнетова Елена Георгиевна. - Томск, 2016. - 447 с.

19. Шмуклер, А. Б. Шизофрения / А. Б. Шмуклер. - М.: ГЭОТАР: Медиа. - 2017. - С.176.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике простой формы шизофрении. Применение белков серин/треонин-протеинкиназы (DCLK1) в концентрации выше 22,3 нг/мл и рецепторной серин/треонин-протеинкиназы 1 (RIPK1) в концентрации выше 51,5 нг/мл в сыворотке крови в качестве биомаркеров простой шизофрении. Вышеописанное изобретение позволяет использовать выявление биомаркеров для дифференциальной диагностики простой формы шизофрении. 2 табл., 4 пр.

Применение белков серин/треонин-протеинкиназы (DCLK1) в концентрации выше 22,3 нг/мл и рецепторной серин/треонин-протеинкиназы 1 (RIPK1) в концентрации выше 51,5 нг/мл в сыворотке крови в качестве биомаркеров простой шизофрении.