ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ИНКАПСУЛЯЦИЯ ГИДРОФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В УНИЛАМЕЛЛЯРНЫЕ ЛИПОСОМЫ Российский патент 2023 года по МПК A61K9/127 A61K47/10 A61K47/24 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области фармацевтической технологии и в частности к высокоэффективной инкапсуляции в липосомы гидрофильных веществ. Конкретнее, настоящее изобретение относится к униламеллярным липосомам (УЛ) с одним липидным бислоем, окружающим гидрофильное пространство, причем указанное гидрофильное пространство содержит по меньшей мере одно гидрофильное соединение, и к жидкой композиции, содержащей такие униламеллярные липосомы. Также настоящее изобретение относится к способу инкапсуляции гидрофильных соединений в униламеллярные липосомы (УЛ) и к применению указанных УЛ при производстве лекарственных средств, косметических продуктов, пищевых добавок или дезинфицирующих средств.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Липосомы представляют собой маленькиевезикулы, имеющие мембрану, состоящую из липидного бислоя - аналогично клеточной мембране - окружающего гидрофильное пространство. Характерным признаком является амфифильный характер молекул мембраны, которые обладают гидрофильной головой и гидрофобным хвостом. В мембране липосом амфифильные молекулы расположены таким образом, что гидрофильные части находятся в контакте с водной средой внутри и снаружи липосомы, в то время как гидрофобные части расположены внутри двойного слоя. Молекулы мембраны соединены между собой посредством нековалентных взаимодействий. Липосомы имеют один или более двойных липидных слоев и могут иметь размер от 25 нм до 100 мкм. Форма и размер везикул зависят, в числе прочего, от свойств окружающей водной фазы, точного химического состава мембраны и способа их получения.

Липосомы широко применяют в фармакологических и косметических составах, например, для увеличения растворимости амфифильных и гидрофобных соединений, что приводит к увеличению их биодоступности (см., например, Kshirsagar, N.A., Pandya, S.K., Kirodian, В.G., and Sanath, S. (2005) Liposomal drug delivery system from laboratory to clinic, J. Postgrad. Med. 51, S5-S15; или Kalhapure, R.S., Suleman, N., Mocktar, C, Seedat, N., and Govender, T. (2015) Nanoengineered Drug Delivery Systems for Enhancing Antibiotic Therapy, J Pharm Sci-Us 104, 872-905). Использование липосом в качестве систем доставки лекарственных средств способствует целевой и избирательной транспортировке указанного лекарственного средства в соответствующие места организма человека. Это уменьшает побочные действия лекарственного средства в составе липосом и увеличивает эффективность и широту терапии, поскольку позволяет вводить меньшие дозы.

По существу, липосомные составы пригодны для большинства соединений благодаря специальным физико-химическим характеристикам липосомы. В водной липосомной дисперсии вещества с высоким коэффициентом распределения обнаруживаются только внутри липидного бислоя, независимо от их структуры или от размера липосом, в то время как вещества с низким коэффициентом распределения могут как находиться в дисперсии или разбавленном водном растворе дисперсии, так и быть инкапсулированными в гидрофильном пространстве липосом.

Тем не менее, в настоящее время фактическое терапевтическое применение заключенных в липосомы гидрофильных соединений незначительно по причине отсутствия универсального способа высокоэффективной инкапсуляции гидрофильных веществ в липосомы. Пассивная инкапсуляция, включающая получение липосом путем гидратации сухой липидной пленки посредством встряхивания в водном растворе, содержащем инкапсулируемое гидрофильное соединение, приводит к очень низкой эффективности инкапсуляции, часто не превышающей нескольких процентов. Кроме того, липосомы, полученные указанным способом, представляют собой мультиламеллярные везикулы (МЛВ), сильно варьирующиеся по размеру и форме (см., например, WO 01/13887, ЕР 1565164). Способ пассивной инкапсуляции можно модифицировать, подвергая дисперсию гидратированного липида гомогенизации (см., например, ЕР 0776194 A1, PL 396706 A1, PL 399298 A1, PL 388134 А1 и PL 399592 А1) или ультразвуковому воздействию (см., например, PL 389430 А1; или Watwe, R. М., и Bellare, J. R. (1995) Manufacture of Liposomes - a Review, Curr Sci India 68, 715-724) для получения суспензий с везикулами меньшего размера и более однородных по размерам. Тем не менее, указанные методики обычно приводят к получению суспензий низкой вязкости, в которых водная дисперсионная среда недостаточно структурирована липидными структурами, что, в свою очередь, приводит к низкой эффективности инкапсуляции. Обычно только около 5-15% от общего количества введенного в липидную пленку лекарственного средства инкапсулируется в везикулы. Кроме того, высокая энергия, применяемая во время гомогенизации или ультразвукового воздействия, вызывает нестабильность суспензии липосом, обусловленную окислением, и увеличивает риск функционального разложения чувствительных активных веществ, таких как белки или супрамолекулярные ассоциаты.

В другой группе методик инкапсуляции гидрофильных соединений в липосомы применяют смесь веществ с различной полярностью. Тем не менее, указанные методики не подходят для инкапсуляции большинства белков или других сложных молекулярных структур, поскольку неполярные растворители, применяемые в указанных методиках, необратимо изменяют структуру таких молекул. Кроме того, эффективность инкапсуляции в указанных методиках также неудовлетворительна. Например, в ЕР 0514435 В1 описан способ получения композиции липосомного геля, в котором фосфолипиды (15-30% масс.) растворяют путем встряхивания в водном растворе, содержащем одноатомный спирт в количестве 14-20% по массе, и полученные липосомы нагружают гидрофильными соединениями путем гомогенизации. Указанный способ обеспечивает структурирование водной фазы везикулами с липидными мембранами с малой вероятностью, что делает эффективность инкапсуляции низкой, в то время как одноатомные спирты обладают денатурирующими и раздражающими свойствами. В DE 4003783 А1 описан способ получения дисперсий липосом путем энергичного перемешивания фосфолипидов растительного происхождения в концентрациях до 30% по массе в присутствии одноатомного спирта (этанола или 2-пропанола) в количестве 15-20% по массе. В данном случае полученная содержащая липосомы водная дисперсия также не структурирована, и ожидается низкая эффективность инкапсуляции. Другой недостаток указанного способа заключается в том, что полученные путем перемешивания липосомы неоднородны по размерам.

Изменение полярности водного раствора, обеспечивающее образование липосом, также может быть достигнуто при использовании галогенированных углеводородов в качестве растворителя (WO 96/40061 А1) или при впрыскивании липидов, растворенных в хлор фторугл ер одном растворителе («фреон»), в водный раствор при высокой температуре (US 4752425). Однако ни в каком из указанных способов не достигается эффективность инкапсуляции гидрофильного вещества более 50%. Кроме того, необходимость применения высоких температур для испарения растворителей препятствует применению указанных способов для инкапсуляции белков и супрамолекулярных ассоциатов.

Другая альтернативная методика инкапсуляции гидрофильных веществ в липосомы включает образование комплексов гидрофильных частиц активного вещества с высоким электростатическим зарядом и амфифильных противоионов. В результате образуется амфифильный комплекс, который затем покрывают липидами. Указанный способ требует работы со смесями с различными полярностями, что технологически сложно. Кроме того, указанный способ можно применять только к сильно заряженным молекулам, т.е. нуклеиновым кислотам (см, например, Oh, Y. К., и Park, Т. G. (2009) siRNA delivery systems for cancer treatment Adv Drug Deliv Rev 61, 850-862), и он не подходит для инкапсуляции белков, которые денатурируются в присутствии гидрофобных жидкостей.

В качестве попытки значительно увеличить эффективность инкапсуляции гидрофильных пуриновых нуклеозидов и получить высокие внутрилипосомные концентрации лекарственных средств, в WO 95/15762 описан способ получения липосомных составов, включающий получение мультиламеллярных липосом, содержащих видарабин (или его производное), и воздействие на липосомы лиофилизации, управляемой регидратации и, необязательно, экструзии под давлением. Тем не менее, после экструзии достигалась максимальная эффективность инкапсуляции только 45%.

Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение липосом, содержащих гидрофильные соединения, а также способа получения таких липосом, причем указанные липосомы и способ в значительной степени преодолевают обсуждаемые выше проблемы известного уровня техники.

Конкретнее, целью настоящего изобретения является обеспечение липосом, стабильно инкапсулирующих большие количества гидрофильных соединений независимо от их прочих физико-химических свойств, таких как размер или заряд, включая, например, ионы, белки, пептиды, углеводы, природные и синтетические полимеры, нуклеиновые кислоты и производные нуклеиновых кислот, которые денатурируются в присутствии гидрофобных жидкостей.

Также целью настоящего изобретения является обеспечение способа инкапсуляции таких гидрофильных соединений в гидрофильное пространство липосом с эффективностью инкапсуляции до 100%. Неожиданно было обнаружено, что указанные цели достигаются при помощи настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящего изобретения предложена униламеллярная липосома (УЛ) с одним липидным бислоем, окружающим гидрофильное пространство, причем УЛ содержит: (i) по меньшей мере одно гидрофобное соединение, образующее липидный бислой, и (ii) пропиленгликоль или глицерин, причем гидрофильное пространство содержит по меньшей мере одно гидрофильное соединение, растворенное в гидрофильном растворителе, причем концентрация гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе составляет по меньшей мере 80% от концентрации насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа.

В варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, массовое отношение по меньшей мере одного гидрофобного соединения, образующего липидный бислой, к пропиленгликолю или глицерину составляет от 2:1 до 1:1.

В другом варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, массовое отношение по меньшей мере одного гидрофобного соединения, образующего липидный бислой, к по меньшей мере одному гидрофильному соединению составляет от 100:1 до 1:3, от 50:1 до 1:2 или от 25:1 до 1:1.

В другом варианте реализации настоящего изобретения, УЛ содержит по меньшей мере одно гидрофобное соединение в количестве от 15 до 40%, от 16 до 39%, от 17 до 38%, от 18 до 37%, от 19 до 35%, от 20 до 30%, от 21 до 25% или от 22 до 24% от массы УЛ, и предпочтительно, от 20 до 40% от массы УЛ.

В другом варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, по меньшей мере одно гидрофильное соединение выбрано из группы, состоящей из: (i) низкомолекулярных гидрофильных веществ с молекулярной массой от 100 Да до 1500 Да, от 200 Да до 1400 Да, от 300 Да до 1200 Да или от 500 Да до 1000 Да; и (ii) гидрофильных макромолекул с молекулярной массой от 1500 Да до 300 кДа, от 2 кДа до 280 кДа, от 5 кДа до 250 кДа, от 10 кДа до 200 кДа или от 50 кДа до 200 кДа.

В другом варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, по меньшей мере одно гидрофильное соединение выбрано из группы, состоящей из ионов, белков, пептидов, углеводов, природных и синтетических полимеров, нуклеиновых кислот, производных нуклеиновых кислот и комбинаций указанных соединений.

В другом варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, концентрация насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе составляет от 1 г до 500 г на 1000 мл гидрофильного растворителя, предпочтительно, от 10 г до 200 г.

В другом варианте реализации УЛ согласно первому аспекту, гидрофильный растворитель выбран из группы, состоящей из воды, водного буферного раствора, водного солевого раствора, водного раствора моно- или дисахарида и комбинаций указанных вариантов.

Во втором аспекте настоящего изобретения предложен способ инкапсуляции гидрофильных соединений в УЛ, включающий следующие стадии: (а) обеспечение раствора липида, содержащего по меньшей мере одно гидрофобное соединение и многоатомный спирт, выбранный из пропиленгликоля и глицерина; (b) обеспечение водной фазы, содержащей по меньшей мере одно гидрофильное соединение; (с) получение раствора гидратированного липида путем смешивания раствора липида со стадии (а) с водной фазой со стадии (b); и (d) экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) при температуре менее 80°С, причем по меньшей мере одно гидрофобное соединение образует однородную популяцию УЛ, причем указанные УЛ составляют более 50% от общего объема водной фазы.

В одном варианте реализации способа согласно второму аспекту, по меньшей мере одно гидрофильное соединение инкапсулируют в УЛ с эффективностью инкапсуляции, выбранной из по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%.

В другом варианте реализации способа согласно второму аспекту, многоатомный спирт содержится в растворе гидратированного липида на стадии (с) в концентрации от 5 до 30%, от 10 до 25%, от 15 до 22% или от 18 до 20% от массы раствора гидратированного липида.

В другом варианте реализации способа согласно второму аспекту, общая концентрация по меньшей мере одного гидрофобного соединения в растворе гидратированного липида на стадии (с) составляет от 15 до 40%, от 16 до 39%, от 17 до 38%, от 18 до 37%, от 19 до 35%, от 20 до 30%, от 21 до 25% или от 22 до 24% от массы указанного раствора гидратированного липида, и предпочтительно от 20 до 40% от массы указанного раствора гидратированного липида.

В другом варианте реализации способа согласно второму аспекту, по меньшей мере одно гидрофобное соединение выбрано из фосфолипидов, сфинголипидов или стеролов, предпочтительно, из фосфатидилхолина, и более предпочтительно, из очищенного соевого фосфатидилхолина.

В другом варианте реализации способа согласно второму аспекту, стадия (b) включает регулирование рН водной фазы, предпочтительно до рН в диапазоне от 5,0 до 7,5, от 6,0 до 7,4 или от 7,0 до 7,2.

В другом варианте реализации способа согласно второму аспекту, стадия (d) включает экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) при температуре менее 60°С, менее 40°С или менее 30°С, предпочтительно, при 20°С.

В другом варианте реализации, способ согласно второму аспекту включает дополнительную стадию (е), на которой многоатомный спирт, выбранный из пропиленгликоля и глицерина, удаляют из экструдиро ванного раствора гидратированного липида, полученного на стадии (d), предпочтительно, указанный многоатомный спирт удаляют из указанного экструдированного раствора гидратированного липида путем ультрафильтрации.

В третьем аспекте настоящего изобретения предложена УЛ, полученная при помощи способа согласно второму аспекту настоящего изобретения.

В четвертом аспекте настоящего изобретения предложена жидкая композиция, содержащая по меньшей мере одну УЛ согласно первому или третьему аспектам настоящего изобретения.

В одном варианте реализации указанного четвертого аспекта жидкая композиция обладает по меньшей мере одним из следующих свойств: (i) рН в диапазоне от 5,0 до 7,5, от 6,0 до 7,4 или от 7,0 до 7,2; (ii) осмолярность в диапазоне от 30 мОсм до 400 мОсм, от 40 мОсм до 300 мОсм или от 50 мОсм до 200 мОсм; (iii) общее мольное отношение гидрофильных соединений к гидрофобным соединениям между 10^-5 и 1. В предпочтительном варианте реализации жидкая композиция представляет собой водную композицию.

В другом варианте реализации четвертого аспекта настоящего изобретения жидкая композиция дополнительно содержит по меньшей мере один наполнитель, предпочтительно, указанный наполнитель выбран из группы, состоящей из: буферных агентов, осмотически активных агентов, консервантов, антиоксидантов, вкусоароматических агентов, ароматических агентов и комбинаций указанных добавок; предпочтительно, указанные осмотические агенты выбраны из одновалентных солей или сахаров, предпочтительно, из хлорида натрия и сахарозы.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к УЛ согласно первому или третьему аспектам, или к композиции согласно четвертому аспекту, для применения в терапии.

В шестом аспекте настоящее изобретение относится к применению УЛ согласно первому или третьему аспектам, или композиции согласно четвертому аспекту, в качестве лекарственного средства, косметического продукта, пищевой добавки или дезинфицирующего средства.

ЧЕРТЕЖИ

Фиг. 1: Графическое представление изменений вязкости в зависимости от скорости вращения шпинделя. График иллюстрирует результаты реометрических измерений, описанных в Примере 8. Испытанные образцы липосом содержали различные концентрации липида (10, 15, 20, 25% по массе) и были получены с использованием различных параметров экструзии. ФХ10%: концентрация липида в образце до экструзии 10% от массы указанного образца; ФХ15%: концентрация липида в образце до экструзии 15% от массы указанного образца; ФХ20%: концентрация липида в образце до экструзии 20% от массы указанного образца; ФХ25%: концентрация липида в образце до экструзии 25% от массы указанного образца; ФХ-MLV: образец без экструзии; ФХ-УЛ КТ: образец экструдирован при комнатной температуре, ФХ-УЛ Т70: образец экструдирован при 70°С.

Фиг. 2: Графическое представление значений вязкости в зависимости от концентрации липида. График иллюстрирует результаты реометрических измерений, описанных в Примере 8. Испытанные образцы липосом содержали различные концентрации липида (10, 15, 20, 25% по массе) и были получены с использованием различных параметров экструзии. Подробности см. в описании Фиг. 1.

Фиг. 3А, Фиг. 3В: Графическое представление распределения липосом по размеру и корреляционных данных. На графике показано распределение липосом по размеру в образцах, полученных в Примере 8, по данным динамического рассеяния света (ДРС) с подобранными корреляционными функциями, представляющими распределение частиц в измеренном образце, нанесенными на график. На Фиг. 3А показано распределение по размеру липосом в образцах, полученных с одним циклом экструзии, с содержанием липида 10% по массе. Коэффициент полидисперсности (K_n) этих образцов составляет по меньшей мере 0,2 (K_n>0,2). На Фиг. 3В показано распределение по размеру липосом в образцах, полученных с одним циклом экструзии, с содержанием липида 30% по массе. Коэффициент полидисперсности этих образцов составляет менее 0,2 (K_n<0,2).

Фиг. 4: Графическое представление зависимости размера липосом от концентрации липида и числа циклов экструзии при комнатной температуре. График иллюстрирует размеры липосом в образцах, полученных в Примере 8 путем экструзии при комнатной температуре, в зависимости от концентрации липида и числа циклов экструзии, необходимых для получения образцов с K_n<0,2. Для содержания липида 20-40% по массе были получены образцы с весьма однородным распределением липосом по размерам уже после первого цикла экструзии.

Фиг. 5: Графическое представление эмиссионных спектров образцов инкапсулированного в УЛ декстрана с флуоресцентной меткой (ФИТЦ-меченый) и папаина. График иллюстрирует спектры пермеата и ретентата, полученных при ультрафильтрации и фракционировании образцов, описанных в Примере 9. Декстран-ФИТЦ M_r 5000 ФХ 16% пермеат: эмиссионный спектр пермеата из образцов, содержащих инкапсулированный в УЛ меченый ФИТЦ декстран, 5 кДа, с общей концентрацией фосфатидилхолина (ФХ) 16% от массы образца; Декстран-ФИТЦ M_r 5000 ФХ 16% ретентат: эмиссионный спектр ретентата 6 из образцов, содержащих инкапсулированный в УЛ меченый ФИТЦ декстран, 5 кДа, с общей концентрацией ФХ 16% от массы образца; Папаин M_r 23000 ФХ 16% пермеат: эмиссионный спектр пермеата из образцов, содержащих инкапсулированный в УЛ папаин, 23 кДа, с общей концентрацией ФХ 16% от массы образца; Папаин M_r 23000 ФХ 16% ретентат: эмиссионный спектр ретентата из образцов, содержащих инкапсулированный в УЛ папаин, 23 кДа, с общей концентрацией ФХ 16% от массы образца.

Фиг. 6: Графическое представление эффективности инкапсуляции декстрана с флуоресцентной меткой (ФИТЦ-меченый) и папаина. График иллюстрирует эффективность инкапсуляции декстрана с флуоресцентной меткой, с молекулярной массой 5 кДа, и папаина с молекулярной массой 23 кДа, при помощи способа, описанного в Примере 9, в зависимости от концентрации липида в полученной суспензии УЛ.

Фиг. 7А, 7В: Изображение образцов, содержащих гидрофильные макромолекулы, инкапсулированные в гидрофильное пространство УЛ согласно настоящему изобретению. Изображения были получены при помощи просвечивающей электронной микроскопии. На Фиг. 7А показан инкапсулированный в УЛ нефракционированный гепарин. Гидродинамический диаметр структуры: 150 нм. На Фиг. 7 В показан инкапсулированный в УЛ полимер поливинилпирролидон (PVP) с ковалентно связанной молекулой хлорина Е6, с молекулярной массой 12 кДа. Гидродинамический диаметр структуры: 130 нм.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Перед тем, как настоящее изобретение будет ниже описано более подробно, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реактивами, указанными в настоящем описании, поскольку они могут варьироваться. Также следует понимать, что применяемая терминология используется только для описания конкретных вариантов реализации, и не предназначена ограничивать объем настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не определено иное, все технические и научные термины в настоящем описании имеют значения, обыкновенно понимаемые средним специалистом в данной области техники.

В тексте настоящего описания ссылаются на некоторые документы. Каждый из указанных документов (включая все патенты, заявки на патенты, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), как выше, так и ниже, полностью включены в настоящее описание посредством ссылок. Ничто в настоящем описании не должно рассматриваться как допущение, что настоящее изобретение неправомочно по причине противопоставления источника информации с более ранним приоритетом.

Ниже будут описаны элементы настоящего изобретения. Указанные элементы приведены с конкретными вариантами реализации, тем не менее, следует понимать, что их можно комбинировать любым образом в любом количестве для создания дополнительных вариантов реализации. Различные описанные примеры и предпочтительные варианты реализации не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение только явно описанными вариантами реализации. Настоящее описание следует рассматривать как вспомогательное и включающее варианты реализации, сочетающие явно описанные варианты реализации с любым числом описанных и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных в настоящей заявке элементов следует рассматривать как описанные в настоящем описании, если контекстом явно не предписывается иное.

В настоящем описании и формуле изобретения, если контекстом не предписывается иное, слово «содержать» и его варианты, такие как «содержит» и «содержащий», следует понимать как подразумевающее включение указанного числа или стадии, или группы чисел или стадий, но не исключение любого другого числа или стадии, или группы чисел или стадий. В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число соответствующих объектов, если контекстом явно не предписывается иное.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В следующей части будут подробнее описаны различные аспекты настоящего изобретения. Каждый описанный аспект можно комбинировать с любым другим аспектом или аспектами, если явно не указано иное. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или выгодный, можно комбинировать с любым другим признаком или признаками, указанными как предпочтительные или выгодные.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что большие количества гидрофильных соединений можно стабильно инкапсулировать в униламеллярные липосомы согласно настоящему изобретению. А именно, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что гидрофильное соединение, растворенное в гидрофильном растворителе, может быть инкапсулировано в гидрофильное пространство униламеллярной липосомы (УЛ) в концентрации по меньшей мере 80% от концентрации насыщения указанного гидрофильного соединения в указанном гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа, в том случае, если УЛ содержит пропиленгликоль или глицерин.

Успешная инкапсуляция таких больших количеств гидрофильных соединений в униламеллярные липосомы обеспечивает несколько преимуществ, в зависимости от пути введения указанных липосом. При парентеральном введении, как внутривенным, так и внутримышечным путем, липосомы могут обеспечивать управляемое замедленное высвобождение инкапсулированного гидрофильного компонента в течение длительного промежутка времени, и уменьшение побочных действий гидрофильного соединения благодаря ограничению концентрации свободного гидрофильного соединения в кровотоке. Липосомы могут изменять распределение в тканях и усвоение гидрофильных соединений в терапевтически желательном направлении, и увеличивать приемлемость терапии благодаря обеспечению возможности менее частого введения соединения.

Следовательно, согласно первому аспекту настоящего изобретения предложена униламеллярная липосома (УЛ) с одним липидным бислоем, окружающим гидрофильное пространство, причем указанная УЛ содержит: (i) по меньшей мере одно гидрофобное соединение, образующее липидный бислой, и (ii) пропиленгликоль или глицерин, причем гидрофильное пространство содержит по меньшей мере одно гидрофильное соединение, растворенное в гидрофильном растворителе, причем концентрация гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе составляет по меньшей мере 80% от концентрации насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа.

Униламеллярная липосома (УЛ)

Термин «униламеллярная липосома» или «УЛ» в настоящем описании относится к везикуле, образованной одним липидным бислоем, который окружает гидрофильное пространство. Указанный пузырек может иметь любую форму, включая эллипсоиды, дискоиды, грушевидные везикулы, чашевидные везикулы, почковидные везикулы и сферические везикулы. Предпочтительно, униламеллярная липосома согласно настоящему изобретению имеет по существу сферическую форму.

УЛ согласно настоящему изобретению могут представлять собой мелкие униламеллярные везикулы (МУВ) с диаметром до 100 нм, или большие униламеллярные везикулы (БУВ) с диаметром свыше 100 нм вплоть до 1 мкм. Предпочтительно, чтобы диаметр УЛ согласно настоящему изобретению составлял от 50 до 250 нм, от 100 до 200 нм или от 130 до 150 нм. Термин «диаметр» в настоящем описании относится к гидродинамическому диаметру, который следует понимать как размер гипотетической твердой сферы, диффундирующей так же, как измеряемая частица. Подходящие способы определения гидродинамического диаметра УЛ согласно настоящему изобретению, такие как динамическое рассеяние света (ДРС), известны специалистам в данной области техники.

УЛ согласно настоящему изобретению можно применять в терапии, или для получения лекарственного средства, косметического продукта, пищевой добавки или дезинфицирующего средства.

Липидный бислой

Термин «липидный бислой» в настоящем описании относится к замкнутой структуре, состоящей из двух липидных слоев, образованных самосборкой гидрофобных соединений.

Гидрофобное соединение

Термин «гидрофобное соединение» в настоящем описании относится к амфифильным липидным соединениям, содержащим одновременно полярные и неполярные участки. Предпочтительно указанное гидрофобное соединение выбрано из фосфолипидов, сфинголипидов и стеролов. Более предпочтительно, указанное гидрофобное соединение представляет собой фосфатидилхолин, еще более предпочтительно, очищенный соевый фосфатидилхолин.

В описанной в настоящей заявке УЛ неполярные цепи гидрофобных соединений направлены внутрь липидного бислоя, обращенные друг к другу, и таким образом составляют неполярную область между двумя полярными областями. Полученное таким образом липофильное внутреннее пространство между двумя липидными слоями действует как барьер проницаемости для гидрофильных веществ, как в направлении внутрь, так и в направлении наружу.

Полярные группы гидрофобных соединений обращены к окружающей среде и к внутреннему пространству замкнутой структуры, образованной липидным бислоем.

Предпочтительно, чтобы в УЛ согласно настоящему изобретению массовое отношение по меньшей мере одного гидрофобного соединения, образующего липидный бислой, и пропиленгликоля или глицерина, содержащегося в УЛ, составляло от 2:1 до 1:1. Подходящие способы определения указанного массового отношения хорошо известны специалисту в данной области техники, такие как ультрацентрифугирование для разделения соединений, ВЭЖХ с детектором испарительного рассеяния света (HPLC-ELSD) для определения концентрации гидрофобного соединения и газовая хроматография (ГХ) для определения концентрации пропиленгликоля и глицерина (см., например, Elmoslemany RM, Abdallah OY, El-Khordagui LK, Khalafallah NM. Propylene Glycol Liposomes as a Topical Delivery System for Miconazole Nitrate: Comparison with Conventional Liposomes. AAPS PharmSciTech. 2012;13(2):723-731. doi:10.1208/sl2249-012-9783-6).

Также предпочтительно, чтобы УЛ согласно настоящему изобретению содержала по меньшей мере одно гидрофобное соединение в количестве от 15 до 40%, от 16 до 39%, от 17 до 38%, от 18 до 37%, от 19 до 35%, от 20 до 30%, от 21 до 25% или от 22 до 24% от массы УЛ, и более предпочтительно, от 20 до 40% от массы УЛ.

Также предпочтительно, чтобы отношение по меньшей мере одного гидрофобного соединения, образующего липидный бислой, и по меньшей мере одного гидрофильного соединения, содержащегося в гидрофильном пространстве описанной УЛ, находилось в диапазоне от 100:1 до 1:3, от 50:1 до 1:2 или от 25:1 до 1:1. Указанное массовое отношение в УЛ можно определить при помощи способов, известных специалисту в данной области техники, например, путем экстракции гидрофобного соединения с последующим определением концентрации гидрофобного соединения при помощи ВЭЖХ с детектором испарительного рассеяния света. Выбор соответствующего метода анализа для определения гидрофильного соединения, в зависимости от физико-химических свойств указанного гидрофильного соединения, лежит в области компетенции среднего практикующего специалиста в данной области техники.

В одном варианте реализации УЛ согласно настоящему изобретению не содержит заряженных липидов.

Гидрофильное пространство

Термин «гидрофильное пространство» в настоящем описании относится к пространству, объединенному полярной внутренней поверхностью замкнутой структуры, образованной липидным бислоем. Гидрофильное пространство УЛ согласно настоящему изобретению содержит гидрофильный растворитель и по меньшей мере одно гидрофильное соединение, растворенное в указанном гидрофильном растворителе.

Гидрофильный растворитель

Термин «гидрофильный растворитель» в настоящем описании относится к любому растворителю, не смешивающемуся с октанолом. Предпочтительно, указанный термин относится к любому растворителю с величиной относительной диэлектрической проницаемости в диапазоне 75,0-80,1 при 20°С. В способе согласно настоящему описанию гидрофильный растворитель может быть выбран из группы, состоящей из воды, водного буферного раствора, водного солевого раствора, водного раствора моно- или дисахарида и комбинаций указанных вариантов.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% от массы гидрофильного растворителя содержалось в гидрофильном пространстве УЛ согласно настоящему изобретению. Наиболее предпочтительно, чтобы 100% от массы гидрофильного растворителя содержалось в гидрофильном пространстве УЛ согласно настоящему изобретению.

Гидрофильное соединение

Термин «гидрофильное соединение» в настоящем описании относится к любому соединению с отрицательным значением log Р (Р = коэффициент распределения октанол-вода). Коэффициент распределения можно определить при помощи любого способа, известного в данной области техники (см., например, J. Sangster: Octanol-WaterPartition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol.2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997). Предпочтительно, гидрофильное соединение выбрано из группы, состоящей из ионов, белков, пептидов, углеводов, природных и синтетических полимеров, нуклеиновых кислот, производных нуклеиновых кислот и комбинаций указанных соединений.

Также предпочтительно, чтобы по меньшей мере одно гидрофильное соединение было выбрано из группы, состоящей из: (i) низкомолекулярных гидрофильных веществ с молекулярной массой от 100 Да до 1500 Да, от 200 Да до 1400 Да, от 300 Да до 1200 Да или от 500 Да до 1000 Да; и (ii) гидрофильных макромолекул с молекулярной массой от 1500 Да до 300 кДа, от 2 кДа до 280 кДа, от 5 кДа до 250 кДа, от 10 кДа до 200 кДа или от 50 кДа до 200 кДа.

Концентрация гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе, содержащемся в УЛ согласно настоящему изобретению, составляет по меньшей мере 80% от концентрации насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа.

Термин «концентрация насыщения» в настоящем описании обозначает такую концентрацию гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа, при которой гидрофильный растворитель не способен растворить больше гидрофильного соединения, и дополнительные количества указанного гидрофильного соединения будут образовывать отдельную фазу, т.е. осадок. Подходящие способы определения концентрации насыщения гидрофильного соединения хорошо известны специалисту в данной области техники, например, метод колбы или колоночный метод, согласно руководству ОЭСР (OECD) для испытания растворимости в воде химикатов (см. Руководство ОЭСР для испытания химикатов, Часть 1, Испытание №1-5 Растворимость в воде).

Предпочтительно, концентрация насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе составляет от 1 г до 500 г на 1000 мл гидрофильного растворителя, более предпочтительно, от 10 г до 200 г на 1000 мл гидрофильного растворителя.

Кроме того, предпочтительно, чтобы общее мольное отношение гидрофильных соединений к гидрофобным соединениям, содержащимся в УЛ согласно настоящему изобретению, составляло более 1:100000.

Способ согласно настоящему изобретению

Кроме того, авторы настоящего изобретения разработали способ высокоэффективной инкапсуляции гидрофильных соединений в униламеллярные липосомы. Неожиданно было обнаружено, что более 50% от общего объема водной фазы, содержащей гидрофильное соединение, может быть стабильно инкапсулировано в УЛ с использованием многоатомного спирта, выбранного из пропиленгликоля и глицерина, в качестве растворителя гидрофобного соединения, образующего липидный бислой.

Следовательно, второй аспект настоящего изобретения относится к способу инкапсуляции гидрофильных соединений в УЛ, включающему следующие стадии: обеспечение раствора липида, содержащего по меньшей мере одно гидрофобное соединение и многоатомный спирт, выбранный из пропиленгликоля и глицерина; обеспечение водной фазы, содержащей по меньшей мере одно гидрофильное соединение; получение раствора гидратированного липида путем смешивания раствора липида со стадии (а) с водной фазой со стадии (b); и экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) при температуре менее 80°С, причем по меньшей мере одно гидрофобное соединение образует однородную популяцию УЛ, причем указанные УЛ содержат более 50% от общего объема водной фазы.

Предпочтительно, указанные УЛ содержат более 55%, более 60%, более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 95%, более 98% или более 99% от общего объема водной фазы.

Эффективность инкапсуляции

Вышеописанный способ согласно настоящему изобретению способствует получению стабильной содержащей УЛ суспензии с четко определенным распределением по размерам при помощи простого способа низкоэнергетической экструзии при комнатной температуре, при обеспечении высокой структурной стабильности инкапсулированного гидрофильного соединения и высокой эффективности инкапсуляции, соответственно.

По меньшей мере одно гидрофильное соединение может быть инкапсулировано в УЛ с эффективностью инкапсуляции, выбранной из по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%.

В контексте настоящего изобретения термин «эффективность инкапсуляции» относится к величине «а», выраженной в процентах [%], которую определяют согласно следующей формуле:

а=(C_tot - C_out)/C_tot

где «C_out» относится к концентрации гидрофильного соединения в той части водной фазы, которая остается вне гидрофильного пространства УЛ в образце, а «C_tot» относится к общей концентрации гидрофильного соединения в образце. Значения «C_out» и «C_tot» определяют при помощи спектроскопии.

Эффективная инкапсуляция гидрофильных соединений при помощи способа согласно настоящему изобретению достигается в результате высокого отношения инкапсулированного объема водной фазы, содержащей по меньшей мере одно гидрофильное соединение, к объему указанной водной фазы, остающейся снаружи УЛ. Это означает, что по меньшей мере половина от общего объема водной фазы, обеспеченной на стадии (b) способа согласно настоящему изобретению, содержится внутри липосом, полученных при помощи способа согласно настоящему изобретению.

Следовательно, композиция, полученная в способе согласно настоящему изобретению, содержит однородную совокупность УЛ, причем указанные УЛ содержат более 50%, более 55%, более 60%, более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 95%, более 98% или более 99% от общего объема водной фазы.

На стадии (b) способа согласно настоящему изобретению водная фаза, содержащая по меньшей мере одно гидрофильное соединение, может быть получена путем растворения указанного по меньшей мере одного гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе. Предпочтительно, концентрация гидрофильного соединения в водной фазе, обеспеченной на стадии (b), составляет по меньшей мере 80% от концентрации насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20°С и 101 кПа. Концентрация насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе может находиться в диапазоне от 1 г до 500 г на 1000 мл гидрофильного растворителя, и предпочтительно, в диапазоне от 10 г до 200 г на 1000 мл гидрофильного растворителя.

Стадия (b) способа согласно настоящему изобретению может дополнительно включать регулировку рН водной фазы, предпочтительно, до рН в диапазоне от 5,0 до 7,5, от 6,0 до 7,4 или от 7,0 до 7,2. Предпочтительно осуществлять указанную регулировку рН при температуре 20°С. Подходящие способы измерения и регулировки рН жидких растворов известны специалистам в данной области техники.

В способе согласно настоящему изобретению предпочтительно, чтобы многоатомный спирт содержался в растворе гидратированного липида на стадии (с) в концентрации от 5 до 30%, от 10 до 25%, от 15 до 22% или от 18 до 20% от массы раствора гидратированного липида.

Концентрация гидрофобного соединения

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что при высокой концентрации по меньшей мере одного гидрофобного соединения, содержащегося в растворе гидратированного липида, полученном на стадии (с) способа согласно настоящему изобретению, получают суспензию УЛ с высокой плотностью расположения липидных бислоев указанных УЛ. Следовательно, общая концентрация по меньшей мере одного гидрофобного соединения в растворе гидратированного липида, полученном на стадии (с), может составлять от 15 до 40%, от 16 до 39%, от 17 до 38%, от 18 до 37%, от 19 до 35%, от 20 до 30%, от 21 до 25% или от 22 до 24% от массы указанного раствора гидратированного липида.

Особенно предпочтительно, чтобы общая концентрация по меньшей мере одного гидрофобного соединения в растворе гидратированного липида, полученном на стадии (с), составляла от 20 до 40% от массы указанного раствора гидратированного липида, от 20 до 30% от массы указанного раствора гидратированного липида или от 30 до 40% от массы указанного раствора гидратированного липида. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что один цикл экструзии такой концентрированной суспензии УЛ дополнительно улучшает эффективность инкапсуляции способа согласно настоящему описанию до 99% и обеспечивает высокую вязкость суспензии УЛ, не менее 4000 сП (6 об./мин, КТ) без применения дополнительных гелеобразующих или загущающих агентов. Предпочтительно, вязкость получаемой суспензии УЛ составляет по меньшей мере 5000 сП, по меньшей мере 7000 сП или по меньшей мере 10000 сП (6 об./мин, КТ).

По меньшей мере одно гидрофобное соединение может быть выбрано из фосфолипидов, сфинголипидов или стеролов. Предпочтительно, по меньшей мере одно гидрофобное соединение выбрано из фосфатидилхолина, более предпочтительно, из очищенного соевого фосфатидилхолина. В одном из вариантов реализации раствор гидратированного липида на стадии (с) не содержит заряженных липидов.

Экструзия

Экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) на стадии (d) можно осуществлять при температуре менее 80°С, менее 60°С или менее 40°С.

Неожиданно было обнаружено, что способ согласно настоящему изобретению обеспечивает инкапсуляцию гидрофильных макромолекул в описанные УЛ с эффективностью, превышающей 95%, уже после одного цикла экструзии при комнатной температуре.

Следовательно, предпочтительно, чтобы стадия (d) способа согласно настоящему изобретению включала экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) при температуре менее 30°С, и более предпочтительно, при комнатной температуре (20°С). Кроме того, предпочтительно, чтобы способ согласно настоящему изобретению включал один цикл экструзии. Наиболее предпочтительно, стадия (d) способа согласно настоящему изобретению включает экструзию раствора гидратированного липида со стадии (с) при комнатной температуре (20°С) в единственном цикле экструзии.

Термин «цикл экструзии» в настоящем описании относится к одному проходу раствора гидратированного липида со стадии (с) через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм.

Дополнительные стадии способа

За стадией экструзии (d) способа согласно настоящему изобретению может следовать дополнительная стадия (f) удаления глицерина или пропиленгликоля из содержащей УЛ суспензии, полученной на стадии экструзии (d). Предпочтительно, указанное удаление многоатомного спирта осуществляют путем ультрафильтрации. В особенно предпочтительных вариантах реализации содержащую УЛ суспензию, полученную на стадии экструзии (d), пропускают через систему ультрафильтрации (например, MicroKros MWCO 70kD лабораторного масштаба или коммерчески доступные кассеты для более крупных синтезов), а затем промывают изоосмотической водной фазой. Количество многоатомного спирта, остающегося в суспензии липосом после стадии ультрафильтрации, пропорционально объемной доле образца и применяемой водной фазы. Предпочтительно, указанное количество составляет менее 1%, менее 0,8%, менее 0,5%, менее 0,4%, менее 0,3%, менее 0,2% или менее 0,1% от массы содержащей УЛ суспензии.

Способ согласно настоящему изобретению может включать дополнительную стадию разбавления содержащей УЛ суспензии, полученной на стадии (d) или (е), предпочтительно, путем добавления солевого раствора, более предпочтительно, стерильного солевого раствора.

Альтернативно, указанная дополнительная стадия способа может включать лиофилизацию или высушивание распылением содержащей УЛ суспензии, полученной на стадии (d) или (е), для обеспечения твердой содержащей липосомы композиции, такой как порошок липосом.

Наполнители

Способ согласно настоящему изобретению может дополнительно включать введение по меньшей мере одного наполнителя, который может быть выбран из группы, состоящей из: буферных агентов, осмотически активных агентов, консервантов, антиоксидантов, вкусоароматических агентов, ароматических агентов и комбинаций указанных добавок. Предпочтительно, указанные осмотические агенты выбраны из одновалентных солей или сахаров, более предпочтительно, из хлорида натрия и сахарозы. Кроме того, предпочтительно, чтобы способ согласно настоящему изобретению включал введение осмотического агента в таком количестве, чтобы осмолярность конечного продукта находилась в диапазоне от 30 мОсм до 400 мОсм.

Композиции согласно настоящему изобретению

В третьем аспекте настоящего изобретения предложена композиция, содержащая по меньшей мере одну УЛ согласно настоящему изобретению. В четвертом аспекте настоящего изобретения предложена композиция, полученная при помощи способа согласно настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения термин «композиция» относится как к композиции согласно третьему аспекту, так и к композиции согласно четвертому аспекту, соответственно, и включает жидкие, полутвердые и твердые композиции. Композиция согласно настоящему изобретению может представлять собой жидкую композицию, предпочтительно, водную жидкую композицию, такую как водный раствор или суспензия, или полутвердую композицию, такую как мазь или гель.

Композиция согласно настоящему изобретению может также представлять собой твердую композицию, предпочтительно, порошкообразную композицию, такую как лиофилизированная или высушенная распылением порошкообразная композиция.

Композиция согласно настоящему описанию может быть выбрана из фармацевтической композиции, косметической композиции, пищевой композиции, композиции пищевой добавки или композиции дезинфицирующего средства. В случае если композиция согласно настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, предпочтительно, чтобы гидрофильное соединение представляло собой фармацевтически активный агент или лекарственное соединение.

Композиция согласно настоящему описанию может дополнительно содержать по меньшей мере один наполнитель. Предпочтительно, указанный наполнитель выбран из группы, состоящей из: буферных агентов, осмотически активных агентов, консервантов, антиоксидантов, вкусоароматических агентов, ароматических агентов и комбинаций указанных добавок; предпочтительно, указанные осмотические агенты выбраны из одновалентных солей или сахаров, более предпочтительно, из хлорида натрия и сахарозы.

Предпочтительно, композиция согласно настоящему изобретению обладает по меньшей мере одним из следующих свойств: (i) рН в диапазоне от 5,0 до 7,5, от 6,0 до 7,4 или от 7,0 до 7,2; (ii) осмолярность в диапазоне от 30 мОсм до 400 мОсм, от 40 мОсм до 300 мОсм или от 50 мОсм до 200 мОсм; и/или (iii) общее мольное отношение гидрофильных соединений к гидрофобным соединениям между 10^-5 и 1.

Кроме того, предпочтительно, чтобы композиция согласно настоящему описанию имела вязкость по меньшей мере 4000 сП (6 об./мин, КТ), по меньшей мере 5000 сП (6 об./мин, КТ), по меньшей мере 7000 сП (6 об./мин, КТ) или по меньшей мере 10000 сП (6 об./мин, КТ).

Применение УЛ и композиции согласно настоящему изобретению

Описанные униламеллярные липосомы (УЛ) или композицию можно применять в качестве лекарственного средства, косметического продукта, пищевой добавки или дезинфицирующего средства, соответственно. В одном из вариантов реализации УЛ или композицию согласно настоящему изобретению применяют в терапии.

Описанную композицию можно применять без дополнительных модификаций в качестве дерматологического или косметического продукта в форме мази.

Описанную композицию можно также применять в разведенной форме. Если гидрофильное вещество, инкапсулированное в УЛ, предназначено для системного применения в качестве медицинского продукта, композицию согласно настоящему изобретению предпочтительно разбавляют изотоническим раствором, который не изменяет количество гидрофильного соединения, инкапсулированного в УЛ. Такие разбавленные суспензии УЛ можно применять для введения пептидов, полных белков, полимеров, сахаров или нуклеиновых кислот в терапевтических применениях. В настоящее время фармацевтическое применение таких соединений ограничено по причине их незамедлительного удаления из физиологических текучих сред. Это особенно важно для перорального введения, при котором белки, полимеры, сахара или нуклеиновые кислоты гидролизуются в процессе пищеварения.

Следовательно, в целом, главные препятствия для разработки и терапевтического применения биологических лекарственных средств преодолеваются благодаря настоящему изобретению.

Настоящее изобретение описано при помощи следующих примеров, которые следует рассматривать только как иллюстрации, а не как ограничения объема настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

1000 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) растворяли в 750 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 3250 мг водной фазы, содержащей 5 мг декстрана с флуоресцентной меткой (M_r 5 кДа) в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм.

В результате получали суспензию липосом с концентрацией липида 20% от массы суспензии, причем 96% меченого декстрана было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).

ПРИМЕР 2

1500 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) растворяли в 1000 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 2500 мг водной фазы, содержащей 5 мг декстрана с флуоресцентной меткой (M_r 5 кДа) в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм.

В результате получали суспензию липосом с концентрацией липида 30% от массы суспензии, причем 96% меченого декстрана было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).

ПРИМЕР 3

2000 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) растворяли в 1000 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 2000 мг водной фазы, содержащей 5 мг декстрана с флуоресцентной меткой (M_r 5 кДа) в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм.

В результате получали суспензию липосом с концентрацией липида 40% от массы суспензии, причем 99% меченого декстрана было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).

ПРИМЕР 4

1500 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) растворяли в 1000 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 2500 мг водной фазы, содержащей 50 мг папаина (M_r 23 кДа) в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм.

В результате получали суспензию липосом с концентрацией липида 30% от массы суспензии, причем 99% папаина было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).

ПРИМЕР 5

Сильно концентрированный продукт витамина С для применения в качестве добавки или пищевой добавки при лечении рака получали с использованием следующих ингредиентов:

Продукт получали, растворяя 210 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) в 180 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ, 60 об./мин) до получения однородного желтого раствора липида. Полученный раствор смешивали (12 ч, КТ, 200 об./мин) с 590 мг водной фазы, содержащей 210 мг витамина С в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Последовательно добавляли ЭДТА, натуральный ароматизатор и подсластитель, и перемешивали (0,5 ч, КТ, 60 об./мин) для получения готового продукта.

ПРИМЕР 6

Сильно концентрированный состав железа для применения в качестве добавки или пищевой добавки при лечении анемии получали с использованием следующих ингредиентов:

Продукт получали, растворяя 220 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) в 180 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ, 60 об./мин) до получения однородного желтого раствора липида. Полученный раствор смешивали (12 ч, КТ, 200 об./мин) с 580 мг водной фазы, содержащей 20 мг дифосфата железа(III) в фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,2). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Последовательно добавляли витамин Е в качестве антиоксиданта, натуральный ароматизатор и подсластитель, и перемешивали (0,5 ч, КТ, 60 об./мин) для получения готового продукта.

ПРИМЕР 7

Медицинский продукт для применения в генной терапии получали с использованием следующих ингредиентов:

Продукт получали, растворяя 240 мг фосфатидилхолина, 10 мг метилсульфата N-[1-(2,3-диолеилокси)-пропил]-N,NJ,N-триметиламмония (DOTAP) и 20 мг 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DOPE) в 200 мг пропиленгликоля (Chempur) при перемешивании (4 ч, КТ, 60 об./мин) до получения однородного желтого раствора липида. Полученный раствор смешивали (12 ч, КТ, 200 об./мин) с 530 мг водной фазы, содержащей 20 мг дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в фосфатно-солевом буферном растворе 1х (ФСБ). Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Полученный продукт лиофилизировали или разбавляли солевым раствором для непосредственного применения.

ПРИМЕР 8

Для оптимизации способа получения униламеллярных липосом (УЛ) было получено несколько содержащих липосомы образцов с использованием составов и параметров, показанных в Таблице 1, и определены вязкость и распределение липосом по размерам в указанных образцах.

На первой стадии способа получения образцов, содержащих униламеллярные липосомы (УЛ), получали раствор липида путем смешивания фосфатидилхолина и пропиленгликоля и выдержки полученной смеси в течение нескольких часов при комнатной температуре до полного растворения фосфатидилхолина. К полученному прозрачному желтому раствору липида добавляли дистиллированную воду в количестве, необходимом для получения готового образца массой 10 г. Образец энергично перемешивали до получения однородной белой суспензии фосфолипида.

Полученную суспензию мультиламеллярных липосом (МЛП) разделяли на три равные части. Одну часть подвергали определению вязкости (некалиброванная часть). Две другие части калибровали путем экструзии через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 100 нм. Экструзию проводили при комнатной температуре (КТ) или при 70°С, соответственно, до получения однородного распределения по размерам полученных униламеллярных липосом (УЛ) в образце.

Вязкость полученных содержащих липосомы образцов определяли на реометре Брукера, снабженном системой измерения конус-плоскость. Небольшое количество образца (0,1-0,2 г) помещали в термостатируемую измерительную камеру и проводили определение изменения вязкости в зависимости от скорости вращения конуса. Измерения проводили при комнатной температуре (20°С). Результаты измерений вязкости показаны на Фиг. 1 и Фиг. 2.

Кроме того, определяли распределение липосом по размерам в полученных образцах при помощи динамического рассеяния света (ДРС) при помощи прибора Malvern ZetaSizer Nano ZS, после разбавления образцов дистиллированной водой в соотношении 1:100. Результаты определения размеров показаны на Фиг. 3А, Фиг. 3В и Фиг. 4.

Результаты

В результате оптимизации способа получения униламеллярных липосом (УЛ) было обнаружено, что образование УЛ наблюдается после экструзии при низком давлении при комнатной температуре. Кроме того, было обнаружено, что предпочтительное количество липида в экструдированных образцах составляет по меньшей мере 20% по массе. Кроме того, было обнаружено, что концентрация липида, большая или равная 20% по массе, способствует получению монодисперсной совокупности липосом (K_n<0,2) при однократном пропускании через поликарбонатный фильтр, в отличие от образцов, содержащих меньшие количества липида.

ПРИМЕР 9

Для демонстрации высокой эффективности способа инкапсуляции согласно настоящему изобретению в отношении гидрофильных макромолекул были получены образцы согласно Примерам 1-4 путем смешивания раствора липида в пропиленгликоле с водным раствором гидрофильного полимера с флуоресцентной меткой (ФИТЦ-меченый декстран, 5 кДа) или белка (папаин с молекулярной массой 23 кДа),соответственно, и экструзии полученных суспензий через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Концентрация липида в полученных суспензиях УЛ составляла от 20% до 40% от массы указанных суспензий.

Размер УЛ подтверждали при помощи методики ДРС, как описано в Примере 8, после разбавления образца дистиллированной водой в соотношении 1:100.

Концентрации инкапсулированного в УЛ полимера с флуоресцентной меткой или белка определяли при помощи спектроскопии. Для этого образцы подвергали ультрафильтрации через кассету Biomax-50 (Merck Millipore) с пороговым диапазоном 140-300 кДа для определения концентрации гидрофильного соединения в обеих частях, а именно снаружи липосом (фракция пермеат) и внутри липосом (фракция ретентат). Получали стационарные эмиссионные спектры флуоресценции на спектрофлуориметре Thermo Scientific Nicolet Evolution 100 UV-VIS. Диапазон длин волн возбуждения устанавливали 280 нм и 490 нм для папаина и декстрана с флуоресцентной меткой (ФИТЦ-декстран), соответственно.

Эффективность инкапсуляции определяли согласно приведенной выше формуле. Коротко, эффективность инкапсуляции «а», выраженную в процентах [%], определяли согласно следующей формуле:

а=(C_tot - C_out)/C_tot

где «C_out» относится к концентрации гидрофильного соединения в той части водной фазы, которая остается вне гидрофильного пространства УЛ в образце, а «C_tot» относится к общей концентрации гидрофильного соединения в образце.

Результаты

Во всех образцах однородная совокупность УЛ, со средним диаметром около 100 нм и K_n<0,2, была получена после одного цикла экструзии, при этом почти 100% декстрана или папаина, соответственно, были инкапсулированы в УЛ. Эмиссионные спектры фильтрата (пермеата) и инкапсулированной в УЛ водной фракции (ретентата) для образцов, содержащих папаин и декстран с флуоресцентной меткой, соответственно, показаны на Фиг. 5.

Конкретнее, способ согласно настоящему изобретению показал достижение инкапсуляции указанных гидрофильных макромолекул в указанные УЛ с эффективностью, превышающей 95%. Расчетная эффективность инкапсуляции показана на Фиг. 6 в зависимости от концентрации липида в образце.

ПРИМЕР 10

Для подтверждения высокой эффективности представленной методики инкапсуляции для гидрофильных макромолекул, а также целостности полученных структур, были получены изображения составов УЛ согласно настоящему изобретению, содержащих нефракционированный гепарин и ПВП с ковалентно связанной молекулой хлорина Е6, соответственно, при помощи просвечивающей электронной микроскопии (см. Фиг. 7). Полученные изображения подтверждают эффективность инкапсуляции гидрофильных макромолекул в УЛ согласно настоящему изобретению и высокую эффективность способа инкапсуляции согласно настоящему изобретению.

ПРИМЕР 11

Для дальнейшей демонстрации высокой эффективности способа инкапсуляции согласно настоящему изобретению для гидрофильных макромолекул, растворяли 1000 мг Фосфолипона 90G (Липоид AG) в 1000 мг глицерина (РСС, Poland) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 2000 мг водного раствора, содержащего 10 мг альбумина (M_r более 66 кДа) в 0,1 М NaCl. Эффективность инкапсуляции определяли, как описано в Примере 9 выше.

В результате получали суспензию УЛ с концентрацией липида 25% от массы указанной суспензии, причем 83% альбумина было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).

ПРИМЕР 12

Для дальнейшей демонстрации высокой эффективности способа инкапсуляции согласно настоящему изобретению для гидрофильных макромолекул, растворяли 25 г Фосфолипона 90G (Липоид AG) в 25 г глицерина (РСС, Poland) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 50 г водной фазы, содержащей 0,5% масс./масс, гепарина в 0,1 М NaCl. Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Для оценки эффективности инкапсуляции полученные суспензии УЛ подвергали ультрафильтрации через кассету Biomax-50 (Merck Millipore) с пороговым диапазоном 140-300 кДа для определения концентрации гидрофильного соединения в обеих частях, а именно снаружи липосом (фракция пермеат) и внутри липосом (фракция ретентат). Концентрации растворенного и инкапсулированного в УЛ гепарина определяли при помощи ВЭЖХ с детектором испарительного рассеяния света и колонкой ГПХ.

В результате получали суспензии УЛ с концентрацией липида 25% от массы указанной суспензии, причем 56% гепарина было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).

ПРИМЕР 13

Для дальнейшей демонстрации высокой эффективности способа инкапсуляции согласно настоящему изобретению для гидрофильных макромолекул, растворяли 30 г Фосфолипона 90G (Липоид AG) в 20 г глицерина (РСС, Poland) при перемешивании (4 ч, КТ) до получения однородного желтого раствора липида, а затем смешивали с 50 г водной фазы, содержащей 0,5% масс./масс, гепарина в 0,1 М NaCl. Полученную смесь однократно экструдировали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Для оценки эффективности инкапсуляции полученные суспензии УЛ подвергали ультрафильтрации через кассету Biomax-50 (Merck Millipore) с пороговым диапазоном 140-300 кДа для определения концентрации гидрофильного соединения в обеих частях, а именно снаружи липосом (фракция пермеат) и внутри липосом (фракция ретентат). Концентрации растворенного и инкапсулированного в УЛ гепарина определяли при помощи ВЭЖХ с детектором испарительного рассеяния света и колонкой ГПХ.

В результате получали суспензии УЛ с концентрацией липида 30% от массы указанной суспензии, причем 80% гепарина было инкапсулировано в униламеллярные липосомы (УЛ).

Настоящая группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, в частности к высокоэффективной инкапсуляции в липосомы гидрофильных веществ. Униламеллярная липосома (УЛ) с одним липидным бислоем, окружающим гидрофильное пространство, для инкапсулирования гидрофильных веществ, содержащая: (i) по меньшей мере одно гидрофобное соединение, образующее липидный бислой, и (ii) пропиленгликоль или глицерин, в которой гидрофильное пространство содержит по меньшей мере одно гидрофильное соединение, растворенное в гидрофильном растворителе, причем концентрация гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе составляет по меньшей мере 80 % от концентрации насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20 °C и 101 кПа, и где указанная УЛ содержит по меньшей мере одно гидрофобное соединение в количестве от 15 до 40 % от массы УЛ. Жидкая композиция, содержащая по меньшей мере одну УЛ для инкапсулирования гидрофильных веществ. Способ инкапсуляции гидрофильных соединений в УЛ, включающий определённые стадии. Применение УЛ в качестве лекарственного средства. Применение УЛ в качестве косметического продукта. Применение УЛ в качестве пищевой добавки. Применение УЛ в качестве дезинфицирующего средства. Применение композиции в качестве лекарственного средства. Применение композиции в качестве косметического продукта. Применение композиции в качестве пищевой добавки. Применение композиции в качестве дезинфицирующего средства. Технический результат заключается в обеспечении способа инкапсуляции гидрофильных соединений в гидрофобное пространство липосом с высокой эффективностью инкапсуляции. 12 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 13 пр.

1. Униламеллярная липосома (УЛ) с одним липидным бислоем, окружающим гидрофильное пространство, для инкапсулирования гидрофильных веществ, содержащая:

(i) по меньшей мере одно гидрофобное соединение, образующее липидный бислой, и

(ii) пропиленгликоль или глицерин,

в которой гидрофильное пространство содержит по меньшей мере одно гидрофильное соединение, растворенное в гидрофильном растворителе, причем концентрация гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе составляет по меньшей мере 80 % от концентрации насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе при 20 °C и 101 кПа,

и где указанная УЛ содержит по меньшей мере одно гидрофобное соединение в количестве от 15 до 40 % от массы УЛ.

2. УЛ по п. 1, в которой массовое отношение по меньшей мере одного гидрофобного соединения, образующего липидный бислой, к пропиленгликолю или глицерину составляет от 2:1 до 1:1.

3. УЛ по любому из пп. 1, 2, в которой массовое отношение по меньшей мере одного гидрофобного соединения, образующего липидный бислой, к по меньшей мере одному гидрофильному соединению составляет от 100:1 до 1:3, от 50:1 до 1:2 или от 25:1 до 1:1.

4. УЛ по любому из пп. 1-3, в которой указанная УЛ содержит по меньшей мере одно гидрофобное соединение в количестве, выбранном из группы, состоящей из от 20 до 40 %, от 16 до 39 %, от 17 до 38 %, от 18 до 37 %, от 19 до 35 %, от 20 до 30 %, от 21 до 25 % или от 22 до 24 % от массы УЛ.

5. УЛ по любому из пп. 1-4, в которой указанное по меньшей мере одно гидрофильное соединение выбрано из группы, состоящей из:

(i) низкомолекулярных гидрофильных веществ с молекулярной массой от 100 до 1500 Да, от 200 до 1400 Да, от 300 до 1200 Да или от 500 до 1000 Да; и

(ii) гидрофильных макромолекул с молекулярной массой от 1500 Да до 300 кДа, от 2 до 280 кДа, от 5 до 250 кДа, от 10 до 200 кДа или от 50 до 200 кДа.

6. УЛ по любому из пп. 1-5, в которой указанное по меньшей мере одно гидрофильное соединение выбрано из группы, состоящей из ионов, белков, пептидов, углеводов, природных и синтетических полимеров, нуклеиновых кислот, производных нуклеиновых кислот и комбинаций указанных соединений.

7. УЛ по любому из пп. 1-6, в которой концентрация насыщения гидрофильного соединения в гидрофильном растворителе составляет от 1 до 500 г на 1000 мл гидрофильного растворителя, предпочтительно, от 10 до 200 г.

8. УЛ по любому из пп. 1-7, в которой указанный гидрофильный растворитель выбран из группы, состоящей из воды, водного буферного раствора, водного солевого раствора, водного раствора моно- или дисахарида и комбинаций указанных вариантов.

9. УЛ по п. 1, в которой по меньшей мере одно гидрофобное соединение выбрано из фосфолипидов или сфинголипидов.

10. Жидкая композиция, содержащая по меньшей мере одну УЛ для инкапсулирования гидрофильных веществ по любому из пп. 1-9.

11. Жидкая композиция по п. 10, в которой указанная композиция обладает по меньшей мере одним из следующих свойств:

(i) pH в диапазоне от 5,0 до 7,5, от 6,0 до 7,4 или от 7,0 до 7,2;

(ii) осмолярность в диапазоне от 30 до 400 мОсм, от 40 до 300 мОсм или от 50 до 200 мОсм;

(iii) общее мольное отношение гидрофильных соединений к гидрофобным соединениям между 10^-5 и 1;

предпочтительно, указанная композиция представляет собой водную композицию.

12. Жидкая композиция по п. 10 или 11, дополнительно содержащая по меньшей мере один наполнитель, предпочтительно, указанный наполнитель выбран из группы, состоящей из: буферных агентов, осмотически активных агентов, консервантов, антиоксидантов, вкусоароматических агентов, ароматических агентов и комбинаций указанных добавок; предпочтительно, указанные осмотические агенты выбраны из одновалентных солей или сахаров, предпочтительно, из хлорида натрия и сахарозы.

13. Способ инкапсуляции гидрофильных соединений в УЛ, включающий следующие стадии:

(a) обеспечение раствора липида, содержащего по меньшей мере одно гидрофобное соединение и многоатомный спирт, выбранный из пропиленгликоля и глицерина;

(b) обеспечение водной фазы, содержащей по меньшей мере одно гидрофильное соединение;

(c) получение раствора гидратированного липида путем смешивания раствора липида со стадии (a) с водной фазой со стадии (b); и

(d) экструзию раствора гидратированного липида со стадии (c) при температуре

менее 80 °C,

причем по меньшей мере одно гидрофобное соединение образует однородную популяцию УЛ, где указанные УЛ составляют более 50 % от общего объема водной фазы,

и общая концентрация по меньшей мере одного гидрофобного соединения в растворе гидратированного липида на стадии (c) составляет от 15 до 40 % от массы указанного раствора гидратированного липида.

14. Способ по п. 13, в котором указанное по меньшей мере одно гидрофильное соединение инкапсулируют в УЛ с эффективностью инкапсуляции, выбранной из по меньшей мере 50 %, по меньшей мере 55 %, по меньшей мере 60 %, по меньшей мере 65 %, по меньшей мере 70 %, по меньшей мере 75 %, по меньшей мере 80 %, по меньшей мере 85 %, по меньшей мере 90 %, по меньшей мере 95 %, по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 %.

15. Способ по п. 13 или 14, в котором многоатомный спирт содержится в растворе гидратированного липида на стадии (c) в концентрации от 5 до 30 %, от 10 до 25 %, от 15 до 22 % или от 18 до 20 % от массы раствора гидратированного липида.

16. Способ по любому из пп. 13-15, в котором общая концентрация по меньшей мере одного гидрофобного соединения в растворе гидратированного липида на стадии (c) выбрана из группы, включающей от 20 до 40 %, от 16 до 39 %, от 17 до 38 %, от 18 до 37 %, от 19 до 35 %, от 20 до 30 %, от 21 до 25% или от 22 до 24 % от массы указанного раствора гидратированного липида.

17. Способ по любому из пп. 13-16, в котором указанное по меньшей мере одно гидрофобное соединение выбрано из фосфолипидов, сфинголипидов или стеролов, предпочтительно, из фосфатидилхолина, и более предпочтительно, из очищенного соевого фосфатидилхолина.

18. Способ по любому из пп. 13-17, в котором стадия (b) включает регулирование pH водной фазы, предпочтительно до pH в диапазоне от 5,0 до 7,5, от 6,0 до 7,4 или от 7,0 до 7,2.

19. Способ по любому из пп. 13-18, дополнительно включающий стадию (e), на которой многоатомный спирт, выбранный из пропиленгликоля и глицерина, удаляют из экструдированного раствора гидратированного липида, полученного на стадии (d), предпочтительно, указанный многоатомный спирт удаляют из указанного экструдированного раствора гидратированного липида путем ультрафильтрации.

20. Униламеллярная липосома (УЛ) для инкапсулирования гидрофильных веществ, полученная способом по любому из пп. 13-19.

21. УЛ по любому из пп. 1-9 или 20 для применения в терапии.

22. Композиция по любому из пп. 10-12 для применения в терапии.

23. Применение УЛ по любому из пп. 1-9 или 20 в качестве лекарственного средства.

24. Применение УЛ по любому из пп. 1-9 или 20 в качестве косметического продукта.

25. Применение УЛ по любому из пп. 1-9 или 20 в качестве пищевой добавки.

26. Применение УЛ по любому из пп. 1-9 или 20 в качестве дезинфицирующего средства.

27. Применение композиции по любому из пп. 10-12 в качестве лекарственного средства.

28. Применение композиции по любому из пп. 10-12 в качестве косметического продукта.

29. Применение композиции по любому из пп. 10-12 в качестве пищевой добавки.

30. Применение композиции по любому из пп. 10-12 в качестве дезинфицирующего средства.