СПОСОБ ОЦЕНКИ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА МИКРОМИЦЕТОВ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/37 C12N9/50 C12N1/14 

Изобретение относится к области биотехнологии. В настоящее время одними из наиболее эффективных средств для борьбы с тромботическими осложнениями с точки зрения современной медицины являются терапевтические субстанции - активаторы плазминогена. Они способны оказывать стимулирующее действие на собственную систему тромболизиса человека, одновременно освобождая кровеносное русло от тромбов и при этом не вызывая серьезных последствий, связанных с обильными кровотечениями и ретромбозами. Применение подобных средств в России (например, стрептокиназы, урокиназы, альтеплазы или аналогов) ограничено в связи с довольно высокой стоимостью и значительными рисками непереносимости: кровопотерей, возникновения разнообразных реакций гиперчувствительности организма и обширных кровоизлияний в жизненно-важные органы (Osmolovskiy et al., 2018).

Инновационным подходом к решению проблемы терапии и диагностики тромбозов может стать использование терапевтических субстанций, основанных на протеолитических ферментах микроскопических грибов - микромицетов. Характерной особенностью всех микромицетов является их способность продуцировать широкий спектр внеклеточных ферментов, в том числе и протеиназ. Общее число существующих протеиназ, ферментов, катализирующих гидролиз пептидных связей в белках, довольно велико, и они весьма разнообразны, что может быть обусловлено разнообразием задач, решаемых протеолитическими ферментами, и множественностью субстратов, потребляемых микромицетами (Kornienko et al., 2017).

Протеолитические ферменты некоторых микромицетов обладают рядом ценных для медицины свойств, в частности они способны к селективному протеолизу компонентов плазмы крови, воздействию на факторы крови, подобно тромбину, индуцируя коагуляцию плазмы и крови человека. Среди наиболее перспективных культур известны и достаточно подробно исследованы представители родов Cladosporium, Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Arthrobotrys и Alternaria (Kotb et al., 2014). Одними из наиболее релевантных с биомедицинской и биотехнологической точки зрения являются микромицеты - продуценты протеиназ со свойствами ферментов системы гемостаза - плазмина, т.е. обладающих плазминоподобной активностью (прямой фибринолитической) и активностью активаторной к плазминогену (катализирует превращение плазминогена в собственный плазмин крови человека) (Шаркова и др., 2015). Использование активаторов плазминогена позволяет уменьшить количество белка в лечебном препарате, повысить специфичность его действия, и, соответственно, снизить риск негативных последствий в сравнении с протеиназами с прямой фибринолитической активностью. Поэтому необходимы продуценты, у которых среди протеиназ наряду с фибринолитической активностью встречается и преобладает активаторная к плазминогену активность.

В связи с этим, есть необходимость создания наиболее оптимальной, быстрой и эффективной стратегии выявления подобных перспективных продуцентов тромболитических ферментов среди многообразия существующих штаммов микромицетов через определение тромболитического потенциала их протеиназ. Помимо этого, крайне важно определение минимального количества ключевых параметров подобного скрининга, влияющих на качество отбора штаммов с наиболее высоким возможным тромболитическим потенциалом внеклеточных протеиназ, экскретируемых в культуральную жидкость.

Из уровня техники известны способы оценки различных процессов с участием микроорганизмов, в том числе микромицетов, основанные на применении формул, использующих различные коэффициенты, отражающие вклад или влияние тех или иных факторов на процесс. Из патента РФ 2672193 известен способ оценки опасности биокоррозионных процессов подземных стальных сооружений характеризуется тем, что определяют влажность в почве, минеральный состав почвы, удельное электросопротивление грунта, окислительно-восстановительный потенциал грунта, рН почвы, общее количество аэробных бактерий, общее количество микрогрибов (микромицетов), отдельные классы микроорганизмов - сульфатвосстанавливающих железобактерий бактерий, после чего рассчитывается коэффициент агрессивности грунта по формуле, вклад в которую вносит каждый из приведенных факторов, выраженных конкретным коэффициентом.

В патенте РФ 2570637 описан способ определения токсичности среды по степени угнетения роста тест-культур микроорганизмов, включающий определение показателей роста тест-культур в контроле и опыте, определение интегрального показателя (критерия) токсичности среды в баллах, сравнение интегрального показателя (критерия) с условно установленными классами опасности среды, отличающийся тем, что в качестве тест-культур используют микромицеты, дают интегральную оценку роста для каждой тест-культуры по сравнению с контролем в баллах с последующим ранжированием величины процента роста по одной из пяти категорий: по общему количеству баллов у всех тест-культур за весь период инкубации определяют интегральный показатель (критерий) токсичности среды, который сравнивают с пятью классами опасности среды, условно установленными в зависимости от балльной интегральной оценки токсичности исследуемой среды.

Известен способ тестирования и отбора перспективных тромболитических субстанций из культуральной жидкости микромицетов, основанный на модели тромболизиса (модели лизиса фибринового тромба). В основе способа - формирование фибринового сгустка в пробирке и оценка степени протекания тромболизиса, выражающаяся в изменении со временем массы сгустка в динамике вследствие его тромболизиса протеиназами культуральной жидкости микромицета через определенные заданные временные интервалы. По итоговому изменению массы тромба от первоначальной определяют степень протекания тромболизиса. Данный способ позволяет смоделировать in vitro модель лизиса тромба в пространстве. Недостатком данного способа является невозможность оценить наличие активаторной к плазминогену активности - ключевого свойства, определяющего тромболитический потенциал для протеиназ культуральной жидкости микромицета, - а также невозможность учесть ряд параметров, определяющих стабильность получаемых тромболитических субстанций протеиназ из культуральной жидкости микромицета при физиологических показателях температуры и pH крови человека.

Ближайшим аналогом является способ отбора перспективного штамма продуцента, основанный на определении фибринолитической и активаторной по отношению к плазминогену активности на фибриновых пластинах по методу Аструпа - Мюллерц (Astrup and Mullertz, 1952; Lassen, 1952) для его культуральной жидкости. Для приготовления фибриновых пластин смешивают 900 мкл 3% раствора бычьего фибриногена в физиологическом растворе (0,5 М NaCl), добавляют 200 мкл раствора тромбина (2 мг/мл физ. раствора), аккуратно перемешивают и переносят раствор в чашки Петри. Образование фибринового геля происходит при комнатной температуре в чашках с открытыми крышками. Уплотнение геля продолжается в таких условиях в течение 1-3 часов. После уплотнения геля часть чашек с закрытыми крышками прогревают при температуре 86°С 30 минут, тем самым инактивируя плазминоген. Для измерения фибринолитической и активаторной к плазминогену активности на пластины наносят по 30 мкл пробы и помещают чашки в термостат на 4 часа. По истечении указанного времени, на пластинах измеряют площадь зоны лизиса в мм². Разность в размерах зон на непрогретых и прогретых чашках служит показателем способности фермента к прямой фибринолитической активности, но и его способности активировать плазминоген. Недостатком применения данного способа для оценки тромболитического потенциала микромицета является отсутствие возможности дополнительного учета дополнительных и наиболее значимых параметров, определяющих стабильность получаемых тромболитических субстанций протеиназ из культуральной жидкости микромицета при физиологических показателях температуры и pH крови человека.

Задачей настоящего изобретения является создание комплексного способа оценки перспективности получения тромболитических субстанций из культуральной жидкости микромицета, учитывающего не только наличие фибринолитической и активаторной к плазминогену активности у кандидатного продуцента тромболитических протеиназ, но и учитывающей показатели степени тромболизиса фибринового сгустка данными протеиназами в прострастве, физиологической стабильности, в которых находится оптимум работы данных протеиназ в контексте последующей возможности их последующего использования в качестве терапевтических или диагностических средств.

Задача решается с помощью предложенного авторами способа отбора микромицета перспективного для получения тромболитических субстанций из его культуральной жидкости. Способ включает определение фибринолитической и активаторной к плазминогену активности (качественное определение на фибриновых пластинах), количественное определение степени тромболизиса (в модели пространственного лизиса фибринового сгустка in vitro), определение температурного и pH оптимума для культуральной жидкости исследуемого микромицета (в сопоставлении и нормировании на физиологические параметры pH и температурного оптимума крови человека) после чего рассчитывается коэффициент тромболитического потенциала по формуле:

ТП = Тр × А_ф/л × А_акт × Т_опт × рН_опт, где

Тр - степень тромболизиса (от 0 до 1),

А_ф/л - коэффициент фибринолитической активности (если фибринолитическая активность есть в пробе культуральной жидкости исследуемого микромицета, - коэффициент считать равным 2, если фибринолитическая активность отсутствует, - коэффициент считать равным 1),

А_акт - коэффициент активаторной к плазминогену активности (если активаторная к плазминогену активность есть в пробе культуральной жидкости исследуемого микромицета, - коэффициент считать равным 2, если отсутствует, - коэффициент считать равным 1),

T_opt - коэффициент температурного оптимума (если измеренный температурный оптимум для протеиназ культуральной жидкости исследуемого микромицета составляет менее 35,5°С, либо более 37,5°С, - коэффициент считать равным 1, если температурный оптимум находится в интервале от 35,5°С до 37,5°С, - коэффициент считать равным 2),

pH_opt - коэффициент pH оптимума (если измеренный температурный pH оптимум для протеиназ культуральной жидкости исследуемого микромицета составляет менее 7, либо более 8, - коэффициент считать равным 1, если pH оптимум находится в интервале от 7 до 8, - коэффициент считать равным 2)

с последующим ранжированием данного коэффициента тромболитического потенциала для исследуемого микромицета по одной из трех категорий:

ТП < 8: низкий тромболитический потенциал исследуемого микромицета,

8 ≤ ТП ≤ 12: средний тромболитический потенциал исследуемого микромицета,

ТП > 12: высокий тромболитический потенциал исследуемого микромицета.

По результатам исследований составляется суммарная таблица. На основе рейтинговой системы по показателю коэффициента ТП для культуральной жидкости выбирается наиболее перспективный продуцент для дальнейших исследований, выделения тромболитических субстанций из культуральной жидкости, масштабирования и т.п. процессов.

На фиг. 1 представлена общая схема способа оценки тромболитического потенциала микромицета.

На фиг. 2 представлена схема эксперимента по определению фибринолитической и активаторной к плазминогену активностей методом фибриновых пластин.

На фиг. 3 представлена схема эксперимента по определению степени тромболизиса.

На фиг. 4 представлена схема экспериментов по определению температурного и pH оптимумов.

Определение степени тромболизиса

Степень тромболизиса определяют по следующей экспериментальной схеме. Перед началом проведения эксперимента взвешивают пробирку типа Eppendorf на аналитических весах с точностью до десятитысячной доли г. Затем в нее добавляют 100 мкл плазмы и 20 мкл раствора тромбина. После формирования фибринового сгустка повторно взвешивают пробирку и фиксируют массу пробирки с тромбом. Затем в пробирку вносят аликвоту культуральной жидкости и фиксируют изменение массы тромба во времени (в пробе через 90 минут). По показателю убыли массы тромба в сравнении с первоначальной определяют степень протекания тромболизиса, выраженную в числовом интервале от 0 до 1.

Определение фибринолитической и активаторной к плазминогену активности методом фибриновых пластин

Для приготовления фибриновых пластин смешивают 900 мкл 3% раствора бычьего фибриногена в физиологическом растворе (0,5 М NaCl), добавляют 200 мкл раствора тромбина (2 мг/мл физ. раствора), аккуратно перемешивают и переносят раствор в чашки Петри. Образование фибринового геля происходит при комнатной температуре в чашках с открытыми крышками. Уплотнение геля продолжается в таких условиях в течение 1 - 3 часов. После этого часть чашек с закрытыми крышками прогревают при температуре 86°С 30 минут, тем самым инактивируя плазминоген. Для измерения фибринолитической и активаторной к плазминогену активности на пластины наносят по 30 мкл пробы и помещают чашки в термостат на 4 часа. По истечении указанного времени, на пластинах измеряют площадь зоны лизиса в мм². Разность в размерах зон на непрогретых и прогретых чашках служит показателем способности фермента не только к прямой фибринолитической активности, но и его способности активировать плазминоген.

В отличие от способа определения фибринолитической и активаторной к плазминогену активности по методу Аструпа-Мюллерц, в описанном авторами способе данный показатель необходим для качественной оценки наличия или отсутствия соответствующих фибринолитической и активаторной к плазминогену активности и является показателем выражаемых с помощью соответствующих коэффициентов в формуле определения тромболитического потенциала: если фибринолитическая активность в целом есть в пробе культуральной жидкости исследуемого микромицета после соответствующего эксперимента на фибриновой пластине, - соответствующий ей коэффициент считать равным 2, если фибринолитическая активность отсутствует, - коэффициент считать равным 1. Аналогично в случае активаторной к плазминогену активности.

Определение температурного оптимума протеиназ культуральной жидкости микромицета

Температурный оптимум для протеиназ культуральной жидкости исследуемого микромицета определяют в 0.05М Трис-HCl-буфере, рН 8.2 по казеинолитической активности при температурах 25, 30, 37, 45, 55 и 65°С. К 75 мкл пробы культуральной жидкости микромицета добавляют 150 мкл раствора казеина (1% раствор в Трис-HCl буфере), инкубируют полученную смесь в течение 10 минут при 37°С. Реакцию казеинолиза останавливают добавлением в пробу 225 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. После этого производят центрифугирование пробы и измеряют активность на спектрофотометре при длине волны равной 275 нм. В контрольную пробу добавляют 225 мкл ТХУ, 150 мкл раствора казеина и 75 мкл пробы. В результате для каждого значения температуры (каждой точки из группы 25, 30, 37, 45, 55 и 65°С) получают значение казеинолитической активности. Показатель пробы для значения температуры с наибольшим итоговым значением казеинолитической активности считают температурным оптимумом (при данной температуре достигается температурный оптимум, т.к. максимальная казеинолитическая активность в сравнении с другими температурами).

Если измеренный температурный оптимум для культуральной жидкости исследуемого микромицета составляет менее 35,5°С, либо более 37,5°С (что означает, что он находится вне физиологических показателей, характерных для крови человека), - коэффициент T_opt в формуле расчета тромболитического потенциала ТП считают равным 1, т.е. показывают, что данный параметр не вносит вклад в соответствующую формулу, если температурный оптимум находится в интервале от 35,5°С до 37,5°С (что означает, что он находится в пределах физиологических показателей, характерных для крови человека), - коэффициент T_opt в формуле расчета тромболитического потенциала ТП считают равным 2, т.е. считают, таким образом, что данный параметр вносит вклад в соответствующую формулу и повышает перспективность выбора исследуемого микромицета.

Определение pH-оптимума для протеиназ культуральной жидкости микромицета

рН-оптимум активности протеиназы определяют в 0.4М натрий-ацетат-фосфат-боратном буфере с рН от 3.0 до 11.0 (меньшие или большие значения соотвестсвуют экстремально кислым или щелочным показателям). К 50 мкл пробы культуральной жидкости микромицета добавляют 50 мкл буферного раствора с нужным значением pH и 200 мкл раствора казеина (1% раствор в Трис-HCl буфере, pH 8,2), инкубируют полученную смесь в течение 10 минут при 37°С. Реакцию казеинолиза останавливают добавлением в пробу 300 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). После этого производят центрифугирование пробы и измерение активности на спектрофотометре при длине волны равной 275 нм. В контрольную пробу добавляют 300 мкл ТХУ, 200 мкл раствора казеина 50 мкл пробы и 50 мкл буфера с соответствующим значением pH. В результате для каждого значения pH получают значение казеинолитической активности. Показатель пробы с добавлением буфера определенного значения pH с наибольшим итоговым значением казеинолитической активности считают pH-оптимумом (при данном значении pH достигается pH оптимум, т.к. при данном значении pH показана максимальная казеинолитическая активность в сравнении с другими pH).

Если измеренный pH оптимум для протеиназ культуральной жидкости исследуемого микромицета составлял менее 7, либо более 8 (что означало, что он находится вне физиологических показателей, характерных для крови человека), - коэффициент pH_opt в формуле расчета коэффициента тромболитического потенциала ТП считали равным 1, т.е. показывали, что данный параметр не вносит вклад в соответствующую формулу, если pH оптимум находится в интервале от 7 до 8 (что означало, что он находится в пределах физиологических показателей, характерных для крови человека), - коэффициент pH_opt в формуле расчета коэффициента тромболитического потенциала ТП принимают равным 2, т.е. считают, таким образом, что данный параметр вносит вклад в соответствующую формулу и повышает перспективность выбора исследуемого микромицета.

Пример 1. Оценка тромболитического потенциала микромицета Sarocladium strictum ВКМ F-4845D

В качестве примера оценки тромболитического потенциала микромицета рассмотрим штамм Sarocladium strictum 203 (ВКМ F-4845D). В экспериментах по тромболизису степень тромболизиса составила 86%, в экспериментах по определению фибринолитической и активаторной к плазминогену активностей наблюдались зоны лизиса как на непрогретых чашках, так и на прогретых, что свидетельствует о наличии фибринолитической и активаторной к плазминогену активностей, притом диаметр зон лизиса на непрогретой чашке был меньше, чем на прогретой, что свидетельствует о наличии в культуральной жидкости микромицета, как фибринолитической, так и активваторной к плазминогену активности. Определенный температурный оптимум составил 37°С; pH оптимум составил 7,3. Далее оцениваем вклад полученных экспериментальных данных в коэффициент перспективности штамма. Результаты оценки и вывод представлены в таблице 1.

Таблица 1

Оценка тромболитического потенциала микромицета Sarocladium strictum

Компонент формулы: Экспериментальное
значение (для КЖ): Нормирование на коэфф-т формулы: ТП = Тр × А_ф/л × А_акт × Т_опт × рН_опт / Вывод : Степень тромболизиса 86 % Тр 0,86 ТП = 13,76; Значение коэффициента тромболитического потенциала, рассчитанного для протеиназ культуральной жидкости микромицета составляет более 12, следовательно, микромицет обладает высоким потенциалом для получения тромболитических субстанций из его культуральной жидкости Активность фибринолитическая Наблюдается зона лизиса в экспериментах на фибриновых пластинах, активность есть А_ф/л 2 Активность активаторная к плазминогену Наблюдается зона лизиса в экспериментах на фибриновых пластинах после инкубации, активность есть А_акт 2 Температурный оптимум °С 37 Т_опт 2 pH - оптимум 7,3 рН_опт 2

Пример 2. Оценка тромболитического потенциала микромицета Tolypocladium inflatum k1

В качестве другого примера оценки тромболитического потенциала микромицета рассмотрим штамм Tolypocladium inflatum k1 (Sharkova et al., 2016). В экспериментах по тромболизису степень тромболизиса составила 73,5%, в экспериментах по определению фибринолитической и активаторной к плазминогену активностей наблюдались зоны лизиса как на непрогретых чашках, так и на прогретых, что свидетельствует о наличии фибринолитической и активаторной к плазминогену активностей, притом диаметр зон лизиса на непрогретой чашке был меньше, чем на прогретой, что свидельствует о наличии в культуральной жидкости микромицета, как фибринолитической, так и активваторной к плазминогену активности. Определенный температурный оптимум составил 37°С; pH оптимум составил 7,3. Далее оцениваем вклад полученных экспериментальных данных в коэффициент перспективности штамма. Результаты оценки и вывод представлены в таблице 2.

Таблица 2

Оценка тромболитического потенциала микромицета Tolypocladium inflatum k1

Компонент формулы: Экспериментальное
значение (для КЖ): Нормирование на коэфф-т формулы: ТП = Тр × А_ф/лит × А_акт × Т_опт × рН_опт / Вывод: Степень тромболизиса 73,3 % Тр 0,733 ТП = 11,728; Значение коэффициента тромболитического потенциала, рассчитанного для протеиназ культуральной жидкости микромицета составляет более 8, но менее 12, следовательно, микромицет обладает средним потенциалом для получения тромболитических субстанций из его культуральной жидкости Активность фибринолитическая Наблюдается зона лизиса в экспериментах на фибриновых пластинах, активность есть А_ф/л 2 Активность активаторная к плазминогену Наблюдается зона лизиса в экспериментах на фибриновых пластинах после инкубации, активность есть А_акт 2 Температурный оптимум °С 37 Т_опт 2 pH - оптимум 8 рН_опт 2

Пример 3. Оценка тромболитического потенциала микромицета Fusarium sp. BLB

В качестве еще одного примера оценки тромболитического потенциала микромицета рассмотрим штамм Fusarium sp. BLB (Ueda et al., 2007) В экспериментах по тромболизису степень тромболизиса составила 28%, в экспериментах по определению фибринолитической и активаторной к плазминогену активностей наблюдались зоны лизиса на прогретых чашках, так и на прогретых, что свидетельствует о наличии фибринолитической и активаторной к плазминогену активностей, притом диаметр зон лизиса на непрогретой чашке был меньше, чем на прогретой, что свидетельствует о наличии в культуральной жидкости микромицета, как фибринолитической, так и активваторной к плазминогену активностей. Определенный температурный оптимум составил 50°С; pH оптимум составил 9,5. Оцениваем вклад полученных экспериментальных данных в коэффициент перспективности штамма. Результаты оценки и вывод представлены в таблице 3.

Таблица 3

Оценка тромболитического потенциала микромицета Fusarium sp. BLB

Компонент формулы: Экспериментальное
значение (для КЖ): Нормирование на коэфф-т формулы: ТП = Тр × А_ф/лит × А_акт × Т_опт × рН_опт / Вывод: Степень тромболизиса 28 % Тр 0,28 ТП = 0,56; Значение коэффициента тромболитического потенциала, рассчитанного для протеиназ культуральной жидкости микромицета составляет менее 8, следовательно, микромицет обладает низким потенциалом для получения тромболитических субстанций из его культуральной жидкости Активность фибринолитическая Наблюдается зона лизиса в экспериментах на фибриновых пластинах, активность есть А_ф/л 2 Активность активаторная к плазминогену Не наблюдается зона лизиса в экспериментах на фибриновых пластинах после инкубации, активность есть А_акт 1 Температурный оптимум °С 50 Т_опт 1 pH - оптимум 9,5 рН_опт 1

Литература

1. Шаркова Т.С., Кураков А.В., Осмоловский А.А., Матвеева Э.О., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С., 2015. Скрининг продуцентов протеиназ с фибринолитической и коллагенолитической активностями среди микромицетов. Микробиология, 84, 3, 316-322.

2. Astrup R., S., 1952. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys., 40, 346-351.

3. Kornienko E.I., Bobrovskaya A.A., Fokichev N.S., Osmolovskiy A.A., Sharkova T.S., 2017. In vitro Thrombolytic Action of New Fibrinolytic Enzyme Complexes - Strictoliase and Lilasyn // Research and practice in thrombosis and haemostasis, 1, S1, p. 635-635.

4. Kotb E., 2014. The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombi. Biotechnol Prog. 30, 3, 656-72.

5. Lassen M., 1952. Heart denaturation of plasminogen in the fibrin method // Acta Physiol. Scand., 27, 371-376.

6. Osmolovskiy Alexander A., Lukianova Anna A., Zvonareva Elena S., Kreyer Valeriana G., Baranova Nina A., Egorov Nikolay S., 2018. Combined microbiological approach to screening of producers of proteases with hemostasis system proteins activity among micromycetes // Biotechnology Reports, 19, 265.

7. Sharkova T.S., Matveeva E.O., Kreier V.G., Osmolovskiy A.A., Kurakov A.V., Baranova N.A., Egorov N.S., 2016. Production of Proteinase - Plasminogen Activators by Micromycete Tolypocladium inflatum k1 // Applied Biochemistry and Microbiology, 52 (1), 32-35.

8. Ueda M., Kubo T., Miyatake K., Nakamura T., 2007. Purification and characterization of fibrinolytic alkaline protease from Fusarium sp. BLB // Appl. Microbiol. Biotechnol., 74, 331-338.

9. Патент РФ 2672193, 2017. Способ оценки опасности биокоррозионных процессов подземных стальных сооружений.

10. Патент РФ 2570637, 2014. Способ определения токсичности среды по степени угнетения роста тест-культур микроорганизмов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ оценки тромболитического потенциала микромицета, включающий определение в пробе его культуральной жидкости показателей степени тромболизиса, наличия фибринолитической активности и активаторной к плазминогену активности, температурного оптимума и pH-оптимума с последующим расчетом коэффициента тромболитического потенциала ТП по представленной формуле с последующим ранжированием коэффициента тромболитического потенциала ТП для исследуемого микромицета: при ТП < 8 - низкий тромболитический потенциал исследуемого микромицета; при 8 ≤ ТП ≤ 12 - средний тромболитический потенциал исследуемого микромицета; при ТП > 12 - высокий тромболитический потенциал исследуемого микромицета. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов выявление перспективных продуцентов тромболитических ферментов среди многообразия существующих штаммов микромицетов. 4 ил., 3 табл., 3 пр.

Способ оценки тромболитического потенциала микромицета, включающий определение в пробе его культуральной жидкости показателей степени тромболизиса, наличия фибринолитической активности и активаторной к плазминогену активности, температурного оптимума и pH-оптимума с последующим расчетом коэффициента тромболитического потенциала ТП по формуле:

ТП = Тр × А_ф/л × А_акт × T_опт × pH_опт,

где Тр - степень тромболизиса по показателю убыли массы тромба в сравнении с первоначальной, выраженная в числовом интервале от 0 до 1,

А_ф/л - коэффициент фибринолитической активности: если фибринолитическая активность есть в пробе культуральной жидкости исследуемого микромицета - коэффициент считать равным 2, если фибринолитическая активность отсутствует - коэффициент считать равным 1,

А_акт - коэффициент активаторной к плазминогену активности: если активаторная к плазминогену активность есть в пробе культуральной жидкости исследуемого микромицета - коэффициент считать равным 2, если отсутствует - коэффициент считать равным 1,

T_opt - коэффициент температурного оптимума: если измеренный температурный оптимум протеиназ для культуральной жидкости исследуемого микромицета составляет менее 35,5°С, либо более 37,5°С - коэффициент считать равным 1, если температурный оптимум находится в интервале от 35,5°С до 37,5°С - коэффициент считать равным 2,

pH_opt - коэффициент pH оптимума: если измеренный температурный pH оптимум протеиназ для культуральной жидкости исследуемого микромицета составляет менее 7 либо более 8 - коэффициент считать равным 1, если pH оптимум находится в интервале от 7 до 8 - коэффициент считать равным 2,

с последующим ранжированием коэффициента тромболитического потенциала ТП для исследуемого микромицета по одной из трех категорий:

ТП < 8: низкий тромболитический потенциал исследуемого микромицета,

8 ≤ ТП ≤ 12: средний тромболитический потенциал исследуемого микромицета,

ТП > 12: высокий тромболитический потенциал исследуемого микромицета.