ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании временной заявки на патент США номер 62/524315, поданной 23 июня 2017 г., и временной заявки на патент США номер 62/633807, поданной 22 февраля, 2018 г., содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Нозокомиальная инфекция, также называемая внутрибольничной инфекцией, является основной проблемой, с которой сталкиваются пациенты в настоящее время. Опросы, проведенные в США в 183 больницах (Magill et al., 2014), показали, что из 11282 пациентов, 452 имели одну или более инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (4,0%; 95% доверительный интервал, 3,7-4,4). Из 504 таких инфекций, наиболее распространенными были пневмония (21,8%), инфекции операционного поля (21,8%) и желудочно-кишечные инфекции (17,1%). Clostridium difficile являлся наиболее часто упоминаемым патогеном (вызывающим 12,1% инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи). Инфекции, связанные с медицинскими устройствами (то есть, связанная с центральным катетером инфекция кровотока, связанная с катетером инфекция мочевыводящих путей и связанная с вентилирующим устройством пневмония), на которые традиционно были направлены программы по предотвращению инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, составляли 25,6% таких инфекций. По оценкам авторов изобретения, в больницах неотложной помощи в Соединенных Штатах Америки (США) в 2011 г. находились 648000 пациентов с 721800 инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи.

С резким возрастанием числа бактерий с множественной лекарственной резистентностью (МЛР), стало сложно лечить внутрибольничные инфекции. Клиницистам приходится прибегать к применению более токсичных и менее эффективных антибиотиков. Тем не менее, по оценкам Центра контроля и профилактики заболеваний (ЦКПЗ), ежегодно происходят ~23000 смертей от инфекций, вызываемых МЛР бактериями.

Таким образом, сохраняется потребность в эффективных технологиях профилактики и/или лечения таких инфекций.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на решение проблемы отсутствия соответствующих технологий профилактики и/или лечения внутрибольничных инфекций. В числе прочего настоящее изобретение направлено на решение проблем получения вакцин с достаточной иммуногенностью для создания иммунитета и предотвращения колонизации.

В частности, настоящее раскрытие относится к композициям и способам для профилактики и/или лечения внутрибольничных инфекций у пациентов.

В частности, настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим, например, (i) каркасный полимер, включающий полимер и один или более антигенных полисахаридов, конъюгированных с полимером; и (ii) один или более полипептидных антигенов в не ковалентном комплексе с полимером или антигенным полисахаридом.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция может содержать один или более антигенных полисахаридов, конъюгированных с полимером при помощи линкера. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция может содержать один или более антигенных полисахаридов, конъюгированных с полимером без линкера. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов получены из грамотрицательных бактерий и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов получены из антигенных полисахаридов Klebsiella, Pseudomonas и/или E. coli.

В некоторых вариантах осуществления одно или более из потенциальной возможности опсонизации или иммуногенности одного или более антигенных полисахаридов увеличивается относительно ранее определенного уровня, при измерении методом ELISA и/или в функциональном анализе антител. В некоторых вариантах осуществления одно или более из потенциальной возможности опсонизации или иммуногенности одного или более антигенных полисахаридов увеличивается относительно контрольной композиции, при измерении методом ELISA и/или в функциональном анализе антител. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в вакцинной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в вакцинной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в вакцинной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в вакцинной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в вакцинной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в вакцинной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в вакцинной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в фармацевтической композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в фармацевтической композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в фармацевтической композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в фармацевтической композиции, и не содержать полимер, присутствующий в фармацевтической композиции.

В некоторых вариантах осуществления одно или более из потенциальной возможности опсонизации или иммуногенности одного или более антигенных полисахаридов увеличивается по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза или 5 раз относительно ранее определенного уровня, при измерении методом ELISA и/или в функциональном анализе антител. В некоторых вариантах осуществления ранее определенный уровень представляет собой преиммунный уровень. В некоторых вариантах осуществления эпитопная валентность одного или более антигенных полисахаридов по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза или 5 раз превышает таковую у нативного полисахарида.

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов могут представлять собой белки-носители для одного или более антигенных полисахаридов. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенная композиция вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на более высоком уровне, чем в случае композиции, содержащей антигенный полисахарид и не содержащей каркасный полимер, при измерении методом ELISA. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенная композиция вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на более высоком уровне, чем в случае композиции, содержащей полипептидный антиген и не содержащей каркасный полимер, при измерении методом ELISA. В некоторых вариантах осуществления один или более патогенов выбирают из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенная композиция вызывает иммунный ответ против одного или более из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления полипептидный антиген представляет собой, или содержит, бактериальный полипептид, грибковый полипептид и/или вирусный полипептид, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления полипептидный антиген представляет собой, или содержит, полипептид, или его иммуногенный фрагмент, из Klebsiella, Pseudomonas и/или E. coli. В некоторых вариантах осуществления полипептидный антиген представляет собой, или содержит, полипептид, полученный из полипептида Klebsiella, Pseudomonas и/или E. coli.

В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, полисахарид, полипептид или синтетический дендример. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет размер от примерно 50 кДа до примерно 2000 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, капсульный полисахарид из грамотрицательных или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой, или содержит, капсульный полисахарид Klebsiella, экзополисахарид Pseudomonas и/или капсульный полисахарид Escherichia. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, линейный поли-L-лизин или дендример L-лизина. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, дендример синтетического моносахарида или олигосахарида.

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов находятся в не ковалентном комплексе с полимером и/или одним или более антигенными полисахаридами за счет образования по меньшей мере одной пары комплементарных аффинных молекул, включающей (i) первую аффинную молекулу, связанную с полимером или одним или более антигенными полисахаридами; и (ii) комплементарную аффинную молекулу, связанную с одним или более полипептидными антигенами. В некоторых вариантах осуществления пару комплементарных аффинных молекул выбирают из группы, состоящей из: биотина/биотин-связывающего белка, антитела/антигена, фермента/субстрата, рецептора/лиганда, металла/металл-связывающего белка, углевод/углевод-связывающего белка, липида/липид-связывающего белка и His-метки/His-метку-связывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула представляет собой биотин или его производное. В некоторых вариантах осуществления комплементарная аффинная молекула представляет собой биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок представляет собой ризавидин, авидин, стрептавидин, брадавидин, тамавидин, лентиавидин, зебавидин, нейтравидин, каптавидин™, или их сочетание.

В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула перекрестно сшита или ковалентно связана с полимером, или одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула перекрестно сшита или ковалентно связана с полимером каркасного полимера. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула перекрестно сшита или ковалентно связана с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула перекрестно сшита или ковалентно связана с полимером каркасного полимера и с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, поли-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов представляют собой, или содержат, полисахарид из одного или более из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов представляют собой, или содержат, OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов представляют собой или содержат OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11, O12 P. aeruginosa, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из антигенных полисахаридов представляет собой, или содержит, экзополисахарид PsL P. aeruginosa. В некоторых вариантах осуществления PsL представляет собой, или содержит, по меньшей мере один эпитоп, который связывает моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 4, и/или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 5.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1 (фимбриальный белок I типа K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 (консервативный фимбриальный белок III типа MrkA K. pneumoniae), и/или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3, или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой, или содержит, флагеллин подтипа A FliC P. aeruginosa, флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6 (флагеллин подтипа A1 FliC P. aeruginosa), аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 9 (флагеллин подтипа A2 FliC P. aeruginosa), аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция по изобретению представляет собой, или содержит, (a) каркасный полимер, включающий (i) полимер, содержащий капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19; и (ii) один или более антигенных полисахаридов, содержащих полисахарид Klebsiella или Pseudomonas, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19; и (b) один или более полипептидных антигенов в не ковалентном комплексе с полимером за счет образования по меньшей мере одной пары комплементарных аффинных молекул, включающей (i) первую аффинную молекулу, связанную с полимером; и (ii) комплементарную аффинную молекулу, связанную с одним или более полипептидными антигенами. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов представляют собой, или содержат, OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов представляют собой, или содержат, OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула представляет собой биотин или его производное, и комплементарная аффинная молекула представляет собой, или содержит, биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок представляет собой, или содержит, ризавидин или его биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов представляют собой, или содержат, домен D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива, PcrV P. aeruginosa, MrkA K. pneumoniae, их антигенные фрагменты, или их сочетание.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул включает слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина FlaB, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой, или содержит, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 24 (Rhavi-FlaB-Домен2-MrkA-His).

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул включает слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой, или содержит, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 26 (Rhavi-FlaB-Домен2-PcrV-His).

В частности, настоящее изобретение относится к вакцинным композициям. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать одну или более иммуногенных композиций. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать одно или более из (a) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (b) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (c) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и (d) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать одно или более из (a) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (b) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (c) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и (d) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать одно или более из (a) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (b) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (c) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (d) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (e) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (f) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (g) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и (h) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать одно или более из (a) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (b) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (c) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (d) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (e) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (f) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (g) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и (h) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать одно или более из: (a) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (b) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (c) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (d) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (e) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (f) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (g) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (h) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (i) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (j) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (k) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и (l) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать одно или более из (a) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (b) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (c) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (d) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (e) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (f) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (g) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (h) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (i) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (j) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (k) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и (l) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером. В некоторых вариантах осуществления слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA представляет собой, или содержит, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 24 (Rhavi-FlaB-Домен2-MrkA-His). В некоторых вариантах осуществления слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV представляет собой, или содержит, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 26 (Rhavi-FlaB-Домен2-PcrV-His).

В некоторых вариантах осуществления OPS каждой иммуногенной композиции присутствует в массовом отношении примерно 1:1. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер каждой иммуногенной композиции присутствует в массовом отношении примерно 1:1. В некоторых вариантах осуществления совокупно OPS и CPS каждой иммуногенной композиции присутствуют в массовом отношении примерно 1:1. В некоторых вариантах осуществления OPS каждой иммуногенной композиции присутствует в количестве примерно 1 мкг. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер каждой иммуногенной композиции присутствует в количестве примерно 1 мкг. В некоторых вариантах осуществления совокупно OPS и CPS каждой иммуногенной композиции присутствуют в количестве примерно 1 мкг. В некоторых вариантах осуществления OPS каждой иммуногенной композиции присутствует в количестве примерно 5 мкг. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер каждой иммуногенной композиции присутствует в количестве примерно 5 мкг. В некоторых вариантах осуществления совокупно OPS и CPS каждой иммуногенной композиции присутствуют в количестве примерно 5 мкг. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой, или содержит, каркас BP-1. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой, или содержит, каркас BP-1.2. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой, или содержит, каркас BP-2a. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой, или содержит, каркас BP-2b. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой, или содержит, каркас BP-3.

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов представляют собой, или содержат, один или более белков P. aeruginosa, или их вариантов, и при этом комплементарная аффинная молекула представляет собой, или содержит, биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из полипептидных антигенов представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин FlaB P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из полипептидных антигенов представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6 (флагеллин FlaA1 P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 9 (флагеллин FlaA2), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина FlaB, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 11 (домен D2 флагеллина FlaA1, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 12 (домен D2 флагеллина FlaA2, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина FlaB, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 11 (домен D2 флагеллина FlaA1, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 12 (домен D2 флагеллина FlaA2, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV секреторной системы III типа (TTSS) P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенная композиция вызывает продуцирование антител, которые узнают нативный MrkA на K. pneumoniae, экспрессирующей MrkA. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту вакцинная композиция вызывает продуцирование антител, которые узнают нативный MrkA на K. pneumoniae, экспрессирующей MrkA.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит одну или более иммуногенных композиций или вакцинных композиций, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит один или более адъювантов. В некоторых вариантах осуществления адъювант выбирают из группы, состоящей из фосфата алюминия, гидроксида алюминия, фосфатированного гидроксида алюминия, агонистов TLR, таких как агонист TLR2 сапонин (QS21) или порины, агонистов TLR4, таких как, например, монофосфориллипид A (MPL), и агонистов TLR5, таких как флагеллины, и так далее.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция составлена для внутримышечного, внутрибрюшинного, внутрикожного и/или подкожного введения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция составлена для инъекции. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту фармацевтическая композиция вызывает Th1 и/или Th17 клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту фармацевтическая композиция вызывает опсонический/бактерицидный ответ против одного или более из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту фармацевтическая композиция приводит к уменьшению скорости передачи инфекции и/или колонизации слизистых поверхностей одним или более из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту фармацевтическая композиция приводит к уменьшению скорости передачи инфекции и/или колонизации ЖК тракта одним или более из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции Klebsiella, включающим введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции Klebsiella, включающим введение пациенту эффективного количества вакцинной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции Klebsiella, включающим введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции P. aeruginosa, включающим введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции P. aeruginosa, включающим введение пациенту эффективного количества вакцинной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции P. aeruginosa, включающим введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции E. coli, включающим введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции E. coli, включающим введение пациенту эффективного количества вакцинной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции E. coli, включающим введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенная композиция вызывает иммунный ответ против грамотрицательных и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту вакцинная композиция вызывает иммунный ответ против грамотрицательных и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту фармацевтическая композиция вызывает иммунный ответ против грамотрицательных и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления грамотрицательные бактерии выбирают из Klebsiella, Pseudomonas, E. coli, а также их сочетания. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой выработку антител или B-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой CD4+ T-клеточный ответ, включая Th1, Th2, или Th17 ответ, или CD8+ T-клеточный ответ, или CD4+/CD8+ T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой выработку антител или B-клеточный ответ; и T-клеточный ответ.

Некоторые варианты осуществления относятся к композициям антител, содержащим антитела, выработанные у млекопитающего, иммунизированного иммуногенной композицией по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к композициям антител, содержащим антитела, выработанные у млекопитающего, иммунизированного вакцинной композицией по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к композициям антител, содержащим антитела, выработанные у млекопитающего, иммунизированного фармацевтической композицией по изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция антител содержит по меньшей мере одно антитело, выбранное из группы, состоящей из моноклональных антител и антиидиотипических антител. В некоторых вариантах осуществления композиция антител содержит выделенную гамма-глобулиновую фракцию.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам очистки O-антигенного полисахарида от одного или более клеточных компонентов Klebsiella, при этом клеточные компоненты включают белок и/или нуклеиновую кислоту, включающим стадии: создания контакта одного или более клеточных компонентов с окисляющим реагентом, с получением смеси, при этом pH смеси составляет примерно 3-5; отделения O-антигенного полисахарида от клеточных компонентов; и извлечение OPS, при этом OPS является практически свободным от других клеточных компонентов и содержит свободный альдегид на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент представляет собой нитрит натрия, кислота представляет собой уксусную кислоту, и при этом восстанавливающий конец OPS представляет собой остаток 2,5-ангидроманнозы, содержащий свободный альдегид.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам очистки O-антигенного полисахарида от одного или более клеточных компонентов грамотрицательных бактерий, при этом клеточные компоненты включают белок и/или нуклеиновую кислоту, включающим: создание контакта одного или более клеточных компонентов с кислотным реагентом, с получением смеси, при этом pH смеси составляет примерно 3-5, нагревание смеси до температуры от примерно 80°C до примерно 100°C; отделение O-антигенного полисахарида от клеточных компонентов; и извлечение OPS, при этом OPS является практически свободным от других клеточных компонентов и содержит кетон на его восстанавливающем конце.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, при этом O-антигенный полисахарид содержит первичную аминогруппу, и по меньшей мере один биотинилированный полисахарид, включающим: химическое связывание первичной аминогруппы O-антигенного полисахарида путем смешивания O-антигенного полисахарида с частично окисленным полисахаридом, содержащим альдегидные группы и биотин, содержащий первичный амин, с получением смеси; и восстановительное аминирование смеси восстанавливающим реагентом, с получением полимерного каркаса BP-1, при этом полисахарид является биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным. Некоторые варианты осуществления относятся к полимерному каркасу BP-1, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, при этом O-антигенный полисахарид содержит первичную аминогруппу, и по меньшей мере один биотинилированный полисахарид, включающим: химическое связывание первичной аминогруппы O-антигенного полисахарида путем смешивания O-антигенного полисахарида с полисахаридом, биотинилированным и окисленным, полученным сначала путем обработки карбоксилатных групп полисахарида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS), а также биотин гидразидом, с последующей обработкой полисахарида окисляющим реагентом; и восстановительное аминирование смеси восстанавливающим реагентом, с получением полимерного каркаса BP-1.2, при этом полисахарид является биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления первичная группа на O-антигенном полисахариде представляет собой α-аминогруппу L-аланина внешнего ядра OPS из P. aeruginosa или аминогруппу, которая была введена в восстанавливающий конец O-антигенного полисахарида за счет химического связывания короткой спейсерной молекулы, содержащей первичную группу на каждом конце, путем восстановительного аминирования восстанавливающим реагентом. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент для окисления полисахарида представляет собой периодат натрия, короткий спейсер, содержащий диамин, представляет собой дигидразид адипиновой кислоты, и восстанавливающий реагент для восстановительного аминирования представляет собой цианоборогидрид натрия. Некоторые варианты осуществления относятся к полимерному каркасу BP-1.2, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, при этом O-антигенный полисахарид содержит первичную аминогруппу, и по меньшей мере один биотинилированный полисахарид, включающим: химическое связывание первичной аминогруппы O-антигенного полисахарида путем смешивания O-антигенного полисахарида с полисахаридом, биотинилированным и CDAP-активированным, полученным сначала путем обработки карбоксилатных групп полисахарида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS), а также биотин гидразидом, с последующей активацией биотинилированного полисахарида CDAP, с получением полимерного каркаса BP-1.3, при этом полисахарид является биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления первичная группа на O-антигенном полисахариде представляет собой α-аминогруппу L-аланина внешнего ядра OPS P. aeruginosa или аминогруппу, которая была введена в восстанавливающий конец O-антигенного полисахарида за счет химического связывания короткой спейсерной молекулы, содержащей первичную группу на каждом конце, путем восстановительного аминирования восстанавливающим реагентом. В некоторых вариантах осуществления короткий спейсер, содержащий диамин, представляет собой дигидразид адипиновой кислоты, и восстанавливающий реагент для восстановительного аминирования представляет собой цианоборогидрид натрия. Некоторые варианты осуществления относятся к полимерному каркасу BP-1.3, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид и по меньшей мере один биотинилированный полисахарид, включающим: химическое связывание O-антигенного полисахарида, содержащего первичный амин в его ядре, полученного либо путем связывания короткого спейсера, содержащего первичный амин на каждом конце, с O-антигенным полисахаридом путем восстановительного аминирования, с получением молекулы O-антигенный полисахарид-спейсер, или с использованием не дериватизированного OPS, содержащего α-аминогруппу L-аланина, смешивания O-антигенного полисахарида, содержащего первичный амин, с частично окисленным полисахаридом, с получением смеси; восстановительное аминирование смеси, с получением каркаса OPS; и дериватизацию каркаса OPS при помощи CDAP и биотина, содержащего первичный амин, с получением, в результате, каркасного полимера, при этом полисахарид и химически связанный O-антигенный полисахарид являются биотинилированными. Некоторые варианты осуществления относятся к каркасному полимеру, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид и по меньшей мере один не биотинилированный полисахарид, включающим: биотинилирование O-антигенного полисахарида, содержащего один или более коровых KDO и/или фрагментов гептозы, при помощи CDAP и биотина, содержащего первичный амин, с получением смеси биотинилированного OPS; частичное окисление смеси биотинилированного OPS периодатом натрия для введения альдегидов в коровые KDO и/или фрагменты гептозы; восстановительное аминирование биотинилированной смеси дигидразидом адипиновой кислоты; смешивание биотинилированного и аминированного OPS с частично окисленным полисахаридом, с получением смеси; и восстановительное аминирование смеси; с получением, в результате, каркасного полимера, при этом полисахарид является не биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является биотинилированным. Некоторые варианты осуществления относятся к каркасному полимеру, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид и полимер PLL, включающим: восстановительное аминирование O-антигенного полисахарида, содержащего концевые альдегиды или альфа-KDO, ε-NH₂ группами полимера PLL, с получением полимера OPS-PLL; дериватизацию OPS при помощи CDAP, с получением смеси производных; проведение реакции смеси производных с биотином, содержащим первичный амин; и обработку, или не обработку, смеси ацилирующим реагентом для блокирования непрореагировавших ε-NH₂ групп полимера PLL; с получением, в результате, каркасного полимера, при этом блокированный каркас N-ацетилированный-PLL, или неблокированный PLL, является не биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления ацилирующий реагент представляет собой уксусный ангидрид или ацетилхлорид. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий реагент представляет собой цианоборогидрид натрия. Некоторые варианты осуществления относятся к каркасному полимеру, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, при этом O-антигенный полисахарид содержит азидогруппу на его восстанавливающем конце, и по меньшей мере один биотинилированный полисахарид, содержащий алкиновые группы, включающим: связывание реакцией клик-химии в присутствии катализатора O-антигенного полисахарида, содержащего азидогруппу на его восстанавливающем конце, с биотинилированным полисахаридом, содержащим алкины, с получением в результате каркасного полимера OPS, при этом полисахарид является биотинилированным, а связанный реакцией клик-химии O-антигенный полисахарид является не биотинилированным. Некоторые варианты осуществления относятся к каркасному полимеру, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, при этом O-антигенный полисахарид содержит альдегидную или кетонную группу на его восстанавливающем конце, и по меньшей мере один биотинилированный полисахарид, содержащий первичные аминогруппы, полученный реакцией клик-химии в присутствии катализатора, при этом биотинилированный полисахарид содержит алкиновые группы с низкомолекулярным соединением, содержащим азидогруппу на одном конце и свободную аминогруппу на другом конце, включающим: химическое связывание O-антигенного полисахарида, содержащего альдегидные или кетонные группы, путем смешивания O-антигенного полисахарида с биотинилированным полисахаридом, содержащим первичные аминогруппы, и восстановительного аминирования смеси восстанавливающим реагентом, с получением в результате каркасного полимера, при этом полисахарид является биотинилированным, а химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным. Некоторые варианты осуществления относятся к каркасному полимеру, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид, при этом биотинилированный O-антигенный полисахарид содержит азидогруппу на его восстанавливающем конце, и по меньшей мере один не биотинилированный полисахарид, содержащий алкины, включающим: связывание реакцией клик-химии в присутствии катализатора биотинилированного O-антигенного полисахарида, содержащего азидогруппу на его восстанавливающем конце, с не биотинилированным полисахаридом, содержащим алкины, с получением в результате каркасного полимера, при этом полисахарид является не биотинилированным, и связанный реакцией клик-химии O-антигенный полисахарид является биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления катализатор для связывания реакцией клик-химии O-антигенного полисахарида и полисахарида посредством алкин-азидного циклоприсоединения представляет собой сульфат меди. В некоторых вариантах осуществления алкиновую группу для дериватизации полисахарида выбирают из группы, состоящей из 1-амино-3-бутина, 1-амино-4-пентина, DBCO-амина и алкин-ПЭГ4-амина. В некоторых вариантах осуществления азидную группу для дериватизации полисахарида выбирают из группы, состоящей из азидо-ПЭГ3-амина, азидопропиламина и азидобутиламина. Некоторые варианты осуществления относятся к каркасному полимеру, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой, или содержит, биотин-связывающий домен и полипептид, который представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с любой последовательностью из SEQ ID NO: 16-26. В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой, или содержит, биотин-связывающий домен и полипептид, который представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с любой последовательностью из SEQ ID NO: 1-3 или 6-26.

В некоторых вариантах осуществления способ получения варианта MAPS включает образование комплекса из по меньшей мере одного каркасного полимера, описанного в настоящем изобретении, с по меньшей мере одним слитым белком, описанным в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления вариант MAPS представляет собой BP-1 MAPS, BP-1.2 MAPS, BP-1.3 MAPS, BP-2a MAPS, BP-2b MAPS или BP-3 MAPS.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки иммуногенности иммуногенной композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и уровней цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки эффективности иммуногенной композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки иммуногенности вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки эффективности вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки иммуногенности фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки эффективности фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

Список общепринятых сокращений

ADH: дигидразид адипиновой кислоты; ПМР: резистентность к противомикробным средствам; УЕ: условная единица; BB: каркас; BP: каркасный полимер; CDAP: 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборат; ЦКПЗ: Центр контроля и профилактики заболеваний; CDM: среда с определенным химическим составом; КФ: кистозный фиброз; CP: общая часть; CPS: капсульный полисахарид; КОЕ: колониеобразующие единицы; COPS: коровый O-полисахарид; ХТ: холерный токсин; ДНК: дезоксирибонуклеиновая кислота; ДТТ: дитиотреитол; EC: Escherichia coli; EDC: 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид; ELISA: иммуноферментный анализ; ELISpot: клеточный иммуноферментный анализ; ETEC: энтеротоксичная E. coli; ПЦ: проточная цитометрия; ПФ: проточная фаза; ЖК: желудочно-кишечный; ГОБ: грамотрицательные бактерии; ГОП: грамотрицательные палочки; H-ЯМР: протонный ядерный магнитный резонанс; ГА: гемагглютинация; УН: убитые нагреванием; клетки HL-60: человеческие клетки промиелоцитарного лейкоза; ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография; IATS: Международная система серотипирования антигенов; ОИТ: отделение интенсивной терапии; ИОХ: ионообменная хроматография; IFN: интерферон; IL: интерлейкин; в/м: внутримышечно; и/н: интраназально; в/б: внутрибрюшинно; в/в: внутривенно; в/в IG: внутривенный иммуноглобулин; Ig: иммуноглобулин; KDO: группа кетокислоты; KP: Klebsiella pneumoniae; KO: Klebsiella oxytoca; LAL: лизат амебоцитов мечехвоста: LPS: липополисахарид; мАт: моноклональные антитело; MALLS: анализ многоуглового рассеяния лазерного излучения; MAPS: множественная система представления антигенов; МЛР: множественная лекарственная резистентность; MHC: главный комплекс гистосовместимости; ММ: молекулярная масса; NAPLL: N-ацетил-поли-L-лизин; NaBH₃CN: цианоборогидрид натрия; NaIO₄: метапериодат натрия; NHS: N-гидроксисукцинимид; НЧС: нормальная человеческая сыворотка; ЯМР: ядерный магнитный резонанс; OD: оптическая плотность; OMP: белок наружной мембраны; ОФА: анализ опсонофагоцитирующей активности; ОФУ: опсонофагоцитарное уничтожение; OPS: O-полисахарид; PA: Pseudomonas aeruginosa; ПЦР: полимеразная цепная реакция; PBS: фосфатно-солевой буфер; ПЭГ: полиэтиленгликоль; PMN: полиморфноядерные лейкоциты; PLL: поли-L-лизин; п/о: перорально; ППГ: полипропиленгликоль; PRO-CN: контрольный белок-носитель; КТ: коклюшный токсин; RCB: исследовательский банк клеток; КП: коэффициент преломления; РИА: радиоиммунный анализ; РНК: рибонуклеиновая кислота; об/мин: оборотов в минуту; СБТ: сывороточный бактерицидный тест; п/к: подкожно; SDS: додецилсульфат натрия; SDS-ПААГ: электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия: ЭХ: эксклюзионная хроматография; TFF: проточная фильтрация вдоль потока; TLR: toll-подобный рецептор; TNF: фактор некроза опухоли; TTSS: секреторная система третьего типа, УФ: ультрафильтрация; США: Соединенные Штаты Америки; WFI: вода для инъекций.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Идеи настоящего изобретения, описанные в настоящем описании, будут более понятны при изучении следующего далее описания различных иллюстративных вариантов осуществления в сочетании с сопроводительными чертежами. Следует понимать, что описанные ниже чертежи предназначены исключительно для иллюстративных целей и никоим образом не должны ограничивать объем настоящего изобретения.

На Фигуре 1A схематически показана структура внутреннего ядра (верх) и наружного ядра (низ) липополисахарида из P. aeruginosa (PA), стрелка с надписью «расщепление» указывает на сайт расщепления, опосредованного уксусной кислотой, между «группами кетокислоты» (KDO) и молекулой липида A. На Фигуре 1B схематически показана структура повторяющихся O-полисахаридных (OPS) единиц нескольких из разных соответствующих международным стандартам типирования (IATS) коровых типов PA. На Фигуре 1C показана структура части корового полисахарида липополисахарида (LPS) K. pneumoniae с сайтом дезаминирующего расщепления между остатками глюкозамина и галактуроновой кислоты ядра при обработке LPS нитритом натрия и уксусной кислотой (азотистой кислотой), что приводит к образованию 2,5-ангидроманнозы с альдегидной группой на C-1 на восстанавливающем конце общей части (CP) OPS. На Фигуре 1D показана химическая структура повторяющихся единиц некоторых из OPS K. pneumoniae (KP) с 2,5-ангидроманнозой на восстанавливающем конце CP OPS. На Фигуре 1E показана химическая структура повторяющейся единицы капсульного полисахарида (CPS) K. oxytoca (KO) K19, который идентичен CPS K. pneumoniae K19 (Brisse et al., 2013), таким образом, их обоих взаимозаменяемо называют в настоящем изобретении KP K19 CPS. На Фигуре 1F представлен спектр H-ядерного магнитного резонанса (H-ЯМР) при 950 МГц очищенного KP K19 CPS.

На Фигуре 2A схематически представлен иллюстративный химический способ получения KP/PA OPS, меченого дигидразидом адипиновой кислоты (ADH) и связанного путем восстановительного аминирования с окисленным CPS, с избирательным биотинилированием на CPS (BP-1). На Фигуре 2B схематически представлен иллюстративный химический способ получения KP/PA CPS/OPS BP-1.2, где остатки биотина связаны на карбоксилатных группах CPS каркасного полимера в процессе реакции с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом (EDC-NHS), и ADH-меченый OPS связан с биотинилированным CPS каркасного полимера путем восстановительного аминирования с окисленным периодатом и биотинилированным CPS. На Фигуре 2C схематически представлен иллюстративный химический способ получения KP/PA CPS/OPS BP-1.3, где остатки биотина связаны на карбоксилатных группах CPS каркасного полимера в процессе реакции с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом (EDC-NHS), с последующим связыванием ADH-меченого OPS с биотинилированным и CDAP-активированным CPS каркасного полимера.

На Фигуре 3 схематически представлен иллюстративный химический способ получения ADH-меченого OPS, связанного с окисленным CPS, с последующим добавлением остатков биотина на CPS и OPS (BP-2a).

На Фигуре 4 схематически представлен иллюстративный химический способ получения OPS, связанного с окисленным CPS, в котором остатки биотина избирательно связывают с OPS (BP-2b).

На Фигуре 5A схематически представлен иллюстративный химический способ получения каркасного полимера OPS с полимером поли-L-лизином (PLL), в котором остатки биотина избирательно вводят в OPS, и непрореагировавшие свободные ε-аминогруппы PLL блокируют для получения каркасного полимера биотинилированного OPS и N-ацетилированного PLL (NAPLL) (BP-3). На Фигуре 5B представлены три схемы получения иллюстративных каркасных полимеров. На схеме 1 и схеме 2 показаны два варианта химического способа получения CPS/OPS каркаса 1 (BP-1) с использованием клик-химии; на схеме 3 показан химический способ с использованием клик-химии для получения CPS/OPS каркаса 2b (BP-2b).

На Фигуре 6A показаны результаты иллюстративной эксклюзионной хроматографии (ЭХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Waters BioAlliance с колонкой Phenomenex BioSep SEC-4000 и скоростью потока 1 мл/мин в PBS pH 7,4, содержащем азид натрия (0,02%); профили элюции окисленного CPS KP K19, OPS-ADH дериватизированного KPO1 (кривая 1), KPO5 (кривая 5), PAO6 (кривая 6), PAO10 (кривая 10). На Фигуре 6B показаны результаты ЭХ-ВЭЖХ (Waters BioAlliance с колонкой Phenomenex BioSep SEC-4000 и скоростью потока 1 мл/мин в PBS, pH 7,4, содержащем азид натрия (0,02%); профили элюции (слева): OPS_ADH; окисленный KP K19 CPS_OX (указано на фигуре как K19_OX); и K19 CPS_OX: OPS_ADH каркасный полимер и (справа): K19 CPS_OX: OPS_ADH каркасный полимер после определения размера молекул методом либо ЭХ, либо ультрафильтрации (УФ), при использовании мембраны с номинальным порогом отсечения по молекулярной массе (NMWCO) 100 кДа. На Фигуре 6C показаны результаты изучения антигенности методом иммуноферментного анализа (ELISA) с конструктами PA COPS или PA COPS: K19 BP-1, с использованием гипериммунной кроличьей сыворотки после иммунизации убитой нагреванием (УН) Pseudomonas aeruginosa (после четвертой иммунизации). COPS энтеротоксичной E. coli (ETEC) использовали в качестве отрицательного контроля в ELISA. Сильная реакционная способность PA COPS K19 BP-1 с иммунной сывороткой, специфичной для OPS Pseudomonas aeruginosa, указывает на то, что эпитопы OPS в каркасном полимере сохранены.

На Фигуре 7A схематически представлен иллюстративный комплекс BP-1 MAPS со слитым белком ризавидина и OPS BP-1 или BP-1.2; На Фигуре 7B схематически представлен иллюстративный комплекс BP-2a MAPS со слитым белком ризавидина и OPS BP-2a; На Фигуре 7C схематически представлен иллюстративный комплекс BP-2b MAPS со слитым белком ризавидина и OPS BP-2b; на Фигуре 7D схематически представлен комплекс BP-3 MAPS со слитым белком ризавидина и OPS BP-3; на Фигуре 7E схематически представлен комплекс MAPS со слитым белком ризавидина и нативным OPS.

На Фигуре 8A представлена иллюстративная схема последовательности операций последующего процесса очистки OPS из KP и OPS из PA. На Фигуре 8B показаны результаты иллюстративной ЭХ-ВЭЖХ (Waters BioAlliance с колонкой Phenomenex BioSep SEC-4000 использовали при скорости потока 1 мл/мин в PBS, pH 7,4, содержащем азид натрия (0,02%); профили очищенных KP OPS и K19 CPS наложены на кривые коэффициента преломления (КП), слева направо: K19 CPS, O1, O3, O2 и O5. На Фигуре 8C показаны результаты иллюстративной ЭХ-ВЭЖХ (Waters BioAlliance с колонкой Phenomenex BioSep SEC-4000 использовали при скорости потока 1 мл/мин в PBS, pH 7,4, содержащем азид натрия (0,02%); профили очищенных PA OPS наложены на кривые КП, слева направо: O2, O6, O3, O4, O5, O1, O10 и O11.

На Фигуре 9A представлена иллюстративная схема последовательности операций последующего процесса очистки KO CPS K19. На Фигуре 9B представлена конструкция гена для избыточно продуцирующего экзополисахарид PsL штамма Pseudomonas. На Фигуре 9C представлена схема последовательности операций последующего процесса очистки экзополисахарида PsL PA.

На Фигуре 10, верхней панели, представлен иллюстративный профиль элюции при ЭХ на колонке Superdex-200 комплексов BP-2a MAPS слитого белка Rhavi-FlaBD2-MrkA с K19: KPO2-ADH BP-2a. На Фигуре 10, нижней панели, показаны результаты скрининга путем проведения электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ) и окрашивания на общий белок фракций, элюированных с колонки при ЭХ, образцы были обработаны без нагревания в буфере с додецилсульфатом натрия (SDS) для образцов, содержащем 10 мМ дитиотреитол (ДТТ), перед проведением SDS-ПААГ, чтобы комплексы MAPS могли оставаться интактными.

На Фигурах 11A-11C приведены примеры анализа методом SDS-ПААГ и окрашивания на общий белок иллюстративных вариантов комплексов MAPS с BP-1, полученных с использованием разных слитых белков. На Фигуре 11A показаны результаты иллюстративного SDS-ПААГ вариантов комплексов MAPS с BP-1, образованных из слитого белка ризавидина (PRO-CN) отдельно с PA O10 OPS BP-1 (дорожки 4 и 5), PA O1 OPS BP-1 (дорожки 6 и 7) и PA O2 OPS BP-1 (дорожки 8 и 9). На Фигуре 11B показаны результаты иллюстративного SDS-ПААГ вариантов комплексов MAPS с BP-1, образованных из белка ризавидин-FlaB-PcrV (Rhavi-FlaB-PcrV) отдельно с PA O10 OPS BP-1 (дорожки 4 и 5), PA O1 OPS BP-1 (дорожки 6 и 7) и PA O2 OPS BP-1 (дорожки 8 и 9). На Фигуре 11C показаны результаты иллюстративного SDS-ПААГ вариантов комплексов MAPS с BP-1, образованных из белка ризавидин-FlaB-D2-MrkA (Rhavi-FlaBD2-MrkA) с PA O10 OPS BP-1 (дорожки 4 и 5), PA O1 OPS (дорожки 6 и 7) и PA O2 OPS BP-1 (дорожки 8 и 9). На Фигурах 11A-11C отдельно слитый белок ризавидина использовали в качестве контроля (дорожки 1 и 2). Каждый из образцов обрабатывали с нагреванием (при кипячении) (дорожки 1, 4, 6 и 8) и без нагревания (дорожки 2, 5, 7 и 9). Варианты комплексов MAPS с BP-1 не разрушались без нагревания, и белок в вариантах комплексов MAPS с BP-1 оставался в самой верхней части геля. При кипячении варианты комплексов MAPS с BP-1 разрушались, белок высвобождался, и белковый димер также диссоциировал. В эксперимент также включали белковые маркеры молекулярной массы (дорожка 3), и молекулярная масса стандартов указана слева от геля в кДа.

На Фигуре 12A приведено схематическое изображение слитых белков ризавидин-антиген, которые получены из Pseudomonas (PcrV; FlaB; FlaA2; FlaA1; FlaB-PcrV; FlaBD2; FlaA2-D2) или Klebsiella (MrkA), или гибридных белков, полученных как из Klebsiella, так и из Pseudomonas (FlaB-D2-MrkA; PcrV-MrkA). На Фигуре 12B показана биологическая активность toll-подобного рецептора (TLR) 5 в отношении нативных флагеллинов Pseudomonas и слитых белков Rhavi, отдельно или в виде варианта комплекса MAPS с пневмококковыми полисахаридами (PnPS) 6B, в этом анализе клетки HEK293-NFkB:Luc отвечали на флагеллин, но не отдельно взятую среду. Эти результаты указывают на то, что конструкты ризавидина и флагеллина (FlaB, FlaA1, FlaA2), отдельно или в комплексе MAPS с PnPS 6B, стимулировали активность TLR5, следовательно, белок имел правильную укладку.

На Фигурах 13A-13B приведено сравнение способности комплексов MAPS, полученных с разными слитыми белками ризавидин-антиген и пневмококковыми капсульными полисахаридами (PnCPS), вызывать ответ в виде продуцирования анти-CPS 19A антитела (Фигура 13A) или анти-CPS 6B антитела (Фигура 13B) у кроликов, при измерении методом ELISA. Оценивали образцы, полученные до иммунизации (P0), через две недели после первой иммунизации (P1) и через две недели после второй иммунизации (P2). Измеренный ответ в виде IgG выражали в условных единицах (УЕ) на основании стандартной кривой, считая УЕ на мл за 12500. Среднее геометрическое значение указано в виде горизонтальной черной линии с планками погрешностей для 95% доверительного интервала. Фигура 13A, верхняя панель: ответ в виде продуцирования иммуноглобулинов (IgG) на PnCPS 19A с PRO-CN; отдельно ризавидин (Rhavi); ризавидин-FlaB-D2 (FlaBD2); ризавидин-FlaA2-D2 (FlaA2D2); ризавидин-FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); ризавидин-FlaB-D2-MrkA (FlaBD2-MrkA); ризавидин-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA). Фигура 13A, нижняя панель: PRO-CN; ризавидин-PcrV (PcrV); ризавидин-FlaB (FlaB); ризавидин-FlaA1 (FlaA1); ризавидин-FlaA2 (FlaA2); ризавидин-MrkA (MrkA). Фигура 13B, верхняя панель: ответ в виде продуцирования IgG на PnCPS 6B с PRO-CN; отдельно ризавидин (Rhavi); ризавидин-FlaB-D2 (FlaBD2); ризавидин-FlaA2-D2 (FlaA2D2); ризавидин-FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); ризавидин-FlaB-D2-MrkA (FlaBD2-MrkA); ризавидин-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA). Фигура 13B, нижняя панель: PRO-CN; ризавидин-PcrV (PcrV); ризавидин-FlaB (FlaB); ризавидин-FlaA1 (FlaA1); ризавидин-FlaA2 (FlaA2); ризавидин-MrkA (MrkA).

На Фигуре 14 показан иммунный ответ у кроликов, иммунизированных слитыми белками ризавидин-антиген (100 мкг белка в адъюванте Фрейнда). IgG против используемого для иммунизации антигена у кроликов при измерении методом ELISA в образцах сыворотки, полученных до иммунизации (P0) и через две недели после второй иммунизации (P2). Измеренный ответ в виде IgG выражали в условных единицах (УЕ) на основании стандартной кривой, считая УЕ на мл за 12500. Среднее геометрическое значение указано в виде горизонтальной черной линии. Титры представлены в УЕ для белков Rhavi-FlaB-D2 (FlaB-D2); Rhavi-FlaA2-D2 (FlaA2-D2); Rhavi-FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); Rhavi-FlaB-D2-MrkA (FlaB-D2-MrkA) и Rhavi-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA).

На Фигуре 15 приведено сравнение иммуногенности у кроликов двухвалентных препаратов PA O6 и O10 нативных OPS в комплексах MAPS со слитым белком ризавидина PRO-CN или ризавидином (Rhz). Титры IgG против O6 или O10 OPS представлены в виде единиц ELISA до (P0), после одной (P1) или двух инъекций (P2).

На Фигуре 16 приведено сравнение иммуногенности у кроликов препаратов 2-валентного KP O1 и KP O5 OPS BP-1; одновалентного KP O1 BP-2a, а также KP O1 BP-2b, все в вариантах комплексов MAPS со слитым белком ризавидина PRO-CN и с фосфатом алюминия. Титры IgG против KP O1 или KP O5 OPS представлены в виде единиц ELISA до (P0), после одной (P1) или двух инъекций (P2).

На Фигуре 17 приведено сравнение иммуногенности у кроликов препаратов: 2-валентного PA O6, O10 OPS BP-1 в комплексе с PRO-CN; PA O6, O10 OPS BP-1 в комплексе с PRO-CN (без квасцов); PA O6, O10-BP-1 (без белка, например, без PRO-CN); PA O6, O10 OPS BP-1 (без MAPS; например, без биотинилирования, но компоненты каркасного полимера и PRO-CN включены); и одновалентного PA-O6 OPS BP-1 в BP-1 комплексах MAPS со слитым белком ризавидина PRO-CN с фосфатом алюминия, если нет иных указаний. Титры IgG против PA O6 и против PA O10 OPS представлены в виде единиц ELISA до (P0), после одной (P1) или двух инъекций (P2).

На Фигуре 18A приведено сравнение результатов опсонофагоцитарного уничтожения (ОФУ), полученных с использованием человеческих клеток промиелоцитарного лейкоза (HL-60), клеток Klebsiella штамма 12-0581 (O1: K62), кроличьей иммунной сыворотки (от кроликов AFV651 и AFV667) к: KP O1 OPS BP-1 PRO-CN MAPS до и после второй иммунизации (слева); KP O1 OPS BP-2a/ризавидин PRO-CN MAPS до и после второй иммунизации (справа). Повышенное уничтожение наблюдали в случае сыворотки к BP-2a при сравнении иммунной сыворотки с преиммунной сывороткой от одного и того же кролика. На Фигуре 18B приведено сравнение результатов ОФУ, полученных с клетками HL-60, клетками Pseudomonas штамма PA IATSO6, кроличьей иммунной сывороткой к двухвалентному PA O6, O10-OPS BP-1 PRO-CN MAPS и одновалентному PA IATSO6-OPS BP-1 PRO-CN MAPS. Отдельные протестированные сыворотки кроликов приводили к ОФУ клеток PA IATSO6, кроличья сыворотка AFV643 приводила к эффекту прозоны, что свидетельствовало о высоком титра антител против OPS. На Фигуре 18C показано, что четыре отдельные иммунные сыворотки кроликов (P2), полученные с использованием 2-валентной вакцины PA O6, PA O10 OPS BP-1-PRO-CN-MAPS, индуцировали сильное ОФУ бактерий PA O10 клетками HL-60.

На Фигуре 19A приведено сравнение полученных методом проточной цитометрии (ПЦ) результатов связывания целых клеток Klebsiella штамма B5055 (O1: K2) с отдельными кроличьими сыворотками к PRO-CN вариантов MAPS KPO1, O5 OPS BP-1 (слева) и KPO1 OPS BP-2a (справа). Эти полученные методом ПЦ результаты связывания с целыми бактериями имели аналогичную тенденцию с титрами ELISA к очищенному KPO1 OPS, то есть, низкий титр, низкое связывание методом ПЦ. Небольшое число дважды положительных событий указывало на слабое связывание антитела или ограниченное экспонирование OPS на поверхности клеток Klebsiella штамма B5055. На Фигуре 19B (верхняя панель) показана диаграмма разброса данных ПЦ для отдельной кроличьей сыворотки (AFV667) к PRO-CN BP-2a комплексу MAPS с KPO1 OPS BP-2a, где сравнивается слабое связывание с (B5055) и (K. pneumoniae, штамм Caroli, O1: K2) и сильное связывание с не инкапсулированными клетками штаммов Klebsiella (CVD 3001) O1. На Фигуре 19B (нижняя панель) показаны определенные методом ПЦ общие события связывания с теми же тремя штаммами Klebsiella O1 сыворотки от кролика, вакцинированного 2-валентным KP O1, O5 OPS BP-1 PRO-CN MAPS. Эти данные по связыванию указывают на то, что количество CPS, влияющее на экспонирование OPS, возможно, зависит от условий выращивания.

На Фигуре 20 приведено сравнение полученных методом ПЦ результатов связывания целых бактерий Pseudomonas штамма PAK (O6:FlaA1) с (слева) кроличьей сывороткой к 2-валентному PAO6-PAO10 с нативным OPS-PRO-CN (объединенная сыворотка от 3 кроликов, после второй иммунизации); (в центре) кроличьей сывороткой к 2-валентному PAO6-PAO10 OPS BP-1-PRO-CN MAPS (объединенная сыворотка от 3 кроликов, после второй иммунизации); (справа) кроличьей сывороткой к одновалентному PAO6-IATSO6 - OPS BP-1-PRO-CN MAPS (объединенная сыворотка от 3 кроликов, после второй иммунизации); более сильное связывание по результатам ПЦ наблюдали для PAO6 OPS BP-1 MAPS в сравнении с нативной формой OPS MAPS.

На Фигуре 21A показаны полученные методом ПЦ данные по связыванию анти-FlaB кролика с PA O1 штамма O5, экспрессирующего FlaB: на правой панели показана диаграмма разброса данных с высокой процентной долей меченой популяции PA O1 в сыворотке после третьей иммунизации (иммунизация P3; объединенная сыворотка от 10 кроликов) у кроликов, вакцинированных ризавидин-FlaB-D2 (без связывающей области TLR5) при сравнении с сывороткой до иммунизации (P0) (левая панель). На Фигуре 21B, верхняя панель, показаны результаты ПЦ для отдельной кроличьей сыворотки P3 против ризавидин-FlaB-D2; центральная панель, показаны результаты для отдельной кроличьей сыворотки P3 против ризавидин-FlaB-PcrV; нижняя панель, показаны результаты для отдельной кроличьей сыворотки P3 против ризавидин-FlaB-D2-MrkA.

На Фигуре 22 показаны результаты ОФУ клетками HL-60 штамма-мишени Pseudomonas штамма PAO1 (O5: экспрессирующего FlaB) с объединенной кроличьей анти-Rhavi-FlaB-His иммунной сывороткой в сравнении с положительным контролем - анти-PA-FlaB антителом против PAO1 FlaB и поликлональным человеческим внутривенным иммуноглобулином (в/в IG) и отрицательным контролем (без антитела).

На Фигуре 23 показано блокирование адгезии KP O5 6997 (место происхождения Южная Африка) к клеткам A549 (карцинома легкого) при разных разбавлениях анти-FlaBD2-MrkA кроличьей сыворотки. Сыворотка против FlaBD2-MrkA (после третьей иммунизации, P3) ингибировала связывание Klebsiella штамма 6997 с клетками A549, в отличие от преиммунной сыворотки. Это указывает на то, что белковый компонент MrkA в СБ FlaBD2-MrkA имел правильную укладку и вызывал продуцирование функциональных антител.

На Фигуре 24A показана защита анти-PcrV антителами клеток A549 от цитотоксической интоксикации Pseudomonas штамма PAK (O6:FlaA1). Монослои клеток A549 инфицировали Pseudomonas штамма PAK (O6:FlaA1) в течение 4 часов в присутствии 10% сыворотки от кроликов (3 объединенные сыворотки), вакцинированных слитым белком Rhavi-FlaB-PcrV. Анти-Rhavi-FlaB-PcrV (P3, после третьей иммунизации) сыворотка защищала клетки от интоксикации Pseudomonas штамма PAK, в сравнении с преиммунной сывороткой, о чем свидетельствует меньшее количество округлившихся и отделившихся клеток. На Фигуре 24B, монослой клеток A549 инфицировали Pseudomonas штамма PAK в течение 4 часов в присутствии сыворотки от NCB006 Rhavi-FlaB-PcrV (3 объединенные сыворотки) при разных разведениях. Клетки промывали PBS и инкубировали в течение 1 часа с нейтральным красным. Клетки лизировали, и поглощение красителя в каждой лунке регистрировали. Анти-Rhavi-FlaB-PcrV (P3) сыворотка защищала клетки от цитотоксической интоксикации Pseudomonas штамма PAK, в сравнении с преиммунной сывороткой, до разведения 1 к 40.

На Фигуре 25 показаны результаты анализа на цитотоксичность с использованием клеток A549 и анти-FlaB-PcrV кроличьей сыворотки (после третьей иммунизации; P3) с разными штаммами Pseudomonas: в случае высокотоксичной PA IATS O1 (замкнутые ромбы) сывороточная защита от цитотоксичности отсутствовала; в случае цитотоксической PA M2 O5 (замкнутые кружки) сывороточная защита отсутствовала; в случае цитотоксической PA 17002 O10 (замкнутые треугольники) четко наблюдалась сывороточная защита; в случае не цитотоксической PA IATS O6 (замкнутые треугольники) токсичность отсутствовала.

На Фигуре 26 представлен график Каплана-Мейера выживаемости мышей, которым были нанесены ожоги, с последующим инфицированием 28 колониеобразующими единицами (КОЕ) экспрессирующих FlaB Pseudomonas штамма M-2 (O5), введенными в ожоговую рану. В данной модели мышам CD-1 пассивно вводили преиммунную кроличью сыворотку или анти-FlaB кроличью сыворотку и либо имитировали инфицирование фосфатно-солевым буфером (PBS), либо инфицировали Pseudomonas штамма M-2 в PBS. Мыши, которым вводили анти-FlaB иммунную сыворотку, были защищены (5/5, или выживаемость 100%) в течение 10 дней, или более, от заражения раны Pseudomonas штамма M-2, в то время как все мыши из других групп, кроме ложно инфицированных мышей, погибали от заражения раны.

На Фигуре 27 показан клиренс и нагрузка органа в мышиной модели инфекции KP. Мышам (CD1; группы из 3) пассивно вводили внутрибрюшинной (в/б) инъекцией кроличью сыворотку против KPO1 BP-2a OPS-PRO-CN MAPS, и затем инфицировали внутривенно (в/в) Klebsiella штамма KP B5055 O1: K2 (9×10⁴ КОЕ). Количество жизнеспособных KP в селезенке измеряли через 14 ч после инфицирования. Имело место явное уменьшение количества жизнеспособных KP в селезенках мышей, получавших иммунную сыворотку (P2), в сравнении с селезенками мышей, которые получали преиммунную сыворотку (P0). Эти данные свидетельствуют о том, что анти-OPS O1 антитело, полученное к каркасному полимеру в вакцине варианта MAPS, было способно очищать ткани мышей от микроорганизмов и, таким образом, имело функциональную защитную активность in vivo.

На Фигуре 28 представлен график Каплана-Мейера выживаемости при пассивной защите мышей введенной кроличьей сывороткой против KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS перед инфицированием их Klebsiella штамма B5055 (O1: K2), выращенными в салицилате для уменьшения экспрессии капсулы. Мышам CD1 (5/группу) вводили в/б 0,1 мл объединенной кроличьей иммунной (P2) или преиммунной (P0) сыворотки, с последующим в/б бактериальным заражением 2×10⁴ КОЕ Klebsiella штамма B5055 (O1: K2). Показаны графики Каплана-Мейера выживаемости для мышей, получавших сыворотку P0 или P2 против KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS. Сыворотка P2 защищала животных в модели, с выживанием мышей, получавших сыворотку против KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS, в большем количестве и в течение более длительного времени, чем мышей, получавших сыворотку P0.

На Фигуре 29 представлены результаты ELISA конечных титров IgG против KP OPS в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 (5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине, экспериментальная группа 5), в сравнении с 4-валентной KP вакциной (5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине, экспериментальная группа 4).

На Фигуре 30 представлены результаты ELISA конечных титров IgG против PA OPS в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 (5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине, экспериментальная группа 5), в сравнении с 8-валентной PA вакциной (5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине, экспериментальная группа 4).

На Фигуре 31 представлены результаты ELISA конечных титров IgG против PA OPS в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 (например, 60 мкг суммарных PS в вакцине; 5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине), в сравнении с 12-валентной KP/PA вакциной 1 при (1 мкг PS от каждого типа BP в вакцине, экспериментальная группа 6).

На Фигуре 32 показаны индивидуальные титры IgG против каждого PS в 12-валентной KP/PA вакцине 1 в дозе 5 мкг (например, 60 мкг суммарных PS в вакцине; 5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине).

На Фигуре 33 показаны индивидуальные титры IgG против каждого PS в 12-валентной KP/PA вакцине 1 в дозе 1 мкг (например, 12 мкг суммарных PS в вакцине; 1 мкг PS от каждого типа BP в вакцине).

На Фигуре 34 показано увеличение индукции индивидуальных анти-OPS IgG в случае 12-валентной KP/PA вакцины в дозе 5 мкг.

На Фигуре 35 приведено сравнение увеличения индукции индивидуальных анти-OPS IgG в случае 12-валентной KP/PA вакцины в дозе 5 мкг PS на дозу BP и 1 мкг PS на дозу BP.

На Фигуре 36 представлены результаты ELISA конечных титров IgG против PA и KP OPS в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 2 в дозе 60 мкг, 5 мкг PS от каждого типа BP в дозе вакцины (экспериментальная группа 1), в сравнении с 12-валентной KP/PA вакциной 2 в дозе 12 мкг, 1 мкг PS от каждого типа BP в вакцине (экспериментальная группа 2).

На Фигуре 37 показаны индивидуальные титры IgG против каждого PS в 12-валентной KP/PA вакцине 2 в дозе 5 мкг.

На Фигуре 38 показано увеличение индукции индивидуальных анти-OPS IgG в случае 12-валентной KP/PA вакцины 2 в дозе 5 мкг.

На Фигуре 39 показаны результаты анализа ELISA кроличьих IgG против FlaBD2, индуцированных введением 12-валентной KP/PA вакцины 1, 12-валентной KP/PA вакцины 2, 8-валентной PA вакцины и 4-валентной KP вакцины.

На Фигуре 40 показаны результаты анализа ELISA кроличьих IgG против MrkA, индуцированных введением 12-валентной KP/PA вакцины 1, 12-валентной KP/PA вакцины 2, 8-валентной PA вакцины и 4-валентной KP вакцины.

На Фигуре 41 показаны результаты анализа ELISA кроличьих IgG против PcrV, индуцированных введением 12-валентной KP/PA вакцины 1.

На Фигуре 42 показано увеличение индукции индивидуальных IgG против белка-носителя, индуцированных введением 12-валентной KP/PA вакцины 1, 12-валентной KP/PA вакцины 2, 8-валентной PA вакцины и 4-валентной KP вакцины.

На Фигуре 43 показано увеличение индукции ответа на FlaB, вызванного введением различных вакцинных препаратов в трех исследованиях иммуногенности на кроликах: NCB007, NCB008 и NCB012.

На Фигуре 44 показано увеличение индукции ответа на MrkA, вызванного введением различных вакцинных препаратов в трех исследованиях иммуногенности на кроликах: NCB007, NCB008 и NCB012.

На Фигуре 45 показано увеличение индукции ответа на PcrV, вызванного введением различных вакцинных препаратов в трех исследованиях иммуногенности на кроликах: NCB007, NCB008 и NCB012.

На Фигуре 46 показано отсутствие биологической активности агониста TLR5 у белков-носителей, содержащих только домен 2 FlaB.

На Фигуре 47 показаны результаты анализа ОФУ человеческими нейтрофилами KP O2 K-штамма 7380.

На Фигуре 48A показаны результаты анализа поглощения и ОФУ с клеточной линией J774 макрофагов в присутствии гентамицина. На Фигуре 48B показаны результаты анализа поглощения и ОФУ с клеточной линией J774 макрофагов в отсутствие гентамицина.

На Фигуре 49 показаны результаты анализа защиты от гентамицина для PA и KP, опсонизированных объединенной сывороткой от кроликов, иммунизированных 12-валентной вакциной 1. Иммунная сыворотка (P2) опосредует поглощение бактерий макрофаг-подобными клетками J774, в отличие от преиммунной сыворотки (P0).

На Фигуре 50 показаны результаты микроскопического анализа поглощения бактерий макрофаг-подобными клетками J774 с использованием GFP-меченых PA. PA активно поглощаются после воздействия иммунной сыворотки.

На Фигуре 51 показано, что объединенная сыворотка от кроликов, получавших дозу 5 мкг 12-валентной KP/PA вакцины 1 (всего 60 мкг PS), стимулирует поглощение бактерий фагоцитирующими клетками.

На Фигуре 52 показана выживаемость клеток, в процентах, в анализе HL60 ОФУ с KP O2 штамма 7380.

На Фигуре 53 представлены результаты анализов, демонстрирующие, что антитела к PcrV защищают клетки от цитотоксичности. При смешивании штамма PA (без FlaB) с 12-валентной иммунной сывороткой (пул 10, высокая доза вакцины 1) наблюдается сниженная цитотоксичность для клеток в сравнении с использованием преиммунной сыворотки от тех же кроликов.

На Фигуре 54 показано, что клетки, обработанные объединенной сывороткой от кроликов, иммунизированных дозой 5 мкг (например, всего 60 мкг PS в вакцине; 5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине) 12-валентной KP/PA вакцины 1, демонстрируют сниженную подвижность штамма PA O5 FlaB через антитело к FlaB, в сравнении клетками, обработанными преиммунной сывороткой.

На Фигуре 55 показано, что объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных 4-валентной KP вакциной (доза 5 мкг, экспериментальная группа 4), не содержащей PA OPS, приводит к увеличению агрегации FlaB-экспрессирующих PA, что свидетельствует о том, что антитело, полученное против FlaB-содержащего белка-носителя, является функциональным.

На Фигуре 56 показано, что объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1, объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных 8-валентной PA вакциной (MrkA является единственным антигеном KP в 8-валентной PA вакцине), объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных 4-валентной KP вакциной, блокируют адгезию KP O5 штамма 6997 к клеткам A549. Данные свидетельствуют о том, что причиной является антитело к MrkA, индуцированное белком-носителем FlaBD2-MrkA.

На Фигуре 57 представлены результаты анализа клиренса крови для 3 мышей, зараженных KP O1 штамма B5055, через 1 час и 4 часа после заражения.

На Фигуре 58 показана нагрузка органа в печени и селезенке мышей после заражения KP O1 штамма B5055.

На Фигуре 59 представлены результаты анализа клиренса крови для 3 мышей, зараженных KP O5 штамма 6997, через 1 час и 4 часа после заражения.

На Фигуре 60 показана нагрузка органа в селезенке мышей после заражения KP O5 (штамм 6997).

На Фигуре 61 представлены результаты анализа пассивной защиты от нагрузки органа в селезенке мышей, показывающие клиренс KP O2 (штамм KPN-12) из системы кровообращения мышей, получивших сыворотку от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1.

На Фигуре 62 показаны различные иллюстративные оптимизированные протоколы и результаты экспериментов по пассивной защите мышей CD-1 при помощи преиммунной и иммунной сывороток против Klebsiella O2 K2 из исследования NCB012.

На Фигура 63 показана индукция IL-17a в стимулированных клетках селезенки от мышей, иммунизированных вакциной KP O1 MAPS, с последующим бактериальным заражением KP O1:K2 штамма B5055.

На Фигуре 64 представлен экспериментальный протокол и результаты исследования с колонизацией PA O6 ЖК тракта крыс, иммунизированных двумя дозами вакцины PA O6 MAPS, с последующим бактериальным заражением.

На Фигуре 65 представлено схематическое изображение структуры KP OPS Gal-I, Gal-II и Gal-III эпитопов.

На Фигуре 66 показано связывание с клетками, экспрессирующими эпитопы KP D-Gal-III и KP D-Gal-I, определенное методом проточной цитометрии в сыворотке от животных, иммунизированных 4-валентной KP PRO-CN MAPS вакциной.

На Фигуре 67 представлены результаты анализа методом проточной цитометрии, демонстрирующие, что антитела в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1, связываются с двумя из трех штаммов ST258 из бактериемических изолятов и также связываются с тремя из четырех штаммов серотипов, не присутствующих в вакцине с мутантными аллелями MrkA.

На Фигуре 68 показаны индивидуальные титры анти-OPS IgG после иммунизации BP-1 (группа 1) и BP-1.2 (группа 2) KP/PA 4-валентной MAPS вакциной.

На Фигуре 69 показан ответ в виде IgG на белок-носитель, наблюдаемый при сравнении объединенных сывороток против BP-1 MAPS (группа 1) и BP-1.2 MAPS (группа 2).

На Фигуре 70 показаны в отдельных сыворотках ответы в виде продуцирования антител к белку-носителю FlaBD2 для BP-1 и BP-1.2 (KP/PA, 4-валентная), соответственно.

На Фигуре 71 показаны в отдельных сыворотках ответы в виде продуцирования антител к белку-носителю MrkA для BP-1 и BP-1.2 (KP/PA, 4-валентная), соответственно.

Определения

В настоящей заявке, если иное не следует из контекста, (i) термин в единственном числе можно считать означающим «по меньшей мере один»; (ii) «или» можно понимать как «и/или»; (iii) термины «содержащие» и «включающие» можно понимать как охватывающие указанные компоненты или стадии, представленные либо в отдельности, либо совместно с одним или более дополнительными компонентами или стадиями; (iv) термины «примерно» и «приблизительно» следует считать допускающими стандартное отклонение, как понятно специалистам в данной области; и (v) при указании диапазонов конечные точки включены.

Примерно: Термин «примерно», используемый в настоящем изобретении применительно к значению, относится к значению, которое является аналогичным, в контексте указанного значения. Как правило, специалисты в данной области, знакомые с контекстом, понимают относительную степень отличия, охваченную термином «примерно» в этом контексте. Например, в некоторых вариантах осуществления термин «примерно» может охватывать диапазон значений, который находится в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, или менее, от указанного значения.

Введение: Используемый в настоящем изобретении термин «введение», как правило, означает введение композиции пациенту, или в систему, для обеспечения доставки средства, которое представляет собой, или включено в, композицию. Специалистам в данной области знакомо множество способов, которые можно, в соответствующих обстоятельствах, использовать для введения пациенту, например, человеку. Например, в некоторых вариантах осуществления введение может быть внутриглазным, пероральным, парентеральным, топическим и так далее. В некоторых конкретных вариантах осуществления введение может быть бронхиальным (например, путем бронхиальной инстилляции), трансбуккальным, кожным (которое может представлять собой, или включать, например, одно или более из топического введения на кожу, внутрикожного, подкожного, чрескожного и так далее), энтеральным, внутриартериальным, внутрикожным, внутрижелудочным, интрамедуллярным, внутримышечным, интраназальным, внутрибрюшинным, интратекальным, внутривенным, интравентрикулярным, в конкретный орган (например, в печень), мукозальным, назальным, пероральным, ректальным, подкожным, подъязычным, топическим, трахеальным (например, путем интратрахеальной инстилляции), вагинальным, интравитреальным и так далее. В некоторых вариантах осуществления введение может включать введение одной дозы. В некоторых вариантах осуществления введение может включать введение фиксированного количества доз. В некоторых вариантах осуществления введение может включать прерывистое (например, несколько доз, разделенных во времени) и/или периодическое (например, отдельные дозы, разделенные одинаковыми временными интервалами) введение доз. В некоторых вариантах осуществления введение может включать непрерывное введение дозы (например, перфузию) в течение по меньшей мере выбранного периода времени.

Средство: В настоящем изобретении термин «средство», как правило, может быть использован для обозначения соединения или объекта любого химического класса, включая, например, полипептид, нуклеиновую кислоту, сахарид, липид, малую молекулу, металл, либо их сочетание или комплекс. При определенных обстоятельствах, как понятно из контекста специалистам в данной области, термин может быть использован для обозначения объекта, который представляет собой, или содержит, клетку или микроорганизм, или его фракцию, экстракт или компонент. Альтернативно или дополнительно, как будет понятно из контекста, термин может быть использован для обозначения естественного продукта, в том отношении, что он встречается, и/или может быть получен, в природе. В некоторых случаях, опять-таки, как будет понятно из контекста, термин может быть использован для обозначения одного или более объектов, которые являются искусственными в том отношении, что они спроектированы, сконструированы и/или созданы рукой человека, и/или не встречаются в природе. В некоторых вариантах осуществления средство может быть использовано в выделенной или чистой форме; в некоторых вариантах осуществления средство может быть использовано в необработанной форме. В некоторых вариантах осуществления потенциальные средства могут быть предоставлены в виде наборов или библиотек, например, которые могут быть подвергнуты скринингу для идентификации или определения характеристик активных средств в их составе. В некоторых случаях термин «средство» может относиться к соединению или объекту, представляющему собой, или содержащему, полимер; в некоторых случаях термин может относиться к соединению или объекту, содержащему один или более полимерных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления термин «средство» может относиться к соединению или объекту, не являющемуся полимером и/или практически свободному от любого полимера и/или от одного или более конкретных полимерных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления термин может относиться к соединению или объекту, лишенному или практически свободному от любого полимерного фрагмента.

Аминокислота: В самом широком смысле используемый в настоящем изобретении термин «аминокислота» относится к любому соединению и/или веществу, которое может быть включено в полипептидную цепь, например, за счет образования одной или более пептидных связей. В некоторых вариантах осуществления аминокислота имеет общую структуру H₂N-C(H)(R)-COOH. В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой природную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой неприродную аминокислоту; в некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой D-аминокислоту; в некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой Lаминокислоту. Термин «стандартная аминокислота» относится к любой из двадцати стандартных L-аминокислот, обычно встречающихся в природных пептидах. Термин «нестандартная аминокислота» относится к любой аминокислоте, отличающейся от стандартных аминокислот, независимо от того, получена ли она путем синтеза, или из природного источника. В некоторых вариантах осуществления аминокислота, включая карбокси- и/или амино-концевую аминокислоту в полипептиде, может иметь структурную модификацию в сравнении с общей структурой, приведенной выше. Например, в некоторых вариантах осуществления аминокислота может быть модифицирована путем метилирования, амидирования, ацетилирования, пегилирования, гликозилирования, фосфорилирования и/или замены (например, аминогруппы, карбоксильной группы, одного или более протонов и/или гидроксильной группы) в сравнении с общей структурой. В некоторых вариантах осуществления такая модификация может, например, изменять время полувыведения из системы кровообращения полипептида, содержащего модифицированную аминокислоту, в сравнении с полипептидом, содержащим в остальном идентичную, не модифицированную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления такая модификация существенно не изменяет соответствующую активность полипептида, содержащего модифицированную аминокислоту, в сравнении с полипептидом, содержащим в остальном идентичную, не модифицированную аминокислоту. Как будет понятно из контекста, в некоторых вариантах осуществления термин «аминокислота» может быть использован для обозначения свободной аминокислоты; в некоторых вариантах осуществления он может быть использован для обозначения аминокислотного остатка полипептида.

Антитело: Используемый в настоящем изобретении термин «антитело» относится к полипептиду, содержащему канонические элементы последовательности иммуноглобулина, достаточные для придания свойства специфического связывания конкретного антигена-мишени. Как известно в данной области, интактные антитела, продуцируемые в природе, представляют собой тетрамерные молекулы размером примерно 150 кДа, состоящие из двух идентичных полипептидов тяжелой цепи (каждая размером примерно 50 кДа) и двух идентичных полипептидов легкой цепи (каждая размером примерно 25 кДа), которые связаны друг с другом в структуру, обычно называемую «Y-образной» структурой. Каждая тяжелая цепь состоит из по меньшей мере четырех доменов (каждый длиной примерно 110 аминокислот) - амино-концевого вариабельного (VH) домена (расположенного на концах Y-образной структуры), за которым следуют три константных домена: CH1, CH2 и карбокси-концевой CH3 (расположенный у основания стебля «Y»). Короткая область, известная как «переход», соединяет вариабельную и константные области тяжелой цепи. «Шарнир» соединяет домены CH2 и CH3 с остальной частью антитела. Два дисульфидных моста в этой шарнирной области соединяют два полипептида тяжелой цепи друг с другом в интактном антителе. Каждая легкая цепь состоит из двух доменов - амино-концевого вариабельного (VL) домена, за которым следует карбокси-концевой константный (CL) домен, они отделены друг от друга еще одним «переходом». Тетрамеры интактного антитела состоят из двух димеров тяжелая цепь-легкая цепь, в которых тяжелая и легкая цепи связаны друг с другом одной дисульфидной связью; две другие дисульфидные связи соединяют шарнирные области тяжелых цепей друг с другом, так что димеры связаны друг с другом, образуя тетрамер. Продуцируемые в природе антитела также являются гликозилированными, как правило, на домене CH2. Каждый домен в природном антителе имеет структуру, называемую «укладкой цепи иммуноглобулинов», которая образована из двух бета-складчатых слоев (например, 3-, 4- или 5-цепочечных складчатых слоев), упакованных друг против друга в плотную антипараллельную бета-бочку. Каждый вариабельный домен содержит три гипервариабельные петли, известные как «определяющие комплементарность области» (CDR1, CDR2 и CDR3), и четыре в некоторой степени инвариантные «каркасные» области (FR1, FR2, FR3 и FR4). При сворачивании природных антител области FR образуют бета-складчатые структуры, которые создают структурный каркас для доменов, области петель CDR, как из легкой, так и из тяжелой, цепей сближаются в трехмерном пространстве, образуя один гипервариабельный антигенсвязывающий сайт, расположенный на конце «Y» структуры. Fc-область природных антител связывается с элементами системы комплемента, а также с рецепторами на эффекторных клетках, включая, например, эффекторные клетки, которые опосредуют цитотоксичность. Как известно в данной области, аффинность и/или другие характеристики связывания Fc-областей с Fc-рецепторами можно модулировать путем гликозилирования или другой модификации. В некоторых вариантах осуществления антитела, полученные и/или используемые в соответствии с настоящим изобретением, содержат гликозилированные Fc-домены, включая Fc-домены, модифицированные или сконструированные с использованием такого гликозилирования. Для целей настоящего изобретения, в конкретных вариантах осуществления любой полипептид или комплекс полипептидов, включающий достаточные последовательности доменов иммуноглобулина, которые имеются в природных антителах, можно называть и/или использовать в качестве «антитела», независимо от того, произведен ли полипептид естественным образом (например, выработан организмом в ответ на антиген), или произведен рекомбинантными методами, химическим синтезом или с использованием другой искусственной системы или методологии. В некоторых вариантах осуществления антитело является поликлональным; в некоторых вариантах осуществления антитело является моноклональным. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет последовательности константной области, которые характерны для антител мыши, кролика, примата или человека. В некоторых вариантах осуществления элементы последовательности антитела являются гуманизированными, приматизированными, химерными, и так далее, как известно в данной области. Кроме того, используемый в настоящем изобретении термин «антитело» в соответствующих вариантах осуществления может означать (если нет иных указаний или не очевидно из контекста) любой из известных в данной области или разработанных конструктов или форматов для использования структурных и функциональных признаков антитела в альтернативной презентации. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело, используемое по настоящему изобретению, имеет формат, выбранный из, но без ограничения, интактных IgA, IgG, IgE или IgM антител; би- или мультиспецифических антител (например, Zybodies^® и так далее); фрагментов антител, таких как Fab-фрагменты, Fab’-фрагменты, F(ab’)₂-фрагменты, Fd’-фрагменты, Fd-фрагменты, а также выделенные области CDR или их наборы; одноцепочечных Fv; продуктов слияния полипептид-Fc; однодоменных антител (например, однодоменных антител акулы, таких как IgNAR или их фрагменты); верблюжьих антител; маскированных антител (например, Probodies^®); иммунофармацевтических средств на основе модульного белка малого размера (Small Modular ImmunoPharmaceuticals («SMIP™»); одноцепочечных или тандемных диател (TandAb^®); VHH; антикалинов^®; нанотел^® минител; BiTE^®; белков, содержащих анкириновые повторы, или дарпинов^®; авимеров^®; DART; TCR-подобных антител;, аднектинов^®; аффилинов^®; транстел^®; аффител^®; ТримерX^®; микробелков; финомеров^®, центиринов^® и калбиторов^®. В некоторых вариантах осуществления у антитела может отсутствовать ковалентная модификация (например, присоединение гликана), которую оно бы имело в случае естественного продуцирования. В некоторых вариантах осуществления антитело может иметь ковалентную модификацию (например, присоединение гликана, полезной нагрузки (например, детектируемого фрагмента, терапевтического фрагмента, каталитического фрагмента и так далее), или другую боковую группу (например, полиэтиленгликоль и так далее).

Антиген: Используемый в настоящем изобретении термин «антиген» означает (i) средство, вызывающее иммунный ответ; и/или (ii) средство, которое связывается с T-клеточным рецептором (например, при представлении молекулой MHC) или с антителом. В некоторых вариантах осуществления антиген вызывает гуморальный ответ (например, включающий продуцирование антиген-специфических антител); в некоторых вариантах осуществления антиген вызывает клеточный ответ (например, с вовлечением T-клеток, рецепторы которых специфически взаимодействуют с антигеном). В некоторых вариантах осуществления антиген вызывает гуморальный ответ и клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления антиген связывается с антителом, и может вызывать или не вызывать конкретный физиологический ответ в организме. Как правило, антиген может представлять собой, или содержать, любую химическую молекулу, такую как, например, малая молекула, нуклеиновая кислота, полипептид, углевод, липид, полимер (в некоторых вариантах осуществления отличный от биологического полимера (например, отличный от нуклеотидного или аминокислотного полимера)) и так далее. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой, или содержит, полипептид. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой, или содержит, полисахарид. Специалисты в данной области понимают, что, как правило, антиген может быть предоставлен в выделенной или чистой форме, или, альтернативно, может быть предоставлен в необработанной форме (например, вместе с другими материалами, например, в экстракте, таком как клеточный экстракт или другой относительно необработанный содержащий антиген источник). В некоторых вариантах осуществления антигены, используемые по настоящему изобретению, предоставлены в необработанной форме. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой рекомбинантный антиген.

Связанные с: Два объекта являются «связанными» друг с другом, при использовании этого термина в настоящем изобретении, если присутствие, уровень и/или форма одного коррелирует с соответствующими характеристиками другого. В некоторых вариантах осуществления два или более объектов физически «связаны» между собой, если они взаимодействуют, прямо или опосредованно, так, что они находятся и/или остаются в физической близости друг с другом. В некоторых вариантах осуществления два или более объектов, которые физически связаны между собой, являются ковалентно связанными между собой; в некоторых вариантах осуществления два или более объектов, которые физически связаны между собой, не являются ковалентно связанными между собой, но являются связанными нековалентно, например, за счет аффинности взаимодействия, водородных связей, ван-дер-ваальсовых сил, гидрофобных взаимодействий, магнетизма, а также их сочетаний.

Каркасный полимер: Используемый в настоящем изобретении термин «каркасный полимер» означает полимер, с которым конъюгированы, или могут быть конъюгированы, один или более полисахаридов (например, антигенных полисахаридов). В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой полимер и один или более полисахаридов (например, антигенных полисахаридов), конъюгированных с полимером.

Связывание: Следует понимать, что используемый в настоящем изобретении термин «связывание», как правило, означает нековалентную ассоциацию между, или среди, двумя, или более, объектами. «Прямое связывание» включает физический контакт между объектами или фрагментами; непрямое связывание включает физическое взаимодействие путем физического контакта с одним или более промежуточными объектами. Связывание между двумя или более объектами можно, как правило, оценивать в любом из различных контекстов - включая случаи, когда взаимодействующие объекты или фрагменты изучают в изоляции или в контексте более сложных систем (например, в ковалентной или иной ассоциации с носителем и/или в биологической системе или клетке).

Белок-носитель: Используемый в настоящем изобретении термин «белок-носитель» означает белок или пептид, который вызывает или усиливает иммунный ответ на связанный с ним, или находящийся в комплексе с ним, гаптен. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ, вызванный или усиленный белком-носителем, представляет собой ответ на гаптен. В некоторых вариантах осуществления не развивается какой-либо существенный ответ на сам белок-носитель; в некоторых вариантах осуществления ответ на белок-носитель может быть обнаружен. В некоторых вариантах осуществления белок-носитель находится в комплексе с одной или более другими молекулами.

Клик-химия: Используемый в настоящем изобретении термин «клик-химия» означает быструю и высокопроизводительную реакцию, например, описанную K. B. Sharpless в 2001 г. В некоторых вариантах осуществления в реакции клик-химии образуются побочные продукты, которые могут быть удалены без применения хроматографии. В некоторых вариантах осуществления в реакции клик-химии образуются только побочные продукты, которые могут быть удалены без применения хроматографии. В некоторых вариантах осуществления реакция клик-химии является стереоспецифической. В некоторых вариантах осуществления реакцию клик-химии можно проводить с использованием одного или более легко удаляемых растворителей. В некоторых вариантах осуществления реакцию клик-химии можно проводить с использованием одного или более слабых растворителей. В некоторых вариантах осуществления в реакции клик-химии используют катализируемую медью реакцию азид-алкинового циклоприсоединения для соединения одного или более молекулярных объектов. В некоторых вариантах осуществления один или более молекулярных объектов не ограничены молекулярными размерами. В некоторых вариантах осуществления реакция клик-химии может быть биоортогональной; например, ни реагенты, ни функциональные группы их продуктов не взаимодействуют с функционализированными биомолекулами, и/или реакция протекает легко в мягких нетоксичных условиях, например, при комнатной температуре и, предпочтительно, в воде. В некоторых вариантах осуществления реакция клик-химии может представлять собой катализируемое медью циклоприсоединение Хьюсгена, азид-алкиновое [3+2] биполярное циклоприсоединение, лигирование Штаудингера, или азид-фосфиновое лигирование. В некоторых вариантах осуществления клик-химию можно использовать для связывания между собой двух полимеров (например, двух нуклеиновых кислот или нуклеиновую кислоту и белок или пептид, или два гликополимера, и так далее).

Колонизация (например, слизистой оболочки или ЖК тракта): Используемый в настоящем изобретении термин «колонизация» означает способность микроорганизма создавать нишу в анатомической зоне, например, слизистой оболочке, участке повреждения, органе и так далее.

Комбинированная терапия: Используемый в настоящем изобретении термин «комбинированная терапия» относится к ситуациям, когда пациент одновременно подвергается воздействию двух или более терапевтических режимов (например, двух или более лекарственных средств). В некоторых вариантах осуществления два или более режимов могут быть применены одновременно; в некоторых вариантах осуществления такие режимы могут быть применены последовательно (например, все «дозы» первого режима вводят до введения какой-либо из доз второго режима); в некоторых вариантах осуществления такие средства вводят в перекрывающихся режимах дозирования. В некоторых вариантах осуществления «применение» комбинированной терапии может включать применение одного или более средств или методов лечения для пациента, получающего другое средство(а) или метод(ы) лечения, в сочетании. Для ясности, для комбинированной терапии не требуется, чтобы отдельные средства были введены совместно в одной композиции (или даже обязательно в одно и то же время), хотя в некоторых вариантах осуществления два или более средств, или их активных фрагментов, могут быть введены совместно в комбинированной композиции, или даже в комбинированном соединении (например, в виде части одного химического комплекса или ковалентно связанного объекта).

Композиция: Специалисты в данной области понимают, что используемый в настоящем изобретении термин «композиция» может быть использован для обозначения дискретного физического объекта, который содержит один или более определенных компонентов. Как правило, если не указано иначе, композиция может иметь любую форму - например, газ, гель, жидкость, твердое вещество и так далее.

Производное: Используемый в настоящем изобретении термин «производное» означает структурный аналог эталонного вещества. То есть, «производное» представляет собой вещество, которое имеет значительное структурное сходство с эталонным веществом, например, общую центральную или консенсусную структуру, но также и отличается некоторыми дискретными признаками. В некоторых вариантах осуществления производное представляет собой вещество, которое может быть получено из эталонного вещества путем химических манипуляций. В некоторых вариантах осуществления производное представляет собой вещество, которое может быть получено путем проведения процесса синтеза, в значительной степени аналогичного (например, имеющего множество общих этапов) тому, который приводит к получению эталонного вещества.

Домен: Используемый в настоящем изобретении термин «домен» означает секцию или часть объекта. В некоторых вариантах осуществления «домен» связан с конкретным структурным и/или функциональным признаком объекта таким образом, что, когда домен физически отделен от остальной части исходного объекта, он в значительной степени, или полностью, сохраняет конкретный структурный и/или функциональный признак. Альтернативно или дополнительно, домен может представлять собой, или включать, часть объекта, которая при отделении от этого (исходного) объекта и связывании с другим объектом (реципиентом) в значительной степени сохраняет и/или передает объекту-реципиенту один или более структурных и/или функциональных признаков, которые характеризуют его в исходном объекте. В некоторых вариантах осуществления домен представляет собой секцию или часть молекулы (например, малой молекулы, углевода, липида, нуклеиновой кислоты или полипептида). В некоторых вариантах осуществления домен представляет собой секцию полипептида; в некоторых таких вариантах осуществления домен характеризуется конкретным структурным элементом (например, конкретной аминокислотной последовательностью или мотивом последовательности, α-спиральной структурой, β-складчатой структурой, биспиральной структурой, случайной спиральной структурой и так далее), и/или конкретным функциональным признаком (например, активностью связывания, ферментативной активностью, активностью сворачивания, активностью сигнализации и так далее).

Лекарственная форма или стандартная лекарственная форма: Специалисты в данной области понимают, что термин «лекарственная форма» может быть использован для обозначения физически дискретной единицы активного средства (например, терапевтического или диагностического средства) для введения пациенту. Как правило, каждая такая единица содержит заранее определенное количество активного средства. В некоторых вариантах осуществления такое количество представляет собой количество стандартной дозы (или ее целой части), подходящее для введения в соответствии с режимом введения, который был выбран для достижения желаемого или полезного результата при введении соответствующей популяции (то есть, в соответствии с терапевтическим режимом дозирования). Специалисты в данной области понимают, что общее количество терапевтической композиции, или средства, введенное конкретному пациенту, определяет один или более практикующих врачей, и его можно вводить во множестве лекарственных форм.

Режим дозирования: Специалисты в данной области понимают, что термин «режим дозирования» может быть использован для обозначения набора стандартных доз (как правило, более одной), индивидуально вводимых пациенту, как правило, с некоторыми интервалами времени. В некоторых вариантах осуществления конкретное лекарственное средство имеет рекомендованный режим дозирования, который может включать введение одной или более доз. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение множества доз, при этом каждую из них вводят через некоторый промежуток времени. В некоторых вариантах осуществления временные интервалы между введениями отдельных доз являются одинаковыми; в некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение множества доз, и имеют место по меньшей мере два разных временных интервала между введением отдельных доз. В некоторых вариантах осуществления все дозы в режиме дозирования являются одинаковыми в отношении вводимого количества. В некоторых вариантах осуществления разные дозы в режиме дозирования являются разными в отношении вводимого количества. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение первой дозы в первом количестве дозы, с последующим введением одной или более дополнительных доз во втором количестве дозы, отличающемся от первого количества дозы. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение первой дозы в первом количестве дозы, с последующим введением одной или более дополнительных доз во втором количестве дозы, таком же, как первое количество дозы. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования приводит к достижению желаемого или полезного результата при введении соответствующей популяции (то есть, представляет собой терапевтический режим дозирования).

Эпитоп: Используемый в настоящем изобретении термин «эпитоп» охватывает любой фрагмент, который специфически узнается связывающим компонентом иммуноглобулина (например, антителом или рецептором). В некоторых вариантах осуществления эпитоп состоит из множества химических атомов или групп на антигене. В некоторых вариантах осуществления такие химические атомы или группы экспонируются на поверхности, когда антиген принимает соответствующую трехмерную конформацию. В некоторых вариантах осуществления такие химические атомы или группы физически расположены в пространстве в непосредственной близости друг от друга, когда антиген принимает такую конформацию. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере некоторые такие химические атомы или группы физически отдаляются друг от друга, когда антиген принимает альтернативную конформацию (например, линеаризуется).

Экзополисахарид: Используемый в настоящем изобретении термин «экзополисахарид» относится к природным высокомолекулярным полимерам, состоящим из остатков сахара и секретируемым микроорганизмами в окружающую их среду. Экзополисахариды могут быть названы взаимозаменяемо внеклеточными полисахаридами (ВПС). ВПС обеспечивают функциональную и структурную целостность биопленок и считаются фундаментальным компонентом, определяющим физико-химические свойства биопленки. ВПС составляют от 50% до 90% общего органического вещества биопленок.

Фрагмент: «Фрагмент» материала или объекта, описанного в настоящем изобретении, имеет структуру, которая включает дискретную часть целого, но лишена одного или более фрагментов, имеющихся в целом объекте. В некоторых вариантах осуществления фрагмент состоит из такой дискретной части. В некоторых вариантах осуществления фрагмент включает дискретную часть целого, при этом дискретная часть имеет одну или более функциональных характеристик, общих с целым объектом. В некоторых вариантах осуществления фрагмент состоит из такой дискретной части. В некоторых вариантах осуществления фрагмент состоит из, или содержит характерный структурный элемент или группу, имеющиеся в целом объекте. В некоторых вариантах осуществления фрагмент полимера содержит, или состоит из, по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, или более, мономерных единиц (например, остатков), которые присутствуют в целом полимере. В некоторых вариантах осуществления фрагмент полимера содержит, или состоит из, по меньшей мере примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или более, мономерных единиц (например, остатков), которые присутствуют в целом полимере. В некоторых вариантах осуществления целый материал или объект может быть назван «исходным» целым.

Гомология: Используемый в настоящем изобретении термин «гомология» относится к общему родству между полимерными молекулами, например, между молекулами нуклеиновой кислоты (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК) и/или между полипептидными молекулами. В некоторых вариантах осуществления полимерные молекулы считают «гомологичными» друг другу, если их последовательности имеют идентичность по меньшей мере 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. В некоторых вариантах осуществления полимерные молекулы считают «гомологичными» друг другу, если их последовательности имеют сходство по меньшей мере 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%.

Идентичность: Используемый в настоящем изобретении термин «идентичность» относится к общему родству между полимерными молекулами, например, между молекулами нуклеиновой кислоты (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК) и/или между полипептидными молекулами. В некоторых вариантах осуществления полимерные молекулы считают «в значительной степени идентичными» друг другу, если их последовательности имеют идентичность по меньшей мере 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. Рассчитывать процент идентичности двух нуклеотидных или полипептидных последовательностей, например, можно путем выравнивания двух последовательностей для целей оптимального сравнения (например, делеции могут быть внесены в одну или обе из первой и второй последовательностей для оптимального выравнивания, и неидентичные последовательности можно не учитывать для целей сравнения). В конкретных вариантах осуществления длина последовательности, выравниваемой для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или практически 100% от длины эталонной последовательности. Затем сравнивают нуклеотиды в соответствующих положениях. Если положение в первой последовательности занято тем же остатком (например, нуклеотидом или аминокислотой), что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы идентичны в этом положении. Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от числа идентичных положений в обеих последовательностях, с учетом числа делеций и длины каждой делеции, которые необходимо внести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнять с использованием математического алгоритма. Например, процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определять с использованием алгоритма Майерса-Миллера (CABIOS, 1989, 4: 11-17), который включен в программу ALIGN (версия 2.0). В некоторых иллюстративных вариантах осуществления для сравнений нуклеотидных последовательностей, выполняемых при помощи программы ALIGN, используют таблицу весов замен остатков PAM120, штраф за удлинение делеции 12 и штраф за внесение делеции 4. Альтернативно, процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определять с использованием программы GAP в пакете программ GCG, используя матрицу NWSgapDNA.CMP.

«Улучшение», «увеличение», «ингибирование» или «уменьшение»: Используемые в настоящем изобретении термины «улучшение», «увеличение», «ингибирование», «уменьшение», или их грамматические эквиваленты, указывают на изменение значений относительно исходного уровня или другого эталонного показателя. В некоторых вариантах осуществления соответствующий эталонный показатель может представлять собой, или включать, показатель в конкретной системе (например, у одного индивидуума) при сопоставимых во всем остальном условиях, за исключением присутствия (например, до и/или после) конкретного средства или воздействия, или в присутствии соответствующего сопоставимого эталонного средства. В некоторых вариантах осуществления соответствующий эталонный показатель может представлять собой, или включать, показатель в сопоставимой системе, который, как известно или как ожидается, будет отвечать определенным образом в присутствии соответствующего средства или воздействия.

Выделенные: Используемый в настоящем изобретении термин означает вещество, и/или объект, которое было (1) отделено от по меньшей мере некоторых из компонентов, с которыми оно было связано, когда было исходно получено (или в природе и/или в экспериментальных условиях), и/или (2) сконструировано, продуцировано, получено и/или изготовлено рукой человека. Выделенные вещества, и/или объекты, могут быть отделены от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более приблизительно 99% других компонентов, с которыми они были исходно связаны. В некоторых вариантах осуществления выделенные средства являются на приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более приблизительно 99% чистыми. В настоящем изобретении вещество называют «чистым», если оно в значительной степени свободно от других компонентов. В некоторых вариантах осуществления, как понятно специалистам в данной области, вещество все-еще может считаться «выделенным» или даже «чистым» после объединения с некоторыми другими компонентами, такими как, например, один или более носителей или эксципиентов (например, буфер, растворитель, вода и так далее); в таких вариантах осуществления степень, в процентах, изолированности или чистоты вещества рассчитывают без учета таких носителей или эксципиентов. В качестве одного примера, в некоторых вариантах осуществления биологический полимер, такой как полипептид или полинуклеотид, существующий в природе, считают «выделенным», если a) в силу своего происхождения, или источника происхождения, он не связан с некоторыми или всеми компонентами, которые сопровождают его в его естественном состоянии в природе; b) он является в значительной степени свободным от других полипептидов или нуклеиновых кислот того же вида от биологического вида, который продуцирует его в природе; c) он экспрессируется или иным образом связан с компонентами из клетки, или другой экспрессионной системы, не принадлежащей биологическому виду, который продуцирует его в природе. Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления полипептид, который химически синтезирован или синтезирован в клеточной системе, отличной от той, которая продуцирует его в природе, считают «выделенным» полипептидом. Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления полипептид, к которому были применены один или более методов очистки, можно считать «выделенным» полипептидом в той степени, в которой он был отделен от других компонентов a) с которыми он связан в природе; и/или b) с которыми он был связан, когда исходно был продуцирован.

Линкер: Используемый в настоящем изобретении термин «линкер» означает часть многокомпонентного средства, которая соединяет разные компоненты друг с другом. Например, специалисты в данной области понимают, что полипептид, структура которого включает два или более функциональных или организационных доменов, часто включает последовательность аминокислот между такими доменами, которая связывает их друг с другом. В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий элемент линкера, в целом, имеет структуру общей формулы S1-L-S2, где S1 и S2 могут быть одинаковыми или разными, и представляют собой два домена, связанные друг с другом линкером. В некоторых вариантах осуществления полипептидный линкер имеет длину по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер характеризуется тем, что он не принимает жесткую трехмерную структуру, а, скорее, обеспечивает гибкость полипептиду. Множество различных элементов линкера, которые могут быть соответствующим образом использованы при конструировании полипептидов (например, слитых полипептидов), известны в данной области (Holliger et al., 1993; Poljak, 1994).

Фармацевтическая композиция: Используемый в настоящем изобретении термин «фармацевтическая композиция» означает композицию, в которой активное средство составлено совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями. В некоторых вариантах осуществления активное средство присутствует в стандартном количестве дозы, подходящем для введения в терапевтическом режиме, который имеет статистически значимую вероятность достижения заранее определенного терапевтического эффекта при введении соответствующей популяции. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может быть специально составлена для введения в твердой или жидкой форме, включая формы, адаптированные для: перорального введения, например, жидкие лекарственные формы (водные или неводные растворы или суспензии), таблетки, например, предназначенные для трансбуккальной, подъязычной и системной абсорбции, болюсы, порошки, гранулы, пасты для нанесения на язык; парентерального введения, например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидуральной инъекции, в виде, например, стерильного раствора или суспензии, или препарата с замедленным высвобождением; топического нанесения, например, в виде крема, мази, пластыря с контролируемым высвобождением или спрея, наносимого на кожу, в легкие или ротовую полость; интравагинального или интраректального введения, например, в виде пессария, крема или пены; подъязычного; глазного; чрескожного введения; назального, легочного введения и введения на другие слизистые поверхности.

Фармацевтически приемлемые: В настоящем изобретении термин «фармацевтически приемлемые», используемый применительно к носителю, разбавителю или эксципиенту, которые используют для формулирования композиции, раскрытой в настоящем изобретении, означает, что носитель, разбавитель или эксципиент должны быть совместимы с другими ингредиентами композиции и не наносить вред реципиенту.

Полисахарид: Используемый в настоящем изобретении термин «полисахарид» означает полимерную углеводную молекулу, состоящую из длинных цепей моносахаридных единиц, связанных между собой гликозидными связями, которая при гидролизе распадается на составляющие ее моносахариды или олигосахариды. Полисахариды имеют структуру в диапазоне от линейной до сильно разветвленной. Примеры включают запасающие полисахариды, такие как крахмал и гликоген, структурные полисахариды, такие как целлюлоза и хитин, а также микробные полисахариды и антигенные полисахариды, присутствующие в микроорганизмах, включая, но без ограничения, OPS, CPS, COPS и LPS.

Профилактика или предотвращение: В настоящем изобретении при использовании в связи с возникновением заболевания, нарушения и/или состояния термины «профилактика» или «предотвращение» означают уменьшение риска развития заболевания, нарушения и/или состояния, и/или отсрочку начала проявления одного или более признаков или симптомов заболевания, нарушения или состояния. Предотвращение можно считать полным, если начало развития заболевания, нарушения или состояния было отсрочено на заранее определенный период времени.

Белок: Используемый в настоящем изобретении термин «белок» означает полипептид (то есть, цепь из по меньшей мере двух аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями). Белки могут включать фрагменты, отличные от аминокислот (например, могут представлять собой гликопротеины, протеогликаны и так далее), и/или могут быть иным образом обработаны или модифицированы. Специалисты в данной области понимают, что «белок» может представлять собой полную полипептидную цепь, которая продуцируется клеткой (с сигнальной последовательностью или без нее), или может представлять собой ее характерную часть. Специалисты в данной области понимают, что белок может иногда содержать более одной полипептидной цепи, например, связанные одной или более дисульфидными связями или связанные другим способом. Полипептиды могут содержать L-аминокислоты, D-аминокислоты, или и те, и другие, и могут иметь любые из множества аминокислотных модификаций или аналогов, известных в данной области. Полезные модификации включают, например, концевое ацетилирование, амидирование, метилирование и так далее. В некоторых вариантах осуществления белки могут содержать природные аминокислоты, неприродные аминокислоты, синтетические аминокислоты и их сочетания. Термин «пептид», как правило, используют для обозначения полипептида, имеющего длину менее приблизительно 100 аминокислот, менее приблизительно 50 аминокислот, менее 20 аминокислот или менее 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления белки представляют собой антитела, фрагменты антител, их биологически активные части и/или их характерные части.

Полипептид: Используемый в настоящем изобретении термин «полипептид», как правило, является признанным в данной области обозначением полимера из по меньшей мере трех аминокислот. Специалисты в данной области понимают, что термин «полипептид» должен быть достаточно общим, чтобы охватывать не только полипептиды, имеющие полную последовательность, приведенную в настоящем изобретении, но также охватывать полипептиды, которые представляют собой функциональные фрагменты (то есть, фрагменты, сохраняющие по меньшей мере одну активность) таких полных полипептидов. Кроме того, специалисты в данной области понимают, что белковые последовательности, как правило, могут допускать некоторую степень изменения без нарушения активности. Таким образом, любой полипептид, который сохраняет активность и имеет, в целом, по меньшей мере приблизительно 30-40% идентичности последовательности, часто более приблизительно 50%, 60%, 70% или 80%, и также, как правило, включает по меньшей мере одну область с гораздо более высокой степенью идентичности, часто более 90% или даже 95%, 96%, 97%, 98% или 99% в одной или более высоко консервативных областях, как правило, включающих по меньшей мере 3-4 и часто до 20 или более аминокислот, с другим полипептидом того же класса, охвачен соответствующим используемым в настоящем изобретении термином «полипептид». Полипептиды могут содержать L-аминокислоты, D-аминокислоты, или и те, и другие, и могут иметь любые из множества аминокислотных модификаций или аналогов, известных в данной области. Полезные модификации включают, например, концевое ацетилирование, амидирование, метилирование и так далее. В некоторых вариантах осуществления белки могут содержать природные аминокислоты, неприродные аминокислоты, синтетические аминокислоты и их сочетания.

Предотвращение: Используемый в настоящем изобретении термин «предотвращение» означает отсрочку начала развития и/или уменьшение частоты и/или степени тяжести одного или более симптомов конкретного заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления предотвращение оценивают на базе популяции, таким образом, считают, что средство «предотвращает» конкретное заболевание, нарушение или состояние, если статистически значимое уменьшение развития, частоты и/или интенсивности одного или более симптомов заболевания, нарушения или состояния наблюдается в популяции, предрасположенной к заболеванию, нарушению или состоянию. Предотвращение можно считать полным, если начало развития заболевания, нарушения или состояния было отсрочено на заранее определенный период времени.

Белок: Используемый в настоящем изобретении термин «белок» означает полипептид (то есть, цепь из по меньшей мере двух аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями). Белки могут включать фрагменты, отличные от аминокислот (например, могут представлять собой гликопротеины, протеогликаны и так далее), и/или могут быть иным образом обработаны или модифицированы. Специалисты в данной области понимают, что «белок» может представлять собой полную полипептидную цепь, которая продуцируется клеткой (с сигнальной последовательностью или без нее), или может представлять собой ее характерную часть. Специалисты в данной области понимают, что белок может иногда содержать более одной полипептидной цепи, например, связанные одной или более дисульфидными связями или связанные другим способом. Полипептиды могут содержать L-аминокислоты, D-аминокислоты, или и те, и другие, и могут иметь любые из множества аминокислотных модификаций или аналогов, известных в данной области. Полезные модификации включают, например, концевое ацетилирование, амидирование, метилирование и так далее. В некоторых вариантах осуществления белки могут содержать природные аминокислоты, неприродные аминокислоты, синтетические аминокислоты и их сочетания. Термин «пептид», как правило, используют для обозначения полипептида, имеющего длину менее приблизительно 100 аминокислот, менее приблизительно 50 аминокислот, менее 20 аминокислот или менее 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления белки представляют собой антитела, фрагменты антител, их биологически активные части и/или их характерные части.

Рекомбинантные: Используемый в настоящем изобретении термин «рекомбинантные» означает полипептиды, которые были спроектированы, сконструированы, получены, экспрессированы, созданы, изготовлены и/или выделены рекомбинантными методами, например, полипептиды, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфицированного в клетку-хозяина; полипептиды, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих полипептидов; полипептиды, полученные от животного (например, мыши, кролика, овцы, рыбы и так далее), которое является трансгенным, или иным образом было изменено для экспрессии гена или генов, или генных компонентов, которые кодируют и/или управляют экспрессией полипептида или одного или более его компонентов, частей, элементов или доменов; и/или полипептиды, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими методами, включающими сплайсинг или лигирование выбранных элементов нуклеотидных последовательностей друг с другом, химический синтез выбранных элементов последовательности и/или получение иным образом нуклеиновой кислоты, которая кодирует и/или управляет экспрессией полипептида или одного или более его компонентов, частей, элементов или доменов. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательности встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательности сконструированы in silico. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательности получены в результате мутагенеза (например, in vivo или in vitro) известного элемента последовательности, например, из природного или синтетического источника, такого как, например, имеющийся в зародышевой линии исходного интересующего организма (например, человека, мыши и так далее).

Эталон: Используемый в настоящем изобретении термин «эталон» описывает стандарт, или контроль, с которым проводят сравнение. Например, в некоторых вариантах осуществления представляющие интерес средство, животное, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение сравнивают с эталонным, или контрольным, средством, животным, индивидуумом, популяцией, образцом, последовательностью или значением. В некоторых вариантах осуществления эталон, или контроль, тестируют и/или определяют практически одновременно с тестированием или определением представляющего интерес объекта. В некоторых вариантах осуществления эталон, или контроль, представляет собой исторический эталон, или контроль, необязательно, воплощенный в материальном носителе. Обычно, как понятно специалистам в данной области, эталон, или контроль, определяют или характеризуют в условиях или обстоятельствах, сопоставимых с теми, в которых проводят оценку. Специалисты в данной области понимают, когда имеет место достаточное сходство для оправдания опоры на, и/или сравнения с конкретным возможным эталоном или контролем.

Ответ: Используемый в настоящем изобретении термин «ответ» на лечение может означать любое полезное изменение состояния пациента, которое вызвано, или коррелирует с, лечением. Такое изменение может включать стабилизацию состояния (например, предотвращение ухудшения, которое имело бы место в отсутствие лечения), уменьшение симптомов состояния и/или улучшение перспектив лечения состояния, и так далее. Он может означать ответ пациента или ответ опухоли. Ответ опухоли или пациента можно измерять в соответствии с самыми разными критериями, включая клинические критерии и объективные критерии. Методы оценки ответа включают, но без ограничения, клиническое обследование, позитронную эмиссионную томографию, рентгенографию грудной клетки, КТ-сканирование, МРТ, ультразвуковое, эндоскопическое, лапароскопическое исследование, определение присутствия и уровня опухолевых маркеров в образце, полученном от пациента, цитологический и/или гистологический анализ. Многие из этих методов направлены на определение размера опухоли или определение общей опухолевой нагрузки иным образом. Методы и руководства для оценки ответа на лечение описаны в Therasse et. al. (2000) «New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors», Европейской организации по изучению и лечению рака, Национального института рака США, Национального института рака Канады. Точные критерии ответа могут быть выбраны любым соответствующим образом, при условии, что при сравнении групп опухолей и/или пациентов, сравниваемые группы оценивают на основании одинаковых или сопоставимых критериев для определения степени ответа. Специалист в данной области сможет выбирать соответствующие критерии.

Риск: Как будет понятно из контекста, «риск» развития заболевания, нарушения и/или состояния означает вероятность, что у конкретного индивидуума разовьется заболевание, нарушение, и/или состояние. В некоторых вариантах осуществления риск выражают в процентах. В некоторых вариантах осуществления риск составляет от 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 до 100%. В некоторых вариантах осуществления риск выражают как риск относительно риска, связанного с эталонным образцом или группой эталонных образцов. В некоторых вариантах осуществления эталонный образец, или группа эталонных образцов, связан с известным риском заболевания, нарушения, состояния и/или события. В некоторых вариантах осуществления эталонные образцы, или группа эталонных образцов, получены от индивидуумов, сопоставимых с конкретным индивидуумом. В некоторых вариантах осуществления относительный риск составляет 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более.

Серотип: Используемый в настоящем изобретении термин «серотип», также называемый сероваром, относится к определенной вариации среди видов бактерий или вирусов, или среди иммунных клеток разных индивидуумов. Эти микроорганизмы, вирусы или клетки коллективно классифицируют на основании их клеточных поверхностных антигенов, что делает возможной эпидемиологическую классификацию микроорганизмов на подвидовом уровне. Группу сероваров с общими антигенами можно называть серогруппой или, иногда, серокомплексом.

Короткий олигосахарид: Для целей настоящего изобретения олигосахарид, как правило, считают «коротким», если он имеет менее 4, или менее 3, остатков в любой линейной цепи.

Пациент: Используемый в настоящем изобретении термин «пациент» означает организм, как правило, млекопитающее (например, человека, в некоторых вариантах осуществления включая человека до рождения). В некоторых вариантах осуществления пациент страдает от соответствующего заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления пациент предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию. В некоторых вариантах осуществления пациент проявляет один или более симптомов или признаков заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления пациент не проявляет какие-либо симптомы или признаки заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления пациент является пациентом с одним или более признаками, характерными для наличия предрасположенности или риска развития заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления пациент является пациентом. В некоторых вариантах осуществления пациент является индивидуумом, которому поставлен диагноз, и/или применяется и/или была применена терапия.

Предрасположенность: Индивидуум, который «предрасположен» к заболеванию, нарушению или состоянию, имеет риск развития заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, который предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию, не проявляет какие-либо симптомы заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления у индивидуума, который предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию, не было диагностировано заболевание, нарушение и/или состояние. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, который предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию, является индивидуумом, который был подвергнут условиям, связанным с развитием заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления риск развития заболевания, нарушения и/или состояния является риском, основанным на оценке популяции (например, членов семьи индивидуумов, страдающих от заболевания, нарушения или состояния).

Уменьшение симптомов: В соответствии с настоящим изобретением, имеет место «уменьшение симптомов», когда один или более симптомов конкретного заболевания, нарушения или состояния уменьшаются по величине (например, интенсивности, степени тяжести и так далее) и/или частоте. Для ясности, отсрочку начала проявления конкретного симптома считают одной из форм уменьшения частоты данного симптома.

Терапевтически эффективное количество: Используемый в настоящем изобретении термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, которое производит желаемый эффект, ради которого оно было введено. В некоторых вариантах осуществления термин означает количество, которое является достаточным при введении популяции, страдающей от, или предрасположенной к заболеванию, нарушению и/или состоянию, в соответствии с терапевтическим режимом дозирования для лечения заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к уменьшению частоты и/или степени тяжести, и/или к отсрочке начала проявления одного или более симптомов заболевания, нарушения и/или состояния. Специалисты в данной области понимают, что термин «терапевтически эффективное количество» не обязательно означает, что было проведено успешное лечение конкретного индивидуума. Скорее, терапевтически эффективное количество может представлять собой такое количество, которое обеспечивает конкретный желаемый фармакологический ответ у значительного количества пациентов при введении пациентам, которые нуждаются в таком лечении. В некоторых вариантах осуществления ссылка на терапевтически эффективное количество может быть ссылкой на количество, измеренное в одной или более конкретных тканях (например, ткани, пораженной заболеванием, нарушением или состоянием) или жидкостях (например, крови, слюне, сыворотке, поте, слезах, моче и так далее). Специалисты в данной области понимают, что в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество конкретного средства или терапевтического препарата может быть составлено и/или введено в одной дозе. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество средства может быть составлено и/или введено в нескольких дозах, например, в виде части режима дозирования. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество может означать количество иммуногенной композиции или вакцины, которое достаточно для вызывания иммунного ответа. Например, «терапевтически эффективное количество» означает нетоксическое, но достаточное количество, которое может быть использовано для лечения, ослабления или предотвращения инфекции и/или заболевания (например, бактериальной инфекции, пневмококковой инфекции и так далее) у какого-либо пациента.

Лечение: Используемый в настоящем изобретении термин «лечение» (а также «лечить» или «терапия») относится к любому применению терапии, которое приводит к частичному или полному ослаблению, облегчению, смягчению, ингибированию, отсрочке начала проявления, уменьшению степени тяжести и/или уменьшению частоты одного или более симптомов, признаков и/или причин конкретного заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления такое лечение может быть применено к пациенту, который не проявляет признаки соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния, и/или к пациенту, который проявляет лишь ранние признаки заболевания, нарушения и/или состояния. Альтернативно или дополнительно, такое лечение может быть применено к пациенту, который проявляет один или более признанных признаков соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления лечение может быть применено к пациенту, который был диагностирован, как страдающий от соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления лечение может быть применено к пациенту, который, как известно, имеет один или более факторов предрасположенности, которые статистически коррелируют с повышенным риском развития соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния.

Вариант: Используемый в настоящем изобретении в контексте молекул, например, нуклеиновых кислот, белков или малых молекул, термин «вариант» означает молекулу, которая имеет значительную структурную идентичность с эталонной молекулой, но отличается структурно от этой эталонной молекулы, например, присутствием или отсутствием, или уровнем одной или более химических групп, в сравнении с эталонной молекулой. В некоторых вариантах осуществления вариант также отличается функционально от его эталонной молекулы. Как правило, решение о том, есть ли основания считать конкретную молекулу «вариантом» эталонной молекулы, основано на степени ее структурной идентичности с эталонной молекулой. Как понимают специалисты в данной области, любая биологическая или химическая эталонная молекула имеет определенные характерные структурные элементы. Вариант, по определению, является отдельной молекулой, которая имеет общие один или более таких характерных структурных элементов, но отличается по меньшей мере в одном аспекте от эталонной молекулы. В качестве нескольких примеров, полипептид может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества аминокислот, имеющих определенные положения относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве и/или вносящих вклад в формирование конкретного структурного мотива и/или биологической функции; нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества нуклеотидных остатков, имеющих определенные положения относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, может отличаться от эталонного полипептида, или нуклеиновой кислоты, вследствие одного или более отличий аминокислотной или нуклеотидной последовательности и/или одного или более отличий в химических группах (например, углеводах, липидах, фосфатных группах), которые являются ковалентно связанными компонентами полипептида или нуклеиновой кислоты (например, которые присоединены к каркасу полипептида или нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет общую идентичность последовательности с эталонным полипептидом, или нуклеиновой кислотой, которая составляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, отличается по меньшей мере одним характерным элементом последовательности от эталонного полипептида, или нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет один или более видов биологической активности. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет общие один или более видов биологической активности с эталонным пептидом, или нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, лишен(а) одного или более видов биологической активности эталонного пептида, или нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет сниженный уровень одного или более видов биологической активности, в сравнении с эталонным полипептидом, или нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления интересующий полипептид, или нуклеиновую кислоту, считают «вариантом» эталонного пептида, или нуклеиновой кислоты, если он(она) имеет аминокислотную, или нуклеотидную, последовательность, которая идентична последовательности эталона, но имеет небольшое количество изменений последовательности в конкретных положениях. Как правило, менее приблизительно 20%, приблизительно 15%, приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7%, приблизительно 6%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3% или приблизительно 2% остатков в варианте замещены, вставлены или делетированы в сравнении с эталоном. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6, приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3, приблизительно 2, или приблизительно 1 замещенный остаток в сравнении с эталоном. Часто вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет очень небольшое количество (например, менее приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3, приблизительно 2 или приблизительно 1) замещенных, вставленных или делетированных функциональных остатков (то есть, остатков, которые участвуют в конкретной биологической активности) в сравнении с эталоном. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет не более приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3, приблизительно 2 или приблизительно 1 добавления или делеции, и, в некоторых вариантах осуществления, не имеет добавления или делеции, в сравнении с эталоном. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет менее приблизительно 25, приблизительно 20, приблизительно 19, приблизительно 18, приблизительно 17, приблизительно 16, приблизительно 15, приблизительно 14, приблизительно 13, приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6 и, обычно, менее приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3 или приблизительно 2 добавлений или делеций в сравнении с эталоном. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид, или нуклеиновая кислота, встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид, или нуклеиновая кислота, представляет собой полипептид, или нуклеиновую кислоту, человека.

Вакцинация: Используемый в настоящем изобретении термин «вакцинация» означает введение композиции, предназначенной для инициации иммунного ответа, например, на вызывающий заболевание агент. Для целей настоящего изобретения вакцинацию можно проводить до, в процессе и/или после воздействия вызывающего заболевание агента и, в конкретных вариантах осуществления, до, в процессе и/или вскоре после воздействия агента. В некоторых вариантах осуществления вакцинация включает несколько введений, надлежащим образом разнесенных во времени, вакцинной композиции.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение относится, в целом, к композициям, системам и способам, которые включают находящиеся в комплексе белки и полисахариды, например, вакцины из находящихся в комплексе белков и полисахаридов. Такие комплексы могут быть использованы, например, для индукции и/или усиления иммунного защитного ответа у пациентов, имеющих риск внутрибольничной инфекции.

Внутрибольничная инфекция представляет собой инфекцию, приобретаемую в больнице или другой организации здравоохранения в течение по меньшей мере приблизительно 48 часов после поступления. Чтобы подчеркнуть как больничные, так и не больничные условия, внутрибольничную инфекцию иногда называют инфекцией, связанной с оказанием медицинской помощи (ИСМП или ИСОМП). В некоторых вариантах осуществления внутрибольничная инфекция может быть приобретена в больнице, доме престарелых, реабилитационном центре, поликлинике или других клинических условиях. В некоторых вариантах осуществления внутрибольничная инфекция передается в клинических условиях предрасположенному к ней пациенту различными способами. В некоторых вариантах осуществления медицинский персонал может распространять внутрибольничную инфекцию, помимо передачи через зараженное оборудование, постельное белье или воздушно-капельным путем. В некоторых вариантах осуществления источником внутрибольничной инфекции может быть внешнее окружение, другой инфицированный пациент, персонал, который может быть инфицирован, или, в некоторых случаях, источник внутрибольничной инфекции может быть неизвестен. В некоторых случаях микроорганизм, вызывающий внутрибольничную инфекцию, происходит из собственной микробиоты кожи пациента, становясь оппортунистическим после операции или других процедур, которые нарушают защитный барьер кожи. Хотя источником заражения пациента может являться его собственная кожа, такая инфекция все еще считается внутрибольничной, поскольку она развивается в условиях оказания медицинской помощи.

Резистентность к противомикробным средствам

Люди все больше понимают и ценят роль вакцин в решении проблемы резистентности к противомикробным средствам (ПМР). Вакцины могут уменьшать распространенность резистентности за счет уменьшения потребности в использовании противомикробных средств и могут уменьшить ее последствия за счет сокращения общего числа случаев. Путем уменьшения количества патогенов, которые могут быть ответственны за конкретный клинический синдром, вакцины могут позволять использовать антибиотики более узкого спектра для эмпирической терапии. Эти эффекты могут быть усилены за счет популяционного иммунитета, с распространением защиты на не вакцинированных людей в популяции. Поскольку большая часть селекции на резистентность происходит вследствие селекции на не вовлеченные в процесс представители нормальной микрофлоры, вакцинация может уменьшать давление селекции на резистентность даже для патогенов, не включенных в вакцину. Некоторые вакцины оказали непропорциональное влияние на лекарственно-устойчивые клоны видов-мишеней, полезный эффект, который мог бы быть более обдуманно использован при разработке вакцин (Lipsitch and Siber, 2016). Полезные эффекты вакцин в борьбе с ПМР по каждому из этих механизмов могут быть усилены за счет непрямой защиты, или популяционного иммунитета (Fine, 1993), который имеет место, когда вакцинированные индивидуумы не подвергаются инфицированию или колонизации и, таким образом, не передают патоген другим. В этом случае число инфекций, резистентных инфекций и применение противомикробных средств может быть уменьшено не только для вакцинированных индивидуумов, но также и для контактирующих с ними лиц. И наконец, для вакцин против микроорганизмов, которые бессимптомно колонизируют носоглотку, кожу, кишечник или другие участки тела, существует теоретическая возможность того, что уменьшение плотности микробных популяций за счет вакцинации приведет к уменьшению возможности генетического обмена элементами резистентности (Levin et al., 1979; Levin and Cornejo, 2009).

Вакцинами, представляющими особый интерес, являются вакцины, направленные на наиболее важные возбудители ИСМП, которые часто являются устойчивыми ко многим антибиотикам (ЦКПЗ, 2013; Chang et al., 2015). Наиболее распространенные возбудители ИСМП включают грамотрицательные бактерии с множественной резистентностью; в недавних публикациях сообщается об изолятах со всего мира, которые стали резистентными к средствам, являющимся последней надеждой, полимиксину B и колистину (Du et al., 2015: Liu et al., 2016). Резистентность к средствам первой и второй линии также является проблемой в случае грамположительных микроорганизмов. Вид Candida является важным возбудителем мукозальных и диссеминированных инфекций у пациентов с иммунной недостаточностью, а также после противомикробной терапии (ЦКПЗ, 2013). Грамотрицательные виды E. coli, Pseudomonas, Klebsiella и Acinetobacter также становятся все более резистентными ко многим антибиотикам (McGann et al., 2016; Collignon, 2009; Agodi et al., 2011, отчет ВОЗ, 2014). Чтобы устранить этот пробел в знаниях, ЦКПЗ начал трехэтапное исследование в 2009 году по разработке и проведению многоуровневого обследования распространенности ИСМП и использования противомикробных средств. Исследования распространенности были проведены в других странах для осознания масштабов и глубины проблемы, связанной с такой инфекцией. Кульминацией усилий ЦКПЗ в 2011 году стало проведение масштабного опроса, в котором была оценена распространенность ИСМП в больницах неотложной помощи, определена распространенность этих инфекций в зависимости от участка инфицирования и патогена, как показано в Таблице 1, и получены обновленные оценки национального бремени этих инфекций (Magill et al., 2014).

Опросы были проведены в США в 183 больницах (Magill et al., 2014). Из 11282 пациентов, 452 имели 1 или более ИСМП (4,0%; 95% доверительный интервал, 3,7-4,4). Из 504 таких инфекций, наиболее распространенными типами были пневмония (21,8%), инфекции операционного поля (21,8%) и желудочно-кишечные (ЖК) инфекции (17,1%). C. difficile являлся наиболее часто упоминаемым патогеном (вызывающим 12,1% инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи). Инфекции, связанные с медицинскими устройствами (то есть, связанная с центральным катетером инфекция кровотока, связанная с катетером инфекция мочевыводящих путей и связанная с вентилирующим устройством пневмония), на которые традиционно были направлены программы по предотвращению ИСМП, составляли 25,6% таких инфекций. По оценкам авторов изобретения, в больницах неотложной помощи в Соединенных Штатов Америки (США) в 2011 г. находились 648000 пациентов с 721800 инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи. Вакцинация против K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli, или их сочетания, в больничных условиях значительно повлияла бы на частоту случаев наиболее распространенных ИСМП, таких как пневмония, инфекции операционного поля и мочевыводящих путей, а также привела бы к уменьшению распространенности резистентности к антибиотикам, как показано в Таблице 1.

Таблица 1: Многоуровневая оценка распространенности ИСМП: в зависимости от типа инфекции (Magill et al., 2014)

Патоген Все участки Пневмония Инфекции операционного поля ИКР ИМП Инфекции ЖКТ K. pneumoniae 9,9% 11,8% 13,6% 8% 23,1%* 1,2% P. aeruginosa 7,1% 12,7%* 6,4%* 4% 10,8%* 1,2% A. baumannii 1,6% 3,6%* 1,8% 0% 0% 0% E. coli 9,3% 2,7% 12,7%* 10% 27,7%* 1,2% S. aureus 10,7% 16,4%* 15,5%* 14% 3,1% 1,2% C. difficile 12,1% 0% 0% 0% 0% 70,9%* Candida 6,3% 3,6% 2,7% 22%* 4,6% 3,5% ^*Большинство бактерий с множественной резистентностью к антибиотикам находятся в этих группах

Иммуногенные комплексы

Настоящее изобретение относится к иммуногенным комплексам, которые включают каркасные полимеры, полисахариды и полипептиды.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенные комплексы представляют собой множественные системы представления антигенов (MAPS). Некоторые системы MAPS ранее были описаны в WO 2012/155007. Как правило, иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, представляет собой новый вариант комплексов MAPS-типа, которые включают (i) каркасный полимер, включающий полимер и один или более полисахаридов (например, антигенных полисахаридов), конъюгированных с полимером; и (ii) один или более полипептидов (например, антигенных полипептидов и/или полипептидов-носителей) в не ковалентном комплексе с полимером и/или антигенным полисахаридом. Некоторые иллюстративные каркасные полимеры показаны в иммуногенных комплексах, представленных на Фигурах 7A-7D. В некоторых вариантах осуществления вариантный комплекс MAPS представляет собой BP-1 MAPS. В некоторых вариантах осуществления вариантный комплекс MAPS представляет собой BP-1.2 MAPS. В некоторых вариантах осуществления вариантный комплекс MAPS представляет собой BP-2a MAPS. В некоторых вариантах осуществления вариантный комплекс MAPS представляет собой BP-2b MAPS. В некоторых вариантах осуществления вариантный комплекс MAPS представляет собой BP-3 MAPS.

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов находятся в не ковалентном комплексе с каркасным полимером, и/или антигенным полисахаридом, конъюгированным с указанным полимером, за счет образования по меньшей мере одной пары аффинная молекула/комплементарная аффинная молекула, включающей (i) первую аффинную молекулу, связанную с полимером и/или антигенным полисахаридом; и (ii) комплементарную аффинную молекулу, связанную с одним или более полипептидными антигенами. В некоторых вариантах осуществления один или более полисахаридов химически связаны с полимером. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов получены из грамотрицательных бактерий и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления один или более микробных антигенных полисахаридов получены из антигенных полисахаридов K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидов ковалентно связаны (например, слиты) с комплементарной аффинной молекулой, описанной в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 по массе. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 по массе. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 по массе. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 по массе. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 по массе. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 1 до приблизительно 10 по массе.

В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов получены из одного или более патогенов. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов получены из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 серотипов или штаммов патогена.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер содержит одну или более аффинных молекул, конъюгированных с каркасным полимером. В некоторых вариантах осуществления антигенные полисахариды содержат одну или более аффинных молекул, конъюгированных с антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер и антигенные полисахариды конъюгированы с одной или более аффинными молекулами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер конъюгирован с одной или более аффинными молекулами, и антигенные полисахариды не конъюгированы с аффинной молекулой. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер не конъюгирован с аффинной молекулой, и антигенные полисахариды конъюгированы с одной или более аффинными молекулами. В некоторых вариантах осуществления аффинные молекулы включают биотин или производные биотина.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер содержит множество аффинных молекул, конъюгированных с каркасным полимером. В некоторых вариантах осуществления антигенные полисахариды содержат множество аффинных молекул, конъюгированных с антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер и антигенные полисахариды конъюгированы с множеством аффинных молекул. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер конъюгирован с множеством аффинных молекул, и антигенные полисахариды не конъюгированы с аффинной молекулой. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер не конъюгирован с аффинной молекулой, и антигенные полисахариды конъюгированы с множеством аффинных молекул. В некоторых вариантах осуществления аффинные молекулы включают биотин или производные биотина.

В некоторых вариантах осуществления полисахариды и/или полипептиды, которые могут быть включены в иммуногенные комплексы, получены рекомбинантными методами или методами синтеза. В некоторых вариантах осуществления полисахариды и/или полипептиды, которые могут быть включены в иммуногенные комплексы, выделены и/или получены из природных источников. Иллюстративные полисахариды и/или полипептиды описаны ниже.

Klebsiella

Подавляющее большинство инфекций Klebsiella связаны с госпитализацией. Как оппортунистические патогены, Klebsiella spp. в основном атакуют индивидуумов с иммунной недостаточностью, которые госпитализированы и страдают от тяжелых основных заболеваний, таких как сахарный диабет или хроническая обструктивная болезнь легких. Возбудителем внутрибольничных инфекций Klebsiella является в основном K. pneumoniae, самый важный для медицины вид рода. По оценкам, Klebsiella spp. является возбудителем в 8% случаев всех внутрибольничных бактериальных инфекций в США и Европе (Podschun and Ullmann, 1998). Не было отмечено значительных географических различий в частоте встречаемости, за исключением гипервирулентных K1-инкапсулированных штаммов, которые встречаются преимущественно в Азии и редко встречаются в Европе и Западном полушарии. В США Klebsiella является возбудителем в 3-7% случаев всех внутрибольничных бактериальных инфекций, что ставит ее в число восьми наиболее важных инфекционных патогенов в больницах (Horan et al., 1988; Schaberg et al., 1991); и данные, полученные из Соединенного королевства (Bergogne-Berezin, 1995) и из Германии (Ullmann, 1986), на удивление аналогичны тем, о которых сообщает ЦКПЗ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полисахаридов и/или полипептидов Klebsiella.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полисахаридов из LPS, и/или CPS полисахаридов Klebsiella. В некоторых вариантах осуществления полисахариды из LPS представляют собой OPS. В некоторых вариантах осуществления полисахариды из LPS представляют собой COPS. Капсулы продуцируются почти всеми штаммами Klebsiella; они представляют собой самый наружный слой поверхностных структур, соприкасающийся с окружающей средой хозяина, и доказано, что они являются высоко иммуногенными и нетоксичными (Cryz et al., 1985). Недостатком вакцины против CPS Klebsiella pneumoniae (KP) является большое число капсульных (K) антигенов (более 80 разных антигенов). Однако в исследованиях частоты встречаемости капсульных типов среди бактериемических изолятов Klebsiella, было обнаружено, что лишь 25 серотипов составляют 70% всех бактериемических штаммов (Cryz et al., 1986a). С учетом этих серо-эпидемиологических данных была составлена 24-валентная KP CPS вакцина, которая, как было впоследствии доказано, является безопасной и иммуногенной (Edelman et al., 1994). Однако простые полисахариды сами по себе являются недостаточно иммуногенными для индукции и поддержания долгосрочного и эффективного ответа памяти, и часто должны быть конъюгированы с белками, чтобы быть эффективными. Разработка 24-валентной полисахаридной конъюгатной KP вакцины является сложной и проблематичной, поскольку для объединения 24 гликоконъюгатов в одной вакцине может потребоваться уравновешивание иммуногенности каждого компонента.

Вследствие его эндотоксических свойств, LPS считают важным в патологии септицемии. До последнего времени, как правило, считалось, что O-антигены LPS Klebsiella маскированы CPS, и, следовательно, не экспонированы на бактериальной поверхности. Однако в нескольких исследованиях было продемонстрировано экспонирование на поверхности и доступность для антител O-антигенов в штаммах, экспрессирующих конкретные капсульные серотипы (Tomas et al., 1988). В отличие от K-антигенов, известно лишь восемь O-типов, при этом O1 является наиболее часто встречающимся O-типом в клинических изолятах. На четыре изолята KP (O1, O2, O3, O5) приходится большинство клинических изолятов (Hansen et al., 1999). Сообщалось, что введение моноклональных антител (мАт) к антигену O1 Klebsiella производило защитное действие в мышиной модели летальной эндотоксемии (Mandine et al., 1990).

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает белок или полипептид пилей 3 типа Klebsiella. В отличие от других фимбрий, пили 3 типа вызывают агглютинацию эритроцитов, обработанных танином. Несмотря на то, что его название, манноза-резистентный, Klebsiella-подобный гемагглютинин (MR/K-HA), подразумевает, что этот фимбриальный тип синтезируется только Klebsiella, более поздние исследования продемонстрировали, что пили 3 типа имеются у многих родов кишечных бактерий (Clegg and Gerlach, 1987). Кроме того, пили 3 типа, очевидно, не идентичны во всех родах энтеробактерий, поскольку серологические исследования показали значительное антигенное разнообразие (Old and Adegbola, 1985). Первоначально описанные как адгезионные органеллы Klebsiella, населяющих корни растений, эти пили, как позднее было обнаружено, способны связываться с различными клетками человека. Штаммы K. pneumoniae, экспрессирующие пили 3 типа, прикрепляются к эндотелиальным клеткам, эпителию дыхательных путей и уроэпителиальным клеткам (Hornick et al., 1992; Tarkkanen et al., 1997; Würker et al, 1990). В почках эти пили опосредуют бактериальную адгезию к базальным мембранам канальцев, капсулам Боумена и почечным кровеносным сосудам (Tarkkanen et al., 1990). MrkA является основным белком фимбриального комплекса III типа и участвует в адгезии к клетке-хозяину и образовании биопленок (Murphy and Clegg, 2012), стратегии, используемой бактериальными патогенами при инфицировании (Burmolle et al., 2008). MrkA, но не адгезин (MrkD), как показано ранее, способствует образованию биопленок (Langstraat et al., 2001). Антиген MrkA имеет высокую степень консервативности последовательности в разных изолятах KP и, в целом, является доступным в качестве внеклеточной мишени (Wang et al., 2016). MrkA из двух наиболее преобладающих патогенных изолятов, K. pneumoniae и Klebsiella oxytoca, имеют гомологию 95%. Кроме того, гомология MrkA у репрезентативных представителей семейства Enterobacteriaceae составляет >90% и, таким образом, эти данные о последовательности предоставляют потенциальную возможность разработки основанной на MrkA стратегии против K. pneumoniae и всех грамотрицательных бактерий.

Полисахариды Klebsiella pneumoniae

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полисахаридов K. pneumoniae. Помимо CPS (например, K-антигена), OPS является другим важным фактором вирулентности для K. pneumoniae. Существуют по меньшей мере 9 подтипов OPS K. pneumoniae, каждый из которых имеет разную химическую структуру полисахарида. В некоторых вариантах осуществления полисахариды OPS включены в иммунный комплекс, описанный в настоящем изобретении. Каждое используемое в настоящем изобретении обозначение серотипа указано в соответствии со Справочно-исследовательским центром изучения Escherichia и Klebsiella, сотрудничающим с Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ).

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Klebsiella, которые представляют собой полисахариды, или их производные, из одного или более серотипов K. pneumoniae, выбранных из O1 (и d-Gal-III вариантов), O2 (и d-Gal-III вариантов), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 и O12. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает полисахариды, или их производные, из одного или более из серотипов O1, O2, O3 и O5 Klebsiella, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает полисахариды, или их производные, из каждого из серотипов O1, O2, O3 и O5 Klebsiella.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Klebsiella, которые представляют собой, или получены из, OPS. В некоторых вариантах осуществления OPS представляет собой, или получен из серотипа O1, O2, O3, O5 Klebsiella, а также их вариантов и/или сочетания. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает OPS Klebsiella, выбранный из, или полученный из, одного или более из серотипов O1, O2, O3 и O5, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает OPS Klebsiella из, или полученный из, каждого из серотипов O1, O2, O3 и O5.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Klebsiella, которые представляют собой, или получены из, CPS. В некоторых вариантах осуществления CPS представляет собой, или получен из K1, K2, K10, K16 и K19 Klebsiella. В некоторых вариантах осуществления CPS представляет собой, или получен из K19 Klebsiella.

Полипептиды Klebsiella pneumoniae

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полипептидов K. pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой полипептид, или производное, фимбриального белка I типа K. pneumoniae, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 1, опубликованной в Gerlach et al., 2012, J Bacteriology, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 1 фимбриального белка I типа K. pneumoniae

mkiktlamivvsalslsstaaladtttvnggtvhfkgevvnaacavdagsidqtvqlgqvrsaklatagstssavgfniqlddcdttvatkasvafagtaidssnttvlalqnsaagsatnvgvqildntgtplaldgatfsaattlndgpniipfqaryyatgaatagianadatfkvqye

В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой полипептид, или производное, консервативного фимбриального белка III типа MrkA K. pneumoniae, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 2, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 2 консервативного фимбриального белка III типа MrkA K. pneumoniae

MKKVLLSAAMATAFFGMTAAHAADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQ

В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой полипептид, или производное, фимбриального белка III типа MrkA K. pneumoniae, или его иммуногенный фрагмент, например, фрагмент с повторяющимися последовательностями для обеспечения стабилизирующих взаимодействий с мономерным белком MrkA. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 3, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 3 стабилизированного фимбриального белка III типа MrkA K. pneumoniae

ADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVS

Pseudomonas

Pseudomonas является основным возбудителем ИСМП, в частности, при иммунной недостаточности вследствие нейтропении и у пациентов с механической вентиляцией легких, и является главной причиной смерти пациентов с кистозным фиброзом. Инфекция Pseudomonas также имеет место в случае ожоговых ран, повреждений глаз (например, роговицы), травме и так далее. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полисахаридов и/или полипептидов Pseudomonas.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает O-антиген Pseudomonas. Ранее, компания Wellcome Research направляла основные усилия на разработку вакцины на основе этого антигена, объединяя очищенные экстракты, содержащие O-антиген 16 из 20 серотипов, в вакцине PEV-1. Результаты в общей сложности пяти клинических исследований фаз 1-2 были опубликованы с 1976 по 1984 годы (Jones et al., 1976, 1978, 1979, 1980; Langford and Hiller, 1984). Данные по изучению безопасности вакцины указывают на то, что она была хорошо переносима. Сероконверсия оказалась относительно постоянной в вакцинированных группах здоровых добровольцев, а также пациентов с ожогами или кистозным фиброзом (КФ). Вакцинация оказывала переменное влияние на колонизацию ожоговой раны, от незначительного или нулевого до значительного. В одном исследовании посев крови показал снижение количества бактерий почти в 10 раз вследствие вакцинации. В каждом исследовании с участием пациентов с ожогами имело место снижение смертности, которое варьировало в пределах 70-100%, хотя количество смертей из-за P. aeruginosa не всегда точно поддается определению. В исследованиях КФ (Langford and Hiller, 1984), судя по всему, отсутствовала как клиническая польза, так и отличие в колонизации P. aeruginosa при вакцинации, и отсутствовала корреляция между титрами антител в ELISA и клиническими или бактериологическими показателями. В Swiss Serum Institute, Berna Biotech и Crucell была разработана восьмивалентная O-антиген-экзотоксин A конъюгатная вакцина (Aerugen), которая прошла через три клинических испытания фаз 1-2, результаты которых опубликованы (Schaad, et al., 1991; Lang, et al., 1995; Cryz et al., 1994). Их вводимая внутримышечно (в/м) вакцина, судя по всему, была хорошо переносимой, и сероконверсия для всех серотипов была признана значимой во всех исследованиях. Вакцинация приводила к значительному уменьшению колонизации в большинстве исследований, и сообщалось об отсутствии связанных с PA смертей в группах применения вакцины или плацебо. В исследовании Crucell фазы 3 с участием 476 пациентов с КФ результаты для вакцины не достигли желаемого конечного результата и не повторили результаты, полученные в предыдущих исследованиях.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает жгутик Pseudomonas, или его антигенный фрагмент. В ранних исследованиях эффективности (Holder et al., 1982; Holder and Naglich, 1986; Montie, et al., 1987) установлено, что жгутик как a, так и b, типа мог обеспечивать специфическую для типа защиту от гибели в мышиных моделях ожогов, однако жгутик типа b, похоже, был несколько более эффективен в этом. В доклинических исследованиях компании IMMUNO AG (Crowe, et al., 1991) были использованы индивидуальные вакцины, состоящие из жгутика типа a0, a0a1a2, a0a2, a0a3, a0a3a4 и b, и определено, что антиген b, судя по всему, является лучшим иммуногеном, обеспечивая более высокую степень защиты в мышиной модели иммунной недостаточности, чем препараты с типом a. Результаты исследования фазы 1 в той же публикации показали, что все из этих иммуногенов вызывали продуцирование сывороточных антител с высокими титрами и продолжительным действием, как и одиночный иммуноген типа b в последующем исследовании фазы 2 (Döring, et al., 1995), где также наблюдали сероконверсию IgG, IgA и sIgA в бронхоальвеолярных смывах. Введение комбинированной вакцины с тип a (a0a1a2) + тип b жгутиками пациентам с КФ (фаза 3) приводило к продуцированию сывороточных IgG с высокими титрами и продолжительным действием. Однако, хотя имел место некоторый защитный эффект от легочной инфекции P. aeruginosa, присутствие серотипов, не связанных с вакциной, не позволило четко интерпретировать результат (Döring and Dorner, 1997; Döring, et al. 2007). В последующем обзоре Döring и Pier (2008) предположили, что двухвалентная флагеллярная вакцина может быть неоптимальной, и тем не менее, видимо, отсутствуют данные по одиночной вакцине, содержащей жгутик типа b и все из подтипов типа a.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает флагеллин Pseudomonas, или его антигенный фрагмент. Исследования субъединиц жгутика, флагеллина, не продвинулись дальше исследовательской фазы. В исследования были включены очищенный флагеллин (Campodonico, et al., 2010; Faezi, et al., 2013), ДНК вакцина с флагеллином (Saha, et al., 2007), а также конъюгат флагеллин/полиманнуроновая кислота (Campodonico, et al., 2011). Хотя все из них являются иммуногенными и защитными, они, судя по всему, не достигают уровней, которых достигают флагеллярные препараты. Также была изучена пассивная иммунизация с использованием сыворотки против типа b (Barnea, et al., 2006), мАт против типа a (Barnea, et al., 2009) и сыворотки против типа a (Faezi, et al., 2011). Все препараты приводили к уменьшению смертности в мышиной модели ожога.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает PcrV Pseudomonas (секреторной системы III типа), или его антигенный фрагмент. Ключевым фактором вирулентности, связанным с тяжестью заболевания, является секреторная система III типа (T3SS) P. aeruginosa, которая инъецирует бактериальные токсины непосредственно в цитоплазму клеток-хозяев. Белок PcrV, расположенный на конце инжектисомного комплекса T3SS, необходим для функционирования T3SS и является надежно подтвержденной мишенью в животных моделях для разработки иммунологических стратегий профилактики, направленных на P. aeruginosa. Основываясь на предыдущих результатах исследований PcrV, в которых активная и пассивная иммунизация (Sawa, et al., 1999; Holder, et al., 2001; Shime, et al., 2001; Frank, et al., 2002) демонстрировала защиту в различных животных моделях, в KaloBios были разработаны «Humaneered™, высокоаффинные пегилированные Fab'» (KB-001), которые были изучены в качестве пассивной терапии в доклинических (Baer, et al., 2009) и клинических испытаниях (Francois et al., 2012; Milla et al., 2014). Хотя как мышиные, так и гуманизированные («humaneered»), мАт и их Fab’-фрагменты продемонстрировали эффективность в исследованиях на животных, при клиническом испытании KB-001 не были обнаружены существенные отличия в количественных показателях колонизации P. aeruginosa, симптомах или спирометрии, и новый усовершенствованный вариант KB-001A для лечения инфекции P. aeruginosa у пациентов с кистозным фиброзом не соответствовал основным показателям эффективности в клиническом испытании фазы 2 с участием людей (ClinTrials.gov, 2014). Что касается использования в качестве активной вакцины, до настоящего изобретения было проведено мало исследований с белковым антигеном PcrV.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает экзополисахарид Pseudomonas. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает PsL Pseudomonas. Этот экзополисахарид важен для адгезии P. aeruginosa к клеткам млекопитающих, а также для образования и поддержания биопленок, продуцируемых немукоидными и мукоидными изолятами P. aeruginosa. Полисахарид PsL удерживает вместе клетки биопленок, таким образом, в этом заключается важная роль PsL в адгезии (Ma et al., 2006). Функциональный скрининг выявил, что мАт к одному эпитопу PsL демонстрируют превосходную активность в ОФУ и анализах адгезии к клеткам, и обеспечивают значительную защиту во многих животных моделях.

Полисахарид PsL представляет собой доступный для антител независимый от серотипа поверхностный элемент, который распространен как среди немукоидных, так и мукоидных, клинических изолятов (DiGiandomenico et al., 2012). У животных анти-PsL антитела опосредуют ОФУ в присутствии эффекторных клеток и ингибируют связывание P. aeruginosa с эпителиальными клетками. Предположительно анти-PsL специфическое мАт Cam-003 пассивно защищало и уменьшало бактериальную нагрузку в органах мышей зависимым от дозы образом (DiGiandomenico et al., 2012). мАт Cam-003 также оказывало защитное действие против множества серотипов P. aeruginosa в модели мышиной пневмонии. Аналогичные результаты были получены в мышиных моделях скарификации роговицы или ожога, в обоих случаях Cam-003 было эффективно для уменьшения инфекции. MEDI 3902 представляет собой биспецифическое антитело, нацеленное на независимый от серотипа фактор вирулентности TTSS PcrV и экзополисахарид PsL фактора персистенции (DiGiandomenico et al., 2014). Завершено исследование фазы 1 по изучению безопасности MEDI 3902 для предотвращения пневмонии (связанной с вентилированием легких пневмонии), вызываемой Pseudomonas (https://clinicaltrials.gov/NCT02255760). Что касается использования в качестве активной вакцины, до настоящего изобретения было проведено мало исследований с антигенным экзополисахаридом PsL.

Полисахариды Pseudomonas aeruginosa

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полисахаридов P. aeruginosa. Известно приблизительно 20 серотипов O-антигена при определении методом IATS. O-антигенный полисахарид молекулы является нетоксической потенциальной мишенью для разработки вакцины. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более OPS, LPS и/или экзополисахаридов Pseudomonas. В некоторых вариантах осуществления полисахариды из LPS представляют собой OPS. В некоторых вариантах осуществления полисахариды из LPS представляют собой COPS.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Pseudomonas, которые представляют собой полисахариды, или их производные, из одного или более серотипов P. aeruginosa, выбранных из O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19 и O20 (IATS). В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает один или более полисахаридов Pseudomonas, которые представляют собой полисахариды, или их производные, из одного или более серотипов P. aeruginosa, выбранных из O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10 и O11, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает полисахариды Pseudomonas, которые представляют собой полисахариды, или их производные, из каждого из серотипов P. aeruginosa, выбранных из O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10 и O11.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Pseudomonas, которые представляют собой, или получены из, OPS. В некоторых вариантах осуществления OPS представляет собой OPS, или его производное, из Pseudomonas типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O1O, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19 и O2O, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления OPS представляет собой OPS, или его производное, из Pseudomonas типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O1O, или O11, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления OPS представляет собой OPS, или его производное, из каждой из Pseudomonas типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O1O или O11.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Pseudomonas, которые представляют собой, или являются производными капсульного или подобного капсульному внеклеточного полисахарида. В некоторых вариантах осуществления капсульный или подобный капсульному полисахарид представляет собой полисахарид, или его производное, из альгината, Psl или Pel Pseudomonas.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Pseudomonas, которые представляют собой, или получены из экзополисахарида. В некоторых вариантах осуществления экзополисахарид представляет собой, или получен из, PsL. В некоторых вариантах осуществления PsL содержит по меньшей мере один эпитоп, который связывает моноклональное антитело, содержащее последовательность SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое связывает по меньшей мере один эпитоп PsL, представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 4, или его PsL-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое связывает по меньшей мере один эпитоп PsL, представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 5, или его PsL-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое связывает по меньшей мере один эпитоп PsL, представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 4, или его PsL-связывающий фрагмент, и полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 5, или его PsL-связывающий фрагмент.

Последовательность SEQ ID NO: 4 в PsL-связывающем мАт Cam-003

QVRLQQSGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSTSPYFWSWLRQPPGKGLEWIGYIHSNGGTNYNPSLKSRLTISGDTSKNQFSLNLSFVTAADTALYYCARTDYDVYGPAFDIWGQGTMVTV

Последовательность SEQ ID NO: 5 в PsL-связывающем мАт Cam-003

SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVL

Полипептиды Pseudomonas aeruginosa

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полипептидов P. aeruginosa. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой полипептид, или его производное, флагеллина подтипа A1 FliC P. aeruginosa, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 6, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 6 флагеллина подтипа A1 FliC P. aeruginosa

MALTVNTNIASLNTQRNLNNSSASLNTSLQRLSTGSRINSAKDDAAGLQIANRLTSQVNGLNVATKNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRMRDLSLQSANGSNSDSERTALNGEVKQLQKELDRISNTTTFGGRKLLDGSFGVASFQVGSAANEIISVGIDEMSAESLNGTYFKADGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFSDGDTISYVSKAGKDGSGAITSAVSGVVIADTGSTGVGTAAGVTPSATAFAKTNDTVAKIDISTAKGAQSAVLVIDEAIKQIDAQRADLGAVQNRFDNTINNLKNIGENVSAARGRIEDTDFAAETANLTKNQVLQQAGTAILAQANQLPQSVLSLLR

В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой полипептид, или его производное, флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 7, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 7 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa

MALTVNTNIASLNTQRNLNASSNDLNTSLQRLTTGYRINSAKDDAAGLQISNRLSNQISGLNVATRNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRIRDLALQSANGSNSDADRAALQKEVAAQQAELTRISDTTTFGGRKLLDGSFGTTSFQVGSNAYETIDISLQNASASAIGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSVASVDISTADGAQNAIAVVDNALAAIDAQRADLGAVQNRFKNTIDNLTNISENATNARSRIKDTDFAAETAALSKNQVLQQAGTAILAQANQLPQAVLSLLR

В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой полипептид, или его производное, домена D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенного TLR5-связывающего мотива, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 10, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 10 домена D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенного TLR5-связывающего мотива

GSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSS

В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой полипептид, или его производное, фактора вирулентности PcrV секреторной системы третьего типа (TTSS) P. aeruginosa, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 8, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 8 фактора вирулентности PcrV секреторной системы третьего типа (TTSS) P. aeruginosa

MEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI

Escherichia coli

Смертность в результате сепсиса, вызванного E. coli, составляет 20%-40% даже при оптимальной противомикробной терапии и поддерживающей терапии (Grandsen et al., 1990; Kreger et al., 1980; Rayner and Willcox, 1988; Bryan et al., 1983; Cross et al., 1983). Безусловно, существует потребность в новых профилактических и терапевтических подходах, включая дополнительное лечение антителами к этим и другим грамотрицательным бактериям. Хотя O-антиген-специфичные антитела защищают от инфекции, вызываемой гомологичными бактериальными штаммами, исследователи считают, что иммунотерапия такими антителами имеет ограниченную ценность ввиду разнообразия серотипов грамотрицательных бактерий (Baumgartner, 1990). Однако эпидемиологические исследования бактериальных серотипов, связанных с внекишечной инвазивной инфекцией E. coli, выявили, что ограниченное количество O-серогрупп являются причиной приблизительно 60% случаев бактериемии (Grandsen et al., 1990; Cross et al., 1984; McCabe et al., 1978). Соответственно, сохраняется потребность в эффективных технологиях профилактики и/или лечения таких инфекций.

Способы очистки полисахаридов

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам очистки одного или более полисахаридов, описанных в настоящем изобретении, от одного или более клеточных компонентов бактерий. В некоторых вариантах осуществления способы включают очистку O-антигенного полисахарида от одного или более клеточных компонентов бактерий. В некоторых вариантах осуществления способы включают очистку CPS от одного или более клеточных компонентов бактерий.

В некоторых вариантах осуществления бактерии являются грамотрицательными. В некоторых вариантах осуществления бактерии представляют собой K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления клеточные компоненты включают белок. В некоторых вариантах осуществления клеточные компоненты включают нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления клеточные компоненты включают липиды. В некоторых вариантах осуществления клеточные компоненты включают полисахариды. В некоторых вариантах осуществления клеточные компоненты являются частью лизата.

В некоторых вариантах осуществления способ очистки полисахарида от одного или более клеточных компонентов бактерий включает создание контакта клеточных компонентов с окисляющим реагентом и кислотой, с получением смеси. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент представляет собой нитрит натрия. В некоторых вариантах осуществления кислота представляет собой уксусную кислоту. В некоторых вариантах осуществления значение pH смеси составляет от приблизительно 3 до приблизительно 5. В некоторых вариантах осуществления способ включает отделение O-антигенного полисахарида от одного или более клеточных компонентов в смеси. В некоторых вариантах осуществления отделенный OPS содержит свободный альдегид на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления отделенный OPS содержит остаток 2,5-ангидроманнозы, содержащий свободный альдегид, на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления способ включает извлечение OPS, при этом извлеченный OPS является практически свободным от одного или более других клеточных компонентов. В некоторых вариантах осуществления извлеченный OPS содержит свободный альдегид на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления извлеченный OPS содержит остаток 2,5-ангидроманнозы, содержащий свободный альдегид, на его восстанавливающем конце.

В некоторых вариантах осуществления способ очистки полисахарида от одного или более клеточных компонентов грамотрицательных бактерий включает создание контакта клеточных компонентов с кислотным реагентом, с получением смеси. В некоторых вариантах осуществления значение pH смеси составляет от приблизительно 3 до приблизительно 5. В некоторых вариантах осуществления способ включает нагревание смеси до температуры от приблизительно 80°C до приблизительно 135°C. В некоторых вариантах осуществления способ включает отделение корового и O-антигенного полисахарида (COPS) от одного или более клеточных компонентов в смеси. В некоторых вариантах осуществления отделенный COPS содержит KDO на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления отделенный COPS содержит кетон в KDO на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления способ включает извлечение COPS, при этом извлеченный COPS является практически свободным от одного или более других клеточных компонентов. В некоторых вариантах осуществления извлеченный COPS содержит кетон на его восстанавливающем конце.

Пары аффинных молекул

Как описано в настоящем изобретении, в некоторых вариантах осуществления иммунные комплексы по изобретению включают один или более полипептидов в не ковалентном комплексе с одним или более полимерами и/или одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидов образуют комплекс за счет аффинного взаимодействия с одним или более полимерами и/или одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления иммунные комплексы по изобретению включают один или более полипептидов в не ковалентном комплексе с одним или более полимерами и/или одним или более антигенными полисахаридами, образованном за счет одной или более пар аффинная молекула/комплементарная аффинная молекула. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает (i) первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении, конъюгированную с одним или более полимерами и/или конъюгированную с одним или более антигенными полисахаридами, и (ii) слитый белок, который представляет собой, или содержит, комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении, и полипептид. При связывании первой аффинной молекулы и комплементарной аффинной молекулы один или более полипептидов образуют не ковалентный комплекс с одним или более полимерами и/или одним или более антигенными полисахаридами.

В некоторых вариантах осуществления пару аффинная молекула/комплементарная аффинная молекула выбирают из одного или более из: биотина/биотин-связывающего белка, антитела/антигена, фермента/субстрата, рецептора/лиганда, металла/металл-связывающего белка, углевод/углевод-связывающего белка, липида/липид-связывающего белка и His-метки/His-метку-связывающей молекулы.

В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула представляет собой биотин (или его производное, или фрагмент), и комплементарная аффинная молекула представляет собой биотин-связывающий белок, или его биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок представляет собой ризавидин, авидин, стрептавидин, брадавидин, тамавидин, лентиавидин, зебавидин, нейтравидин, каптавидин™, или их биотин-связывающие фрагменты, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок представляет собой ризавидин, или его биотин-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок содержит полипептид с SEQ ID NO: 13, или его биотин-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок содержит полипептид с SEQ ID NO: 14, или его биотин-связывающий фрагмент.

Слитые белки

В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает слитый белок, который представляет собой, или содержит, комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении, и один или более полипептидов, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления такие слитые белки имеют свойства носителя и/или антигенные свойства. В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой, или содержит, биотин-связывающий белок, или его биотин-связывающий домен, и полипептид.

В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок содержит полипептид с SEQ ID NO: 13, или его биотин-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 13, или его биотин-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок содержит полипептид с SEQ ID NO: 14, или его биотин-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 14, или его биотин-связывающий фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и один или более полипептидов, полученные из одного или более из K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит один или более линкеров и/или гистидиновую метку. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 (GGGGSSS). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 15.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин FlaB P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6 (флагеллин FlaA1 P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 9 (флагеллин FlaA2 P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина FlaB P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 11 (домен D2 флагеллина FlaA1 P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 12 (домен D2 флагеллина FlaA2 P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV секреторной системы III типа (TTSS) P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или его иммуногенный фрагмент, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 26.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 (консервативный MrkA K. pneumoniae), или его иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или его иммуногенный фрагмент, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3 (стабилизированный MrkA K. pneumoniae), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит полипептид с SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3 (стабилизированный MrkA K. pneumoniae), или его иммуногенный фрагмент.

Каркасные полимеры

Как описано в настоящем изобретении, в некоторых вариантах осуществления иммунные комплексы по изобретению включают каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, полисахарид, полипептид или синтетический дендример. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, поли-L-лизин (PLL). В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, линейный поли-L-лизин или дендример L-лизина. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой CPS, полученный из грамотрицательных или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления CPS представляет собой CPS K. pneumoniae, экзополисахарид P. aeruginosa и/или CPS E. coli. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой CPS KP K19. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой дендример синтетического моносахарида или олигосахарида. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет размер от приблизительно 50 КДа до приблизительно 2000 КДа. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет антигенные свойства. В некоторых вариантах осуществления полимер не является антигенным. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, один или более антигенных полисахаридов. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов могут представлять собой OPS K. pneumoniae, OPS P. aeruginosa, или их сочетание.

Каркасный полимер 1 (BP-1)

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с полимером. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полисахарид. В некоторых вариантах осуществления антигенный полисахарид представляет собой O-антигенный полисахарид, коровый O-антиген или коровый полисахарид. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает по меньшей мере один полимер (например, полисахарид), который является биотинилированным, и по меньшей мере один антигенный полисахарид (например, по меньшей мере один O-антигенный полисахарид), который является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер, который включает по меньшей мере один биотинилированный полимер (например, биотинилированный полисахарид) и по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, получают путем объединения не биотинилированного O-антигенного полисахарида, который содержит первичную аминогруппу (естественным образом или с линкером), с частично окисленным полисахаридом, содержащим альдегидную группу и биотин, содержащий первичный амин, с получением смеси; и восстановительного аминирования смеси восстанавливающим реагентом, для химического связывания O-антигенного полисахарида (то есть, антигенного полисахарида) с полисахаридом (то есть, полимером), за счет чего образуется каркасный полимер, который включает биотинилированный полисахарид, химически связанный с не биотинилированным антигенным полисахаридом (то есть, не биотинилированным O-антигенным полисахаридом).

В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид химически связан с частично окисленным полимером (например, полисахаридом) при помощи спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой короткий спейсер. В некоторых вариантах осуществления короткий спейсер содержит первичный амин на каждом конце спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер может представлять собой дигидразид адипиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид содержит первичную аминогруппу. В некоторых вариантах осуществления первичная аминогруппа представляет собой α-аминогруппу L-аланина внешнего ядра O-полисахарида P. aeruginosa или аминогруппу, которая была введена в восстанавливающий конец O-антигенного полисахарида за счет химического связывания спейсерной молекулы, содержащей первичную группу на каждом конце, путем восстановительного аминирования восстанавливающим реагентом. В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид, содержащий первичную аминогруппу, химически связывают путем смешивания O-антигенного полисахарида, содержащего первичную аминогруппу, с частично окисленным полимером (например, полисахаридом), содержащим альдегидную группу и биотин, содержащий первичный амин, с получением смеси; и восстановительного аминирования смеси восстанавливающим реагентом, с получением каркасного полимера, при этом полимер (например, полисахарид) является биотинилированным, но химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является частично окисленным окисляющим реагентом. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент представляет собой периодат натрия. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий реагент включает цианоборогидрид натрия или борогидрид натрия.

Каркасный полимер 1.2 (BP-1.2)

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с полимером. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полисахарид. В некоторых вариантах осуществления антигенный полисахарид представляет собой O-антигенный полисахарид, коровый O-антиген или коровый полисахарид. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает по меньшей мере один полимер (например, полисахарид), который является биотинилированным, и по меньшей мере один антигенный полисахарид (например, по меньшей мере один O-антигенный полисахарид), который является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер, который включает по меньшей мере один биотинилированный полимер (например, биотинилированный полисахарид) и по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, получают путем объединения не биотинилированного O-антигенного полисахарида, который содержит первичную аминогруппу (естественным образом или с линкером), с частично окисленным полисахаридом, содержащим одну или более альдегидных групп и один или более остатков биотина, введенных в ортогональный сайт путем проведения реакции с карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS), и с использованием карбоксилатов остатков уроновой кислоты полисахарида, и восстановительного аминирования смеси восстанавливающим реагентом для химического связывания O-антигенного полисахарида (то есть, антигенного полисахарида) с полисахаридом (то есть, полимером), за счет чего образуется каркасный полимер, который включает биотинилированный полисахарид, химически связанный с не биотинилированным антигенным полисахаридом (то есть, не биотинилированным O-антигенным полисахаридом). В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид химически связан с частично окисленным полимером (например, полисахаридом) при помощи спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой короткий спейсер. В некоторых вариантах осуществления короткий спейсер содержит первичный амин на каждом конце спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер может представлять собой дигидразид адипиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид содержит первичную аминогруппу. В некоторых вариантах осуществления первичная аминогруппа представляет собой α-аминогруппу L-аланина внешнего ядра O-полисахарида P. aeruginosa или аминогруппу, которая была введена в восстанавливающий конец O-антигенного полисахарида за счет химического связывания спейсерной молекулы, содержащей первичную группу на каждом конце, путем восстановительного аминирования восстанавливающим реагентом. В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид, содержащий первичную аминогруппу, химически связывают путем смешивания O-антигенного полисахарида, содержащего первичную аминогруппу, с частично окисленным полимером (например, полисахаридом), содержащим альдегидную группу и биотин, содержащий первичный амин, с получением смеси; и восстановительного аминирования смеси восстанавливающим реагентом, с получением каркасного полимера, при этом полимер (например, полисахарид) является биотинилированным, но химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является частично окисленным окисляющим реагентом. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент включает периодат натрия. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий реагент включает цианоборогидрид натрия или борогидрид натрия.

В некоторых вариантах осуществления OPS, содержащий альдегид или кетон, аминируют на его восстанавливающем конце, с использованием короткого спейсера, содержащего первичный амин на каждом конце (например, дигидразид адипиновой кислоты ADH), путем восстановительного аминирования цианоборогидридом натрия (NaBH3CN), с получением дериватизированного гидразидом OPS. В некоторых вариантах осуществления каркас CPS KP19 биотинилируют одним или более остатками биотина, введенными в ортогональный сайт путем проведения реакции карбоксилатов остатков уроновой кислоты полисахарида с карбодиимидом (EDC), N-гидроксисукцинимидом (NHS) и производным биотина, содержащим первичный амин (таким как, например, амин-ПЭГ3-биотин). В некоторых вариантах осуществления биотинилированный полимер CPS KP 19 затем частично окисляют периодатом, получая одну или более альдегидных групп, смешивают с дериватизированным гидразидом OPS и проводят восстановительное аминирование смеси восстанавливающим реагентом, таким как цианоборогидрид натрия (NaBH3CN), с получением каркасного полимера BP-1.2, содержащего один или более фрагментов биотина на остатках уроновой кислоты полимерного каркаса и без биотина на O-антигенном полисахариде.

Каркасный полимер 1.3 (BP-1.3)

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с полимером. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полисахарид. В некоторых вариантах осуществления антигенный полисахарид представляет собой O-антигенный полисахарид, коровый O-антиген или коровый полисахарид. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает по меньшей мере один полимер (например, полисахарид), который является биотинилированным, и по меньшей мере один антигенный полисахарид (например, по меньшей мере один O-антигенный полисахарид), который является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер, который включает по меньшей мере один биотинилированный полимер (например, биотинилированный полисахарид) и по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, получают путем объединения не биотинилированного O-антигенного полисахарида, который содержит первичную аминогруппу (естественным образом или с линкером), с CDAP-активированным полисахаридом с одним или более остатками биотина, введенными в ортогональный сайт путем проведения реакции с карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS), и с использованием карбоксилатов остатков уроновой кислоты полисахарида, с получением каркасного полимера, который включает биотинилированный полисахарид, химически связанный с не биотинилированным антигенным полисахаридом (то есть, не биотинилированным O-антигенным полисахаридом). В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид химически связан с CDAP-активированным полимером (например, полисахаридом) при помощи спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой короткий спейсер. В некоторых вариантах осуществления короткий спейсер содержит первичный амин на каждом конце спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер может представлять собой дигидразид адипиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления OPS, содержащий альдегид или кетон, аминируют на его восстанавливающем конце, с использованием короткого спейсера, содержащего первичный амин на каждом конце (например, дигидразид адипиновой кислоты ADH), путем восстановительного аминирования цианоборогидридом натрия (NaBH3CN), с получением дериватизированного гидразидом OPS. В некоторых вариантах осуществления каркас CPS KP19 биотинилируют одним или более остатками биотина, введенными в ортогональный сайт путем проведения реакции карбоксилатов остатков уроновой кислоты полисахарида с карбодиимидом (EDC), N-гидроксисукцинимидом (NHS) и производным биотина, содержащим первичный амин (таким как, например, амин-ПЭГ3-биотин). В некоторых вариантах осуществления биотинилированный полимер CPS KP 19 затем активируют CDAP, смешивают с дериватизированным гидразидом OPS, с получением каркасного полимера BP-1.3, содержащего один или более фрагментов биотина на остатках уроновой кислоты полимерного каркаса, и без биотина на O-антигенном полисахариде.

Каркасный полимер 2a (BP-2a)

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с полимером, и включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полисахарид. В некоторых вариантах осуществления антигенный полисахарид представляет собой O-антигенный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает по меньшей мере один полимер (например, полисахарид), который является биотинилированным, и по меньшей мере один O-антигенный полисахарид, который является биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер, который включает по меньшей мере один биотинилированный полимер (например, биотинилированный полисахарид) и по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид, получают путем объединения O-антигенного полисахарида с частично окисленным полимером (например, полисахаридом), содержащим альдегидную группу, с получением смеси; и восстановительного аминирования смеси восстанавливающим реагентом для химического связывания O-антигенного полисахарида с полимером (например, полисахаридом), с получением каркасного полимера, который включает O-антигенный полисахарид и полимер (например, полисахарид); а также дериватизации каркасного полимера при помощи CDAP или другого цианилирующего реагента (например, CNBr) и биотина, содержащего первичный амин, с получением каркасного полимера, который включает биотинилированный полимер (например, биотинилированный полисахарид), химически связанный с биотинилированным O-антигеном и полимерным полисахаридом.

В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид химически связан с частично окисленным полисахаридным каркасом при помощи спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой короткий спейсер. В некоторых вариантах осуществления короткий спейсер содержит первичный амин на каждом конце спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер может представлять собой дигидразид адипиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид содержит первичную аминогруппу. В некоторых вариантах осуществления первичная аминогруппа представляет собой α-аминогруппу L-аланина внешнего ядра O-полисахарида P. aeruginosa или аминогруппу, которая была введена в восстанавливающий конец O-антигенного полисахарида за счет химического связывания короткой спейсерной молекулы, содержащей первичную группу на каждом конце, путем восстановительного аминирования восстанавливающим реагентом.

В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является частично окисленным окисляющим реагентом. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент включает периодат натрия. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий реагент включает цианоборогидрид натрия или борогидрид натрия.

Каркасный полимер 2b (BP-2b)

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с антигенным полисахаридом. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полисахарид. В некоторых вариантах осуществления антигенный полисахарид представляет собой O-антигенный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает по меньшей мере один полимер (например, полисахарид), который является не биотинилированным, и по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер, который включает по меньшей мере один не биотинилированный полимер (например, не биотинилированный полисахарид) и по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид, получают путем биотинилирования O-антигенного полисахарида, содержащего O-полисахаридные повторы и один или более коровых альфа-KDO и/или гептозных фрагментов, при помощи CDAP и биотина, содержащего первичный амин, с получением смеси биотинилированного O-антигенного полисахарида; частичного окисления смеси биотинилированного OPS периодатом натрия для введения альдегидов в коровые KDO и/или гептозные фрагменты и/или остатки OPS; восстановительного аминирования биотинилированного полисахарида дигидразидом адипиновой кислоты; смешивания биотинилированного и аминированного OPS с частично окисленным полимером (например, полисахаридом), с получением смеси; и восстановительного аминирования смеси; с получением каркасного полимера, который включает полимер (например, полисахарид), который является не биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид, который является биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид является частично окисленным окисляющим реагентом. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент включает периодат натрия. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий реагент включает цианоборогидрид натрия или борогидрид натрия.

Каркасный полимер 3 (BP-3)

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с антигенным полисахаридом. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полимер поли-L-лизин (PLL). В некоторых вариантах осуществления антигенный полисахарид представляет собой O-антигенный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид и полимер PLL.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер, который включает по меньшей мере один не биотинилированный полимер (например, не биотинилированный полимер PLL) и по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид, получают путем восстановительного аминирования O-антигенного полисахарида, содержащего концевые альдегиды или KDO, с ε-NH₂ группами полимера PLL, с получением полимера OPS-PLL; обработки, или не обработки, смеси ацилирующим реагентом для блокирования непрореагировавших ε-NH₂ групп полимера PLL; дериватизации OPS при помощи CDAP, с получением смеси производных; и проведения реакции смеси производных с биотином, содержащим первичный амин; с получением каркасного полимера, при этом блокированный полимер N-ацетилированный-PLL или неблокированный PLL является не биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления ацилирующий реагент представляет собой уксусный ангидрид или ацетилхлорид.

В некоторых вариантах осуществления реакцию «клик-химии» используют для связывания полимера (например, полисахарида), имеющего алкиновую функциональную группу на его карбоксилатных группах, с окисленными полисахаридными альдегидами на O-антигенном полисахариде, дериватизированном азидогруппой на его восстанавливающем конце. Связывание реакцией клик-химии 2 полисахаридов проводят с катализатором в водной среде. Связывание реакцией клик-химии O-антигенного полисахарида с полисахаридом можно использовать в обратимых вариантах, либо с азидогруппой, присоединенной к OPS и алкиновой группой, присоединенной к полисахариду, либо наоборот. Биотинирование можно проводить с использованием такой химии избирательно либо на полисахариде, с получением каркасного полимера 1, либо на O-антигенном полисахариде, с получением каркасного полимера 2b.

В некоторых вариантах осуществления катализатором для алкин-азидного циклоприсоединения является сульфат меди. В некоторых вариантах осуществления алкиновую группу для дериватизации полисахарида выбирают из группы, состоящей из 1-амино-3-бутина, 1-амино-4-пентина, DBCO-амина и алкин-ПЭГ4-амина.

В некоторых вариантах осуществления азидную группу для дериватизации O-антигенного полисахарида на его восстанавливающем конце выбирают из группы, состоящей из амино-ПЭГ-азида, азидо-ПЭГ3-амина, азидопропиламина и азидобутиламина.

Применение иммуногенных комплексов

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, который включает один или более антигенных полисахаридов, характеризуется тем, что одно или более из потенциальной возможности опсонизации или иммуногенности одного или более антигенных полисахаридов увеличивается относительно ранее определенного уровня, при измерении методом ELISA и/или в функциональном анализе антител. В некоторых вариантах осуществления одно или более из потенциальной возможности опсонизации или иммуногенности одного или более антигенных полисахаридов увеличивается по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза или 5 раз относительно ранее определенного уровня, при измерении методом ELISA и/или в функциональном анализе антител. В некоторых вариантах осуществления ранее определенный уровень представляет собой преиммунный уровень. В некоторых вариантах осуществления эпитопная валентность одного или более антигенных полисахаридов превышает по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза или 5 раз таковую у нативного полисахарида. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов представляют собой белки-носители для одного или более антигенных полисахаридов.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на уровне, превышающем уровень в случае композиции, содержащей только антигенный полисахарид, и не содержащий каркасный полимер, при измерении методом ELISA. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на уровне, превышающем уровень в случае композиции, содержащей только каркасный полимер, и не содержащей антигенный полисахарид, при измерении методом ELISA.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту индуцирует иммунный ответ против одного или более патогенов у пациента на уровне, превышающем уровень в случае композиции, содержащий только антигенный полисахарид, и не содержащей каркасный полимер. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту индуцирует иммунный ответ против одного или более патогенов у пациента на уровне, превышающем уровень в случае композиции, содержащей каркасный полимер, и не содержащей антигенный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой выработку антител или B-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой CD4+ T-клеточный ответ, включая Th1, Th2, или Th17 ответ, или CD8+ T-клеточный ответ, или CD4+/CD8+ T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой выработку антител или B-клеточный ответ; и T-клеточный ответ.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на более высоком уровне, чем в случае композиции, содержащей только полипептидный антиген, и не содержащей каркасный полимер, при измерении методом ELISA. В некоторых вариантах осуществления один или более патогенов выбирают из K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает иммунный ответ против одного или более из K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает иммунный ответ против грамотрицательных и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления грамотрицательные бактерии выбирают из K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli., а также их сочетания. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает продуцирование антител, которые узнают нативный MrkA на экспрессирующих MrkA K. pneumoniae.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, содержит один или более полипептидных антигенов. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов представляют собой бактериальный полипептид, грибковый полипептид и/или вирусный полипептид. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов представляют собой полипептид из Klebsiella, Pseudomonas и/или E. coli.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из антигенных полисахаридов представляет собой экзополисахарид PsL P. aeruginosa. В некоторых вариантах осуществления PsL содержит по меньшей мере один эпитоп, который связывает моноклональное антитело, содержащее последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 4, и/или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 5 (Cam-003). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1 (фимбриальный белок I типа K. pneumoniae). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 (консервативный фимбриальный белок III типа MrkA K. pneumoniae), или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3 мономерного стабилизированного MrkA, или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой флагеллин подтипа A FliC P. aeruginosa, флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6 (подтип A1), аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 9 (подтип A2), или ее иммуногенный фрагмент.

Получение иммуногенных комплексов

Настоящее изобретение относится к способам получения иммуногенных комплексов, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления способ получения иммуногенных комплексов включает образование комплекса из по меньшей мере одного биотинилированного каркасного полимера с по меньшей мере одним биотин-связывающим слитым белком. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с любой из SEQ ID NO: 16-26.

Заболевания, нарушения и состояния

В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении (например, композиция, содержащая иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении), вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на более высоком уровне, чем в случае композиции, содержащей антигенный полисахарид, и не содержащей каркасный полимер, при измерении методом ELISA. В некоторых вариантах осуществления один или более патогенов выбирают из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении (например, композиция, содержащая иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении), вызывает иммунный ответ против одного или более патогенов у пациента. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, вызывает иммунный ответ против одного или более патогенов у пациента на более высоком уровне, чем в случае композиции, содержащей антигенный полисахарид, и не содержащий каркасный полимер. В некоторых вариантах осуществления один или более патогенов выбирают из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении (например, композицию, содержащую иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении), используют для лечения или предотвращения инфекции. В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой инфекцию ожоговой раны, ЖК инфекцию, инфекцию операционного поля, инфекцию мочевыводящих путей, инфекцию роговицы, инфекцию кожи и/или мягких тканей, инфекцию диабетических язв, инфекцию, связанную с медицинским устройством (например, катетером, хирургическим имплантатом, протезом). В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенную композицию, описанную в настоящем изобретении, используют для лечения или предотвращения пневмонии, сепсиса и/или колонизации.

Иммуногенные композиции и составы

Изобретение также относится к композициям, содержащим один или более иммуногенных комплексов, описанных в настоящем изобретении. Например, иммуногенная композиция, например, вакцинная композиция, может содержать один или более иммуногенных комплексов, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления такие композиции могут содержать множество иммуногенных комплексов одного типа, описанных в настоящем изобретении. Дополнительно или альтернативно, такие композиции могут содержать множество иммуногенных комплексов более, чем одного типа, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные комплексы, описанные в настоящем изобретении, составлены в фармацевтическую композицию. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может представлять собой вакцину. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция представляет собой поливалентную или мультивалентную вакцину. В некоторых вариантах осуществления валентность вакцинной композиции означает число типов иммуногенных комплексов, присутствующих в вакцинной композиции. Валентность вакцины, описанной в настоящем изобретении, не ограничена в отношении общего количества антигенов, присутствующих в указанной фармацевтической композиции, иммуногенном комплексе или вакцине, или в отношении числа штаммов патогенов, против которых введение указанной фармацевтической композиции, иммуногенного комплекса, иммуногенной композиции или вакцинной композиции, может индуцировать защитный иммунный ответ. В качестве неограничивающего примера 12-валентная вакцинная композиция может содержать более чем 12 антигенных компонентов (например, пептидных и/или полисахаридных компонентов), и может индуцировать защитный иммунный ответ против более чем 12 патогенов или патогенных штаммов.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1-50 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1-25 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1-15 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1-10 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1-5 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцина представляет собой поливалентную вакцину.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1 тип иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 2 типа иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 4 типа иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 6 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 8 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 10 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 12 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных комплексов в таких количествах, что масса OPS в вакцинной композиции из каждой иммуногенной композиции отличается, например, они присутствуют в массовом отношении, отличном от приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных комплексов в таких количествах, что масса OPS в вакцинной композиции из каждой иммуногенной композиции является приблизительно одинаковой, например, они присутствуют в массовом отношении приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления масса OPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 1 мкг. В некоторых вариантах осуществления масса OPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 2 мкг. В некоторых вариантах осуществления масса OPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 3 мкг. В некоторых вариантах осуществления масса OPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 4 мкг. В некоторых вариантах осуществления масса OPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 5 мкг.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных комплексов в таких количествах, что суммарная масса OPS и CPS в вакцинной композиции из каждой иммуногенной композиции отличается, например, они присутствуют в массовом отношении, отличном от приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных комплексов в таких количествах, что суммарная масса OPS и CPS в вакцинной композиции из каждой иммуногенной композиции отличается, например, они присутствуют в массовом отношении, отличном от приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных комплексов в таких количествах, что суммарная масса OPS и CPS в вакцинной композиции из каждой иммуногенной композиции является приблизительно одинаковой, например, они присутствуют в массовом отношении приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления суммарная масса OPS и CPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 1 мкг. В некоторых вариантах осуществления суммарная масса OPS и CPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 2 мкг. В некоторых вариантах осуществления суммарная масса OPS и CPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 3 мкг. В некоторых вариантах осуществления суммарная масса OPS и CPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 4 мкг. В некоторых вариантах осуществления суммарная масса OPS и CPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 5 мкг.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных композиций, выбранных из

(a) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(b) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(b’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(c) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(d) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(d’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(e) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(e’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(f) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(f’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(g) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(g’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(h) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(h’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(i) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(j) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(k) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и

(l) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных композиций, выбранных из

(a) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(a’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(b) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(b’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(c) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(c’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;