Ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно 35 U.S.С. § 119(е) по предварительной заявке на выдачу патента США №61/484934, поданной 11 мая 2011, предварительной заявке на выдачу патента США №61/608168, поданной 8 марта 2012 и предварительной заявке на выдачу патента США №61/609974, поданной 13 марта 2012, содержание каждой из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится к молекулярной генетике, иммунологии и микробиологии. Настоящая заявка, в общем, направлена на композиции и способы получения иммуногенных композиций. Более конкретно, вариант осуществления настоящего изобретения относится к иммуногенному макрокомплексу, содержащему по меньшей мере один белковый или пептидный антиген, прикрепленный к полимеру, такому как полисахарид, который может также представлять собой антиген. Согласно некоторым вариантам осуществления этот комплекс может применяться в качестве иммуногенной композиции, такой как вакцина, для предоставления синергического гуморального и клеточного иммунного ответа; и согласно некоторым вариантам осуществления вызывает синергическую опосредованную антителами и клетками защиту от патогенов, например, летальной инфекции и носительства таких патогенов на слизистых оболочках.
Уровень техники
Вакцины предусматривают профилактику и лечение разнообразных заболеваний, включающих в себя микробную инфекцию, вирусную инфекцию и злокачественные опухоли. Используемые в настоящее время вакцины на полисахаридной основе, тем не менее, не всегда эффективны у большинства уязвимых групп населения. Например, вызванные Streptococcus pneumonia (пневмококком) и Salmonella typhi инфекции представляют собой два основных заболевания детей в развивающихся странах. Для брюшного типа разрешенные к применению Vi полисахаридные вакцины являются неэффективными у детей младше двух лет. Тем не менее, успешное применение вакцин на полисахаридной основе и пассивная иммунизация для профилактики колонизации или заболевание продемонстрировала важность капсульных антител, в частности, в борьбе с заболеванием, вызванным S. pneumoniae. Более того, исследования как на животных, так и на людях показывают, что антитела, активированные в результате пневмококковой вакцинации, могут защищать от назофарингеальной (NP) пневмококковой колонизации, которая предшествует пневмококковому заболеванию.
Ограничение используемых в настоящее время полисахаридных пневмококковых вакцин состоит в том, что защита с помощью антикапсульного антитела ограничена специфичностью его серотипа. Например, хотя 7-валентеная пневмококковая конъюгированная вакцина (PCV7) значительно снижала заболеваемость инвазивным пневмококковым заболеванием, вызванным штаммами вакцинного типа (VT), показали, что не относящиеся к VT серотипы постепенно замещают VT пневмококковые популяции, потенциально ограничивая полезность вакцины. Это привело к оценке того, можно ли предотвратить пневмококковую колонизацию с помощью иммунизации консервативными антигенами. В частности, некоторые пневмококковые белки были оценены в качестве кандидатов вакцины на животных моделях пневмококковой колонизации. Было показано, что иммунизация слизистых оболочек некоторыми из этих белков активирует системные антитела и антитела в слизистых оболочках и предоставляет защиту от пневмококкового заболевания и колонизации. Остается необходимость в иммуногенной композиции, которая включает в себя как пневмококковые полисахариды, так и белки, способной вызывать устойчивые как клеточные, так и гуморальные иммунные ответы на все пневмококковые серотипы.
Кроме того, врожденный иммунный ответ предусматривает быструю и обычно эффективную защиту от микробных патогенов. Этот ответ включает в себя клеточное распознавание связанных с патогеном молекул, запускающее выработку и высвобождение медиаторов воспаления, рекрутинг лейкоцитов и активацию противомикробных эффекторов. Toll-подобные рецепторы (TLR), из которых по меньшей мере одиннадцать были описаны для млекопитающих, способны различать среди разнообразия связанных с патогеном молекул и вызывать защитные ответы. Например, TLR4 распознает многие продукты микроорганизмов, включая в себя продукты от грамотрицательных бактерий, F белок респираторно-синцитиального вируса и зависимые от холестерина цитолизины (CDC) грамположительных бактерий. Кроме того, TLR2 распознает большое число микробных и синтетических соединений. Таким образом, включение таких агонистов TLR может усилить иммунный ответ на вакцины. Остается необходимость в улучшении эффективности вакцин активации врожденного иммунного ответа (опосредованного TLR или другого) против инфекций, таких как пневмококковая колонизация и заболевание.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к иммуногенной системе презентации множественных антигенов (MAPS), применимой для получения иммуногенных композиций, таких как применимые в вакцинах композиции. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим иммуногенный комплекс, содержащий по меньшей мере один тип полимера, например, полисахарид, который может быть, необязательно, антигенным; по меньшей мере один антигенный белок или пептид; и по меньшей мере одну комплементарную пару аффинных молекул, содержащую (i) первую аффинную молекулу, которая связана с полимером, и (ii) комплементарную аффинную молекулу, которая связана с белком или пептидом; так чтобы первая и комплементарная аффинные молекулы служили в качестве опосредованной сшивки между полимером и антигенным белком или пептидом. Соответственно, полимер может прикреплять по меньшей мере 1, или по меньшей мере 2, или множество одинаковых или различных белковых или пептидных антигенов. Согласно некоторым вариантам осуществления полимер является антигенным, например, полимер представляет собой пневмококковый капсульный полисахарид. Согласно некоторым вариантам осуществления белковые или пептидные антигены представляют собой рекомбинантные белковые или пептидные антигены.
Раскрытые в настоящем документе иммуногенные композиции могут одновременно вызывать как гуморальные, так и клеточные ответы на один или множество антигенов. Иммуногенные композиции обеспечивают долгосрочную иммунологическую память, потенциально защищающую субъект от инфекции в будущем. Это предусматривает возможность для отдельной иммуногенной композиции, которая вызывает высокий титр функционального антиполисахаридного антитела, и является аналогичной или выгодно отличается от уровней антител, индуцируемых традиционной конъюгированной вакциной. Более того, нет ограничения в отношении специфического белка-носителя и различные антигенные белки могут применяться в конструкте MAPS для генерации устойчивого ответа антиполисахаридных антител. Кроме того, сильный ответ антител и ответы Th17/Th1 являются специфическими ко множественным белковым антигенам, подвергнутым презентации посредством композиции MAPS. Это представляет собой главное преимущество в качестве средства для активации двух форм иммунитета с помощью одного конструкта. В дополнение к более традиционному иммунному ответу на антигенный полисахарид, конъюгированный с белковым носителем, настоящее изобретение предусматривает Т-клеточный ответ и, конкретнее, ответы Th17 и Th1 на белки, системно введенные с помощью инъекции. Более того, иммуногенная композиция по настоящему изобретению может встраивать лиганды в полимерный остов. Это предоставляет потенциальное усиление специфических B-клеточных или T-клеточных ответов путем модификации соотношения белок/полимер, размера комплекса или путем встраивания специфического фактора костимуляции, такого как лиганды TLR2/4 и т.д. в композицию.
По сравнению с типичной технологией конъюгации, которая включает в себя грубую обработку белков, настоящие способы позволяют избежать риска денатурации или другой модификации пептидного антигена. Это предоставляет существенное преимущество в сохранении антигенности включенных белков и увеличивает вероятность того, что сам белок будет служить в качестве антигена (а не просто носителя). Аналогично, настоящие способы позволяют избежать ненужной модификации/повреждения полисахаридного остова, поскольку в настоящем документе отсутствует сильное химическое сшивание: можно точно контролировать биотинилирование для реакции со специфическими функциональными группами полисахарида, и уровень биотинилирования можно легко регулировать. Это является преимущественным в избегании типичного способа конъюгации, который приводит к повреждению критически важных боковых цепей или эпитопов, что может вызвать сниженную иммуногенность и защиту.
Настоящая основанная на аффинности сборка предусматривает простое и высоко адаптивное получение иммуногенной композиции. Она является высоко специфической и стабильной; она может храниться в холоде в течение месяцев и сохранять свою активность. Способ сборки является достаточно простым для обеспечения высокой воспроизводимость; необходимо лишь несколько стадий для снижения риска разброса характеристик изделия от партии к партии, что представляет собой большое промышленное преимущество. Сборка MAPS является высоко эффективной (свыше 95%), даже при низких концентрациях белка и полисахарида (таких как 0,1 мг/мл); это представляет собой основное преимущество, поскольку низкие производительности в производстве конъюгатов (как правило производительности находятся в диапазоне <50%) представляют собой главное затруднение и причину высокой стоимости вакцин. В отношении получения состава: легко регулировать состав и физические свойства конечного продукта. Соотношение белок:полимер в комплексе является регулируемым; с помощью умеренного биотинилирования полимера соотношение белок:полимер может составлять 10:1 (вес/вес) или более; наоборот, соотношение может составлять 1:10 или менее, если это представляет интерес с точки зрения иммунологических целей. Кроме того, размер иммуногенной композиции MAPS может регулироваться путем выбора размера полимера. Способы получения MAPS предусматривают простоту в комбинировании белков и полимеров с небольшой модификацией. Возможная многовалентность конечного продукта путем загрузки множественных белковых антигенов, их одинаковых или различных патогенов (например, пневмококк и туберкулез), в один иммуногенный конструкт предусматривает композицию, которая может применяться для уменьшения количества вакцин, необходимых для иммунизации субъекта против более чем одного заболевания. Более того, композиция MAPS является высоко стабильной; становясь диссоциированной только при кипячении и поддерживая иммуногенность даже после многих месяцев при 4°С. Иммуногенность комплекса MAPS может быть ограничена стабильностью антигенного белкового или пептидного компонента, чья стабильность может быть увеличена путем включения в комплекс MAPS. Используемые в настоящем документе специфические антигены проявляли стабильность при комнатной температуре и после по меньшей мере одного цикла замораживание-оттаивание. Это предусматривает важное преимущество по сравнению с используемыми в настоящее время вакцинами, которые повреждаются, если правильно не поддерживать "холодовую цепь".
Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к иммуногенной композиции, содержащей полимер, по меньшей мере один белковый или пептидный антиген, и по меньшей мере одну комплементарную пару аффинных молекул, в которой комплементарная пара аффинных молекул содержит первую аффинную молекулу, которая связана с полимером, и комплементарную аффинную молекулу, которая связана с белковым или пептидным антигеном так, что когда первая аффинная молекула связывается с комплементарной аффинной молекулой, она опосредованно сшивает антиген с полимером.
Согласно некоторым вариантам осуществления первая аффинная молекула сшита с полимером с помощью сшивающего реагента, например, сшивающего реагента, выбранного из следующего: CDAP (тетрафторборат 1-циано-4-диметиламинопиридиния), EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлорид), цианоборогидрид натрия; цианогенбромид; или бикарбонат аммония/йодуксусная кислота. Согласно некоторым вариантам осуществления первая аффинная молекула сшита с карбоксильной, гидроксильной, амино, феноксильной, гемиацетальной и меркапто функциональными группами полимера. Согласно некоторым вариантам осуществления первая аффинная молекула ковалентно связана с полимером.
Согласно некоторым вариантам осуществления первая аффинная молекула представляет собой биотин или его производное или молекулу с аналогичной биотину структурой или физическим свойством, например, амин-PEG3-биотин ((+)-биотинил-3-6,9-триоксаундекандиамин) или его производное.
Согласно некоторым вариантам осуществления белковый или пептидный антиген иммуногенной композиции представляет собой белок слияния, содержащий антигенный белок или пептид, слитый с комплементарной аффинной связывающей молекулой. Слияние может представлять собой генетический конструкт, т.е., рекомбинантный пептид или белок слияния. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген может быть ковалентно прикреплен в виде белка слияния к комплементарной аффинной молекуле. Согласно альтернативным вариантам осуществления антиген нековалентно прикреплен к комплементарной аффинной молекуле.
Согласно некоторым вариантам осуществления комплементарная аффинная молекула представляет собой связывающий биотин белок или его производное или функциональную часть. Согласно некоторым вариантам осуществления комплементарная аффинная молекула представляет собой авидиноподобный белок или его производное или функциональную часть, например, без ограничения, ризавидин или его производное. Согласно некоторым вариантам осуществления комплементарная аффинная молекула представляет собой авидин или стрептавидин или его производное или функциональную часть.
Согласно некоторым вариантам осуществления сигнальный пептид секреции расположен на N-конце авидиноподобного белка. Может использоваться любая сигнальная последовательность, известная специалистам в настоящей области техники; и согласно некоторым вариантам осуществления сигнальная последовательность представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO:1) или ее производное или функциональная часть. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген может быть слит с комплементарной аффинной молекулой посредством гибкого линкерного пептида, причем гибкий линкерный пептид прикрепляет антиген к комплементарной аффинной молекуле.
Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный компонент иммуногена содержит полимер, полученный из живого организма, например, полисахарид. Согласно некоторым вариантам осуществления полимер может быть очищен и выделен из естественного источника или может быть синтезированным с естественным составом/структурой или он может быть синтетическим (например, с искусственным составом/структурой) полимером. Согласно некоторым вариантам осуществления полимер получают из организма, выбранного из группы, состоящей из: бактерий, архей или эукариотических клеток, например, клеток грибов, насекомого, растения или их химер. Согласно некоторым вариантам осуществления полимер представляет собой полисахарид, полученный из патогенной бактерии. Согласно конкретным вариантам осуществления полисахарид представляет собой пневмококковый капсульный полисахарид, пневмококковый полисахарид клеточной стенки или Vi полисахарид Salmonella typhi.
Согласно некоторым вариантам осуществления полимер раскрытой в настоящем документе иммуногенной композиций представляет собой полимер с разветвленной цепью, например, разветвленный полисахарид, или альтернативно, может представлять собой полимер неразветвленной цепью, например, одноцепочечный полимер, например, полисахарид. Согласно некоторым вариантам осуществления полимер представляет собой полисахарид, например, декстран или его производное. Согласно некоторым вариантам осуществления полимер, например, полисахарид декстран может характеризоваться средней молекулярной массой, составляющей 425 кДа - 500 кДа, включительно, или согласно некоторым вариантам осуществления более чем 500 кДа. Согласно некоторым вариантам осуществления полимер, например, полисахарид декстран может характеризоваться средней молекулярной массой, составляющей 60 кДа - 90 кДа, включительно, или согласно некоторым вариантам осуществления менее чем 70 кДа. Полимер декстран может быть получен из бактерии, такой как Leuconostoc mesenteroides.
Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытая в настоящем документе иммуногенная композиция содержит по меньшей мере 2 антигена, или по меньшей мере 3 антигена, или по меньшей мере 5 антигенов, или 2-10 антигенов, или 10-15 антигенов, или 15-20 антигенов, или 20-50 антигенов, или 50-100 антигенов, или более чем 100 антигенов, включительно. Согласно некоторым вариантам осуществления, если раскрытая в настоящем документе иммуногенная композиция содержит по меньшей мере 2 антигенов, антигены могут быть одинаковым антигеном или по меньшей мере 2 различными антигенами. Согласно некоторым вариантам осуществления антигены могут происходить из одинаковых или различных патогенов, или могут представлять собой различные эпитопы или части одного и того же антигенного белка, или могут быть одним и тем же антигеном, который является специфическим к различным серотипам или сезонным вариантам одного и того же патогена (например, вирус гриппа А, В, и С).
Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытая в настоящем документе иммуногенная композиция содержит антиген из патогенного организма или аномальной ткани. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген представляет собой опухолевый антиген. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген может представлять собой по меньшей мере один антиген, выбранный из антигенов патогенов или паразитов, таких как антигены Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis или M. tetanus, Bacillus anthracis, ВИЧ, антигены сезонного или эпидемического гриппа (такие как H1N1 или H5N1), Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis или N. gonorrhoeae, ВПЧ, Chlamydia trachomatis, ВПГ или другие вирусы герпеса, или вид Plasmodia. Эти антигены могут включать в себя пептиды, белки, гликопротеины или полисахариды. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген представляет собой анатоксин или часть токсина.
Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытая в настоящем документе иммуногенная композиция содержит антигенный полисахарид, например, такой как Vi антиген (капсульный полисахарид Salmonella typhi), пневмококковые капсульные полисахариды, пневмококковый полисахарид клеточной стенки, капсульный полисахарид Hib (Haemophilus influenzae типа В), менингококковые капсульные полисахариды, полисахарид Bacillus anthracis (возбудитель сибирской язвы) и другие бактериальные капсульные полисахариды или полисахариды клеточной стенки, или любые их комбинации. Полисахарид может характеризоваться белковым компонентом, например, гликопротеином, таким как гликопротеины из вирусов.
Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытая в настоящем документе иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один фактор костимуляции, связанный с полимером или полисахаридом, причем фактор костимуляции может быть связан прямо или опосредованно. Например, согласно определенному варианту осуществления фактор костимуляции может быть ковалентно прикреплен к полимеру. Например, согласно некоторым вариантам осуществления фактор костимуляции может быть ковалентно прикреплен к первой аффинной молекуле, которая затем сшивается с полимером. Например, согласно некоторым вариантам осуществления фактор костимуляции может быть прикреплен к комплементарной аффинной молекуле, которая связывается с первой аффинной молекулой для сшивания фактора костимуляции с полимером. Согласно некоторым вариантам осуществления фактор костимуляции представляет собой адъювант. Согласно альтернативным вариантам осуществления костимулирующий фактор может быть любым известным специалисту в настоящей области техники и включает в себя любую комбинацию, например, без ограничения, агонисты Toll-подобного рецептора (агонисты для TLR2, 3, 4, 5 7, 8, 9 и т.д.), агонисты NOD или агонисты инфламмасомы.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению раскрытой в настоящем документе иммуногенной композиции, подлежащей введению субъекту для активации иммунного ответа у субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления иммунный ответ представляет собой ответ антител/В клеток, CD4+ Т-клеточный ответ (включая в себя клетки Th1, Th2 и Th17) и/или CD8+ Т-клеточный ответ. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один адъювант вводят совместно с иммуногенной композицией.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу индукции иммунного ответа у субъекта по меньшей мере к одному антигену, включающему введение субъекту раскрытой в настоящем документе иммуногенной композиции.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу вакцинации животного, например, птицы, млекопитающего или человека, портив по меньшей мере одного антигена, включающему введение вакцинной композиции, содержащей раскрытую в настоящем документе иммуногенную композицию.
Согласно всем раскрытым в настоящем документе аспектам животное или субъект может представлять собой человека. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект может быть сельскохозяйственным или диким животным, или домашним животным. Согласно некоторым вариантам осуществления вакцинная композиция, содержащая раскрытую в настоящем документе иммуногенную композицию, может быть введена посредством подкожной, интраназальной, пероральной, сублингвальной, вагинальной, ректальной, интрадермальной, интраперитонеальной, внутримышечной инъекции или посредством кожного пластыря для чрескожной иммунизации.
Согласно всем раскрытым в настоящем документе аспектам иммунный ответ представляет собой ответ антител/В-клеток, CD4+ Т-клеточный ответ (включая в себя ответы Th1, Th2 и Th17) или CD8+ Т-клеточный ответ против белкового(ых)/пептидного(ых) антигена(ов). Согласно некоторым вариантам осуществления иммунный ответ представляет собой ответ антител/В-клеток против полимера, например, пневмококкового полисахарида. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один адъювант вводят совместно с иммуногенной композиции.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению раскрытой в настоящем документе иммуногенной композиции для применения в диагностике в отношении воздействия со стороны патогенов или иммуногенного средства.
Другой аспект настоящего изобретения относится к наборам для получения раскрытой в настоящем документе иммуногенной композиции. Например, такие наборы могут содержать любой один или несколько следующих материалов: контейнер, содержащий полимер, например, полисахарид, сшитый с множеством первых аффинных молекул; и контейнер, содержащий комплементарную аффинную молекулу, которая связана с первой аффинной молекулой, причем комплементарная аффинная молекула связывается с антигеном.
Согласно другому варианту осуществления набор может содержать контейнер, содержащий полимер, например, полисахарид; контейнер, содержащий множество первых аффинных молекул; и контейнер, содержащий сшивающую молекулу для сшивания первых аффинных молекул с полимером. Согласно некоторым вариантам осуществления набор может содержать по меньшей мере один фактор костимуляции, который может быть добавлен к полимеру. Согласно некоторым вариантам осуществления набор содержит сшивающий реагент, например, без ограничения CDAP(тетрафторборат 1-циано-4-диметиламинопиридиния), EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлорид), цианоборогидрид натрия; цианогенбромид; бикарбонат аммония/йодуксусная кислота для сшивания кофактора с полимером или полисахаридом. Согласно некоторым вариантам осуществления набор дополнительно содержит средство для прикрепления комплементарной аффинной молекулы к белковому или пептидному антигену, причем средство может быть предусмотрено с использованием сшивающего реагента или определенного промежуточного белка слияния.
Согласно некоторым вариантам осуществления набор может содержать контейнер, содержащий вектор экспрессии для экспрессии белка слияния белкового или пептидного антигена с аффинной молекулой, например, вектор экспрессии для экспрессии белкового или пептидного антигена в виде белка слияния с комплементарной аффинной молекулой. Согласно некоторым вариантам осуществления вектор может необязательно содержать последовательность для линкерного пептида, причем вектор экспрессии может экспрессировать белок слияния антигена с комплементарной аффинной молекулой, содержащий линкерный пептид, расположенный между антигеном и аффинной молекулой.
Согласно некоторым вариантам осуществления набор может необязательно содержать контейнер, содержащий комплементарную аффинную молекулу, которая связывается с первой аффинной молекулой, причем комплементарная аффинная молекула связывается с пептидным/белковым антигеном. Согласно некоторым вариантам осуществления набор может кроме того дополнительно содержать средство для прикрепления комплементарной аффинной молекулы к антигену, например, с использованием раскрытого в настоящем документе сшивающего реагента или другого промежуточного белка, такого как двухвалентное антитело или фрагмент антитела.
Также в настоящем документе предусматривается способ вакцинации субъекта, например, млекопитающего, например, человека с помощью раскрытых в настоящем документе иммуногенных композиций, включающий введение раскрытой в настоящем документе вакцинной композиции субъекту.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлено схематическое изображение системы презентации множественных антигенов (MAPS). MAPS представляет новую платформу сложной иммуногенной композиции, которая получена путем прикрепления ряда белковых антигенов к полисахариду или полисахаридному антигену посредством стабильного взаимодействия аффинной пары, такой как пара авидин-биотин. Согласно одному варианту осуществления комплекса MAPS белковые антигены из одного или различных патогенов рекомбинантно слиты с авидиноподобным белком и экспрессированы в Е. coli. Полисахаридный остов, который может быть выбран из множества патогенов, является биотинилированным и/или сшитым с факторами костимуляции или без них с использованием тетрафторбората 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) или 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлорида (EDC) в качестве активирующего реагента. Комплекс MAPS может быть без труда собран путем простого перемешивания и инкубации очищенных антигенов слияния, одного или множественных, в необходимом соотношении, с биотинилированным полисахаридом. Собранный комплекс MAPS может быть очищен/разделен в соответствии с размером с помощью гель-фильтрационной хроматографии.
На фиг.2 показаны иллюстративные примеры биотинилирования полисахарида: структуры производного биотина, амин-PEG3-биотина (также известного как (+)-биотинил-3-6,9-триоксаундекандиамин); структура CDAP; и структура EDC. На фигуре также показано схематическое изображение способа биотинилирования полисахаридов в использованием CDAP в качестве активирующего реагента, способ (1) или с использованием EDC в качестве активирующего реагента, способ (2). Другие процедуры биотинилирования включены в способы настоящего изобретения.
На фиг.3А-3С показан вариант осуществления рекомбинантного ризавидина и белка слияния ризавидина с антигеном. На фиг.3А показано схематическое изображение конструкции модифицированного ризавидина (вверху) и белка слияния ризавидина с антигеном (внизу). Все конструкты клонировали в вектор PET21b и трансформировали в штамм BL21 (DE3) Е. coli для экспрессии. На фиг.3B показан SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) очищенного рекомбинантного ризавидина (rRhavi). На фиг.3С показан SDS-PAGE очищенных белков слияния ризавидина (rhavi) с антигеном. Дорожка 1, rhavi-Pdt; дорожка 2, rhavi-PsaA; дорожка 3, rhavi-sp1733; дорожка 4, rhavi-sp1534; дорожка 5, rhavi-sp0435; дорожка 6, rhavi-sp1458; дорожка 7, rhavi-ESAT-6/Cfp10; дорожка 8, rhavi-TB9.8/TB10.4; дорожка 9, rhavi-MPT64; м 10, rhavi-MPT83.
На фиг.4А-4С показан профиль элюции собранной иллюстративной MAPS. На фиг.4А MAPS собирали путем инкубации 0,5 мг очищенного rRhavi с 1 мг биотинилированного декстрана 90 (BD90, средний MB 60-90 кДа) при 4°С в течение ночи и затем наносили на колонку superdex-200. Пик А и пик В указывали на элюированные фракции, содержащие комплекс MAPS, пик С указывал на элюированные фракции, содержащие свободный rRhavi. На фиг.4B показан SDS-PAGE пиковых фракций. Все образцы кипятили в SDS буфере для образцов с 10 мМ DTT. На фиг.4С показана стабильность комплекса MAPS. Обрабатывали равные количества образца и затем наносили на SDS-PAGE. Комплекс MAPS оставался интактным даже после обработки SDS буфером для образцов, содержащим восстановитель (дорожка 1) и может быть разрушен только после кипячения, что является доказательством стабильности ассоциации. Дорожка 1, MAPS, обработанный SDS буфером для образцов, содержащим 10 мМ DTT, при комнатной температуре в течение 10 мин; дорожка 2, MAPS, обработанный SDS буфером для образцов без DTT, подвергнутая кипячению в течение 10 мин; дорожка 3, MAPS, обработанный SDS буфером для образцов, содержащим 10 мМ DTT, подвергнутая кипячению в течение 10 мин.
На фиг.5 показана сборка комплекса MAPS при различной температуре и при различной концентрации PS и белкового антигена. Комплекс MAPS может быть эффективно собран в широком диапазоне концентраций полисахарида (PS) или белкового антигена (до 0,1 мг/мл). Сборка может осуществляться в помощью инкубации в течение ночи при 4°С (фиг.5А) или при 25°С (фиг.5B) в зависимости от стабильности антигенов. Эффективность сборки комплекса MAPS может быть оценена путем пропускания смеси для сборки через SDS-PAGE, с предварительным кипячением образца или без него. Без обработки кипячением белковые антигены, которые были включены в комплекс MAPS, остаются на PS и, таким образом, проявляются как полосы очень большой молекулярной массы на геле (MAPS/PS); только несвязанные белки будут опускаться ниже на геле и обнаруживаться при предполагаемой молекулярной массе антигена (положение мономера или димера). Путем сравнения полосы белкового антигена перед и после кипячения можно оценить процентное отношение антигенов, собранных в комплекс MAPS. В общем, эффективность сборки при 4°С составляет более чем 85% и при 25°С она близка к 95%-99%.
На фиг.6 показаны профили элюции MAPS, собранной с различными соотношениями белка к полисахариду. 0,5 мг очищенного rRhavi инкубировали в течение ночи или с 1 мг, 0,5 мг, или с 0,1 мг BD90, соответственно, и затем наносили на систему для гель-фильтрационной хроматографии с использованием колонки superdex 200. Оказалось, что комплекс MAPS, собранный при высоком соотношении белка к полисахариду, имел более высокую молекулярную массу, чем собранный при низком соотношении комплекс. Собирали пиковые фракции, содержащие комплекс MAPS для каждого образца (обозначены стрелками). Измеряли соотношение белка к полисахариду в очищенном комплексу MAPS и показали хорошую корреляцию с исходным соотношением.
На фиг.7 показаны профили элюции MAPS, собранного с различными размерами полисахарида. 0,5 мг антигена слияния инкубировали с 0,25 мг биотинилированного декстрана со средней молекулярной массой 425-500 кДа (BD500), 150 кДа (BD150) или 60-90 кДа (BD90). Комплекс MAPS разделяли с использованием колонки Superpose 6; хроматографический профиль показал, что собранный с большим полисахаридом комплекс имел больший размер.
На фиг.8A-8D показана сборка MAPS с множественными антигенами. На фиг.8А показана сборка MAPS с двумя антигенами при различных соотношениях. Двухвалентный комплекс MAPS получали путем инкубации биотинилированного капсульного полисахарида серотипа 14 S. pneumoniae (SP) с двумя различными пневмококковыми антигенами слияния rhavi-1652 и rhavi-0757, смешанными в молярном соотношении 1:4, 1:2, 1:1, 2:1 или 4:1. Проведение SDS-PAGE показало, что количества каждого включенного в комплекс MAPS антигена хорошо коррелировали с исходными соотношениями. На фиг.8B-8D показан многовалентный комплекс MAPS, который был получен с биотинилированным полисахаридом (декстраном, или пневмококковым капсульным полисахаридом серотипа 3), соединяющим два (2V, фиг.8B), три (3V, фиг.8С) или пять (5V, фиг.8D) различных пневмококковых и/или туберкулезных антигенов. Проведение SDS-PAGE показало антигены, включенные в комплекс MAPS. Все образцы кипятили в SDS буфере для образцов с 10 мМ DTT.
На фиг.9 показано, что иммунизация с помощью комплекса MAPS индуцировала сильный ответ антител против полисахаридных антигенов. Мыши, которых иммунизировали комплексом MAPS, полученным из биотинилированного декстрана (9А), Vi полисахарида (9B) или пневмококкового полисахарида клеточной стенки (CWPS) (9C), производили значительно более высокое количество антиполисахаридных антител по сравнению с группами животных, которые получали только адъювант (без Ag) или смесь несвязанного полисахарида и белков (смесь). На фиг.9D-9F показано, что комплекс MAPS выгодно отличается от традиционной конъюгированной вакцины в производстве антитела к PS. Комплексы MAPS получали из капсульного полисахарида (CPS) серотипа 1, 5, 14 SP, нагруженного пятью белковыми антигенами. Мышей подкожно иммунизировали с помощью MAPS или Prevnar 13® (пневмококковая 13-валентная конъюгированная вакцина [дифтерийный белок CRM197]; Wyeth/Pfizer) (PCV13) дважды с интервалом 2 недели и сывороточное IgG антитело к вакцинированному CPS серотипа анализировали через 2 недели после второй иммунизации с помощью ELISA. Титр к IgG CPS у иммунизированных PCV13 мышей произвольно устанавливали на 1200 единицах для сравнения. Для всех исследуемых серотипов иммунизация комплексом MAPS производила либо аналогичный уровень (серотип 5), либо намного больший уровень IgG антитела к CPS (серотип 1 и серотип 14), чем вырабатывалось путем вакцинации с помощью PCV13. Серотип 1 (фиг.9D); Серотип 5 (фиг.9Е); Серотип 14 (фиг.9F).
На фиг.10 сравнивают антитело к PS, индуцированное MAPS при различных дозировках иммунизации. Комплекс MAPS получали из CPS серотипа 5 SP, нагруженного пятью белковыми антигенами. Мыши получали комплекс MAPS с содержанием 1 мкг - 16 мкг PS на дозу для двух иммунизации с интервалом в две недели. Сывороточное антитело против CPS серотипа 5 измеряли и сравнивали между различными группами иммунизации через две недели после второй иммунизации. При всех дозировках иммунизация с помощью MAPS индуцировала устойчивое IgG антитело к CPS серотипа 5. Прием 2 мкг PS на дозу производил самый высокий титр антител и повышение дозировки PS до 16 мкг снижало титр антител приблизительно в 4 раза.
На фиг.11 показано, что антитела к PS, произведенные путем иммунизации с помощью комплекса MAPS, облегчают лизис целевых патогенов in vitro. На фиг.11А показан опосредованный антителами лизис экспрессирующей Vi бактерии. Сыворотка из животных, иммунизированных комплексом MAPS (с использованием Vi в качестве остова), но не из двух других групп, показала сильный лизис экспрессирующего Vi штамма (более чем 90% лизис) в пределах 1 часа инкубации. Сыворотка из мышей, иммунизированных Alum (пунктирная линия; Смесью (черная линия); или MAPS (серая линия). На фиг.11B-11D показано, что опсонофагоцитирующая лизирующая активность сыворотки из иммунизированных MAPS мышей выгодно отличается от лизирующей активности сыворотки из мышей, иммунизированных разрешенной к применению вакциной PCV13. Способность сыворотки из иммунизированных PCV13 или MAPS мышей к опосредованию in vitro опсонофагоцитирующего лизиса пневмококка нейтрофилами анализировали и сравнивали. Нейтрофилы человека дифференцировали из клеток в клеточной линии HL-60. Опсонофагоцитирующий лизис проводили путем инкубации сыворотки в различных разведениях с серотипом 1 (фиг.11B), серотипом 5 (фиг.11C) или серотипом 13 (фиг.11D), пневмококком и дифференцированными клетками HL-60 при 37°С в течение 1 часа (в присутствии комплемента крольчонка). Аликвоту смеси переносили на планшет после инкубация для подсчета выживших бактерий. Единицу опсонофагоцитирующего лизиса определяли как кратность разведения сыворотки, при которой наблюдается 50% лизис бактерий. Для всех исследуемых серотипов сыворотка из иммунизированных MAPS мышей показала большую по меньшей мере в 4 раза лизисную активность (титр ОРА), чем сыворотка из иммунизированных PCV13 мышей. На фиг.11B-11D: сыворотка из мышей, иммунизированных с помощью Alum (пунктирная линия); PCV13 (черная линия) или MAPS (серая линия).
На фиг.12A-12D показано, что иммунизация комплексом MAPS индуцирует устойчивый ответ антител и клеточный ответ против белковых антигенов. Двухвалентный комплекс MAPS получали из биотинилированного декстрана (BD500) и двух пневмококковых антигенов, rhavi-Pdt и rhavi-PsaA. Подкожные вакцинации проводили раз в две недели, три раза. На фиг.12А показаны результаты сывороточных IgG антител, измеренных к PsaA или Pdt через 2 недели после последней иммунизации. Иммунизированные комплексом MAPS мыши производили значительно более высокий титр антител к Pdt и PsaA, чем мыши, которые получали смесь. Антиген-специфические Т-клеточные ответы оценивали путем in vitro стимуляции цельной крови иммунизированных животных. Продукцию IL-17A (фиг.12В) и IFN-γ (фиг.12С) in vitro измеряли в образцах крови, инкубированных в течение 6 дней или с очищенным PsaA, Pdt, или пневмококковым цельноклеточным антигеном (WCA). По сравнению с иммунизированными смесью мышами животные, которые получали комплекс MAPS, показали значительно более сильный ответ IL-17A и IFN-γ. На фиг.12D показана корреляция продукции IL-17A и IFN-γ путем стимуляции WCA. Для всех диаграмм столбики представляют среднее со стандартным отклонением и статистический анализ проводили с использованием теста Манна-Уитни или с использованием коэффициента корреляции ранговых рядов Спирмена.
На фиг.13 показана оценка иммуногенности комплекса MAPS с различными размерами. Комплексы MAPS получали из двух пневмококковых антигенов слияния, rhavi-PsaA и rhavi-Pdt, и с использованием декстрана с различной длиной в качестве остова (BD500, MB 425-500 кДа; BD90, MB 60-90 кДа). Ответы антител на декстран и на два белковых антигена PdT и PsaA, а также антиген-специфические Т-клеточные ответы измеряли и сравнивали после 3 иммунизации. Как показано, мыши, которых иммунизировали с помощью большего комплекса (MAPS BD500), вырабатывали аналогичный уровень антител к PsaA и Pdt (фиг.13B), но значительно более высокий титр антидекстранового антитела (фиг.13А), а также связанного с IL-17A Т-клеточного ответа (фиг.13С), чем животные, получавшие меньший комплекс (MAPS BD90).
На фиг.14 показано, что добавление костимулирующих факторов (лигандов TLR) к комплексу MAPS облегчает связанные с IL-17A (Фиг.14А) и IFN-γ (Фиг.14B) Т-клеточные ответы. Комплексы MAPS получали из биотинилированного декстрана и одного пневмококкового белкового антигена, rhavi-0435, с добавлением лиганда/агониста TLR: rhavi-Pdt, лиганда TLR4; Pam3CSK4, агониста TLR2, или без этого. Встраивание rhavi-Pdt происходит посредством аффинного взаимодействия между rhavi и биотином, тогда как Pam3CSK4 ковалентно сшивается с декстрановым остовом. Иммунизацию проводили подкожно в течение трех раз и измеряли и сравнивали Т-клеточные ответы против белка 0435. Показано, что добавление агониста TLR2 или комбинации лигандов TLR4 и TLR2 значительно усиливало связанные с IL-17A и IFN-γ Т-клеточные ответы на белковый антиген.
На фиг.15 показан пример многовалентной комбинированной вакцины против пневмококков/Mycobacterium tuberculosis (ТВ). Многовалентную комбинированную MAPS вакцину против SP/TB получали с использованием серотипа 3 SP и загружая один белок SP (анатоксин пневмолизина, Pdt) и шесть белков ТВ (в четырех конструктах слияния) (фиг.15А). Иммунизация мышей с помощью SP/TB MAPS индуцировала большой титр IgG антитела к CPS типа 3 (фиг.15B, левый график), а также к Pdt (фиг.15B, правый график), и приводила к 100% защите мышей от летальной инфекции легких, вызванной пневмококком серотипа 3 (фиг.15С). На фиг.15D-15J показаны B антигены B-клеточного и T-клеточного иммунитета, индуцированные вакцинацией с помощью SP/TB MAPS. На фиг.15D показаны ответы антител на различные белковые антигены ТВ. На фиг.15E-15F показан сильные связанные с IL-17A (фиг.15Е) и IFN-γ (фиг.15F) Т-клеточные ответы в образце цельной крови из иммунизированных MAPS мышей после in vitro стимуляции с помощью очищенных белковых антигенов ТВ. На фиг.15G и 15Н показаны связанные с IL-17A (фиг.15G) и IFN-γ (фиг.15Н) Т-клеточные ответы спленоцитов из иммунизированных MAPS животных на смесь очищенных белковых антигенов ТВ или на цельноклеточный экстракт ТВ. На фиг.15I и 15J представлены дополнительные данные, относящиеся к ТВ-специфическим Т-клеткам памяти/эффекторным Т-клеткам, индуцированным иммунизацией с помощью MAPS. Результаты показали, что истощение CD4+ Т-клеток, но не CD8+ Т клеток имеет существенное влияние на продукцию специфических для ТВ антигена цитокинов, указывая на то, что иммунизация с помощью вакцины MAPS примировала, главным образом, CD4+ Т-клеточный (Т-хелперный) иммунный ответ.
На фиг.16 показано, что прототипная основанная на MAPS многовалентная иммуногенная композиция предотвращает инвазивную инфекцию и назофарингеальную колонизацию пневмококка. Многовалентную SP MAPS получали с использованием полисахарида клеточной стенки SP (CWPS) в качестве остов и нагружали пятью пневмококковыми белковыми антигенами (фиг.16А). Мышей иммунизировали этой MAPS против SP три раза с интервалом в две недели и сывороточные антитела и специфические T-клеточные ответы против пневмококка анализировали через две недели после последней иммунизации. На фиг.16B показано сывороточное IgG антитело против CWPS (левый график) или против пневмококкового цельноклеточного антигена (WCA) (правый график). Иммунизированные с помощью SP MAPS мыши производили значительно более высокий титр антител либо к CWPS, либо к WCA, чем мыши в контрольных группах, которые получали только адъювант (без Ag) или смесь несвязанного PS и белка (Смесь). На фиг.16С и 16D показаны SP-специфические Т-клеточные ответы, индуцированные путем вакцинации с помощью SP MAPS. Периферическую кровь из мышей различных групп иммунизации стимулировали с помощью либо очищенных пневмококковых белков (антигенная смесь), либо WCA. Клетки из вакцинированных MAPS мышей, но не из контрольных групп сильно реагировали на антигены SP и давали в результате устойчивую продукцию IL-17A (фиг.16С) и IFN-γ (фиг.16D). На фиг.16Е и 16F показано, что вакцинация с помощью комплекса MAPS защищает мышей от инвазивной инфекции, а также назофарингеальной колонизации пневмококка. Мышей различных групп иммунизации сенсибилизировали или с помощью штамма WU2 серотипа 3 SP в модели легочной аспирации (фиг.16Е), или с помощью пневмококкового штамма 603 серотипа 6 в модели назальной колонизации (фиг.16F). Защита от сепсиса или колонизации наблюдалась только у иммунизированных MAPS мышей.
На фиг.17 показана универсальность платформы MAPS.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реагентами и т.д., описанными в настоящем документе, и как таковое может изменяться. Используемая в настоящем документе терминология предусмотрена только с целью описания конкретных вариантов осуществления, и не предусматривается для ограничения объема настоящего изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения.
Используемые в настоящем документе и формуле изобретения формы единственного числа включают в себя ссылку ив форму множественного числа и наоборот, если контекст ясно не указывает на иное. Термин "или" является включающим за исключением модифицированного, например, с помощью "либо". За исключением рабочих примеров, или там, где указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов или условия реакции, используемые в настоящем документе, должны пониматься как модифицированные во всех случаях с помощью термина "приблизительно". Следует также понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, данные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предоставлены для описания.
Все указанные патенты и другие публикации в точности включены в настоящий документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, например, методологий, описанных в таких публикациях, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Эти публикации представлены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничего в этом отношении не должно быть истолковано как допущение того, что авторы настоящего изобретения не наделены правом предшествовать такому раскрытию на основании предыдущего изобретения или по какой-либо другой причине. Все заявления относительно даты или представления относительно содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не составляют допущения относительно правильности дат или содержания этих документов.
Если не дано другое определение, то все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значения, обычно принятые специалистами с настоящей области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые известные способы, устройства и материалы могут быть использованы в практическом применении или испытании настоящего изобретения, способы, устройства и материалы в этом отношении описаны в настоящем документе.
Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям и композициям, содержащим иммуногенный комплекс, который содержит по меньшей мере один антиген или множественные антигены, прикрепленные к полимерному каркасу для применения в активации иммунного ответа на каждый из антигенов, прикрепленных к полимеру, и необязательно на сам полимер, при введении субъекту. Эта система презентации множественных антигенов (MAPS) стимулирует гуморальный и клеточный иммунный ответ: она может производить ответы антиполисахаридных антител и B-клеточные/Th1/Th17 ответы на множественные белковые антигены с использованием отдельного иммуногенного конструкта MAPS. Комбинация В- и Т-клеточного иммунитета в отношении организма может представлять оптимальную стратегию вакцинации против многих заболевания, включая в себя связанную с пневмококковыми заболеваниями инвазивную инфекцию и назофарингеальное носительство. Согласно некоторым вариантам осуществления иммуногенная композиция представляет собой вакцину или включена в вакцину.
Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к иммуногенной композиции (системе презентации множественных антигенов, или MAPS), содержащей по меньшей мере один полимер, например, один полисахарид, по меньшей мере один белковый или пептидный антиген, и по меньшей мере одну комплементарную пару аффинных молекул, содержащую (i) первую аффинную молекулу, связанную с полимером, и (ii) комплементарную аффинную молекулу, связанную с антигеном, которая служит для опосредованного прикрепления антигена к полимеру (например, первая аффинная молекула связывается с комплементарной аффинной молекулой для сшивания антигена с полимером). Соответственно, полимер может использоваться в качестве каркаса для прикрепления по меньшей мере 1, или по меньшей мере 2, или более (например, множества) одинаковых или различных антигенов. Раскрытые в настоящем документе иммуногенные композиции могут использоваться для активации как гуморального, так и клеточного иммунитет в отношении множественных антигенов одновременно.
Соответственно, варианты осуществления в настоящем документе предусматривают иммуногенную композицию и способы, применимые для активации иммунного ответа у субъекта, которая может использоваться отдельно или совместно или в дополнение, по сути, к любым существующим подходам к вакцинации.
Определения:
Для удобства здесь собраны определенные термины, используемые во всей заявке (включая в себя описание, примеры и приложенную формулу изобретения). Если не дано другое определение, то все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значения, обычно принятые специалистами с настоящей области техники, к которой относится настоящее изобретение.
Используемый в настоящем документе термин "иммуногенная композиция" определяют как композицию, способную вызывать иммунный ответ, такой как ответ антитела или клеточный иммунный ответ, при введении субъекту. Иммуногенные композиции настоящего изобретения могут являться иммунопротекторными или терапевтическими или не являться таковыми. Когда иммуногенные композиции настоящего изобретения предотвращают, улучшают, временно облегчают или устраняют заболевание у субъекта, то иммуногенная композиция может необязательно называться вакциной. Тем не менее, не предусматривается, что используемый в настоящем документе термин иммуногенная композиция ограничен вакцинами.
Используемый в настоящем документе термин "антиген" относится к любому веществу, которое вызывает иммунный ответ, направленный против вещества. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген представляет собой пептид или полипептид, и согласно другим вариантам осуществления он может представлять собой любое химическое соединение или фрагмент, например, углевод, который вызывает иммунный ответ, направленный против вещества.
Используемый в настоящем документе термин "связывает" относится к соединению двух или более молекул нековалентными или ковалентными связями. Согласно некоторым вариантам осуществления, если соединение двух или более молекул происходит с помощью ковалентной связи, то две или более молекул могут быть слиты вместе или сшиты вместе. Согласно некоторым вариантам осуществления, если соединение двух или более молекул происходит с помощью нековалентной связи, две или более молекул могут формировать комплекс.
Используемый в настоящем документе термин "комплекс" относится к совокупности двух или более молекул, пространственно соединенных посредством взаимодействия, отличного от ковалентного; например, они могут быть соединены электростатическими взаимодействиями, связаны водородной связью или гидрофобными взаимодействиями (т.е., вандерваальсовыми силами).
Используемый в настоящем документе термин "сшитый" относится к ковалентной связи, образованной между полимерной цепью и второй молекулой. Термин "сшивающий реагент" относится к соединению или средству, которое представляет собой промежуточную молекулу, чтобы катализировать ковалентную связь полимера с соединением, например, первой аффинной молекулой или костимулирующим фактором.
Используемый в настоящем документе термин "слитый" означает, что по меньшей мере один белок или пептид физически связан со вторым белком или пептидом. Согласно некоторым вариантам осуществления слияние, как правило, представляет собой ковалентную связь, тем не менее, другие типы связей включены в термин "слитый", включая в себя, например, связь посредством электростатического взаимодействия или гидрофобного взаимодействия и подобного. Ковалентная связь может предусматривать связь в виде белка слияния или химически соединенной связи, например, посредством дисульфидной связи, образованной между двумя остатками цистеина.
Используемый в настоящем документе термин "полипептид слияния" или "белок слияния" означает белок, образованный путем объединения двух или более полипептидных последовательностей вместе. Полипептиды слияния, включенные в настоящее изобретение, предусматривают продукты трансляции химерного генного конструкта, который объединяет последовательности ДНК, кодирующие один или несколько антигенов или их фрагментов или мутантов, с последовательностью ДНК, кодирующей второй полипептид для образования одной открытой рамки считывания. Другими словами, " полипептид слияния" или "белок слияния" представляет собой рекомбинантный белок двух или более белков, которые объединены пептидной связью или посредством нескольких пептидов. Согласно некоторым вариантам осуществления второй белок, с которым слиты антигены, представляет собой комплементарную аффинную молекулу, которая способна взаимодействовать с первой аффинной молекулой комплементарной аффинной пары.
Термины "полипептид" и "белок" могут быть использованы взаимозаменяемо для обозначения полимера аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями и для целей заявленного изобретения, характеризуются типичной минимальной длиной, составляющей по меньшей мере 25 аминокислот. Термин "полипептид" и "белок" может предусматривать мультимерный белок, например, белок, содержащий более чем один домен или субъединицу. Используемые в настоящем документе термин "пептид" относится к последовательности соединенных пептидной связью аминокислот, содержащей менее чем 25 аминокислот, например, от приблизительно 4 аминокислот до 25 аминокислот в длину. Белки и пептиды могут состоять из линейно расположенных аминокислот, соединенных пептидными связями, независимо от того, получены ли они биологически, рекомбинантно или синтетически и независимо от того, состоят ли они из встречающихся в природе или не встречающихся в природе аминокислот, они предусмотрены настоящим определением. Как полноразмерные белки и их фрагменты, составляющие более чем 25 аминокислот, предусмотрены определением белка. Термины также включают в себя полипептиды, которые характеризуются такими котрансляционными (например, отщепление сигнального пептида) и посттрансляционными модификациями полипептида, как, например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, липидизация, протеолитическое расщепление (например, расщепление металлопротеазами) и подобное. Более того, используемый в настоящем документе термин "полипептид" относится к белку, который включает в себя такие модификации, как делеции, вставки и замены (как правило, консервативные по природе, что будет известно специалисту в настоящей области техники) в нативной последовательности, при условии, что белок сохраняет необходимую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, посредством сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, например, посредством мутаций хозяев, которые производят белки, или ошибок вследствие амплификации с помощью ПЦР или других способов рекомбинантной ДНК.
Под термином "сигнальная последовательность" подразумевают последовательность нуклеиновой кислоты, которая, будучи функционально соединенной с молекулой нуклеиновой кислоты, облегчает секрецию продукта (например, белка или пептида), кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления сигнальная последовательность предпочтительно расположена 5' по отношению к молекуле нуклеиновой кислоты.
Используемый в настоящем документе термин "N-гликозилированный" или "N-гликозилирование" относится к ковалентному прикреплению фрагмента сахара к остаткам аспарагина в полипептиде. Фрагменты сахара могут включать в себя без ограничения глюкозу, маннозу и N-ацетилглюкозамин. Также предусмотрены модификации гликанов, например, сиалирование.
"Антигенпрезентирующая клетка" или "АРС" представляет собой клетку, которая экспрессирует молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС) и может экспонировать инородные антигены в комплексе с МНС на своей поверхности. Примеры антигенпрезентирующих клеток представляют собой дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, фибробласты (кожи), тимусные эпителиальные клетки, эпителиальные клетки щитовидной железы, глиальные клетки (мозга), бета-клетки поджелудочной железы и эндотелиальные клетки сосудов.
Термин "функционального часть" или "функциональный фрагмент", используемый в контексте "функциональной части антигена", относится к части антигена или антигенного полипептида, которая опосредует такой же эффект, как и полная антигенная молекула, например, вызывает иммунный ответ у субъекта, или опосредует связь с другой молекулой, например, содержит по меньшей мере один эпитоп.
Используемый в настоящем документе термин "часть" целевого антигена будет составлять по меньшей мере 3 аминокислоты в длину, и может составлять, например, по меньшей мере 6, по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20 или по меньшей мере 25 аминокислот или более, включительно.
Термины "цитотоксический Т-лимфоцит" или "CTL" относится к лимфоцитам, которые индуцируют гибель посредством апоптоза или других механизмов в целевых клетках. CTL образуют антиген-специфические конъюгаты с целевыми клетками посредством взаимодействия TCR с процессированным антигеном (Ag) на поверхностях целевой клетки, приводя в апоптозу целевой клетки. Апоптозные тельца элиминируются макрофагами. Термин "ответ CTL" используется для обозначения первичного иммунного ответа, опосредованного клетками CTL.
Используемые в настоящем документе термин "клеточно-опосредованный иммунитет" или "CMI" относится к иммунному ответу, который не вовлекает антитела или комплемент, но скорее вовлекает активацию, например, макрофагов, клеток-естественных киллеров (NK), антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (Т-клеток), Т-хелперов, нейтрофилов, и высвобождение различных цитокинов в ответ на целевой антиген. Иначе говоря, CMI относится к иммунным клеткам (таким как Т клетки и другие лимфоциты), которые связываются с поверхностью других клеток, которые экспонируют целевой антиген (таких как антигенпрезентирующие клетки (АРС)) и запускает ответ. Ответ может вовлекать любые другие лимфоциты и/или любые другие белые кровяные тельца (лейкоциты) и высвобождать цитокины. Клеточный иммунитет защищает организм путем: (i) активации антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), которые способны разрушать клетки организма, экспонирующие эпитопы чужеродного антигена на их поверхности, такие как инфицированные вирусом клетки и клетки с внутриклеточными бактериями; (2) активации макрофагов и NK клеток, предоставляя им возможность разрушать внутриклеточные патогены; и (3) стимуляции клеток секретировать разнообразные цитокины или хемокины, которые воздействуют на функцию других клеток, таких как Т клетки, макрофаги или нейтрофилы, вовлеченные в приобретенные иммунные ответы и врожденные иммунные ответы.
Используемый в настоящем документе термин "иммунная клетка" относится к любой клетке, которая может высвобождать цитокин, хемокин или антитело в ответ на прямую или опосредованную антигенную стимуляцию. По термином "иммунные клетки" в настоящем документе подразумеваются лимфоциты, включая в себя клетки - естественные киллеры (NK), Т-клетки (CD4+ и/или CD8+ клетки), В-клетки, макрофаги; лейкоциты; дендритные клетки; тучные клетки; моноциты; и любая другая клетка, которая способна производить молекулу цитокина или хемокина в ответ на прямую или опосредованную антигенную стимуляцию. Как правило, иммунная клетка представляет собой лимфоцит, например, Т-лимфоцит.
Используемый в настоящем документе термин "цитокин" относится к молекуле, высвобождаемой из иммунной клетке в ответ на стимуляцию антигеном. Примеры таких цитокинов предусматривают без ограничения: GM-CSF; IL-1α; IL-1β; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-10; IL-12; IL-17A, IL-17F или другие представители семейства IL-17, IL-22, IL-23, IFN-α; IFN-β; IFN-γ; MIP-1α; MIP-1β; TGF-β; TNFα или TNFβ. Термин "цитокин" не включает в себя антитела
Используемый в настоящем документе термин "субъект" относится к любому животному, у которого полезно вызвать иммунный ответ. Субъект может представлять собой дикое, домашнее, коммерческое животное или животное-компаньон, такое как птица или млекопитающее. Субъект может представлять собой человека. Хотя согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения предполагается, что раскрытые в настоящем документе иммуногенные композиции могут также быть подходящими для терапевтического или профилактического лечения у людей, они также применимы для теплокровных позвоночных, например, млекопитающих, таких как не являющиеся человеком приматы (в частности, высшие приматы), овца, собака, грызун (например, мышь или крыса), морская свинка, коза, свинья, кошка, кролики, коровы и такие не являющиеся млекопитающими животные, как цыплята, утки или индейки. Согласно другому варианту осуществления субъект представляет собой дикое животное, например, птицу, такую как для постановки диагноза птичий грипп. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект представляет собой экспериментальное животное или заменитель - животное в качестве модели заболевания. Субъект может представлять собой субъект, нуждающийся в ветеринарном лечении, где активация иммунного ответа на антиген применим для профилактики заболевания и/или контроля распространения заболевания, например SIV, STL1, SFV, или в случае домашнего скота, ящура, или в случае птиц болезни Марека или птичьего гриппа, и других таких заболеваний.
Используемый в настоящем документе термин "патоген" относится к организму или молекуле, которая вызывает заболевание или нарушение у субъекта. Например, патогены включают в себя без ограничения вирусы, грибы, бактерии, паразиты и другие инфекционные организмы или молекулы из них, а также таксономически родственные макроскопические организме в пределах категорий водорослей, грибов, дрожжей, простейших или подобного.
"Клетка злокачественной опухоли" относится к раковой, предраковой или трансформированной клетке, или in vivo, ex vivo, или в тканевой культуре, которая характеризуется спонтанными или вызванными фенотипическими изменениями, которые не обязательно предусматривают захват нового генетического материала. Хотя трансформация может являться результатом инфицирования трансформирующим вирусом и встраивания новой геномной нуклеиновой кислоты или захвата экзогенной нуклеиновой кислоты, она также может возникать спонтанно или после воздействия канцерогена, тем самым мутируя эндогенный ген. Трансформация/злокачественная опухоль связана, например, со следующим: морфологические изменения, иммортализация клеток, аберрантный контроль роста, формирование фокусов, безъякорный рост, злокачественность, потеря контактного торможения и ограничения плотности роста, независимость от фактора роста или сывороточного фактора, специфические для опухоли маркеры, инвазивность или метастазирование и рост опухоли в таких подходящих хозяевах-животных, как бестимусные мыши. Смотри, например, Freshney, CULTURE ANIMAL CELLS: MANUAL BASIC TECH. (3-е изд., 1994).
Термин "дикий тип" относится к встречающейся в природе, нормальной полинуклеотидной последовательности, кодирующей белок или его часть, или белковой последовательности или его части, соответственно, в том виде, в котором она существует в норме in vivo.
Термин "мутант" относится к организму или клетке с любым изменением в ее генетическом материале, в частности, изменением (т.е., делецией, заменой, вставкой или альтерацией) относительно полинуклеотидной последовательности дикого типа или любым изменением относительно белковой последовательности дикого типа. Термин "вариант" может быть использован взаимозаменяемо с термином "мутант". Хотя часто допускают, что изменение в генетическом материале приводит к изменению функции белка, термины "мутант" и "вариант" относятся к изменению в последовательности белка дикого типа независимо от того, меняет ли изменение функцию белка (например, увеличивает, уменьшает, придает новую функцию), либо не обладает эффектом на функцию белка (например, мутация или изменчивость является молчащей).
Термин "фармацевтически приемлемый" относится к соединениям и композициям, которые могут быть введены млекопитающим без неспецифической токсичности. Термин "фармацевтически приемлемые носители" исключает среду тканевой культуры. Иллюстративные фармацевтически приемлемые соли предусматривают без ограничения соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и подобное, и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и подобное. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в настоящей области техники.
Следует понимать, что белки или полипептиды часто содержат аминокислоты, отличные от 20 аминокислот, который принято называть 20 встречающихся в природе аминокислот, и что многие аминокислоты, включая в себя концевые аминокислоты, могут быть модифицированы в данном полипептиде, либо путем таких естественных процессов, как гликозилирование и другие посттрансляционные модификации, либо с помощью техник химической модификации, которые хорошо известны в настоящей области техники. Известные модификации, которые могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения, предусматривают без ограничения следующее: ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное прикрепление флавина, ковалентное прикрепление фрагмента гема, ковалентное прикрепление полинуклеотида или производного полинуклеотида, ковалентное прикрепление липида или производного липида, ковалентное прикрепление фосфатидилинозитола, сшивание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных сшивок, образование цистина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликирование, гликозилирование, образование гликозилфосфатилидилинозитольного (GPI) якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, ацилирование остатком миристиновой кислоты, окисление, протеолитическая обработка, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селенонирование, сульфатирование, опосредованная транспортной РНК вставка аминокислот в белки, например, аргинилирование и убиквитинирование.
Используемые в настоящем документе термины "гомологичный" или "гомологи" используются взаимозаменяемо, и при использовании для описания полинуклеотида или полипептида, показывают, что два полинуклеотида или полипептида, или их установленные последовательности, при оптимальном выравнивании и сравнении, например, с использованием BLAST, версии 2.2.14 с параметрами по умолчанию для выравнивания, являются идентичными, с соответствующими нуклеотидными вставками или делениями или аминокислотными вставками или делениями, как правило, по меньшей мере на 70% нуклеотидов из нуклеотидов для высокой степени гомологии. Для полипептида, должно быть по меньшей мере 30% аминокислотной идентичности в полипептиде, или по меньшей мере 50% для гомологии более высокой степени. Используемый в настоящем документе термин "гомолог" или "гомологичный" также относится к гомологии в отношении структуры. Определение гомологов генов или полипептидов может быть легко установлено специалистом в настоящей области техники. При использовании в контексте определенного процента определенная процентная гомология означает по меньшей мере это процентное отношение аминокислотного сходства. Например, 85% гомологии относится к по меньшей мере 85% аминокислотного сходства.
Используемый в настоящем документе термин "гетерологичный" в отношении к последовательностям нуклеиновых кислот, белкам или полипептидам, означает, что эти молекулы не встречаются в природе в этой клетке. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая описанный в настоящем документе полипептид антигена слияния, который введен в клетку, например, в контексте вектора экспрессии белка, представляет собой гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты.
Для сравнения последовательностей, как правило, одна последовательность действует в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают исследуемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей исследуемые и эталонные последовательности вводят в компьютер, задают координаты субпоследовательности при необходимости и задают параметры программы алгоритма последовательности. Алгоритм сравнения последовательностей затем рассчитывает процентную идентичность последовательностей для исследуемой(ых) последовательности(ей) относительно эталонной последовательности на основании заданных параметров программы. Если это необходимо или желательно, оптимальный выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено с помощью любого из разнообразия подходов, которые хорошо известны в настоящей области техники.
Используемый в настоящем документе термин "вариант" может относиться к полипептиду или нуклеиновой кислоте, которая отличается от встречающегося в природе полипептида или нуклеиновой кислоты на одну или несколько делеций, вставок, замен или модификаций боковой цепи аминокислоты или нуклеиновой кислоты, при этом сохраняя одну или несколько специфических функций или биологических активностей встречающейся в природе молекулы. Аминокислотные замены предусматривают альтерации, в которых аминокислоты заменяется отличным от нее встречающимся в природе или нетрадиционным аминокислотным остатком. Такие замены могут классифицироваться как "консервативные", в случае которых аминокислотный остаток, содержащийся в полипептиде, замещается другой встречающейся в природе аминокислотой сходного характера либо в отношении полярности, функциональности боковой цепи, либо размера. Замены, предусмотренные описанными в настоящем документе вариантами, могут также быть "неконсервативными", в которых аминокислотный остаток, который присутствует в пептиде, замещается аминокислотой, характеризующейся отличными от него свойствами (например, замена заряженной или гидрофобной аминокислоты аланином), или альтернативно, в которых встречающаяся в природе аминокислота замещается нетрадиционной аминокислотой. Также под термином "вариант" подразумеваются, при использовании со ссылкой на полинуклеотид или полипептид, изменения в первичной, вторичной или третичной структуре по сравнению с эталонным полинуклеотидом или полипептидом, соответственно (например, по сравнению с полинуклеотидом или полипептидом дикого типа).
Термин "по сути, сходный", при использовании со ссылкой на вариант антигена или функциональное производное антигена по сравнению с исходным антигеном, означает, что конкретная исследуемая последовательность отличается от последовательности антигенного полипептида на одну или несколько замен, делеций или вставок, но сохраняет по меньшей мере 50% или более, например, по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или более, включительно, функции антигена в активации иммунного ответа у субъекта. В определении полинуклеотидных последовательностей считается, что все исследуемые полинуклеотидные последовательности, способные кодировать, по сути, сходные аминокислотные последовательности, являются, по сути, сходными с эталонной полинуклеотидной последовательностью, независимо от различий в последовательности кодона. Нуклеотидная последовательность является "по сути, сходной" с данной последовательностью нуклеиновых кислот антигена, если: (а) нуклеотидная последовательность гибридизуется с кодирующими участками нативной антигенной последовательности, или (b) нуклеотидная последовательность способна к гибридизации с нуклеотидной последовательностью нативного антигена при умеренно строгих условиях и характеризуется биологической активностью, сходной с нативным антигенным белком; или (с) нуклеотидные последовательности являются вырожденными в результате генетического кода относительно нуклеотидных последовательностей, определенных в (а) или (b). По сути, сходные белки, как правило, будут более чем приблизительно на 80% сходными с соответствующей последовательностью нативного белка.
Варианты могут включать в себя консервативные или неконсервативные аминокислотные изменения, как описано ниже. Полинуклеотидные изменения могут приводить к аминокислотным заменам, вставкам, делециям, слияниям и укорачиваниям в полипептиде, который кодируется эталонной последовательностью. Варианты могут также включать в себя вставки, делеций или замены аминокислот, включая в себя вставки и замены аминокислот и других молекул), которые в норме не встречаются в пептидной последовательности, которая является основой варианта, например, без ограничения вставка орнитина, который в норме не встречается в белках человека. "Консервативные аминокислотные замены" являются результатом замещения одной аминокислоты другой, которая характеризуется сходными структурными и/или химическими свойствами. Таблицы консервативных замен, представляющие функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в настоящей области техники. Например, следующие шесть групп, каждая из которых содержит аминокислоты, являющиеся консервативными заменами друг для друга: (1) аланин (А), серии (S), треонин (Т); (2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); (3) аспарагин (N), глутамин (Q); (4) аргинин (R), лизин (K); (5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); и (6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W). Смотри, например, Creighton, PROTEINS (W.H. Freeman & Co., 1984).
Выбор консервативных аминокислот может быть сделан на основе расположения подлежащей замене аминокислоты в пептиде, например, если аминокислота находится на внешней части пептида и подвергается воздействия растворителей, или на внутренней части и не подвергается воздействию растворителей. Выбор таких консервативных аминокислотных замен находится в пределах квалификации специалистов в настоящей области техники. Соответственно, можно выбрать консервативные аминокислотные замены, подходящие для аминокислот на внешней части белка или пептида (т.е. аминокислот, подвергающихся воздействию растворителя). Эти замены включают в себя без ограничения следующее: замена Y на F, Т на S или K, Р на А, Е на D или Q, N на D или G, R на K, G на N или А, Т на S или K, D на N или Е, I на L или V, F на Y, S на Т или А, R на K, G на N или А, K на R, А на S, K или Р.
Альтернативно, можно также выбрать консервативные аминокислотные замены, подходящие для аминокислот на внутренней части белка или пептида (т.е., аминокислоты не подвергаются воздействию растворителя). Например, можно использовать следующие консервативные замены: где Y замещается на F, Т на А или S, I на L или V, W на Y, М на L, N на D, G на А, Т на А или S, D на N, I на L или V, F на Y или L, S на А или Т и А на S, G, Т или V. Согласно некоторым вариантам осуществления LF полипептиды, включая в себя неконсервативные аминокислотные замены, также включены в термин "варианты". Используемый в настоящем документе термин "неконсервативная" замена относится к замещению аминокислотного остатка отличным аминокислотным остатком, который характеризуется отличными от него химическими свойствами. Не ограничивающие примеры неконсервативных замен предусматривают аспарагиновую кислоту (D), замещаемую глицином (G); аспарагин (N), замещаемый лизином (K); и аланин (А), замещаемый аргинином (R).
Используемый в настоящем документе термин "производное" относится к белкам или пептидам, которые были химически модифицированы, например, с помощью убиквитинирования, мечения, пегилирования (дериватизации с полиэтиленгликолем) или добавлением других молекул. Молекула также представляет собой "производное" другой молекулы, когда она содержит дополнительные химические фрагменты, не являющиеся в норме частью молекулы. Такие фрагменты могут улучшать растворимость, абсорбция, период биологического полураспада и т.д. молекулы. Фрагменты могут альтернативно снижать токсичность молекулы, или устранять или ослаблять нежелательный побочный эффект молекулы и т.д. Фрагменты, способные опосредовать такие эффекты, раскрыты в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (21-ое изд., Tory, ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006).
Термин "функционального" при использовании совместно с "производным" или "вариантом" относится к белковой молекуле, которая обладает биологической активностью, по сути, сходной с биологической активностью соединения или молекулы, чьим производным или вариантом она является. "По сути, сходный" в этом контексте означает, что биологическая активность, например, антигенность полипептида является по меньшей мере на 50% активной по сравнению с эталоном, например, соответствующим полипептидом дикого типа, например, по меньшей мере на 60% активной, на 70% активной, на 80% активной, на 90% активной, на 95% активной, на 100% активной или даже выше (т.е., вариант или производное характеризуется большей активностью, чем дикий тип), например, на 110% активной, на 120% активной или более, включительно.
Термин "рекомбинантная" при использовании для описания молекулы нуклеиновой кислоты, означает полинуклеотид геномного, кДНК, вирусного, полусинтетического и/или синтетического происхождения, который, вследствие его происхождения или манипуляции, не связан со всеми или частью полинуклеотидных последовательностей, с которыми он связан с природе. Термин "рекомбинантный", используемый в отношении пептида, полипептида, белка или рекомбинантного белка слияния, означает полипептид, полученный путем экспрессии из рекомбинантного полинуклеотида. Термин "рекомбинантный", используемый в отношении клетки хозяина, означает клетку хозяина, в которую был введен рекомбинантный полинуклеотид. Рекомбинантный также используется в настоящем документе для обозначения в отношении материала (например, клетки, нуклеиновой кислоты, белка или вектора), что материал был модифицирован путем введения гетерологичного материала (например, клетки, нуклеиновой кислоты, белка или вектора).
Термин "векторы" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать или опосредовать экспрессию гетерологичной нуклеиновой кислоты, с которой она была соединена, к клетке хозяина; плазмида представляет собой вид рода, включенного в термин "вектор". Термин "вектор", как правило, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей источник репликации и другие структуры, необходимые для репликации и/или поддержания в клетке хозяина. Векторы, способные управлять экспрессией генов и/или последовательности нуклеиновой кислоты, с которой они функционально соединены, называются в настоящем документе "векторы экспрессии". В общем, обладающие полезностью векторы экспрессии часто находятся в форме "плазмид", которые относятся к циклическим двухцепочечным молекулам ДНК, которые, в их векторной форме, не связаны с хромосомой и, как правило, содержат структуры для стабильной или временной экспрессии или кодируемой ДНК. Другие векторы экспрессии, которые могут использоваться в раскрытых в настоящем документе способах, предусматривают без ограничения плазмиды, эписомы, бактериальные искусственные хромосомы, дрожжевые искусственные хромосомы, бактериофаги или вирусные векторы, и такие векторы могут интегрироваться в геном хозяина или реплицироваться автономно в конкретной клетке. Вектор может представлять собой ДНК или РНК вектор. Могут также использоваться другие формы векторов экспрессии, известные специалистам в настоящей области техники, которые обслуживают эквивалентные функции, например, самореплицирующиеся внехромосомные векторы или векторы, которые интегрируются в геном хозяина. Предпочтительные векторы представляют собой такие, которые способны к автономной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которой они соединены.
Используемый в настоящем документе Термин "сниженный" или "снижать" или "уменьшать", как правило, означает снижение на статистически значимое количество относительно эталона. Чтобы избежать неопределенности, "сниженный" означает статистически значимое уменьшение по меньшей мере на 10% по сравнению с эталонным уровнем, например, уменьшение по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или более, вплоть до и включая в себя 100% уменьшение (т.е., отсутствующий уровень по сравнению с эталонным образцом), или любой уменьшение от 10 до 100% по сравнению с эталонным уровнем, как этот термин определен в настоящем документе.
Используемый в настоящем документе термин "низкий", как правило, означает сниженный на статистически значимое количество; чтобы избежать неопределенности, "низкий" означает статистически значимое значение, которое по меньшей мере на 10% ниже, чем эталонный уровень, например, значение по меньшей мере на 20% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере на 30% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере на 40% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере на 50% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере на 60% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере на 70% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере на 80% ниже, чем эталонный уровень, по меньшей мере на 90% ниже, чем эталонный уровень, вплоть до и включая в себя на 100% ниже, чем эталонный уровень (т.е., отсутствующий уровень по сравнению с эталонным образцом).
Используемые в настоящем документе термины "увеличенный" или "увеличивать", как правило, означают увеличение на статистически значимое количество; такое как статистически значимое увеличение по меньшей мере на 10% по сравнению с эталонным уровнем, включая в себя увеличение по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100% или более, включительно, включая в себя, например, по меньшей мере 2-кратное, по меньшей мере 3-кратное, по меньшей мере 4-кратное, по меньшей мере 5-кратное, по меньшей мере 10-кратное увеличение или более по сравнению с эталонным уровнем, как этот термин определяется в настоящем документе.
Используемый в настоящем документе термин "высокий", как правило, означает повышение на статистически значимое количество относительно эталона; такое как статистически значимое значение по меньшей мере на 10% выше, чем эталонный уровень, например по меньшей мере на 20% выше, по меньшей мере на 30% выше, по меньшей мере на 40% выше, по меньшей мере на 50% выше, по меньшей мере на 60% выше, по меньшей мере на 70% выше, по меньшей мере на 80% выше, по меньшей мере на 90% выше, по меньшей мере на 100% выше, включительно, например, по меньшей мере 2-кратное повышение, по меньшей мере 3-кратное повышение, по меньшей мере 4-кратное повышение, по меньшей мере 5-кратное повышение, по меньшей мере 10-кратное повышение или более по сравнению с эталонным уровнем.
Используемый в настоящем документе термин "содержащий" означает, что другие элементы могут также присутствовать в дополнение к присутствующим определенным элементам. Использование термина "содержащий" указывает скорее на включение, чем на ограничение.
Термин "состоящий из" относится к композициям, способам и их соответственным компонентам, описанным в настоящем документе, которые являются исключающими любой элемент, не перечисленный в этом описании варианта осуществления.
Используемый в настоящем документе термин "состоящий, по сути, из" относится к тем элементам, которые необходимы для данного варианта осуществления. Термин разрешает присутствие элементов, которые существенно не затрагивают основную(ые) и новую(ые) или функциональную(ые) характеристику(и) этого варианта осуществления настоящего изобретения.
Настоящее изобретение предусматривает адаптивную и многофункциональную композицию, которая может быть разработана и произведена для активации конкретной антигенной мишени, широкого спектра антигенных мишеней или их разнообразия. На Фиг.17 представлено простое иллюстративное руководство для изображения адаптивности вариантов осуществления MAPS.
Полимеры
Один компонент MAP состоит из "остова", как правило, полимера. Полимер может быть антигенным или неантигенным. Они может быть получен из широкого разнообразия веществ, описанных в настоящем документе, с предупреждением о том, что полимер служит в качестве средства, презентирующего связанный(е) антиген(ы) иммунной системе иммуногенным образом. Согласно некоторым вариантам осуществления полимер представляет собой синтетический полимер. Согласно некоторым вариантам осуществления полимер представляет собой встречающийся в природе полимер, например, полисахарид, полученный или очищенный из бактериальных клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления полисахарид получают или очищают из эукариотических клеток, например, клеток грибов, насекомых или растений. Согласно другим вариантам осуществления полимер получают из клеток млекопитающих, таких как инфицированные вирусом клетки или клетки злокачественной опухоли. В общем, такие полимеры хорошо известны в настоящей области техники и предусмотрены для применения в раскрытых в настоящем документе способах и композициях.
Согласно некоторым вариантам осуществления полимер представляет собой полисахарид, выбранный из любого из следующего: декстран, Vi полисахарид Salmonella typhi, пневмококковый капсульный полисахарид, пневмококковый полисахарид клеточной стенки (CWPS), менингококковый полисахарид, полисахарид Haemophilus influenzae типа b или любой другой полисахарид вирусного, прокариотического или эукариотического происхождения.
Согласно некоторым вариантам осуществления полисахарид состоит из или содержит фрагмент антигенного сахара. Например, согласно некоторым вариантам осуществления полисахарид для применения раскрытых в настоящем документе способов и иммуногенных композиций представляет собой Vi полисахарид Salmonella typhi. Vi капсульный полисахарид был разработан против бактериальных кишечных инфекций, таких как брюшной тиф. Robbins et al., 150 J. Infect. Dis. 436 (1984); Levine et al., 7 Baillieres Clin. Gastroenterol. 501 (1993). Vi представляет собой полимер α-1→4-галактуроновой кислоты с N ацетилом в положении С-2 и вариабельным 0-ацетилированием на С-3. Вирулентность S. typhi коррелирует с экспрессией этой молекулы. Sharma et al., 101 PNAS 17492 (2004). Vi полисахаридная вакцина S. typhi характеризуется некоторыми преимуществами: побочные эффекты являются нечастыми и легкими, однократная доза приводит к стойкой иммуногенности и эффективности. Vi полисахарид может быть надежно стандартизирован с помощью физико-химических способов, верифицированных для других полисахаридных вакцин, Vi является стабильным при комнатной температуре и он может быть введен одновременно с другими вакцинами без воздействия на иммуногенность и переносимость. Azze et al., 21 Vaccine 2758 (2003).
Таким образом, Vi полисахарид S. typhi может быть сшит с первой аффинной молекулой, раскрытой в настоящем документе, для прикрепления по меньшей мере одного антигена к полисахариду. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген может быть из того же или из другого организма, так чтобы полученная иммуногенная композиция сообщала по меньшей мере некоторый уровень иммунитета против одного патогена или двух различных патогенов: если антиген придает защиту против пневмококка, то иммуногенная композиция, где полимерный каркас представляет собой Vi полисахарид, может вызывать иммуногенный ответ против как S. typhi, так и пневмококков. Другие примеры предусматривают комбинирование Сахаров из инкапсулированных бактерий (таких как менингококк, S. aureus, пневмококк, Hib и т.д.) и туберкулезных антигенов, для обеспечения иммуногенной композиции, которая вызывает иммунный ответ против двух различных патогенов.
Другие полисахаридные (PS) фрагменты, которые могут быть использованы согласно настоящему изобретению альтернативно декстрану, бактериальным полисахаридам клеточной стенки (CWPS) и т.д., предусматривают углеводные антигены злокачественных опухолей.
Дополнительно в отношении пневмококковых полисахаридов полисахарид может быть получен из любого из свыше 93 серотипов пневмококка, которые были установлены к настоящему времени, например, включая в себя без ограничения серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 6С, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, и 33F. Дополнительные серотипы могут быть установлены и включены в настоящую иммуногенную композицию, описанную в настоящем документе. Более чем один пневмококковый полисахарид может быть включен в качестве полимерного остова настоящих иммуногенных композиций или в вакцину, содержащую настоящие композиции MAPS.
Полисахарид может также быть получен из настоящего изобретения, иммуногенная композиция содержит капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере из одного, двух, трех или четырех из серогрупп А, С, W, W135 или Y.
Дополнительный вариант осуществления содержит тип 5, тип 8 или любой из полисахаридов или олигосахаридов Staphylococcus aureus.
Согласно некоторым вариантам осуществления полимер представляет собой химерный полимер, содержащий более чем один тип полимера. Например, полимер раскрытой в настоящем документе иммуногенной композиции может содержать часть полимера А и оставшуюся часть полимера В. Не существует ограничения в отношении количества различных и типов полимеров, которые могут использоваться в одной структурной единице остова MAPS. Согласно некоторым вариантам осуществления, где полимер представляет собой разветвленный полимер, линейный полимер может представлять собой полимер А, и разветвленный полимер может представлять собой по меньшей мере 1 или по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 или более различных полимеров.
Согласно некоторым вариантам осуществления полимер представляет собой разветвленный полимер. Согласно некоторым вариантам осуществления полимер представляет собой одиночный линейный полимер.
Согласно некоторым вариантам осуществления полимер представляет собой полисахарид, содержащий по меньшей мере 10 углеводный повторяющихся единиц, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере 75, или по меньшей мере 100, или по меньшей мере 150, или по меньшей мере 200, или по меньшей мере 250, или по меньшей мере 300, или по меньшей мере 350, или по меньшей мере 400, или по меньшей мере 450, или по меньшей мере 500, или более чем 500 повторяющихся единиц, включительно.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения полисахарид (PS) может характеризоваться молекулярной массой <500 кДа или >500 кДа. Согласно другому аспекту настоящего изобретения PS характеризуется молекулярной массой <70 кДа.
Согласно некоторым вариантам осуществления полимер представляет собой полимер с высокой молекулярной массой, например, полимер может характеризоваться средней молекулярной массой между приблизительно 425-500 кДа, включительно, например, по меньшей мере 300 кДа, или по меньшей мере 350 кДа, или по меньшей мере 400 кДа, или по меньшей мере 425 кДа, или по меньшей мере 450 кДа, или по меньшей мере 500 кДа или более чем 500 кДа, включительно, но, как правило, менее чем 500 кДа.
Согласно некоторым вариантам осуществления полимер может представлять собой полимер с низкой молекулярной массой, например, полимер может характеризоваться средней молекулярной массой от приблизительно 60 кДа до приблизительно 90 кДа, например, по меньшей мере 50 кДа, или по меньшей мере 60 кДа, или по меньшей мере 70 кДа, или по меньшей мере 80 кДа, или по меньшей мере 90 кДа, или по меньшей мере 100 кДа, или более чем 100 кДа, включительно, но, как правило, менее чем приблизительно 120 кДа.
Согласно некоторым вариантам осуществления полимер собирают и очищают из естественного источника; и согласно другим вариантам осуществления полимер является синтетическим. Способы получения синтетических полимеров, включая в себя синтетические полисахариды, известны специалистам в настоящей области техники и предусмотрены в раскрытых в настоящем документе композициях и способах.
Всего несколько примеров полисахаридов, которые могут служить в качестве остова для любого одного или нескольких антигенов или типов антигенов, проиллюстрированы в таблице 1:
Дополнительные полимеры, которые могут использоваться в описанных в настоящем документе иммуногенных композициях MAPS, предусматривают полимеры на основе полиэтиленгликоля, полимеры поли(сложных ортоэфиров), полиакриловые носители, PLGA, полиэтиленимин (PEI), дендримеры полиамидоамина (РАМАМ), полимеры сложного β-аминоэфира, полифосфоэфир (РРЕ), липосомы, полимеросомы, нуклеиновые кислоты, фосфоротиоатные олигонуклеотиды, хитозан, шелк, полимерные мицеллы, белковые полимеры, вирусные частицы, вирусоподобные частицы (VLP) или другие микрочастицы. Смотри, например, El-Sayed et al., Smart Polymer Carriers for Enhanced Intracellular Delivery of Therapeutic Molecules, 5 Exp. Op. Biol. Therapy, 23 (2005). Биосовместимые полимеры, разработанные для доставки нуклеиновых кислот, могут быть адаптированы для применения в качестве остова согласно настоящему изобретению. Смотри, например, BIOCOMPATIBLE POL. NUCL. ACID. DELIV. (Domb et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ, 2011).
Например, VLP имеют сходство с вирусами, но являются не инфекционными, поскольку они не содержат какого-либо вирусного генетического материала. Экспрессия, включая в себя рекомбинантную экспрессию, вирусных структурных белков, таких как оболочечные или капсидные компоненты, может приводить к самосборке VLP. VLP были получены из компонентов дикого разновидности семейств вирусов, включая в себя Parvoviridae (например, аденоассоциированный вирус), Retroviridae (например, ВИЧ), и Flaviviridae (например, вирусы гепатита В или С). VLP могут быть получены в разнообразных системах клеточных культур, включая в себя клеточные линии млекопитающих, клеточные линии насекомых, клетки дрожжей и растений. Рекомбинантные VLP являются особенно преимущественными, поскольку вирусный компонент может быть слит с рекомбинантными антигенами, описанными в настоящем документе.
Антигены
Раскрытые в настоящем документе иммуногенные композиции могут содержать любой антиген, который вызывает иммунный ответ у субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один или несколько антигенов связаны с полимером композиции. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере 2, или по меньшей мере 3, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере 100, или более чем 100 антигенов могут быть связаны с раскрытым в настоящем документе полимером. Согласно некоторым вариантам осуществления, если иммуногенная композиция содержит более чем один антиген, то антигены могут быть одним и тем же антигеном или они могут быть разнообразием различных антигенов, связанных с полимером. Согласно некоторым вариантам осуществления, если иммуногенная композиция содержит более чем один антиген, то антигены могут быть антигенами из одного и того же патогена или из различных патогенов, или альтернативно, могут быть различными антигенами из одного и того же патогена, или сходными антигенами из различных серотипов патогенов.
Антиген для применения в описанных в настоящем документе иммуногенных композициях и способах может представлять собой любой антиген, включая в себя без ограничения патогенные пептиды, токсины, анатоксины, их субъединицы или их комбинации (например, холерный токсин, столбнячный анатоксин).
Согласно некоторым вариантам осуществления антиген, который может быть слит с комплементарной аффинной молекулой, может представлять собой любой антиген, связанный с инфекционным заболеванием или злокачественной опухолью или иммунным заболеванием. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген может представлять собой антиген, экспрессируемый любой из множества возбудителей инфекций, включая в себя вирус, бактерию, гриб или паразита.
Согласно некоторым вариантам осуществления антиген происходит (например, получен) из патогенного организма. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген представляет собой антиген злокачественной опухоли или опухоли, например, антиген, происходящий из опухолевой клетки или клетки злокачественной опухоли.
Согласно некоторым вариантам осуществления антиген, полученный из патогенного организма, представляет собой антиген, связанный с инфекционным заболеванием; он может быть получен из любого из разнообразных возбудителей инфекций, включая в себя вирус, бактерию, гриб или паразита.
Согласно некоторым вариантам осуществления целевой антиген представляет собой любой антиген, связанный с патологией, например, инфекционным заболеванием или патогеном, или злокачественной опухолью или иммунным заболеванием, таким как аутоиммунное заболевание. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген может быть экспрессирован любой из разнообразных возбудителей инфекций, включая в себя вирус, бактерию, гриб или паразита. Целевой антиген для применения в раскрытых в настоящем документе способах и композициях может также предусматривать, например, патогенные пептиды, токсины, анатоксины, их субъединицы или их комбинации (например, холерный токсин, столбнячный анатоксин).
Не ограничивающие примеры инфекционных вирусов включают в себя: Retroviridae; Picornaviridae (например, вирусы полиомиелита, вирус гепатита А; энтеровирусы, вирусы Коксаки человека, риновирусы, эховирусы); Calciviridae (такие как штаммы, которые вызывают гастроэнтерит); Togaviridae (например, вирусы лошадиного энцефалита, вирусы краснухи); Flaviridae (например, вирусы денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Coronaviridae (например, коронавирусы); Rhabdoviridae (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы гидрофобии); Filoviridae (например, вирусы лихорадки Эбола); Paramyxoviridae (например, вирусы парагриппа, вирус эпидемического паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); Orthomyxoviridae (например, вирусы гриппа); Bungaviridae (например, вирусы Хантаан, вирусы буниа, флебовирусы и найровирусы); Arena viridae (вирусы геморрагической лихорадки); Reoviridae (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Birnaviridae; Hepadnaviridae (вирус гепатита В); Parvoviridae (парвовирусы); Papovaviridae (вирусы папилломы, вирусы полиомы); Adenoviridae (большинство аденовирусов); Herpesviridae (вирус простого герпеса (ВПГ) 1 и ВПГ-2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (CMV), вирус болезни Марека, вирусы герпеса); Poxviridae (вирусы оспы, вирусы осповакцины, поксвирусы); и Iridoviridae (такие как вирус африканской лихорадки свиней); и неклассифицированные вирусы (например, этиологические возбудители губчатых энцефалопатий, возбудитель дельта-гепатита (считается, что он является дефектным сателлитом вируса гепатита В), возбудители ни-А, ни-В гепатита (класс 1 = передающийся алиментарно; класс 2 = передающийся парентерально (т.е., гепатит С); вирус Норфолк и родственные вирусы, и астровирусы). Описанные в настоящем документе композиции и способы предусмотрены для применения в лечении инфекций, вызванных этими вирусными возбудителями.
Примеры грибковых инфекций, на которые может быть направлены настоящие варианты осуществления путем включения антигенов, включают в себя аспергиллез; кандидоз полости рта (вызванный Candida albicans); криптококкоз (вызванный Cryptococcus); и гистоплазмоз. Таким образом, примеры инфекционных грибов включают в себя без ограничения Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Компоненты этих организмов могут быть включены в качестве антигенов в описанную в настоящем документе MAPS.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения антиген происходит из инфекционного микроорганизма, такого как Bordetella pertussis, Brucella, вид Enterococci, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella, типируемый или нетипируемый Haemophilus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, E. coli, Helicobacter pylori, Clostridia, Bacteroides, Chlamydiaceae, Vibrio cholera, Mycoplasma, Treponemes, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, виды Mycobacteria (такие как M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae, M. leprae), Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (стрептококк группы A), Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В), Streptococcus (группа вириданс), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (анаэробные виды), Streptococcus pneumoniae, патогенный вид Campylobacter, вид Enterococcus, Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, виды Leptospira, Pasturella multocida, вид Bacteroides, Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue nActinomyces israelli. Описанные в настоящем документе композиции и способы предусмотрены для применения в лечении или профилактики инфекций, вызванных этими бактериальными возбудителями.
Дополнительные паразитарные патогены, из которых могут происходить антигены, включают в себя, например: Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum, вид Leishmania, Toxoplasma gondii, Rickettsia и гельминты.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения антиген представляет собой укороченный пневмококковые белок PsaA, анатоксин пневмолизина, пневмококковая серин/треонин протеинкиназа (StkP), повторяющаяся единица пневмококковой серин/треонин протеинкиназы (StkPR), пневмококковый белок PcsB, стафилококковый альфа-гемолизин, белок ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis mtb, коровый антиген клеточной стенки M. tuberculosis, полипептиды СТ144, СТ242 или СТ812 Chlamydia или их фрагменты, субъединица В ДНК гиразы Chlamydia, фосфатаза сульфитного синтеза/бифосфата Chlamydia, белок клеточного деления FtsY Chlamydia, метионил-тРНК синтаза Chlamydia, ДНК геликаза (uvrD) Chlamydia, субъединица I АТФ синтазы (atpI) Chlamydia или металлозависимая гидролаза Chlamydia.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения предусматривается иммуногенная композиция, нацеленная на патоген Myocobacterium tuberculosis (ТВ), внутриклеточный бактериальный паразит. Один пример антигена ТВ представляет собой TbH9 (также известный как Mtb 39A). Другие антигены ТВ включают в себя без ограничения, DPV (также известный как Mtb8.4), 381, Mtb41, Mtb40, Mtb32A, Mtb64, Mtb83, Mtb9.9A, Mtb9.8, Mtb16, Mtb72f, Mtb59f, Mtb88f, Mtb71f, Mtb46f и Mtb31f, причем "f" означает, что имеет место слияние или двух или более белков.
Как отмечено выше, антиген может быть получен из видов Chlamydia для применения в иммуногенных композициях настоящего изобретения. Chlamydiaceae (состоящий из Chlamydiae и Chlamydophila) представляет собой облигатные внутриклеточные грамотрицательные бактерии. Инфекции, вызванные Chlamydia trachomatis, находятся среди наиболее преобладающих бактериальных передающихся половым путем инфекций, и вероятно, каждый год возникает 89 миллионов новых случаев генитальной хламидийной инфекции. Chlamydia настоящего изобретения включает в себя, например, С. trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, С. muridarum, С. suis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila felis, Chlamydophila pecorum и С. pneumoniae. На животных моделях хламидийной инфекции было установлено, что Т-клетки играют критически важную роль как в очищении от первичной инфекции, так в защите от повторной инфекции восприимчивых организмов-хозяев. Следовательно, раскрытые в настоящем документе иммуногенные композиции могут использоваться для обеспечения определенного значения путем активации клеточных иммунных ответов против хламидийной инфекции.
Более конкретно, антигены Chlamydia, применимые согласно настоящему изобретению, включают в себя субъединицу В ДНК гиразы, фосфатазу сульфитного синтеза/бифосфата, белок клеточного деления FtsY, метионил-тРНК синтазу, ДНК геликазу (uvrD); субъединицу I АТФ синтазы (atpI) или металлозависимую гидролазу (публикация заявки на патент США №20090028891). Дополнительные Chlamydia trachomatis антигены предусматривают полипептид СТ144, пептид, характеризующийся аминокислотными остатками 67-86 СТ144, пептид, характеризующийся аминокислотными остатками 77-96 СТ144, белок СТ242, пептид, характеризующийся аминокислотами 109-117 СТ242, пептид, характеризующийся аминокислотами 112-120 полипептида СТ242, белок СТ812 (из гена pmpD), пептид, характеризующийся аминокислотными остатками 103-111 белка СТ812; и некоторые другие антигенные пептиды из С. trachomatis: NVTQDLTSSTAKLECTQDLI (SEQ ID NO:2), AKLECTQDLIAQGKLIVTNP (SEQ ID NO:3), SNLKRMQKI (SEQ ID NO:4), AALYSTEDL (SEQ ID NO:5), FQEKAADTL (SEQ ID NO:6), QSVNELVYV (SEQ ID NO:7), LEFASCSSL (SEQ ID NO:8), SQAEGQYRL (SEQ ID NO:9), GQSVNELVY (SEQ ID NO:10) и QAVLLLDQI (SEQ ID NO:11). Смотри публикацию международной патентной заявки № WO 2009/020553. Кроме того, антигены Chlamydia pneumoniae, включая в себя гомологи чужеродных полипептидов (смотри патент США №6919187), могут использоваться в раскрытых в настоящем документе иммуногенных композициях и способах.
Грибковые антигены могут быть получены из видов Candida и других дрожжей; или другие грибы (аспергилл, другие грибы окружающей среды). В отношении других паразитов, возбудители малярии, а также черви и амебы могут представлять антигенный антиген для применения в раскрытых в настоящем документе иммуногенных композициях и способах.
Согласно некоторым вариантам осуществления, если антиген должен произвести противогриппозный иммуноген, то поверхностные гликопротеины, гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), как правило, представляют собой антигены выбора. Как полипептид нуклеопротеина (NP), так и матрикс (М) представляют собой внутренние вирусные белки и, следовательно, не обязательно предусматриваются в разработке вакцины для иммунитета на основе антител. Вакцины против гриппа применяют рутинной у людей и они включают в себя вакцины, полученные из инактивированного цельного вируса гриппа, живого ослабленного вируса гриппа или очищенных и инактивированных материалов из вирусных штаммов. Например, традиционная вакцина против гриппа может быть произведена с использованием трех потенциально представляющих угрозу штаммов вируса гриппа. Эти штаммы обычно выращивают в оплодотворенных куриных яйцах, которые требуют тщательной обработки, содержащей инокуляцию и инкубацию яиц, сбор яиц, очищение и инактивация вирусов, обработку и концентрирование вируса или вирусных компонентов до конечного состава вакцины и асептическое заполнение в подходящие контейнеры. Как правило, этот цикл получения с использованием яиц занимает свыше 70 недель. В случае обширной эпидемии гриппа доступность эффективной и безопасной вакцины является важнейшей задачей. Кроме того, существуют риски, связанные с загрязнениями в яйцах, такими как антибиотики и загрязняющие примеси, которые отрицательно влияют на стерильность вакцины. Более того, полученные из яиц вакцины против гриппа противопоказаны индивидуумам в тяжелыми аллергиями на яичные белки и людям с синдромом Гийена-Барре в анамнезе. Настоящее изобретение относится к альтернативе вакцинам против гриппа с использованием яиц, не только позволяя избежать связанного с использованием яиц патологического состояния, но обеспечивая платформу для применения множественных антигенов гриппа в тщательно контролируемой платформе.
Согласно некоторым вариантам осуществления антиген для применения в раскрытых в настоящем документе иммуногенных композициях может также предусматривать используемые в ведении биологической войны соединения, например, рицин, который может провоцировать CMI ответ.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к содержащим антигены иммуногенным композициям, которые вызывают иммунный ответ против злокачественной опухоли. В этих конъюгатах антиген представляет собой антиген, экспрессируемый злокачественной опухолью или опухолью или полученный из опухоли. Согласно некоторым вариантам осуществления такие антигены в настоящем документе называются "антиген злокачественной опухоли" и, как правило, представляют собой белок, преимущественно экспрессируемый на клетках злокачественной опухоли, так что конъюгат вызывает как сильный гуморальный, так и сильный клеточный иммунитет к этому белку. Было установлено большое число связанных со злокачественными опухолями антигенов, некоторые из которых используют в настоящее время для создания экспериментальных вакцин для лечения злокачественных опухолей и, таким образом, являются подходящими для применения в настоящих вариантах осуществления. Антигены, связанные с более чем одним типом злокачественной опухоли, включают в себя онкоэмбриональный антиген (СЕА); антигены рака яичка, такие как NY-ESO-1; муцин-1 (MUC1), такой как сиалил Tn (STn); ганглиозиды, такие как GM3 и GD2; белок р53; и белок HER2/neu (также известный как ERBB2). Антигены, уникальные для специфического типа злокачественной опухоли, включают в себя мутантную форму рецептора эпидермального фактора роста, имеющего название EGFRvIII; антигены дифференциации меланоцитов/меланомы, такие как тирозиназа, MART1, gp100, линиеспецифическая группа рака яичка (MAGE) и связанные с тирозиназой антигены; специфический для предстательной железы антиген; связанные с лейкозом антигены (LAA), такие как белок слияния BCR-ABL, белок опухоли Вильмса и протеиназа 3; и идиотипические (Id) антитела. Смотри, например, Mitchell, 3 Curr. Opin. Investig. Drugs 150 (2002); Dao & Scheinberg, 21 Best Pract. Res. Clin. Haematol. 391 (2008).
В другом подходе в генерации иммунного ответа против злокачественной опухоли используются антигены из микроорганизмов, которые вызывают или вносят вклад в развитие злокачественной опухоли. Эти вакцины были использованы против злокачественных опухолей, включая в себя гепатоклеточную карциному (вирус гепатита В, вирус гепатита С, Opisthorchis viverrin), лимфому и карциному носоглотки (вирус Эпштейна-Барр), колоректальный рак, рак желудка (Helicobacter pylori), рак мочевого пузыря (Schisosoma hematobium), Т-клеточный лейкоз (Т-клеточный лимфотропный вирус человека), рак шейки матки (папилломавирус человека) и другие. К настоящему времени были проведены клинические исследования для вакцин, направленных на рак мочевого пузыря, опухоли мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, рак почки, меланому, множественную миелому, лейкоз, рак легких, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы и солидные опухоли. Смотри Pardoll et al., ABELOFF'S CLIN. ONCOL. (4-е изд., Churchill Livingstone, Philadelphia 2008); Sioud, 360 Methods Mol. Bio. 277 (2007); Pazdur et al., 30 J. Infusion Nursing 30(3):173 (2007); Parmiani et al., 178 J. Immunol. 1975 (2007); Lollini et al., 24 Trends Immunol. 62 (2003); Schlom et al., 13 Clin. Cancer Res. 3776 (2007); Banchereau et al., 392 Nature 245 (1998); Finn, 358 New Engl. J. Med. 2704 (2008); Curigliano et al., 7 Exp. Rev. Anticancer Ther. 1225 (2007). Вирус болезни Марека, вирус герпеса, который вызывает опухоли у птиц, контролируют в течение длительного времени с помощью вакцины. Таким образом, настоящие варианты осуществления предусматривают как превентивные или профилактические противораковые иммуногенные композиции, так и лечебные/терапевтические раковые вакцины.
Предусмотренные пролиферативные заболевания и злокачественные опухоли включают в себя следующее; связанные со СПИД злокачественные опухоли, нейрома слухового нерва, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, аденокистозная карцинома, рак коры надпочечников, агногенная миелоидная метаплазия, алопеция, альвеолярная саркома мягких тканей, рак анального канала, ангиосаркома, астроцитома, синдром атаксии-телеангиэктазии, базальноклеточная карцинома (кожи), рак мочевого пузыря, рак костей, рак кишечника, опухоли мозга и ЦНС, рак молочной железы, карциноидные опухоли, рак шейки матки, детские опухоли мозга, детский рак, детский лейкоз, детская карцинома мягких тканей, хондросаркома, хориокарцинома, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, колоректальный рак, кожная Т-клеточная лимфома, возвышающаяся дерматофибросаркома, десмопластическая мелкокруглоклеточная опухоль, протоковая карцинома, эндокринные злокачественные опухоли, рак эндометрия, эпендимома, рак пищевода, саркома Юинга, рак внепеченочных желчных протоков, рак глаза, включая в себя, например, меланому глаза и ретинобластому, рак фаллопиевой трубы, анемия Фанкони, фибросаркома, рак желчного пузыря, рак желудка, желудочно-кишечные злокачественные опухоли, желудочно-кишечная карциноидная опухоль, злокачественные опухоли мочеполовых органов, эмбрионально-клеточные опухоли, гестационно-трофобластное заболевание, глиома, гинекологические злокачественные опухоли, гематологические злокачественные новообразования, волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, гепатоклеточный рак, наследственный рак молочной железы, лимфома Ходжкина, связанный с папилломавирусом человека рак шейки матки, хорионаденома, гипофарингеальный рак, рак островковых клеток поджелудочной железы, саркома Капоши, рак почки, рак гортани, лейомиосаркома, лейкоз, синдром Ли-Фраумени, рак губы, липосаркома, рак легких, лимфедема, лимфома, неходжкинская лимфома, рак молочной железы мужчин, злокачественная рабдоидная опухоль почки, медуллобластома, меланома, рак клеток Меркеля, мезотелиома, метастатический рак, рак ротовой полости, множественная эндокринная неоплазия, фунгоидный микоз, миелодиспластические синдромы, миелома, миелопролиферативные нарушения, рак носа, рак носоглотки, нефробластома, нейробластома, нейрофиброматоз, синдром Ниймеген, немеланомный рак кожи, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), рак полости рта, рак ротоглотки, остеосаркома, рак стромы яичников, рак поджелудочной железы, рак придаточных пазух носа, рак паращитовидной железы, рак околоушной слюнной железы, рак полового члена, периферические нейроэктодермальные опухоли, рак гипофиза, истинная полицитемия, рак предстательной железы, почечноклеточная карцинома, ретинобластома, рабдомиосаркома, синдром Ротмунда-Томсона, рак слюнной железы, саркома, шваннома, синдром Сезари, рак кожи, мелкоклеточный рак легких (SCLC), рак тонкого кишечника, саркома мягких тканей, опухоли спинного мозга, сквамозноклеточная карцинома (кожи), рак желудка, синовиальная саркома, рак яичка, рак тимуса, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак (мочевого пузыря), переходно-клеточный рак (почечной лоханки/мочеточника), трофобластический рак, рак мочеточника, рак выделительной система, саркома матки, рак матки, рак влагалища, рак вульвы, макроглобулинемия Вальденстрема и опухоль Вильмса.
Согласно некоторым вариантам осуществления антиген для применения в раскрытых в настоящем документе иммуногенных композициях может включать в себя антигены аутоиммунных заболеваний, например, они может быть "аутоантигенами". Аутоиммунные заболевания, предусмотренные диагностики согласно анализам, описанным в настоящем документе, включают в себя без ограничения следующее: круговая алопеция, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, болезнь Аддисона, апластическая анемия, рассеянный склероз, аутоиммунное заболевание надпочечника, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит и орхит, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатия, дерматит при глютенчувствительной целиакии, синдром хронической усталости, хронический воспалительный демиелинизирующий синдром (CFIDS), хроническая воспалительная полинейропатия, синдром Черджа-Стросса, рубцующийся пемфигоид, синдром CREST, болезнь холодовых агглютининов, болезнь Крона, герпетиформный дерматит, дискоидная волчанка, криоглобулинемия смешанного типа, фибромиалгия, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический пульмонарный фиброз, идиопатическая тромбоцитопения пурпура (ITP), IgA нефропатия, инсулинзависимый диабет (тип I), красный плоский лишай, волчанка, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительной ткани, тяжелая миастения, миокардит, обыкновенная пузырчатка, пернициозная анемия, нодозный полиартериит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическая полимиалгия, полимиозит и дерматомиозит, первичная агаммаглобулинемия, первичный билиарный цирроз, псориаз, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматическая атака, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермия, синдром Шегрена, синдром скованного человека, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, синдром Вегенера, васкулит и витилиго. Как правило, важно достичь потенциальной или острой реактивности CMI у субъектов, характеризующихся аутоиммунным заболеванием или у которых подозревается его наличие или подверженных ему.
Согласно некоторым вариантам осуществления антиген для применения в раскрытых в настоящем документе иммуногенных композициях может представлять собой антиген, связанный с воспалительным заболеванием или состоянием. Примеры воспалительных болезненных состояний, при которых могут быть применимы антигены, предусматривают без ограничения следующее: акне, стенокардия, артрит, аспирационная пневмония, эмпиема, гастроэнтерит, некротизирующий энтероколит, воспалительное заболевание тазовых органов, фарингит, плеврит, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулонейропатия, и хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, среди прочего.
Согласно некоторым вариантам осуществления антиген может быть интактным (т.е., полным или целым) антигеном или функциональной частью антигена, которая содержит более чем один эпитоп. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген представляет собой пептидную функциональную часть антигена. Под термином "интактный" в этом контексте подразумевается, что антиген представляет собой полноразмерный антиген в том виде, как этот антигенный полипептид встречается в природе. Это прямо противоположно доставке только небольшой части или пептида антигена. Доставка интактного антигена к клетке позволяет или облегчает активацию иммунного ответа на полный спектр эпитопов интактного антигена, а не просто на отдельный или выбранные несколько пептидных эпитопов. Соответственно, описанные в настоящем документе способы и иммуногенные композиции предусматривают интактные антигены, связанные с полимером для большей восприимчивости и характеризуются более высокой специфичностью иммунного ответа по сравнению с применением антигена на основе одного эпитопного пептида.
Альтернативно, согласно некоторым вариантам осуществления интактный антиген может быть разделен на много частей в зависимости от размера исходного антигена. Как правило, если целый антиген представляет собой мультимерный полипептид, то цельный белок может быть разделен на субъединицы и/или домены, где каждая отдельная субъединица или домен антигена может быть связан с полимером согласно раскрытым в настоящем документе способам. Альтернативно, согласно некоторым вариантам осуществления интактный антиген может быть разделен на функциональные фрагменты или части целого антигена, например, по меньшей мере две, или по меньшей мере 3, или по меньшей мере 4, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 6, или по меньшей мере 7, или по меньшей мере 8, или по меньшей мере 9, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 11, или по меньшей мере 12, или по меньшей мере 13, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25, или более чем 25 частей (например, кусочков или фрагментов), включительно, и где каждый отдельный функциональный фрагмент антигена может быть связан с полимером согласно раскрытым в настоящем документе способам.
Фрагментация или разделение полноразмерного антигенного полипептида может представлять собой равное деление полноразмерного антигенного полипептида, или альтернативно, согласно некоторым вариантам осуществления фрагментация является асимметричной или неравной. В качестве не ограничивающего примера, если антиген разделен на два перекрывающихся фрагмента, то антиген может быть разделен на фрагменты приблизительно одинакового (равного) размера, или альтернативно один фрагмент может составлять приблизительно 45% целого антигена, а другой фрагмент может составлять приблизительно 65%. В качестве дополнительных не ограничивающих примеров, целый антиген может быть разделен на комбинацию фрагментов различных размеров, например, если антиген разделен на два фрагмента, то фрагменты могут быть разделена на приблизительно 40% и приблизительно 70%, или приблизительно 45% и приблизительно 65%; или приблизительно 35% и приблизительно 75%; или приблизительно 25% и приблизительно 85%, включительно, от целого антигена. Любая комбинация перекрывающихся фрагментов полноразмерного целого антигена предусмотрена для применения в создании панели перекрывающихся полипептидов антигена. В качестве только иллюстративного примера, если антиген разделен на 5 частей, то части могут быть разделены поровну (т.е., каждый перекрывающийся фрагмент составляет приблизительно 21% - 25% полного полноразмерного антигена) или в неравной степени (т.е., антиген может быть разделен на следующие пять перекрывающихся фрагментов; фрагмент 1 составляет приблизительно 25%, фрагмент 2 составляет приблизительно 5%, фрагмент 3 составляет приблизительно 35%, фрагмент 4 составляет приблизительно 10% и фрагмент 5 составляет приблизительно 25% размера полноразмерного антигена, при условии, что каждый фрагмент перекрывается по меньшей мере с одним другим фрагментом).
Как правило, панель антигенных частей может, по сути, охватывать полную длину целого (или интактного) антигенного полипептида. Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления иммуногенная композиция содержит полимер со многими различными и/или перекрывающимися фрагментами одного и того же интактного антигена. Перекрывающиеся белковые фрагменты антигена могут быть получены намного быстрее и дешевле и с увеличенной стабильностью по сравнению с применением пептидных антигенов отдельно. Дополнительно согласно некоторым вариантам осуществления антигены, которые представляют собой полипептиды, большие по размеру, чем простые пептиды, являются предпочтительными, поскольку конформация является важной для распознавания эпитопа, и большие антигенные полипептиды или фрагменты будут обеспечивать преимущество по сравнению с пептидными фрагментами.
Специалист в настоящей области техники может разделить целый антиген на перекрывающиеся белки антигена для создания панели полипептидов антигена. В качестве только иллюстративного примера, ТВ-специфический антиген ТВ1 (CFP также известный как культуральный фильтрат-10 или CFP-10) может быть разделен, например, по меньшей мере на семнадцать частей для создания панели из семнадцати различных полипептидов, каждый из которых содержит различный, но перекрывающийся ТВ-специфический антигенный ТВ1 (CFP) фрагмент. Белок культурального фильтрата (CFP-10) (Genbank AAC83445) представляет собой белковый фрагмент массой 10 кДа из 100 аминокислотных остатков из М. tuberculosis. Он также известен как L45 антигенный гомологичный белок (LHP).
Целевой антиген для применения в описанных в настоящем документе способах и композициях может экпрессироваться рекомбинантными способами, и может необязательно содержать аффинную или эпитопную метку для облегчения очистки, причем способы хорошо известны в настоящей области техники. Химический синтез олигопептида, или свободного, или конъюгированного с белками-носителями, может использоваться для получения антигена по настоящему изобретению. Олигопептиды рассматриваются как тип полипептида. Антиген может экспрессироваться в виде слияния с комплементарной аффинной молекулой, например, без ограничения ризавидином или его производным или функциональным фрагментом. Альтернативно, также возможно получить целевой антиген и затем конъюгировать его с комплементарной аффинной молекулой, например, без ограничения ризавидином или его производным или функциональным фрагментом.
Полипептиды могут также быть синтезированы в виде разветвленных структур, таких как описанные в патентах САШ №№5229490 и 5390111. Антигенные полипептиды включают в себя, например, синтетические или рекомбинантные B-клеточные и T-клеточные эпитопы, универсальные T-клеточные эпитопы и смешанные T-клеточные эпитопы из одного организма или заболевания и B-клеточные эпитопы из другого.
Антиген, который может быть получен посредством рекомбинантных способов или химического синтеза полипептидов, а также антиген, полученный из естественных источников или экстрактов, может быть очищен посредством физических и химических характеристик антигена, например, путем фракционирования или хроматографии. Эти техники хорошо известны в настоящей области техники.
Согласно некоторым вариантам осуществления антиген может быть растворен в воде, растворителе, таком как метанол, или буфере. Подходящие буферы включают в себя, без ограничения, фосфатно-солевой буфер, не содержащий Ca2+/Mg2+ (PBS), нормальный солевой раствор (150 мМ NaCl в воде) и Tris-буфер. Антиген, не растворимый в нейтральном буфере, может быть растворен в 10 мМ уксусной кислоте и затем разбавлен до необходимого объема нейтральным буфером, таким как PBS. В случае антигена, растворимого только в кислом рН, ацетатный PBS при кислом рН может использоваться в качестве разбавителя после растворения в разбавленной уксусной кислоте. Глицерин может представлять собой подходящий неводный растворитель для применения описанных в настоящем документе композиций, способов и наборов.
Как правило, при разработке белковой вакцины против патогена внеклеточный белок или белок, подвергающийся воздействию окружающей среду, на вирусе зачастую является идеальным кандидатом в качестве антигенного компонента в вакцине. Антитела, образованные против этого внеклеточного белка, становятся первой линий защиты от патогена в ходе инфекции. Антитела связываются с белком на патогене для облегчения опсонизации антитела и маркировки патогена для поглощения и разрушения фагоцитом, таким как макрофаг. Опсонизация антител может также лизировать патоген с помощью антителозависимой клеточной цитотоксичности. Антитело запускает высвобождение продуктов лизиса из клеток, таких как моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и клетки - естественные киллеры.
Согласно одному варианту осуществления описанного в настоящем документе изобретения все антигены для применения в раскрытых в настоящем документе композициях представляют собой белки дикого типа, поскольку в аминокислотных остатках содержат последовательности, обнаруженные во встречающихся в природе вирусах и не были изменены условиями селективного роста или молекулярно-биологическими способами.
Согласно одному варианту осуществления описанные в настоящем документе иммуногенные композиции могут содержать антигены, который представляют собой гликозилированные белки. Другими словами, каждый интересующий антиген может представлять собой гликозилированный белок. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе иммуногенных композиций антигены или полипептиды слияния антигенов являются O-связанными гликозилированными. Согласно другому варианту осуществления описанных в настоящем документе иммуногенных композиций антигены или полипептиды слияния антигенов являются N-связанными гликозилированными. Согласно другому варианту осуществления описанных в настоящем документе иммуногенных композиций антигены или слияния антигенов являются как O-связанными, так и N-связанными гликозилированными. Согласно другим вариантам осуществления другие типы гликозилирования являются возможными, например, C-маннозилирование. Гликозилирование белков происходит преимущественно в эукариотических клетках. N-гликозилирование является важным для укладки некоторых эукариотических белков, обеспечивая механизм котрансляционной и посттрансляционной модификации, который модулирует структуру и функцию мембранных и секретируемых белков. Гликозилирование представляет собой ферментативный процесс, который соединяет сахариды для получения гликанов, и прикрепляет их к белкам и липидам. При N-гликозилировании гликаны прикрепляются к азоту амида боковой цепи аспарагина в ходе трансляции белка. Три основных сахарида, образующих гликаны, представляют собой молекулы глюкозы, маннозы и N-ацетилглюкозамина. Консенсус N-гликозилирования представляет собой Asn-Xaa-Ser/Thr, где Хаа может быть любой из известных аминокислот. O-связанное Гликозилирование происходит на более поздней стадии в ходе процессирования белка, вероятно, в аппарате Гольджи. При O-связанном гликозилировании N-ацетилгалактозамин, O-фукоза, O-глюкоза и/или N-ацетилглюкозамин добавляются к остаткам серина или треонина. Специалист в настоящей области техники может использовать биоинформационное программное обеспечение, такое как программные средства для прогнозирования NetNGlyc 1.0 и NetOGlyc от Технического университета Дании (Technical University of Denmark) для обнаружения сайтов N- и O-гликозилирования в полипептиде согласно настоящему изобретению. Сервер NetNglyc служит для прогнозирования сайтов N-гликозилирования в белках с использованием искусственных нейронных сетей, которые исследуют контекст последовательностей сиквонов Asn-Xaa-Ser/Thr. Программное обеспечение для прогнозирования NetNGlyc 1.0 и NetOGlyc 3.1 может быть доступным на Интернет-сайте EXPASY. Согласно одному варианту осуществления N-гликозилирование происходит в целевом антигенном полипептиде описанном в настоящем документе полипептиде слияния.
Пары аффинных молекул:
Раскрытый в настоящем документе согласно некоторым вариантам осуществления антиген присоединен к полимеру посредством комплементарных аффинных пар. Это присоединение антигена к полимеру опосредовано полимером, подлежащим присоединению к первой аффинной молекуле, которая связывается со второй (например, комплементарной) аффинной молекулой, которая прикреплена к антигену. Пример комплементарной аффинной пары представляет собой пару биотин/связывающий биотип белок.
Иллюстративные примеры аффинных комплементарных аффинных пар включают в себя без ограничения связывающие биотин белки или авидиноподобные белки, которые связываются с биотином. Например, если первая аффинная связывающая молекула представляет собой биотин (который связывается с полимером), то комплементарная аффинная молекула может представлять собой связывающий биотин белок или авидиноподобный белок или их производное, например, без ограничения авидин, ризавидин или стрептавидин или их варианты, производные или функциональные части.
Согласно некоторым вариантам осуществления первая аффинная связывающая молекула представляет собой биотин, производное биотина или миметик биотина, например, без ограничения амин-PEG3-биотин (((+)-биотинил-3-6,9-триоксаундекандиамин) или его производное или функциональный фрагмент. Специфический миметик биотина характеризуется специфическим пептидным мотивом, содержащим последовательность DXaAXbPXc (SEQ ID NO:12) или CDXaAXbPXcCG (SEQ ID NO:13), где Xa представляет собой R или L, Xb представляет собой S или Т, и Xc представляет собой Y или W. Эти мотивы могут связывать авидин и нейтравидин, но не стрептавидин. Смотри, например, Gaj et al., 56 Prot. Express. Purif. 54 (2006).
Связь первой аффинной молекулы с полимером и комплементарной аффинной молекулы с антигеном может представлять собой нековалентную связь или химический механизм, например, ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркаляцию, координационное связывание и комплексообразование. Ковалентное связывание предусматривает очень стабильное связывание и является особенно хорошо подходящим для настоящих вариантов осуществления. Ковалентное связывание может быть достигнуто либо путем конденсации существующих боковых цепей, либо путем встраивания внешних мостиковых молекул.
Например, согласно некоторым вариантам осуществления антиген может быть нековалентно связан с одной из пар в комплементарной фиксирующей паре. Согласно альтернативным вариантам осуществления антиген может быть ковалентно связан или слит с одной из пар в комплементарной фиксирующей паре. Способы получения белков слияния хорошо известны в настоящей области техники и обсуждаются в настоящем документе.
Согласно другим вариантам осуществления первая аффинная связывающая молекула сшита с полимером нековалентной связью или ковалентной связью. Согласно некоторым вариантам осуществления сшивающий реагент используется для ковалентного связывания первой аффинной связывающей молекулы с раскрытым в настоящем документе полимером.
Согласно некоторым вариантам осуществления первая аффинная связывающая молекула связывается с комплементарной аффинной молекулой с помощью нековалентно связанной ассоциации, как известно в настоящей области техники, включая в себя, без ограничения электростатическое взаимодействие, соединение с помощью водородной связи, гидрофобное взаимодействие (т.е., вандерваальсовы силы), гидрофильные взаимодействия и другие нековалентные взаимодействия. Также предусматриваются другие взаимодействия более высокого порядка с промежуточными фрагментами.
Согласно некоторым вариантам осуществления комплементарная аффинная молекула представляет собой связанный с авидином полипептидом. Согласно конкретным вариантам осуществления комплементарная аффинная молекула представляет собой ризавидин, такой как рекомбинантный ризавидин. В частности, рекомбинантный ризавидин представляет собой модифицированный ризавидин, который может экспрессироваться в Е. coli с высоким выходом. Типичный выход составляет >30 мг на литр культуры Е. coli. Ризавидин характеризуется более низкой гомологией последовательностей с яичным авидином (22,4% идентичности последовательностей и 35,0% сходства) по сравнению с другими авидиноподобными белкам. Применение модифицированного ризавидина снижает риск MAPS, вызывающей аллергическую реакцию на яйца у субъекта. Более того, антитело к рекомбинантному модифицированному ризавидину не обладает выраженной перекрестной реактивностью на яичный авидин (и наоборот).
Более конкретно, некоторые варианты осуществления содержат модифицированный ризавидин, разработанный для рекомбинантной экспрессии в Е. coli. Кодирующая последовательность для гена ризавидина была оптимизирована с использованием кодонов экспрессии Е. coli, чтобы избежать какого-либо затруднения в ходе экспрессии в Е. coli вследствие редких кодонов, присутствующих в исходном гене. Для упрощения конструкта после биоинформационного и структурного анализа первые 44 остатка полноразмерного ризавидина удаляют, поскольку было обнаружено, что они не являются необходимыми для основной структуры и функции. Правильную укладку рекомбинантного белка улучшали путем добавления сигнальной последовательности секреции Е. coli к N-концу укороченного ризавидина (45-179), для облегчения транслокации рекомбинантного белка в периплазматическое пространство клеток Е. coli, где функционально важная дисульфидная связь в ризавидине может формироваться правильно. Модифицированный рекомбинантный ризавидин образует димер, по сравнению с известными авидиноподобными белками, которые образуют тетрамеры, дополнительно улучшая экспрессию слияния рекомбинантного ризавидина с антигеном в виде растворимого белка в Е. coli.
Более того, как обсуждается более подробно где-либо в настоящем документе, для улучшения экспрессии и растворимости слияния антигенов в Е. coli гибкий линкерный участок добавляли между ризавидином и антигенным белком. Кроме того, основываясь на биоинформационном и структурном анализе, различные антигенные конструкты клонировали и экспрессировали: или полноразмерный антиген, или важный функциональный домен, или химерные белки содержали два различных антигена.
Дополнительные аффинные пары, которые могут быть применимыми в описанных в настоящем документе способах и композициях включают в себя антиген-антитело, металл/ион-металл/ связывающий ион белок, липид/ связывающий липид белок, сахарид/ связывающий сахарид белок, аминокислота/пептид/ связывающий аминокислоту или пептид белок, фермент-субстрат или фермент-ингибитор, лиганд-агонист/рецептор или биотиновый миметик. При использовании альтернативных аффинных пар может также использоваться альтернативно средство прикрепления соответствующего полимера и антигена, такой как in vitro ферментативные реакции вместо генетического слияния. Более конкретно, аффинная пара антиген-антитело предусматривает очень сильное и специфическое взаимодействие. Антиген может быть любым эпитопом, включая в себя белок, пептид, нуклеиновую кислоту, липид, поли/олигосахарид, ион и т.д. Антитело может быть любым типом иммуноглобулина или Ag-связывающей частью иммуноглобулина, такой как Fab фрагмент. Рассматривая пару металл/ион-металл/связывающий ион белок, примеры включают в себя пару Ni NTA - гистидин-меченный белок или Zn - связывающий Zn белок. Рассматривая пару липид/ связывающий липид белок, примеры включают в себя пару холестерин - связывающий холестерин белок. Рассматривая пару сахарид/ связывающий сахарид белок, примеры включают в себя пару мальтоза - мальтоза связывающий белок, манноза/глюкоза/олигосахарид - лектин. Фермент-субстрат/ингибиторы включают в себя субстраты из широкого диапазона веществ, включая в себя белок, пептид, аминокислоту, липид, сахар или ионы. Ингибитор может быть аналогом существующего субстрата, который может, как правило, связываться с ферментами более тесно и даже необратимо. Например, трипсин - ингибитор соевого трипсина. Ингибитор может быть натуральной или синтетической молекулой. Рассматривая другие пары лиганд/агонист-рецептор, лиганд может принадлежать к широкому диапазону веществ, включая в себя белок, пептид, аминокислоту, липид, сахар, ион, агонист может быть аналогом существующего лиганда. Примеры содержат взаимодействие LPS с TLR4.
Сшивающие реагенты:
Многие двухвалентные или поливалентные сшивающие средства применимы в соединении белковых молекул с другими молекулами. Например, иллюстративные сшивающие средства могут включать в себя органические соединения, такие как сложные тиоэфиры, карбодиимиды, сложные эфиры сукцинимида, диизоцианаты, глутаральдегиды, диазобензолы и гексаметилендиамины. Не предусматривается, что этот перечень является исчерпывающим списком различных классов сшивающих средств, известных в настоящей области техники, но, скорее, является иллюстративным для наиболее распространенных сшивающих средств. Смотри Killen & Lindstrom, 133 J. Immunol. 1335 (1984); Jansen et al., 62 Imm. Rev. 185 (1982); Vitetta et al.
Согласно некоторым вариантам осуществления сшивающие реагенты, описанные в литературе, предусмотрены для применения в раскрытых в настоящем документе способах, иммуногенных композициях и наборах. Смотри, например, Ramakrishnan, et al., 44 Cancer Res. 201 (1984) (описывающей применение MBS (сложный эфир М-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида)); Umemoto et al., патент США №5030719 (описывающий применение галогенированного производного ацетилгидразида, сшитого с антителом посредством олигопептидного линкера). Конкретные линкеры включают в себя: (a) EDC (1-этил-3-(3-диметиламино-пропил)карбодиимидгидрохлорид; (b) SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридил-дитио)-толуол (Pierce Chem. Co., кат. № (21558G); (с) SPDP (сукцинимидил-6 [3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (Pierce Chem. Co., кат. №21651G); (d) сульфо-LC-SPDP (сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамид]гексаноат (Pierce Chem. Со. кат. №2165-G); и (f) сульфо-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид: Pierce Chem. Co., кат. №24510), конъюгированный с EDC.
Описанные выше связи или сшивающие средства содержат компоненты, которые характеризуются различными свойства, таким образом, приводя к конъюгатам с отличающимися физико-химическими свойствами. Например, сульфо-NHS сложные эфиры алкильных карбоксилатов являются более стабильными, чем сульфо-NHS сложные эфиры ароматических карбоксилатов. Содержащие сложные эфиры NHS линкеры являются менее растворимыми, чем сложные эфиры сульфо-NHS. Дополнительно, линкер SMPT содержит стерически затрудненную дисульфидную связь и может формировать конъюгаты с увеличенной стабильностью. Дисульфидные связи являются, в общем, менее стабильными, чем другие связи, поскольку дисульфидная связь может быть расщеплена in vitro, приводя к тому, что доступным является меньший конъюгат. Сульфо-NHS, в частности, может усиливать стабильность карбодиимидных сшивок. Карбодиимидные сшивки (такие как EDC) при использовании совместно с сульфо-NHS, формируют сложные эфиры, которые являются более устойчивыми к гидролизу, чем отдельно реакция карбодиимидного сшивания.
Иллюстративные сшивающие молекулы для применения в раскрытых в настоящем документе способах и иммуногенных композициях включают в себя без ограничения перечисленные в таблицах 2 и 3.
Костимулирующий фактор
Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытая в настоящем документе иммуногенная композиция содержит по меньшей мере одну костимулирующую молекулу. Согласно некоторым вариантам осуществления костимулирующий фактор сшит с полимером. Согласно некоторым вариантам осуществления костимулирующий фактор связан с полимером с помощью комплементарной аффинной пары, сходной с той, которой антиген связан с полимером. Согласно некоторым вариантам осуществления комплементарная аффинная пара, которая сшивает костимулирующий фактор с полимером, является одинаковой или отличающейся от комплементарной аффинной пары, которая сшивает антиген с полимером.
Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один, или по меньшей мере 2, или по меньшей мере 3, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере 100, или более чем приблизительно 100, включительно, костимулирующих факторов могут быть связаны с раскрытым в настоящем документе полимером. Согласно некоторым вариантам осуществления костимулирующие факторы могут быть одинаковым костимулирующим фактором или они могут представлять собой разнообразие различных костимулирующих факторов, связанных с полимером.
Согласно некоторым вариантам осуществления костимулирующий фактор представляет собой лиганд/агонист Toll-подобных рецепторов, например, без ограничения TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11 и т.д. Согласно некоторым вариантам осуществления костимулирующий фактор представляет собой NOD лиганд/агонист или активатор/агонист инфламмасомы. Не желая быть связанным теорией, инфламмасома представляет собой мультипротеиновый олигомер, состоящий из каспазы 1, PYCARD, NALP и иногда каспазы 5 или каспазы 11 и стимулирует созревание воспалительных цитокинов интерлейкина 1-β и интерлейкина 18.
Согласно некоторым вариантам осуществления костимулирующий фактор представляет собой цитокин. Согласно некоторым вариантам осуществления цитокин выбран из группы, состоящей из: GM-CSF; IL-1α; IL-1β; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-10; IL-12; IL-23; IFN-α; IFN-β; IFN-β; IFN-γ; MIP-1α; MIP-1β; TGF-β; TNFα и TNFβ. Согласно некоторым вариантам осуществления костимулирующий фактор представляет собой адъювант, который может быть связан с полимером, как только что обсуждалось, или может быть добавлен к композиции MAPS перед или одновременно с введением субъекту. Адъюванты дополнительно описаны где-либо в настоящем документе.
Получение антигенов и антигенов, слитых с комплементарной аффинной молекулой
Рекомбинантные белки могут быть легко экспрессированы и очищены специалистом в настоящей области техники или с использованием коммерчески доступных наборов, например. Система очистки PROBOND™ (Invitrogen Corp., Карлсбад, Калифорния). Согласно некоторым вариантам осуществления рекомбинантные антигены могут быть синтезированы и очищены с помощью способов очищения белка с использованием бактериальных систем экспрессии, дрожжевых систем экспрессии, системы экспрессии бакуловирусов/клеток насекомого, систем экспрессии клеток млекопитающих или систем трансгенных растений или животных, известных специалистам в настоящей области техники.
Описанные в настоящем документе полипептиды слияния могут все быть синтезированы и очищены с помощью белковых и молекулярных способов, хорошо известных специалисту в настоящей области техники. Используются молекулярно-биологические способы и системы экспрессии рекомбинантных гетерологичных белков. Например, рекомбинантный белок может быть экспрессирован в бактериальных клетках, клетках млекопитающих, насекомых, дрожжей или растений; или в трансгенных хозяевах-растениях или животных.
Согласно одному варианту осуществления в настоящем документе представлен выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид слияния или неслитый полипептид, описанный в настоящем документе. Традиционные техник клонирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) могут использоваться для конструирования химерной или слитой кодирующей последовательности, кодирующей описанный в настоящем документе полипептид слияния. Кодирующая последовательность может клонироваться в такой универсальный клонирующий вектор, как векторы pUC19, pBR322, pBLUESCRIPT® (Stratagene, Inc.) или pCR TOPO® (Invitrogen). Полученный рекомбинантный вектор, несущий нуклеиновую кислоту, кодирующую описанный в настоящем документе полипептид, может затем использоваться для дополнительных молекулярно-биологических манипуляций, таких как сайт-направленный мутагенез для создания описанного в настоящем документе вариантного полипептида слияния или может быть субклонирован в векторы экспрессии белка или вирусные векторы для синтеза белка в разнообразных системах экспрессии белка с использованием клеток хозяина, выбранных из группы, состоящей из клеточных линий млекопитающих, клеточных линий насекомых, дрожжей, бактерий и растительных клеток.
Каждый ПЦР праймер должен содержать по меньшей мере 15 нуклеотидов, перекрывающихся его соответствующими матрицами на участке, подлежащем амплификации. Полимераза, используемая в ПЦР амплификации, должна характеризоваться высокой степенью соответствия, такой как полимераза PfuULTRA® (Stratagene) для снижения ошибок в последовательности в ходе процесса ПЦР амплификации. Для простоты лигирования нескольких отдельных ПЦР фрагментов вместе, например, в конструкцию полипептида слияния, и последующего введения в клонирующий вектор, ПЦР праймеры должны содержать также отдельные и уникальные сайты рестрикционной обработки на их фланкирующих концах, которые не отжигаются с ДНК матрицей в ходе ПЦР амплификации. Выбор сайтов рестрикционной обработки для каждой пары специфических праймеров должен быть таким, чтобы кодирующая полипептид слияния последовательность ДНК находилась внутри рамки считывания и кодировала полипептид слияния от начала до конца без стоп-кодонов. В то же время выбранные сайты рестрикционной обработки не должны обнаруживаться внутри кодирующей последовательности ДНК для полипептида слияния. Кодирующая последовательность ДНК для предусмотренного полипептида может быть лигирована в клонирующий вектор pBR322 или одно из его производных для амплификации, подтверждения соответствия и аутентичности химерной кодирующей последовательность, замены/или специфического сайт-направленного мутагенеза для специфических аминокислотных мутаций и замен в полипептиде.
Альтернативно кодирующая последовательность ДНК для полипептида может быть клонирована путем ПЦР в вектор с использованием, например, ТОРО® способа клонирования, содержащего ТА векторы при содействии топоизомеразы, такие как PCR®-TOPO, PCR®-Blunt II-TOPO, pENTR/D-TOPO®, и pENTR/SD/D-TOPO®. (Invitrogen, Inc., Карлсбад, Калифорния). Как pENTR/D-TOPO®, так и pENTR/SD/D-TOPO® представляют собой направленные ТОРО исходные векторы, которые обеспечивают клонирование последовательности ДНК в 5'→3' ориентации в вектор экспрессии GATEWAY®. Направленное клонирование в 5'→3' ориентации облегчает однонаправленную вставку последовательности ДНК в вектор экспрессии белка так, чтобы промотор находился против хода транскрипции 5' ATG старт-кодона кодирующей полипептид слияния последовательности ДНК, обеспечивая управляемую промотором экспрессию белка. Рекомбинантный вектор, несущий кодирующую последовательность ДНК для полипептида слияния, может быть трансфицирован и репродуцирован в общих клонирующих клетках Е. coli, таких как клетки XL1 Blue, SURE® (STRATAGENE®) и TOP-10 (Invitrogen).
Специалист в настоящей области техники будет способен клонировать и лигировать кодирующий участок интересующего антигена с кодирующим участком комплементарной аффинной молекулы для конструирования химерной кодирующей последовательности для полипептида слияния, содержащего антиген или его фрагмент и комплементарную аффинную молекулу или ее производное с использованием специально разработанных олигонуклеотидных зондов и методик полимеразной цепной реакции (ПЦР), хорошо известных в настоящей области техники. Специалист в настоящей области техники также будет способен клонировать и лигировать химерную кодирующую последовательность для белка слияния в выбранный вектор, например, бактериальный вектор экспрессии, вектор экспрессии насекомого или бакуловирусный вектор экспрессии. Кодирующие последовательности антигена и целевого антигенного полипептида или его фрагмента должны быть лигированы в пределах рамки считывания и химерная кодирующая последовательность должна быть лигирована по ходу транскрипции ниже промотора, и между промотором и терминатором транскрипции. После этого рекомбинантный вектор трансфицируют в регулярную клонирующую Е. coli, такие как XL1 Blue. Рекомбинантную Е. coli, несущую вектор переноса ДНК, затем подвергают селекции путем устойчивости к антибиотикам для удаления любой Е. coli, несущей нерекомбинантную ДНК плазмиду. Выбранные трансформанты Е. coli выращивают и рекомбинантный вектор ДНК может впоследствии очищен для трансфекции в клетки S. frugiperda.
Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе антигены могут содержать сигнальный пептид для переноса в периплазматическое пространство бактерий. Сигнальный пептид также называется лидерным пептидом на N-конце, который может отщепляться или может не отщепляться после переноса через мембрану. Один пример сигнального пептида представляет собой MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO:1), раскрытый в настоящем документе. Другая сигнальная последовательность представляет собой MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA (SEQ ID NO:14). Другие примеры сигнальных пептидов можно найти на SPdb, База данных сигнальных пептидов, которую можно найти на Интернет-сайте "proline.bic.nus.edu.sg/spdb/".
Согласно некоторым вариантам осуществления когда антиген слит с комплементарным аффинным белком, то сигнальная последовательность может быть расположена на N-конце комплементарного аффинного белка. Например, если антиген слит с авидиноподобным белком, то сигнальная последовательность может быть расположена на N-конце комплементарного аффинного белка. Согласно некоторым вариантам осуществления сигнальная последовательность отщепляется от комплементарного аффинного белка перед тем, как комплементарный аффинный белок связывается с первой аффинной молекулой.
Согласно некоторым вариантам осуществления антиген и/или комплементарный аффинный белок, описанный в настоящем документе, не содержит сигнальную последовательность.
Описанные в настоящем документе полипептиды могут быть экспрессированы в разнообразных клетках хозяина экспрессии, например, бактериях, дрожжах, клетках млекопитающих, клетках насекомых, клетках растений, клетках водорослей, таких как Chlamydomonas, или в бесклеточных системах экспрессии. Согласно некоторым вариантам осуществления нуклеиновая кислота может быть субклонирована из клонирующего вектора в рекомбинантный вектор экспрессии, который является подходящим для экспрессии полипептида слияния в бактериях, клетках млекопитающих, насекомых, дрожжей или растений или бесклеточной системе экспрессии, такой как система экспрессии ретикулоцитов кролика. Некоторые векторы разрабатывают для переноса кодирующей нуклеиновой кислоты для экспрессии в клетки млекопитающих, клетки насекомых и дрожжей в одну отдельную реакцию рекомбинации. Например, некоторые из GATEWAY® (Invitrogen) векторов назначения разрабатывают для конструкции бакуловируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), ретровируса и лентивирусов, которые при инфицировании их соответственных клеток хозяина, делают возможной гетерологичную экспрессию полипептидов слияния в подходящих клетках хозяина. Перенос гена в вектор назначения осуществляется всего лишь в две стадии согласно инструкциям производителя. Существуют векторы экспрессии GATEWAY® для экспрессии белка в клетках насекомых, клетках млекопитающих и дрожжах. После трансформации и селекции в Е. coli, вектор экспрессии готов к использованию для экспрессии в подходящем хозяине.
Примеры других векторов экспрессии и клеток хозяина представляют собой основанные на сильном промоторе CMV рсДНК3.1 (Invitrogen) и pCINEO векторы (Promega) для экспрессии в клеточных линиях млекопитающих, таких как СНО, COS, HEK-293, Jurkat и MCF-7; векторы репликации некомпетентного аденовирусного вектора pADENO-X™, pAd5F35, pLP-ADENO™-X-CMV (CLONTECH®), pAd/CMV/V5-DEST, pAd-DEST вектор (Invitrogen) для аденовирус-опосредованного переноса генов и экспрессии в клетках млекопитающих; pLNCX2, pLXSN, и pLAPSN ретровирусные векторы для применения с RETRO-X™ системой от Clontech для опосредованного ретровирусом переноса генов и экспрессии в клетках млекопитающих; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™, и pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) для опосредованного лентивирусом переноса генов и экспрессии в клетках млекопитающих; аденовирусассоциированные вирусные векторы экспрессии, такие как pAAV-MCS, pAAV-IRES-hrGFP и pAAV-RC вектор (Stratagene) для опосредованного аденоассоциированным вирусом переноса генов и экспрессии в клетках млекопитающих; BACpak6 бакуловирус (Clontech) и pFASTBAC™ HT (Invitrogen) для экспрессии в S. frugiperda 9 (Sf9), Sf11, Tn-368 и BTI-TN-5B4-1 клеточных линиях насекомых; pMT/BiP/V5-His (Invitrogen) для экспрессии в клетках Drosophila schneider S2; векторы экспрессии Pichia pPICZα, pPICZ, pFLDα и pFLD (Invitrogen) для экспрессии в P. pastoris и векторы pMETα и рМЕТ для экспрессии в Р. methanolica; pYES2/GS и pYD1 (Invitrogen) векторы для экспрессии в дрожжах S. cerevisiae.
Описаны последние достижения в промышленной экспрессии гетерологичных белков в Chlamydomonas reinhardtii. Griesbeck., 34 Mol. Biotechnol. 213 (2006); Fuhrmann, 94 Methods Mol Med. 191 (2006). Чужеродные гетерологичные кодирующие последовательности вводят в геном ядра, хлоропласта и митохондрии путем гомологичной рекомбинации. Вектор экспрессии хлоропласта р64, несущий наиболее универсальный селектируемый маркер хлоропласта аминогликозидаденилтрансферазу (aadA), которая придает устойчивость к спектиномицину или стрептомицину, может использоваться для экспрессии чужеродного белка в хлоропласте. Биобаллистический способ генной пушки может использоваться для введения вектора в водоросли. При его введении в хлоропласты чужеродная ДНК высвобождается из частиц генной пушки и интегрируется в геном хлоропласта посредством гомологичной рекомбинации.
Также согласно настоящему изобретению предусмотрена комплементарная аффинная молекула, слитая с антигеном. Согласно некоторым вариантам осуществления конструкт слияния может также необязательно содержать очищенные метки и/или сигнальные пептиды секреции. Эти белки слияния могут быть получены любым стандартным способом. Например, для получения стабильной клеточной линии, экспрессирующей белок слияния антигена с комплементарной аффинной молекулой амплифицированные с помощью ПЦР антигенные нуклеиновые кислоты могут быть клонированы в сайт рестрикции производного вектора экспрессии млекопитающего. Например, КА, который представляет собой производное рсДНК3 (Invitrogen), содержит фрагмент ДНК, кодирующий гемагглютининовую метку вируса гриппа (НА). Альтернативно, могут использоваться производные вектора, кодирующие другие метки, такие как c-myc или полигистидиновые метки. Слитый конструкт экспрессии антигена с комплементарной аффинной молекулой может быть котрансфицирован с маркерной плазмидой в подходящую клеточную линию млекопитающих (например, COS, HEK293T, или NIH 3Т3 клетки) с использованием, например, LIPOFECTAМИН™ (Gibco-BRL, Гейтерсберг, Мэриленд) согласно инструкциям производителя, или любой другой подходящей техники трансфекции, известной в настоящей области техники. Подходящие маркеры трансфекции включают в себя, например, плазмиды экспрессии β-галактозидазы или зеленого флуоресцентного белка (GFP) или любую плазмиду, которая не содержит такие же обнаруживаемые маркеры, как и белок слияния антигена с комплементарной аффинной молекулой. Экспрессирующие белок слияния клетки могут быть отсортированы и дополнительно культивированы, или меченый белок слияния антигена с комплементарной аффинной молекулой может быть очищен. Согласно некоторым вариантам осуществления белок слияния антигена с комплементарной аффинной молекулой амплифицируют с сигнальным пептидом. Согласно альтернативным вариантам осуществления кДНК, кодирующая белок слияния антигена с комплементарной аффинной молекулой может быть амплифицирован без сигнального пептида и субклонирован в вектор (pSecTagHis), содержащий сильный сигнальный пептид секреции. Согласно другому примеру белок слияния антигена с комплементарной аффинной молекулой может содержать метку щелочной фосфатазы (АР) или метку гистидина (His) для очищения. Любой способ, известный специалистам в настоящей области техники для очищения белка антигена и/или белка слияния антигена с комплементарной аффинной молекулой, предусмотрен для применения в способах настоящего изобретения.
Согласно некоторым вариантам осуществления любой из описанных в настоящем документе полипептидов получают путем экспрессии из рекомбинантного бакуловирусного вектора. Согласно другому варианту осуществления любой из описанных в настоящем документе полипептидов экспрессируют с помощью клетки насекомого. Согласно другому варианту осуществления любой из описанных в настоящем документе полипептидов выделяют из клетки насекомого. Существует несколько преимуществ экспрессии белка с бакуловирусом в клетках насекомых, включая в себя высокие уровни экспрессии, простоту линейного увеличения, получение белков с посттрансляционными модификациями и упрощенное выращивание клеток. Клетки насекомых не нуждаются в СО2 для роста и могут легко быть адаптированы к суспензионной культуре с высокой плотностью для промышленной экспрессии. Многие из путей посттрансляционной модификации, присутствующие в системах млекопитающих, также используются в клетках насекомых, обеспечивая получение рекомбинантного белка, который является антигенно, иммуногенно и функционально сходным с нативным белком млекопитающего.
Бакуловирусы представляют собой ДНК вирусы в семействе Baculoviridae. Известно, что эти вирусы характеризуются узким диапазоном хозяев, который ограничен, главным образом, видами насекомых Lepidopteran (бабочки и мотыльки). Бакуловирус Autographa californica вирус ядерного полиэдроза (AcNPV), который стал прототипным бакуловирусом, эффективно реплицируется в чувствительных культивируемых клетках насекомых. AcNPV характеризуется геномом в виде двухцепочечной замкнутой циклической ДНК приблизительно из 130000 пар оснований и хорошо охарактеризован в отношении диапазона хозяев, молекулярной биологии и генетики. Бакуловирусная векторная система экспрессии (BEVS) представляет собой безопасный и быстрый способ получения в большом количестве рекомбинантных белков в клетках насекомых и насекомых. Бакуловирусные системы экспрессии являются мощными и многоцелевыми системами для экспрессии рекомбинантного белка на высоком уровне в клетках насекомых. Сообщалось об уровнях экспрессии до 500 мг/л с использованием бакуловирусной системы экспрессии, делая ее оптимальной системой для экспрессии на высоком уровне. Рекомбинантные бакуловирусы, которые экспессируют чужеродные гены, конструируют путем гомологичной рекомбинации между бакуловирусной ДНК и химерными плазмидами, содержащими интересующую генную последовательность. Рекомбинантные вирусы могут быть обнаружены посредством их отчетливой морфологии в виде бляшек и очищены от бляшек до гомогенности.
Описанные в настоящем документе рекомбинантные белки слияния могут быть получены в клетках насекомых, включая в себя без ограничения клетки, полученные из вида Lepidopteran S. frugiperda. Другие клетки насекомых, которые могут быть инфицированы бакуловирусом, такие как клетки из вида Bombyx mori, Galleria mellanoma, Trichplusia ni или Lamanthria dispar, могут также быть использованы в качестве подходящего субстрата для получения описанных в настоящем документе рекомбинантных белков. Бакуловирусная экспрессия рекомбинантных белков хорошо известна в настоящей области техники. Смотри патенты США №№4745051, 4879236, 5179007, 5516657, 5571709, 5759809. Специалистам в настоящей области техники будет понятно, что система экспрессии не ограничена бакуловирусной системой экспрессии. Важным является то, что система экспрессии направляет N-гликозилирование экспрессированных рекомбинантных белков. Описанные в настоящем документе рекомбинантные белки могут быть также экспрессированы в других системах экспрессии, таких как вирусы Entomopox (поксвирусы насекомых), вирусы цитоплазматического полиэдроза (CPV) и трансформация клеток насекомых с конститутивной экспрессией рекомбинантного гена или генов. Большое количество бакуловирусных векторов переноса и соответствующих подходящим образом модифицированных клеток хозяина являются коммерчески доступными, например, pAcGP67, pAcSECG2TA, pVL1392, pVL1393, pAcGHLT, и рАсАВ4 от BD Biosciences; pBAC-3, pBAC-6, pBACgus-6, и pBACsurf-1 от NOVAGEN®, и pPolh-FLAG и pPolh-MAT от SIGMA ALDRICH®.
Участок между промотором и терминатором транскрипции может содержать множественные сайты обработки ферментом рестрикции для облегчения клонирования чужеродной кодирующей последовательности, в этом примере, кодирующей последовательности ДНК для антигенного полипептида и комплементарной аффинной молекулы. Могут быть включены дополнительные последовательности, например, сигнальные пептиды и/или кодирующие последовательности меток, такие как His-метка, МАТ-метка, FLAG метка, последовательность распознавания для энтерокиназы, сигнал секреции пчелиного мелиттина, бета-галактозидаза, метка глутатион S-трансферазы (GST) против хода транскрипции MCS для облегчения секреции, идентификации, правильной вставки, положительной селекции рекомбинантного вируса и/или очищения рекомбинантного белка.
Согласно некоторым вариантам осуществления белок слияния может содержать раскрытую в настоящем документе N-концевую сигнальную последовательность. Согласно некоторым вариантам осуществления сигнальная последовательность прикреплена к N-концу раскрытой в настоящем документе комплементарной аффинной молекулы.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанный в настоящем документе полипептид слияния содержит спейсерный пептид, например, спейсер из 14 остатков (GSPGISGGGGGILE) (SEQ ID NO:15), отделяющий антиген от комплементарной аффинной молекулы. Кодирующая последовательность такого короткого спейсера может быть сконструирована путем отжига комплементарной пары праймеров. Специалист в настоящей области техники может разработать и синтезировать олигонуклеотиды, которые будут кодировать выбранный спейсер. Спейсерные пептиды, как правило, должны содержать неполярные аминокислотные остатки, такие как глицин и пролин.
Стандартные техники, известные специалистам в настоящей области техники, могут использоваться для введения мутаций (для создания аминокислотных замен в антигенной полипептидной последовательности описанного в настоящем документе полипептида слияния, например, в антигене в нуклеотидной последовательности, кодирующей описанный в настоящем документе полипептид слияния, включая в себя, например, сайт-направленный мутагенез и опосредованный ПЦР мутагенез. Предпочтительно, вариантный полипептид слияния содержит менее чем 50 аминокислотных замен, менее чем 40 аминокислотных замен, менее чем 30 аминокислотных замен, менее чем 25 аминокислотных замен, менее чем 20 аминокислотных замен, менее чем 15 аминокислотных замен, менее чем 10 аминокислотных замен, менее чем 5 аминокислотных замен, менее чем 4 аминокислотных замены, менее чем 3 аминокислотных замены, или менее чем 2 аминокислотных замены, включительно, относительно описанных в настоящем документе полипептидов слияния.
В кодирующей последовательности ДНК также могут быть произведены определенные молчащие или нейтральные миссенс-мутации, которые не изменяют кодируемую аминокислотную последовательность или способность стимулировать трансмембранную доставку. Эти типы мутаций применимы для оптимизации частоты использования кодона или для улучшения экспрессии и продукции рекомбинантного белка.
Специфический сайт-направленный мутагенез кодирующей последовательности для полипептида слияния в векторе может использоваться для создания специфических аминокислотных мутаций и замен. Сайт-направленный мутагенез может быть проведен с использованием, например, набора QUICKCHANGE® для сайт-направленного мутагенеза от Stratagene согласно инструкциям производителя.
Согласно одному варианту осуществления в настоящем документе описаны векторы экспрессии, содержащие кодирующую последовательность ДНК для описанных в настоящем документе полипептидов для экспрессии и очищения рекомбинантного полипептида, полученного из системы экспрессии белка с использованием клеток хозяина, выбранных из, например, бактерий, клеток млекопитающих, насекомых, дрожжей или растений. Вектор экспрессии должен содержать обязательные 5' против хода транскрипции и 3' по ходу транскрипции регуляторные элементы, такие как промоторные последовательности, сайт рибосомного распознавания и ТАТА-бокс, и 3' UTR AAUAAA последовательность терминации транскрипции для высокоэффективной транскрипции и трансляции генов в их соответственной клетке хозяина. Вектор экспрессии, предпочтительно, представляет собой вектор, содержащий промотор транскрипции, выбранный из группы, состоящей из следующего: промотор CMV (цитомегаловируса), промотор RSV (вируса саркомы Рауса), β-актиновый промотор, промотор SV40 (вируса обезьян 40) и промотор мышечной креатинкиназы, и терминатор транскрипции, выбранный из группы, состоящей из SV40 поли(А) и BGH терминатора; более предпочтительно, вектор экспрессии, содержащий последовательность раннего промотора/энхансера цитомегаловируса и триплетную лидерную/интронную последовательность аденовируса и содержащий источник репликации и поли(А) последовательность SV40. Вектор экспрессии может содержать дополнительные кодирующие участки, такие как кодирующие, например, 6X-гистидин, V5, тиоредоксин, глутатион-S-трансферазу, с-Мус, VSV-G, ВПГ, FLAG, связывающий мальтозу пептид, связывающий металл пептид, НА и сигналы "секреции" (пчелиный мелиттин, □ α-фактор, PHO, Bip), которые могут быть встроены в экспрессированный полипептид слияния. Кроме того, могут иметь место сайты ферментативной обработки, встроенные после этих кодирующих участков для облегчения их ферментативного удаления, если они больше не нужны. Эти дополнительные нуклеиновые кислоты применимы для обнаружения экспрессии полипептида слияния, для очищения белка с помощью аффинной хроматографии, усиленной растворимости рекомбинантного белка в цитоплазме хозяина и/или для секреции экспрессированного полипептида слияния в культуральные среды или сферопласт дрожжевых клеток. Экспрессия полипептида слияния может быть конститутивной в клетках хозяина или она может быть индуцирована, например, с помощью сульфата меди, таких сахаров, как галактоза, метанола, метиламина, тиамина, тетрациклина, инфицирования бакуловирусом и (изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида) IPTG, стабильного синтетического аналога лактозы.
Согласно другому варианту осуществления вектор экспрессии, содержащий описанные в настоящем документе полинуклеотид, представляет собой вирусный вектор, такой как векторы аденовируса, аденоассоциированный вируса (AAV), ретровируса и лентивируса, среди прочих. Рекомбинантные вирусы представляют многоцелевую систему исследований генной экспрессии и терапевтических применений.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе полипептиды слияния экспрессируются из вирусной инфекции клеток млекопитающих. Вирусные векторы могут представлять собой, например, аденовирус, аденоассоциированный вирус (AAV), ретровирус и лентивирус. Упрощенная система получения рекомбинантных аденовирусов представлена Не et al., 95 PNAS 2509 (1998). Интересующий ген вначале клонируют в шаттл-вектор, например, pAdTrack-CMV. Полученную плазмиду линеаризуют путем обработки рестрикционной эндонуклеазой PmeI, и впоследствии котрансформируют в Е. coli. Клетки BJ5183 с плазмидой с аденовирусным остовом, например, pADEASY-1 Stratagene ADEASY™ аденовирусная векторная система. Рекомбинантные аденовирусные векторы подвергают селекции на устойчивость к канамицину, и рекомбинацию подтверждают анализом с помощью рестрикционной эндонуклеазы. В итоге, линеаризованную рекомбинантную плазмиду трансфицируют в линию упаковывающих аденовирусы клеток, например, клетки HEK 293 (E1-трансформированные эмбриональные клетки почки человека) или 911 (E1-трансформированные эмбриональные ретинальные клетки человека). Fallaux, et al. 7 Human Gene Ther. 215 (1996). Рекомбинантные аденовирусы получают в клетках HEK 293.
Рекомбинантный лентивирус характеризуется преимуществом в доставке и экспрессии полипептидов слияния в делящиеся и неделящиеся клетки млекопитающих. Основанная на ВИЧ-1 лентивирусная система может эффективно трансдуцировать более широкий диапазон хозяев, чем основанный на вирусе лейкоза Молоуни (MoMLV) ретровирусные системы. Получение рекомбинантного лентивируса может быть достигнуто с использованием, например, векторов pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ или pLenti вместе с лентивирусными системами экспрессии VIRAPOWER™ от Invitrogen, Inc.
Рекомбинантные векторы аденоассоциированного вируса (rAAV) применимы к широкому диапазону клеток хозяина, включая в себя многие различные клеточные линии или ткани человека и не относящиеся к человеку. rAAV способны трансдуцировать широкий диапазон клеточных типов и трансдукция не зависит от активного деления клетки хозяина. Высокие титры, >108 вирусных частиц/мл, легко получают в супернатанте и 1011-1012 вирусных частиц/мл с дополнительной концентрацией. Трансген интегрируется в геном хозяина, поэтому экспрессия является длительной и стабильной.
Получение в промышленных масштабах векторов AAV осуществляется путем трехплазмидной котрансфекции линии упаковывающих клеток: вектор AAV, несущий кодирующую нуклеиновую кислоту, вектор AAV RC, содержащий гены AAV rep и cap, и аденовирусная хелперная плазмида pDF6, в 50×150 мм планшетах субконфлюэнтных 293 клеток. Клетки собирают через три дня после трансфекции и вирусы высвобождают путем трех циклов замораживания-оттаивания или путем обработки ультразвуком.
Векторы AAV могут быть очищены двумя различными способами в зависимости от серотипа вектора. Вектор AAV2 очищают путем одностадийного безнапорного колоночного способа очищения на основании его аффинности к гепарину. Auricchio et. al., 12 Human Gene Ther. 71 (2001); Summerford & Samulski, 72 J. Virol. 1438 (1998); Summerford & Samulski, 5 Nat. Med. 587 (1999). Векторы AAV2/1 и AAV2/5 в настоящее время очищают с помощью трех последовательных градиентов CsCl.
Не желая быть связанным теорией, когда белки экспрессируются клеткой, включая в себя бактериальную клетку, то белки направляются к конкретной части в клетке или секретируются из клетки. Таким образом, направление белка или сортировка белка представляет собой механизм, с помощью которого клетка транспортирует белки к соответствующим частям в клетке или вне ее. Целями сортировки могут быть внутреннее пространство органеллы, любая из нескольких внутренних мембран, внешняя мембрана клетки или ее окружение посредством секреции. Этот процесс доставки осуществляется на основании информации, содержащейся в самом белке. Правильная сортировка является ключевой для клетки; ошибки могут привести к заболеваниям.
За некоторым исключением бактерии не содержат ограниченных мембранами органелл, которые встречаются у эукариот, но они могут собирать белки на различных типах включений, таких как газовые везикулы и накопительные вакуоли. Также в зависимости от вида бактерий бактерии могут содержать одну плазматическую мембрану (грамположительные бактерии) или как внутреннюю (плазматическую) мембрану, так и внешнюю мембрану клеточной стенки, с водным пространством между ними, которое называется периплазма (грамотрицательные бактерии). Белки могут секретироваться в окружение, в соответствии с тем, имеет ли место внешняя мембрана. Основной механизм на плазматической мембране аналогичен с тем, который характерен для эукариотической клетки. Кроме того, бактерии могут направлять белки во внешнюю мембрану или через нее. Системы секреции белков через бактериальную внешнюю мембрану могут быть достаточно сложными, и они играют ключевые роли в патогенезе. Эти системы могут быть описаны как секреция I типа, секреция II типа и т.д.
У большинства грамположительных бактерий определенные белки направляются для выведения через плазматическую мембрану и последующего ковалентного прикрепления к бактериальной клеточной стенке. Специализированный фермент, сортаза, отщепляет целевой белок на характерном сайте распознавания вблизи С-конца белка, такого как мотив LPXTG (SEQ ID NO:16) (где Х может представлять собой любую аминокислоту), затем переносит белок на клеточную стенку. Система аналогична сортазе/LPXTG, содержащая мотив PEP-CTERM (SEQ ID NO:17), имеющая название экзосортаза/PEP-CTERM, предположительно, существует у широкого спектра грамотрицательных бактерий.
Белки с подходящими N-концевыми направляющими сигналами синтезируются в цитоплазме и затем направляются на специфический путь транспорта белка. В ходе, или сокращено, после его транслокации через цитоплазматическую мембрану белок процессируется и подвергается укладке в его активную форму. Затем транслоцированный белок либо удерживается на периплазматической стороне клетки или высвобождается в окружающее пространство. Поскольку сигнальные пептиды, которые направляют белки к мембране являются ключевыми детерминантами для специфичности транспортного пути, то эти сигнальные пептиды классифицируются в соответствии с транспортным путем, по которому они направляют белки. Классификация сигнальных пептидов основана на типе сигнальной пептидазы (8Разы), которая отвечает за удаление сигнального пептида. Большинство экспортируемых белков экспортируется из цитоплазмы через общий "секреторный (Sec) путь". Большинство хорошо известных факторов вирулентности (например, экзотоксины Staphylococcus aureus, защитный антиген Bacillus anthracis, листериолизин О Listeria monocytogenes), которые секретируются грамположительными патогенами, содержат типичный N-концевой сигнальный пептид, который будет приводить их на Sec-путь. Белки, которые секретируются посредством этого пути, транслоцируются через цитоплазматическую мембрану в развернутом состоянии. Последующий процессинг и укладка этих белков имеет место в пространстве клеточной стенки на противоположной стороне мембраны. В дополнение к Sec системе некоторые грамположительные бактерии также содержат Tat-систему, которая способна транслоцировать уложенные белки через мембрану. Патогенные бактерии могут содержать определенные специализированные экспортные системы, которые, в частности, вовлечены в транспорт только нескольких белков. Например, были установлены некоторые генные кластеры в микобактериях, которые кодируют белки, секретируемые в окружающее пространство посредством специфических путей (ESAT-6) и являются важными для микобактериального патогенеза. Специфические транспортеры АТФ-связывающей кассеты (АВС) направляют экспорт и процессинг только малых антибактериальных пептидов, имеющих название бактериоцины. Гены для эндолизинов, которые отвечают за начало бактериального лизиса, часто расположены вблизи генов, которые кодируют холиноподобные белки, позволяя предположить, что эти холины отвечают за экспорт эндолизинов к клеточной стенке. Wooldridge, BACT. SECRETED PROTS: SECRETORY MECHS. & ROLE IN PATHOGEN. (Caister Academic Press, 2009)
Согласно некоторым вариантам осуществления применимая согласно настоящему изобретению сигнальная последовательность представляет собой OmpA сигнальную последовательность, тем не менее, любая сигнальная последовательность, широко известная специалистам в настоящей области техники, которая обеспечивает транспорт и секрецию противомикробных средств вовне инфицированных бактериофагом клетки, предусмотрена для применения согласно настоящему изобретению.
Сигнальная последовательность, которая направляет секрецию белков из бактериальных клеток, хорошо известна в настоящей области техники, например, как раскрыто в международной заявке WO 2005/071088. Например, можно использовать несколько не ограничивающих примеров сигнального пептида, представленных в таблице 4, который может быть прикреплен к амино-концу или карбоксильному концу противомикробного пептида (Amp) или противомикробного полипептида для экспрессии бактериофага, сконструированного для получения противомикробного средства, например, АМР-сконструированного бактериофага. Прикрепление может осуществляться посредством слияния или химерной композиции с выбранным антигеном или белком слияния антигена с комплементарной аффинной молекулой, приводя к секреции из бактерии, инфицированной бактериофагом, сконструированным для получения противомикробного средства, например АМР-сконструированным бактериофагом.
Описанные в настоящем документе полипептиды, например, антигены или белок слияния антигена с комплементарной аффинной молекулой, могут быть экспрессированы и очищены разнообразными известными специалисту в настоящей области техники способами, например, описанные в настоящем документе полипептиды слияния могут быть очищены из любой подходящей системы экспрессии. Полипептиды слияния могут быть очищены до существенной степени чистоты стандартными техниками, включая в себя селективно осаждение с такими веществами, как сульфат аммония; колоночная хроматография, иммуносорбционные способы очищения и другие; которые хорошо известны в настоящей области техники. Смотри, например, Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES & PRACTICE (1982); патент США №4673641.
Ряд процедуры может быть использован, когда рекомбинантные белки очищены. Например, белки, характеризующиеся доказанными молекулярно-адгезивными свойствами, могут быть обратимо слиты с белком выбора. С подходящим лигандом белок может быть селективно адсорбирован на очистительной колонке и затем выделен из колонки в относительно чистой форме. Слитый белок затем удаляют с помощью ферментативной активности. В итоге, белок выбора может быть очищен с использованием аффинных или иммуноаффинных колонок.
После того, как белок экспрессировался в клетках хозяина, клетки хозяина могут быть лизированы для освобождения экспрессированного белка для очищения. Способы лизирования различных клеток хозяина описаны в "Sample Preparation-Tools for Protein Research" EMD Bioscience и в Current Protocols in Protein Sciences (CPPS). Примером способа очищения является аффинная хроматография, такая как металло-аффинная хроматография с использованием аффинных смол никеля, кобальта или цинка для меченных гистидином полипептидов слияния. Способы очищение меченных гистидином рекомбинантных белков описаны Clontech с использованием их кобальтовой смолы TALON® и NOVAGEN® в их руководстве по системе рЕТ, 10-е издание. Другая предпочтительная стратегия очищения представляет собой иммуноаффинную хроматографию, например, смола, конъюгирующая антитело к myc, может использоваться для аффинного очищения меченных туе полипептидов слияния. Если присутствуют последовательности распознавания соответствующих протеаз, полипептиды слияния могут отщепляться от гистидиновой или myc-метки, высвобождая полипептид слияния из аффинной смолы, в то время как гистидиновые метки и myc-метки остаются прикрепленными к аффинной смоле.
Стандартные техники разделения белка для очищения рекомбинантных и встречающихся в природе белков хорошо известны в настоящей области техники, например, фракционирование по растворимости, эксклюзионная гель-фильтрация и различные типы колоночной хроматографии.
Фракционирование по растворимости: Часто в качестве начальной стадии, особенно если белковая смесь является сложной, начальной солевое фракционирование может отделить многие из нежелательных белков клеток хозяина (или белков, полученных из клеточных культуральных сред) от интересующего белка. Предпочтительной солью является сульфат аммония. Сульфат аммония осаждает белки путем эффективного снижения количества воды в белковой смеси. Белки затем осаждаются на основании их растворимости. Чем более гидрофобным является белок, тем более вероятно он осядет при более низких концентрациях сульфата аммония. Типичный протокол включает в себя добавление насыщенного сульфата аммония к раствору белка так, чтобы полученная концентрация сульфата аммония составляла 20-30%. Эта концентрация будет осаждать наиболее гидрофобные из белков. Осадок затем удаляют (если только интересующий белок не является гидрофобным) и сульфат аммония добавляют к супернатанту до концентрации, которая, как известно, осаждает интересующий белок. Осадок затем растворяют в буфере и избыток соли удаляют при необходимости, или посредством диализа, или диафильтрации. Другие способы, которые основаны на растворимости белков, такие как осаждение холодного этанола, хорошо известны специалистам в настоящей области техники и могут использоваться для фракционирования сложных белковых смесей.
Эксклюзионная гель-фильтрация: Молекулярная масса белка выбора может использоваться для выделения его из белков большего и меньшего размера с использованием ультрафильтрации через мембраны с различным размером пор (например, мембраны AMICON® или MILLIPORE®). В качестве первой стадии белковую смесь подвергают ультрафильтрации через мембрану с размером пор, который имеет меньшее пороговое значение молекулярной массы, чем молекулярная масса интересующего белка. Концентрат ультрафильтрации затем подвергают ультрафильтрации через мембрану с большим пороговым значением молекулярной массы, чем молекулярная масса интересующего белка. Рекомбинантный белок будет проходить через мембрану в фильтрат. Фильтрат может затем быть подвергнут хроматографии, как описано ниже.
Колоночная хроматография: Белок выбора может также быть отделен от других белков на основании его размера, поверхностного заряда, гидрофобности и аффинности к лигандам. Кроме того, антитела, вырабатывающиеся к рекомбинантным или встречающимся в природе белкам, могут быть конъюгированы с матрицами колонок и белки могут быть очищены иммунособрентным способом. Все эти способы хорошо известны в настоящей области техники. Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что хроматографические техники могут быть проведены в любом масштабе и с использованием оборудования от многих различных производителей (например, Pharmacia Biotech). Например, антиген полипептид может быть очищен с использованием РА63 гептамерной колонки для аффинной хроматографии. Singh et al., 269, J. Biol. Chem. 29039 (1994).
Согласно некоторым вариантам осуществления комбинация стадий очищения, содержащая, например: (а) ионообменную хроматографию, (b) гидроксиапатитную хроматографию, (с) хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия и (d) экслюзионную хроматографию, может использоваться для очищения описанных в настоящем документе полипептидов слияния.
Также предусмотрены бесклеточные системы экспрессии. Бесклеточные системы экспрессии предлагают некоторые преимущества по сравнению с традиционными клеточными способами экспрессии, включая в себя простоту модификации условий реакции для содействия укладке белка, сниженную чувствительность к токсичности продукта и пригодность для стратегий с высокой производительностью, таких как быстрый скрининг экспрессии или получение белка в больших количествах, благодаря сниженным объемам реакции и времени обработки. Бесклеточная система экспрессии может использовать плазмидную или линейную ДНК. Более того, улучшения в эффективности трансляции привели к уровням выхода, которые превышают миллиграмм белка на миллилитр реакционной смеси. Коммерчески доступные бесклеточные системы экспрессии включают в себя системы связанного с TNT ретикулоцитарного лизата (Promega), которые используют основанную на ретикулоцитах кролика in vitro систему.
Составы иммунной композиции и способы применения
Специфические варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают применение раскрытых в настоящем документе иммуногенных композиций для активации иммунного ответа у животного. Более конкретно, композиции вызывают как гуморальный, так и клеточный иммунитет, и во многих случаях иммунитет слизистых оболочек. Варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают по меньшей мере частичную защиту от или частичное улучшение после инфицирования, в частности, пневмококком. Пневмококки вызывают ряд таких заболеваний, как менингит, пневмония, бактериемия и отит среднего уха. Каждый год почти один миллион детей умирает от пневмококковых заболеваний во всем мире. Были тщательно изучен S. pneumoniae, и по меньшей мере некоторые геномы секвенированы. Смотри, например, патент США №7141418. Хотя антитела к капсульным полисахаридам, которые определяют известные серотипы, обеспечивают специфическую для серотипа защиту, были описаны другие защитные механизмы иммунитета. Смотри Malley et al., 88 J. Mol. Med. 135 (2010). Эти другие защитные механизмы включают в себя без ограничения антитела к некапсульным антигенам и Т-клеточные ответы к пневмококковым компонентам. Применение основанной на конъюгате белка и полисахарида вакцины, PCV7, значительно снижало заболевания. Black et al., 24(S2) Vaccine 79 (2006); Hansen et al., 25 Pediatr. Infect. Dis. J. 779 (2006)). При этом недавние исследования показали, что отсутствие других серотипов в PCV7 приводило к появлению замещающих пневмококковых серотипов. Pichichero & Casey, 26(S10) Pediatr. Infect. Dis. J. S12 (2007).
Было показано, что определенные пневмококковые антигены, распространенные для всех серотипов вида, характеризуются иммунозащитным потенциалом, несмотря на инкапсулирование, например, поверхностные белки PspA, PspC, PsaA и цитотоксин пневмолизин или пневмолизоидные мутанты (Basset et al., 75 Infect. Immun. 5460 (2007); Briles et al., 18 Vaccine 1707 (2000)); применение геномики и мутационных библиотек установило несколько дюжин дополнительных общих для вида белков (Hava & Camilli, 45 Mol. Microbiol. 1389 (2002); Wizemann et al., 60 Infect. Immun. 1593 (2001)). Иммунитет индуцировался отдельными антигенами в животных моделях (Alexander et al., 62 Infect. Immun. 5683 (1994); Balachandran et al., 70 Infect. Immun. 2526 (2002); Chung et al., 170 J. Immunol. 1958 (2003); Glover et al., 76 Infect. Immun. 2767 (2008); Wu et al., 175 J. Infect. Dis. 839 (1997)), но ни одна вакцина на основании общего антигена не была одобрена к настоящему времени для применения у людей.
Согласно одному варианту осуществления в настоящем документе предусмотрен способ вакцинации млекопитающего, включающий введение иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один или множественные антигены, прикрепленные по меньшей мере к одному типу полимерного каркаса, например, полисахаридному или углеводному полимеру, для применения в активации иммунного ответа в отношении одного или нескольких антигенов, прикрепленных к полимеру при введении субъекту. Согласно некоторым вариантам осуществления иммунный ответ представляет собой гуморальный и/или клеточный иммунный ответ.
Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к способам активации иммунного ответа у субъекта, включающим введение субъекту иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один тип полимера, например, полисахарид, по меньшей мере один антиген и по меньшей мере одну комплементарную пару аффинных молекул, содержащую (i) первую аффинную молекулу, которая связывается с полимером, например, полисахаридом, и (ii) комплементарную аффинную молекулу, которая связывается с антигеном, для прикрепления антигена к полимеру, например, полисахариду, (например, первая аффинная молекула связывается с комплементарной аффинной молекулой для сшивания антигена с полимером, например, полисахаридом).
Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к способам активации гуморального и/или клеточного иммунитета в отношении множественных антигенов одновременно, например, где иммуногенная композиция, вводимая субъекту, содержит полимер, содержащий по меньшей мере 1, или по меньшей мере 2, или более, например, множество одинаковых или различных антигенов.
Один аспект настоящего изобретения относится к способу иммунизации или вакцинации субъекта, например, птицы или млекопитающего, например, человека против патогена, который предусматривает введение раскрытой в настоящем документе иммунной композиции, содержащей по меньшей мере один антиген, полученный из одного или нескольких патогенов. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект может быть иммунизирован против по меньшей мере 1, или по меньшей мере 2, или по меньшей мере 2, или по меньшей мере 3, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере приблизительно 20, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере приблизительно 100, или более чем 100 различных патогенов одновременно, где полимер иммуногенной композиции является соответствующим различным прикрепленным антигенам.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъекту могут быть введены несколько различных иммуногенных композиций, раскрытых в настоящем документе, например, субъекту может быть введена композиция, содержащая полимер с антигеном или множество антигенов, например, антигены А, В, С и D и т.д., а также введена композиция, содержащая полимер, содержащий другой антиген или другой набор антигенов, например, антигены W, X, Y и Z и т.д. Альтернативно, субъекту может быть введена композиция, содержащая полимер А с антигеном или множество антигенов, например, антигены А, В, С и D и т.д., а также введена композиция, содержащая полимер В, содержащий такие же, например, антигены А, В, С и D и т.д., или другой набор антигенов. Предусматривается, что настоящее изобретение относится к способам иммунизации субъекта с помощью стольких антигенов, сколько необходимо, например, разнообразия различных иммуногенных комплексов, описанных в настоящем документе, для обеспечения иммунизации с помощью более чем 100 или более антигенов.
Согласно одному варианту осуществления описанные в настоящем документе иммуногенные композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель. Согласно другому варианту осуществления описанную в настоящем документе иммуногенную композицию составляют для введение птице, млекопитающему или человеку, в качестве вакцины или в вакцине. Подходящие составы можно найти, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (2006) или Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms (4-е изд., Lea & Febiger, Philadelphia, 1985).
Согласно одному варианту осуществления описанные в настоящем документе иммуногенные композиции содержат фармацевтически приемлемые носители, которые по природе нетоксичны и не являются терапевтическими. Примеры таких носителей включают в себя следующее: ионообменные соединения, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, такие сывороточные белки, как альбумин сыворотки человека, такие буферные вещества, как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат натрия, смеси неполного глицерида насыщенных растительных жирных кислот, вода, соли или такие электролиты, как протаминсульфат, фосфат натрия двузамещенный, фосфат калия двузамещенный, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный кремнезем, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы и полиэтиленгликоль. традиционные формы хранения соответствующим образом используютя для всех типов введения. Такие формы включают в себя, например, микрокапсулы, нанокапсулы, липосомы, пластыри, ингаляционные формы, назальные спреи, сублингвальные таблетки и препараты замедленного высвобождения. В отношении примеров композиций замедленного высвобождения, смотри патенты США №№3773919, 3887699, европейские патенты №№ ЕР 58481А, ЕР 158277А, патент Канады №1176565; Sidman et al., 22 Biopolymers 547 (1983); Langer et al., 12 Chem. Tech. 98 (1982). Белки, как правило, будут составлены в концентрации приблизительно 0,1 мг/мл - 100 мг/мл на одно применение на одного пациента.
Согласно одному варианту осуществления другие ингредиенты могут быть добавлены к составам вакцин, включая в себя антиоксиданты, например, аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные (менее чем приблизительно десять остатков) полипептиды, например, полиаргинин или трипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая в себя целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; и сахарные спирты, такие как маннит или сорбит.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящие MAPS иммуногенные композиции вводят по меньшей мере с одним адъювантом. Адъюванты представляют собой гетерогенную группу веществ, которые усиливают иммунологический ответ против антигена, которые вводят одновременно. В некоторых случаях, адъюванты улучшают иммунный ответ так, что требуется меньше вакцины. Адъюванты служат для приведения антигена - вещество, которое стимулирует специфический защитный иммунный ответ - в контакт с иммунной системой и влияют на тип вызываемого иммунитета, а также качество иммунного ответа (величину или длительность). Адъюванты могут также снижать токсичность определенных антигенов; и обеспечивать растворимость некоторых компонентов вакцины. Почти все адъюванты, используемые на сегодняшний день для усиления иммунного ответа против антигенов, представляют собой частицы или образуют частицы вместе с антигеном. В книге VACCINE DESIGN - SUBUNIT & ADJUVANT APPROACH (Powell & Newman, Eds., Plenum Press, 1995), многие известные адъюванты описаны как с точки зрения их иммунологической активности, так и в отношении их химических характеристик. Тип адъювантов, которые не образуют частицы, представляют собой группу веществ, которые действуют как иммунологические сигнальные вещества и которые при нормальных условиях состоят из веществ, которые образованы иммунной системой как следствие иммунологической активации после введения дисперсных адъювантных систем.
Адъюванты для иммуногенных композиций и вакцин хорошо известны в настоящей области техники. Примеры включают в себя без ограничения моноглицериды и жирные кислоты (например, смесь моноолеина, олеиновой кислоты и соевого масла); минеральные соли, например, гидроксид алюминия и гели фосфата алюминия или кальция; масляные эмульсии и составы на основе поверхностно-активных веществ, например, MF59 (микрофлюидизированная стабилизированная детергентом эмульсия масло-в-воде), QS21 (очищенный сапонин), AS02 [SBAS2] (эмульсия масло-в-воде + MPL + QS-21), MPL-SE, Montanide ISA-51 и ISA-720 (стабилизированная эмульсия вода-в-масле); дисперсные адъюванты, например, виросомы (однослойные липосомные носители, включающие гемагглютинин гриппа), AS04 ([SBAS4] А1 соль с MPL), ISCOMS (структурированный комплекс сапонинов и липидов), сополимер лактида и гликолида (PLG); производные микроорганизмов (естественные и синтетические), например, монофосфориллипид A (MPL), Detox (MPL + М. Phlei скелет клеточной стенки), AGP [RC-529] (синтетический ацилированный моносахарид), Detox-PC, DC_Chol (липоидные иммуностимуляторы, способные к самоорганизации в липосомы), ОМ-174 (производное липида А), мотивы CpG (синтетические олигонуклеотиды, содержащие иммуностимулирующие мотивы CpG) или другие ДНК структуры, модифицированные LT и СТ (генетически модифицированные бактериальные токсины для обеспечения нетоксических адъювантных эффектов); эндогенные иммуномодуляторы человека, например, hGM-CSF или hIL-12 (цитокины, которые могут быть введены или в виде белка, или кодируются плазмидой), Immudaptin (C3d тандемный повтор), MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, В-алетин, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, Alum и MF59 и инертные носители, такие как частицы золота. Дополнительные адъюванты известны в настоящей области техники, смотри, например, патент США №6890540; публикацию заявки на патент США №2005; 0244420; международную патентную заявку PCT/SE97/01003.
Согласно некоторым вариантам осуществления адъювант является дисперсным и может характеризоваться тем, что является медленно биоразлагаемым. Следует уделить внимание тому, чтобы убедиться, что адъювант не образует токсических метаболитов. Предпочтительно, согласно некоторым вариантам осуществления такие адъюванты могут представлять собой используемые матрицы, главным образом, вещества, имеющие свое происхождение в организме. Они включают в себя полимеры молочной кислоты, полиаминокислоты (белки), углеводы, липиды и биосовместимые полимеры с низкой токсичностью. Также использоваться могут комбинации этих групп веществ, происходящих из организма, или комбинации веществ, происходящих из организма, и биосовместимых полимеров. Липиды являются предпочтительными веществами, поскольку они экспонируют структуры, которые делают их биоразлагаемыми, а также на основании того факта, что она являются ключевым элементом во всех биологических мембранах.
Согласно одному варианту осуществления описанные в настоящем документе иммуногенные композиции для введения должны быть стерильными для введения субъекту. Стерильность легко достигается путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны (например, 0,2 микронные мембраны), или с помощью гамма-облучения.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе иммуногенные композиции дополнительно содержат фармацевтические вспомогательные вещества, включая в себя без ограничения биосовместимые масла, физиологические солевые растворы, консерванты, углевод, белок, аминокислоты, контролирующие осмотическое давление средства, газы-носители, контролирующие рН средства, органические растворители, гидрофобные средства, ингибиторы ферментов, гигроскопические полимеры, поверхностно-активные вещества, промоторы абсорбции и антиоксиданты. Иллюстративные примеры углеводов включают в себя следующее: растворимые сахара, такие как гидроксипропилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, карбоксилцеллюлоза натрия, гиалуроновая кислота, хитозан, альгинат, глюкоза, ксилоза, галактоза, фруктоза, мальтоза, сахароза, декстран, хондроитин сульфат и т.д. Иллюстративные примеры белков включают в себя альбумин, желатин и т.д. Иллюстративные примеры аминокислот включают в себя глицин, аланин, глутаминовую кислоту, аргинин, лизин и их соли. Такие фармацевтические вспомогательные вещества хорошо известны в настоящей области техники.
Согласно некоторым вариантам осуществления иммуногенную композицию MAPS вводят в комбинации с другими терапевтическими ингредиентами, включая в себя, например, γ-интерферон, цитокины, химиотерапевтические средства или противовоспалительные или противовирусные средства. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытая в настоящем документе иммуногенная композиция может быть введена с одной или несколькими раскрытыми в настоящем документе костимулирующими молекулами и/или адъювантами.
Согласно некоторым вариантам осуществления иммуногенную композицию вводят в чистой или, по сути, чистой форме, но она может быть введена в виде фармацевтической композиции, состава или препарата. Такой состав содержит описанную в настоящем документе MAPS вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно другими терапевтическими ингредиентами. Другие терапевтические ингредиенты включают в себя соединения, которые усиливают презентацию антигена, например, гамма-интерферон, цитокины, химиотерапевтические средства или противовоспалительные средства. Составы могут для удобства быть представлены в стандартной дозированной форме и могут быть получены с помощью способов, хорошо известных в фармацевтической области техники. Например, в Plotkin and Mortimer, в VACCINES (2-е изд., W.B. Saunders Co., 1994) описана вакцинация животных или людей для индукции иммунного ответа, специфического для конкретных патогенов, а также способы получения антигена, определения подходящей дозы антигена и анализ индукции иммунный ответ.
Составы, подходящие для внутривенного, внутримышечного, интраназального, перорального, сублингвального, вагинального, ректального, подкожного или интраперитонеального введение в целях удобства содержат стерильные водные растворы активного ингредиента с растворами, которые предпочтительно являются изотоничными крови реципиента. Такие составы могу в целях удобства быть получены путем растворения твердого активного ингредиента в воде, содержащей физиологически совместимые вещества, такие как хлорид натрия (например, 0,1 М - 2,0 М), глицин и подобное, и придавая поддерживаемый буфером рН, совместимый с физиологическими условиями для получения водного раствора, и делая раствор стерильным. Они могут присутствовать в однодозовых или много дозовых контейнерах, например, герметичных ампулах или флаконах.
Липосомные суспензии могут также использоваться в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены согласно способам, известным специалистам в настоящей области техники, например, описанным в патенте США №4522811.
Составы для интраназальной доставки описаны в патентах США №№5427782, 5843451, 6398774.
Составы иммуногенных композиций могут содержать стабилизатор. Иллюстративные стабилизаторы представляют собой полиэтиленгликоль, белки, сахарид, аминокислоты, неорганические кислоты и органические кислоты, которые может быть использованы или отдельно, или в виде смесей. Два или более стабилизатора могут быть использованы в водных растворах при подходящей концентрации и/или рН. Специфическое осмотическое давление в таком водном растворе, как правило, находится в диапазоне 0,1-3,0 осмоль, предпочтительно в диапазоне 0,80-1,2. рН водного раствора доводят так, чтобы этот показатель находился в диапазоне рН 5,0-9,0, предпочтительно в диапазоне рН 6-8.
Если необходимы пероральные препараты, то иммуногенные композиции могут комбинироваться с типичными носителями, такими как лактоза, сахароза, крахмал, тальк, стеарат магния, кристаллическая целлюлоза, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, глицерин, альгинат натрия или гуммиарабик среди прочего.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе иммуногенные композиции могут быть введены внутривенно, интраназально, внутримышечно, подкожно, интраперитонеально, сублингвально, вагинально, ректально или перорально. Согласно некоторым вариантам осуществления путь введения является пероральным, интраназальным, подкожным или внутримышечным. Согласно некоторым вариантам осуществления путь введения представляет собой интраназальное введение.
Вакцинация может проведена традиционными способами. Например, иммуногенные композиции могут использоваться в подходящем разбавителе, таком как солевой раствор или вода, или полные или неполные адъюванты. Иммуногенная композиция может быть введена любым путем, подходящим для активации иммунного ответа. Иммуногенная композиция может быть введена однократно или с периодическими интервалами, пока не будет вызван иммунный ответ. Иммунные ответы могут быть обнаружены с помощью разнообразных способов, известных специалистам в настоящей области техники, включая в себя без ограничения продукцию антител, анализ цитотоксичности, анализ пролиферации и анализы высвобождения цитокинов. Например, образцы крови могут быть собраны из иммунизированного млекопитающего и проанализированы на присутствие антител против антигенов иммуногенной композиции с помощью ELISA (смотри de Boer et. al., 115 Arch Virol. 147 (1990) и титр этих антител может быть определен с помощью известных в настоящей области техники способов.
Точная доза для использования в составе будет также зависеть от пути введения и должна быть установлена согласно решению практикующего врача и обстоятельств каждого пациента. Например, диапазон 25 мкг - 900 мкг общего белка может быть введен раз в месяц в течение трех месяцев.
В конце концов, лечащий врач будет решать количество иммуногенной композиции или вакцинной композиции для введения конкретным индивидуумам. Как в случае всех иммуногенных композиций или вакцин, иммунологически эффективные количества иммуногенов должны определяться опытным путем. Факторы, которые должны быть учтены, включают в себя иммуногенность, будет ли или нет иммуноген образовывать комплекс или ковалентно прикрепляться к адъюванту или белку-носителю или другому носителю, пути введений и количество иммунизационных дозировок, подлежащих введению. Такие факторы известны в области техники, относящейся к вакцинам и находятся в пределах квалификации иммунологов, чтобы произвести такие определения без излишнего экспериментирования.
Наборы
Настоящее изобретение также предусматривает наборы для получения раскрытой в настоящем документе иммуногенной композиции, которые являются полезными для исследователя для адаптации иммуногенной композиции с их предпочтительными антигенами, например, для исследовательских целей для оценки эффекта антигена или комбинации антигенов на иммунный ответ. Такие наборы могут быть получены из уже доступных материалов и реагентов. Например, такие наборы могут содержать любой один или несколько из следующих материалов: контейнер, содержащий полимер, например, полисахарид, сшитый с множеством первых аффинных молекул; и контейнер, содержащий комплементарную аффинную молекулу, которая связывается с первой аффинной молекулой, причем комплементарная аффинная молекула связывается с антигеном.
Согласно другому варианту осуществления набор может содержать контейнер, содержащий полимер, например, полисахарид, контейнер, содержащий множество первых аффинных молекул, и контейнер, содержащий сшивающий реагент для сшивания первых аффинных молекул с полимером.
Согласно некоторым вариантам осуществления набор дополнительно содержит средство для прикрепления комплементарной аффинной молекулы к антигену, где средство может осуществляться с помощью сшивающего реагента или некоторого промежуточного белка слияния. Согласно некоторым вариантам осуществления набор может содержать по меньшей мере один фактор костимуляции, который может быть добавлен к полимеру. Согласно некоторым вариантам осуществления набор содержит сшивающий реагент, например, без ограничения CDAP (тетрафторборат 1-циано-4-диметиламинопиридиния), EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлорид), цианоборогидрид натрия; цианогенбромид; бикарбонат аммония/йодуксусная кислота для сшивания кофактора с полимером.
Разнообразные наборы и компоненты могут быть получены для применения в описанных в настоящем документе способах в зависимости от предусмотренного применения набора, конкретного целевого антигена и потребностей пользователя.
Согласно одному варианту осуществления описанная в настоящем документе иммуногенная композиция или вакцинная композиция при введении мышам может провоцировать иммунный ответ, который предотвращает симптом заболевания по меньшей мере у 20% животных, сенсибилизированных 5 LD50 иммуногенной композицией, содержащей антигены, симптом заболевания, вызванный которыми, предотвращается. Способы вакцинации и сенсибилизации иммунизированного животного известны специалисту в настоящей области техники. Например, 10 мкг аликвота раскрытой в настоящем документе иммуногенной композиции или вакцинной композиции может быть получена в 100 мкл PBS и/или с добавлением неполного адъюванта Фройнда и введена с помощью внутримышечной инъекции одной мыши за одну вакцинацию. Альтернативно могут использоваться парентеральные, интраперитонеальные инъекции и инъекции в подушечки лап. Объемы инъекций в подушечки лап снижаются до 50 мкл. Мыши могут быть иммунизированы. Мыши могут быть иммунизированы раскрытой в настоящем документе иммуногенной композицией или вакцинной композицией за три раза с течение нескольких дней, например, с 14-дневным интервалом между ними.
Эффективность вакцинации может быть проанализирована с помощью сенсибилизации патогеном. Через семь дней после последней дозы иммуногенной композиции иммунизированных мышей сенсибилизируют интраназально патогенным организмом, из которого происходил антиген. Анестезированные эфиром мыши (10 г - 12 -) могут быть инфицированы интраназально с помощью 50 мкл разведенной в PBS аллантоисной жидкости, содержащей 5 LD50 патогенного организма. Уровень защиты может быть измерен путем мониторинга выживаемости животных и массы тела, которую оценивают в течение 21-дневного периода наблюдения. Тяжело пораженных мышей подвергали эвтаназии. Одна доза LD50 A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 равна 100-1000 дозам в анализе заражения 50% культуры ткани (TCID50).
Согласно другим вариантам осуществления иммунизированные мыши могут быть сенсибилизированы с помощью разнообразия различных патогенных организмов, например, различных патогенных организмов, из которых происходит каждый из антигенов, прикрепленных к полимеру. Например, если иммуногенная композиция содержит пять различных антигенов, прикрепленных к полимеру, например, полисахариду, где каждый антиген происходит из пяти различных патогенных организмов, иммунизированные мыши могут быть сенсибилизированы с помощью каждого из пяти различных патогенных организмов, либо последовательно (в любом порядке), либо одновременно. Специалист в настоящей области техники будет способен определить значение LD50 для каждого патогенного организма, используемого для сенсибилизации иммунизированных мышей с помощью способов, известных в настоящей области техники. Смотри, например, LaBarre & Lowy, 96 J. Virol. Meths. 107 (2001); Golub, 59J. Immunol. 7 (1948).
Хотя вышеизложенное изобретение было описано подробно с целью иллюстрации и приведения примера с целью ясности понимания, специалисту в настоящей области техники будет очевидно в свете сущности настоящего изобретения, что определенные изменения и модификации могут быть произведены в нем, не отклоняясь от сущности и объема прилагаемой формулы изобретения. Изложенное ниже предназначено для иллюстрации настоящего изобретения; тем не менее, практическое осуществление настоящего изобретения не лимитировано или ограничено каким-либо образом примерами.
Примеры
Представленные в настоящем документе примеры относятся к способам создания иммуногенного комплекса, описанного в настоящем документе, и его способам и композициям. В частности, примеры относятся к способам получения комплекса презентации множественных антигенов (MAP), раскрытого в настоящем документе, и способам применения для генерации иммунного ответа у субъекта.
Пример 1. Конструкция рекомбинантного ризавидина и белков слияния ризавидинас антигеном
Рекомбинантный ризавидин (rRhavi), используемый в этих исследованиях, представляет собой модифицированную по N-концу версию, которая содержит только остатки 45-179 белка дикого типа. Для оптимизации уровня экспрессии rRhavi в Е. coli генную последовательность, которая кодирует полипептиды ризавидина (45-179) сконструировали заново с использованием предпочтительных для Е. coli кодонов экспрессии, затем синтезировали и клонировали в вектор PET21b. Для облегчения правильной укладки и получения высокого выхода растворимого рекомбинантного белка последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность периплазматической локализации Е. coli (19 аминокислот, MKKIWLALAGLVLAFSASA, SEQ ID NO:1) вводили на 5' конце синтетического гена rRhavi. Предположили, что эта сигнальная последовательность удаляется автоматически из рекомбинантного белка после его попадания в периплазму Е. coli в ходе процесса экспрессии.
Для конструирования белка слияния ризавидина с антигеном последовательность ДНК, кодирующую гибкий линкерный участок, состоящий из семи аминокислот (GGGGSSS, SEQ ID NO:27), напрямую вводили в 3' конец синтетического гена rRhavi, для содействия в стабилизации белка слияния. Гены, кодирующие кандидатные антигены (полноразмерные или необходимый фрагмент) амплифицировали из геномной ДНК представляющих интерес патогенов с помощью рутинных ПЦР процедур и вводили в вектор экспрессии rRhavi сразу за линкерным участком.
Для экспрессии белка плазмиды, содержащие целевые конструкты, трансформировали в штамм BL21 Е. coli (DE3) с использованием стандартной процедуры теплового шока. Одну колонию отбирали в свежем виде из планшета (или стоковый раствор глицерина использовали позже) и инокулировали в 30 мл среду Лурия-Бертани (LB), содержащую ампициллин (Amp+) для культивирования в течение ночи при 37°С. На 2 день 5 мл исходной культуры инокулировали в 1 литр среды LB/Amp+ и выращивали при 37°С до достижения OD600=1. После охлаждения среды до 16°С 0,2 мМ конечной концентрации IPTG добавляли в культуры для индукции в течение ночи.
Белки очищали от периплазматической фракции с использованием модифицированного протокола осмотического шока. Кратко, бактериальные клетки из 6 литровой культуры собирали и ресуспендировали в 120 мл буфера, содержащего 30 мМ Tris (pH 8,0), 20% сахарозы и 1 мМ EDTA. После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 мин клетки повторно осаждали путем центрифугирования при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант собирали как фракцию 1 и клетки ресуспендировали в 80 мл ледяного раствора, содержащего 5 мМ MgCl2, ингибитор протеазы и ДНКазу. После перемешивания при 4°С в течение 20 мин, смесь подвергали центрифугированию при 13000 об/мин в течение 20 мин и супернатант собирали как фракцию 2. После добавления конечной концентрации 150 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 и 10 мМ имидазола комбинированную фракцию супернатанта 1 и 2 наносили на Ni-NTA колонку. Белки, элюированные из Ni-NTA колонки, дополнительно очищали с помощью гель-фильтрации с использованием колонки superdex 200, работающей на очистителе AKTA. Пиковые фракции, содержащие целевой белок, объединяли и концентрировали. Концентрацию белка измеряли с использованием ВСА набора для анализа белка от Bio-Rad, Очищенные белки делили на аликвоты, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С для будущего применения.
Пример 2. Биотинилирование полисахарида
Биотинилирование полисахаридов выполняли с использованием тетрафторбората 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) в качестве активационного реагента. Кратко, полисахариды растворяли в не содержащей LPS воде в концентрации 10 мг/мл (или другой концентрации, как указано). При t=0 объем CDAP (свежеприготовленный в концентрации 100 мг/мл в ацетонитриле) медленно добавляли к раствору полисахарида в соотношении 1-2 мг CDAP/мг полисахарида, при интенсивном перемешивании. Через тридцать секунд объем 0,2 М триэтиламина (TEA) добавляли (равный или двойной по отношению к объему CDAP в зависимости от различных типов полисахарида) для повышения pH. На 2,5 мин объем производного биотина (EZ-Link амин-PEG3-биотин от Pierce, растворенный в концентрации 20 мг/мл в не содержащей LPS воде) добавляли к конечному соотношению 1-1,5 мг биотина/мг полисахарида для связывания в течение ночи при 4°С (или 1-3 часового связывания при 25°С). На 2 день 50 мМ конечную концентрацию глицина или серина добавляли для остановки реакции и затем смесь обессоливали путем пропускания через колонку или диализировали с большим объемом PBS для удаления свободного производного биотина. Содержание биотина в биотинилированном полисахариде измеряли с использованием набора для количественной оценки биотина от Pierce и концентрацию полисахарида определяли с помощью антронового анализа.
Пример 3. Сборка и очищение MAPS
Чтобы собрать комплекс MAPS объем биотинилированного полисахарида смешивали с кандидатными белками слияния rRhavi с антигеном в необходимом соотношении и затем инкубировали при 4°С или 25°С в течение ночи. После инкубации смесь центрифугировали при 13200 об/мин в течение 3 мин для удаления нерастворимых агрегатов. Супернатант наносили на гель-фильтрационную хроматографию с использованием колонки superpose-6 или sperdex-200 с PBS, Tris буфером или солевым раствором в качестве рабочего раствор. Пиковые фракции, содержащие высокомолекулярный комплекс собирали и концентрировали. Содержание белка и соотношение различных антигенов в комплексе MAPS анализировали с помощью SDS-PAGE с окрашиванием кумасси синим и соотношение белка к полисахариду MAPS определяли с использованием набора ВСА для анализа белка и антронового анализа.
Пример 4. Иммунизация; анализ антител и цитокинов; сенсибилизация у мышей
Все иммуногенные композиции и вакцины получали за день до иммунизации. Пневмококковую цельноклеточную вакцину, MAPS или эквимолярную смесь, содержащую все специфические антигены, ризавидин, полисахарид и биотин, разбавляли с использованием солевого раствора для установления концентрации и затем смешивали с Al(ОН)3 в 15 мл конической пробирке для адсорбции в течение ночи при 4°С.
Мышей C57BL/6J (Jackson Laboratories, Бар-Харбор, Мэн) использовали во всех экспериментах по иммунизации. Возраст на момент первой иммунизации составлял 4-6 недель. Аккуратно фиксированным, не подвергшимся анестезии мыши получали 3 подкожных инъекции 200 мкл адъюванта с указанным количеством антигена или без него в нижнюю часть спины с 2-недельными интервалами. Забор крови производили через 2 недели после второй и/или третьей иммунизации и анализировали в отношении продукции антител и цитокинов in vitro после стимуляции с помощью пневмококкового цельноклеточного антигена (WCA), экстракта ТВ или конкретного белкового антигена.
Сенсибилизацию проводили через 2 недели после последней иммунизации или забора крови. В модели NP колонизации мышей сенсибилизировали интраназально с помощью 2×107 колониеобразующих единиц (CFU) штамма 0603 серотипа 6B в 20 мкл PBS. Для определения присутствия и степени NP колонизации культуру верхних дыхательных путей получали через 10 дней путем закапывания стерильного солевого раствора ретроградно через надрезанную трахею, собирая первые 6 капель (приблизительно 0,1 мл) из ноздрей, и помещая неразведенные или разведенные образцы на планшеты с кровяным агаром, содержащие 2,5 мкг гентамицина/мл.
В модели аспирационно-септической модели сенсибилизации мышам вводили легкую анестезию с помощью изофлорана, фиксируя в положении на спине и вводили 100 мкл интраназальной инокуляции, содержащей 106 CFU пневмококкового штамма WU-2 серотипа 3. Мышей подвергали мониторингу дважды в день и умерщвляли путем ингаляции СО2 и окончательного кровоизвлечения при демонстрации признаков заболевания, после чего получали культуру крови.
Анализы мышиных антител к WCA или различным белковым антигенам проводили в Immulon 2 НВ 96-лунковых микропланшетах (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс), покрытых WCA (100 мкг белка/мл PBS) или белковыми антигенами (1 мкг белка/мл PBS). Планшеты блокировали с помощью 1% BSA в PBS. Добавляли антитело, разбавленное в PBS-T и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Планшеты отмывали с помощью PBS-T и добавляли вторичное HRP-конъюгированное антитело к мышиному иммуноглобулину G (от Sigma) и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Планшеты отмывали и проявляли с помощью субстрата пероксидазы для анализа микропланшетов SureBlue ТМВ (KPL, Гейтерсберг, Мэриленд).
Для стимуляции цитокинов стимуляторы разбавляли в среде стимуляции (DMEM (BioWhittaker, Уолкерсвиль, Мэриленд), содержащей 10% FBS с низкой эндотоксичностью (Hyclone, Логан, Юта), 50 мкМ 2-меркаптоэтанол (Sigma) и ципрофлоксацин (10 мкг/мл, Cellgro, Манассас, Вирджиния)), в концентрации 1 мкг/мл - 10 мкг/мл для всех белковых антигенов или для пневмококкового WCA. 25 мкл гепаринизированной крови добавляли к 225 мкл среды DMEM с/без стимуляторов и культивировали при 37°С в течение 6 дней. Супернатанты собирали после центрифугирования и хранили при -80°С до анализа с помощью ELISA для определения концентрации IL-17A или IFN-γ (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота).
Для стимуляции спленоцитов мышиные спленоциты выделяли, ресуспендировали в среде стимуляции и затем высевали в 48-луночный планшет (3×106 клеток/планшет, в 300 мкл объема). После инкубации при 37°С в течение 2 ч стимуляторы добавляли в указанной концентрации для стимуляции при 37°С в течение 3 дней. Супернатанты собирали после центрифугирования и хранили при -80°С до анализа с помощью ELISA для определения концентрации IL-17A или IFN-γ.
Концентрации антител и IL-17A и плотности NP колонизации сравнивали с помощью U-критерия Манна-Уитни с использованием PRISM (версия 4.0а для Macintosh, GraphPad Software, Inc). Различия в выживаемости анализировали с помощью критерия Каплана-Мейера также с использованием PRISM.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| МОДИФИЦИРОВАННЫЙ БИОТИН-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК, СЛИТЫЕ БЕЛКИ НА ЕГО ОСНОВЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2012 |
|
RU2632651C2 |
| ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ | 2018 |
|
RU2791256C2 |
| ПОЛИВАЛЕНТНЫЕ ПНЕВМОКОККОВЫЕ ВАКЦИНЫ | 2019 |
|
RU2815390C2 |
| САМОСОБИРАЮЩИЕСЯ СИНТЕТИЧЕСКИЕ БЕЛКИ | 2014 |
|
RU2801230C2 |
| САМОСОБИРАЮЩИЕСЯ СИНТЕТИЧЕСКИЕ БЕЛКИ | 2014 |
|
RU2747857C2 |
| ВАКЦИНЫ И КОМПОЗИЦИИ ПРОТИВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE | 2012 |
|
RU2623174C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ГРИБКОВЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ | 2014 |
|
RU2717306C2 |
| ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ КОРОНАВИРУСА БЛИЖНЕВОСТОЧНОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА (MERS-COV) И СПОСОБЫ | 2014 |
|
RU2685185C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ЭФФЕКТОМ, И СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ИНГИБИРУЮЩЕГО ЭФФЕКТА PD-L1 НА Т-КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА | 2016 |
|
RU2688692C2 |
| ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ И ВАКЦИННЫЕ КОМПОЗИЦИИ | 2011 |
|
RU2578420C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным системам презентации множественных антигенов, и может быть использовано в медицине. Иммуногенная композиция против одного или более из антигенного полисахарида, пептидного антигена или полипептидного антигена содержит по меньшей мере один антигенный полисахарид, по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген и по меньшей мере одну комплементарную пару аффинных молекул. При этом первая аффинная молекула связана с по меньшей мере одним антигенным полисахаридом, а комплементарная аффинная молекула связана с по меньшей мере одним пептидным или полипептидным антигеном, причем первая аффинная молекула связывается с комплементарной аффинной молекулой для соединения пептидного или полипептидного антигена и антигенного полисахарида. Изобретение позволяет вызывать как гуморальные, так и клеточные иммунные ответы в отношении одного или множественных антигенов одновременно. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 40 ил., 4 табл., 4 пр.
1. Иммуногенная композиция против одного или более из антигенного полисахарида, пептидного антигена или полипептидного антигена, содержащая по меньшей мере один антигенный полисахарид, по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген и по меньшей мере одну комплементарную пару аффинных молекул, содержащую:
первую аффинную молекулу, связанную с по меньшей мере одним антигенным полисахаридом, и
комплементарную аффинную молекулу, связанную с по меньшей мере одним пептидным или полипептидным антигеном,
причем первая аффинная молекула связывается с комплементарной аффинной молекулой для соединения пептидного или полипептидного антигена и антигенного полисахарида.
2. Иммуногенная композиция по п. 1, в которой первая аффинная молекула сшита или ковалентно связана с антигенным полисахаридом.
3. Иммуногенная композиция по п. 1 или 2, в которой первая аффинная молекула сшита с антигенным полисахаридом с использованием сшивающего реагента, выбранного из любого в группе, состоящей из следующего: CDAP (тетрафторборат 1-циано-4-диметиламинопиридиния); EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлорид); цианоборогидрид натрия; цианогенбромид и бикарбонат аммония/йодуксусная кислота.
4. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-2, в которой комплементарная пара аффинных молекул выбрана из группы, состоящей из следующего: биотин/связывающий биотин белок, антитело/антиген, фермент/субстрат, рецептор/лиганд, металл/связывающий металл белок, углевод/связывающий углевод белок, липид/связывающий липид белок, гистидиновая метка/связывающее гистидиновую метку вещество.
5. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-2, в которой первая аффинная молекула представляет собой биотин или его производное или молекулу-миметик, и в которой комплементарная аффинная молекула выбрана из группы, состоящей из: связывающего биотин белка, авидиноподобного белка, такого как ризавидин, авидин, стрептавидин или его гомолога или производного или его функциональной части.
6. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-2, в которой пептидный или полипептидный антиген представляет собой белок слияния, содержащий пептидный или полипептидный антиген, слитый с комплементарной аффинной молекулой или аффинной связывающей белок молекулой.
7. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-2, в которой пептидный или полипептидный антиген нековалентно или ковалентно прикреплен к комплементарной аффинной молекуле.
8. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-2, в которой антигенный полисахарид представляет собой полисахарид с разветвленной цепью или полисахарид с неразветвленной цепью.
9. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-2, дополнительно содержащая гибкий линкерный пептид, прикрепленный к пептидному или полипептидному антигену, причем гибкий линкерный пептид связывает пептидный или полипептидный антиген с комплементарной аффинной молекулой.
10. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-2, в которой пептидный или полипептидный антиген происходит из патогенного организма или из опухоли.
11. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-2, содержащая 1-10 различных пептидных или полипептидных антигенов, или 10-20 различных пептидных или полипептидных антигенов, или 20-50 различных пептидных или полипептидных антигенов, или 50-100 различных пептидных или полипептидных антигенов, или более чем 100 различных пептидных или полипептидных антигенов, где различные пептидные или полипептидные антигены выбраны из группы, состоящей из: различных пептидов или полипептидов одного или различных патогенных организмов или из опухоли, различных вариантов одного пептида или полипептида, или различных доменов или частей одного пептида или полипептида.
12. Иммуногенная композиция по п. 10, в которой пептидный или полипептидный антиген из патогенного организма выбран из группы, состоящей из: пневмококковых антигенов, антигенов туберкулеза, антигенов сибирской язвы, антигенов ВИЧ, антигенов сезонного или эпидемического гриппа, антигенов коклюша, антигенов золотистого стафилококка, менингококковых антигенов, антигенов гемофильной инфекции, антигенов ВПЧ, антигенов Е. coli, антигенов Salmonella, антигенов Enterobacter, антигенов Acinetobacter, антигенов Pseudomonas, антигенов Klebsiella, антигенов Citrobacter, антигенов Serratia, антигенов Clostridium difficile, антигенов кишечных или некишечных грамотрицательных бактерий, токсоидов, токсинов или их частей, или их комбинаций.
13. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-2, 12, в которой антигенный полисахарид выбран из группы, состоящей из: декстрана, Vi полисахарида, пневмококковых капсульных полисахаридов, пневмококкового полисахарида клеточной стенки, полисахарида Haemophilus influenzae типа b, менингококкового полисахарида, липополисахарида из грамположительных бактерий и других бактериальных капсульных полисахаридов или полисахаридов клеточной стенки.
14. Иммуногенная композиция по п. 1, дополнительно содержащая по меньшей мере один фактор костимуляции, связанный с антигенным полисахаридом, пептидным или полипептидным антигеном, или по меньшей мере один адъювант.
15. Иммуногенная композиция по п. 14, в которой фактор костимуляции выбран из группы, состоящей из: лиганда или агонистов Toll-подобного рецептора, лиганда или агонистов NOD или активатора/агонистов инфламмасомы.
16. Применение иммуногенной композиции по п. 1 для индукции иммунного ответа у субъекта по меньшей мере к одному антигенному полисахариду или по меньшей мере к одному пептидному или полипептидному антигену, присутствующему в иммуногенной композиции.
17. Применение иммуногенной композиции по п. 1 для индукции иммунного ответа у субъекта по меньшей мере к одному антигенному полисахариду и по меньшей мере к одному пептидному или полипептидному антигену, присутствующему в иммуногенной композиции.
18. Применение иммуногенной композиции по п. 16 или 17, при котором иммунный ответ представляет собой ответ антител или В-клеток.
19. Применение иммуногенной композиции по п. 16 или 17, при котором иммунный ответ представляет собой CD4+ Т-клеточный ответ, включая в себя ответ Th1, Th2, или Th17, или CD8+ Т-клеточный ответ, или CD4+/CD8+ Т-клеточный ответ.
20. Применение иммуногенной композиции по п. 16 или 17, при котором иммунный ответ представляет собой ответ антител или В-клеток и Т-клеточный ответ.
| JIN Zh | |||
| et al., Conjugates of group A and W135 Capsular Polysaccharides of Neisseria meningitidis bound to recombinant Staphylococcus aureus Enterotoxin C1: preparation, physicochemical characterization, and immunological properties in mice, Infection and Immunity, 2005, v | |||
| Способ подготовки рафинадного сахара к высушиванию | 0 |
|
SU73A1 |
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
| МАШИНА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СТЕКЛЯННЫХ ИЗДЕЛИЙ | 1926 |
|
SU7887A1 |
| КОМБИНИРОВАННЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНОГО МЕНИНГИТА ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ ЧЕРЕЗ СЛИЗИСТУЮ ОБОЛОЧКУ | 2003 |
|
RU2378008C2 |
| INSEL R | |||
| et al., Response to oligosaccharide-protein conjugate vaccine against Hemophilus influenzae b in two patients with IgG2 deficiency unresponsive to capsular polysaccharide vaccine, N | |||
| Engl J | |||
| Med.,1986, v | |||
| Способ очищения амида ортотолуолсульфокислоты | 1921 |
|
SU315A1 |
| Топка с несколькими решетками для твердого топлива | 1918 |
|
SU8A1 |
| Складная пожарная (штурмовая) лестница | 1923 |
|
SU499A1 |
| SCOTT D | |||
| et al., Immunogenicity of biotinylated hapten-avidin complexes, Mol | |||
| Immunol., 1984, v | |||
| Выбрасывающий ячеистый аппарат для рядовых сеялок | 1922 |
|
SU21A1 |
| Походная разборная печь для варки пищи и печения хлеба | 1920 |
|
SU11A1 |
| ВСПОМОГАТЕЛЬНАЯ МАШИНА ДЛЯ РЕГУЛИРОВАНИЯ СКОРОСТИ ТРЕХФАЗНОГО АСИНХРОННОГО ДВИГАТЕЛЯ | 1924 |
|
SU1055A1 |
| Thermo Scientific Avidin-Biotin Technical Handbook, 2009, стр | |||
| Устройство для электрической сигнализации | 1918 |
|
SU16A1 |
| SEN G | |||
| et al., In vivo humoral immune responses to isolated Pneumococcal polysaccharides are dependent on the presence of associated TLR ligands, The Journal of Immunology, 2005, v | |||
| Ручной прибор для загибания кромок листового металла | 1921 |
|
SU175A1 |
| Кипятильник для воды | 1921 |
|
SU5A1 |
| МЕХАНИЗМ ДЛЯ ИЗМЕНЕНИЯ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО СЖАТИЯ ЗАРЯДА В ДВИГАТЕЛЯХ ВНУТРЕННЕГО ГОРЕНИЯ | 1923 |
|
SU3084A1 |
