Способ конструирования минигенов млекопитающих и рекомбинантная плазмида pgC1HDR, кодирующая миниген ингибитора С1 эстеразы человека, предназначенная для получения гуманизированных по гену Serping1 мышей Российский патент 2023 года по МПК C12N15/11 C12N15/85 C12N15/90 A01K67/27 

Область техники настоящего изобретения

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной биологии и представляет собой способ конструирования минигенов путем минимизации протяженных интронов и рекомбинантную плазмиду, кодирующую миниген ингибитора С1 эстеразы человека, предназначенную для получения гуманизированных по гену Serping1 мышей с помощью системы CRISPR/Cas9.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019 на базе Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины (ЦВРГТБ) ИБГ РАН.

Уровень техники

Наследственный ангионевротический отек (НАО) является орфанным заболеванием, встречающимся с частотой 1:50000 -1:100000 и обусловленным генетическим дефектом в гене SERPING1, кодирующим белок ингибитор С1-эстеразы (С1-ИНГ) [Santacroce R, D'Andrea G, Maffione AB, Margaglione M, d'Apolito M. The Genetics of Hereditary Angioedema: A Review. J Clin Med. 2021 May 9;10(9):2023.doi: 10.3390/jcm10092023. PMID: 34065094; PMCID: PMC8125999; Drouet C, López-Lera A, Ghannam A, López-Trascasa M, Cichon S, Ponard D, Parsopoulou F, Grombirikova H, Freiberger T, Rijavec M, Veronez CL, Pesquero JB,Germenis AE. <i>SERPING1</i> Variants and C1-INH Biological Function: A Close Relationship with C1-INH-HAE. Front Allergy. 2022 Mar 31;3:835503. doi:10.3389/falgy.2022.835503. PMID: 35958943; PMCID: PMC9361472]. Клинически, дефицит С1-ИНГ у человека проявляется в спонтанном развитии отеков, зачастую угрожающих жизни.

Согласно данным клинических рекомендаций Минздрава РФ от 2020 года в РФ насчитывалось 276 пациентов с НАО [https://www.pediatr-russia.ru/information/klin-rek/deystvuyushchie-klinicheskie-rekomendatsii/%D0%9D%D0%B0%D1%81%D0%BB%D0%B5%D0%B4%D1%81%D1%82%D0%B2%D0%B5%D0%BD%D0%BD%D1%8B%D0%B9%20%D0%B0%D0%BD%D0%B3%D0%B8%D0%BE%D0%BE%D1%82%D0%B5%D0%BA_2020.pdf?ysclid=lai45cymxn452176419].

Белок С1-ИНГ человека, кодируется геном SERPING1 на одиннадцатой хромосоме, и относится к семейству ингибиторов протеаз serpin участвуя в инактивации протеаз системы комплемента (C1r, C1s, MASP), калликреин-кининовой системы (фактор свертывания XII, калликреин), системы свертывания крови по внутреннему пути (фактор XI) и фибринолитической системы (плазмин, тканей активатор плазминогена) [Davis AE 3rd, Lu F, Mejia P. C1 inhibitor, a multi-functional serine protease inhibitor. Thromb Haemost. 2010 Nov;104(5):886-93. doi: 10.1160/TH10-01-0073. Epub 2010 Aug 30. PMID: 20806108].

Основной вклад в патогенез НАО вносит нарушение работы калликреин-кининовой системы. При отсутствии или снижении активности С1-ИНГ происходит неконтролируемое превращение прекалликреина в калликреин, который расщепляет высокомолекулярный кининоген с образованием вазоактивного пептида брадикинина. Брадикинин взаимодействует с брадикининовыми рецепторами второго типа (B2), что приводит к расширению сосудов, повышению проницаемости сосудистой стенки и экстравазации жидкости, что приводит к развитию отеков различной локализации [Davis AE 3rd, Lu F, Mejia P. C1 inhibitor, a multi-functional serine protease inhibitor. Thromb Haemost. 2010 Nov;104(5):886-93. doi: 10.1160/TH10-01-0073. Epub 2010 Aug 30. PMID: 20806108]. Для купирования и профилактики отеков у пациентов с дефицитом С1-ИНГ используются препараты С1-ИНГ, получаемого либо из плазмы доноров, либо из молока трансгенных кроликов.

Продукция рекомбинантных белков в молоко трансгенных животных представляет собой один из актуальных способов получения терапевтически значимых рекомбинантных белков. Актуальность такого подхода иллюстрируется присутствием на рынке ряда препаратов рекомбинантных белков крови человека, получаемых из молока трансгенных животных. В настоящий момент на рынке присутствуют три таких препарата: ATryn ®, рекомбинантный антитромбин III, получаемый из молока трансгенных коз; Sevenfact®, рекомбинантный фактор свертывания крови VIIa, получаемый из молока трансгенных кроликов; и Ruconest ®, рекомбинантный ингибитор С1-эстеразы человека, получаемый из молока трансгенных кроликов.

Одной из проблем при получении рекомбинантных белков крови человека из молока трансгенных животных является присутствие в молоке примесей эндогенных белков крови животного, которые могут вызывать иммунную реакцию у пациента. Гомологичные белки животного могут проникать в молоко путем активного транспорта из крови [Monks J, Neville MC. Albumin transcytosis across the epithelium of the lactating mouse mammary gland. J Physiol. 2004 Oct 1;560(Pt 1):267-80. doi:10.1113/jphysiol.2004.068403. Epub 2004 Aug 5. PMID: 15297572;] или за счет параклеточного транспорта при повышении проницаемости гемато-лактационного барьера в начале лактации или при мастите [Wall SK, Gross JJ, Kessler EC, Villez K, Bruckmaier RM. Blood-derived proteins in milk at start of lactation: Indicators of active or passive transfer. J Dairy Sci. 2015 Nov;98(11):7748-56. doi: 10.3168/jds.2015-9440. Epub2015 Aug 20. PMID: 26298756]. В силу высокой гомологии и сходства физико-химических свойств очистка от таких примесей практически невозможна.

Поэтому одним из актуальных направлений биотехнологии и геномного редактирования является разработка методов получения гуманизированных трансгенных животных, у которых инактивирован ген, кодирующий белок крови, а функция этого гена замещена за счет экспрессии гомологичного гена человека.

Появление технологий CRISPR/Cas9-опосредованного геномного редактирования существенно упростило получение трансгенных животных с направленными модификациями генома [Shepelev MV, Kalinichenko SV, Deykin AV, Korobko IV. Production of Recombinant Proteins in the Milk of Transgenic Animals: Current State and Prospects. Acta Naturae. 2018 Jul-Sep;10(3):40-47. PMID: 30397525; PMCID:PMC6209402]. В частности, при репарации разрывов ДНК по механизму гомологичной рекомбинации возможно осуществление нокина (встройки) больших генетических конструкций в целевое место генома.

Учитывая это, была предложена стратегия получения гуманизированных животных, основанная на нокине генетической конструкции, кодирующей белок крови человека непосредственно в локус гена животного таким образом, чтобы за счет корректного нокина конструкции в целевое место генома происходила инактивация гена животного, а вместо него экспрессировался белок человека. Для реализации такой стратегии гуманизации необходимо создание генетических конструкций, кодирующих белки крови человека, и характеризующихся высоким уровнем экспрессии рекомбинантного белка.

Генетические конструкции для экспрессии рекомбинантных белков для различных экспериментальных целей, как правило, содержат кДНК, кодирующую белок, в виде открытой рамки считывания. Помимо этого, возможно использование и полноразмерных генов, что, однако, встречается крайне редко в силу большого размера генов млекопитающих (до 10 - 100 тыс. пар оснований), что сопряжено с техническими сложностями генно-инженерных манипуляций с такими фрагментами ДНК. Альтернативой полноразмерным генам являются так называемые минигены, которые можно определить как экспрессионные конструкции, несущие белоккодирующие последовательности, включающие хотя бы один интрон. На модели трансгенных мышей в ряде работ было показано, что присутствие интронов в генетических конструкциях для экспрессии белков существенно повышает уровень экспрессии трансгена [Brinster RL, Allen JM, Behringer RR, Gelinas RE, Palmiter RD. Introns increase transcriptional efficiency in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Feb;85(3):836-40. doi:10.1073/pnas.85.3.836. PMID: 3422466; PMCID:PMC279650]. При этом для этих целей можно использовать и гетерологичные интроны (интроны из других генов, включая гены других видов или искусственные интроны;) [Palmiter RD, Sandgren EP, Avarbock MR, Allen DD, Brinster RL. Heterologous introns can enhance expression of transgenes in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Jan 15;88(2):478-82. doi: 10.1073/pnas.88.2.478. PMID: 1988947; PMCID:PMC50834; Choi T, Huang M, Gorman C, Jaenisch R. A generic intron increases gene expression in transgenic mice. Mol Cell Biol. 1991 Jun;11(6):3070-4. doi:10.1128/mcb.11.6.3070-3074.1991. PMID: 2038318; PMCID: PMC360146.].

При получении трансгенных животных, продуцирующих рекомбинантные белки в молоко, уже достаточно давно используют минигены. Одним из примеров использования генетических конструкций для экспрессии рекомбинантных белков в молоко трансгенных животных является коммерчески доступный вектор pBC1 (Invitrogen). В частности, данный вектор содержит первый экзон, первый интрон, нетранслируемые фрагменты второго и седьмого экзонов, а также седьмой интрон, восьмой экзон, восьмой интрон и девятый экзон гена бета-казеина козы. Таким образом, кДНК любого гена, клонированная в вектор pBC1 между вторым и седьмым экзонами гена бета-казеина козы будет экспрессироваться в составе минигена. Ряд рекомбинантных белков успешно продуцировали в молоко с использованием вектора pBC1 [Young, M. W., Okita, W. B., Brown, E. M., and Curling, J. M. (1997). Production of Biopharmaceutical Proteins in the Milk of Transgenic Dairy Animals. BioPharm 10, 34-38].

Кроме того, используя минигены получали трансгенных животных, продуцирующих в молоко сывороточный альбумин человека (САЧ) [Shani M, Barash I, Nathan M, Ricca G, Searfoss GH, Dekel I, Faerman A, Givol D, Hurwitz DR. Expression of human serum albumin in the milk of transgenic mice. Transgenic Res. 1992 Sep;1(5):195-208. doi:10.1007/BF02524750. PMID: 1284483]. Важно отметить, что САЧ продуцировался в молоко только при использовании минигена несущего 1 и 2 интроны гена САЧ, но не при использовании кДНК САЧ.

Сходно, было выявлено повышение продукции в молоко мышей фактора свертывания крови IX человека при использовании минигена, несущего эндогенный первый интрон гена человека по сравнению с кДНК [Zhang K, Jiang P, Lu D, Huang W, Chen L, Xue J, Qiu X. Expression and regulation of hFIX minigene and cDNA driven by beta-casein gene in mouse mammary gland. Sci China C Life Sci. 1998 Aug;41(4):406-12. doi: 10.1007/BF02882741.PMID: 18726258.]

Кроме того, получали животных, продуцирующих в молоко α1-антитрипсина человека [Archibald AL, McClenaghan M, Hornsey V, Simons JP, Clark AJ. High-level expression of biologically active human alpha 1-antitrypsin in the milk of transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Jul;87(13):5178-82. doi:10.1073/pnas.87.13.5178. PMID: 1695012; PMCID: PMC54285].

Таким образом, при получении трансгенных животных-продуцентов рекомбинантных белков в молоко одним из важнейших параметров является уровень продукции рекомбинантного белка в молоко. Использование минигенов в генетических конструкция для трансгенеза существенно повышает уровень экспрессии трансгена, и соответственно, выход рекомбинантного белка, что подтверждается во множестве других ранее опубликованных работ. На основании этих данных можно сделать вывод, что для получения трансгенных животных, гуманизированных по гену Serping1, кодирующему ингибитор С1-эстеразы, а также для получения животных-продуцентов рекомбинантного С1-ИНГ в молоко, целесообразно использовать генетическую конструкцию для экспрессии С1-ИНГ в виде минигена, что обеспечит более высокой уровень экспрессии транскрипта по сравнению с кДНК С1-ИНГ. Задачей данного изобретения является получение минигена С1-ИНГ человека с корректным паттерном сплайсинг и высоким уровень транскрипции, а также разработка эффективного способа конструирования минигенов с использованием систем бесшовного клонирования фрагментов ДНК.

Механизмы сплайсинга пре-мРНК

Сплайсинг пре-мРНК играет важную роль в регуляции экспрессии генов у эукариот, в том числе за счет альтернативного сплайсинга. Считается, что около 10-30% генетических вариантов, вызывающих заболевания у человека, нарушают процесс сплайсинга [Chiang HL, Chen YT, Su JY, Lin HN, Yu CA, Hung YJ, Wang YL, Huang YT, Lin CL. Mechanism and modeling of human disease-associated near-exon intronic variants that perturb RNA splicing. Nat Struct Mol Biol. 2022 Nov;29(11):1043-1055. doi:10.1038/s41594-022-00844-1. Epub 2022 Oct 27. PMID: 36303034]. Выделяют ряд ключевых элементов, необходимых для эффективного сплайсинга. В частности, 5’-сайт сплайсинга (донорный) характеризуется наличием инвариантного динуклеотида GU в начале интрона, 3’-сайт сплайсинга (акцепторный) характеризуется наличием инвариантного динуклеотида AG в конце интрона. Кроме того, в интроне в пределах 40 нуклеотидов до 3’-сайта сплайсинга расположены точка ветвления, содержащая консервативный аденозин, и полипиримидиновый тракт в 3’-области относительно точки ветвления [Wilkinson ME, Charenton C, Nagai K. RNA Splicing by the Spliceosome. Annu Rev Biochem. 2020 Jun 20;89:359-388. doi: 10.1146/annurev-biochem-091719-064225.Epub 2019 Dec 3. PMID: 31794245.]. Важно отметить, что в некоторых интронах также существуют и дистантные точки ветвления, расположенные на расстоянии в 100-400 п.о. от 3’-сайта сплайсинга, которые определяют возможность альтернативного сплайсинга экзонов [Gooding C, Clark F, Wollerton MC, Grellscheid SN, Groom H, Smith CW. A class of human exons with predicted distant branch points revealed by analysis of AG dinucleotide exclusion zones. Genome Biol. 2006;7(1):R1. doi:10.1186/gb-2006-7-1-r1. Epub 2006 Jan 13. PMID: 16507133; PMCID: PMC1431707]. Таким образом, можно считать, что для большинства интронов генов млекопитающих все регуляторные элементы, необходимые для эффективного сплайсинга, располагаются в пределах 100-200 п.о. от сайтов сплайсинга. На основании этого, автором изобретения был предложен способ конструирования минигенов, заключающийся в минимизации наиболее протяженных интронов гена с сохранением не более 125-190 п.о. интронных последовательностей, фланкирующих экзоны. С технической точки зрения, данный способ реализуется за счет амплификации в ПЦР фрагментов целевого гена, несущих экзоны, фланкированные интронными последовательностями указанной длины, с последующим клонированием не менее четырёх фрагментов в строго заданной ориентации в промежуточную плазмиду с помощью систем бесшовного клонирования, например, NEBuilder.

Ген SERPING1 человека расположен на 11 хромосоме, состоит из восьми экзонов и семи интронов и имеет длину 17164 п.о. от начала первого экзона до конца восьмого экзона. Таким образом, получение полноразмерного гена с помощью ПЦР и генно-инженерные манипуляции с ним с использованием эндонуклеаз рестрикции представляются затруднительными. Предложенный в данном изобретении способ конструирования минигенов позволяет получить миниген существенно меньшего размера (Фиг.2), с сохранением корректного паттерна сплайсинга и формированием полноразмерного транскрипта, кодирующего полноразмерный белок.

Генетические конструкции, несущие кодирующую последовательность ингибитора C1 эстеразы человека.

Известен ряд рекомбинантных плазмид, относящихся к данному изобретению.

В частности, ранее была описана генетическая конструкция, несущая миниген C1-ИНГ человека, который включал в себя промоторную область, первый и второй экзоны, и первый и второй интроны гена SERPING1 человека. Кодирующая последовательность с третьего по восьмой экзоны была представлена в виде кДНК, фланкированной в 3’-области нетранслируемой областью гена длиной 2.5 т. п.о. Данная конструкция была использована для получения трансгенных мышей, экспрессирующий белок C1-ИНГ человека [Vinci G, Lynch NJ, Duponchel C, Lebastard TM, Milon G, Stover C, Schwaeble W, Tosi M. In vivo biosynthesis of endogenous and of human C1 inhibitor in transgenic mice: tissue distribution and colocalization of their expression. J Immunol. 2002 Nov 15;169(10):5948-54. doi: 10.4049/jimmunol.169.10.5948. PMID:12421980]. Рекомбинантная плазмида, описанная в данном изобретении, отличается тем, что кодирующая последовательность белка C1-ИНГ представлена исключительно в виде экзонов, разделенных минимизированными интронами и одним эндогенным интроном.

Известен патент (US2005223416A1), описывающий получение трансгенных животных, в том числе кроликов, продуцирующих белок С1-ИНГ человека в молоко. Генетическая конструкция для экспрессии С1-ИНГ включала полную геномную последовательность гена SERPING1 человека длиной 16600 п.о. и 3’-фланкирующую последовательность длиной 5500 п.о., под транскрипционным контролем промотора бычьего αS1-казеина. Размер линейного фрагмента ДНК, использованного для микроинъекций, составлял 32 000 п.о. Геномная последовательность С1-ИНГ была получена из клона геномной библиотеки. В случае, когда невозможно получить из каких-либо источников генетическую конструкцию, несущую геномную последовательность целевого гена, получение генетической конструкции такого размера методами генной инженерии представляется затруднительным. Таким образом, предложенный способ конструирования минигенов, позволяет эффективно решить задачу создания генетической конструкции для экспрессии целевого белка на высоком уровне, пригодную, в том числе, для получения генно-модифицированных животных.

Также известны генетические конструкции, несущие кДНК С1-ИНГ человека, которые были использованы для продукции белка С1-ИНГ человека в клеточных экспрессионных системах. В частности, описано получение рекомбинантного С1-ИНГ из клеточной линии CHO, стабильной трансфицированной вектором pXLG6, несущим кДНК С1-ИНГ с оптимизированным кодонным составом для экспрессии в клетках китайского хомяка (US2018334493A1). Также известны изобретения WO2016081889A1 и WO2011116291A1 относящееся к способу получения рекомбинантного ингибитора C1-эстеразы, в котором описано получение С1-ИНГ из клеток линии HEK293. Описанная в данном изобретении конструкция, несущая кДНК белка C1-ИНГ человека, отличается тем, что кДНК находится под транскрипционным контролем регуляторных элементов гена Serping1 мыши, а также несет плечи гомологии локуса Serping1, и может быть использована для получения гуманизированных мышей.

Способ конструирования минигенов

В части стратегии конструирования минигена наиболее близко к данному изобретению относится рекомбинантная плазмида pmhATg7, кодирующая миниген антитромбина III человека [Shepelev MV, Saakian EK, Kalinichenko SV, Korobko IV. Human Antithrombin III Minigene with an Optimized Splicing Pattern. Mol Biol (Mosk). 2019 May-Jun;53(3):411-420. doi: 10.1134/S0026898419030170. PMID: 31184606.]. Однако способ конструирования плазмиды pmhATg7 основан на последовательном клонировании в плазмидные вектора амплифицированных фрагментов гена SERPINC1 человека с помощью эндонуклеаз рестрикции, в отличии от использованной в данном изобретении системы бесшовного клонирования NEBuilder, которая позволяет клонировать в плазмидный вектор до 4 фрагментов ДНК заданным образом за один шаг, что существенно упрощает и ускоряет процесс конструирования минигена.

Кроме того, описан способ конструирования минигена рецептора липопротеина низкой плотности (LDLR) крысы, мыши и человека (WO2021096499A1). В отличии от заявленного изобретения, миниген LDLR конструировали путем последовательного клонирования фрагментов ДНК, несущих экзоны, фланкированные интронными последовательностями, с помощью эндонуклеаз рестрикции, что требует больших затрат времени и реагентов по сравнению с предложенным в данном изобретении способе конструирования минигенов с помощью системы NEBuilder.

Ген LDLR человека состоит из 18 экзонов, однако авторы конструировали миниген, включающий лишь четыре первых экзона гена, которые после сплайсинга, кодируют укороченный вариант белка LDLR. Кроме того, длина фланкирующих интронных последовательностей составляла от 47 до 53 п.о., что существенно меньше по сравнению с длиной интронных последовательностей в данном изобретении. Известно, что в ряде интронов существуют дистантные точки ветвления на расстоянии 100-400 п.о. от сайтов сплайсинга [Gooding C, Clark F, Wollerton MC, Grellscheid SN, Groom H, Smith CW. A class of human exons with predicted distant branch points revealed by analysis of AG dinucleotide exclusion zones. Genome Biol. 2006;7(1):R1. doi:10.1186/gb-2006-7-1-r1. Epub 2006 Jan 13. PMID: 16507133; PMCID: PMC1431707], поэтому включение в миниген интронных последовательностей длиной от 125 до 190 п.о. представляется более оптимальным решением, которое к тому же не существенно увеличивает размер генетической конструкции.

Таким образом, в литературе отсутствуют данные как о конструировании минигена С1-ИНГ человека, несущего все белоккодирующие экзоны, разделенные интронами того или иного типа, так и о способе конструирования минигена с использованием тех или иных систем для бесшовного клонирования фрагментов ДНК.

Раскрытие изобретения

Изобретение решает задачу получения рекомбинантной плазмиды pgC1HDR, кодирующей миниген ингибитора С1-эстеразы (С1-ИНГ) человека. Получаемая плазмида обеспечивает эффективную экспрессию транскрипта минигена С1-ИНГ под контролем эндогенных регуляторных последовательностей гена Serping1 мыши. Миниген С1-ИНГ человека конструируется путем минимизации наиболее протяженных интронов гена SERPING1 человека, с сохранением фланкирующих интронных последовательностей длиной от 125 до 189 п.о., содержащих регуляторные элементы, необходимые для эффективного сплайсинга. Технически, результат достигается путем амплификации с помощью ПЦР белоккодирующих экзонов гена SERPING1, фланкированных с 5’ и 3’-сторон интронными последовательностями, и последующим конструированием минигена из амплифицированных фрагментов. Схема конструирования минигена С1-ИНГ приведена на Фиг.2. В частности, амплифицированные фрагменты, кодирующие с третьего по седьмой экзоны, клонируются в промежуточный плазмидный вектор с использованием системы для бесшовного клонирования фрагментов ДНК NEBuilder (New England Biolabs), что существенно упрощает и ускоряет процесс конструирования минигена. Далее, рекомбинантная плазмида pgC1HDR конструируется с использованием стандартных методов генной инженерии.

Предложенная рекомбинантная плазмида pgC1HDR предназначена для получения генно-модифицированных мышей, гуманизированных по гену Serping1, кодирующему ингибитор С1-эстеразы мыши. Для этого описанная в настоящем изобретении рекомбинантная плазмида pgC1HDR используется в качестве матрицы для репарации двуцепочечного разрыва ДНК, вносимого в геном мыши с помощью системы CRISPR/Cas9. Для этого используют гидовую РНК (sgC1; последовательность в геноме мыши, комплементарная sgC1: 5’- ctgaggctaactggcttcgtagg -3’), вносящую двуцепочечный разрыв в первом интроне гена Serping1 мыши на расстоянии 5 п.о. от начала второго экзона, и получают препарат гидовой РНК с помощью транскрипции in vitro. Далее проводят микроинъекции в зиготы мыши смеси гидовой РНК, мРНК нуклеазы Cas9 и рекомбинантной плазмиды pgC1HDR в качестве матрицы для репарации разрыва ДНК. В случае корректной репарации разрыва ДНК по механизму гомологичной рекомбинации в геном мыши встраивается миниген С1-ИНГ человека таким образом, что в геноме мыши сохраняются эндогенные регуляторные последовательности гена Serping1, включающие промотор, первый экзон и первый интрон, вплоть до кодона инициации трансляции белка C1-ИНГ, после которого следует миниген C1- ИНГ человека. Таким образом, за счет встройки минигена С1-ИНГ человека достигается инактивация гена Serping1 мыши, а функция белка С1-ИНГ мыши компенсируется за счет экспрессии белка С1-ИНГ человека, кодируемого минигеном.

Рекомбинантную плазмиду pgC1HDR (SEQ ID NO: 1) конструируют на основе вектора pBluescriptSK II (-) (Stratagene, США). Сконструированная плазмида содержит фрагмент плазмиды pBluescriptSK II (-), включающий в себя промотор гена β-лактамазы и открытую рамку считывания β-лактамазы (ген устойчивости к ампициллину), высококопийную точку начала репликации ColE1/pMB1/pBR322/pUC, сайт связывания CAP (Catabolite activator protein), Lac промотор и Lac оператор, промоторы для РНК полимераз бактериофагов T3 и T7 и точку начала репликации для фага f1.

Кроме того, рекомбинантная плазмида pgC1HDR содержит:

- нуклеотидную последовательность минигена C1-ИНГ человека, который включает в себя белоккодирующие экзоны гена SERPING1 человека (со второго по седьмой), разделенные вторым, третьим, четвертым, шестым и седьмым минимизированными и пятым полноразмерным интронами гена SERPING1 человека.

- левое и правое плечи гомологии для локуса Serping1 мыши, длиной 1807 и 1787 п.о., соответственно, необходимые для обеспечения возможности репарации двуцепочечного разрыва ДНК, вносимого Cas9, по механизму гомологичной рекомбинации.

- левое плечо гомологии в своей 5’-части включает в себя 1192 п.о. промоторной области гена Serping1, за которым далее в 3’-области расположен первый экзон и первый интрон гена Serping1 мыши. Наличие этих генетических элементов обеспечивает эффективную экспрессию транскрипта минигена при трансфекции рекомбинантной плазмиды pgC1HDR в клеточные линии, что позволяет оценить уровень экспрессии минигена и характер сплайсинга, и выявить вероятные аберрантные транскрипты.

- для предотвращения расщепления плазмиды pgC1HDR нуклеазой Cas9 при осуществлении CRISPR/Cas9-опосредованного геномного редактирования для получения гуманизированных мышей по гену Serping1 левое плечо гомологии локуса Serping1 мыши содержит мутированный PAM сайт для выбранной гидовой РНК (sgC1). В частности, два нуклеотида GG PAM сайта AGG заменяют на нуклеотиды CT (AGG -> ACT).

Для эффективной терминации транскрипции и полиаденилирования мРНК в 3’-области минигена помещен сигнал полиаденилирования из вируса SV40. Помимо этого, в 3’-области относительно минигена рекомбинантная плазмида содержит двунаправленный терминатор транскрипции из гена SKIV2L человека для блокирования возможной проходящей транскрипции минигена и предотвращения формирования аберрантных транскриптов.

Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что мутация PAM сайта достигается путем инсерции двух нуклеотидов AC перед сайтом PAM (плазмида pgC1HDRSpl, SEQ ID NO: 2).

Также настоящее изобретение представляет упомянутую выше рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризующуюся тем, что вместо минигена С1-ИНГ человека, между кодонами инициации трансляции (ATG) и терминации трансляции (TGA), расположена открытая рамка считывания, кодирующая белок C1-ИНГ человека, а мутация PAM сайта достигается путем инсерции двух нуклеотидов AC перед сайтом PAM (плазмида pсC1HDR, SEQ ID NO: 3).

Экспрессию и паттерн сплайсинга сконструированного минигена C1-ИНГ проверяют в клеточных линиях гепатоклеточной карциномы человека HepG2 и гепатомы мыши MH22a. Для этого клетки транзиторного трансфицируют полученными рекомбинантными плазмидами pgC1HDR, pgC1HDRSpl и pсC1HDR, через 72 часа после трансфекции выделяют суммарную клеточную РНК и проводят реакцию обратной транскрипции. Уровень экспрессии минигена С1-ИНГ человека определяют с помощью количественной ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, специфичными для кДНК С1-ИНГ человека используя для нормализации уровень транскрипта гена GAPDH человека или мыши в зависимости от клеточной линии.

Паттерн сплайсинга минигена определяют амплифицруя полноразмерный транскрипт минигена с помощью специфичных праймеров. Для этого подбирают пары праймеров, позволяющие специфично амплифицировать полноразмерный транскрипта минигена и эндогенные транскрипты С1-ИНГ человека и мыши. Специфичность соответствующих пар праймеров подтверждают на образцах первых цепей кДНК, полученных из клеток линии MH22a, трансфицированных рекомбинантной плазмидой pgC1HDR, и экспрессирующих только транскрипт минигена (в клетках MH22a отсутствует экспрессия эндогенного транскрипта Serping1 мыши); из нетрансфицированных клеток HepG2, экспрессирующих только эндогенный транскрипт SERPING1 человека; и из печени мыши, в которой экспрессируется только эндогенный транскрипт Serping1 мыши.

Преимуществом данного изобретения является то, что способ конструирования минигена путем минимизации протяженных интронов гена позволяет существенно уменьшить размер рекомбинантной генетической конструкции, что упрощает генно-инженерные манипуляции с такой конструкцией, а также способствует повышению эффективности доставки рекомбинантной конструкции в клетки с помощью трансфекции и повышению эффективности нокина с помощью системы CRISPR/Cas9.

Преимуществом предложенного в изобретении способа конструирования минигена путем минимизации размера интронов с сохранением от 125 до 189 п.о. интронных последовательностей, фланкирующих 5’ и 3’-сайты сплайсинга, является корректный паттерн сплайсинга транскрипта минигена, который выявляется по амплификации с помощью ПЦР полноразмерного транскрипта минигена ожидаемого размера около 1500 п.о., и по отсутствию или существенно более низкому уровню амплификации транскриптов меньшего или большего размера, свидетельствующих о пропуске экзонов или включении в транскрипт аберрантных экзонов, соответственно. Кроме того, корректный сплайсинг транскрипта минигена определяется путем секвенирования амплифицированного фрагмента ДНК по Сэнгеру.

Преимущество предложенного в изобретении способа конструирования минигена с использованием системы для бесшовного клонирования NEBuilder заключается в том, что амплифицированные в ПЦР фрагменты гена (в настоящем изобретении - четыре фрагмента ДНК, несущие пять экзонов гена SERPING1) клонируются в плазмидный вектор в одной реакции. Это существенно упрощает и ускоряет конструирование минигена и значительно снижает трудозатраты по сравнению с последовательным клонированием амплифицированных фрагментов в плазмидные векторы с использованием эндонуклеаз рестрикции. Система NEBuilder позволяет одновременно клонировать в вектор максимум пять фрагментов ДНК, таким образом, для генов, имеющих десять и более кодирующих экзонов, возможно конструирование двух и более плазмид с помощью данной системы, с последующим их объединением с помощью клонирования по уникальным сайтам рестрикции, которые можно ввести в минимизированные интроны без существенного влияния на эффективность сплайсинга.

Преимуществом предложенных рекомбинантных плазмид pgC1HDR и pgC1HDRSpl является более высокий уровень транскрипта по сравнению с плазмидой pcC1HDR, несущей кДНК C1-ИНГ. При транзиторной трансфекции в клетки HepG2 уровень транскрипта минигена был в 2.1 (pgC1HDR) и 1.57 (pgC1HDRSpl) раз выше по сравнению с уровнем транскрипта, кодируемого кДНК С1-ИНГ (pcC1HDR), а в клетках MH22a - в 6.35 (pgC1HDR) и 6.67 (pgC1HDRSpl) раз. Эти результаты свидетельствуют о том, что использование минигена С1-ИНГ человека в генетических конструкциях обеспечивает более высокий уровень экспрессии транскрипта по сравнению с конструкциями, несущими кДНК С1-ИНГ.

Автором впервые сконструирован миниген С1-ИНГ человека и описана рекомбинантная плазмида pgC1HDR, экспрессирующая миниген под контролем регуляторных элементов гена Serping1 мыши. Кроме того, в отличие от ранее описанных в литературе минигенов С1-ИНГ человека и антитромбина III человека, предложен более эффективный способ конструирования минигена за счет одномоментного клонирования нескольких фрагментов ДНК в плазмидный вектор с помощью системы сборки фрагментов ДНК NEBuilder. Показано, что сконструированный миниген обеспечивает эффективный и корректный сплайсинг транскрипта, а уровень экспрессии транскрипта минигена С1-ИНГ при транзиторной трансфекции плазмиды pgC1HDR в клетки человека и мыши существенно выше по сравнению с уровнем транскрипта, кодируемого рекомбинантной плазмидой pcC1HDR, несущей кДНК С1-ИНГ человека, что подтверждает целесообразность конструирования минигенов и включения интронов в генетические конструкции для экспрессии белков, предназначенные как для получения гуманизированных животных, так и для получения животных-продуцентов рекомбинантных белков в молоко. Все плазмидные конструкции, олигонуклеотидные праймеры, способ амплификации полноразмерных транскриптов и способ определения уровня транскрипта минигена впервые предложены автором и не описаны ранее в литературе. Предложенная рекомбинантная плазмида pgC1HDR может быть использована для получения трансгенных мышей, гуманизированных по гену Serping1. Миниген С1-ИНГ человека может быть использован для конструирования генетических конструкций для экспрессии белка С1-ИНГ в молоко трансгенных животных.

Краткое описание чертежей

Фиг.1

На Фиг.1 показана генетическая карта плазмидной конструкции pgC1HDR, кодирующей миниген C1-ИНГ человека, и имеющей размер 10 885 п.о. Показаны основные элементы плазмиды: “AmpR promoter” – промотор гена устойчивости к ампициллину; “AmpR“ - ген устойчивости к ампициллину (β-лактамаза); “ColE1/pBR322 ori” – точка начала репликации; “f1 ori” – точка начала репликации из бактериофага f1; “lac operator” – lac оператор; “lac promoter” – lac промотор; “T7 promoter” – промотор для РНК полимеразы бактериофага T7; “T3 promoter” – промотор для РНК полимеразы бактериофага T3; “CAP binding site” - cайт связывания белка CAP (Catabolite activator protein); “Mm C1 LHA” (left homology arm) - левое плечо гомологии для локуса гена Serping1 мыши; “Mm C1 RHA” (right homology arm) - правое плечо гомологии для локуса гена Serping1 мыши; “Exon1” - первый экзон гена Serping1 мыши; “Exon3” - третий экзон гена Serping1 мыши; “ATG” - кодон инициации трансляции белка C1-ИНГ человека; “STOP” - кодон терминации трансляции белка C1-ИНГ; “C1-INH minigene” - миниген С1-ИНГ человека, состоящий из фрагментов гена SERPING1, включающих со второго по восьмой экзоны (элементы на карте плазмиды– Ex2 hybrid, Ex3, Ex4, Ex56, Ex7 и Ex8); “SV40” – последовательность полиаденилирования из вируса SV40; “SKIV2L terminator” - терминатор транскрипции из гена SKIV2L человека; кроме того, показан ряд уникальных сайтов рестрикции (NotI, NcoI, NheI, NdeI, PaeI и др.).

Фиг.2

На Фиг.2 показана схема конструирования минигена С1-ИНГ человека. Ген SERPING1 человека состоит из 8 экзонов и 7 интронов. Кодон инициации трансляции расположен во втором экзон, а кодон терминации трансляции в восьмом экзоне. Полноразмерный ген SERPING1 имеет длину 17164 п.о., от начала первого экзона, до конца восьмого экзона. Для конструирования минигена с помощью ПЦР амплифицируют фрагменты гена SERPING1 содержащие белоккодирующие экзоны, фланкированные с двух или одной стороны интронными последовательностям протяженностью не более 189 п.о. Фрагмент, включающий экзоны 5 и 6, содержит эндогенный пятый интрон длиной 194 п.о. ПЦР фрагменты, содержащие с 3 по 7 экзоны, клонируются в вектор pBK-CMV с помощью системы NEBuilder. Фрагменты, содержащие 2 и 8, экзоны клонируются в соответствующие плазмидные векторы с помощью эндонуклеаз рестрикции. Далее с помощью методов генной инженерии все фрагменты гена объединяются в виде единого минигена, содержащего белоккодирующие экзоны и минимизированные интроны. Длина полученного минигена от начала второго экзона до конца восьмого экзона составляет 3299 п.о. Видно, что за счет минимизации интронов гена достигается существенное уменьшение размера генетической конструкции (примерно в пять раз), по сравнению с полноразмерным геном.

Фиг.3

На Фиг.3 показаны результаты проверки специфичности праймеров для амплификации полноразмерных транскриптов генов C1-ИНГ человека (Hs) и мыши (Ms), а также транскрипта минигена (Mg). Транскрипты амплифицировали с помощью ПЦР с соответствующими парами праймеров на матрице первых цепей кДНК из печени мыши, клеточной линии карциномы печени человека HepG2 и клеточной линии гепатомы мыши MH22a, транзиторной трансфицированной рекомбинантной плазмидой pgC1HDR. Продукты амплификации разделяли в 1%-ом TAE-агарозном геле. RT+ - образцы реакции обратной транскрипции с добавлением обратной транскриптазы. RT- контрольные образцы реакции обратной транскрипции без добавления обратной транскриптазы. Треугольником отмечено положение полосы маркера молекулярного веса ДНК (O’GeneRuler 1 kb DNA Ladder, #SM1163, Thermo Scientific) длиной 1500 п.о.

Фиг.4

На Фиг.4 показаны результаты анализа экспрессии транскриптов C1-ИНГ человека, кодируемых плазмидами pgC1HDR, pgC1HDRSpl и pcC1HDR, транзиторно трансфицированными в клетки линий HepG2 и MH22a. Транскрипты амплифицировали с помощью ПЦР используя праймеры для амплификации полноразмерных транскриптов минигена (Mg) и генов C1-ИНГ человека (Hs) и мыши (Ms) на матрице первых цепей кДНК из клеток, трансфицированных указанными плазмидами. Продукты амплификации разделяли в 1%-ом TAE-агарозном геле. RT+ - образцы реакции обратной транскрипции с добавлением обратной транскриптазы. RT- контрольные образцы реакции обратной транскрипции без добавления обратной транскриптазы. н.т. – нетрансфицированные клетки. Треугольником отмечено положение полосы маркера молекулярного веса ДНК (O’GeneRuler 1 kb DNA Ladder, #SM1163, Thermo Scientific) длиной 1500 п.о.

Фиг.5

На Фиг.5 показана схема сплайсинга первого (Ex1) и второго (Ex2) экзонов транскриптов, кодируемых указанными плазмидами и транскрипта гена Serping1 мыши (wt). Нуклеотидные последовательности экзонов выделены рамкой и показаны заглавным шрифтом, нуклеотидные последовательности первого интрона показаны строчными буквами. Показаны частичные последовательности экзонов и интрона, прилежащие к сайтам сплайсинга. PAM сайт для гидовой РНК sgC1 (AGG) подчеркнут одной чертой, мутированные PAM сайты подчеркнуты двумя чертами. Динуклеотиды AG отмечены звездочками.

Фиг.6

На Фиг.6 показаны результаты анализа уровней экспрессии транскриптов C1-ИНГ человека, кодируемых плазмидами pgC1HDR, pgC1HDRSpl и pcC1HDR, транзиторно трансфицированными в клетки линий HepG2 и MH22a. Проводили количественную ПЦР для амплификации фрагментов транскрипта минигена (pgC1HDR и pgC1HDRSpl) или кДНК С1-ИНГ (pcC1HDR ) с праймерами специфичными для транскрипта C1-ИНГ человека на матрице первых цепей кДНК из клеток, трансфицированных указанными плазмидами, используя в качестве матрицы образцы реакции обратной транскрипции с добавлением обратной транскриптазы. Из графиков амплификации определяли значения порогового цикла (Ct) и рассчитывали относительный уровень транскриптов по формуле 2^–∆∆Ct, используя для нормализации уровень транскрипта гена GAPDH. Относительный уровень транскрипта С1-ИНГ человека выражали в относительных единицах (О.Е.) ± стандартное отклонение. н.т. – нетрансфицированные клетки.

Примеры осуществления настоящего изобретения

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды, кодирующей миниген ингибитора С1-эстеразы человека.

Пример1а. Конструирование промежуточных рекомбинантных плазмид pBl-C1LAhyb и pBl-C1LAhyb2.

Получают плазмиды pBl-C1LAhyb и pBl-C1LAhyb2, несущие левое плечо гомологии локуса Serping1 мыши, слитое с последовательностью второго экзона гена SERPING1 человека, и различающиеся способом мутагенеза PAM сайта гидовой РНК sgC1. Левое плечо гомологии содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную гидовой РНК sgC1 (ctgaggctaactggcttcgtagg, 23 п.о., PAM сайт подчеркнут), выбранной для осуществления нокина в локус Serping1 мыши генетической конструкции, кодирующей миниген C1-ИНГ. Поэтому для предотвращения расщепления плазмидной матрицы для репарации нуклеазой Cas9 проводят мутагенез PAM сайта для выбранной гидовой РНК. Однако сайт PAM (agG) совпадает с акцепторным сайтом сплайсинга второго экзона гена Serping1 мыши (консервативные нуклеотиды ag относятся к первому интрону, а с нуклеотида G начинается второй экзон). Поэтому мутагенез сайта PAM проводят двумя способами, учитывая возможный эффект на сплайсинг второго экзона минигена: (1) путем замены нуклеотидов GG на CT (плазмида pBl-C1LAhyb) и (2) путем инсерции нуклеотидов AC перед PAM сайтом (плазмида pBl-C1LAhyb2). Во последнем случае в рекомбинантной плазмиде сохраняется интактный акцепторный сайт сплайсинга второго экзона минигена.

Помимо этого, конструируют гибридное левое плечо гомологии сливая его 3’-часть с 5’-областью второго экзона гена SERPING1 человека таким образом, что второй экзон минигена C1-ИНГ от 5’-конца до кодона инициации трансляции (ATG) содержит нуклеотидную последовательность второго экзона гена мыши, а после ATG кодона следует нуклеотидная последовательность второго экзона и части второго интрона гена SERPING1 человека (Таблица 3, п.1, экзон 2). При этом 19 п.о. второго экзона гена человека начиная с ATG идентичны нуклеотидной последовательности второго экзона гена мыши.

Для получения плазмиды pBl-C1LAhyb с помощью ПЦР амплифицируют фрагмент генома мыши длиной 1954 п.о. (левое плечо гомологии) используя олигонуклеотидные праймеры C1LA_F и C1LA_R (Таблица 1). Продукт ПЦР клонируют в вектор pCR-Blunt (Invitrogen, США) получая плазмиду pCR-C1LA. Полученную плазмиду секвенируют, определяя полную нуклеотидную последовательность ПЦР-продукта. Далее, с помощью ПЦР с праймерами 5sgC1mut и 3sgC1mut (Таблица 1) в плазмиде pCR-C1LA мутируют PAM-сайт для гидовой РНК sgC1 получая плазмиду pCR-C1LAmut. Далее, плазмиду pCR-C1LAmut используют в качестве матрицы в ПЦР-реакции и реамплифицируют последовательность левого плеча гомологии с праймерами 5C1LA_KM и C1LA_R (Таблица 1) для введения сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции KpnI и MssI в 5’-область относительно левого плеча гомологии. Продукт ПЦР клонируют в вектор pCR-Blunt, при этом выбирают вариант плазмиды в котором 3’-конец ПЦР продукта ориентирован в сторону уникального сайта рестрикции XhoI в полилинкере вектора pCR-Blunt. Полученную плазмиду называют pCR-C1LAmutKM. Далее, с помощью ПЦР амплифицируют последовательность второго экзона и части второго интрона гена SERPING1 с праймерами C1ex2_F и C1ex2_R (Таблица 1) и продукт ПЦР клонируют в вектор pCR-Blunt. Для получения гибридной последовательности ДНК между левым плечом гомологии локуса Serping1 мыши и вторым экзоном гена SERPING1 человека из плазмиды pCR-C1LAmutKM вырезают фрагмент BglII-BglI, а из плазмиды pCR-C1ex2 - фрагмент BglI-XhoI, и очищают фрагменты ДНК из агарозного геля с помощью набора QiaexII (Qiagen). Очищенные фрагменты лигируют между собой по сайту BglI, после чего реакцию лигирования переосаждают и полученный фрагмент ДНК клонируют в вектор pCR-C1LAmutKM по сайтам BglII-XhoI получая плазмиду pCR-C1LAhyb. Далее фрагмент KpnI-XhoI клонируют из плазмиды pCR-C1LAhyb в вектор pBluescriptSK(II) (Stratagene, США) по сайтам KpnI-XhoI получая промежуточную рекомбинантную плазмиду pBl-C1LAhyb.

Для получения плазмиды pBl-C1LAhyb2, несущей альтернативный вариант мутации в сайте PAM, не затрагивающий акцепторный сайт сплайсинга второго экзона гена Serping1 мыши, с помощью ПЦР с праймерами 5sgC1mut2 и 3sgC1mut2 (Таблица 1) в плазмиде pCR-C1LA мутируют PAM-сайт для гидовой РНК sgC1 получая плазмиду pCR-C1LAmut2. Далее для получения гибридной последовательности ДНК между левым плечом гомологии и вторым экзоном гена SERPING1 человека из плазмиды pCR-C1LAmut2 вырезают фрагмент BglII-BglI, а из плазмиды pCR-C1ex2 - фрагмент BglI-XhoI, и очищают фрагменты ДНК из агарозного геля с помощью набора QiaexII (Qiagen). Очищенные фрагменты лигируют между собой по сайту BglI, после чего переосаждают реакцию лигирования и полученный фрагмент ДНК клонируют в вектор pBl-C1LAhyb по сайтам BglII-XhoI получая плазмиду pBl-C1LAhyb2.

Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при конструировании рекомбинантных плазмид pBl-C1LAhyb2, pBl-C1LAhyb2 и pBl-SV40-SKIV-C1RA.

Название Нуклеотидная последовательность Длина, нт 1. C1LA_F 5’-TTATGGAAACTCCCTACAGTTTA-3’ 23 2. C1LA_R 5’-ACCAAGACCTGAAGAGTTAATTC-3’ 23 3. 5sgC1mut 5'-CTGAGGCTAACTGGCTTCGTACTACGCAGCTGACA-3' 35 4. 3sgC1mut 5'-TGTCAGCTGCGTAGTACGAAGCCAGTTAGCCTCAG-3' 35 5. 5C1LA_KM 5’-GGTACCGTTTAAACTCCCTACAGTTTAG-3’ 28 6. 5sgC1mut2 5'-TGAGGCTAACTGGCTTCGTACAGGACGCAGC-3' 31 7. 3sgC1mut2 5'-GCTGCGTCCTGTACGAAGCCAGTTAGCCTCA-3' 31 8. C1_F 5’-CCTCTGGCTTATTGTTCTGTTAA-3’ 23 9. C1RA_R 5’-AATGAAACCATGTTCAAGAGTGAA-3’ 24 10. С1ex2_F 5’-GACTGGGGCCTGAGACGGAAT-3’ 21 11. C1ex2_R 5’-CTCGAGTGCGTGTGCAAGGATCACA-3’ 25

Пример1б. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмиды pBl-SV40-SKIV-C1RA

Получают плазмиду pBl-SV40-SKIV-C1RA, несущую правое плечо гомологии для локуса Serping1, и содержащую в 5’-области относительно правого плеча сигнал полиаденилирования из вируса SV40 и терминатор транскрипции из гена SKIV2L человека, необходимый для блокирования возможной аберрантной транскрипции минигена в направлении правого плеча гомологии, которое содержит третий экзон гена Serping1 мыши.

Для этого с помощью ПЦР амплифицируют фрагмент генома мыши длиной 2122 п.о. (правое плечо гомологии) используя олигонуклеотидные праймеры C1_F и C1RA_R (Таблица 1). Продукт ПЦР клонируют в вектор pCR-Blunt (Invitrogen) получая плазмиду pCR-C1RA. Полученную плазмиду секвенируют, определяя полную нуклеотидную последовательность ПЦР-продукта. Фрагмент ДНК длиной 1077 п.о., несущий последовательности SV40 и SKIV2L, клонируют из плазмиды pgATHDR1 (получена ранее в лаборатории) в вектор pBluescript II SK(-) (Stratagene) по сайтам рестрикции XbaI-EcoRI получая плазмиду pBl-SV40-SKIV. Далее в эту плазмиду по сайту EcoRV, обработанному щелочной фосфатазой CIAP (Fermentas, #EF0341) клонируют фрагмент правого плеча гомологии из плазмиды pCR-C1RA, который вырезают с помощью эндонуклеаз рестрикции StuI и BglI, после гидролиза дополнительно обрабатывая сайт BglI ферментом T4 ДНК полимеразой (Thermo Scientific, #EP0061). Полученную плазмиду называют pBl-SV40-SKIV-C1RA.

Пример1в. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмиды pBl-C1Ex3-8

Получают рекомбинантную плазмиду, несущую последовательности с третьего по восьмой экзонов гена SERPING1 человека, разделенных минимизированными интронами. Вначале получают плазмиду pBl-C1ex8. Для этого амплифицируют последовательность восьмого экзона гена SERPING1 вместе с фланкирующими интронными последовательностями с праймерами C1ex8_F (5’-AAGCTTACAGTATGTAATCTGGCAAACA-3’) и C1ex8_R (5’- GCGGCCGCCCTAACCTGATCCTGCA-3’) (Таблица 2), полученный ПЦР продукт клонируют в вектор pCR-Blunt получая pCR-C1ex8. Из вектора pCR-C1ex8 клонируют фрагмент HindIII-NotI в вектор pBluescript II SK(-) по сайтам HindIII-NotI получая pBl-C1ex8.

Далее, с помощью системы NEBuilder (New England Biolabs, США) и набора реагентов NEBuilder HiFi DNA assembly master mix (NEB, #M5520AA) получают плазмиду pBK-C1ex3-7. Для этого сначала проводят in silico конструирование плазмиды pBK-C1ex3-7 и дизайн праймеров для ПЦР используя он-лайн ресурса NEBuilder assembly tool компании NEB по адресу (https://nebuilder.neb.com/#!/). Для этого создают новый проект, определяют полные нуклеотидные последовательности всех фрагментов ДНК и вектора, которые будут объединены в конечную плазмиду, и загружают их в созданный проект. В частности, выбирают фрагменты, содержащие экзоны гена SERPING1, фланкированные интронными последовательностями длиной от 125 до 189 п.о. Выбирают следующие настройки проекта: финальная сборка в виде кольцевой плазмиды, все фрагменты и вектор получают с помощью ПЦР, минимальная длина праймеров 20 нт, минимальная длина перекрывания между праймерами – 20 п.о. В результате in silico конструирования с помощью ресурс NEBuilder assembly tool получают полную нуклеотидную последовательность плазмиды pBK-C1ex3-7, имеющую размер 7160 п.о., и нуклеотидные последовательности праймеров для амплификации фрагментов гена SERPING1 человека и вектора pBK-CMV (Таблица 2), необходимых для сборки сконструированной плазмиды. В соответствии с предложенным дизайном сборки фрагмент минигена C1-INH человека в плазмиде pBK-C1ex3-7 фланкирован уникальными сайтами рестрикции XhoI и HindIII на 5’ и 3’-концах, соответственно.

Таблица 2. Олигонуклеотидные праймеры для амплификации фрагментов гена SERPING1 человека и вектора pBK-CMV, необходимых для сборки плазмиды pBl-C1Ex3-8.

Название Нуклеотидная последовательность Длина фрагмента, п.о. 1. ex3_fwd 5’-GCTCTAGAAGTACTCTCGAGTTCTAAGACAGATTGCTCATC-3’ 840 2. ex3_rev 5’-CTCTCAATCTAAGAATGAAAAGATACATCCCT-3’ 3. ex4_fwd 5’-TTTCATTCTTAGATTGAGAGAACACTTCCAGC-3’ 460 4. ex4_rev 5’-CTTACAGATGAATGCTCCTGCCAAGGTCTTCA-3’ 5. ex56_fwd 5’-CAGGAGCATTCATCTGTAAGAGGAGTGGGC-3’ 882 6. ex56_rev 5’-AGTCAGACCTCCAAGGCTAGAGAAAGGAGAAG-3’ 7 ex7_fwd 5’-CTAGCCTTGGAGGTCTGACTGATGCTTGTTG-3’ 566 8 ex7_rev 5’-GTGGATCCAAAGAATTCAAAAAGCTTCTGAGCCTCCATTTC-3’ 9 pBK_fwd 5’-TTTGAATTCTTTGGATCCAC-3’ 4512 10 pBK_rev 5’-CTCGAGAGTACTTCTAGAGC-3’ 11 C1ex8_F 5’-AAGCTTACAGTATGTAATCTGGCAAACA-3’ 12 C1ex8_R 5’- GCGGCCGCCCTAACCTGATCCTGCA-3’

Далее фрагменты гена SERPING1 человека амплифицируют с помощью ПЦР в реакции объемом 50 мкл с помощью высокоточной ДНК-полимеразы Accuprime Pfx (Invitrogen). Каждая реакция содержит 1-х кратный реакционный буфер для полимеразы Accuprime Pfx, прямой и обратный праймер (Таблица 2) в концентрации 120 нМ, 50 нг геномной ДНК из клеточной линии человека HEK293 в качестве матрицы для ПЦР и 1 ед. активности ДНК-полимеразы Accuprime Pfx. Реакции для амплификации всех фрагментов проводят при следующих условиях: 95°С -3 мин; 2 цикла - 95°С -30 с, 50°С – 30 с, 68°С – 1 мин; 33 цикла - 95°С -30 с, 60°С – 30 с, 68°С – 45 с; 68°С – 3 мин; 4°С -постоянно. 4 мкл каждой реакции анализируют с помощью электрофореза в агарозном. Продукты ПЦР, содержащие только целевой фрагмент, и не содержащие примесей неспецифических фрагментов (экзоны 3, 4 и 7) очищают с помощью набора реагентов для очистки продуктов ПЦР MinElute Reaction Cleanup Kit (Qiagen, #28204), элюируют с помощью 20 мкл стерильной воды. Продукт ПЦР, содержащий примеси неспецифических продуктов (экзон 5 и 6), разделяют в агарозном геле и очищают целевой продукт из агарозного геля с помощью набора реагентов QiaexII (Qiagen), элюируют с помощью 15 мкл стерильной воды. Концентрации полученных продуктов ПЦР измеряют с помощью спектрофотометра NanoPhotometer N120 (Implen). Амплификацию фрагмента вектора pBK-CMV проводят таким же образом, только реакция ПЦР содержит кольцевую плазмиду pBK-CMV в качестве матрицы для ПЦР, а реакцию амплификации проводят при следующих условиях: 95°С -3 мин; 16 циклов - 95°С -30 с, 54°С – 30 с, 68°С – 4 мин 30с; 68°С – 3 мин; 4°С -постоянно. Для удаления кольцевой плазмидной матрицы реакцию ПЦР обрабатывают рестриктазой DpnI, которая специфически расщепляет метилированную в клетках E.coli ДНК, но не продукты ПЦР, которые неметилированы. Далее, амплифицированный вектор очищают из агарозного геля с помощью набора реагентов QiaexII (Qiagen). В Таблице 3 указаны характеристики всех фрагментов гена SERPING1, амплифицированных для конструирования плазмиды, в частности, длина экзонных и фланкирующих интронных последовательностей. Помимо этого, в Таблице 4 приведены геномные координаты всех фрагментов гена SERPING1 человека в соответствии с версией генома человека GRCh38.p14.

Далее проводят реакцию сборки для получения плазмиды pBK-C1ex3-7. В соответствии с рекомендациями компании NEB при сборке плазмиды фрагменты ДНК смешиваются в эквимолярных количествах, а общее количество ДНК в реакции составляет 0.2-0.5 пМ. Поэтому далее рассчитывают молярную концентрацию очищенных фрагментов ДНК и берут в реакцию по 0.05 пМ каждого фрагмента, при этом общее количество ДНК в реакции составляет 0.25 пМ.

Смешивают реакцию в объеме 40 мкл:

2х NEBuilder master mix 20 мкл Фрагмент экзон 3 (0.0158 пМ/мкл) 3.16 мкл Фрагмент экзон 4 (0.0268 пМ/мкл) 1.87 мкл Фрагмент экзоны 5 и 6 (0.0221 пМ/мкл) 2.27 мкл Фрагмент экзон 7 (0.0371пМ/мкл) 1.6 мкл Фрагмент pBK-CMV (0.00034 пМ/мкл) 8.75 мкл Стерильная вода 2.35 мкл

Реакцию инкубируют при +50°С в течение 1 часа, после чего 10 мкл реакции используют для трансформации химически компетентных клеток E.coli XL-1 Blue MRF’ (Stratagene). Полученные на селективной чашке колонии анализируют с помощью ПЦР на наличие минигена С1-ИНГ используя набор реагентов для ПЦР GenPak PCR Core (#U1010-0.8, Лаборатория Изоген, Россия) и праймеры, специфичные для 4 экзона минигена. Из ПЦР-позитивных колоний выделяют плазмидную ДНК и анализируют на предмет корректной сборки плазмиды с помощью рестрикционного анализа с рестриктазами SacI, PstI, PvuII, SphI, EcoRI и BamHI, HincII и XbaI. Образцы с корректным паттерном рестрикции секвенируют по Сэнгеру, полностью определяя нуклеотидную последовательность фрагмента минигена С1-ИНГ в полученной плазмиде pBK-C1ex3-7. Далее, используя уникальные сайты рестрикции, введённые при амплификации фрагментов генома человека, клонируют фрагмент XhoI-HindIII из плазмиды pBK-C1ex3-7 в плазмиду pBl-C1ex8 по сайтам XhoI-HindIII получая промежуточную плазмиду pBl-C1ex3-8.

Таблица 3. Характеристика амплифицированных геномных фрагментов, содержащих экзоны гена SERPING1 человека.

Экзон Длина 5’-интронной последовательности, п.о. Длина экзона, п.о. Длина 3’-интронной последовательности, п.о. Общий размер фрагмента, п.о. 1. 2 нет 74* 155 229 2. 3 155 499 157 811 3. 4 150 135 155 440 4. 5 и 6 155
194** 204
140 194**
169 862 5. 7 127 220 189 563 6. 8 142 278 нет 420

*Второй экзон минигена представляет собой гибридный экзон длиной 74 п.о., состоящий из 23 п.о. 5’-области второго экзона гена Serping1 мыши вплоть до ATG кодона и из 51 п.о. второго экзона гена человека.

** Пятый интрон гена SERPING1 человека имеет длину 194 п.о., поэтому этот интрон не был минимизирован, и экзоны 5 и 6 были амплифицированы в виде одного фрагмента, включающего эндогенный пятый интрон между ними, и фланкированного последовательностями четвертого и шестого интронов.

Таблица 4. Геномные координаты фрагментов ДНК гена SERPING1 из которых сконструирован миниген С1-ИНГ человека.

Фрагмент Длина Координаты по pgC1HDR (SEQ ID NO:1) Геномные координаты Гибридный экзон 2* 229 п.о. 4012…4240 57598253…57598476 Экзон 3 811 п.о. 4242…5052 57599724…57600534 Экзон 4 440 п.о. 5053…5492 57601885…57602324 Экзоны 5 и 6 862 п.о. 5493…6354 57605855…57606716 Экзон 7 536 п.о. 6355…6890 57611590…57612125 Экзон 8 420 п.о. 6891…7310 57614185…57614605

(Указаны геномные координаты 11 хромосомы согласно сборке генома человека GRCh38.p14 Primary Assembly). *Гибридный экзон содержит в 5’-части 23 п.о. второго экзона гена мыши, из которых 18 п.о. перед кодоном ATG идентичны таковым из 5’-части второго экзона гена человека, за исключением пар оснований в позициях -7 и -12 относительно ATG кодона. Пять пар оснований на 5’-конце гибридного экзона не имеют гомологии с геномом человека, поэтому общий размер фрагмента 229 п.о. на 5 п.о. длиннее области гомологии с геномом человека, указанной в столбце Геномные координаты.

Пример 1г. Конструирование плазмид pgC1HDR и pgC1HDRSpl

Сначала получают плазмиду pBl-C1LAhybEx2-8 клонируя фрагмент XhoI-NotI из вектора pBl-C1ex3-8 в плазмиду pBl-C1LAhyb по сайтам XhoI-NotI. Конечную плазмиду pgC1HDR, несущую миниген C1-INH человека и терминатор транскрипции SKIV, фланкированные плечами гомологии локуса Serping1 мыши, получают путем клонирования фрагмента MssI-NotI из плазмиды pBl-C1LAhybEx2-8 в вектор pBl-SV40-SKIV-C1RA по сайтам рестрикции Ecl136I-NotI.

Плазмиду pgC1HDRSpl, аналогичную pgC1HDR, но несущую альтернативную мутацию PAM-сайта для гидовой РНК sgC1, получают путем клонирования фрагмента XhoI-NotI из вектора pBl-C1ex3-8 в плазмиду pBl-C1LAhyb2 по сайтам XhoI-NotI, получая вектор pBl-C1LAhyb2Ex2-8, из которого клонируют фрагмент MssI-NotI в вектор pBl-SV40-SKIV-C1RA по сайтам рестрикции Ecl136I-NotI.

Сконструированная рекомбинантная плазмида pgC1HDR (SEQ ID NO: 1) имеет размер 10885 п.о. и включает в себя следующие элементы: промотор гена β-лактамазы в позиции 24-128 п.о. длиной 105 п.о., открытая рамка считывания β-лактамазы в позиции 129-989 п.о. длиной 861 п.о., точка начала репликации ColE1/pMB1/pBR322/pUC в позиции 1160-1748 п.о. длиной 589 п.о., сайт связывания белка CAP (Catabolite activator protein) в позиции 2036-2057 п.о. длиной 22 п.о., Lac промотор в позиции 2072-2102 п.о. длиной 31 п.о., Lac оператор в позиции 2110-2126 длиной 17 п.о., промотор РНК полимеразы бактериофага T3 в позиции 2171-2189 длиной 19 п.о., cигнал полиаденилирования из вируса SV40 в позиции 7322-7583 п.о. длиной 262 п.о., промотор РНК полимеразы бактериофага T7 в позиции 10242-10260 п.о. длиной 19 п.о., точка начала репликации бактериофага f1 в позиции 10428-10856 п.о. длиной 429 п.о., терминатор транскрипции из гена SKIV2L человека в позиции 7615-8383 п.о. длиной 769 п.о., левое плечо гомологии для локуса гена Serping1 мыши в позиции 2205-4011 п.о. длиной 1807 п.о., правое плечо гомологии для локуса гена Serping1 мыши в позиции 8402-10188 п.о. длиной 1787 п.о., первый экзон гена Serping1 мыши в позиции 3396-3462 п.о. длиной 67 п.о., третий экзон гена Serping1 мыши в позиции 9547-10060 п.о. длиной 514 п.о., мутированный PAM сайт в позиции 4009-4011 п.о. длиной 3 п.о., миниген С1-ИНГ человека в позиции 4012..7310 длиной 3299 п.о., кодон инициации трансляции белка C1-ИНГ в позиции 4035-4037 п.о. длиной 3 п.о. и кодон терминации трансляции белка C1-ИНГ в позиции 7284-7286 п.о. длиной 3 п.о.

Сконструированная рекомбинантная плазмида pgC1HDRSpl (SEQ ID NO: 2) имеет размер 10887 п.о., и отличается от плазмиды pgC1HDR тем, что в позиции 4011 вместо нуклеотида T содержится нуклеотид A, а в позициях 4012-4013 содержатся два дополнительных нуклеотида GG. Следовательно, к координатам всех элементов плазмиды pgC1HDRSpl, расположенных после мутированного сайта PAM, прибавляется два нуклеотида.

Генетическая карта плазмиды pgC1HDR приведена на Фиг.1. Генетическая карта плазмиды pgC1HDRSpl соответствует таковой для pgC1HDR.

Пример 1д. Конструирование плазмиды pсC1HDR несущей кДНК С1-ИНГ человека

Для оценки паттерна сплайсинга минигена и уровня экспрессии транскрипта минигена конструируют контрольную рекомбинантную плазмиду, несущую кДНК С1-ИНГ человека вместо минигена. Для этого кДНК С1-ИНГ человека амплифицируют с помощью ПЦР с праймерами 5C1Hs_end (5-cctggtgaccagaagtttgga-3) и C1ex8_R (Таблица 2) на матрице первых цепей кДНК из клеток HEK293. Продукт ПЦР клонируют в вектор pCR-Blunt, получая плазмиду pCR-cC1. Далее вырезают фрагмент BglII-BglI из плазмиды pCR-C1LAmut2 и фрагмент BglI-NotI из плазмиды pCR-cC1, фрагменты лигируют, далее очищают из лигазной смеси и клонируют в вектор pCR-C1LAmutKM по сайтам BglII-NotI получая плазмиду pCR-C1LAhybC. Для получения конечной плазмиды, несущей кДНК С1-ИНГ человека и терминатор транскрипции SKIV, фланкированные плечами гомологии для локуса Serping1 мыши, из вектора pCR-C1LAhybC клонируют фрагмент MssI-NotI в вектор pBl-SV40-SKIV-C1RA по сайтам рестрикции Ecl136I-NotI.

Сконструированная рекомбинантная плазмида pсC1HDR (SEQ ID NO: 3) имеет размер 9138 п.о., и включает в себя следующие элементы: промотор гена β-лактамазы в позиции 24-128 п.о. длиной 105 п.о., открытая рамка считывания β-лактамазы в позиции 129-989 п.о. длиной 861 п.о., точка начала репликации ColE1/pMB1/pBR322/pUC в позиции 1160-1748 п.о. длиной 589 п.о., сайт связывания белка CAP (Catabolite activator protein) в позиции 2036-2057 п.о. длиной 22 п.о., Lac промотор в позиции 2072-2102 п.о. длиной 31 п.о., Lac оператор в позиции 2110-2126 длиной 17 п.о., промотор РНК полимеразы бактериофага T3 в позиции 2171-2189 длиной 19 п.о., cигнал полиаденилирования из вируса SV40 в позиции 5575-5836 п.о. длиной 262 п.о., промотор РНК полимеразы бактериофага T7 в позиции 8495-8513 п.о. длиной 19 п.о., точка начала репликации бактериофага f1 в позиции 8681-9109 п.о. длиной 429 п.о., терминатор транскрипции из гена SKIV2L человека в позиции 5868-6636 п.о. длиной 769 п.о., левое плечо гомологии для локуса гена Serping1 мыши в позиции 2205-4011 п.о. длиной 1807 п.о., правое плечо гомологии для локуса гена Serping1 мыши в позиции 6655-8441 п.о. длиной 1787 п.о., первый экзон гена Serping1 мыши в позиции 3396-3462 п.о. длиной 67 п.о., третий экзон гена Serping1 мыши в позиции 7800-8313 п.о. длиной 514 п.о., мутированный PAM сайт в позиции 4009-4011 п.о. длиной 3 п.о., кДНК С1-ИНГ человека в позиции 4037-5536 длиной 1500 п.о., кодон инициации трансляции белка C1-ИНГ в позиции 4037-4039 п.о. длиной 3 п.о. и кодон терминации трансляции белка C1-ИНГ в позиции 5537-5539 п.о. длиной 3 п.о.

Пример 2. Анализ экспрессии минигена, кодирующего ингибитор С1-эстеразы человека, в клетках мыши и человека.

Пример 2а. Трансфекция клеток линий MH22a и HepG2 плазмидной ДНК.

Клетки линий MH22a (гепатома мыши, Российская Коллекция Культур Клеток Позвоночных (РКККП)) и HepG2 (гепатоклеточная карцинома человека, (РКККП)) культивируют в среде DMEM/High Modified (HyClone, #SH30285.01) с добавлением 10%-ой фетальной бычей сыворотки (HyClone #SV30160.03), 2 мМ L-глутамина (Gibco, #25030) и 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, #15140) в увлажнённой атмосфере в присутствии 5% CO₂. Для трансфекции клетки рассевают в лунки 6-ти луночного планшета (Costar, #3506) в количестве 250 000 (MH22a) и 400 000 (HepG2) клеток в лунку. На следующий день клетки трансфицируют плазмидной ДНК (pgC1HDR, pgC1HDRSpl и pcC1HDR) с использованием реагента для трансфекции EcoTransfect (OZ Bioscience, #ET11000). Для этого смешивают 80 мкл среды DMEM/High Modified (HyClone), не содержащей сыворотку, L-глутамин и антибиотики, и 20 мкл плазмидной ДНК в концентрации 100 нг/мкл (общее количество ДНК на лунку – 2 мкг). Затем смешивают 100 мкл такой же среды и 2 мкл реагента EcoTransfect, и добавляют по каплям к смеси, содержащей плазмидную ДНК. Аккуратно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 20 минут. Далее, полученную смесь аккуратно по каплям добавляют в лунки 6-ти луночного планшета и перемешивают, осторожно наклоняя планшет. После трансфекции клетки культивируют 72 часа, после чего выделяют суммарную РНК.

Пример 2б. Выделение суммарной РНК из трансфицированных клеток линий MH22a и HepG2.

Cуммарную РНК из трансфицированных клеток линий MH22a и HepG2 выделяют с помощью набора реагентов RNeasy mini kit (Qiagen, #74104), дополнительно обрабатывая РНК ферментом ДНКазой для удаления примесей геномной ДНК и трансфицированной плазмидной ДНК. Для этого с помощью водоструйного насоса удаляют из лунок планшета культуральную среду и добавляют 2 мл фосфатно-солевого буфера без кальция и магния (ICN, # 1760420), промывают клетки от остатков среды и удаляют буфер. Далее, к клеткам добавляют 350 мкл буфера RLT, содержащего 3.5 мкл β-меркаптоэтанола, и смывают клетки с планшета с помощью автоматического дозатора с наконечником объемом 1 мл, переносят лизат в стерильную микроцентрифужную пробирку. Для гомогенизации лизат пропускают 5 раз через иглу калибра 23G с помощью стерильного одноразового шприца объемом 2 мл. Полученные лизаты замораживают и хранят при -70 С. Для выделения РНК лизаты оттаивают при +37°С, добавляют равный объем 70%-го спирта, перемешивают пипетированием и наносят лизат на колонку из набора RNeasy mini kit, центрифугируют 30 с при скорости 16000g для связывания РНК с колонкой. Далее колонку промывают, используя 350 мкл буфера RW1, после чего обрабатывают РНК на колонке с помощью ДНКазы из набора RNase-free DNase set (Qiagen, #79254). Для этого смешивают 70 мкл буфера RDD и 10 мкл ДНКазы, наносят смесь на колонку и инкубируют 15 мин при комнатной температуре. Далее, колонку промывают, используя 350 мкл буфера RW1, удаляют проскок. Затем, колонку дважды промывают, используя 500 мкл буфера RPE, центрифугируют первый раз 15 с, удаляют проскок, второй раз - 2 мин для подсушивания РНК. Связанную с колонкой РНК элюируют с помощью 50 мкл стерильной воды свободной от РНКаз, концентрацию РНК определяют с помощью спектрофотометра NanoPhotometer N120 (Implen).

Пример2в. Проведение реакции обратной транскрипции.

Реакцию обратной транскрипции проводят с использованием набора реагентов SuperScript IV VILO Master Mix with ezDNase (Thermo Fisher Scientific, # 11766050) используя 500 нг суммарной РНК на одну реакцию. В стрипованных пробирках 0.2mL SnapStrip II PCR Tubes (SSIbio, #3245-00) смешивают 1000 нг РНК каждого из образцов (из расчета на две реакции: с добавлением обратной транскриптазы и контрольную без добавления обратной транскриптазы) со стерильной водой в объеме 8 мкл. Добавляют 1 мкл 10-кратного буфера для ezDNase и 1 мкл ДНКазы ezDNase, перемешивают реакцию и инкубируют при +37°С в течение 2 мин, после чего реакции переносят в лед. Далее на льду добавляют в каждую реакцию 6 мкл стерильной воды, перемешивают и переносят 8 мкл в чистые стрипованные пробирки. Далее, в одну из пробирок, добавляют 2 мкл мастермикса с обратной транскриптазой, а в соответствующую ей вторую пробирку с тем же образцом – 2 мкл мастермикса без обратной транскриптазы. Реакции аккуратно перемешивают, осаждают жидкость центрифугированием. Инкубируют в ПЦР-амплификаторе Dyad (Bio-Rad) при следующих условиях: +25°С – 10 мин, +50°С – 10 мин, +85°С – 5 мин. Затем добавляют 20 мкл стерильной воды для разведения образца и хранят при -80°С.

Пример 2г. Анализ паттерна экспрессии и сплайсинга полноразмерного транскрипта минигена C1-ИНГ с помощью ПЦР.

Экспрессию полноразмерного транскрипта минигена C1-ИНГ человека и паттерн сплайсинга анализируют с помощью ПЦР с детекцией продуктов реакции в агарозном геле используя мастермикс LongAmp^® Hot Start Taq 2X Master Mix (NEB, #M0533S). Смешивают реакцию объемом 8 мкл, содержащую 1-х кратный LongAmp мастермикс, прямой и обратный праймеры в концентрации 500 нМ и 1 мкл реакции обратной транскрипции в качестве матрицы. Амплификацию проводят в амплификаторе Dyad (Bio-Rad) при следующих условиях: 94°С – 3 мин; 32 цикла -94°С – 30с, 63°С – 30 с, 65°С -1 мин 30 с; 65°С – 5 мин, 4°С – постоянно. Далее 4 мкл реакции ПЦР разделяют в 1%-ом ТАЕ-агарозном геле. Документацию результатов электрофореза проводят с помощью системы гель-документации ChemiDoc XRS (Bio-Rad).

Фрагмент транскрипта гена SERPING1 человека длиной 1506 п.о. амплифицируют в ПЦР используя праймеры 5C1Hs_end (5-cctggtgaccagaagtttgga -3, SEQ ID NO: 4) и 3C1Hs_end (5-aacttgtgctgctggtcccaga -3, SEQ ID NO: 5) ожигающиеся на последовательности первого и восьмого экзонов гена.

Фрагмент транскрипта гена Serping1 мыши длиной 1474 п.о. амплифицируют в ПЦР используя праймеры 5C1Mm_end (5-tgcctagtgaccaagaacttg-3, SEQ ID NO: 6) и 3C1Mm_end (5-agatgggtaagcttcggccaaa-3, SEQ ID NO: 7) ожигающиеся на последовательности первого и восьмого экзонов гена.

Фрагмент транскрипта минигена С1-ИНГ мыши длиной 1576 п.о. амплифицируют в ПЦР используя праймеры 5C1Mm_end (5-tgcctagtgaccaagaacttg-3, SEQ ID NO: 6) и C1ex8_R (5-gcggccgccctaacctgatcctgca -3, SEQ ID NO: 8) ожигающиеся на последовательности первого экзона гена Serping1 мыши в левом плече гомологии и восьмого экзона минигена С1-ИНГ человека.

Как видно из Фиг.3, праймеры на транскрипт человека (панель Hs) амплифицируют только эндогенный транскрипт гена SERPING1 из клеток HepG2, но не амплифицируют транскрипт гена мыши из печени или транскрипт минигена из трансфицированных клеток линии MH22a. Аналогично, праймеры на транскрипт гена мыши (панель Mm) амплифицируют только эндогенный транскрипт из печени мыши, но не транскрипт из клеток HepG2 или транскрипт минигена из трансфицированных клеток MH22a, а праймеры на миниген (панель Mg) амплифицируют только транскрипт минигена. Таким образом, предложенные пары праймеров позволяют специфически детектировать каждый из транскриптов. Кроме того, из Фиг.3 видно, что во всех трех образцах амплифицируется фрагмент, соответствующий ожидаемому размеру корректно сплайсированного транскрипта около 1500 п.о.

Далее, сходным образом анализируют паттерн сплайсинга транскрипта С1-ИНГ, кодируемого соответствующими плазмидами при трансфекции их в клетки HepG2 и MH22a. Параллельно анализируют экспрессию эндогенных транскриптов С1-ИНГ человека и мыши. Из Фиг.4 видно, что во всех образцах трансфицированных клеток (панель Mg) амплифицируется преимущественно фрагмент, соответствующий полноразмерному корректно сплайсированному транскрипту. В случае плазмид pgC1HDR и pgC1HDRSpl, также детектируется полоса меньшей интенсивности, длиной примерно 2 т.п.о. Данная полоса может отражать присутствие в образце транскрипта, содержащего несплайсированный интрон. Важно отметить, что, во-первых, интенсивность такой полосы существенно ниже по сравнению с интенсивностью полосы, соответствующей корректно сплайсированному транскрипту. Во-вторых, наличие такой же полосы детектируется и при амплификации эндогенного транскрипта человека (Фиг.4, панель Hs). В результате секвенирования этого продукта ПЦР по Сэнгеру было установлено, что это транскрипт минигена, содержащий несплайсированный интрон. Важно отметить, что при сплайсинге транскрипта минигена неизбежно будут присутствовать промежуточные формы пре-мРНК, содержащие несплайсированные интроны. Учитывая достаточно высокий уровень экспрессии транскрипта минигена при транзиторной трансфекции плазмид в клетки можно предположить, что за счет высокой чувствительности ПЦР действительно амплифицируется один из промежуточных вариантов пре-мРНК, содержащий несплайсированный интрон. Тем не менее, стоит отметить, что интенсивность такой полосы существенно ниже по сравнению с полосой, соответствующей корректно сплайсированному транскрипту.

Как и ожидалось, в клетках HepG2, но не в MH22a, c праймерами на эндогенный транскрипт гена SERPING1 амплифицировали фрагмент длиной 1500 п.о. (панель Hs). C праймерами на эндогенный транскрипт гена мыши (панель Mm) не отмечалось амплификации каких-либо продуктов, так как в клеточной линии MH22a не экспрессируется ген Serping1 (Фиг.3).

Кроме того, для проверки корректности сплайсинга первого экзона гена мыши и второго гибридного экзона минигена, в котором мутированный сайт PAM совпадает с 5’-сайтом сплайсинга второго экзона, амплифицированные фрагменты транскриптов, кодируемых сконструированными плазмидами, выделяют из агарозного геля с помощью набора реактивов QiaexII, клонируют в плазмидный вектор pJET1.2 (Thermo Scientific) и секвенируют по Сэнгеру.

В результате секвенирования определяют, что в случае транскрипта, кодируемого плазмидой pgC1HDR с мутацией консервативного динуклеотида AG 5’-сайта сплайcинга второго экзона, первый интрон заканчивается на следующий динуклеотид AG в 3’-сторону, а второй экзон начинается с последовательности CTGACAT (Фиг.5). Интересно отметить, что в случае альтернативного мутагенеза PAM сайта с помощью инсерции нуклеотидов CT в плазмиде pgC1HDRSpl сохраняется динуклеотид AG дикого типа, однако сплайсинг транскрипта также идет с использованием следующего AG в 3’-области, как и в случае плазмиды pgC1HDR. Важно отметить, что в случае транскрипта, кодируемого плазмидой pcC1HDR, несущий PAM сайт, мутированный таким же образом, как и в плазмиде pgC1HDRSpl, сплайсинг, тем не менее, проходит с использованием первого динуклеотида AG, как и в транскрипте гена Serping1 мыши дикого типа (wt) (Фиг.5). Таким образом, при обоих вариантах мутагенеза PAM сайта гидовой РНК sgC1 сплайсинг первого и второго экзонов происходит таким образом, что формируется корректный транскрипт и не нарушается кодирующая последовательность белка С1-ИНГ человека. В целом, сплайсинг всех транскриптов, кодируемых предложенными в данном изобретении рекомбинантными плазмидами происходит корректно, с образованием преимущественно транскрипта ожидаемого размера, корректность которого также подтверждается с помощью секвенирования по Сэнгеру. Таким образом, можно сделать вывод, что предложенный способ конструирования минигенов путем минимизации протяженных интронов с сохранением интронных последовательностей длиной от 125 до 189 п.о., позволяет получать функциональные минигены, которые корректно сплайсируются с образованием полноразмерного транскрипта С1-ИНГ человека.

Пример 2д. Определение уровня транскрипта минигена C1-ИНГ человека с помощью количественной ПЦР.

Количественную ПЦР проводят, используя мастермикс iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix (#1725121, Bio-Rad), реакции объемом 20 мкл смешивают в стрипованных пробирках 0.2 ml 8-Tube PCR Strips without Caps, low profile, clear (#TLS0801, Bio-Rad) и закрывают стрипованными оптически прозрачными крышками 0.2 ml Flat PCR Tube 8-Cap Strips, optical, ultraclear (#TCS0803, Bio-Rad). Одна реакция содержит 1-х кратный мастермикс, прямой и обратный праймеры в концентрации 200 нМ, и 2 мкл реакции обратной транскрипции в качестве матрицы для ПЦР. Амплификацию проводят в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad) при следующих условиях: 95°C – 1 мин; 45 циклов: 95°С – 15 с, 60°C – 30 с, детекция флуоресценции; анализ кривой плавления от 60°С до 95°С с интервалом 0.5°С. Из графиков амплификации определяют значения порогового цикла (Ct) для всех транскриптов, и рассчитывают относительный уровень экспрессии по формуле 2^–∆∆Ct, как описано в работе [Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 2008;3(6):1101-8. doi: 10.1038/nprot.2008.73. PMID:18546601.] В качестве референсного гена используют транскрипт гена GAPDH человека или мыши, в зависимости от образца. Фрагмент транскрипта гена SERPING1 человека или минигена C1-ИНГ длиной 133 п.о. амплифицируют с праймерами 5qHsC1 (5-gaaggtcgcaacaacagttatc-3; SEQ ID NO: 9) и 3qHsC1 (5-ggtgggttcatcagtggtatta-3; SEQ ID NO: 10). Фрагмент транскрипта гена GAPDH человека длиной 131 п.о. амплифицируют с праймерами 5qGAPD (5-gtctcctctgacttcaacagcg-3; SEQ ID NO: 11) и 3qGAPD (5-accaccctgttgctgtagccaa-3: SEQ ID NO: 12). Фрагмент транскрипта гена Gapdh мыши длиной 153 п.о. амплифицируют с праймерами 5qMmGAPD (5-catcactgccacccagaagactg-3; SEQ ID NO: 13) и 3qMmGAPD (5-atgccagtgagcttcccgttcag-3; SEQ ID NO: 14). Как видно из Фиг.6, уровень экспрессии транскрипта С1-ИНГ человека, кодируемого минигеном, в клетках Hno5G2 был в 2.1 (pgC1HDR) и 1.57 (pgC1HDRSpl) раз выше по сравнению с уровнем транскрипта, кодируемого кДНК (pcC1HDR), а в клетках MH22a - в 6.35 (pgC1HDR) и 6.67 (pgC1HDRSpl) раз выше. Эти результаты свидетельствуют о том, что использование минигена С1-ИНГ человека в генетических конструкциях обеспечивает более высокий уровень экспрессии транскрипта по сравнению с конструкциями, несущими кДНК С1-ИНГ.

Изобретение относится к рекомбинантной плазмидной ДНК pgC1HDR, включающей миниген ингибитора С1-эстеразы человека (C1-ИНГ), фланкированный геномными последовательностями локуса Serping1 мыши, при этом экспрессия минигена контролируется промотором гена Serping1 мыши, сигнал полиаденилирования вируса SV40 и терминатор транскрипции из гена SKIV2L человека. Предложен способ конструирования минигенов, заключающийся в получении плазмидной конструкции, несущей все кодирующие экзоны гена, фланкированные интронными последовательностями, обеспечивающими корректный сплайсинг минигена, способ детекции полноразмерных транскриптов минигена C1-ИНГ и генов SERPING1 человека и Serping1 мыши, а также способ оценки уровней транскриптов гена SERPING1 человека и минигена С1-ИНГ человека с помощью количественной ПЦР и олигонуклеотидные праймеры для их осуществления. Изобретение позволяет получить генно-модифицированных мышей, гуманизированных по гену Serping1. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл., 2 пр.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК последовательностью SEQ ID NO: 1 для экспрессии минигена ингибитора С1-эстеразы человека и для получения генно-модифицированных мышей, гуманизированных по гену Serping1, кодирующая миниген ингибитора С1-эстеразы человека под транскрипционным контролем регуляторных элементов гена Serping1 мыши, сигнала полиаденилирования вируса SV40 и терминатора транскрипции из гена SKIV2L человека, а также несущая плечи гомологии локуса Serping1 мыши с мутированным сайтом PAM, которые обеспечивают возможность CRISPR/Cas9-опосредованной интеграции плазмиды в локус Serping1.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК по п.1, отличающаяся тем, что PAM сайт локуса Serping1 мыши мутирован таким способом, что в позиции 4011 вместо нуклеотида T содержится нуклеотид А, а в позициях 4012-4013 содержатся два дополнительных нуклеотида GG, и имеющая соответственно последовательность SEQ ID NO: 2.

3. Рекомбинантная плазмидная ДНК по п.2 для оценки эффективности и паттерна сплайсинга, отличающаяся тем, что вместо минигена ингибитора С1-эстеразы человека в позициях 4037-5536 содержится открытая рамка считывания, кодирующая белок ингибитор С1-эстеразы человека, и имеющая соответственно последовательность SEQ ID NO: 3.

4. Способ конструирования минигена ингибитора С1-эстеразы человека, включающий следующие стадии:

1) амплификацию с помощью ПЦР всех кодирующих экзонов гена SERPING1 человека, фланкированных интронными последовательностями протяженностью от 127 до 189 п.о.;

2) клонирование полученных фрагментов ДНК, несущих кодирующие экзоны гена SERPING1 человека, в плазмидные конструкции, несущие сигнал полиаденилирования вируса SV40, терминатор транскрипции из гена SKIV2L человека и плечи гомологии локуса Serping1 мыши с мутированным сайтом PAM;

3) конструирование на их основе рекомбинантных плазмид по пп.1, 2 путем клонирования фрагментов.

5. Способ конструирования минигена ингибитора С1-эстеразы по п.4, отличающийся тем, что амплифицированные фрагменты гена SERPING1, включающие с 3 по 7 экзоны, клонируют в промежуточный плазмидный вектор с помощью системы NEBuilder (NEB).

6. Способ специфической ПЦР-амплификации полноразмерных транскриптов минигена ингибитора С1-эстеразы человека, экспрессия которых происходит с использованием плазмид по пп.1, 2, кДНК ингибитора С1-эстеразы человека, экспрессия которой происходит с использованием плазмиды по п. 3, и генов SERPING1 человека и Serping1 мыши, включающий

1) выделение суммарной РНК из тканей мыши или клеточных линий человека или мыши;

2) проведение реакции обратной транскрипции и реакции ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 с последующей детекцией ампликонов с помощью электрофореза в агарозном геле.

7. Способ оценки уровней транскриптов минигена ингибитора С1-эстеразы человека, экспрессия которых происходит с использованием плазмид по пп.1, 2, кДНК ингибитора С1-эстеразы человека, экспрессия которой происходит с использованием плазмиды по п. 3, и гена SERPING1 человека с помощью количественной ПЦР, включающий:

1) выделение суммарной РНК из тканей мыши или клеточных линий человека или мыши;

2) проведение реакции обратной транскрипции и проведение количественной ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, с последующей детекцией результатов с помощью интеркалирующего красителя SYBR Green I или его аналогов.