Идентификация дрожжеподобного гриба Candida auris Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/04 C12N1/16 C12R1/72 

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного выявления и идентификации дрожжеподобного гриба Candida auris в лабораторной диагностике, микологии.

Колонизация и инфицирование Candida auris среди госпитализированных пациентов и лиц, находящихся на длительном лечении, стала глобальной проблемой, Candida auris является распространенным оппортунистическим патогеном, представляющим серьезную угрозу здоровью. Данный микроорганизм трудно идентифицировать стандартными лабораторными методами. Возбудитель легко распространяется в медицинских учреждениях, способен вызывать групповые заболевания и распространяться внутри медицинской организации. По этой причине важно быстро идентифицировать Candida auris у госпитализированного пациента, чтобы принять меры для предотвращения распространения и возникновения вспышечной заболеваемости. Уязвимыми являются иммунокомпроментированные лица - пожилые, ослабленные хроническими и острыми заболеваниями (онкозаболевания, политравма, сахарный диабет, сепсис, пневмонии, почечная недостаточность и т.п.), новорожденные, люди после пересадки органов и косного мозга, ВИЧ-инфицированные. Особая опасность представляется для отделений интенсивной терапии (ОИТ) и пациентов с тяжелой формой COVID -19. Симптомы некоторых грибковых заболеваний могут быть аналогичны симптомам симптомам COVID-19, включая лихорадку, кашель и одышку. Лабораторное тестирование необходимо для определения того, есть ли у человека грибковая инфекция или COVID-19. У некоторых пациентов может быть COVID-19 и грибковая инфекция одновременно. Сочетанные инфекции ведут к тяжести заболевания и смерти пациентов. Candida auris - внутрибольничный патоген, отличающийся множественной лекарственной устойчивостью (устойчива к флуконазолу и может быть устойчива к вориконазолу, АмВ и эхинокандинам). Во «Временных методических рекомендациях «Профилактика, диагностика и лечение новой короновирусной инфекции (COVID-19)» (Версия14 (27.12.22, стр. 27 - 28) 4.2.4.) в разделе «Диагностика инвазивного аспергиллеза, инвазивного кандидоза и мукормикоза у больных COVID-19» прослеживается озабоченность о существующим среднем времени выявления Candida spp. (при посеве крови, составляет от 18 часов до 3-х суток и может достигать 8 дней для C. glabrata). При выделении Candida spp., из стерильных в норме биосубстратов, следует обязательно определить вид возбудителя и его чувствительность in vitro стандартным методом. Надежные методы ПЦР диагностики инвазивного аспергиллеза и инвазивного кандидоза в настоящее время не разработаны.

В методических рекомендациях «Грибы рода CANDIDA (Методы выделения, идентификации на видовом уровне и определение чувствительности к противогрибковым препаратам)» (НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), М. 2009, описаны методы выделения и идентификации грибов рода Candida, определению чувствительности их к антигрибковым препаратам (антимикотикам), однако Candida auris была впервые идентифицирована в 2010 году, 2021 году CDC выделены штаммы, которые были невосприимчивы ко всем существующим лекарствам, используемым для лечения грибковых инфекций.

Лабораторная диагностика инфекции Candida auris с использованием доступных тест-систем затруднительна ввиду частых ошибок идентификации. Наиболее высокой степенью точности обладает метод, основанный на матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF) и способен отличить Candida auris от других видов Candida. Такая услуга доступна крупным бактериологическим лабораториям, но не доступна для обычных клинических и бактериологических лабораторий. Для бактериологического контроля Candida spp. (Candida albicans и других видов грибов рода Candida) рекомендовано использование питательных сред: «Питательная среда для контроля микробной загрязненности» (Питательная среда (ГРМ №2 (Сабуро)», «Питательная среда для выделения и культивирования дрожжеподобных и плесневых грибов (Сабуро - мальтоза агар)», триптикоза - соевого агара по ОФС.1.2.4.0003.15 (ГФ РФ Государственная Фармокопея Российской Федерации XIV издание), МУК 4.2.2942-11 (Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях), регламентирующим перечень питательных сред для выявления Candida albicans.

Ведущими зарубежными фирмами MERCK, HiMedia выпускаются сухие питательные среды для обнаружения Candida spp.): Соево-казеиновый агар (Casein Soya Bean Digest agar) HiMedia, Агар Сабуро с глюкозой (Sabouraud 4% Glucose Agar) HiMedi, Бульон Сабуро (Sabouraud Broth), Агар Сабуро с глюкозой (Sabouraud 4% Glucose Agar) HiMedia, Декстрозный агар Сабуро с4% Glucose Agar) HiMedi, Бульон Сабуро (Sabouraud Broth), Агар Сабуро с глюкозой (Sabouraud 4% Glucose Agar) HiMedia, Декстрозный агар Сабуро с соевым лецитином и Твин 80 HiMedia (ФСЗ 2009/03709.

Недостатком вышеперечисленных сред является одинаковый рост колоний Candida spp. что не позволяет провести идентификацию до вида.

Для идентификации и дифференциации C. albicans и других видов Candida в клинических и неклинических образцах используют хромогенную среду: «HiCrome Candida Differential agar» M1297A состоящий из следующих компонентов г/л: пептон особый - 15,0 г/л, дрожжевой экстракт - 4,0г/л, дикалий гидрофосфат - 1,0 г/л, хромогенная смесь - 7,22 г/л, хлорамфеникол - 0,500 г/л, агар микробиологический - 15 г/л

«HiCrome Candida Differential agar» является альтернативой традиционным средам для выделения и идентификации Candida spp. Хромогенные субстраты, содержащиеся в данной среде, позволяют быстро идентифицировать и дифференцировать различные виды кандид по цвету колоний. Колонии Candida albicans - зеленые, Candida krusei - фиолетово-розовые, Candida tropicalis - синие, Candida glabrata и Candida parapsilosis - бледно-фиолетовый. Candida auris может иметь на данной среде розовый, красный, кремовый или фиолетовый цвет, а также иметь сочетание этих цветов на одной чашке.

Слабовыраженное окрашивание колоний Candida auris, приводит к сомнительным дифференцирующим свойствам.

Рекомендованной и наиболее используемой для идентификации Candida spp. служит «Питательная среда для выращивания дрожжевых и плесневых грибов (агар Сабуро)». Состав питательной среды (агар Сабуро): панкреатический гидролизат рыбной муки - 10 г/л, панкреатический гидролизат казеина - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 2,0 г/л, натрий фосфорнокислый однозамещенный - 2 г/л, глюкоза моногидрат - 40 г/л, агар микробиологический - 10,0 +/- 3,0, вода очищенная - 1 л, мл, рН 6,0. Навеску, соответственно прописи, растворяют в 1 л дистиллированной воды, автоклавировать 15 мин. при 121°С, после охлаждения до 50 - 45°С разливают в стерильные чашки Петри.

Высев до единичных колоний проводят общепринятым микробиологическим методом, посевы инкубировать при температуре 20-25°С в течение 24±72ч. Данная среда традиционно используется для микробиологической практики.

На агаре Сабуро рост Candida spp. в виде белых колоний среднего размера, а рост Candida auris в виде более мелких белых колоний, что затрудняет идентификацию Candida spp. до вида.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ идентификации гриба Candida albicans,( RU, патент № 2386693) предусматривающий посев гриба на среде с индикаторами, инкубацию при 37°С и выделение культуры гриба по изменению цвета колоний на среде, посев осуществляют на агар Сабуро, содержащий среду Гисса с глюкозой и среду Гисса с мальтозой, и на агар Сабуро, содержащий среду Гисса с сахарозой, инкубацию проводят в течение 24-48 ч. Выделение дрожжеподобных грибов Candida albicans осуществляют по изменению цвета колоний: при этом на агаре Сабуро, содержащем среду Гисса с глюкозой и среду Гисса с мальтозой, - колонии синего цвета, на агаре Сабуро, содержащем среду Гисса с сахарозой, - бледно-голубого цвета.

Однако Candida albicans и Candida auris на агаре Сабуро, содержащем среду Гисса с глюкозой, среду Гисса с сахарозой, среду Гисса с мальтозой, не дифференцируются по цвету.

Задача данного изобретения - модификация отечественной сухой питательной среды для идентификации дрожжеподобного гриба Candida auris.

Техническим результатом изобретения является достижение стабильности результатов по ростовым и дифференцирующим свойствам, позволяющей упростить и исключить ложную идентификацию возбудителя, сократить время исследования.

Технический результат достигается тем, что идентификацию дрожжеподобного гриба Candida auris, предусматривающую посев культуры на питательную среду с добавками, инкубацию при температуре 37°C и визуальную идентификацию культуры, причем посев осуществляют на Сульфитный агар, модификация №3, дополнительно содержащий глюкозу - 40 г/л и 100 мл эмульсии яичного желтка, который вносят после автоклавирования в течение 15 мин. при 121°С. и охлаждения до 50 - 45°С, а визуальную идентификацию осуществляют по наличию зоны фосфолипазной активности в виде появления беловатой зоны преципитации вокруг колонии Candida auris и отсутствию данной зоны у других дрожжеподобных грибов вида Candida.

Графические материалы, иллюстрирующие предлагаемое изобретение:

Фиг.1 фото среды по прототипу «Сабуро агар»

Фиг.2 фото среды по прототипу «Сульфитный агар»

Фиг.3 фото среды по прототипу «Сульфитный агар с эмульсией яичного желтка»

Фиг.4 Рост культуры Candida albicans на питательной среде «Сабуро агар»

Фиг.5 Рост культуры Candida auris на питательной среде «Сабуро агар»

Фиг.6 Рост культуры Candida albicans на питательной среде «Сульфитный агар»

Фиг.7 фото Рост культуры Candida auris на питательной среде «Сульфитный агар»

Фиг.8 фото Рост культуры Candida auris на питательной среде «Сульфитный агар с эмульсией яичного желтка»

Фиг.9 фото Рост культуры Candida auris на питательной среде «Сульфитный агар с эмульсией яичного желтка»

Фиг.10 Рост культуры Candida albicans на питательной среде «Сульфитный агар с эмульсией яичного желтка»

Фиг.11 фото Рост культуры Candida lusitania на питательной среде «Сульфитный агар с эмульсией яичного желтка»

Фиг.12 фото Рост культуры Candida glabrata на питательной среде «Сульфитный агар с эмульсией яичного желтка»

Фиг.13 фото Рост культуры Candida parapsilosis на питательной среде «Сульфитный агар с эмульсией яичного желтка»

Фиг.14 фото Рост культуры Candida dubliensis на питательной среде «Сульфитный агар с эмульсией яичного желтка»

Фиг.15 фото Рост культуры Candida kefir на питательной среде «Сульфитный агар с эмульсией яичного желтка»

Фиг.16 фото Рост культуры Candida auris (клинический вариант) на питательной среде «Сульфитный агар с эмульсией яичного желтка»

Изобретение осуществляется следующим образом: навеску питательной среды для выявления клостридий по сульфитредуцирующему признаку (Сульфитный агар, модификация №3) следующего состава: панкреатический гидролизат казеина - 15,0 г/л, дрожжевой экстракт- 10,0 г/л, железа цитрат - 1, г/л, натрия сульфит - 0,5 г/л, агар бактериологический - 17,0±2,5 г/л, растворяют в 900 мл дистилированной воды, дополнительно вносят глюкозу - 40 г/л, автоклавируют 15 мин. при 121°С. После охлаждения до 50 - 45°С в среду вносят 100 мл эмульсии яичного желтка, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. После застывания чашки используют для засева штаммами Candida spp, посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 24±48ч, а визуальную идентификацию осуществляют по наличию зоны фосфолипазной активности вокруг колонии Candida auris и отсутствию данной зоны у других дрожжеподобных грибов вида Candida.

Пример 1.

Навеску 41,5 г Сульфитного агара, модификация №3, содержащую панкреатический гидролизат казеина - 15,0 г/л, дрожжевой экстракт - 10,0 г/л, железа цитрат - 1,0 г/л, натрия сульфит 0,5 г/л, агар бактериологический - 17,5±2,5 г/л, растворяют в 900 мл дистилированной воды, дополнительно вносят глюкозу - 20 г/л, автоклавируют15 мин. при 121°С. После охлаждения до 50 - 45°С в среду вносят 100 мл эмульсии яичного желтка, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри, охлаждают, подсушивают и используют для высева.

Контроль: «Питательная среда для выращивания дрожжевых и плесневых грибов (агар Сабуро) и Сульфитный агар модификация №3

Высев на Сульфитный агар №3 с эмульсией яичного желтка и контрольные среды агар Сабуро и Сульфитный агар №3 штаммов C. auris CBS 10913, C. auris 48/20, C. albicans ATCC 90028, C. lusitania AV85, C. glabrata, C. dubliensis KM19, C. parapsilosis OR16, C. kefir до единичных колоний проводят общепринятым микробиологическим методом, посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 24±48ч. Результаты характерных признаков роста колоний Candida spp., выращенных при температуре 37°C в течение 24 - 48 часов, представлены в таблице№1.

таблице №1. №
п/п Наименование исследуемых штаммов Сабуро агар Сульфитный агар №3 Сульфитный агар №3 с эмульсией яичного желтка 1 C. auris CBS 10913 Более мелкие белые колонии Очень мелкие белые колонии Мелкие белые колонии с четкой зоной фосфолипазной активности 2 C. auris 48/20 Более мелкие белые колонии Очень мелкие белые колонии Мелкие белые колонии с четкой зоной фосфолипазной активности 3 C. albicans ATCC 90028 Мелкие белые колонии Средние белые колонии Средние белые колонии 4 C. lusitania AV85 Мелкие белые колонии Средние белые колонии Средние белые колонии 5 C. glabrata Т19 Мелкие белые колонии Средние белые колонии Средние белые колонии 6 C. dubliensis KM19 Мелкие белые колонии Средние белые колонии Средние белые колонии 7 C. parapsilosis OR16 Мелкие белые колонии Средние белые колонии Средние белые колонии 8 C. kefir Мелкие белые колонии Средние белые колонии Средние белые колонии

На агаре Сабуро - рост Candida spp. в виде белых колоний, рост Candida auris в виде более мелких белых колоний.

Предлагаемый способ обеспечивает рост Candida albicans, Candida lusitania, Candida glabrata, Candida dubliensis, Candida parapsilosis, C. kefir в виде белых колоний среднего размера, а рост Candida auris в виде- мелких белых колоний с четкой зоной фосфолипазной активности (появление беловатой зоны преципитации вокруг колонии дрожжей Candida auris).

Данный способ позволяет визуально идентифицировать C. auris по наличию продукции фосфолипазы у и отсутствие продукции фосфолипазы у C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata и C. parapsilosis, C. kefir.

Таким образом, из фото № 4 - № 16 видно, что предлагаемый способ позволяет исключить ложную идентификацию Candida auris, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis, C. kefir

Внесение до стерилизации глюкозы и после стерилизации - эмульсии яичного желтка, дает возможность не проводить трудоемких затрат для разработки питательных сред и одновременно и получить четкий результат идентификации до вида, что позволяет визуально идентифицировать Candida auris.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен способ идентификации дрожжеподобного гриба Candida auris, включающий посев культуры на питательную среду и инкубацию при 37°C. Питательная среда содержит сульфитный агар, модификация №3, включающий 15,0 г/л панкреатического гидролизата казеина, 10,0 г/л дрожжевого экстракта, 1,0 г/л железа цитрата, 0,5 г/л натрия сульфита, 17,5±2,5 г/л агара бактериологического; 900 мл дистиллированной воды и дополнительно 20 г/л глюкозы и 100 мл эмульсии яичного желтка; причем эмульсию яичного желтка вносят после автоклавирования питательной среды в течение 15 мин при 121°С и охлаждения до 50-45°С. Визуальную идентификацию осуществляют по наличию зоны фосфолипазной активности в виде появления беловатой зоны преципитации вокруг колонии Candida auris и отсутствию данной зоны у других дрожжеподобных грибов вида Candida. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов селективного обнаружения Candida auris. 16 ил., 1 табл., 1 пр.

Идентификация дрожжеподобного гриба Candida auris, предусматривающая посев культуры на питательную среду с добавками, инкубацию при температуре 37°C и визуальную идентификацию культуры, отличающаяся тем, что посев осуществляют на сульфитный агар, модификация №3, следующего состава: панкреатический гидролизат казеина - 15,0 г/л, дрожжевой экстракт - 10,0 г/л, железа цитрат - 1,0 г/л, натрия сульфит - 0,5 г/л, агар бактериологический - 17,5±2,5 г/л, 900 мл дистиллированной воды, дополнительно содержащий глюкозу - 20 г/л и 100 мл эмульсии яичного желтка, эмульсию яичного желтка вносят после автоклавирования в течение 15 мин при 121°С и охлаждения до 50-45°С, а визуальную идентификацию осуществляют по наличию зоны фосфолипазной активности в виде появления беловатой зоны преципитации вокруг колонии Candida auris и отсутствию данной зоны у других дрожжеподобных грибов вида Candida.